PT91684A - Metodo para o isolamento, purificacao e caracterizacao das aminopeptidases: ap1 e ap122 - Google Patents

Description

2 ......Invenção A invençlo é dirigida para o isolamento e purificaçâo de aminopeptidases especificas de substrato e para as próprias enzimas .

Fyndagenio da......Inyençgo

As enzimas que são capazes de clivar uma ligação pepi-ídica entre o resíduo amino-terminal de uma proteína ou peptidso e um resíduo de aminoâcido adjacente sSo conhecidas como "aminopeptidases" . Tais enzimas foram identificadas numa variadads ds microrganismos, tais como E-coi i, Bacillus licheniformis, Bac i- llys......suMlllSj Salmonel la__.typhimurl.ym. e My.cop.la.sma_mlivarium CCárter, T. H. et al., J. Bacteriol. 159;453-459 <1984); Hayashi, S., J. Biol. Chero. 259:10448-10454 (1984); Hermsdorf, C. L., Bi-ochem. 17:3370-3376 <1978); McHugh, Θ. L. et al., J. Bacteriol 120:364-371 <1974); Mil ler, C. <3. et al., J. Bacteriol. 135; 603--611 <1978), Simmonds, S., Biochem. 9;1-8 <1970); and Shibaia, K. st al., J. Bacteriol. 16953409-3413 <1987)1.

Um exemplo de uma aminopeptidase é a aminopeptidase específica de leucina produzida na mucosa intestinal e rins de mamíferos. A aminopeptidase especifica de leucina do fluido intestinal de suíno foi purificada e caraeterizada e observou-se pos-suir um ião Zn . A enzina tem uma sspecificidade de substrato larga relativamente ao resíduo N~terminai do peptídeo substrato. Através da hidrólise sucessiva de ligações peptidicas N-termi- nais, ela pode degradar peptídeos dando origem a aminoáeidos li — . ,.., +2, que & capaz: vres. ir-ncont.rou-se que s.-,enzirna e sa.ive.aa por nn de substituir o ilo ZN EWhite, A. et al., Em; Principies of

Biochemistry, Sth Ed., McSraw Hill, MV, Ny <19/3). Um segundo exemplo de uma aminopeptidase especifica de metionina de E. coli

' j : - - ' (Sen-Bassat et al ., J. Sacieriol. 169 i 751-757 (1987)]. Sherman, F. el al., CBioEssays 3127-31 (1985)3.

As leveduras, e em particular, a levedura Saceharomyces cerevisiae também contem aminopaptidases, Trumbly, R.. J. ei ai., iJ. Bacieriol. 156:36-48 (198333,por exemplo, identificou em levedura uma aminopeptida.se de leucina a qual é capaz de clivar um peptidso contendo leucina. As pspiidases ds levedura foram revistas por Achstetier, 7. et al , CYast JJ 133-157 (1385)3, cuja referência é aqui incluída como referência. As aminopeptidases são também produzidas no intestino delgado humano íríartin, 0. W. ei al., Em: Harpsr‘s Revieu of Biochemistry 13th Ed., Lange ns™ dical Publications, Los Altos, CA (1383)3.

As aminopeptidases são importantes no processamento e degradação e psptirfeos e proteínas. Elas têm sido usadas como alternativa á degradação de Edman na determinação ds sequência de am i noá c i dos de poli pep t í deos e p r o te í nas.

As aminopeptidases específicas de substratos podem também ser usadas para clivar especificamente resíduos de aminoâcidos do extremo amina de uma proteína ou pepiídeo. Assim, tais enzimas podem ser importantes na remoção de sequências sinal, sequências de localização nuclear, sequências líder, sequências de secreção, etc., as quais podem estar presentes no extremo amino™terminal de um peptídeo ou proteína. Uma vez que muitas proteínas, produzidas através da tecnologia de DNA recombinante ou por outros meios contém tais sequências, as aminopeptidases podem ser usadas para converter tais moléculas nas suas formas maduras e/ou funcionais. A identíficação e disponibi1 idade de outras aminopeptidases especificas de substrato é pois altamente desejável. r? 5

De acordo com a presente invenção, aminopeptidases especificas d® substrato, capazes de clivar a ligação pepiídica entre o grupo carboxilo de um resíduo de aminoácido amino-terminal particular s o grupo amina de um resíduo de aminoâcido adjacente foram isoladas e substancialments purificadas. A presente invenção está portanto relacionada com a purificação destas enzimas, com as utilizações destas enzimas e com as próprias enzimas substanc ia1mente purifiçadas.

Dstalhadamente, a invenção diz respeito a uma enzima ami-nopeptida.se especifica de substrato substanciaImente purificada tendo cãpB.cid&ds para clivar a ligação peptídica entre um resíduo de meiionina amino-terminal e um penúltimo resíduo de aminoâcido amino-terminal seleccionado do grupo constituído por; Vai, Ala, Arg, Cis, 61i, His, Ile, Leu, Lys, Hat e Fen. A invenção também diz respeito a uma enzima aminopeptida-se específica de substrato substancia1mente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptídica, em que X é um resíduo de aminoâcido seleccionado do grupo constituído por; Arg, 61u, Leu, Het, Fen e Trp. A invenção também diz respeito a uma enzima aminopeptida-se específica de substrato substanc ia .1 mente purificada, tendo capacidade para clivar a ligação peptídica entre um resíduo amino--terminal X e um resíduo de Ile adjacente de um peptídeo, em que X ê um resíduo ds aminoâcido seleccionado do grupo constituído pori Vai, Ala, Arg, 61n, His, Leu, Het, Fen, Pro, Ser, Ire e Trp. -\ 5 s ίί.; A invenção também dis respeito ás sminopspiidases especificas de substrato atrás descritas que são API ou API22. A invenção também diz respeito a uma molécula da DMA re-combinante compreendendo uma sequência genética codificadora de qualquer uma das aminopeptidases especificas de substrato atrás descritas. A invenção também diz respeito a qualquer uma das aminopeptidases especificas de substrato atrás descritas que é produzida através da expressão de uma molécula recombinante. A invenção também diz respeito a um método para a re cu-peração da aminopeptidsse API especifica de substrato, substancialmente purificada e atrás descrita a partir de uma amostra contendo a aminopeptidase, caracterizado pelos seguintes passos;

Ca) recuperação da aminopeptidase bruta especifica d® substrato a partir de uma amostra contendo a aminopeptidase;

Cfo) sujeição da aminopeptidase especifica de substrato bruta do passo Ca) a. uma série de crematografias de permuta iônica em CM-Sep-harose e DEAE-Sephaross CL-~SB;, e

Cc) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada através de precipitação com sulfato de amónio a partir do eluato da cromatogra-fia de per mu ta i ón i c a se r i ada. 6 A invenção diz ainda respeito ao método atrás descrito que se caracteriza pelos passos adicionais de :

Cd) sujeição da aminopeptidase especifica de substrato recuperada do passo Ct> a cromatografia de interac:-· c-Io hidrofâbica em Pheny i “Sepharose;· e

Ce) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela cromatografia de interac-ção hidrofóbica em Pheny1-Sepharose. A invenção diz ainda respeito ao método atrás descrito que se caracteriza ainda pelos passos de!

Cf) sujeição da aminopeptidase específica de substrato recuperada do passo Ce) a cromatografia em Sepharose CL--6B; e

Cg) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada por cromatografia em Sepharose CL-SB. A invenção também diz respeito a um método para a recuperado da aminopeptidase APí22 especifica de substrato e substancial mente purificada^ atrás descrita, a partir de uma amostra contendo a aminopeptidase caracierizada pelos seguintes passos!

Ca) recuperação da aminopeptidase bruta especifica de substrato a partir de uma amostra contendo a aminopeptidase;

(b) sujeição da aminopeptidase bruta específica de substrato do passo (a) a cromatografia de permuta ióni-ca; e

Cc) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato por precipitação com sul farto de amónio a partir d© elusto da cromatografia de permuta iônica. A invenção diz ainda respeito ao método atrás descrito que se caracteriza pelos passos adicionais de; (d) sujeição da aminopeptidase especifica de substrato recuperada do passo Cc) a cromatografia de interseção hidrofôhica em Phenyi-Sepharose; e

Ce) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela eromatografia de interseção hidrofóbíca em Phenyi-Sephaross. A invenção diz ainda respeito ao método atrás descrito que se caracteriza pelos passos adicionais dei

Cf) sujeição da aminopeptidase especifica de substrato recuperada do passo Ce) a cromaiograíia em hidroxi-1apat i te; e

Cg) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela cromatografia em hidroxi-lapati te. & ......-''Λ1 0 invento proporciona ainda um método par® a remoção d© um resíduo de metionina amino-··terminal d© um peptídeo contendo o resíduo amino-terminal © contendo como penúltimo resíduo de aminoácido amino-terminal, um aminoácido seleccionado do grupo constituído porí Vai, Ala, Arg, Cis; Sli, His, Ile, Leu, Lis, Het s Fsn, método este qus s© caractsriza psla incubação do peptidso na presença da aminopeptidase especifica de substrato APÍ para assim remover o resíduo amino-terminal. fi invenção proporciona ainda um método para a remoção de um resíduo de metionina amino-terminal de um pepiídeo contendo o resíduo amino-terminal e contendo como penúltimo resíduo de aminoácido amino-terminal um aminoácido seleccionado do grupo constituído por Arg, Cis, Gli, His, Ile, Leu, Lis, nei, Fen, Ser s

Tre, método esse que s© caracteriza pela incubação do peptídeo na presença da aminopeptidase especifica de substrato AP122 para assim remover o resíduo amino-terminal. A invenção proporciona ainda um método para a remoção de um resíduo X amino-terminal de um peptídeo contendo o resíduo terminal X e um resíduo Ile adjacente, em que X é seleccionado do grupo constituído por Arg, Glu, Leu, Met, Fen © Trp, método esse que se caracteriza pela incubação do peptídeo na presença da aminopeptidase específica de substrato AP1 para assim remover o re-

I siduo amino-terminal. A invenção proporciona ainda um método para a remoção de um resíduo amino-terminal X de um peptídeo contendo o resíduo termina! X e um resíduo Ile adjacente, em que X é seleccionado do grupo constituído por Vai, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Leu, net, Fen, Pro, Ser, Tre e Trp, método esse que se caracteriza pela incubação do peptídeo na presença da aminopeptidase específica de substrato AP122 para assim remover o resíduo amino-terminal. - Λ> ,·' ' x' / s * -í f 0 : > .· A invenção diz ainda respeito á realização dos métodos atrás em que a aminopeptidase específica de substrato é imobilizada num suporte sólido.

Dgsg..r.ÍS..iQ......detalhada, da, Inyenc.go I. Isolamento e purificação das aminopeptidases especificas de substrato AP1 e APÍ22 da presente invenção

Oe acordo com a presente invenção, qualquer uma das aminopeptidases específicas de substrato da presente invenção pode ser isolada a partir de uma amostra contendo a enzima. As aminopeptidases específicas de substrato parecem ser ubíquas, sendo encontradas em todos os eucar.iotas, incluindo plantas, animais e organismos mui ti celulares. Pensa-se que também esteja presente nos procariotas uma enzima diferente tendo actividade de aminopepiidase espsc if ica de metionina. Assim qualquer fonte celular é abrangida nesta invenção. Como aqui é usado, a amostra contendo qualquer uma das enzimas será referida simplesmente como "amostra" . A menos que seja especificado como sendo particulares para uma outra das aminopeptidases especificas de substrato da presente invenção, os métodos de DMA recombinanie aqui descritos podem ser empregues para clonar e expressar uma ou ambas as aminopeptidases da presente invenção.

Ma descrição que se segue da purificação das aminopeptidases específicas de substrato da presente invenção, a actividade de aminopepiidase pode ser testada por qualquer método conveniente. 0 ensaio preferido para a actividade de aminopeptidase especifica de substrato é a seguinte! 10

- t-' A ac ividads snzimâtica pode ser testada usando Het-pMA (para-niiroani1 ida de meiionina) ou o pepiídeo Hai-Ala-Ser como substrato. Quando se usa como substrato net-pNA uma amostra de 10 ,ul de cada fracção colhida de uma coluna de cromatograíia é adicionada a uma cavidade marcada de uma placa de microiituIaçSo *4·· contendo 45 jul de uma solução que contem 4 mH Hei-pNA, HEPES-K 10 mH; pH 7,35, 0,2 mH CoCl.-,, 0,02% NaN0. Todas as reacçfíes foram de preferência conduzidas usando uma placa de microtiiulação.

Após incubação durante uma hora á temperatura ambiente, a absov...... vência da amostra a 4/4 nm foi determinada usando sm leitor de placas.

Quando o ensaio foi conduzido usando Mei-Ala-Ser como substrato, uma amostra de 10 jjI de cada fracção colhida de uma coluna de cromatograíia foi adicionada a uma cavidade marcada de uma placa de microtitulaçSo contendo 45 ,ul da solução que contem 4 mH Hei-Ala-Ser, 10 mH HEPES-k!*, pH 7,35, 0,2 mH CoCl..,, 0,2 M KC1, í,5 mH HgCI._,, 0,02¾ WaN0, 10 ..ug de oxidas® de L-aminoác idos, 115 jug de peroxidase de rábano silvestre e 10 ,ug de di -hidro·-cloreto de o-dianisina. As reacções foram efeciuadas â temperatura ambiente, durante uma hora e registada a absorvência a 450 nm ou a 414 nm. 0 isolamento e purificação das aminopeptidase especifica de substrato do presente invento será daqui em diante descrito a partir de uma amostra de levedura, se bem que se deva entender que outras amostras poderão igualmente ser usadas como fonte de material.

As células de levedura, de preferência Saccharomyces ce-rsvisias, são cultivadas em meio adequado (de preferência meio YP0 ; í% de extracto de levedura, 2% de Baciopepione, 2¾ de glucose) para uma A...de 5-20. As preparações cie células colhidas a v« - τ’

XV 11 Λ Ο· - * S *. uma Α....... de 8 ou a uma A......... de i 8™ 20 têm aciividades equivalentes

OUU fc>VU de aminopeptidase específica de substrato. As células são colhi-das, da preferência, por centrifugação e ressuspensas em meio YDP contendo 15% de glicsrol. As células podem ser então congeladas a -70° C e guardadas durante um período de tempo prolongado.

As células congeladas são descongeladas, de preferência por incubação num banho-mar ia a 30° C e colhidas por centrifugação â temperatura ambiente. As células sedimentadas foram res..... suspensas num tampão adequado como seja Tampão S <í M sorbitol, 50 mM Tris, pH 7,8, 10 m!1 MgCl0, 3 mM DTT) suplementado com li-tíase e incubados a 30° C para permitir a formação de esfolastes. Os esferoplasios são então colhidos, lavados em mais Famplo S, Usados e homogeneizados em tampão hipotónico, como seja o tampão A CIO mM HEPES-K+, pH 7,0, 1,5 mH MgCÍ.>; 10 mM KC1 e 0,5 mH DTT). A homogeneização é de preferência conseguida a 4° C usando um homogeneizador Dounce. A aminopeptidase especifica de substrato de levedura é libertada paira o lisado celular por agitação suave. Apôs remoção de quaisquer detritos existentes por centrifugação, adiciona-se giicerol ao sobrenadante do lisado ¢10% concentração fina1) para aumentar a estabilidade da aminopeptidase especifica de substrato. 0 sobrenadante, atrás descrito, do lisado celular é então concentrado para Í00 ml utilizando uma membrana de ultrafiltração PM-10 e dialisado três vezes contra 2 litros de um tampão adequado, como seja Tampão H ¢100 mH HEPES-K*, pH 7,35, 1,5 mM HgCl.., 0,5 mH DTT, 0,2% NaN..., .. . , 3, 10% giicerol), suplemem-aoo para comer 0,05 M KCi. 0s biomateriais celulares residuais presentes na sobrenadante são removidos para evitar a agregação de proteína-bio-material nos passos subsequentes. Para este processo pode ser usada a cromatografia de permuta iônica. Neste passo, a permuta iónica usada é de preferência cromatografia em CHSepharose, de

3 Λ

preferência empregando CM-Sepharose CL-βΒ. 0 sobrenadante concentrado é de preferência aplicado numa coluna ds CM-Sepharose CL-5B que foi ligada a uma coluna de DEAE-Sepharose CL-βΒ de tal forma que o eluato da coluna de CM-Sepharose CL-S8 é aplicado continuamente na coluna de DEAE-Sepharose CL-SB. Ambas as colunas slo equilibradas contra o mesmo tampão usado na diâiise. As duas colunas ligadas são então eluidas com 2 litros de tampão H (suplementado para conter 0,05 M KC1) ou um outro tampão adequado. Colhe-se o eluato.

Adiciona-se sulfato de amónio solido ao eluato para fazer uma solução saturada de sulfato de amónio a 50% a 4o C, Esta solução é agitada até se formar um precipitado, ou, de preferência; durante a noite a 4° C. 0 precipitado é removido por centrifugação, de preferência a 10.000 rpm durante 30 minutos. Adiciona-se então sulfato de amónio sólido ao sobrenadante para fazer uma solução saturada de sulfato de amónio a 80%. Esta solução é agitada até se formar um precipitado, ou, de preferência durante a noite a 4o C. 0 precipitado á colhido por csntrifugação a 10.000 rpm durante 30 minutos a 4° C. Este precipitado é redissolvido numa quantidade mínima de tampão H contendo 0,2 KC1, para formar uma solução contendo ambas as amínopeptidases AP1 e AP122.

As amínopeptidases AP1 e AP122 podem ser ainda purificadas usando cromatografia de interseção hidrofábica (ds preferência usando cromatografia em Phenyl-Sepharose CL-48). 0 precipitado redissolvido é dialisado três vezes contra 1 litro de tampão H ou um outro tampão adequado, suplementado para conter 0,2 M HC1. Um volume igual de solução saturada de sulfato de amónio a 80%, 10 mM HEPES-K*, pH 7,35, 10% glicerol, 0,02% NaM,, .. 8 e enx-ao

adicionado à soluçlo contendo a aminopeptida.se. Esta mistura é então aplicada a uma coluna ds Phenyl-Sepharose CL-4B equilibrada com uma solução saturada de sulfato de amónio a 40%, 10 mH

HEPES-K’, pH 7,35, 10% glieerol, 0,25 mH DTi', 0,1 H KCi; 0,02¾ UíSÍY, ' "3. A coluna á primeiro eluítía com o mesmo tampão descrito atrás s depois com um gradiente linear de solução de sulfato de amónio de 40¾ a 0?í, 10 mH HEPES-K*, ph 7,35, 10¾ glieerol, 0,25 mM DTT, 0,02% NaN0, 100 mH KC 1 a 73 ml/hr.As íracções (tipicamente de cerca de 4 ml) são colhidas. Numeram-se as íracções consecutivamente com a primeira fracção colhida sendo designada ”?racção 1”. As íracções tendo uma condutividade de aproximada-mente 67,5 ms Caproximadamente íracções 45-53) contêm a aminope-ptidase AF;,1 . As fracçSes tendo uma conduti vidade de aproximada-mente 35 ms (aproximadamente fracçSes 81-33) contêm a aminopepii-dase AP122. As aminopeptidases são ainda purificadas usando cro™ matografia em hidroxilapetite (para AP122) ou cromaiografia em Sepharose CL-6B (para AP1).

As íracções reunidas contendo actividade de aminopepti-dase AP122 da cromaiografia em Phenyl-Sepharose CL-4B são concentradas para 5 ml usando uma membrana de ultrafi1 tração PH-10. As fracçSes reunidas e concentradas foram diaiisadas três vezes con..... ira 1 litro de tampão de potássio 0,01 H, 0,5 H DTT, 1,5 mH NgCl.-,, 0,2¾ MaM.„,, 5 mH KCi, 10% glieerol e aplicadas numa coluna de hi- •m* droxilapatite (2,5X20 cm) equilibrada com o mesmo tampão usado na diáliss. A coluna foi eluida com um gradiente linear de tampão de fosfatos de potássio de 0,01 H a 0,5 H, 0,5 mH DTT, 0,2¾ NaNoJ 5 mH KCI, 10% glieerol a aproximadamente 13 ml/hr. Colheram-se íracções com aproximadamente 4 ml e testaram-se quanto á actividade de aminopeptidase como descrito atrás. Tipicamente a amino-pepiidase AP122 é encontrada numa condutividade de aproximadamente 3,1 ms (aproximadamente fracçSes 33-101). Reuniram-se as íracções contendo actividade de aminopeptidase APÍ22.

As fracçSes da cromaiografia em Phenyl-Sepharose CL-4B tendo actividade de aminopeptidase AP1 foram concentradas para um

V

volume de 2 ml Ubsndo uma membrana de ul traí i .1 tração PM—10. A solução foi então dialisada três vezes contra 1 litro de tampão H (suplementado para conter 0,2 M KC1) e aplicada numa coluna de Sepharose CL-SB equilibrada com o mesmo tampão usado na diálise. A coluna foi eluida com tampão H contendo 0,2 ri KC! a 18,5 ml/hr. Colheram-se íracçfíes de aproximadamente 4 ml e testaram-se quanto á actividade de aminopepiidase como descrito atrás. Tipicamente, a aminopeptidase APí é encontrada num pico de absorvência a A ,, . 414 no terço final da eiuição (aproximadamente fracçâes S8-S9 de 77 íracçííes totais). As íracções contendo actividade de aminopeptidase Api foram reunidas.

Usando esta série de passos cromatogràficos, a aminope-ptidase especifica de substrato APÍ de levedura foi purificada quase até έ homogeneização. A enzima tem um peso molecular aparente de 8Í.000.

Os termos peptideo, polipeptideo e proteina referem-se todos a polímeros de resíduos de aminoâcidos. Um peptideo é um polímero de pelo menos dois resíduos de aminoâcidos ligados um ao outro por uma ligação peptídica. Um polipeptideo é um polímero de vários resíduos de sminoâcidos ligados uns aos outros por iiga-çSes peptídicas. Uma proteína é um polímero grande de muitos resíduos de aminoâcidos ligados uns aos outros por uma ligação psp-tídica. 0 termo "aminopeptidase" como aqui é usado pretende indicar um enzoma capaz de atacar e clivar a ligação peptídica que liga o resíduo de aminoácido amino-terminai de um peptideo <e portanto também de um polipeptideo ou proteina) ao penáltimo resíduo de aminoácido amino-terminal daquele peptideo (ou polipeptideo ou proteína).

As aminopeptidases do presente invento são aminopeptida-sss especificas de substrato. Uma aminopeptidase ê referida como sendo "especifica de substrato" se apenas certos peptídsos ou proteínas (i.e. não qualquer peptídeo ou proteína) podem servir como substrato da inzima. Tais substratos adequados possuem resíduos amino-terminais e penúltimos resíduos amino™terminais particulares que estão ligados por uma ligação peptídica. A especialidade de substrato da aminopeptidase é definida com a sua incapacidade ou incapacidade para clivar um substrato particular. A sspecificidade de substrato das aminopeptidases da presente invenção está definida abaixo. A presente invenção diz respeito a uma enzima aminope™ ptidas© especificas de substrato que está "substanc ialmente pura" ou que foi "substancialmente purificada”. Conforme aqui são usados, os termos "substancialmente pura" ou "substancialmente purificada" pretendem ser equivalentes e descrevem uma aminopeptidase especifica de substrato que está substancialmente livre de um composto normalmente associado â enzima no seu estado natural, i.e., uma proteína, açúcar, lípido, etc.. 0 termo pretende ainda descrever uma aminopeptidase especifica de substrato que é homogénea de acordo com um ou mais ensaios de pureza ou homogeneidade usados pelos fami1iarizados com a matéria. Por exemplo, uma aminopeptidase especifica de substrato substancialmente pura apresentará características constantes e reprodutíveis dentro dos desvios padrões experimentais para parâmetros tais como! peso molecular, técnicas cromatográíicas, etc.. 0 termo, porém, não pretende excluir misturas artificiais ou sintéticas das enzimas com outros compostos. 0 termo também não pretende excluir' a presença de impurezas que não interferem com a aciividade biológica da enzima e que podem estar presentes, por exemplo, devido a purificação incompleta. V Λ/χ * V/'-

II. Caracterização das aminopepí-idases específicas de substrato da presente invenção

Peso Molecular de APi 6éis de SDS-poi izicri lam idas da amostra purificada revelam que APi migra como uma única banda de peso molecular aparente de cerca de 81 000 quando corados com azul Coomassie. A elec troío-rese foi efectuada segundo o método de Lae.mmii, U.K. CNature 227; 680--68-5 <197033 usando um gel de 10%. 0 gel foi corado com azul Coomassie. Padrões proteicos de 45, 66, 97, 116 s 205 Kd de peso molecular foram usados para calibrar o gel. 0 peso molecular aparente de AP122 não foi determinado.

Espec i f icidade de substrato Eíectuou-se uma determinação parcial de especificidade de substrato de APi e AP 122 usando uma. série de trinta e seis pspti--deos puros. Os peptídeos tinham uma de duas sequências: <13 MET-X-ILE-PRO-GLU-TRE ou

<H3 X-ILE-PR0-6LU-TRE em que "X" refere-se a um dos seguintes dezoito aminoâcidos! Vai, Ala, Arg, Asp, Cis, Glu, Gin, Gli, His, Ile, Leu, net, Fen, Pro, Ser, Ire e Trp.

Encontrou-se que API é capaz de clivar os peptídeos do grupo I em que "X" é Vai, Ala, Arg, Cis, Gli, His, Ile, Leu, Lis, net ou Fen. Nenhum outro peptídeo do grupo I testado foi clivado por APi. API foi capaz de clivar apenas os peptídeos do grupo II

£·!Ϊ! que ·''Xé Arg., Gin, Leu, Hei, Fen ou Trp. Nenhum outro pepti-deo do grupo II testado foi clivado.

Encontrou-se que AP 122 é capaz de clivar os peptídeos do grupo I em que "X" é Arg, Cis, Gli, His, Ile, Leu, Lis, Met, Fen, Ser ou Ire. Nenhum outro peptideo do grupo I testado foi clivado. APÍ22 foi capaz de clivar os peptideos do grupo II em que "X" â Vai, Ala, Arg, Gin, His, lie, Leu, Met, Fen, Pro, Ser, Tre ou Trp. Nenhum outro peptideo de grupo II foi clivado. III. Engenharia genética das aminopept-idases do presente invento A identificação das fracçSes que contêm aciividade de AP* ou AP122 substancialmente purificadas permite que seja determinada a sequência de aminoaeidos destas enzimas e permite ainda que estas moléculas sejam produzidas através da aplicação de téc..... nicas de DNA recombinante, Assim, o presente invento inclui não sô AP1 e AP122 substancialmente purificadas e métodos para a sua utilização, como também inclui as sequências de aminoâcidos destas enzimas, as sequências genéticas codificadoras destas enzimas, veículos contendo tais sequências genéticas, hospedeiros transiormados com eles, produção de enzimas através da expressão no hospedeiro transformado e utilização das enzimas na clivagem de peptideos ou proteínas contendo o substrato, AP1 é aminopepti-dase específica de substrato preferida da presente invenção.

Para se obter a sequência de aminoâcidos das enzimas, as enzimas nas fracçQes substancialmente purificadas são recuperadas, en tão sequenc i acias, por exemplo, por electroeluição de um gel de poliacriiamida. As moléculas recuperadas podem ser então sequenciadas, de - 18 -

preferência usando um sequenciador automático e a sequência de aminoácidos da enzima assim determinada.

Como alternativa e de preferência, a sequência de aminoácidos das enzimas á determinada através de uma análise do DMA ou ainda mais preferível, da sequência de cQNA, do gene que codifica a enzima. Para se obter estas sequências de ácido muleico fsz-se o despiste de uma fonte que contem o gene de AP1 ou de AP122 ou a sequência de cDNA usando sondas oligonucleotidicas que codificam fragmentos da enzima. AP1 ou Apl 22.

Para preparar as sondas oligonucleotídicas, a enzima substancialmente purificada foi recuperada e fragmentada com brometo de cianogánio ou com proteases tais como papaína, quim- otripsina, iripsina, etc.. EOike, Y., et_______al., J. Biol-Chem. 2^7:3751-3758 (1382); Liu, C. et.......al..,..., l.nt,.........J,_FgEt_·.........Protejn,..........M. 21! 203.....215 (1383).1. Os peptídeos resultantes foram separados, d® preferência por HPLC de fase reversa a sujeitos a ssquertciaçfc de aminoácidos. Para se atingir este fim, os peptídeos são analisados de preferência por ssqusnciadorss automáticos.

Uma vez sequenciados um ou mais peptídeos adequados, as sequências de DMA capazes de os codificar foram examinados. Se os peptídeos forem superiores a 10 aminoácidos de comprimento esta informação da sequência é geralmente suficiente para permitir a clonagem da sequência de um gene como seja os que codificam as enzimas da presente invenção. Devido ao código genético ser degenerado, no entanto, mais do que um codão pode ser usado para codificar um sminoácido particular tWaison, J.D. Em! Molecular Biology of ihe Gene, 3rd Ed., U.A. Benjamin, Inc., nenlo Park, CA (1377), pág. 356-3571. Usando o código genético podem ser identificados um ou mais oligonucleotídeos diferentes, cada um dos quais será capaz de codificar os peptídeos da enzima. A - 13 ···· i

probabi1 idade de um oligonucleotideo particular constituir d© facto a. sequência codificadora do fragmento d© enzima pode ser calculada considerando as relações de empar©lhamento de bases anormais e a frequência com que um codão particular é de facto usado (para codificar um aminoácido particular! nas células ©uca-riôticas. Tais regras de "frequência d© utilização de codSes" estão descritas por Laihe, R., et al., J. Holec. Biol. 19311--12(136-5). Usando as "regras de frequência de utilização de co-dfíes" de Lathe pode-se identificar um oligonucleotídeo ou uma serie de oligonucleotideos que contenha a sequência, de núcleo vídeos teoricamente "mais provável" capaz de codificar as sequên-c i as psp t í d i c as do f ragmen to anz i mâ t i c o .

As técnicas para a síntese de o1igonucleotideos estão descritas por, por exemplo, EWu. R., et al . , Prog. Nuc1. ficld. Res. Holec. Biol. 21J 101-141 (1378)3. Processos para a construção de moléculas recombinantes de acordo com o método atrás descrito estão descritos por Maniatis, Ϊ., et ai., Em 1 Molecular Cloning. A_LãÈSEãí •ory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Sprins Har-bor, NY (1984), referência que aqui á incluída por referência.

Se bem que apenas ocasionalmente, uma sequência de ami-noácidos pode ser codificada, por um só ol igonuc leotídeo, frequentemente a sequência de aminoácidos pode ser codificada por qualquer uma de uma série de oligonucleotideos semelhantes, é importante que enquanto todos os membros desta série contém oiigonu-cleotideos que são capazes de codificar o fragmento peptidico e assim potencia1mente contem a mesma sequência oligonucleotídica do gene que codifica o fragmento peptidico apenas um membro da série contem a sequência, nucleotídica que é idêntica à sequência nucleotídica de gene. Devido a este membro estar presente na série e ser capaz de hibridar com DMA mesmo na presença dos outros membros da série, ê possível empregar a série não fraccionada de ο1igonucieotideos do mesmo modo que se empregar ia. um único oligonuc leotideo para clonar o gene que codifica o peptideo. 0 oligonucleotideo ou série de oligonucIeotideos, con™ tendo a sequência teoricamente "mais provável" capaz de codificar o fragmento peptídico da enzima foi usado para identificar a sequência de um oiigonucleotideo complementar ou série de oligonucleotídeos que é capaz de hibridar com a sequência "mais provável" ou série de sequências. Um oligonucleotideo contendo tal sequência complementar pode ser empregue como sonda para identificar e isolar uma sequência do gene que codifica a enzima CMania-tis, T.» et ai -, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)3. A sonda de DMA pode ser marcada com um grupo detectável. Tal grupo detectável pode ser qualquer material tendo uma propriedade física ou química detectável. Tais materiais foram bem desenvolvidos no campo dos imunoensaios e em geral a maior parte das marcas úteis em tais métodos podem ser aplicadas na presente invenção. São particularmente úteis grupos enzimaticamente acti-vos, tais como enzimas Ever Clxn. Chem. 22;1243(1976)3, substratos de enzimas E(ver Pat. Britânica Espec. 1,548,741), coenzimas (ver Pat, U.S. M2 4,230,797 3 4,238,565) e inibidores de enzimas (ver Pat. U.S. ÍM2 4,134,792); substâncias fluorescentes (ver €1in. Chem. 25;353 (1979); cromóforos; substâncias luminescentes tais como quimioluminescentes e bioluminsscen tes (ver ÇHn^JSheHL·. 25:512 (1979)3; ligandos especificamente ligáveis; pares de in-

qj-j qtrc; qop 1 “· q I lSEacfi?sp£8íêSllé SaF8jTiÍsâí?fí?aY4locai&ú.id^Torbise'‘''Ta; suas propriedades físicas Ce.g., substâncias fluorescentes, cro— móforos e radioisôtopos) ou nas suas propriedades reactivas ou de ligação (e.g., enzimas, substratos, coenzimas e inibidores). Por exemplo, uma sonda marcada com um cofactor pode ser detectada pela adiç-lto da enzima par® a qual a marca é um cofactor e um 21 substrato da enzima. Por exemplo, pode-se usar uma enzima que actue sobre um substrato para gerar um produto com uma propriedade física mensurável. Exemplos desta última incluem, mas nio estio limitados a beta-galactosidase, íosfatass alcalina a pero-xidase.

Um oligonucleotideo adequado ou série de oligonucleoti-deos que é capas de codificar um fragmento da sequência do gene que codifica a enzima (ou que é complementar de tal oligonucleotideo ou série de ol igonuc isotídeos) foi identificado (usando o processo atrás descrito), sintetizado e hihridado, por meios bem conhecidos na área, com um DMA ou de preferência uma preparaçao de cDNA derivado de células que são capazes de expressar a enzima. Moléculas de oligonucleotideos de cadeia simples complementares das sequências "mais prováveis" codificadorss do peptideo da enzima podem ser sintetizadas usando processos que sSío bem conhecidos dos fami1iarizados com a matéria CBelagaje, R., et al., J . Ei i o 1 --(.-hem. 254 157& 5—b 7 S0 (1379 ) ; rianiatis, T., §lÍ,„jlLí_' Em; hc·.— ls,cularL.J1echanism.s......i.n.......the...........Control......Q.f..,Sene..,.Expre^loD, Nierlich, D.P. et al., Eds., Acad. Press, M.Y. Í137S); Wn, R., ei__al.,

Prog. Nuc1. Acid. Res. Molec. Blol. 21; 101-141 (1378); Khorana, R.8. Science £03;614-625 (1373)3. Em adiçio a síntese de DMA pode ser conseguido através da utilização de sintetizadores automáticos. As técnicas de hibr idação de ácidos nucleicos estão descritas por Maniatis, T., et^ajL., Em £ (Molecular...... ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, MY (1332)3 e por 4-Iaymes, B.D., et al . , lEm; Muclelc Acid Hybridl-zatlon, A Praticai Approach, IRL Press, Washington, DC (1335)3, as referências dos quais estáo incluídas por referência.

Uma sequência de DMA codificadora de AP1 ou de AP122 pode derivar de uma variedade de fontes. Por exemplo, mRMA codificador de ambas as enzimas pode ser isolado a partir de tecidos de

qualquer espécie que produza a enzima e identificados usando o método de iransferência Northern LAluine ei al., Melhod Enzymol. S8;220;242 (1373)3 e sondas oligonucleoiideas marcadas. 0 mENA pode ser então convertido em cDNA por técnicas conhecidas dos famiIiarizados com a matéria. Como alternativa, DMA gsnômico pode ser isolado s empregue. A fonte de DNA ou de cDNA usada terá sido preferencialmente enriquecida na sequência do gene que codifica a enzima. Tal enriquecimenio pode ser mais facilmente obtido a partir de cDNA obtido por ext-racção de RNA das células, tais como células de levedura, que produzam níveis elevados da enzima. Um exemplo de tais células é Sac.charoyc.es........cerevislae.

Qualquer um de uma variedade de métodos poda ser usado para clorsar uma sequência de genes que codificam as enzimas da presente invenção. Um desses métodos engloba a análise de uma biblioteca de inserções de cDNA num vecior "vai-vem" (inserções derivadas de uma célula que expressa as enzimas do presente invento) quanto á presença de uma inserção que contenha uma sequência do gene a qual é capaz de codificar a enzima. Tal análise deve ser conduzida através da transiecção de células com o vector e depois testando a expressão da enzima.

Para identificar e clonar a sequência do gene capaz de codificar cada uma das enzimas da presente invenção faz-se o: despiste de uma biblioteca de DNA ou preferencialmente de cDNA quanto á sua capacidade para hibridar com as sondas oligonucleotídi™ cas descritas atrás. As preparações de DNA adequadas (como seja DNA genômico humano) são clivadas enzimáticamente ou fragmentadas ao acaso s ligadas a vectores recombinantes. A capacidade destes vectores recombinantes para hibridar com as sondas oligonucleoii- dicas atrás descritas foi então medida. Os vectores que se sncon..... iraram capazes de tal hibridação foram então analisados para determinar o grau e natureza das sequências enzimáiicas que contêm. 23 ο - -Ν '\ . - >>\ '

Baseado puramente em considerações estatísticas uma sequência de gene capas de codificar qualquer uma das enzimas da presente invenção poderá ser identificada sem ambiguidade (através do despiste de hibridação) usando uma sonda oligonuclsotídica tendo apenas í 8 nuc1eotí deos.

Numa via alternativa de clonsgem de uma sequência dos genes que codificam as enzimas da presente invenção, preparou-se uma biblioteca de vectores de expressão por cionagem tíe DNA ou, de preferência, cDMfi (derivado de uma célula capaz de expressar a enzima) num vector de expressão. A biblioteca foi então despistada quanto a membros capazes de expressar uma proteína que se liga ao anticorpo específico da enzima e que tem uma sequência nuclsotídica que é capaz de codificar polipeptídeos que possuem a mesma sequência de aminoácidos da enzima ou seus fragmentos. Mesta realização, DNA ou, de preferência cDMA é extraído e purificado a partir de uma célula que seja capaz de expressar a enzima. 0 cDNA purificado foi fragmentado (por fricção, digestão com sndo-nuclesses, etc.) para produzir um conjunto de fragmentos de DMA ou de cDNA. Os fragmentos de ONA ou de cDNA deste conjunto foram então cionados num vector de expressão para produzir uma biblioteca genómica ou de cDNA em vectores de expressão cujos membros contêm um único fragmento de DNA ou cDNA clonado.

Assim, resumindo, a identificação das aminopeptidases especificas de substrato do presente invento permite a identificação de uma sequência de DNA •'•'teoricamente mais provável·'·' ou de uma série de tais sequências, capazes de codificar a sequência peptídica destas enzimas. Através da construção de um oligonu-cleotídeo complementar desta sequência teórica (ou através da construção d© uma série de oligonucleotídeos complementares da série de oligonucleotídeos "mais prováveis") obtém-se uma molécula de DNA (ou série de moléculas de DNA) capazes de funcionarem

como sonda para identificar e isolar uma sequência de gene capaz de codificar cada uma das enzimas da presente invenção. Técnicas semelhantes ou iguais âs descritas atrais permitiram elonar com êxito genes da aldeido-desidrogenases humanas íHm, L.C. , et ai . , Proc . Natl . Acad· Sei USA 82,*3771 -3775 <1985)3, fibronectina (Suzuki, S., et al., Eur. Mol. 8iol. Organ. •J. 4; 2519-2524 (1985)3, o gene do receptor de estrogénios humano [Uaiter, P., et al.. Proc. Natl.___Acad. Sei. USA §2!7889-7893 (1985)3, activador do piasminogénio tipo-iecido CPennica, D., st al., Mature 301:214-221 <1983)3 e DMA complementar da fosfatase alcalina humana de placenta (Kam, W., si al,, Proc. Natl.__Acad.

Sc i. USA 82:8715-8719 <1985)3.

Iv. Expressão de sequências codificadoras das aminopept-idases especificas de substrato

Moléculas de DMA ou de cDNA que codificam a enzima APí ou AP122 podem ser operscionalmente ligadas num vector de expressão e introduzidas numa célula hospedeira para permitir a expressão da enzima APÍ ou AP122 pela célula. Duas sequências de DMA (como sejam uma sequência da região promotora e uma sequência codificadora da enzima pretendida) são referidas como estando operacionalmente ligadas se a natureza da ligação entre as duas sequências de DMA não (1) resultar na introdução de uma mutação de desvio da grelha de leitura, (2) interferir com a capacidade da sequência da região promotora para dirigir a transcrição da sequência do gene codificador da enzima pretendida ou (3) interferir com a capacidade da sequência do gene da enzima pretendida para ser transcrita pela sequência da região promotora. i i

Uma sequência de DMA codificadora de APi ou APí22 pode ser recombinada com o DMA vscior de acordo com técnicas convencionais , incluindo extremos cerses ou extremos coesivos para ligação, digestão com enzimas de restrição para dar os extremos adequados., preenchimento dos extremos coesivos conforme adequado, tratamento com íosfotass alcal iria para evitar ligações indesejáveis e ligação com ligases adequadas, 0 presente invento inclui a expressão da enzima pretendida em células procar iôí-icas ou eucar ióticas. Hospedeiros eucs-rióticos preferidos incluem leveduras, fungos (especialmente Aspergi 1lus 3, células de mamíferos Ciais como, por exemplo, células humanas ou de primatas) in vivo ou em cultura de tecidos.

As leveduras são os hospedeiros preferidos da presente invenção. A utilização de leveduras proporciona vantagens substanciais pelo facto de as leveduras poderem fazer modi f icações dos peptídeos após a tradução, incluindo glicosilação. Existe uma série de estratégias de DMA recombinsnte que utilizam sequências promotoras fortes e plasmideos de elevado número de cópias que podem ser utilizados na produção das proteínas pretendidas em levedura. As leveduras reconhecem sequências líder em produtos de genes clonados de mamíferos e secretam peptídeos portadores de sequência líder (i.e., pré-peptídeos). As células de mamífero proporcionam modificações pôs-tradução a moléculas de proteína incluindo enrolamento correcto ou glicosilação nos sítios certos.

As células de mamífero que podem ser úteis como hospedeiros incluem células de origem fibroblástica tais como VERO ou CH0-K1 e seus derivados. Para um hospedeiro mamífero, existem! vários sistemas vector possíveis para a expressão da enzima pretendida. Pode ser empregue uma grande variedade de sequências reguladoras da transcrição e da tradução, dependendo da natureza > 25

do hospedeiro. Os sinais reguladores dei transcrição e da tradução podem ser derivados de fontes virais, tais como adenovirus, vírus do papiloma bovino, vírus símio ou similares, sempre que os sinais reguladores estejam associados a um gene particular que tem um nível de expressão elevada. Como alternativa podem ser empregues promotores de produtos de expressão de mamíferos, tais como actina, colagénio, miosina, etc.. Podem ser seleccionados sinais reguladores da iniciação da tradução que permitam a repressão ou activaçao, de modo a poder-se modular a expressão dos genes. São de interesse os sinais reguladores que sejam sensíveis â tempera..... tura de tal modo que variando a temperatura, a expressão pode ser reprimida ou iniciada ou que estejam sujeitos a regulação química, e.g. metabolito. A expressão da enzima pretendida em hospedeiros eucariá-ticos requere a utilização de sinais reguladores eucarióticos. Tais regiões incluirão em geral uma região promotora suficiente para dirigir a iniciação da síntese de RNA. Promotores eueariõ-iicos preferidos incluem o promotor do gene de metalitioneina 1 de ratinho EHamsr, 0., et al. , J, Ho 1. App 1. Cen. 1.; 273-288 <1382)1; o promotor TK dos vírus Herpes <Md<night, 8., Cel1 31_!3δ5-355 <1982)3; o promotor precoce de Sv40 ESenoist, €., ei al., Mature (London> 290;304-310 <1981)3; o promotor do gene gal4 de levedura Íl-Johnsion, 8. A., ei al . , Proc . Ma ti .___Acad. Sei. < USA) 81,!5951-59SS <1984)3.

Como é largamente conhecido, a tradução de mRMA eucar-ioiico é iniciada no codão que codifica a primeira meiionina. Por esta razão, ê preferível assegurar que a ligação entre um promotor eucariãtico e uma sequência de DMA que codifique a enzima pretendida (ou um seu derivado funcional) não contenha quaisquer codões intervenientes que sejam capazes de codificar uma mstio-nina <i.e. AUQ). A presença de tais codões resulta na formação de 27

uma proteína de fusão (se o cod-Io AU6 estiver na mesma grelhai de leitura da sequência de DMA codificadora da enzima pretendida) ou numa mutação por desvio da grelha de leitura /se o co dão AUQ não estiver na mesma grelha de leitura da sequência codificadora da enzima).

Hospedeiros procarióticos preferidos incluem bactérias tais como EL__£Sll^ iâ£lllus> Stregtomyces, P^udomonas, Salmon-, §i.M> Serratia, © tc.. 0 hospedeiro procariótico mais preferido é §L______coli. Hospedeiros bacterianos de interesse particular incluem E. coli K12 estirpe 294 CATCC 31446), E. coli X177S CATCC 31537), rr_™, lanbda-, prototrôfica CATCC 27326)3 e outras

ir-.___cjs i. j. «W I J. v t P enterobactérias (tais como Salmonella typhimurlum ou Serratia marcescens) a várias espécies de Pseudomonas. 0 hospedeiro pro-cariôtico deve ser compatível com o replicão e com as sequências de controle no plasmídeo de expressão.

Para expressar a enzima pretendida Cou um seu derivado funcional) numa célula procariôtica Ctal como, por exemplo, E. £211* i-,_____subtlM.!, Pseudomonas, StoEÍ201I2SS, etc.) é necessário ligar operacionalmente a sequência codificadora da enzima pretendida a um promotor procariótico funcional. Tais promotores podem ser constitutivos ou, de preferência, reguláveis íi. e., induzíveis ou desreprimíveis). Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor int do bacteriófago .. e o promotor bla do gene da B-iactamase do pBR322, etc. Exemplos de promotores procarióticos indutíveis incluem os principais promotores esquerdo e direito do bacteriófago . . CP, _ riR>, os promotores trp, recA, lacZ, lacI, ga1 e ta1 de £. coli, a oí-amilase CUlrsanen, l.s SlJêLL·.. l^-Sacterigl^ 162:1 76-182 <1985)3, os promotores específicos de or-23 de l^sybMlls ESilman, Μ. Z. , et........ai,., gene. 32:11 — -20 <1884)3, os promotores dos bacteriófagos de Bacillus [Sryczan, T.J., Em; The Molecular Blology of the Baciíli, Academic Press, Inc., MY <1882)3 e promotores de Sirspiomyces <Ward, J. H., ei 28

' ·ί· :« 1 ai .; Moi. Gen. 6enet. 203;468-478 (Ί386)3. Os promotores procs- riôticos foram revistos por Glick, 8.R., CJ. Ind._____Hlcrobiol. JL,; 277-282 <1387)3; Cena ti empo, Y. EBiochimie 68:505-518 <1386)3; s Gottesman, S. EAnn. Rev. Gsnet. i_8; 41S-442 <1384)3. A expressão correcta numa célula procariôtica também requere a presença de um sitio de ligação ao ribossoma a montante da sequência codificadora do gene. Tais sítios de ligação aos ribossomas estão descritos, por exemplo; por Sold. L. , st ai. têDIL.......fígv.^..MÍcrob.io.l...... 35 ί 365-404 <1981)3. A sequência codificadora da enzima pretendida e um promotor operacionalmente ligado podem ser introduzidos numa célula procaráóiica ou eucariôtica recipiente como uma molécula de DMA <ou RN A) não repli cativa, a qual pode ser uma .molécula linear ou de preferência uma molécula circular covaieniemenie fechada. Uma vez que tais moléculas são incapazes de replicação autónoma; a expressão da enzima pretendida pode ocorrer através da expressão transitória da sequência introduzida. Como alternativa, a expressão permanente pode ocorrer através da integração da sequência introduzida no cromossoma hospedeiro.

Numa realização, emprega-se um vecior que á capaz de integrar as sequências de gene pretendidas no cromossoma da célula hospedeira. As células que têm estávelmente integrado o DMA introduzido nos seus cromossomas podem ser seleccionados através de introdução simultânea de uma ou mais marcas que permitam selecção das células hospedeiras que contem o vector de expressão. A marca pode complementar uma auxotrofia no hospedeiro <como seja leu____2 ou ura3, as quais são marcas auxotrôficas comuns em leveduras), resistência a biocidas, e.g., antibióticos, ou metais pesados, tais como cobre ou similares. 0 gene da marca seleccionável pode w ser directamenie ligado às sequências de' £)NA de gene a ser expresso ou introduzido na mesma célula por co-transíseção.

Numa realização preferida, a sequência introduzida ssra incorporada num plasmideo ou vecior virai capaz de replicaçSo autónoma no hospedeiro recipiente. Qualquer um de uma, larga variedade de vectores pode ser empregue com esta finalidade. Os faciores importantes na sslecção de um plasmideo ou vecior virai particular incluem; a facilidade com que as células recipientes que contêm o vecior podem ser reconhecidas e seleccionadas de entre as células recipientes que não contêm o vecior; o número de cópias do vecior que são pretendidas num hospedeiro particular; e se é desejável poder-se fazer o "vai-vem" do vecior entre células hospedeiras de diferentes espécies.

Pode ser utilizado qualquer um da série de sistemas de expressão de genes em leveduras. Exemplos de tais vectores de expressão incluem o circulo 2-micron de levedura, os plasmideos de expressão YEPÍ3, YCP e YRP, etc., ou seus derivados. Tais pias-mídaos são bem conhecidos EBoisiein, D. et al., Hiami Wnir Symp. 12,1265-274 ¢1982): Broach, J.R., Em; The Molecular Biology of the Υ®£§1·......___LAJJe_Çjrç2s-MBd ......Inher iíanes, Cold Spring

Harbor Laboraiory, Cold Spring Harbor, NY, pág. 445.....470 (1981);

Broach. J.R., Cel1 28;203-204 (1982)]. YEP13 é o vecior preferido de pressn te invenção.

Para um hospedeiro mamífero existem vários sistemas vecior possíveis para a expressão. Uma classe de vectores utiliza elementos de DMA que proporcionam plasmideos extra-cromossómicos de replicação autónoma, derivados de vírus animais tais como vírus do papiloma bovino, vírus polioma, adenovirus ou vírus SV40. Uma segunda classe de vectores baseia-se na integração das sequências de genes pretendidos no cromossoma hospedeiro. As 30

células que têm estávelmente integrado o DMA introduzido nos seus cromossomas podem ser seleccionadas introduzindo também uma ou mais marcas que permitem a selecção de células hospedeiras que contem o vecior de expressão. A marca pode proporcionar prototro-! bia a um hospedeiro auxotróíico, resistência a biocidas, e.g. antibióticos ou metais pesados, tais como cobre ou similares. 0 gene da marca seleccionâvel pode ser directamente ligado a sequências de DMA a serem expressas ou introduzido na mesma célula por coiransíormação. Podem ser também necessários elementos adicionais para a síntese óptima de mENA. Estes elementos podem in- i cluir sinais de "splicing", assim como promotores das transcrição, poienciadores e sinais de terminação. Os veciores de expressão de cDMA incorporando tais elementos incluem os descritos por Okayama, H., Hoi. Cell. Siol. 31280 (1383) e outros.

Vectores procarióticos preferidos incluem piasmideos tais como os capazes de se replicarem em E. coli Ciais como, por exemplo, pBE322, ColEÍ, pSCiOi, pACYC 184, rrVX. Tais piasmideos sao, por exemplo, descritos por Mamiaiis, I., et al. (Em; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, MY (1382)3. Piasmideos de £?aci 1 lus incluem pC194, i pC221, pT127, etc.. Tais piasmideos estão descritos por Cryczan, ?'., (Em; The Molecular Biology of the Sacilli, Academic Press, MY (1982), pág. 307-323). Piasmideos de Streptomyces adequados incluem pIJlOl EKendalI, K.J., et- al . , J. Saeteriol. 1 β9 I 4177-4183 (1387)3 e bacteriófagos de Streptomyces tais como 0C31 CChater, , !<. F. , ei a 1. , Em; Sixth International Symposium -2Ι1_™Α£ΜΠ2ΜΖ£.§Ζ tales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (13863, pág. 45-543. Os piasmideos de Pseudomonas foram revistos por -John, •J.F., et al., CRev. Infect. Pis. 8;693-704 <198633 e Izaki, K. CJeíL-JL··......Bacleriol^. 33:723-742 (13873 3. 31

Uma vez o vector ou sequência de DMA contendo as construções tenham sido preparados para expressão, as construções de DMA podem ser introduzidas num hospedeiro adequado. Podem ser empregues várias técnicas, como sejam a fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio, eiectroporação ou outras técnicas convencionais. Após a fusão, as células são cultivadas em meio e despistadas quanto às actividades adequadas. A expressão da sequência pretendida resulta na produção da aminopeptidase específica de substrato. A aminopeptidase específica de substrato da invenção pode ser isolada e purificada a partir das moléculas recombinantes atrás descritas de acordo com métodos convencionais tais como extracção precipitação, cromatografia, cromaiografia de afinidade, electroforese ou similares.

V. UTILIZAÇÕES DE AMINOPEPTIDASE ESPECIFICA DE SUBSTRATO

Qualquer uma. das aminopeptidases especificas de substrato do presente invento uma vez produzida e purificada pode ser usada, por exemplo, num ambiente farmacêutico ou de produção para remover certos resíduos amino-terminais (consistente com a especificidade de substrato de cada enzima como se mostra nas Tabelas 2 e 3 abaixo) de peptideos © proteínas para as quais se deseje tal remoção de modo a aumentar a sua estabi1 idade, solubilidade, actividads biológica, ssmi-vida biológica, etc. ou para diminuir a imunogeneicidade do peptideo ou proteína. Em adição pode ainda ser usado para clivar proteínas e polipeptideos de acordo com as suas espec i f ic idades de substratos, 32

A aminopeptida.se especifica ds substrato pode ser incubada com um substrato pretendido como uma enzima solúvel ou pode ser imobilizada, por meios bem conhecidos, num suporte sólido (como seja por exemplo, vidro, borracha, plástico, celulose, etc.)

Tendo agora descrito de um modo gerai esta invenção, a mesma será melhor compreendida por referência a exemplos específicos os quais são aqui incluídos apenas com fins ilustrativos não pretendendo serem limitantes a menos que seja espscificado.

£ x £ m p i- Q_____L kykiU!iA,,,pE......células......e p;iEF:AjiãCA.CL„j2£..... gMllur_a......e _ a rmazenamento......de células A estirpe de levedura TD 71.8 /Alfa, ino3, 1eu2, his3, l.ys2> foi cul tivacla a 30° C em í litro de meio YPD (1¾ cie extrac— to de levedura, 2% Bacto-peptone, 2% glucose) até A.......-, ......

few I células foram colhidas por centrifugação a 3 SOO rpm durante 10 min a 4o C. 0 sedimento í,„25 g) foi ressuspenso em 25 ml de meio YPD contendo 15¾ gliterol s gusrd&clo a -70° C.

Fmearaçgto de extractos celulares.......totais

Descongelaram-se células de levedura congeladas (...... SOO g de peso seco) num banho-mar ia a 30° C e colheram-se por centrifugação a 3.SOO rpm durante 10 minutos á temperatura ambiente. 0 sedimento foi ressuspenso em 1 litro do tampão S (sorbitol í M, 50 mM Tris, ph 7,8, 10 mH MgCl.~,, 3 mH DTT) contendo 50 mg de li-ticass. Esta mistura foi incubada a 30 6 C durante 2 horas com agitação para induzir a formação ds esíeroplastos. Os esíeroplas™ tos foram colhidos por centrifugação a 3.SOO rpm durante 10 minutos a 40 C e lavados por ressuspensão suave em í litro de tampão S frio, colhidos por csntrifugação a 3.500 rpm durante 10 minutos s rsssuspsnsos suavemente em 500 ml de tampão A (10 mH HEPES-K', ph 7,0, IjS ríiíl MgCi.~,, 10 mH KC1 s 0,5 mH DITO. Todos os passos subsequentes foram efectuados a 4o C. Os esferoplastos foram 11-sados neste tampão hipotónico por 12-15 estocadas com um pistão bem ajustado seguido de 15-20 estocadas com um pistão mais laço num homogeneizador Qounce e depois a concentração final de HC1 foi ajustada 0,2 H com uma solução fria de 2 H KC1. 0 lisado foi agitado em gelo durante 30 minutos e os detritos foram removidos por centrifugação a 17 000 rpm durante 30 minutos. Adicionou-ss glicerol até 10% em todos os tampões usados nos processos de purificação subsequentes para estabilizar mais a aminopeptidase.

As fracçSes foram testadas quanto á actividad© especifica de substrato como descrito atrás. EXEMPLO__2

BmEicaagLBft......adiw£Pi.ma.§i......εβρε^λειμ.....bs.....suBsiBaia ΪΣΜ£ίΕΐΜ^Μ...^1ίΙ.^ΜΪΙΛΪο.....de^yrgnio 0 lisado bruto foi concentrado para 100 ml usando uma membrana de ultraíiltração e diaiisado três vezes contra 2 litros de tampão H CÍ0 mH HEPES-K+, ph 7,35, 1,5 mH HgCl.-,, 0,5 mH DTT, glicerol) contendo 0,05 H KC1 . Foi então aplicado numa coluna de CM-Sepharose CL-SB (2,5 x 45 cm) que tinha sido ligada a uma coluna de CM-Sepharose CL-SB (2,5 x 45 cm) de tal 34 34

modo que o eluato da coluna de CM-Sepharose GL-SB foi aplicado continuamente á coluna de DEAE-Sepharose C1.....SB. Ambas as colunas tinham sido equilibradas contra o mesmo tampão usado na diálise. Estas duas colunas ligadas foram sntao eluídas com 2 litros de tampão H contendo 0,05 KC1. 0 eluato de SOO mi da coluna de DEAE--Sepharose CL..-6B foi colhido. Adicionou-se sulfato de amónio sólido <260,4 g) a este eluato para íszer uma solução saturada da sulfato de amónio a 50% a 4o C. Agitou-se durante a noite a 4o C s o precipitado foi removido por centrifugação a 10.000 rpm durante 30 min. Adicionou-se sulfato de amónio sólido (188,4 g> ao sobrenadante para fazer uma solução saturada de sulfato de amónio a 80%. Agitou-se durante a noite e o precipitado foi colhido por centrifugação a 10.000 rpm durante 30 min a 4o C. Este precipitado foi redissolvido numa quantidade mínima de tampão H contendo 0,2 KC1. 0 precipitado redissolvido foi dialisado três vezes contra i litro de tampão H (10 mH HEPES-K*-, ph 7,35, 0,5 mil DTT, 1,5 glicerol) contendo 0,2 H KC1. Um volume igual de solução saturada de sulfato de amónio a 80%, 10 mH ΗΕΡΞ8--í<+, pH 7,35, 10% glicerol, 0,02 NaN..,, foi adicionado á solução contendo aminopeptidase. Esta mistura foi aplicada numa coluna de Pheny1-Sepharose CL-48 (1,2 x 20 cm) equilibrada com solução saturada de sulfato de amónio a 40%, 10 mH HEPES-K’, pH 7,35, 10% glicerol, 0,25 mH DTT, 0,1 H KOI, 0,02% NaN.-,. A coluna foi primeiro aluída com 50 ml do mesmo tampão descrito atrás e depois com um gradiente linear de 40% (100 ml) a 0% (100 ml) de solução de sulfato de amónio, 10 mH HEPES-K-1, pH 7,35, 10% glicerol, 0,25 mH DTT, 0,02% MaN.-,, 100 mH KCl a 79 ml/hr. Colheram-se fracçSes o (3,95 ml). As fracedes 45 a 53 e 81 a 93 foram reunidas 35 -

separadamente. A aminopeptidase nas fracçdes 4-5 a 53 foi designada APí; a presente nas íracçSes 81-33 foi designada AP122. A AP122 foi ainda purificada numa coluna de hidroxilapati te. Apl foi aplicado numa coluna de Sepharose CL-SE·'. .....jSlMroxllapati te.

As fracçdes reunidas 181-33) da cromaiograíia em Phenyi--Sepharose CL-6B foram encontradas para 5 ml usando uma membrana de ultrafi1traçlo PH-10. A fracção concentrada foi dialisada três vezes contra 1 litro de tampão de potássio 0,01 M, 0,5 mH DTT, 1,5 HgCl.,, 0,2¾ NaN.-,, 5 mH KC1, 10¾ glicerol e aplicada numa coluna de hidroxilapatite (2,5 x 20 cm) equilibrada com o mesmo tampão usado na diálise. A coluna foi aluída com um gradiente linear de 0,01 M a 0,5 H de tampão de fosfatos de potássio, 0,2¾ hiaM 3, 5 mH KCl, 10% glicerol a 13,1/hr. Colheram-se fracçdes (3,82 ml). As fracçdes contendo aciividade de aminopeptidase foram reunidas.

Cromatografia......em Sepharose,......CLr4B

As fracçdes reunidas (45 a 53) da cromatografia em rhenyl--Sepharose CL-4B foram concentradas para um volume de 2 ml usando uma membrana de ultrafiltração PH-10. Dialisou-se três vezes contra 1 1 de tampão H contendo 0,2 M KCl e aplicou-se numa coluna de Sepharose CL-6B (2,0 x 30 cm) equilibrada com o mesmo tampão usado na diálise. A coluna foi eluida com o tampão H contendo 0,2 H KCl a 18,5 ml/hr. Colheram-se as facçSes (3,7 ml). As fracçdes contendo activida.de de aminopeptidase foram reunidas. 36 ; - λ i (. - Os perfis das fracções contendo actividade de aminopepti-das© especifica de substrato estSo apresentados na Tabela 1.

Tabela i

Perfil das fracções contendo actividade

Coxuna

Dados actividade Concen- Conductivi—

Fracçso # nái4 traçao dade média Proteica das fracções 280 nm$ aciivas (ms )

AP1 Pheny1-Sepharose CL-4B Sepharose CL-6B 43-53 53-53 O, 0,583 2,73 0,673 67,3 AP122 Phenyl-Sepharose CL-4B H i droxi1apa t i te 81-33 93-101 ij, :-:vy 0,240 2,329 0,243 3, 1 # Absorvência é a medida das fracçâes activas reunidas EXEMPLO 3 QéàJMM......MLEE2Q......HPLmJLâR......

ELECTROFORESE ΕΝΘΕΕ DE SOS-POLIACRIjlIDA A electroforese foi efectuada de acordo com o método de Laemmli, U.K. ENaiure 227=’680-685 <1970)3 usando um gel de 10%. 0 gel foi corado com azul Coomassie e o peso molecular aparente da AP1 desnaturada foi calculado a partir da mobilidade relativa de 37

padrões proteicos incluindo (í > miosina (205.000), (2) beiaga-lactosidade de E. co1i (I IS.000), (3) fosforiiase de músculo de coelho <37.000); <4) albumina de soro bovino (£6.000) s <5) albumina de ovo C4S.000) e <6) anidra.se carbónica. (29.000). 0 peso molecular aparente de AP1 foi de aproximadamenie 81.000. 0 peso molecular aparente de ΑΡ122 não foi determinado.

§ULiLi±ILLJL^A

Fizeram-se trinta e seis peptideos para estudar a especificidade de substrato das aminopeptidases purificadas do presente invento. Dezoito dos peptideos têm diferentes resíduos de aminoaeidos N-terminais e os restantes dezoito peptideos têm diferentes resíduos de aminoáeidos na penúltima posição amino-terminal . A solução de proteína CÍOjui) a ser testada foi adicionada a 90 ).sl da soluçlío contendo 4 mH H-X-J-P-E-T ou X-I-P-E-T; 10 mH HEPES-K+, pH 7; 35; 0;2 mH CoCl..,, 0,2 H KC1, 1,5 mH HgCI.-,, 0,02% NaN.-,; 30/jg de oxidase de L-aminoàcidos, 3 ,us de peroxidase de rábano silvestre e 20 ,ug de di-hidrocloreto de o-dianisidina. Todas as reacçQes foram efectuadas á temperatura ambiente numa placa de microiiiulaçSo de 96 cavidades e a absorvéneia deieeiada a 414 ou 450 mm. 0 desenvolvimento rápido da cor indica a presença de aciividade peptidase elevada naquele peptídeo especifico. Os resultados destas experiências estão apresentados nas Tabelas 2 e 3. A identidade de X foi designada pelas abreviaturas de uma só letra normalmente usadas para os aminoácidos comuns, V-Val ,· A-Ala, R=Arg, P=Asp, C-Cys, E=Q 1 u, Q=Gln, H=Hi.s, 1 = 11®, L-L.su, K'-1.-/5., íi^Met, F=Phe, P=Pro, S=Ser, T=Thr e W-Trp. 0s

números nas tabe 1 as 2 e 3 representam cálculos qualitativos de actividade; 0 (ne nhuma actividade); 1 (+/-); 2 ( + >; 3 ( + *·/-); 4 ( ..w- \ « fi í' „j„ „j„ B 6 ( ·Ή"-ί-).

Tabela 2 !!· 3· fiei dad ’0 dí 5 s ubstrato! M 1 i a .1.....F - i Identidade de X; V A R D C E Q a H I 1 κ M F P s 1 w ENZIMA! AP1 •J >~2 «!· i3hi 4 v 2 0 0 4 4 3 3 2 í 4 0 0 0 0 λ r,;* ·ι o o 0 0 r.* 0 í 0 0 2 2 2 O Γ) 2 2 0 T abe1 *····~ _ , In. :£> p f“d L f. T 1 c i da ríi e o íe SL ;h str a c O 1 Identidade de Xí V A í~\ 0 C cr L_ Q b u i £ r 0. í l·· íví cr o o I— f \ I ( ! t ·_' T w CM7 T ίνίΛ * ADí 2 ! 1 2 : Ht Λ 0 0 •*l 0 0 0 í 0 A 0 & 0 & P, 0 0 0 1 .λ J .“V-, Hi~ .1 λ.\. .d. •i Λ 1 X. A 0 0 2 o i i 6 0 6 6 1 2 2 *4·

descrito se refira a realiza feridas deve entender que o presente in*™ m i taao. Os f am i 1 iar i soados c oro a roax-er ,x a ve™ •dem ser f ei tos vá r i as mod i f i c a ç >5es ès rea- que ta i s fγ· a· d i f i c açdes devem estar dentro dO ζ·θ bem que o que foi Ecrè.» çdes particulares vento não está t! rão facilmente que podem 11zaçfies desc ri tas âmbito da presente invenção.

Claims (3)

1. Ν' '' — 3CÍ Ν' '' — 3CÍ reivindicações; li - Método para a recuperação de uma enzima aminopepti-da se específica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptídica entre um resíduo de metionina amino-terminal e um penúltimo resíduo de ami noa eido ami no--ter minai seleccionado do grupo constituído por! Vai, Ala. Arg, Cis, SI 1, His, He, Leu, Lis, Mst e Fen a partir de uma amostra contendo a referida aminopeptidasa, caractsrizado por compreender os sagu i n tes passos; (a) recuperação de aminopeptldase bruta especifica de substrato a partir de uma amostra contendo a. referida aminopeptidasa; Cb> sujeição da referida aminopeptidase bruta especifica ou substrato do passo (a) a. c romatograf ia de permuta iòniea em CM-Sepharose e DEAE-Sepharose CL-6B; e Cc> recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada através de prec ipi tacão com sulfato de amónio a partir do eluato da referida cromatografia seriada de permuta iónica.
2. 21· - Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado por compreender ainda os passos de; (d) sujeição da referida aminopeptidase recuperada especifica de substrato do passo Cc) a cromatografia de interaeção hidrófoba em Phenyi-Sepharose e 40 Ο

   Ν' · (s> recuperação de qualquer aminopeptidase específica de substrato purificada através da referida croma tog r a f ia de 1n ter ac ção h i dr ó f ofoa.
3. 31 - Método de acordo com a reivindicação 2, caracteri-zado por compreender ainda os passos dei <f> sujeição da referida aminopeptidase recuperada especifica de substrato do passo Ce) a cromaiograíia em Sepharose CL-SB e 4ã - Método de acordo com uma das reivindicaçôes í a 3, caractsrizado por se obter uma enzima aminopeptidase especifica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um resíduo X amino-terminal e um resíduo Jle adjacente de um peptideo, em que X é um resíduo de aminoácido seleccio-nado do grupo constituído por Arg. Gin, Leu, Met, Fen e Trp. &ê - Método de acordo com uma das reivindicacSes la 4, caracterizado por se obter uma aminopeptidase especifica de substrato que é a aminopeptidase AP1. S§ ~ Método para a recuperação de uma enzima aminopepti™ tíase específica de substrato substancialmente purií icBdm tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um resíduo de metionina amino-terminal e um penúltimo resíduo de aminoácido amino-terminal seleccionado do grupo constituído por a partir de uma amostra contendo a ref eri da ami nopepti dase ssgui ntes passos; caracterizsdo por compreender os <a> necuperacSo da aminopeptidase bruta específica de substrato a partir de uma amostra contendo a referida aminopepiidase; <b) sujeição de referida aminopeptidase bruta específica de substrato do passo (a) a cromatografia de permuta iónica; e <c> recuperação de qualquer aminopeptidase específica de substrato purificada através de precipitado com sulfato de amónio a partir de eluato da referida cromatografia de permuta iónica. 7§ - Método de acordo com a reivindicacêío 6, caracteri-zado por compreender ainda os passos de! <d> sujeição da referida aminopeptidase recuperada especifica de substrato do passo <.c') a cromatograíia de interacçSo hidrôfoba em Phenyi-Sephaross; s <e) recuperação de qualquer aminopeptidase específica de substrato purificada pela referida cromatograf ia de interacção hidrôfoba em Phenyi-Sepharose. Si - Método de acordo com a reivindicação 7/ caracteri-zsdo por compreender ainda os passos de; íf> sujeição da referida aminopeptidase recuperada especifica de substrato do passo (s) a cromatoaraí ia de hidroxilapatite; e Cg) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela referida cromato-grafia de hidroxilapatite. 3§í - Método de acordo com uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado por se obter uma enzima aminopeptida.se especifica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um resíduo amino-terminal X e um resíduo íle adjacente de um papiídeo, em que X é um resíduo de aminoácido seleccio-nado do grupo constituído por Vai, Ala, Arg, €íln, His, Ile, Leu, Met, Fen, Pro, Ser, Ire e Trp. íOâ - Método de acordo com uma das reivindicações S a 3, caracterizado por se obter uma aminopeptidase específica de substrato que é aminopeptidase APÍ22. íí-ã - Processo para a preparação de uma molécula de DMA recombinante, caracterizado por se incorporar na referida molécula uma sequência genética codificador® da aminopeptidase específica de substrato da reivindicação S. 12§ - Processo para preparação de uma molécula de DMA recombinante, caracterizado por se incorporar uma sequência

   genéiica codificadora da aminopspiirfase especifica de substrato da reivindicaclo 10. 13i - Processo para obtenção da aminopepiidase especifica de substrato API da reivindicação 5, caracterizado por ser produzida através da expressão de uma molécula recom-binante. 14§ ~ Processo para o obtenção de aminopeptidase específica de substrato AP 122 da rei vindi cação 10 , caracteri— zado por ser produzida através da expressão de uma molécula recombinante. ISi - Hétodo para a remoção de um resíduo de metionina amino-ierminal de um peptideo contendo o referido resíduo amino-terminal e contendo como penúltimo resíduo de aminoâcido amino-terminal um aminoâcido seleccionado do grupo constituído por Vai, Ala, Arg, Cis, Qli, His, He, Lis, Het, Fen e Leu, caracterizado por compreender a incubação do referido peptideo na presença da aminopepti..... dase de substrato API, para assim remover o referido resíduo amino-terminal. 16ã - Hétodo para a remoção de um resíduo de metionina amino-terminal de um peptideo contendo o referido resíduo amino-ierminal e contendo como penúltimo resíduo de ami-noâcido amino-terminal um aminoâcido seleccionado do grupo constituído por Arg, Cis, Qli, His, Ile, Lis, Het, Fen, Ser, Tre e leu, caracterizado por compreender a incubação do referido peptídeo na presença da aminopepti..... dase específica de substrato AP122, para assim remover o referido resíduo amino-terminal. Í7Ê - Método para a remoção de um resíduo X amino-terminal de um peptídeo contendo o referido resíduo X terminal e um resíduo He adjacente em que X é seleccionado do grupo constituído por Arg, Θΐη, Leu, net, Fen e Trp, caracte-rizado por compreender a incubação do referido peptídeo na presença de aminopeptidase especifica de substrato APi para assim remover o referido resíduo amino-terminal. 18§ - Método para a remoção de um resíduo X amino-terminal de um peptídeo contendo o referido terminal X e um resíduo íle adjacente, em que X é seleccionado do grupo constituído por Vai, Ala, Arg, 61n, His, Ile, Leu, liei, Fen, Pro, Ser, Ire e Trp, caracterizado por compreender a incubação do referido peptídeo na presença da aminopeptidase específica de substrato AP122 para assim remover o referido resíduo amino-terminal. ÍSi - Método de acordo com qualquer um® das reivindicações 15-18, caracterizado por a referida aminopeptidase específica de substrato ser imobilizada num suporte sólido. L i sboa 11 de Setembro de 1389

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Gíicid da Prepristóe Industrial «UA VICTCfl COBD@N, 10-A, 1/ 1200 USBQ&