PT91685A - Metodo para o isolamento, purificacao e caracterizacao das aminopeptidases: mas ii e mas iii - Google Patents

Description

-3-

Campo da Invenção A invenção ê dirigida para o.isolamento e purificação de aminopeptidases especificas de substrato e para as próprias enzimas.

Fundamento da Invenção

As enzimas que são capazes de clivar uma ligação peptidica entre o residuo amino-terminal de uma proteína ou peptideo e um residuo de aminoácido adjacente são conhecidas como "aminopeptidases11. Tais enzimas foram identificadas numa variedade de microorganismos, tais como E. coli, Bacillus 1icheniformis , Bac i1lus subtilis, Salmonella thyphimurium e Mycoplasma salivarium (Cárter, T. H. et a_K , J. Bacteriol 159: 453-459(1984) ;Hayashi, S., J. Biol Chem. 259:10448-10454(1984);Hermsdorf C.L.,

Biochem. 17:3370-3376( 1978); McHugh, G.L. et al. ,J.Bacteriol 120:364-371( 1974); Mi 1 ler C.G.et al.,J.Bacteriol 135:603--611( 1978),Simmonds, S., Biochem 9: 1-8(1970); e Shibata, K. et al., J. Bacteriol 169:3409-3414(1987)).

Um exemplo de uma aminopeptidase é a aminopeptidase especifica de leucina produzida na mucosa intestinal e rins de mamíferos.A aminopeptidase especifica de leucina do fluido intestinal de suino foi purificada e caraeterizada e observou-se possuir um ião Zn+^.A enzima tem uma especificidade de substrato larga relativamente ao residuo N-terminal do peptideo substrato. Através da hidrólise sucessiva de ligações peptidicas N-terminais, ela pode degradar peptideos dando origem a aminoácidos li- +2 vres. Encontrou-se que a enzima é activada por Mn , o +2 qual ê capaz de substituir o ião Zn (Wnite, A. et al.,

Em:Principies of Biochemistry, 5th Ed. Mc Graw ΗΠΙ,ΝΥ,ΝΥ (1973)). Um segundo exemplo de uma amlnopeptidase é a ami-nopeptidase especifica de metionina de E, col i (Ben-Bassat et al_., J. Bacteriol 169:751 -757( 1987). Sherman , F. et al., (BioEssays 3:27-31(1985)) fez uma discussão teórica acerca das propriedades das aminopeptidases.

As leveduras, e em particular, a levedura Saccharomyces cerevisiae também contem aminopeptidases .Trumbly, R.J. et al.,(J. Bacteriol 156:36-48(1983)), por exemplo, identificou em levedura uma aminopeptidase de leucina que ê capaz de clivar um peptideo contendo leucina. As peptidases de levedura foram revistas por Achstetter, T. et al.,(Yeast 1: 139-157(1985)), cuja referência é aqui incluída como referência. As aminopeptidases são também produzidas no intestino delgado humano(Martin, D.W., et al., Em: Harper's Review of Biochemistry 19th Ed., Lange Medicai Publications, Los Altos, CA (1983)).

As aminopeptidases são importantes no processamento e degradação de peptideos e proteinas.Elas têm sido usadas como alternativa â degradação de Edman na determinação da sequencia de aminoácidos de polrçeptideos e proteínas.

As aminopeptidases especificas de substrato podem também ser usadas para clivar especifi-camente resíduos de aminoácidos do extremo amina de uma proteína ou peptideo.Assim, tais enzimas podem ser importantes na reiDção de sequências sinal, sequências de localização nuclear, sequências lider, sequências, de secreção,etc., as quais podem estar presentes no extremo amino-terminal de um peptideo ou proteína. Uma vez que muitas proteínas produzidas através da tecnologia de DI\!A recombinante ou por outros meios contêm tais sequências, as aminopeptidases podem ser usadas para converter tais moléculas nas suas formas

Armaduras e/ou funcionais.A identificaç-ão; e disponibi 1 idade de outras aminopeptidases especificas de substrato ê pois altamente desejável.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, aminopeptidases especificas de substrato, capazes de clivar a ligação peptidica entre o grupo carboxilo de um resíduo de aminoácido amíno-terminal particular e o grupo amina de um residuo de aminoácido adjacente foram isoladas e subs tancialmente purificadas. A presente invenção está portanto relacionada com a purificação destas enzimas, com as utilizações destas enzimas e com as próprias enzimas substancialmente purificadas.

Detalhadamente a invenção diz respeito a uma enzima aminopeptidase especifica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um residuo de metionina amino-termi-nal e um penúltimo residuo de aminoácido amino-terminal seleccionado do grupo constituído porrAla, His, Leu, Lis e Fen. A invenção também diz respeito a uma enzima aminopeptidase especifica de substrato substancia^ mente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um residuo amino-terminal X e um residuo 11 e adjacente de um peptideo, em que X ê um residuo de aminoácido seleccionado do grupo constituinte por:Leu e Met. A invenção também diz respeito a uma enzima aminopeptidase especifica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação -6-

peptidica entre um resíduo de metionina^amino-terminal e um penúltimo residuo de aminoácido amino-terminal seleccio-nado do grupo constituído por: Vai, Ala, Arg, Asp, Cis,Glu, Gin, Gli, His, Ile, Leu,Lis, Met, Fen, Pro, Ser, Tre e Trp. A invenção também diz respeito a uma enzima aminopeptidase especifica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um residuo amino-terminal X e um residuo de Ile adjacente de um peptideo, em que X é um rseiduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por: Ala,Asp, Gin, His, Leu, Met, Fen, Ser, Tre e Trp. A invenção também diz respeito âs aminopeptidases especificas de substrato atrás descritas que são MAS II e MAS III. A invenção também diz respeito a uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequencia genética codificadora de qualquer uma das aminopeptidases especificas de substrato atrás descritas. A invenção também diz respeito a qualquer uma das aminopeptidases especificas de substrato atrás descritas que ê produzida através da expressão de uma molécula recombinante. A invenção também proporciona um método para a recuperação de qualquer uma das aminopeptidases especificas de substrato, substancialmente purificadas atrás descritas a partir de uma amostra contendo a aminopeptidase caracterizado pelos seguintes passos: (a) recuperação de aminopeptidase bruta especifica de substrato a partir de uma amostra contendo a aminopeptidase; -7-

(b) sujeição da aminopeptidase bruta especifica de substrato do passo (a) a cromatografia de permuta iónica;e (c) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela cromatografia de permuta ióni-ca. A invenção engloba ainda o método atrás descrito que se caracteriza também pelos passos de: (d) sujeição da aminopeptidase especifica de substrato recuperada do passo (c) a uma segunda cromatografia de permuta iónica;e (e) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela segunda cromatografia de permu- . ta iónica. 0 invento também proporciona um método para a remoção de um resíduo de metionina amino-ter-minal de um peptideo contendo o residuo amino-terminal e contendo como penúltimo residuo de aminoácido amino-terminal um aminoácido seleceionado do grupo constituído por:Ala,

His, Leu, Lis e Fen, método esse que se caracteriza pela incubação do peptideo na presença da aminopeptidase especifica de substrato MAS II para assim remover o residuo amino--terminal. A invenção também proporciona um método para a remoção de um residuo de metionina amino-terminal de um peptideo contendo o residuo amino-terminal e contendo como penúltimo residuo de aminoácido amino-terminal um aminoácido seleceionado do grupo constituído por Val,Ala,.Arc Asp, Cis, Glu, Gin, Gli, His, I1e, Leu, Lis,Met,Fen,Pro,Ser, Tre e Trp, método esse que se caracteriza pela incubação do peptideo na presença da aminopeptidase especifica de 8-

substrato MAS III para assim remover-o .resíduo amino-termi-nal. A invenção proporciona ainda um método para a remoção de um residuo X amino-terminal de um peptideo contendo o residuo terminal X e um residuo I1e adjacente em que X ê seleccionado do grupo constituído por Leu e Met, método esse que se caracteriza pela incubação do peptideo na presença da aminopeptidase especifica de substrato MAS II para assim remover o residuo amino-terminal. A invenção proporciona ainda um método para a remoção de um residuo amino-terminal X de um peptideo contendo o residuo terminal X e um residuo I1e adjacente, em que X é seleccionado do grupo constituído por Ala, Asp, Gin, His, Leu, Met, Fen,Ser, Tre e Trp,método esse que se caracteriza pela incubação do peptideo na presença da aminopeptidase especifica de substrato MAS III para assim remover o residuo amino-terminal. A invenção diz ainda respeito à realização dos métodos atrás em que a aminopeptidase especifica de substrato ê imobilizada n,um suporte sólido. -9-

Descrição detalhada da invenção I. Isolamento e purificação das aminopeptidases especificas de substrato MAS II e MAS III da presente invenção.

De acordo com a presente invenção qualquer uma das aminopeptidases especificas de substrato da presente invenção pode ser isolada a partir de uma amostra contendo a enzima. As aminopeptidases especificas de substrato parecem ser ubíquas, sendo encontradas em todos os eucariotas, incluindo plantas, animais e organismos multi-celulares. Pensa-se que também esteja presente nos procario-tas uma enzima diferente tendo actividade de aminopeptidase especifica de metionina. Assim, qualquer fonte celular ê abrangida nesta invenção. Como aqui é usado, a amostra contendo qualquer uma das enzimas será referida simplesmente como "amostra". A menos que seja especificado como sendo particulares para uma outra das aminopeptidases especificas de substrato da presente invenção, os métodos de DNA recom-binante aqui descritos podem ser empregues para clonar e expressar uma ou ambas as aminopeptidases da presente invenção.

Na descrição que se segue da purificação das aminopeptidases especificas de substrato da presente invenção, a actividade de aminopeptidase pode ser testada por qualquer método conveniente. 0 ensaio preferido para a actividade de aminopeptidase especifica de substrato ê a seguinte: A actividade enzimática pode ser testada usando Met-pNA (para-nitroani1 ida de metionina) ou o peptideo Met-Ala-Ser como substrato. Quando se usa como substrato Met-pNA uma amostra de 10 p1 de cada fracção colhida de uma coluna de cromatografia é adicionada a uma cavidade -10-

marcada de uma placa de microtitulação contendo 45 /ul de uma solução que contem 4 mM-pNA, HEPES-K+ 10 mM, pH 7,35, 0,2mM CoCl2, 0,2 M KC 1, 1,5 mM MgC12* 0,02% NaNg. Todas as reacções foram de preferencia conduzidas usando uma placa de microtitulação. Após incubação durante uma hora à temperatura ambiente, a absorvância da amostra a 414 nm foi determinada usando um leitor de placas.

Quando o ensaio foi conduzido usando Met-Ala-Ser como sustrato, uma amostra de 10 ul de cada fracção colhida de uma coluna de cromatografia foi adicionada a uma cavidade marcada de uma placa de microtitulação contendo 45 /j 1 da solução que contem 4 mM Met-Ala-Ser, 10 mM HEPES-K+, pH 7,35, 0,2mM CoCl2, 0,2M KC1, l,5mM MgCl2, 0,02% NaNg, 10 jug de oxidase de L-aminoácidos, 115 /ug de pe-roxidase de rábano silvestre e 10 jug de di-hidrocloreto de o-dianisidina. As reacções foram efectuadas à temperatura ambiente durante uma hora e registada a absorvância a 450 nm ou a 414 nm. 0 isolamento e purificação das aminopeptidases especificas de substrato do presente invento será daqui em diante descrito a partir de uma amostra de levedura, se bem que se deva entender que outras amostras poderão ser igualmente usadas como fonte de material.

As células de levedura, de preferencia Saccharomyces cerevisiae são cultivadas em meio adequado(de preferencia meio YPD:1% de extracto de levedura, 2% de Bactopeptone, 2% de glucose) para uma A600 de 5-20.

As preparações de células colhidas a uma A^qq de 8 ou a uma Agqq de 18-20 têm actividades equivalentes de aminopeptidase especifica de substrato. As células são colhidas, de preferencia por centrifugação e ressuspensas em meio YPD contendo 15% de glicerol. As células podem ser então congeladas a -11-

-70°C e guardadas durante um periodo de tempo prolongado.

As células congeladas são descongeladas, de preferencia por incubação num banho-maria a 30°C e colhidas por centrifugação à temperatura ambiente.

As células sedimentadas foram ressuspensas num tampão adequado como seja tampão S (1M sorbitol, 50 mM Tris, pH 7,8, 10 mM MgCl.g, 3 mM DTT)suplementado com liticase e incubadas a 30°C para permitir a formação de esferoplastos. Os esfero-plastos foram então colhidos, lavados em mais Tampão S, lisados e homogenizados em tampão hipotónico, como seja o tampão A (10 mM HEPES-K+, pH 7,0, 1,5 mM MgClg, 10 mM KC1 e 0,5 mM DTT). A homogenização ê de preferencia realizada a 4°C usando um homogenizador Dounce. A aminopeptidase especifica de substrato de levedura ê libertada para o lisado celular por agitação suave. Apôs remoção de quaisquer detritos existentes por centrifugação, adiciona-se glicerol ao sobrenadante do lisado (10¾ concentração final) para aumentar a estabilidade da aminopeptidase especifica de substrato. 0 sobrenadante, atrás descrito, do lisado celular foi então concentrado para 100 ml utilizando uma membrana de ultrafiltração PM-10 e dialisado três vezes contra 2 litros de um tampão adequado, como seja tampão H (10 mM HEPES-K+, pH 7,35, l,5mM MgClg, 0,5 mM DTT, 0,2% NaNg, 10% glicerol), suplementado para conter 0,05M KC 1. Os biomateriais celulares residuais presentes no sobrenadante foram rerovidos para evitar a agregação de proteina-biomaterial nos passos subsequentes. Para este processo pode ser usada a cromatografia de permuta iónica.Neste passo, a permuta iónica usada é de preferencia cromatografia em CM-Sepharose, de preferencia empregando CM-Sepharose CL-6B. 0 sobrenadante concentrado foi de preferencia aplicado numa coluna de CM-Sepharose CL-6B que foi ligada a uma coluna de DEAE-Sepharose C1-6B de tal forma que o eluato da coluna de CM-Sepharose C1-6B ê aplicado continuamente na coluna de DEAE-Sepharose C1-6B. Ambas as colunas são equilibradas contra o mesmo tampão usado na diálise.As duas colunas ligadas são então eluidas com 2 litros de tampão H (suple mentado para conter 0,05M KC 1) ou um outro tampão adequado.

As colunas são então desligadas. A coluna de DEAE-Sepharose CL-6B ê eluida com um gradiente linear de 0,05M a 0,5M KC1 em tampão H a aproximadamente 17 ml/h. Colheram-se fracções de aproxi-madamente 5 ml e testam-se qjanto â actividade de aminopepti-dase especifica de substrato. As fracções que contêm actividade de aminopeptidase (tipicamente fracções 41-71 de um total de 143 fracções;conductividade 9,7 ms) são reunidas e concentradas para um volume de 10 ml usando uma membrana de ultrafiltração PM-10. 0 eluato concentrado da cromatogra-fia em DEAE-Sepharose CL-6B atrás descrita doi dialisado três vezes contra 1 litro de tampão H (suplementado para conter 0,05M KC 1) e aplicado numa segunda coluna de DEAE--Sepharose CL-6B equilibrada com o mesmo tampão usado na diálise. Esta coluna foi eluida com um gradiente linear de 0,05M a 0,2M KC 1 em tampão H a 18 ml/hr. Colhem-se fracções de 4-5ml e testam-se quanto â actividade de aminopeptidase especifica de substrato. A actividade de aminopeptidase MAS II ê encontrada nas fracções 63-67 (de um total de 143 fracções);a conductividade das fracções reunidas é de aproximadamente 5,4ms. A activiadde de aminopeptidase MAS III ê encontrada nas fracções 74-79 (de um total de 143 fracções); a conductividade das fracções reunidas ê de aproximadamente· 6,6 ms. As fracções activas de cada enzima são reunidas e concentradas para 5 ml usando uma membrana de ultrafíltração PM-10. -13·

Usando esta série 'de passos croma-tográficos purificou-se a aminopeptidase de levedura especifica de substrato MAS III. A enzima tem um peso molecular aparente de aproximadamente 48 000. MAS II foi apenas parcialmente purificada e o seu peso molecular aparente não foi determinado.

Os termos peptideo, polipeptideo e proteina referem-se todos a polímeros de residuos de aminoácidos. Um peptideo ê um polímero de pelo menos dois residuos de aminoácidos ligados um ao outro por uma ligação peptidi-ca. Um polipeptideo é um polímero de vários residuos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptidicas. Uma proteina é um polímero grande de muitos residuos de aminoácidos ligados uns aos outros por uma ligação peptidi-ca. 0 termo "aminopeptidase" como aqui ê usado pretende indicar uma enzima capaz de atacar e clivar a ligação peptidiça que liga o resíduo de aminoácido amino-terminal de um peptideo (e portanto também de um polipeptideo ou proteina) ao penúltimo residuo de aminoácido amino-terminal daquele peptideo(ou polipeptideo ou proteina).

As aminopeptidases do presente invento são "aminopeptidases especificas de substrato".Uma aminopeptidase é referida como sendo "especifica de substrato se apenas certos peptideos ou proteínas (i.e. não qualquer peptideo ou proteina) podem servir como substrato da enzima. Tais substratos adequados possuem residuos amino-terminais e penúltimos residuos amino-terminais particulares que estão ligados por uma ligação pqtidica. A especificidade de substratocb aminopeptidase ê definida como a sua capacidade ou incapacidade para clivar um substrato particular. A especificidade de substrato das aminopepti- -14

dases da presente invenção está definida abaixo. A presente invenção diz respeito a uma enzima aminopeptidase especifica de substrato que está "substancialmente pura" ou que foi "substancialmente purificada". Conforme aqui são usados os termos "substancialmente pura" ou "substancialmente purificada"pretendem ser equivalentes e descrevem uma aminopeptidase especifica de substrato que está substancialmente livre de um composto normalmente associado â enzima no seu estado natural,i.e., uma proteína, açúcar,lípido, etc. .0 termo pretende ainda descrever uma aminopeptidase especifica de substrato que ê homogénea de acordo com um ou mais ensaios de pureza ou homogenidade usados pelos familiarizados com a matéria.

Por exemplo, uma aminopeptidase especifica de substrato substancialmente pura apresentará caracteristicas' constantes e reprodutíveis dentro dos desvios padrões experimentais para parâmetros tais como:peso molecular, técnicas cromato-gráficas, etc. 0 termo "substancialmente pura", no entanto, não pretende excluir misturas artificiais ou sintéticas das enzimas com outros compostos. 0 termo também não pretende excluir a presença de impurezas que não interfiram com a activiadde biológica da enzima e que podem estar presentes, por exemplo, devido a purificação incompleta. II. Caracterização das aminopeptidases especificas de substrato da presente invenção.

Peso molecular de MAS III

Geis de SDS-poliacrilamida da amostra purificada revelam que MAS III migra como uma única banda de peso molecular aparente de cerca de 48 000 quando corados com azul Coomassie. A electroforese foi efectuada segundo o método de Laemmli, U.K. (Nature 227: 680-685 (1970) usando um gel de 10¾.0 gel foi corado com azul

Coomassie Padrões proteicos de 45, 66, 97, 116 e 205 Kd de peso molecular foram usados para calibrar o gel.

Especificidade de substrato

Efectuou-se uma determinação parcial da especificidade de substrato de MAS II e MAS III usando uma série de trinta e seis peptídeos puros.Os pepti-deos tinham uma de duas sequências:

(I) MET-X-ILE-PRO-GLU-TRE ou (II) X-ILE-PRO-GLU-TRE em que "X" refere-se a um dos seguintes dezoito aminoâcidos Vai,Ala,Arg,Asp,Cis,Glu,Gln,Gli,His,Ile,Leu,Lis,Met,Fen, Pro,Ser,Tre e Trp.

Encontrou-se que MAS II é capaz de clivar os peptideos do grupo I em que "X" seja Ala,His, Leu,Lis ou Fen. Nenhum outro peptideo testado do grupo I foi clivado por MAS II. MAS II foi capaz de clivar apenas os peptideos do grupo II em que "X" era Met ou Leu. Nenhum outro peptideo testado do grupo II foi clivado.

Encontrou-se que MAS III ê capaz de clivar qualquer peptideo testado do grupo I. MAS III clivou os peptideos do grupo II em que "X" era Ala, Asp, Gin, His, Leu, Met, Fen, Ser, Tre ou Trp.Nenhum outro peptideo testado do grupo II foi clivado. -16-

III. Engenharia genética das aminopeptidases da presente invenção. A identificação das fracções que contêm actividade· de MAS II ou MAS III substancialmente purificada permite que seja determinada a sequencia de aminoá-cidos destas enzimas e permite ainda que estas moléculas sejam produzidas através da aplicação de técnicas de DNA recombinante.Assim, o presente invento inclui não só MAS II e MAS III substancialmente purificadas e métodos para a sua utilização, como também inclui as sequências de aminoáci-dos destas enzimas, as sequências genéticas codificadoras destas enzimas, veículos contendo tais sequências genéticas, hospedeiros transformados com eles, produção de enzimas atra vês da expressão no hospedeiro transformado e utilização das enzimas na clivagem de peptideos ou proteínas contendo o substrato. MAS II é a aminopeptidase especifica de substrato preferida da presente invenção.

Para se obter a sequencia de aminoá-cidos das enziras, as enzimas nas fracções substancialmente purificadas são recuperadas por exemplo por electroeluição de um gel de poliacrilamida. As moléculas recuperadas podem ser então sequenciadas, de perferencia usando um sequencia-dor automático e a sequencia de aminoácidos da enzima foi assim determinada.

Como alternativa e de preferencia, a sequencia de aminoácidos das enzimas ê determinada através de uma análise do DNA ou ainda mais perferivel, da sequencia de cDNA, do gene que codifica a enzima. Para se obter estas sequências de ácido maleico fez-se o despiste de uma fonte que contem o gene de MAS II ou de MAS III ou a sequencia de cDNA usando sondas oligonucleotidicas que codificam fragmentos da enzima MAS II ou MAS III. -17-

Para preparar as sondas oligonucleoti-dicas, a enzima substancialmente purificada foi recuperada e fragmentada com brometo de cianogénio ou com proteases tais como papaína, quimotripsina, tripsina, etc.(0ike, Y, et a_l_., J. Biol. Chem. 257: 9751-9758( 1982); Liu, C., et al.,-Int. J.Pept. Protein Res. 21 :209-215( 1383)). Os peptideos resultantes foram separados, de preferencia por HPLC de fase inversa e sujeitos a sequenciação de aminoá-cidos.Para se atingir este fim, os peptideos são analisados de preferencia por sequenciadores automáticos.

Uma vez sequenciados um ou mais peptí-deos adequados, as sequências de DNA capazes de os codificar são examinadas. Se os peptideos forem superiores a 10 aminoãcidos de comprimento esta informação da sequencia ê geralmente suficiente para permitir a clonagem da sequencia de um gene como seja os que codificam as enzimas da presente invenção. Devido ao código genético ser degenerado, no entanto, mais do que um codão pode ser usado para codificar um aminoãcido particular (Watson, J.D. Em. :Molecular Biology of the Gene, 3rd Ed., W.A., Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), pág. 356-357). Usarôo o código genético podem ser identificados um ou mais oligonucleotideos diferentes cada um dos quais será capaz de codificar os peptideos da enzima. . A probabilidade de um oligonucleotideo particular constituir de facto a sequencia codificadora do fragmento de enzima pode ser calculada considerando as relações de emparelhamento de bases anormais e a frequência com que um codão particular ê de facto usado(para codificar um aminoá-cido particular) nas células eucarióticas.Tais regras de "frequência de utilização de codões" estão descritas por Lathe, R. et aj_., J. Molec. Biol. 183:1-12( 1985). Usando as "regras de frequência de utilização de codões" de Lathe pode-se identificar um oligonucleotideo ou uma série de oligonucleotideos que contenha a sequencia de nucleotídeos teóricamente "mais provável" capaz de codificar as sequências peptidicas do fragmento enzimático.

As técnicas para a síntese de o 1i-gonucleotideos estão descritas, por exemplo, por Wu, R. et aj_., Prog.Nucl .Acid.Res.Molec.Biol 21:101-141( 1978)). Processos para a construção de moléculas recombinantes de acordo com o método atrás descrito estão descritas por Maniatis, T. et al_,, Em: Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,NY (1984), referência que aqui é incluída por referencia.

Se bem que apenas ocasionalmente, uma sequencia de aminoãeidos pode ser codificada por um sô oligonucleotídeo, frequentemente a sequencia de aminoácidos pode ser codificada por qualquer uma de uma série de o 1i-gonucleotídeos semelhantes. E importante que enquanto todos os membros desta série contêm oligonucleotideos que são capazes de codificar o fragmento peptidico e assim potencialmente contem a mesma sequencia oligonucleoldica do gene que codifica o fragmento peptidico apenas um membro da série contem a sequencia nucleotídica que é idêntica à sequência nucleotídica do gene. Devido a este membro estar presente na série e ser capaz de hibridar com DNA mesmo na presença dos outros membros da série, é possível empregar a série não fraccionada de oligonucleotideos do mesmo modo que se empregaria um único oligonucleotideo para clonar o gene que codifica o peptideo. 0 oligonucleotideo ou série de oligonucleotideos, contendo a sequencia teõricamente "mais provável" capaz de codificar o fragmento peptidico da enzima foi usado para identificar a sequencia de um oligonucleo-tideo complementar ou série de oligonucleotideos que ê capaz de hibridar com a sequencia "mais provável" ou série de sequências. Um oligonucleotideo contendo tal sequencia complementar pode ser empregue como sonda para identificar e -19-

isolar uma sequencia do gene que codifica-a enzima(Maniatis, T. et aK, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1982)). A sonda de DNA pode ser marcada com um grupo detectável. Tal grupo detectável pode ser qualquer material tendo uma propriedade fisica ou química detectável. Tais materiais foram bem desenvolvidos no campo dos imunoensaios e em geral a maior parte das marcas úteis em tais métodos podem ser aplicadas na presente invenção. São particularmente úteis grupos enzimáticemente activos, tais como enzimas(ver Clin. Chem. 22: 1243(1976)), substratos de enzimas(ver Pat. Britânica Espec.1548741) coenzimas (ver Pat. U.S. Nos. 4 230 797 e 4 238 565) e ini-bidores de enzimas (ver Pat. U.S. No. 4 134 792)-.substâncias fluorescentes(ver Clin. Chem. 25:353(1979));cromóforos, substâncias luminescentes tais como quimioluminescentes e bioluminescentes(ver Clin. Chem. 25: 512( 1979)); 1igandos específicamente ligáveis; pares de interacção proximal;e radioisótopos tais como ^H, ^S, ^P, e ^C. Tais mar cas e pares de marcação são detectados com base nas suas propriedades fisicas(e.g. substâncias fluorescentes,cromô-foros e radioisótopos) ou nas suas propriedades reactivas ou de ligação (e.g. enzimas, substratos, coenzimas e inibido res). Por exemplo, uma sonda marcada com um cofactor pode ser detectada pela adição da enzima para a qual a marca ê um cofactor e um substrato.da enzima. Por exemplo, pode-se usar uma enzima que actue sobre um substrato para gerar um produto com uma propriedade fisica mensurável. Exemplos desta última incluem, mas não estão limitadas a beta galac-tosidase, fosfatase alcalina e peroxidase. -20-

Um oligonucleotideo· adequado ou série de oligonucleotideos que ê capaz de codificar um fragmento da sequencia do gene que codifica a enzima(ou que ê complementar de tal oligonucleotideo ou série de oligonucleotí-deos)foi identificado(usando o processo atrás descrito), sintetizado e hibridado, por meios bem conhecfdos na área, com um DNA ou de preferencia uma preparação de cDNA derivado de células que são capazes de expressar a enzima Moléculas de oligonucleotideo de cadeia simples complementares das sequências "mais prováveis" codificadoras do peptideo da enzima podem ser sintetizadas usando processos que são bem conhecidos dos familiarizados com a matêria(Belagaje,R. et al.,J. Biol. Chem. 254:5769-5780(1979);maniatis, T.et õJl_. , Em: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expressim Nierlich, D.P. et al., Eds., Acad.Press, NY( 1976) ;Wu,R.et, al.,Prog. Nucl.Acid Res. Molec. Biol 21:101-141( 1978); Khorana,R.G., Science 203:614-625( 1979).Em adição a síntese de DNA pode ser ccnseguida através de utilização de sinteti-zadores automáticos. As técnicas de hibridação de ácidos nucleicos estão descritas por Maniatis, T. et al.,(EM:Mole-cular Cloning, A. Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor,NY(1982) e por Haymes,B.D., et al.,(EM:Nucleic Acid Hybridization,A Praticai Approach, IRL Press, Washington,DC(1985))as referencias dos quais estão aqui incluídas por referencia.

Uma sequencia de DNA codificadora de MAS II e MAS III pode derivar de uma variedade de fontes. Por exemplo,mRNA codificador de ambas as enzimas pode ser isolado a partir de tecidos de qualquer espécie que produza a enzima e identificados usando o método de transferências Northern(Alwine et al.,Method Enzymol. 68:220-242( 1979) )e sondas oligonucleotidicas marcadas.0 mRNA pode ser então convertido em cDNA por técnicas conhecidas dos familiarizados com a matéria. Como alternativa, DNA genómico pode ser isolado e empregue. A fonte de DNA ou de cDNA usada terá -21-

sido preferencialmente enriquecida na' sèquelicia do gene que codifica a enzima. Tal enriquecimento pode ser mais fácil-mente obtido a partir de cDNA obtido por extracção de RNA das células, tais como células de levedura,que produzam níveis elevados da enzima. Um exemplo de tais células é Saccharomyces cerevisiae.

Qualquer um de uma variedade de métodos pode ser usado para clonar uma sequencia de genes que codificam as enzimas da presente invenção.Um desses métodos engloba a análise de uma biblioteca de inserções de cDNA num vector"Vai-vem"(inserções derivadas de uma célula que expressa as enzimas do presente invento)quanto à presença de uma inserção que contenha uma sequencia do gene, a qual ê capaz de codificar a enzima.Tal análise deve ser conduzida através da transfecção de células com o vector e depois testando a expressão da enzima.

Para identificar e clonar a sequencia do gene capaz de codificar cada uma das enzimas da pre sente invenção faz-se·o despiste de uma biblioteca de DNA ou preferencialmente de cDNA quanto â sua capacidade para hibridar com as sondas oligonucleotidicas descritas atrás. As preparações de DNA adequadas(como seja DNA genômico humano) são clivadas enzimáticamente ou fragmentadas ao acaso e ligadas a vectores recombinantes.A capacidade destes vectores recombinantes para hibridar com as sondas oligonucleotidicas atrás descritas foi então medida. Os vectores que se encontraram capazes de tal hibridação foram então analisados para determinar o grau e natureza das sequências enzimáticas que contêm. Baseado puramente em considerações estatísticas uma sequencia de gene capaz de codificar qualquer uma das enzimas da presente invenção poderá ser identificada sem ambiguidade(através do despiste de hibridação) usando uma sonda oligonucleotidica tendo apenas 18 nucleotideos. -22-

Numa via alternativa de clonagem de uma sequencia dos genes que codificam as enzimas da presente invenção, preparou-se uma biblioteca de vectores de expressão por clonagem de DNA ou, de preferencia, cDNA (derivado de uma célula capaz de expressar a enzima) num vector de expressão. A biblioteca foi então despistada quanto a membros capazes de expressar uma proteína que se liga ao anticorpo especifico da enzima e que têm uma sequência nucleotidica que ê capaz de codificar pol i.pept ideos que possuem a mesma sequencia de aminoãcidos da enzima ou seus fragmentos. Nesta realização, DNA ou, de preferencia, cDNA é extraído e purificado a partir de uma célula que seja capaz de expressar a enzima. 0 cDNA purificado foi fragmentado (por fricção,digestão com endonucleases, etc) para produzir um conjunto de fragmentos de DNA ou de cDNA. Os fragmentos de DNA ou de cDNA deste conjunto foram então clonados num vector de expressão para produzir uma biblioteca genômica ou de cDNA em vetores de expressão cujos membros contêm um único fragmento de DNA ou cDNA clonado.

Assim, resumindo, a identificação das aminopeptidases especificas de substrato do presente invento permite a identificação de uma sequencia de DNA "teóricamente mais provável" ou de uma série de tais sequências, capazes de codificar a sequencia peptidica destas enzimas. Através da construção de um oligonucleotideo complementar desta sequencia teórica(ou através da construção de uma série de ol igonucleotideos complementares da série de oligonucleotideos"mais prováveis")obtem-se uma molécula de DNA(ou série de moléculas de DNA) capazes de · funcionarem como sonda para identificar e isolar uma sequencia de gene capaz de codificar cada uma das enzimas da presente invenção. -23-

Técnicas semelhantes ou iguais às descritas atrás permitiram clonar com êxito genes de aldeido--desidrogenases humanas(Hsu, L.C. et al.,Proc.Natl.Acad.Sei USA 82: 3771-3775(1985),fibronectina (Suzuki, S. et al.,

Eur. Mol. Biol. Qrgan J. 4:2519-2524-( 1985)), o gene do receptor de estrogênios humano(Walter.P. et a 1.,Proc.Natl. Acad.Sei.USA 82: 7889-7893(1985)),activador do plasminogê-nio tipo tecido (Pennica, D. et aJL , Nature 301: 214-221 ( 1983)) e DNA complementar da fosfatase alcalina humana de placenta (Kam, W. et al.,Proc.Natl.Acad.Sei.USA 82:8715--8719(1985)). IV Expressão de sequências codificadoras das aminopeptidases especificas de substrato.

Moléculas de DNA ou de cDNA que codificam a enzima MAS II ou MAS III podem ser operacionalmente ligadas num vector de expressão e introduzidas numa célula hospedeira para permitir a expressão da enzima MAS II ou MAS III pela célula. Duas sequências de DNA(como sejam uma sequencia da região promotora e uma sequencia codificadora da enzima pretendida) são referidas como estando operacionalmente ligadas se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não(l) resultar na introdução de uma mutação de desvio da grelha de leitura, (2) interferir com a capacidade da sequencia da região promotora para dirigir a transcrição da sequencia de gene codificador da enzima pretendida ou (3) interferir com a capacidade da sequencia do gene da enzima pretendida para ser transcrita pela sequencia da região promotora.

Uma sequencia de DNA codificadora de MAS II ou MAS III pode ser recombinada com o DNA vector de acordo com técnicas convencionais, incluindo extremos cerses ou extremos coesivos para ligação,digestão com enzi- -24-

mas de restrição para dar os extremos adequados,preenchimento dos extremos coesivos conforme adequado,tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis e ligação com ligases adequadas. 0 preste invento inclui a expressão da enzima pretendida em células procariôticas ou eucariôticas.Hospedeiros eucariôticos preferidos incluem leveduras, fungos(especialmente Aspergillus),células de mamiferos(tais como, por exemplo, células humanas ou de primatas)j_n vivo ou em culturas de tecidos.

As leveduras são os hospedeiros preferidos da presente invenção. A utilização de leveduras proporciona vantagens substanciais pelo facto de as leveduras poderem fazer modificações dos peptideos apôs a tradução, incluindo gl icosi lação. Existe uma série de estratégias de DNA recombinante que utilizam sequências promotoras fortes e plasmideos de elevado número de cópias que podem ser utilizadas na produção das proteínas pretendidas em levedura. As leveduras reconhecem sequências líder em produtos de genes clonados de mamíferos e secretam peptideos portadores da sequencia líder(i.e., pré-peptídeos).

As células de mamífero proporcionam modificações pós-tradu-ção a moléculas de proteína incluindo enrolamento correcto ou glicosilação nos sitios certos.

As células de mamíferos que podem ser úteis ©mo hospedeiros incluem células de origem fibroblâstica tais como VERO ou CH0-K1 e seus derivados. Para um hospedeiro mamífero, existem vários sistemas vec-tor possíveis para a expressão da enzima pretendida.Pode ser empregue uma grande variedade de sequências reguladoras da transcrição e da tradução, dependendo da natureza do hospedeiro. Os sinais reguladores da transcrição e da tradução podem ser derivados de fontes virais,tais como adeno- -25-

vírus, virus do papilona bovino, virus símio ou similares, sempre que os sinais reguladores estejam associados a um gene particular que tem um nível de expressão elevada. Como alternativa podem ser empregues promotores de produtos de expressão de mamíferos,tais como actina, colagénio,miosina, etc. Podem ser seleccionados sinais reguladores da iniciação da tradução que permitam a repressão ou activação,de modo a poder-se modular a expressão dos genes.São de interesse os sinais reguladores que sejam sensíveis à temperatura de tal modo que variando a temperatura, a expressão pode ser reprimida ou iniciada ou que estejam sejeitos a regulação quimica, e.g. metabolito. A expressão da enzima pretendida em hospedeiros eucarióticos requere a utilização de sinais reguladores eucarióticos. Tais regiões incluirão em geral uma região promotora suficiente para dirigir a iniciação da sintese de RNA. Promotores eucarióticos preferidos incluem o promotor do gene da metalotioneina I de ratinho (Hamer, D., et aj_., J. Moí. Appl. Gen. 1:273-288 ( 1982)); o promotor TK dos virus Herpes (MeKnight, S, Cel1 31: 355-365(1982)), o promotor precoce de SV40 (Benoist, C., et al_., Nature (London) 290: 304-310( 1981 )); o promotor do gene ga!4 de levedura (Johnston, S.A., et aK, Proc.

Natl. Acad.Sci.(USA) 79: 6971-6975(1982); Silver, P.A. et al., Proc. Natl.Acad.Sci(USA) 81; 5951-5955(1984)).

Como ê largamente conhecido, a tradução de mRNA eucariôtico ê iniciado no codão que codifica a primeira metionina. Por esta razão, ê preferível assegurar que a ligação entre um promotor eucariôtico e uma sequencia de DNA que codifique a enzima pretendida(ou um seu derivado funcional)não contenha quaisquer codões inter-vinientes que sejam capazes de codificar uma metionina(i.e. AUG).A presença de tais codões resulta na formação de uma proteína de fusão(se o codão AUG estiver na mesma grelha de -26-

leitura da sequencia de DNA codificadora da enzima pretendida) ou numa mutação por desvio da grelha de leitura(se o codão AUG não estiver na mesma grelha de leitura da sequencia codificadora da enzima).

Hospedeiros procariôticos preferidos incluem bactérias tais como £. col i, Baci1 lus, Streptomyces ,Pseudomonas,Salmonella, Serratia, etc.’ 0 hospedeiro procariôtico rais preferido ê E. coli, Hospedeiros bacterianos de interesse particular incluem E. coli K12 estirpe 294(ATCC 31446), E. coli. X1776 (ATCC 31537), E.coli W3110 (F~, lambda", prototrôfica (ATCC 27325)) e outras enterobactérias (tais como Salmonella typhimurium ou Serratia marcescens), e várias espécies de Pseudomonas.0 hospedeiro procariôtico deve ser compatível com o replicão e com as sequências de controle do plasmideo de expressão.

Para expressar a enzima pretendida (ou um seu derivado funcional) numa célula procariôtica (tal como, por exemplo, E. coli, B. subti1 is,Pseudomonas, Streptomyces, etc) é necessário ligar operacionalmente a sequência codificadora da enzima pretendida a um promotor procariôtico funcional. Tais promotores podem ser constituídos ou, de preferencia, reguláveis(i.e., induzíveis ou des reprimíveis). Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor int do bacteriófago)\ e o promotor bla do gene da p-lactamase do pBR322, etc. Exemplos de promotores procariôticos indutíveis incluem os principais promotores esquerdo e direito do bacteriófago λ(PL e PR), os promotores trp, recA, lacZ, lacl, ga1 e tac de E. coli, a X-amila-se (Ulmanen, I., et ak,J. Bacteriol 162: 176-182(1985)), os promotores específicos de tf-28 de B.subti1 is (Gilman, M.Z., et aJL ,Gene 32:11-20(1984)),os promotores dos bacte-riófagos de Baci 1 lus(Gr.yczan, T.J., EM:The Molecular Biology of the Baci11i, Academic Press, Inc.NY(1982))e promotores de Streptomyces (Ward, J.M. et al.,Mol.Gen.Genet. 203 :468-478 (1986)). Os promotores procarióticos foram revistos por 61ick5 B.R., (J. Ind. Microbioí 1:277-282( 1987)); Cenatiempo, Y. (Biochimie 68: 505-516(1986);e Gottesman, S.(Ann, Rev. Genet 18:415-442 (1984)). A expressão correcta numa célula procariôtica também requer a presença de um sitio de ligação ao ribossoma a montante da sequencia codificadora do gene. Tais sitios de ligação aos ribossomas estão descritos, por exemplo, por Gold, L. et al., (Ann. Rev.Microbioí 35: 365-404(1981)). A sequencia codificadora da enzima pretendida e um promotor operacionalmente ligado podem ser introduzidos numa célula procariôtica ou eucariôtica recipj. ente como uma molécula de DNA(ou RNA) não replicativa, a qual pode ser uma molécula linear ou de preferencia uma molécula circular covalentemente fechada.Uma vez que tais moléculas são incapazes de replicação autónoma, a expressão da enzima pretendida pode ocorrer através da expressão transitória da sequencia introduzida. Como alternativa, a expressão permanente pode ocorrer através da integração da sequencia introduzida no cromossoma hospedeiro.

Numa realização, emprega-se um vector que ê ospaz de integrar as sequências de gene pretendidas no cromossoma da célula hospedeira.As células que têm estavelmente integrado o DNA introduzido nos seus cromossomas podem ser seleccionadas através da introdução simuj. tânea de uma ou ma· is marcas que permitam selecção das células hospedeiras que contem o vector de expressão. A marca pode complementar uma auxotrofia no hospedeiro(como seja 'leu2, ou ura3, as quais são marcas auxotróficas comuns em leveduras), resistência a biocidas, eg.,antibióticos, ou metais pesados, tais como cobre ou similares. 0 gene da marca seleccionável pode ser directamente ligado -28-

âs sequências de DNA do gene a ser expresso ou introduzido na mesma célula por cotransfecção.

Numa realização preferida, a sequencia intridduzida será, incorporada num plasmideo ou vector virai capaz de replicação autónoma no hospedeiro recipiente. Qualquer um de uma larga variedade de vectores pode ser empregue com esta finalidade. Os factores importantes na selecção de um plasmideo ou vector virai particular incluem: a facilidade com que as células recipientes que contêm o vector podem ser reconhecidas e seleccionadas de entre as células recipientes que não contêm o vector; o número de cópias do vector que são pretendidas num hospedeiro particular; e se fôr desejável poder-se fazer o "vai-vem" do vector entre células hospedeiras de diferentes espécies.

Pode ser utilizado qualquer um de uma série de sistemas de expressão de genes em leveduras Exemplos de tais vectores de expressão incluem o circulo 2--micron de levedura, os plasmideos de expressão YEP13, YCP e YRP, etc., ou seus derivados.Tais plasmideos são bem conhecidos (Botstein, D., et al_., Miami Wntr Symp. 19: 265-274 (1982);Broach, J.R., EM:The Molecular Biology of the yeast Saccharomyces::Life Cycle and Inheritance,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY pág.445--470(1981);Broach, J.R., CeU 28: 203-204(1982)) YEP13 ê o ' vector preferido da presente invenção.

Para um hospedeiro mamífero existem vários sistemas vector possíveis para a expressão.Uma classe de vectores utiliza elementos de DNA que proporcionam plasmideos extra-cromossómicos de replicação autónoma, derivados de virus animais tais como vírus do papitoma bovino, virus polioma, adenovirus ou SV40. Um segunda classe de vectores baseia-se na integração das sequências de genes pretendidas no cromossoma hospedeiro. As células que contem estávelmente -29- integrado o DNA introduzido nos seus cromossomas podem ser seleccionadas introduzindo também uma ou mais marcas que permitem a selecção de células hospedeiras que contêm o vector de expressão. A marca pode proporcionar prototro-fia e um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas, e.g, antibióticos ou metais pesados, tais como cobre ou similares. 0 gene da marca seleccionável pode ser directamen-te ligado a sequências de DNA a serem expressas ou introduzido na mesma célula por cotransformação. Podem ser também necessários elementos adicionais para a síntese óptima de mRNA. Estes elementos podem incluir sinais de "splicing" assim como promotores da transcrição, potenciadores e sinais de terminação. Os vectores de expressão de cDNA incorporando tais elementos incluem os descritos por Okayamá, H., Mol. Cell. Biol 3: 280(1983) e outros.

Vectores procarióticos preferidos incluem plasmideos tais como os capazes de se replicarem em E. ,coli (tais como, por exemplo, pBR322,ColEl, pSClOl, pACYC184, VX. Tais plasmideos são, por exemplo, descritos por Maniatis, T. et a_l_.,(EM: Molecular Cloning, A. Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1982)). Plasmideos de Baci1lus incluem pC194, pC221, pT127, etc. Tais plasmideos estão descritos por Gryczan, T.(EM: The Molecular Biology of the Baci111, Academic Press, NY(1982), pág 307-329).Plasmideos de Streptomyces adequados incluem pIJlOl(Kendall, K.J., et al, J. Bacteriol.l69:4177-4183(1987)) e bacteriófagos de Streptomyces tais como $C31 (Chater,K.F. et al_.,EM: Sixth International Symposium ou Actinomycetales Biology,Akademiai Kaido, Budapest, Hungary(1986), pág. 45-54). Os plasmideos de Pseudomonas foram revistos por John, J.F. et al.,(REv. Infect.Dis. 8:693-704( 1986))e Izaki;K.(Jpn.J.Bacteriol 33: 729-742(1987)).

Uma vez o vector ou sequencia de DNA contendo as construções tenham sido preparados para expressão, as construções de DNA podem ser introduzidas num hospe deiro adequado. Podem ser empregues várias técnicas como sejam a fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio, electroporação ou outras técnicas convencionais. Após a fusão, as células são cultivadas em meio e despistadas quanto às actividades adequadas. A expressão da sequencia pretendida resulta na produção da aminopeptidase especifica de substrato. A aminopeptidase especifica de subs trato da invenção pode ser isolada e purificada a partir das moléculas recombinantes atrás descritas de acordo com métodos convencionais tais como extracção, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, electroforese ou similares. V. Utilização da aminopeptidase especifica de substrato

Qualquer uma das aminopeptidases especificas de substrato do presente invento uma vez produzida e purificada pode ser usada por exemplo, num âmbito farmacêutico ou de produção para retover certos residuos ami no-terminais(consistente com a especificidade de substrato de cada enzima como se mostra nas Tabelas 2 e 3 abaixo)de peptideos e proteínas para as quais se deseje tal remoção de modo a aumentar a sua estabilidade, solubi1 idade,activi-dade biológica, semi.-vida biológica, etc ou para diminuir a imunogenicidade do peptideo ou proteína. Em adição pode ainda ser usado para clivar proteínas e polipeptideos de acordo com as suas especificidades de substratos. -31-

A aminopeptidase especifica de substrato pode ser incubada com um substrato pretendido como uma enzima solúvel ou pode ser imobilizada, por meios bem conhecidos, num suporte sólido(como seja por exemplo, vidro, borracha, plástico, celulose, etc). geral esta referência dos apenas 1imitantes

Tendo agora descrito de um modo invenção, a mesma serâ melhor compreendida por a exemplos específicos os quais são aqui inclui-com fins ilustrativos não pretendendo serem a menos que seja especificado. EXEMPLO 1

CULTURAS DE CÉLULAS E PREPARAÇÃO DE EXTRACTO BRUTO

Cultura e armazenamento de células A estirpe de levedura TD 71.8 (alfa, ino3, leu2, his3, 1is2) foi cultivada a 30°C em 1 litro de meio YPD(1 % de extracto de levedura, 2% Bacto-pep-tone, 2% glucose) até AgQQ 18-20. As células foram colhidas por centrifugação a 3500 rpm durante 10 min a 4°C. 0 sedimento ( v25 g) foi ressuspenso em 25 ml de meio YPD contendo 15¾ glicerol e guardado a 70°C.

Preparação de extractos celulares totais

Descongelaram-se células de levedura congeladas( ^500 g de peso seco) num banho-maria a 30°C e colheram-se por centrifugação a 3500 rpm durante 10 minutos â temperatura ambiente. 0 sedimento foi ressuspenso em 1 litro de tampão S (sorbitol 1M, 50mM Tris, pH 7,8, -32-

lOmM MgCI2, 3mM DTT contendo 50 mg de íftrcftse. Esta mistura foi incubada a 30°C durante 2 horas.com agitação para induzir a formação de esferoplastos. Os esferoplastos foram colhidos por centrifugação a 3 500 rpm durante 10 minutos a 4°C e lavados por ressuspensão suave em 1 litro de tampão S frio, colhidos por centrifugação a 3 500 rpm durante 10 minutos e ressuspensos suavemente em 500 ml de tampão A (lOmM HEPES-K+, pH 7,0, l,5mM MgC12, LOmM KC1 e 0,5mM DTT). Todos os passos subsequentes foram efectuados a 4°C.0s esferoplastos foram lisados neste tampão hipotônico por 12-15 estocadas com um pistão bem ajustado seguido de 15-20 estocadas com um pistão mais laço num homogenizador Dounce e depois a concentração final de KC 1 foi ajustada a 0,2M com uma solução fria de 2 M KC1. 0 lisado foi agitado em gelo durante 20 minutos.Adicionou-se glicerol atê 1.0¾ em todos os tampões usados nos processos de purificação subsequente para estabilizar mais a aminopeptidase.

As fracções foram testadas qtmto à actividade especifica de substrato com o descrito atrás. EXEMPLO 2

PURIFICAÇÃO DA AMINOPEPTIDASE ESPECIFICA DE SUBSTRATO

Primeira cromatografia em DEAE-Sepharose CL-6B

0 lisado bruto foi cormntrado para 100 ml usando uma membrana de ultrafiltração PM-10 e dialisado três vezes contra 2 litros de tampão H (lOmM HEPES-K+, pH 7,35, l,5mM MgCl2, 0,5mM DTT, 0,2¾ NaN3, 10¾ glicerol) suplementado para conter 0,05M KC1.0 lisado foi então aplicado numa coluna de CM-Sepharose CL-6B(2,5x45cm) que tinha sido ligada a uma coluna de DEAE-Sepharose CL-6B -33-

(2,5 x 45cm) de tal forma que o eluato dà‘· coluna de CM--Sepharose CL-6B foi aplicado continuamente à coluna ligada de DEAE-Sepharose C1-6B. Ambas as colunas tinham sido equiH bradas com o mesmo tampão usado na diálise. Estas duas colunas ligadas foram lavadas com 2 litros de tampão H contendo 0,05M KC1. As colunas foram em seguida desligadas.A coluna de DEAE foi eluida com um gradiente linear de 0,05M (290 ml) a 0,05M (250 ml) KC1 em tampão H a 17,3ml/hr. As fracções (5,2 m) foram colhidas e testadas quanto à activi-dade de aminopeptidase. As fracções que contêm actividade de aminopeptidase foram reunidas (fracções 41-71 de um total de 143 fracções; conduetividade média 9,7ms) e concentradas para um volume de 10 ml usando uma membrana de ultrafiltra-ção PM-10.

Segunda cromatografia em DEAE-Sepharose CL-6B 0 eluato concentrado da cromatogra-fia em DEAE-Sepharose CL-6B atrás descrita foi dialisado três vezes contra 1 litro de tampão H suplementado para conter 0,05M KC1 e aplicado a uma segunda coluna de DEAE-Sepharose CL-6B (2,5x45 cm) equilibrada com o mesmo tampão usado na diálise. A coluna foi eluida com um gradiente linear de 0, 05M (250 ml) a 0,2M(250 ml) KC1 em tampão H a 18ml/hr.As fracções (4,5ml) foram colhidas e testadas quanto â actividade de aminopeptidase. As fracções 53a 67 verificou-se possuírem actividade MAS II. Estas fracções foram reunidas (condutividade média 5,4 ms). As fracções 74 a 79 apresentaram actividade MAS III. Estas fracções foram reunidas (condjj tividade média 6,6ms).Cada conjunto de fracções foi concentrado para 5 ml usando uma membrana de ultrafiltração PM-10.

Os perfis das fracções contendo actividade especifica de substrato estão apresentados na Tabela I.

Perfil das fracções contendo actividade

Coluna Dados de Fracção actividade A414nrn* Concen tração Proteína A280nm* Conducti- vidade média das fracções activas (ms) MAS II lâ DEAE-Sepharose CL-6B 41-71 0,293 2,817 9,7 2ã DEAE-Sepharose CL-6B 53-67 0,088 0,272 5,4 MAS III Iâ DEAE-Sepharose CL-6B 41-71 0,293 2,817 9,7 2^ DEAE-Sepharose CL-6B 74-79 0,100 0,673 6,6 * Absorvância ê a média das fracções activas reunidas. EXEMPLO 3

CALCULO DO PESO MOLECULAR DA AMINOPEPTIDASE POR ELECTROFORESE EM GEL DE SDS-POLIACRILAMIDA A electroforese foi efectuada de acordo com o método de Laemmli, U.K. (Nature 227: 680-685 (1970)) usando um gel de 10¾. 0 gel foi corado com azul

Coomassie e calculado o peso molecular aparente da aminopep-tidase desnaturada a partir de mobilidade relativa dos padrões proteicos incluindo (I) miosina (205 000), (2) betagalactosi-dase de E. coli (116 000), (3) fosforilase de mQsculo de coelho(97 000), (4) albumina do soro bovino (66 000) e (5) -35-

Λ

albumina do ovo(45 000) e (6) anidrase carbÕnica(29 000).0 peso molecular aparente de MAS II foi de aproximadamente 48 000. EXEMPLO 4

ESPECIFICIDADE DE SUBSTRATO

Fizeram-se trinta e seis peptideos para estudar a especificidade de substrato das aminopepti-dases da presente invenção. Dezoito dos peptideos tinham diferentes resíduos de aminoácidos N-terminais e os restantes dezoito peptideos possuíam diferentes resíduos de aminoácidos na penúltima posição amino-terminal. A solução de proteína (10 ul) a ser testada foi adicionada a 90 /ul da solução contendo 4mM M-X-I-P-E-T ou X-I-p-E-T, 10 mM HEPES-K+, pH 7,35 0,2 mM CoC12» 0,2 M KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,2¾ NaN3, 30 yug de oxidase de L-aminoácidos, 3 /ug de peroxidase de rábano silvestre e 20 yug de di-hidrocloreto de o-dianisidina. Todas as reacções foram efectuadas à temperatura ambiente numa placa de microtitulação de 96 cavidades e a absorvância detectada a 414 ou 450 nm. 0 desenvolvimento rápido de côr indica a presença de elevada actividade de peptidase naquele peptideo especifico. Os resultados destas experiências estão apresentados nas Tabelas 2 e 3. A identidade de X é designada pelas abreviaturas de ura sô letra normalmente usadas para os aminoácidos vulgares: V«Val, A=A1a, R=Arg, D=Asp, C=Cis, E=Glu, Q=Gln, G=Gli, H=His, I = Ile, L=Leu, K=L i s , M=Met, F = Fen, P = Pro, S=Ser, T=Tre e W=Trp. Os números nas Tabelas 2 e 3 representam cálculos qualitativos de actividade: 0 (nenhuma actividade);1(+/-); 2(+); 3(++/-); 4(++); 5(++ +/-); e 6 (+++). -36-

Tabela 2

Especificidade do substrato: M-X-I-P-E-T

Identity ofX: VARDCEQGHILKMFPSTW ΕΝΖΥΜΕ: MAS II 020000004021030000 MAS III 114424444442442442

Tabela 3

Especificidade de substrato: X-I-P-E-T

Identity of X: V A R D C E Q G H I L K M F P S T W ΕΝΖΥΜΕ: MAS II 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 MAS III 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 2 0 2 2 0 2 2 1

Se bem que o que foi descrito sejam realizações particulares preferidas, deve-se entender que a presente invenção não ê por.elas limitada. Os familiarizados com a matéria verão que poderão ser feitas várias modificações às realizações descritas e que tais modificações pretendem estar dentro do âmbito da presente invenção.

Claims (2)

1. R EIVINDICAÇOES lâ. - Método para a recuperação de uma enzima aminopeptidase especifica de substrato subs-tancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um resíduo metionina amino-terminal e qualquer penúltimo resíduo de amino-âcido amino-terminal seleccionado do grupo.constituído por: Ala, His, Leu, Lis e Fen, a partir de uma amostra contendo a referida aminopeptidase caracterizado por compreender os seguintes passos: a) recuperação de aminopeptidase bruta especifica de substrato a partir de uma amostra contendo a referida aminopeptidase ; b) sujeição da referida aminopeptidase bruta especifica de substrato do passo (a) a cromatografia de permuta ióni-ca ;e c) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela referida cromatografia de permuta iónica. 2â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda os passos de: d) sujeição da referida aminopeptidase recuperada especifica de substrato do passo (c) a uma segunda cromatogra-fia de permuta iónica; e e) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela referida segunda cromatografia de permuta iónica. -38-
2. 35. - Método de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se obter uma enzima aminopeptidase especifica cfe substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidi-cas entre um resíduo amino-terminal X e um residuo I1e adjacente de um peptideo, em que X ê um residuo de aminoáci-do seleccionado do grupo constituído por:Leu e Met. 4â. - .Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se obter uma aminopeptidase especifica de substrato que é aminopeptidase Mas II. 5â. - Método para a recuperação de uma aminopeptidase especifica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação pep-tidica entre um residuo metionina-terminal e qualquer penúltimo residuo de aminoácido amino-terminal seleccionado do grupo constituído por: Vai, Ala, Arg, Asp, Cis, Glu,Gln, Gli, Ile, Leu, Lis, Met, Fen, Pro, Ser, Tre e Trp, a partir de uma arrcstra contendo a referida aminopeptidase caracterizado pelos seguintes passos: (a) recuperação de aminopeptidase bruta especifica de substrato a partir de uma amostra contendo a referida aminopeptidase; (b) sujeição da referida aminopeptidase bruta especifica de substrato do passo (a) a cromatografia de permuta ióni-ca;e (c) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificado pela referida cromatografia de permuta iónica. -39-

   6a. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender ainda os passos de: (d) sujeição da referida aminopeptidase recuperada es-peáfica de substrato do passo (c) a uma segunda cromatogra-fia de permuta iónica, e (e) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela referida segunda cromatografia de permuta iônica. 7a. - Método de acordo com uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizado por se obter uma enzima aminopeptidase especifica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um residuo amino-terminal X e um residuo Ile adjacente de um peptideo, em que X é um residuo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por:Ala,Asp, Gin, His, Leu, Met,Fen, Ser,Tre e Trp. 8a. - Método de acordo com uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado por se obter uma aminopeptidase especifica de substrato que ê a aminopeptidase MAS III. 9a. - Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante, caracterizado por se incorporar na referidanolêcula uma sequencia genética codificadora da aminopeptidase especifica de substrato da reivindicação 4. -40-

   10a. de uma mol êcu! la de DNA recomb incorporar na ref er ida molêcu dif icadora da amino pept idase rei vindica ção 8. 11a. ami nopepti das< 3 especifi ca de Processo para a obtenção da ibstrato MAS II da reivindicação 4, caracterizado por ser produzida através da expressão de uma molécula recombinante. 12a. - Processo para a obtenção da aminopeptidase especifica de substrato MAS III da reivindicação 8, caracterizado por ser produzida através da expressão de uma molécula recombinante. 13a. - Método para a remoção de um residuo de metionina amino-terminal de um peptideo contendo o referido residuo amino-terminal e contendo como penúltimo residuo de aminoácido amino-terminal, um aminoácido seleccio nado do grupo constituído por: Ala, His, Leu, Lis e Fen, caraeterizado por compreender a incubação do referido peptideo na presença da aminopeptidase especifica de substrato MAS II para assim remover o referido residuo amino-terminal. 14a. - Método para a remoção de um residuo de metionina amino-terminal de um peptideo contendo o referido residuo amino-terminal e contendo como penúltimo residuo de aminoácido amino-terminal, um aminoácido seleccionado do grupo constituído por Vai, Ala, Arg, Asp, Cis, Glu, Gin, Gli, His, I1e, Leu, Lis, Met,Fen,Pro, Ser, Tre e Trp, caraeterizado por compreender a incubação do referido peptideo na presença da aminopeptidase especifica de substrato MAS III para assim remover o referido residuo amino-terminal. -41- >s 15â. - Método para'a remoção de um resíduo amino-terminal X de um peptideo contendo o referido resíduo terminal X e um resíduo I1e adjacente, em que X ê seleccionado do grupo constituído por Leu e Met, caracteri-zado por compreender a incubação do referido peptideo na presença da aminopeptidase especifica de substrato MAS II para assim remover o referido residuo amino-terminal. 16â. - Método para a remoção de um residuo amino-terminal X de um peptideo contendo o referido residuo terminal X e um residuo I1e adjacente, em que X ê seleccionado do grupo constituído por Ala,Asp,Gln,His,Leu, Met, Fen, Ser, Tre e Trp, caracterizado por compreender a-incubação do referido peptideo na presença da aminopeptidase especifica do substrato MAS III para assim remover o referido residuo amino-terminal. 17ã. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado por a referida aminopeptidase especifica de substrato ser imobilizada num suporte sólido. Lisboa, 11 cfe Setembro de 1989

   i. Leseira da cftuz Apnia Útisísl d» Propriedade kieustriel RUA VJCTOR COftO®N. IO-A. 1/ 1200 LISBOA