PT91683A

PT91683A - Metodo para o isolamento, purificacao e caracterizacao das aminopeptidases: ap2, ap1 e apx

Info

Publication number: PT91683A
Application number: PT9168389A
Authority: PT
Inventors: John A Smith; Yie-Hwa Chang
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1988-09-13
Filing date: 1989-09-11
Publication date: 1990-03-30
Also published as: AU4221089A; EP0359164A3; EP0359164A2; WO1990002814A1

Description

"V'N 8gÍMJS£Í,.I......â......El.didos......dg......Patente......gelacionadas '

Este pedido de patente é uma continuação em parte do Pedido de Patente dos Estados Unidos- NQ de Série €>7/243=,733, entregue em 13 de Setembro de 1988 . Sâfflpg.. .da.......Invenção ft invenção é dirigida para o isolamento e purificação de aminopeptidases especificas de substrato e para as próprias enzimas.

EyS^amento.....da, ...InvenjEgo

As enzimas que são capazes de clivar uma ligação peplidica entre o resíduo ameno-terminal de uma proteína ou peptídeo e um resíduo de aminoácido adjacente são conhecidas como "afflinapeptidases"« Tais enzimas foram identificadas numa variedade de microorganisffioss tais como E.coli, Bacilius 1 ícheniformis·, Bacillus subtilis^ Salmanei la typhimurium e rtycopl a-sma salivariam (Cárters T.B.et aL« J. Bacteriol„159s453-459 (1984)5 Hayashi5 S.,J. Biol. Chem. 259í13448-10454 <1984)= Hermsdorf, C.L..Bio-Çhsm=_ 17s337@-337ó (1978)? McHugh. B.L. et al . ã. Bacteriol 1205364-371 (1974); Miller, C.G. et al,, 3.Bacteriol. 155;603-611 (1978). Simmonds. S=? Biochem. 9sl-8 (197®)5 s Shihata, K. et al·. J. Bacteriol. 169£3409-5415 (1987)).

Um exemplo de urna aminopeptidase é a aminopeptidase especifica de leucina produzida na mucosa intestinal e rins de mamíferos. A aminopeptidase específica de leucina do fluído intestinal de suíno foi purificada e caracterizatía e observou-se possuir mm ião in . A enzima tem uma especificidade de substrato larga rei-ativamente ao resíduo M-terminal do peptídeo substrato. ¥ \

Através da hidrólise sucessiva de ligações peptidicas M~tsrminais ela pode degradar peptídeos dando origem a aminoàcidos livres, „ ~ +2 tncontrou-ss que a enzima e actxvada por nn , que ê capas de 4-2 _ substituir o xSo ir? (White, A, et al, ,ό-mgPrincipies of Bxoche-inistrv„ 5 th Ed= f Píc8rai*i Hill, NY, NY (1973))« Um segundo exemplo de uma aminopeptidase é a aminopeptidase especifica de metionina de E„ cpli CBen-Bassat et al .·, t 3* Bactariol » 169a751-757 (1987)),= Sherman, F» et ah (BioEssavs 5s27-51 (1985)) fez uma discussão teórica acerca das propriedades aminopeptidases.

As leveduras, e em particular, a levedura Saccharomyces cerevisiae também contém aminopeptidases. Trumbly» R,J» et al (3, Bactariol. 156s56-48 (1983)), por exemplo, identificou em levedura uma aminopeptidase de leucina a qual é capas de clivar um peptideo contendo leucina. As peptidsses de levedura foram revistas por Achstetter, TB et al. (Yeast ls159-157 (1985)), cuja referencia é aqui incluída como referência. As aminopeptidases são também produzidas no intestino delgado humano (Martin, D»W» et al,, Ems Barper~'s Review of Biochemistrv 19th Ed=, Lange Medicai Publications, Los Altos, CA (1983))» Ã aminopeptidase de levedura, Aminopeptidase I (API ou iSpolipeptidaseSÍ) é de particular interesse para a presente invenção* A enzima foi inicialmente isolada e caracterizada como uma proteína de alto peso molecular por Johnson, M»J», 3» Biol„ Chem»157 g575-586 (1941)). A M._ da enzima nativa foi determinada como sendo entre 56β ΦΦΦ e 766 ΘΘ© e encontrou—se que a enzima consiste em suhunidades múltiplas com uma de aproximadamente 50 0©0 (Johnson, n = J,, J. Biol, Chem 157s575-586 (1941)? Trumbly, R»J» st al, J_........Bacter.io 1. 156s56-48 (1983)5 Frey, J. et.......al,· ,

Biochem. Biophys, Acta 527s5i~41 (1978)? Metz, B. et al., mocMm^MophyB^Êcta......429g953—949 (1976)),

A aminopeptidase i de levedura foi estabelecida como sendo uma g 1 icoproteina contendo 12% de açúcar , assim como uma 4-v ffietaloexopsptiaase contendo Zn que pode ssr inativada por agentes quslatcres de metais e específicaments activada por Zn’’ s CL CJohnson, M,J,, J, Biol, Chem, 157s575-586 (1941)^ Trumbly, R.J.et al.y J , Bacteriol , 156s56-48 (1985)5 llets, 8. et al.,,, Biochem·, Biophys, Acta 429s955-949 (1976>s Rohm, K.H,^ftrch, Biochsm, Bioohys, 249s216-225 < 1985))= Mo entanto o mecanismo 2-5- catalitico de API com sxcepeSo da sua dependência de Zn permanece obscura, A b-iossíntese de API é muito sensível á fonte de carbono e de acato no meio da cultura. Por exemplo quando amónia substituir peptona como única fonte de azoto, a actividade de aminopeptidase I foi aumentada 5 a 10 vezes (Frsy, J, et al» s Bíochem, Biophys, Acta 527s51-41 (1978))= Ainda quando a glucose é usada como fonte de carbono, a biosíntese de API., conforme evidenciado pela traduçaS in vitro de mRNft de levedura, decresceu na fase logarítmica precoce, aumentou na fase log tardia e decresceu, novamente na fase estacionária (Distei, B,et al.t BigcHem.,.........Bioohys, Acta 741 s 128-155 (1985)), no entanto a activi dade· enzim-ática aumentou ao longo da fase log e permaneceu alta na fase estacionária (Frsy, J.et al,,........Biochem, Biophys, Acta 527s31-41 (1978)),

As aminopeptidase de levedura API, leucina—aminopepti— dase IV (Trumbly, R.J.et al, J. Bacteriol, 156s56-48 (1985)), aminopeptidase III (Matile, P, st al.. Planta 96245-55 (1971)) e aminopeptidase yscl (Rsndueles, P,S, et al,, FEHS Microbiol, Rev, 54“17-46 (1988); Aehstetter, T, et al,. Yeast Is 159-157 (1985))) foram localizadas nos vacúolos de levedura (equivalente aos lisossomas encontrados em organismos eucariéticos superiores V/--.

(Hatile, Ρ. et al»,Arch» Hikrohiol» 5ά;140"ία5 (196/)) <Prey5 u » et. aL, Biochem» BiQphys» Ac ta 527 s 31 -41 <1978)) =

Sabe-se que as proteases vácuolares \a»g» proteínas® A (Ammerer, 8* st al.. Mol - Celi. Biol. 6s2493-2499 <1986)), oroteínase B (Moehle, C»H» et al., Mol» Cell» Biol» 7£4590-4599 <1987)) 5 e carboKipeptidase Y ÍCPY) (Hasilik ;i A» st al., Eur. 3, Biochsm = 85¾ 599-008 <1978)) slc» sintetizadas como preproprotei-nas e no caso CYP, a sua pro—sequência provou-ss conter o determinante da selecção vacuolar (Johnson» L»n» et al » =·, Cell 48;875--885 <1987)§ VaiIs, L»A=et al..Cell 48;87-897 <1987))= No entanto API foi anteriormente localizada nas vacúolos de levedura (Frsy, J.et .al,.,·, Biochem. Bioghys» Ac ta 527s5í"-41 (1978)), o seu processo de maturação s selscção intsrcslular permanecem desconhecidos»

Foram anteriormente isolados mutantes de 8acc haromyces cerevisiae incapazes de hidrolisarem eficazmenta leucina js-naf-tilamida, um substrato cromogénico para a actividade de aminope— otidase» As propriedades destes mutantes foram atribuidas à aus@nc.ia de uma ou ma is das quatro aminopeptídases de leucina. (as chamadas» LAPI-LAPIV) por Trumbly e Brsdley < Trumbly» R.J.et al, J„ Bactéria!, 156s56-48 (1983))= As mutações no gene 1ap4 eliminaram a actividade de API e o gene lap4 foi mapeatío genéticamente no braço esquerdo do cromossoma XI (Trumbly? R».j=et al, 3»Sectário 1» 15ès36-48 <1983)5 » No entanto·, uma vez que as estirpes de levedura com mutações em 1 ap4 apresentavam aparentemente te.Kas de crescimento normais» presumia-se que API nlo tem um papel vital na fisiologia celular» Como alternativa, presumiu-se que a sua ausfncia poderia ser compensada por outras aminopeptidases íTrumbly 3 R. J ..et a 1»»3» Bacterio 1» 156g38-48 <1983))» 0 gene lap4 nlo foi clonado nem sequenciado»

V

As arainopeptidases, era geral , são importantes no processamento e degradação de peptideos e proteínas. Elas têm sido usadas como alternativa -à degradação de Edman na determinação da sequência de aminoácidos de polipeptideos e proteínas.

As aminopeptidases especificas de substrato podem também ser usadas para clivar especifieamente resíduos de aminoá-eidos da extrema amina de uma proteína da peptídeo. Assim5 tais enzimas podem ser importantes na remoção de sequências de sinal, sequências de localização nuclear, sequências 1idersequências de secreção etc. , as quais podem estar presentes no extremo-terminal de um peptídeo ou proteína. Uma vez que muitas proteínas produzidas através da tecnologia de DMA recombinante ou por outros meios contêm tais sequências, as aminopeptidases podem ser usadas para converter tais moléculas nas suas formas maduras- e/ou funcionais. A identificação e disponibilidade de outras aminope-ptidases específicas de substrato é pois altamente desejável.

Ura aspecto do presente invento diz respeito à clonagera, sequenciaçao e localização cromossémica do gene codificador da proteína precursora API= a qual contem uma pré—sequência que difere de outras sequências sinal que dirigem as proteínas através da membrana plasraática bacteriana a do retículo andoplss-mático ou para a mitocôndria. Este gene elenado facilitará estudas de processamento, mecanismo catalítico e regulação da biossíntese de API„

Breve Descrição das Figuras A figura 1 mostra a sequência NH.-j-terminal da aminope-ptidase I de levedura e as sondas de oligonucleotídeos sintéticos. As sondas de oligonucleotídeos a e h foram projectadas de

V

acordo com a correspondente sequência proteica e usadas sequen-ciadamente para fazer o despiste da biblioteca genémica de levedura em gtli» A Figura 2 mostra o mapa de restrição e estratégia de saquencisçao para o DMA genómico codificador da aminopeptidase I de levedura. As setas a cheio indicam a direcção e o grau de sequenciaçlo de DMA iniciada com o iniciador T3 ou T7 e as setas a tracejados indicam a sequenciaçlo do DMA iniciada com olígonu-cleotideos sintéticos de vários subclones contidos no vector Bluescri.pt 1Í13-Í- (Stratagene)A grelha de leitura aberta codificadora do precursor da aminopeptidase I5 contendo 514 resíduas de aminoácidos5 está representado pela linha grossa e as regiões dslimitantes pela linha fina» As abreviaturas para os sítios de clivagem sSo as seguintess E, EcoRIρ P5 Pstls X? Xhal» A Figura 3 mostra a sequência de núcleotídeos do DMA genómico que codifica a aminopeptidase I de levedura e a sequfn-cia de aminoácidos deduzida da aminopeptidase I de levedura.» 0 clone começa com uma região não codificadora contendo 5 codões de paragem na mesma grelha de leitura» 0 ATG ma is 5' da grelha de leitura aberta que obedece è. regra de Kozak foi assinalado como o cotíão de iniciação» A set-a vertical marca o extremo NR_, da aminopeptidase I purificada por 3D8--PABE e a sequência sublinhada foi identificada por análise da sequência proteica (Figura 1)» A grelha de leitura aberta a seguir á seta vertical codifica uma proteína contendo 4é9 resíduos de aminoácidos e terminacom um codão de paragem <End>, 0 sublinhado a tracejado identifica o sinal de poliadeni-lação putativo9 AAATAAA» Os asteriscos identificam quatro sítios de M-g 1 i c o 1 i zação putativos (Asn—X-Tre ou. Asn—X—Ber) =

V %

A Figura 4 mostra a presença de uma estrutura «-helicoidal ampifilica dentro da pre—sequfncia da aminopsptidass I de levedura* 0 primeiro resíduo de aminoácido do peptideo sinal putativo do precursor da aminopeptiriase I está numerado -45* A volta helicoidal apresentam os resíduos tíe —41 a -27= A linha a ponteado demarca as faces hidrofóhica e hidrofilica da hélice ;»: ampifilica prevista*

Sumário da Invenção

De acordo com esta invenção5 as aminopeptidases específicas tíe substrato* capazes de clivarem a ligação peptidica entre o grupo carboxilo ds um resíduo de aminoácido particular amino--terminal e o grupo amina de um resíduo de aminoácido adjacente foram isoladas e substancialments purificadas* A invenção está portanto relacionada com a purificação destas snzimas5 com as utilizações das enzimas e com as próprias enzimas substancialmente purificadas*

Betaihadamente a invenção diz respeito a uma enzima aminopeptidase substancialments purificada tendo uma capacidade para clivar a ligação peptidica entre um resíduo metionina amino-terminal e qualquer penúltimo resíduo de aminoácido amina----terminal seleccionado do grupo constituído pors Aro3 Asp? Bln* Gli3 Hís3 IlSj Leu5 Lis, Met Fen* A invenção diz ainda respeito a uma enzima aminopepti™ dass substancialments purificada específica ds substrato tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um resíduo amino-termínal X e um resíduo He adjacente de um peptideo,. em que X é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído pors Ala* firg3 Gin* Hiss Iles Leus Met* Fens Pros Ser3 Ire e Trp* . χ' ;Γ ' .. - ΐ A invenção diz ainda respeito a uma enzima aminopepti— dase especifica de substrato sufostancialmsnte purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um resíduo de metionina amino—terminal s qualquer penúltimo resíduo de aminoá-eido amino-terminal seleccionado do grupo constituído pors Alas Arg2 Asp2 CisP Sli5 His5 Ile? Leu? tis» jlet» Fen 5 Ser e Trp = A invenção diz ainda respeito a uma enzima aminopepti-dase específica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um resíduo amino—terminal X e um resíduo Ile adjacente de um peptídeo.» em que X é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constitui do por; Arg? 61n? Hisf Leu.P Met» Fen? Pro» Ssr5 Tre e Trp« A invenção diz ainda respeito a uma enzima aminopepti--dase específica de substrato substancialmente purificado tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um resíduo de metionina amino-terminal e qualquer penúltimo resíduo de sminoá-cido amino-terminal seleccionado do grupo constituído pors vai ;I Ala5 Args Aspf. Cis5 Blu* 61u5 Sli5 His5 Ile5 Lsu5 Lis5 net5 Fens Pro, Ser3 Tre e Trp = A invenção diz ainda respeito a uma enzima aminopepti-dase especifica de substrato substancialmente purificada tendo capacidade piara clivar a ligação peptidica entre um resíduo amino-terminal X e u.m resíduo Ile adjacente de um psptideo,, em que X é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituí do pors Vai 3 Aias Arg? 8iu5 Gli? His5 Ile3 Leu» Het* Fen5 Tre e Trp» A invenção também engloba qualqyer uma. das aminopepti— dases atrás descritas que é AP25 API ou APX=

A invenção também diz respeita a uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência genética codificadora de qualquer uma das aminopeotidases específicas de substrato atrás descritas» A invenção também diz respeito a qualquer uma das aminopeptidases atrás descritas que seja produzida pela expressão de uma molécula recombinante» A invenção também diz respeito a uma pré-sequência capaz de diriqir a proteína ou polipeptídeo através de uma membrana de uma célula de leveduras e mais específicamente através de tal membrana para um vacúolo de levedura» A invenção também diz respeito a uma molécula de ácida nucleico recombinante que é capaz ds codificar tal pré-sequência» A invenção também proporciona um método para a recuperação de qualquer uma das aminopeptidases específicas de substrato substancialmente purificadas atrás descritas a partir de uma amostra contendo aminopeptidase o qual se caracteriza pelos seguintes passoss (a) recuperação da aminopeptidase específica ds substrato bruta a partir de uma -amostra contendo a aminopeptidase|i <b> sujeição da aminopeptidase especifica de substrato bruta de passo (a) a cromatogr-afia de permuta tónicas e <c> recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela cromatografia da permuta .tónica»

A invenção também engloba, o método atrás descrito que compreende ainda os passos des íd) sujeição da aminopeptidase especifica de substrato recuperada do passo Cc> a cromatografia de hidroKilapatitsH e

Ce) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela cromatografia de hidroKilapatite A invenção também engloba, o método atrás descrito para a purificação de API que em adição compreende os passas des

Cf) sujeição da. aminopeptidase especifica de substrato recuperada do passo Ca) a cromatografia em Phenvl—Sepharose CL-4B e

Cg) recuperação de qualquer -aminopeptidase específica de substrato por- cromatograf ia em Phenyl-Sepharose CL-4B» A invenção também proporciona um método para a remoção de um resíduo de metionina amino-· terminal de um peptideo contendo o resíduo amino-terminal e contendo como penúltimo resíduo de aminoácido amino-terminal um aminoácido seleccionado do grupo constituído por; Arg? Asp? Blns Sli5 His, Ile5 Leu5 Lis5 Met e Fen =: método esse que se caractsriza pela incubação do peptideo na presença da aminopeptidase especifica de substrato AP2 para assim remover o resíduo amino-terminal= A invenção também proporciona um método para remoção de um resíduo de metionina amino-·terminal de um peptideo contendo o resíduo amino-terminal e contendo como penúltimo resíduo de aminoácido amino-terminalum aminoácido seleccionado do grupo constituído por AlaP Arg5 Aspf CisP S1I5 His,= Ile5 Leu== Liss ilet.

Fen, Ser a Trp, método e-sse qua ss caracteriza pala incubação da peptídeo na presença da aminopeptidase especifica de substrato API para assim remover o rasiduo ainina-terminal» A invenção também proporciona um método para a remoção as um rasiduo da mationina amino-terminal de um peptídeo contenda o rasiduo amino-terminal e contendo como penúltimo resíduo de aminoãcido amino-terminal, um aminoácido ssleccionado do grupa constituído por Vai, Ala, Arg, Asp, Cis, Blu, BIn, Bli, His, Ile, Leu, Lis, Met, Fen, Pro, Ser, Tre e Trp, método esse que se caracteriza pela incubação do peptídeo na presença da aminopepti-dase específica de substrato APX para assim remover o aminoãcido amino-terminal „ A invenção proporciona ainda um método para a remoção de um resíduo amino-terminal X de um peptídeo contendo o resíduo terminal X e um resíduo Ile adjacente, em que X é seleccionado do grupo constituído por Ala, Arg, Gin, His, Ile, Leu, Met, Fen,

Pro, Ser, Tre e Trp, método esse que se caracteriza pela incubação do peptídeo na presença da aminopeptidase especifica de substrato AP2 para assim remover o resíduo amino-terminal* A invenção proporciona ainda um método para a remoção amino-terminal X de um peptídeo contendo o resíduo terminal X e um resíduo lie adjacente, em que X ê seleccionado do grupa constituído por Arg, Blu, His, Leu, Met, Fen, Pro, Ser, Tre e Trp, método esse que se caracteriza pela incubação do peptídeo na presença da aminopeptidase específica de substrato API para assim remover o resíduo amino-terminal= A invenção proporciona ainda um método para a remoção de um resíduo amino-terminal X de um peptídeo contendo o resíduo terminal X e um resíduo Ile adjacente, em que X è seleccionado do \ >

grupo constituído por vai, Ala, Arg, Gin, Gli, His, T.le, Leu, Met, Fen , Trp e Tre, método ssse que se caractsrisa pela incubação do peptideo na presença da sminopeotidase especifica de substrato APX para assim remover o resíduo amino—terminal. A invençlo diz ainda respeita à realização de qualquer um dos métodos em que a aminopeptidase especifica de substrato é imobilizada num suporte sólido.

Descrição Detalhada da Invençlo 1= Isolamento s purificação das aminopeptidases especificas de substrato AP2, API e APX da presente invençlo.

De acordo com a presente invençlo, qualquer uma das aminopeptidases especificas de substrato da presente invençlo pode ser isolada a partir de uma amostra contendo a enzima. As aminopeptidases específicas de substrato parecem ser ubíquas, sendo encontradas em todos os eucariotas, incluindo plantas, animais e organismos muiticeluíares. Pensa-se que também eKiste nos procariotas uma enzima diferente tendo actividade de acnino-peptidase específica de metionina. Portanto, nesta invençlo está incluída qualquer fonte celular. Conforme aqui é usado, a amostra contendo qualquer uma das enzimas será referida simplesmente como "amostra”. A menos que sejam especificados como sendo únicos para uma ou outra das aminopeptidases específicas de substrato do presente invento, os métodos de DNA recombinante aqui descritas podem ser empregues para clonar e expressar qualquer uma ou todas as aminopeptidases da presente invençlo.

Ao descrever-se a presente invençlo foram empregues certas -abreviaturas. As abreviaturas usadas s!o§ API, \

aminopsptidase Ij iamplo B, um tampão contende 2€?mM HtrES-K' , pH 7,35, 5mH riqCL^, ®,5mi1 DTT, ®,2M KCL e ®,®2% NaN^„ pb, par de jí. j bases § BSA, albumina de soro bovina§ CMBr, brometo de cianogènios CPY, carbojíipeptidase Y ρ DEAE, dietilaminoetilop DTT, ditiotrei-tolg HEPEBg ácido Ν-2-hidroKÍati1piperazina-N1-2~etanossuIfónicoj kbs quilcbasesi PBS, €>,15H NaCL, 12s5fflM ΚΗ,,ΡΟ ^, ρΗ 7,4, Θ,@2% NaN^s pNA, ρ-nitroaniiidap Pth , ó-fenϊ 1~2--tio-hitían tolna;; SDtí, dodecilsulfaio de sódio;; BDB-PAGE5 electroforese em gel de dadecilsulfato de sódiG-poliacrilamidas SBC, €h, Í5n NaCL, citrato cie sódio ÍSmiiy pH 7,0? YPD, meio contendo 1% de e?ítracto de levedura, 2% Bactopeptona s 27 glucose.

Ao descrever-se a presente invenção, ê feita referencia a uma série de materiais biológicos, vectores e estirpes hospedeiras, Todos os materiais usados na realização deste invento podem ser adquiridos comercialmente ou são fácilmente conseguidas pelos familiarizados com a área, Escepto quando indicado, podem ser usados materiais, vectores e estirpes alternativas na realização do presente invento, D eKlraeto de levedura e Bactopeptona foram da Difco Laboratories, 0 reagente para o ensaio de proteína (método Bradford) e os reagentes para a electroforese em SDS-PABE foram da BioRad, Xnc, Metionina—p—nitroanilida (rlst—pMA) foi da Bachem, ínt, Albumina do soro bovina (BSA), HEPEB, ditiotreitoi (DTT), glucose. Tris, glicerol íqrau de pureza para enzimas), liticase, DMA de esperma de salmão, marcadores de peso molecular de proteínas e azul Coomassis foram adquiridos à Sigma Chemical Corp. DEAE Sepharose CL-éB, Sepharose CL-6B e Bepharose 4B activada com CMBr foram da Pharmacia, A membrana PI1-3® foi da Amicon. HCL fervente CêN) e Polybreno foram da Pierce Biochemi— cais. Os reagentes e solventes para a análise de aminoácidos s os "cocktaiIs" Ready-solv EP foram da Beckman Instruments, Os reagentes e solventes para análise da sequência de proteína s síntese de DMA foram da Applied Biosystems, Inc, Os nucleotídeos

\ ç marcados com l’~'c~Pl foram da New England Nuclear» As enzimas de restrição= DNA-polimsrass I de E.coli (fragmento Kienow), poli-nucleotideo-cinase de T4r, RNase As DNA-ligase de T4 e fosfatase alcalina de intestino de vitela foram da New England Biolabs ou ^3 _ tíoebringer Hannheim» La-'-" S3 dAlP foi da Asmersham» As membranas de nitrocelulose para o despiste e para a análise de imunotrans-fsrfneias foram da Nillipore e Schleicher & Schuell,, Q filme de raios X foi da Kodak» Fenol e sulfato de amónio foram da BEL= Cromo-di-hibridador de Saccharorovces foi da Clonatech» 0 adjuvante completo e incompleto de Freund foi da Miles Laboratories» 0 5lKit” de imunodetecçSo PicoBlue foi da Strsiagene» Todos os outros compostos químicos foram de grau de pureza reagente ou melhor»

Bluescript Mi3-í- e a sua estirpe hospedeira E»coli DHba

Crec^......Z~' 5ndtl.....tmffilZ <rk-5 mk-^)g.,,5up##1........hsd. M‘« inetB, trpR, tonft2i . procssTn-5 CpMC9>j e LE 392 <F , supE44, SágESIb........laçtrp55? QsdR5Í4 (R^ Mk+> lfof.ein usados como hospedeiros para xti 1 e EMBL3A,, respectivamente = A estirpe de levedura de padeiro TD71=8 <*u ino5, leu2n his3, lis2) foi um presente do Dr„ Jack Szostak» As bibliotecas qenómicas de levedura em >;tii e EMBL3A foram oferecidas pelo Dr» Richard A» Young» Como alternativa podem ser empregues vsctares e bibliotecas semelhantes»

Na descrição que se segue da purificação das aminope-ptidases especificas de substrato do presente invento» a activi-dads de aminopeptidase pode ser testada por qualquer método adequado» 0 ensaio preferido para a actividade de aminopeptidase específica de substrato é o seguintes A actividade enzimática pode ser testada usando Net-pNA ímetionina-para-nitroanilida) ou o peptideos net-AIa-Ber» como

substrato. Mst-pMA foi usado para ensaiar a actividade de amino·--peptidase ds API. Com esta final idade, a hidrólise do substrato p~nitraani 1 id.a foi testada de acordo coo Tuppy, et al, „ (Tuoov„ 1-1« st al»,Physioi„ Chsm, 329g278-288 C1962)).

Quando -se usa Met—pNA coma substrato* uma amostra ds 1@μΙ de cada fracção colhida de uma coluna de cromatografia ê adiccionada a uma cavidade marcada de uma placa da microtitulaçao contendo 45μ1 de uma solução que contem 4mM Mst-pNA, 10mM HEPES-—K.' 3 pH 7,35, ® ? 2fm.fi CoCL._s? θ ,022 MaM^« Todas- as rescçSes foram de preferência sfsctuadas usando uma placa de microtitulaçlo, Após incubação durante uma hora ã temperatura ambiente3 a ahsorvãncia da amostra, a 414nm foi determinada usando um leitor de placas.

Quando o ensaio foi conduzido usando Met-Ala~Ser como substrato, uma amostra 16ul de cada uma das fracçSes colhidas de uma coluna de cromatografia foi transferida -para uma cavidade marcada de uma placa de microtitu1ação contendo 45μ1 da solução que contem 4mM Met-Ala-Ser, 10mM HEPES-K*, pH 7,35, 0,2mM CoCL^, 0,211 KCL, 155mM figCL03 0,02% NaR^, 10pg ds oxidsse de L-aminoàci-dos, liSfjg de peroxidase de rábano silvestre e ίθμα de di-hidro-cloreto ds o-dianisidina.

As reacçSes foram efectuadas à temperatura ambiente, durante uma hora e a absorvãncia a 450nms de a 414nm, foi registada.

As mediçSes de UV, quando necessárias, foram obtidas usando um espectofotómetro de UV Packard 845ΘΑ UV« Os ensaios de proteína foram efectuados pelo método de Bradford (valls, L.A.st al., Ce11 48;87-897 (1987)), usando BSA como proteína padrão. As amostras radioactivas foram contadas num contador de cintilação Beckmsn LS 38€>1, 0 isolamento e purificação das aminopeptidases especificas de substrato tío presente invento será daqui em diante descrito a partir de uma amostra de levedura, se bem que se deva entender que outras amostras poderão ser usadas como fonte de material„

As células de levedura, de preferencia Saccharomyces cerevisiae e de preferencia a estirpe TD7i =.8,, foram cultivadas em meio adequado (de prefsrfncia meio YPDsl% extracto de levedura, 2% Bacto-peptona, 2% glucose) para uma de 5—20« As- prepara ções de -células colhidas a uma A.,de 8 ou -a uma A.. Λ,.. de 18-20 D & t? t' encontrou—ss serem equivalentes à actividade de aminopeptidase específica de substrato,. As células foram colhidas, de preferencia por centrifugação e ressuspensas em meio YPD contendo 15% glicerol* As células podem entaão ser congeladas, até -70*0 e guardadas durante um período prolongado*

As células congeladas foram descongeladas os preferfn-cia por incubação num banho-maria a 30°C e colhidas por centrifugação á temperatura ambiente* As células sedimentadas foram ressuspensas num tampão adequado como seja Tampão S < ir! Sorbitol , 50m!vl Tris, pH 7,8, 10mM HgCL_, 3mfi DTT) suplementado com liticase s incubadas a 3®*C para permitir a formação de esferoolastos* Os esferoplastos foram então colhidos, lavados com ®ais JTampão 8, iisados e homogenizados em Tampão hipotónico, como seja o Tampão A <10mM HEPES-K*, pH 7,0, 1 ,5m!1 ligCL^, 10mM KOI. e 0,5mM DTT)* A hofiiogsnização foi de prefsrfncia efectuada a 4*0 usando um homogenizador Dounce» A aminopeptidase especifica de substrato de levedura é libertada para o lisado celular por agitação suave* Após remoção de quaisquer detritos por centrifugação, adicionou-—se glicerol ao sobrenadants tío lisado (10% concentração final) de modo a aumentar a estabilidade da aminopeptidase especifica de substrato* 0 sobrenadante atrás descrito do lisado celular foi então concentrado para i®0ml utilisando uma membrana de ultrafil-tração Prl-1® e dialisado tris vszss contra 2 litros de ura tampão adequados como seja um tampio H (10mM HEPES-K^j pH 7?355 l?5mM MgCL^j 0?5mM ΟΤΤ, ©?2a NaN^,, 1©% gl icerol) ? suplementado para conter 0?Θ5Μ KCL* Os biomateriais celulares residuais presentes no sobrenadan te foram removidos par-a evitar a agregação proteína-—biomaterial nos passos subsequentes = A cromatografia de permuta iónica pode ser usada para este processo» Neste passo» a permuta iènlcs usada é de preferencia cromatografia em CM—Sepharose, de oreferfncia empregando Cll-Sepharose CL-éB» 0 sohrenadante concentrado foi tíe preferencia aplicado numa coluna de CM—Sepharose CL-6B que tinha sido ligada a uma coluna de DEAE-Sepharose CL-6B de modo a que o eluato da coluna de CM-Sepharose CL-6B fosse aplicado continuaments a uma coluna de DEAE—Sepharose CL—6B„

Ambas as colunas foram equilibradas contra o mesmo tampão usado na diálise» As duas colunas ligadas foram então aluídas com 2 litros de tampão H (suplementado para conter β325Μ KCL) ou um outro tampão adequado» As colunas foram então desligadas» A coluna de DEAE-Sepharose CL-6B foi eluíds com um gradiente linear de Θ?05Ι1 a ©põti KCL em tampão H a apronimadamen-t.e 17ml/hr» Colheram-se fracçBes de aprosíimadamente 5ml e testaram-se quanto à actividatíe de aminopeptida.se especifica de substrato» As fracçSes contendo actividade de aminopeptidase (tipicamente fracçSes 41-71 de um total de 143 fracçSes? conduti™ vidade média de 9?7ms> foram reunidas e concentradas para um volume de lôml usando uma membrana de ultrafi1 tração ΡΜ-ΙΘ» 0 eluato concentrado da cromatografia em DEAE-Sepharose CL-éB atrás descrita foi dialisado tris veces contra ! litro de tampio H (suplementado por conter ®?®5n KCL) e aplicado a uma segunda coluna de DEAE-Sepharose CL-6B equilibrada com o mesmo

X tampão asada na diálise, Esta coluna foi sluida com um gradiente linear de θ,05π a 0,2n KCL em tampão H a 18ml/hr» Colheram-se fracções de 4-5ml s testaram—se quanto à actividade de aminope-ptidase específica de substrato, A actividade de aminopeptidase APS5 API e APX encontram-se todas nas fracções 113-133 (de um total de 143 fracções)p a condutividade das fracções reunidas é de aoroximadamente 1 β,2ms = Estas fracções foram reunidas e concentradas para 5ml usando uma membrana de ultrafiltração PM-10. 0 eluato concentrado da cromatografia em DEAE-Sepharose CL—68 atrás descrita foi dialisado tris vezes contra 1 litro de tampão fosfato de potássio, pH 7,15, 0,514 DTT, 5mM KCL, i©% glicarol, 0,02% NalX s aplicado numa coluna da hidroxilapatite equilibrada contra o mesmo tampão usado na diálise, A coluna foi eluída com um gradiente linear de ®,01H a Θ,5Μ de tampão fosfato da potássio, pH 7,15, 0,511 DTT, õraM KCL, 10% glicerol, 8,02%

NaN7? a ISml/hr» Colheram-se fracções de 4~5m!» A aminopeptidase

O APS foi encontrada nas fracções 43-47 (condutividade média 7,2 ms). A aminopeptidase APX foi encontrada nas fracções 67-75 (condutividade média 16s5ins)» A aminopeptidase API foi encontrada nas fracções- 83-97 (condutividade média 23,0 ms)= As fracções contendo cada ums. das aminopeptidases foram reunidas separadamen™ ta a concentradas para ura volume de 5ml usando uma membrana da ultrafiltraçâo ΡΜ-1Θ, A aminopeptidase API pode ser ainda purificada usando cromatografia de interseção hidrofóbica (de preferência usando cromatografia em Phenyl-Sepharose CL—4B), Esta é de preferfncia realizada dialisando o eluato concentrado da cromatografia em hidroxilapatite atrás descrita tris vezes contra 1 litro de tampão H (10mM HEPEB-K% pH 7,35, 0,5mM DTT, í .5mM !1oCL^„ 0,02% S. *

NaN.^n 10% glicerol) contendo Θ,2Μ KCL, Um volume igual de solução $

saturada ds sulfata ds amónia a S-ô%s 1@riM HEPES-K' 5 pH 7S35, i®% glicsrol* 0502% NaN._ foi adiccionado à solução contendo aminops-ptidase» Esta mistura foi aplicada numa coluna ds Phsnyl-Bepha-rose CL-4B equilibrada com solução saturada de sulfata de amónia a 40%5 10mM HEPES-K*·, pH 7,35, 1β% glicerol, θ,25<ηΜ DTT5 0,1M KCL? 0,02% NaN.^» A coluna foi primeiro sluids com 5®ml do mesmo tampão descrito atrás e depois com um gradiente linear de 40% a 0% ds solução de sulfato ds amónio, 10mM HEPES-K' , pH 7,35, 10% glicerol, Θ,25οιγ1 DTT, 0,02% NafsL, 100mM KCL a aproximadamente O ’ 72ml/hr„ Colheram-se fracçoes ds aproximadamsnts 4-m 1 e testaram-—se quanto á actividade de aminopeptidase» A aminopeptidase API é tipicamente encontrada nas fracçSes 103-113 de um total de 141 fracçõess as fracçSes sctivas foram reunidas <condutividade média ds aproximadaments 2óms) e concentradas para 3ml usando uma membrana de u1trafi1tração PM-lΘ =

Usando esta série de passos cromatográficos, as amino-peptidases ds levedura especificas de substrato AP2 s API foram purificadas até quase à homogenidade* As enzimas têm pesos moleculares aparentes ds aproximadamente 93 000 e 5Θ 000 respec-tivamente*

Nuns método alternativo para a purificação de API, um extracto de levedura bruto de células concentradas pode ser obtido segumdo o método de Lin st al., CLin, R = J» et al = =0» Biol* Chsai, 260s 1478Θ-14792 (1985))» A API presente num tal exemplo pode ser purificada até quase á homogenidade pelo método de Metz e Rohm CMstZj 8« et al», Biochem Biophys Acta 429a 933-949 (1976))= Amostras do eluato concentrado da cromatografia em Sepharose Cl-éB foram de preferência aplicadas a três géis de SDS-PAGE (8%) com uma espessura de í,5cnm e com um poço de 12cm, sujeitas a electroforese s electroeluidas, como descrito por Hunkapiller, H„W» et al.(Methods Enzymol. Pis 227-247 (1983)) =

Quando este método de purificação alternativo foi empregues encontrou-ss que as 2 litros de células concentradas continham sproximadamente 900pg de ARI* Uma purificação de aproximadsmsnie 8Θ0 vezes foi conseguida por este método e obtido um rendimento de ^350pg de ΑΡΪ»

Os termos peptídeo3 polipeptideo e proteína referem-se todos a polímeros de resíduos de aminoácidos» Um peptídeo é um polímero de pelo menos dois resíduos de aminoácidos ligados um ao outro por uma ligação peptídica» Um polipeptideo â um polímero de vários resíduos de ajninoácidos ligados uns aos outros por ligações peptidicas» Uma proteína é um polímero grande de muitos resíduos ds aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptidicas» 0 termo " am i η o pe p t i d ase,! conforme aqui é usado refere— -se a uma enzima capaz de atacar s clivar a ligação peptídica que liga o resíduo de aminoáeido amino-terminal de um peptídeo Ce portanto também de um polipeptideo ou proteína) ao penúltimo resíduo de aminoáeido amino-terminal daquele peptídeo (ou poli— peptídeo ou proteína)»

As aminopeptidasss da presente invenção são "aminope-ptidases específicas de substrato”» Uma aminopeptidass é referida como sendo ”especifica de substrato” se apenas certos psptídeos ou proteínasCi»e=não qualquer peptídeo ou proteína) servirem como um substrato para a enzima» Tais substratos adequados possuem resíduos amino-terminais e penúltimos resíduos amino-terminais particulares5 os quais são ligados por uma ligação peptídica» A especificidade de substrato da aminopeptidass é definida pela sua capacidade ou incapacidade para clivar um substrato particular» a especificida.de de substrato das aminopeptidases do presente invento está definida abaixo»

0 termo "pré-sequência" pretende referir-se a uni polipeptideo que quando ligado via uma ligação peptidica ao estremo amina de uma proteína (ou um segundo polipeptideo) á suficiente para fazer com que a proteína (ou um segundo polipe— ptídeo) é suficiente para fazer com que a proteína ou polipeptí-dao ligado seja dirigido para uma localização celular particular« São de particular interesse para a presente invenção as pré-sequências que sejam suficientes para dirigir uma proteína ou polipeptideo através de uma membrana de uma célula de levedura a mais espscificamente através de tal membrana para um vacõolo de levedura* A sequência preferida de tal "pré-sequência de localização vacuolar" és B1u-61u-G1n-Arg-G1u™I1e-Leu-B1u-G1n-Leu-Lys-Lys-Thr-Lsu-BXn-—Mst—Leu-Thr-Va 1—01 u~Pro—Ser-Lys—Asn—Asn—Sln—Σ le~AIa—Asn—Glu~ -G1u-Lys-6Iu-Lys-Lys-S1u-ASn-G1u-Asn-Ser-Trρ-Cys-I1e-Leu*

Uma sequência de localização vacuolar* no entanto, contem ou nso um*. dois ou mais aminoáciuos adicionais de um dos seus extremos* Por exemplo., a sequência pode conter um resíduo de metionina adicional no seu extremo amina* Uma pré-sequência tís localização vacuolar pode ainda ser capaz de dirigir uma proteína ou polipeptideo ligado para outros organelos além dos vacúolos ou através de outras membranas além da membrana do vacáolo* A elucidação da sequência da prs-sequência de localização permite ligar a pré-sequência a qualquer proteína ou poiineptidão heterólogo pretendido de modo a fazer com que a proteína ou polipeptideo fique sujeito ao controle da pré—sequência de localização» Conforme aqui é usada, uma proteína ou polipeptideo é referido como "heterélogo" ss não se encontrar naturalmente ligada á pré-sequência de localização vacuolar da presente invenção» As proteínas e polipstideos heterólogos que slo ligados \ · ás oré-sequência de localização vacuolar da presente invenção podem ser preparadas através da utilização de técnicas recombi-nantes como sejam através de ligação de uma sequência de gene capaz de codificar a pré-sequência de localização a uma sequência de gene capas de codificar a proteína ou polipsptídeo heterélogo» Processos para a construção de moléculas rscombinantes de acordo com o método atrás descrito foram divulgados por liar?iatis, T» et alx..».......Eits.........Molecular ..Cloning.».....A Lafaoratory Manual, Cold Spring

Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1.984), referência essa que aqyui é incluída por referência» A sequência de resíduos de asTiinoàcidos numa proteína ou poiipeptideo é aqui designada através da utilização das suas designações de 3 letras normalmente empregues» Uma lista destas designações de 3 letras pode ser concentrada nos livros de texto tais como Biochemistry» Lehninger, A», Worth Publishers? New YorK, NY (197Θ>» Quando tal sequência é apresentada horizontal-mente, o extremo amina é normalmente o extremo esquerdo enquanto que o extremo carboxilo é normalmente o extremo direito» Os resíduod de aminoácidos num peptídeo podem ser indicados pela maiúscula da primeira letra do resíduo de aminoàcido ou como alternativa, através da separação de resíduos adjacentes usando hifens» Tais hifens destinam-se apenas a facilitar a apresentação de uma sequência., Como exemplo puramente adisíinistrativo, a sequência de aminoàeido designadas SIi—Ala—Ser—Fen índica que um resíduo de Ala está ligado ao grupo carboxilo de Sli e que um resíduo de Ser está ligado ao grupo carboxilo do resíduo Ala e ao grupo amina de um resíduo Fen» A designação indica ainda que usna sequência de aminoácidos contem o tetrape-ptídeo 81i-Ala-Se?—Fen» A designação não se destina a limitar a y ; , sequência de ara ino-ac idos a este tetrapeptídeo. mas antes destina--ss a incluir (1) o tetrapeptídeo tendo um ou mais resíduos de arainoácidos ligados ao extremo araina ou carhoxiloP <25 o tetrapeptídeo tendo um ou mais resíduos de aminoàcidos ligados a ambos os extremos assina s carboxilo. <35 α tetrapeptídeo nao tendo resíduos de aminoàcidos adicionais.

As proteínas e peptideos da presente invenção podem ser codificados por moléculas de ácidos nucleicos. A sequência de tais moléculas de ácido nucleico pode ser facilmente determinada pelas pessoas dentro da matéria através da referência no cédigo genético ÍWatsons d „ D = Eras Molecular Bioloqy of tiis Ssns, 3rd Ed.? W.Ã. Benjamin? Inc. Menlo Park. CA <Í977>? pág . 356-357)5 Lshninger5 A.:, Biocheraistry, Uorth Publishsrs5 Ne^ YorK5 NY (197®)). Devido ao cédigo genético ser degenerado5 mais do que uts codão pode ser usado para codificar ura arainoàcido particular. A presente invenção diz respeito a uma enzima aminope— ptidase especifica de substrato que está l!suhstancialmente pura” ou que foi “substancialmente purifiçada”= Conforme aqui são usados os termos "substanciaimente pura” ou "substancialmente purificada” pretendem ser equivalentes e descrevem uma aminope— ptioase específica de substrato que está substancialmente livre de um composto normalmente associado à enzima no seu estado natural. i.e.? uma proteína., açúcar, lipido. etc. 0 termo pretende ainda descrever uma aminopeptidase especifica de substrato que é homogénea por ura ou mais dos ensaios de pureza ou homogenidade usados pelos familiarizados com a matéria. Por exemplo9 uma aminopeptidase específica de substrato substancialmente pura apresentará característícas constantes e reprodutíveis dentro dos desvios padrões experiraentais para parâmetros tais cornos peso molecular5 técnicas cromatográficas, etc. 0 termo “substancialmente puro”, no entanto não pretenda excluir misturas artificiais ou sintéticas das encimas com outros compostos0 termo também não pretende eKciuir a presença de impurezas que não interfiram com a actividade biológica da enzima e que podem estar presentes., por exemplo., devido a purificação incompleta» IICaracterização das aminopeotidases especificas de substrato da presente invenção» A aminopeptidase AP2

Os géis de SDS-poliacrilamida da amostra purificada revelam que AP2 migra coma uma única banda com um pesa molecular aparente de 93 ΒΦΦ quando corada com azul Coomassie» A electro-forese foi efectuada de acordo com o método de Laemmli, Lí = !< = (Nature 227 s ό8β·~6Β5 (197Θ)) usando um gel de 9 ou 1Θ%» 0 gel foi corado com azul Coomassie» 0 gel foi calibrada usando os seguintes padrões de peso moleculars mi os i na (2Θ5 ©Θ®} 5 p-galactosidade ds E» coli Cílé ΘΘ0)5 fosforilase de músculo de coelho (97 θθθ>5 albumina de soro bovina <66 ΘΦΘ)» albumina tío ovo (45 ΦΘ0) s anidrase carbónica (29 ΘΘθ)«

A aminopeptidase ARI A aminopeptidase API é a aminopeptidase preferida da presente invenção» Conforme aqui sSo usados os termos “Aminope-ptidase API!S ou ”Aminopeptidase I ds levedura2' pretendem referir-—se a aminopeptidase da levedura que foi referida como “Aminopeptidase 121 de levedura" ou "AP121" no Pedido de Patente U»S» do requerente NO de Série 07/243 733 entregue em 13 de Setembro de ISSSs de cujo pedido ds patente o presente pedido reivindica prioridade» 0 nome da aminopeptidase foi alterado para estar de acordo com a nomenclatura empregue pelos que trabalham neste campo» 8éis de SD3-poliacrilamida da amostra API;s purificada como descrito atrás, revelam que API migra como uma única banda com um peso molecular aparente de aproximadsmenta 5© ©©© ± 2 ©Φ© quando eoradaco® azul Coomassie, A elsctroforese foi efectuada como descrito atrás» 0 peso molecular nativo da enzima foi determinada como se segue? A enzima parcialmente purificada foi aplicada numa coluna de Sepharose CL-ôB <2,© κ 9©cííi>,> 0 tampso de sluição foi o tampão B (20mM HEPES-K*, pH 7,35, 5mM MqCL^, Θ„5«ηΗ DTT, @?2M KCL, ©,Θ2% MaN^> e o caudal de Í4ml/hr, 0 volume de eluição da amino-

O psptidase I foi determinado pelo ensaio enzimático convencional s o peso molecular aparente a foi calculado a partir dos volumes de eluiçao relativos dos padrões de proteína incluindo Cl) tiroglo- bulina (669 &&Θ), (2) apoferritina (443 ©©©)5 <3> β-anilase (2©© ΘΦ0}^ (4) àlcool-desidrogenase (15© ©©©), (5) albumina do soro bovina (66 ©©©) e (6) anidras© carbónica (29 ΘΘ©)= A M da enzima r nativa foi calculada como sendo de aproxímadamente 57© ©©© ± 2© ©©0 „ A H da enzima nativa (57© ©Θ© ± 2© ©®@> e da sua subunidade (5© &&Φ ± 2 ©Θ©) está de acordo com os resultados de outros, que determinaram ser a proteína uma glicoproteína muiti-mérica (Johnson, M.J., J. Biol, Chem, 137s575-5B6 (1941); Trum-bly, R, J. st ai., J» Bacteriol 156s56-49 (1983) % Frey, J. et al. Biochem. Biophys, Acta 527s31-41 (I978>| Metz, B = et al,s Bio-chem, Biophys, Acta 429s935~949 (1976)), Para se clonar o DMA gsnómico codificador, a sequfncia NH^-terminal dos 18 primeiros aminoácidos da enzima foi determinada e esta sequfncia constituiu a base da síntese da sondas aligonucleatídicas (Figura 1),

Para detrminar a sequfncia de aminoácidos do estremo vMr> da proteína, aminopeptidase API purificada foi sujeita á degradação de Edinan para determinar a sequência de aminoácidos do extremo amina da enzima» Esta análise revelou que o extremo amina é cofisposto pela seguinte sequtncias 8LU-HIS-ASN-TIR-GLU-ASP-XLE--ALA-SLN-BLU—FEN-ILE-ASP-FEN-ILE-TIR-L1S-ASN« 111= Especificidade de substrato das aminopeptidases

Uma determinação parcial da especificidade de substrato de AP2, API e APX foi efectuada usando uma série de trinta a seis psptideos puros» Os peptideos tinham uma das duas sequi'r?cias%

íI) MET-X-1LE—PRO—BLU—TRE ou CII) X-ILE-PRO-SLU-TRE em que “X“ se refere a um dos seguintes dezoito aminoácidoss Vai, Ala, Arg, Asp, Cís, BIu, Slu, 611, His, Xis, Leu, Lis» ríet, Fsn, Pro, Ser, Tre e TRp,

Encontrou-se que AP” é capaz de clivar os peptideos do grupo I em que “X" seja Arg, Asp» Blu, Gli, His, Ile, Leu, Lis» iist ou Fen»

Nenhum outro peptideo testado do grupo I foi clivado por AP2» AP2 conseguiu clivar apenas as peptideos da grupa II em, que !!X3! era Ala, Arg, Blu, Hís, Ile, Leu, Met, Fen, Pro, Ber, Tre ou Trp» Nenhum outro peptideo testada do grupa II foi clivado»

Encontrou-se que ΑΡΪ é capaz de clivar os psptideos do grupo I em que “X!i é Ala, Arg» Asp, Cis, Gli, His, Ile, Leu, Lis, Met, Fen, Ber ou Trp» Nenhum outro peptideo testado do grupo I foi clivado por API» API foi capaz de clivar apenas as V. polipsptidsQs do grupo II ss que UX!! era Args G1 n, Bis, Leur, flet» Fen, Pro, Ser;, Trs ou TRp»

Nenhum outra peptídea testado do grupo II foi clivado»

Encontrou-se que APX é capaz de clivar qualquer um dos peptideos testados do grupo 1= APX foi capaz de clivar apenas os peptideos do grupo II em que !6XS! era Vai, Ala = Aro, Bln, Gli,

His, 11a, Leu5 Met, Fen, Tre ou Trp, Nenhum outro psptídeo testado do grupo II foi clivado» IV» Engenharia genética das arainopeptidases da presente invenção» A identificação das funções que contêm actividade de AP2, API ou APX substancialmente purificada permite que seja determinada a sequência de aminoácidos destas enzimas e permite ainda que estas moléculas sejam produzidas atarvés da aplicação de técnicas de DMA recombinante» Assim, o presente inclui nlo sé AP”3 API e APX substancialmente purificadas e métodos para a sua utilização, como também inclui as sequências de aminoácidos destas enzimas, as sequências genéticas codificadoras destas enzimas, veículos contendo tais sequências genéticas, hospedeiros transformadoscom eles» produção de enzimas através da expressão no hospedeiro transformado e utilização das enzimas na clivagem de peptideos ou proteínas contendo α substrato» API é a arainope-ptidsse específica de substrato preferida da presente invenção»

Para se obter a sequência de aminoácidos das enzimas, as enzimas» nas fracções substancialmente purificadas são recuperadas por exemplo por electroeluiçao de um gel de poliacrilamida» As moléculas recuperadas podem ser então sequenciadas, de preferência usando um sequenciador automático e a sequência de aminoácidos da enzima assim determinada»

Coíbo alternativa e de preferência, a sequência de aminoàcidos das enzimas é determinada através de uma análise do DNA ou ainda mais preferível, da ssqu?nia de cQNA, do gene que codifica a enzima. Para se obter estas sequências de ácido rmcleico fez-se o despiste de uma fonte que contem o gene AP2, API ou APX ou a sequência de cDNA usando sondas oligonucleotidi-cas sintéticas que codificam fragmentos da. enzima AP% API ou APX

Para preparar as sondas oligonucleotídicas, a enzima substancialmente purificada foi recuperada e fragmentada com brometo de cianogènio ou com proteasss tais como papaina, quimo-tripsina, tripsina, etc, (Oiks, Y. et al.; 3, Biol, Chara, 257s9751-9758 (1982)p Lin, C.-et a.I,, Int.J» Pept, Protein Res, 21_ã209-215 (1983)), Os peptídeos resultantes foram separados, de preferência por HPLC de fase inversa e sujeitos a sequenciaçSo de aminoáciuos, Para se obter esta finalidade os peptídeos foram analisados de preferência por sequenciadores automáticos,

Uma vez sequenciados um ou mais peptídeos adequados, as sequências de DMA capazes de os codificar foram examinadas, Be os peptídeos forem superiores a 1Θ aminoàcidos de comprimento esta informação da sequência é geralmsnte suficiente para permitir a clonagem da sequência de um gene como seja os que codificam as enzimas da presente invenção. Devido ao código genético ser degenerado, no entanto, mais do que um codSo pode ser usado para codificar um aminoácido particular CWatson, J„D= Em5 Molecular Bioloqy of the Gene, 3rd Ed» , W,A, Benjamim, Xnc, , rlenlo Park, CA (1977), pãg, 356-357), Usando o código genético podem ser identificados um ou mais oligonucleotídeos diferentes, cada um dos quais será capaz de codificar os peptídeos da enzima, A probabilidade de ura oligonucleotideo particular constituir de facto a sequência codificadora do fragmento de enzima pode ser calculada

considerando as relações ds emparelhamento de bases anormais e a frequência com que um codão particular é de facto usado (para codificar um aminoácido particular) nas células eucarísticas*

Tais regras* de "frequência de utilização de codões" estão descritas por Laihe, R = et al* * J* Holec* Biol* 183sl-12 C19S5)* Usando as “regras de frequência de utilização de codBes" de Lathe pode-se identificar um oligonucleotídeo ou uma série ds oligonu-clsotideos que contenha a sequência de nucleotideos teoricamente "mais provável" capaz de codificar as sequências peptídicas do fragmento enzimàtíco*

As técnicas parai a síntese de oligonucleotídeos estão descritas por exemplo5 por Wu3 R„ et al*, Prog* Nucl* ficid* Ras* Holec. Biol* 21s101—141 (1970))* Processos para a construção de moléculas recombinantes de acordo com o método atrás descrito estão descritos por Maniatis, T=? et al** Ems Mo1ecular Cloninq , A Laboraiory Manual * Cold Spring Harbor Presss Cold Spring Harborj NY (1984)? referência que aqui é incluída por referência*

Se beiTs que apenas ocasionalmente3 uma sequência de aminoácidos pode ser codificada por um só oligonucleotídeo, frequentemente a sequência de aminoácidos pode ser codificada por qualquer uma de uma série de oligonucleotídeos semelhantes* £ 741)* coenzimas (ver Pai* U*S* NQs* 4* 23® ? 797 e 4, 238s 5ó5) e inibidores de enzima (ver Pat* U*B* NS 4, 134, 792)5 substâncias fluorescentes (ver Clin* Cheau 25s353 < 19795 5 ^ cromafaros5 sbstSncias luminescsntes tais como quimioluminescentes e bíolumi- nescentes (ver Clin* Chem* 25t512 C1979))s ligandos específica- mente ligáveisp pares de interacçao proximals e radioisótopos __ _ tais como 3 * " S, T e 14.^* íais marcas e pares ds ΓΊ ' ‘ P 5 1 i L- marcação são detectados com base nas suas propriedades físicas <e*q* substâncias fluorescentes* cromóforos e radioisótopos) ou nas suas propriedades reactivas ou de ligação ie=q*? enzimas, substratos, coenzimas e inifaidores). Por exemplo, uma sonda marcada com um cofactor pode ser detsctada pela adição da enzima para a qual a marcaé um cofactor e um substrato da enzima. Por exemplo, pode-~se usar uma enzima que actue sobre um substrato para gerar um produto com uma propriedade fisica mensurável= Exemplas desta última incluem, mas não estão limitados a beta-—galactosídase, fosfatase alcalina e paroxioaxe.

Om oligonucleotídeo adequado ou série de oligonucleo-tídsos que é capaz de codificar um fragmento da sequência do gene que codifica a enzima (ou que è complementar de tal oligonucleo— tideo opu série de oligonucleotideos) foi identificado (usando o processo atrás descrito), sintetizado e hihridado, por meios bem conhecidos na área, com um DMA ou de preferência uma preparação de cBNA derivado de células que são capazes de expressar a enzima. Moléculas de oligonucleotídeo de cadeia simples complementares das sequências !ímais prováveis'5 codificadoras do peptí-deo da enzima podem ser sintetizadas usando processos que são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria (Belagajs, R„, et ai.. J. Biol. Chem. 254 § 5765-5780 <1979)i Maniatis, I. .et al. ».JlQleçMlar......Mechanisms. in.......the Control of 6ene„Expressipn.

Misrlich, D.P., et al.. Eds-, Acad. Press, MY (1976) j= Wu, R. et a,l.B„,Proq· Wucl. Acid. Res- Holec. Biol. 21 = 101-191 (1978)? Khorana, R.S., Science 2Θ3s614-625 (1979))= Em adição a síntese de DMA pode ser conseguida através da utilização de sintetizado-res automáticos. As técnicas de hibridação de ácidos nucleicos estão descritas por Maniatis. T..et ah5(Ems Molecular Cloning. A Laboratorv Manual„ Colo Spring Harbor Laboratories, Cola Spring Harbor., NY (1982)) e por Haymes, B.D., et al-.CEmg IMucleic Ac ia. Hybridization„ A Practiçal__Appro5ch,1 IRL Press, Washington, DC (1985)), as referências das quais estão aqui incluídas por referência. >

Uma sequência de DNA codificadora de AP22» API ou APX pode derivar ds uma variedade ds fontes» Por exemplo, mRNA codificador de ambas as enzimas pode ser isolado a partir de tecidos ds qualquer espécie que produza a enzima s identificado usando o método de transferência Northern íAlwine et al», Hethod

Enzymol „___6Ss220~242 (1979)> e sondas oligonucleotídicas marcadas» 0 ORNA pode ser então convertido em cDNA por técnicas conhecidas dos familiarizados com a matéria» Como alternativa,, DNA genómico pode ser isolado e empregue» A fonte de DNA ou de cDNA usada terá sido preferencialmente enriquecida na sequência do gene que codifica a enzima» Tal enriquecimento pode ser mais fácilmente conseguido a partir de cDNA obtido por extracção de RNA das células, tais como células ds levedura, que produzem niveis elevados da enzima» Um exemplo de tais células é Saccharomvces Cerevisiae»

Qualquer uin de uma variedade ds métodos pode ser usado para clonar uma sequência dos genes que codificam as enzimas da presente invenção» um desses métodos engloba a análise ds uma biblioteca de inserções de cDNA num vector “vai vem” íinmserções derivadas de uma célula que expressa as enzimas do presente invento) quanto à presença de uma inserção que contenha uma sequência do gene, a qual é capaz de codificar a enzima» Tal análise deve ser conduzida através da transfscçSo ds células com o vector e depois testando a expressão da enzima»

Para identificar e clonar a sequência do gene capaz de codificar cada uma das enzimas da presente invenção faz—se o despiste de uma biblioteca ds DNA ou preferencialmente de CDNA quanto á sua capacidade para hibridar com as sondas oligonucleotídicas descritas atrás» As preparações de DNA adequadas (como seja DNA genémico humano) sSo clivadas enziméticamente ou fragmentadas ao acaso e ligadas a vectores recombinantes» A

capacidade destes vectores reccmfainantes para hibridar com as sondas olígonueleotídicas atrás descritas foi então medida» Os vectores que se encontraram capazes de tal hibridação foram então analisados para detrminar o grau e natureza das ssquSnciss enzimáticas que contam» Baseado puramente em considerações estatísticas uma sequência de gene capaz de codificar qualqueruma das enzimas da presente invenção poderá ser identificada sem ambiguidade (através da despiste de hibridação) usando uma sonda oligonucleotidica tendo apenas 18 nucleotiddeos»

Numa via alternativa de clonagem de uma sequência dos genes que codificam as enzimas da presente invenção, preparou-se uma biblioteca de vectores de expressão por clonagem de DMA ou, de preferência., cDNA (derivado de uma célula capaz de expressar a enzima) num vector de expressão» A biblioteca foi então despistada quanto a membros capazes de expressar uma proteína que se liga ao anticorpo específico da enzima e que tem uma sequência núcleo-tidica que é capaz de ccídificar polipeptídeosque possuem a mesma sequência de aminoácidos da enzima ou seus fragmentos»

Nesta realização, DNA ou, de preferência cDMA é extraído e purificado a partir de uma célula que seja capaz de expressar a enzima» 0 cDNA purificado foi fragmentado (por fricção, digestão com endonucleases, etc») para produzir um conjunto de fragmentos de DNA ou de cDNA» Os fragmentos de DMA ou de cDMA deste conjunto foram então clcoados num vector de expressão para produzir uma biblioteca genómica ou de cDNA em vectores de expressão cujos membros contêm um único fragmento de DMA ou cDMA clonado»

Assim» resumindo» a identificação das aminopeptidases especificas de substrato do presente invento permite a identificação de uma sequência de DNA Vtteoricamente mais provável" ou de

X uma série de tais sequências? capazes de codificar a sequência peptidica destas enzimas.

Através da construção de ura oligonucleotideo coraplementar desta sequência teórica (ou através da construção de uma séria de aligonucleatídeos corapleraentares da série de oliganu-cleotídeos "m&is prováveis") obtem-se uma molécula de DMA (ou série de moléculas de DMA) capazes de funcionarem como sendo para identificar e isolar uma sequência de gene capaz de codificar cada uma das sequências da presente invenção» Técinicas semelhantes ou iguais às descritas atrás permitiram clonar com êxito genes de aldaido-desidrogenases humanas CHsus L-C.-et ah, Proc Natl. ftcad» Sei, USA §2§3771-3775 (1985)) ? fibronectina (Suzuki, S „ 3 et al., Eur„ Hoh 9iol, Orqan,, 3, 4s2519-2524 (1985)), o gene do receptor de estrogénios humano (walter5 P, et ah. Proc Natl, Acad - Sei, USA 82§7889-7895 (1985)), activador do plasminogénio tipo tecido (Pennica, D=? et ai,, Hature 301¾214-221 (1983)) e DNA co0iplementar da fosfatas© alcalina humana de placenta (Kam, W= st .....Proc.......Natl, fieari ,

Sei. USA 82§8715-8719 (1985)), V, Expressão de sequências codificadoras das aminopeptidases especificas de substrato

Moléculas de DMA ou cBNA que codificam a enzima AP2, API ou APX podem ser operacionalraente ligadas num vsetor de expressão e introduzidas numa célula hospedeira para permitir a expressão da enzima ÃP2, API ou APX pela célula, Duas sequências de DMA (como sejam uma sequência da região promotora e uma sequência codificadora da enzima pretendida) são referidas como estando operacionalmente ligadas se a natureza da ligação entre as duas sequências de DMA não (1) resultar na introdução de uma » - mutação de desvia da grelha de leitura, (2) interferir com a capacidade da sequência da região promotora para dirigir a transcrição da sequência de gene codificador da enzima pretendida ou (3) interferir com a capacidade da sequência do gene da enzima pretendida para ser transcrita pela sequência da região promotora »

Uma sequência de DNA codificadora de AP2, API ou APX pode ser recombinada com o DNA vsctor de acordo com técnicas convencionaiss incluindo extremos cersss ou extremos coesivos para ligação, digestão com enzimas de restrição, para dar os extremos adequados, preenchimento dos extremos coesivos conforme sdeuado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligaçóes indesejáveis e ligação com ligases adequadas» A presente invenção inclui a expressão da enzima pretendida, em células procarióticas ou eucarísticas» Hospedeiros eucarísticos preferidos incluem leveduras» fungos (especialmente Aspergi1lus) células de mamíferos (tais como por exemplo, células humanas ou de primatas) in vivo ou em cultura de tecidos»

As leveduras são os hospedeiros preferidos da presente invenção» A utilização de leveduras proporciona vantagens substanciais pelo facto de as leveduras poderem fazer modificações dos psptídeos após a tradução, incluindo glicosilação» Existe uma série de estratégias de DNA recombinante que utilizam sequências-promotoras fortes e plasmídeos de elevado número de cópias que podem ser utilizados na produção das proteínas pretendidas em levedura» As leveduras reconhecem sequências líder em produtos de genes danados de mamíferos e secretam peptideos portadores de equências líder (i»e=, pré-peptideos)» As células de mamíferos proporcionam modificações pés-tradução a moléculas de proteína incluindo enrolamento corrscto ou glicosilação nos sítios certos, >V -

As células de mamífero que podem ser úteis como hospedeiros incluem células de origem fibroblástica tais como VERO ou CH0-K1 e seus derivados» Para um hospedeiro mamífero existem vários sistemas vector possíveis para a expressão da enzima pretendida» Pode ser empregue uma grande variedade de sequências reguladoras da transcrição s da tradução, dependendo da natureza do hospedeiro» Os sinais reguladores da transcrição e da tradução podem ser derivados de fontes virais, tais como adenovirus, vírus do papiloma bovino, vírus símio ou similares, sempre que os sinais reguladores estejam associados a um gene particular que tem um nível de expressão elevado»

Como alternativa podem ser empregues promotores de produtos de expressão de mamíferos, tais como actina, colaqénio, miosins, etc» Podem ser seleccionados sinais reguladores da iniciação da tradução que permitam a expressão ou aetivação» demodo a poder-se modular a expressão dos genes» São do interesse os sinais reguladores que sejam sensíveis à temperatura de tal modo que variando a temperatura, a expressão pode ser reprimida ou iniciada ou. que estejam sujeitos a regulação química, e»g = metabalito» A expressão da enzima pretendida em hospedeiros suca-rióticas requere a utilização de sinais reguladores eucarióticos incluirão em geral uma região promotora suficiente para dirigir a iniciação da síntese de RNA» promotores eucarióticos preferidos incluem o promotor do gene da metalotioneina I de ratinho íHamer,

• - - - -" . i'.-· -·· . í*";-í* ^ J - .vi-í ; ? \ » =“ r-; TK dos vírus HERPES (Mcknight, S .,Ce 11 31 s355-365 í 1.982) >5 o promotor precoce de SV4® CBenoist, C»,st al»» Nature (London) 29Θg3Θ4-~31β (1901) )ρ o promotor do gene Ba 14 de levedura (Johnston, S»A», et al»» Proc, Natl. Acad» Sei» (USA) 79só97i-ó975 (1982)? 37

Silvsr, P. A. r, st al.. Proc- Natl» ftcad. Sei, (Uaft) 9tg5¥Ol-5955 (1984)i.

Coma é largamente cDnhscidD5 a tradução ds mRNA sues-riético é iniciada na codsa que codifica a primeira metionina.

Por esta razão, é preferível assegurar que a ligação entre um promotor eucariótico e uma sequfncia de DNA que codifique a ensima pretendida íou um seu derivado funcional) não contenha quaisquer codSes intervenientes sejam capazes de codificar uma metionina íi.s. AUG>« A presença de tais codSes resulta na formação ds uma proteína ds fusão (se o codão AUG estiver na mesma grelha de leitura da sequência de DNA codificadora da enzima pretendida) ou uma mutação por desvio da grelha de leitura íse o codão AUS não estiver na mesma grelha de leitura da sequência codificadora da enzima).

Hospedeiros procarièticos preferidos incluem bactérias tais como E ,coli, Bacil lus« Streptoroyces« Fseudomonas. Salmonel- la„ Serratia. etc. 0 hospedeiro procariètico mais preferido é E.coli. Hospedeiros bacterianos de interesse particular incluem E.coli K12 estirpe 294 CATCC 31446). E.coli XI776 CATCC 31537), E.coli W3I1Ô CF . lambda , prototrèfica CATCC 27325)),s outras enterobactérias (tais como Salmortslla tvphimurium ou Serratia marcescsns). e várias espécies ds Fseudomonas.D hospedeiro procariètico deve ser compatível com o replicão e com as sequências de controle no plasmídeo de expressão.

Para expressar a enzima pretendida (ou um seu derivado funcional) numa célula procariètica (tal como, por exemplo, EjlÇQIÍ-^B......subtilis,........Fseudomonas, Streptomycesetc), é necessá rio ligar operacionalmente a sequência codificadora da enzima pretendida a um promotor procariètico funcional. Tais promotores podem ser constitutivos ou, ds preferência, reguláveis Ci = s =

isiduziveis ou desrepricníveis) . Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor int do bacteriófago a. s o promotor bla da gene da R-Iacatmase do pBR322y etc. Εκemolos de promotores procariéticos indutiveis incluem os principais promotores esquerdo e direito do hacteriéfaqo {p, e P„>, os promotores trp, recft. LacZ, LacI,. qal.·,. e, tac de.....E.coli, a α-amilase (Ulmanens I-»et al., J. Bacterial. Iè2s176-182 (1985)), os promotores específicos de a-28 de B. subtilis»(Bilman.M.Z..et ai.» Gene 32s11-20 (1984?)3 os promotores dos bacteriòfagos de Bacillus (Gryczan 5 T. J»s Ems The Holecular Bioloqy of the Bac i 11 i,, Academia Press,, Inc. NY (1982)) e promotores ds Strsptomycss (Ward5 J. M., et al., Mol. Sen. Benet. 203s468-478 (1986)). Ds promotores procariéticos foram revistos por Slick. 8=R.5CJ._Ind. liicrobiol ls277-282 (1987))? Cenatiempo, Y.(Biochimi® 683505-516 (1986))? e Sottesmans S. (Ann. Rsv. 8snet. 183415-442 (1984)). A expressão correcta numa célula procariética também requer a presença de um sitio de ligação ao rihossoms a montante da sequência codificadora do gene. Tais sítios de ligação aos ribossomas estão descritos» por exemplo, por Sold. L.. et al. (Aon. Rev. Hicrobiol» 35s365-464 (1981)). A sequência codificadora da enzima pretendida a um promotor operacionalmente ligado podem ser introduzidos numa célula procariética ou eucarística recipiente como uma molécula de DMA (ou RMA> não replicativas a qual pode ser uma molécula linear ou de preferência uma molécula circular covalentemente fechada. Uma vez que tais moléculas são incapazes de replicação autónoma, a expressão da enzima pretendida pode ocorrer através da εκpressão transitória da sequência introduzida. Como alternativa. a expressão permanente pode ocorrer através da integração da sequência introduzida no cromossoma hospedeiro.

Numa realização» emprega-se um vector que é capas de integrar as sequências da gene pretendidas no cromossoma da célula hospedeira*

As células que têmc estávelmente integrado o DNA introduzidos nos seus cromossomas podem ser seleccionadas aravês da introdução simultânea de uma ou mais ma.rcas que permitam a selecção das células hospedeiras que contem o vector de expressão» A marca pode complementar uma auxotrofia no hospedeiro (como seja leu2 ou ura5·., as quais são marcas auxotróficas comuns em levsduras)5 resistência a biocidas5 e»g=„ antibióticos» ou metais pesados* tais como cobre ou similares = 0 gene ds marca seleccio-nável pode ser directaments ligado às sequências ds DNA do gene a ser expresso ou introduzido na mesma célula por cotransfseção*

Numa realização preferidas a sequência introduzida será incorporada num plasmideo ou vector virai capaz de replicaçlo autónoma no hospedeiro recipiente» Qualquer ura tie uma larga variedade ds vectores pode ser empregue com esta finalidade* Qs fsctorss importantes na selecção de um plasmideo ou vector virai particular incluems a facilidade com que as células recipientes que contêm o vector podem ser reconhecidas e seleccionadas de entre as células recipientes que não contêm o vectorp o número de cópias do vector que se pretende num hospedeiro particular,, s se é desejável poder-se fazer o “vai-vem" do vector entre células hospedeiras de diferentes espécies*

Pode ser utilizado qualquer um de uma série de sistemas de expressão de genes em leveduras» Exemplos ds tais vectores de expressão incluem o circulo 2-micran de levedura5 os plasmídeos de expressão YEP13» YCP a YRPetc»» ou seus derivados» Tais plasmídeos são bem conhecidos <Botstein? D»5 et al*„ Hiami Wntr»

Syrag» 1Vs260-2/4 (ÍVB2)p Broach» u»K» » hms Ihs Molecular Bioloov 40

pf fchs Veast S^ccharQmvc,es,,s_Life .Cyçle..„andInheritance.,. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p* 445-470 <1981)5 Broachs 3. R., Cell 28s203~2@4 <1982))-YEP13 é o vector proferido da presente invenção =

Para um hospedeiro mamífero existem vários sistemas vector possiveis para s expressão* Uma classe de vectores utiliza elementos de DMA que proporcionaram olasmideos extra-cromossámi-cos de replicação autónoma* derivados de vírus animais tais como vírus do papiloma bovino, vírus polioma, ãdsnovirus ou 8V4®* Uma segunda classe de vectores baseia-se na integração das sequências de genes pretendidas no cromossoma hospedeiro* As células que têm estávelmnete integrado o DMA introduzido nos seus cromossomas podem ser selsccionadas introduzindo também uma ou mais marcas que permitam a selecçao de células hospedeiras que contêm o vector de expressão* A marca pode proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas, e*g* antibióticos ou metais pesados, tais como cobre ou similares* 0 gene de marca ssíeccionável pode ser directemente ligado a sequências de EmlA a serem expressas ou introduzido na mesma célula por cotransforma-ção» Podem ser também necessários elementos adicionais para a síntese óptima de mRMfi. Estes elementos podem incluir sinais de "splieing" assim como promotores da transcrição potsncíadores e sinais de terminação« Os vectores de expressão de cDMA incorporando tais elementos incluem os descritos, por Okayaraa, H*= Hol * Cell* Biol* 5;280 (1983) e outros* vectores procarióticos preferidos incluem olasmideos tais como os capazes de ao replicarem em £*coli (tais como * por exemplo, pBR322, CoLEi, pSCi®!, pACYC 184, ti:VX* Tais olasmideos são* por exemplo* descritos por Maniatis, Ϊ** et al <EmsMolecular Cloninq, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor* NY (1982))* Plasmidsos da Bacillus incluem pC194,

ρϋ22Ι, ρϊ12/, etc» lais olasmídeos estão descritos por 8ryczan, T» CEmg The Molecular Bioloqy of the Bacilii, Academia Press, NY <1982)= pág= 3Θ7-329)= Plasmideos de Streptomyees adequados incluem pld1Θ1 <Rendai 1, K ,, J „ , et al«, J. Bacteriol» 169s4177--4183 (1987))= e bacteriáfagos de Streptomycestais como #C3i íChater, K = F=, et aL, Ems Sisth International Symoosium on Hctinomycetales Bioloqy Akademiai Kaida, Budapest, Hungary (1986), pág. 45-54)» Us plasmideos de Pseudomonas revistos por John3 J»F»S et al=.CRev» Infsct» Pis» 8sè93~704 <1986))= s Izaki, K» C-3pn = 3. Bacteriol* 33s729-742 (1978) ) =

Uma ¥8ϊ o vector ou sequtncia de DMA contendo as construções tenham sido preparados para expressão, as construções de DMA podem ser introduzidas num hospedeiro adequado» Podem ser empregues várias técnicas, como sejam a fusão de p roto ρ1as tos, precipitação com fosfato de cálcio, electraporação ou outras técnicas convencionais» Após a fusão, as células são cultivadas em meio e despistadas quanto às actividades adequadas» A expressão da sequfncia pretendida resulta na produção da aminopeptidase especifica de substrato» A aminopeptidase específica de substrato da invenção pode ser isolada e purificada a partir das moléculas recombinan--· tes atrás descritas de acordo com métodos convencionais tais como extracção, precipitação, cromatografia» cromatografia de afinidade,, electroforese e similares» VI» Utilizações da aminopeptidase especifica de substrato

Qualquer uma das aminopeptidases especificas de substrato da presente invenção uma vez produzida e purificada pode ser usada, por exemplo, num ambiente farmacêutico ou de produção

para remover certos resíduos amino-terminais (consistente com a especificidade de substrato os cada enzima como se mostra nas tabelas 2 e 3 abaixo) de peptídeos e proteínas para as quais se deseje tal remoção de modo a aumentar a sua estahi1 idade, solubilidade, actividade biológica, semi-vida biológica, etc», ou para diminuir a imunogenicidade do peptídeo ou proteína* Em adiçlo fsods ainda ser usado para clivar proteínas e palipeptídeos de acordo com as suas especificidades de substratos» A aminopeptidase especifica de substrato pode ser incubada com um substrato pretendido cama uma enzima solúvel ou pode ser imobilizada, por meios bem conhecidos, um suporte sólido (como seja por exemplo, vidro, borracha, plástico, celulose, etc=>*

Tendo agora de um modo geral esta invenção, a mesma será melhor compreendida por referência a exemplos específicos os quais sáo aqui incluídos apenas com fins ilustrativos não pretendendo serem limitantes a menos que seja especificado»

CLILIUBA.. DE... CÉLULAS _E.....PREPARAçgQ......DE_EMgAÇJQ.......BRUTO

Cultura .e.......armazenamento de células A estirpe de levedura TD71.8 (alfa, ino3,, leu2, his3, Iis2) foi cultivada a 3@°C em 1 litro de meio YPD <1% de extracto de levedura, 2% de Bacto-peptona, 2% de glucose até -18-2Θ»

As células foram colhidas por centrifugação a 3 5Φ® rpm durante í@fflín a 4°C„ 0 sedimento <^25g> foi ressuspenso em 25ml de meio YPD contendo 15% de glicerol e guardado a —70*0»

Para produção em larga escala e purificação da enzima 1 ©©© littros de uma cultura de estirpe TD71.8 foi cultivado aeróbicansente a 3©°C em meio YPD <1% de SKiracto de levedura. 2% de Bacto-psptona,, 2% glucose) num fermentador Chemap AG CChemap AS» Volketswil? Switzerland). As células foram colhidas quando a cultura atingiu uma P........ de 8-l©„ concentradas para 38 litros

Q\W pelo sistema de separação Alfa-Laval (Alfa-Laval Separation AB5 TumbaS^edsn) ? e guardadas a ~2€?°C com 1©% (vol/vol) de gliceral até 6 meses sem perda de actividade. trac tos.....celul aregLJ^Juãiã

Descongelaram-se células de levedura congeladas (^©©g ds peso seco) num banho-maria a 3©°C e colheram-se por centrifugação a 3 50© rpm durante 1© minutos à temperatura ambiente. 0 sedimento foi ressuspenso em 1 litro de tampão S (sorbitol 1M5 50mH Tris,. pH7»8,, 10mM HqCL^q 3mM DTT) contendo 5©mq de liticase. Esta mistura foi incubada a 3©°0 durante 2 horas com agitação., para induzir a formação de esferoplasios. Os esferoplastos foram colhidos por centrifugação a 3 5Θ© rpm durante 1© minutos a 4*C e lavados por ressuspensão suave em í litro de tampão S frio» colhidos por centrifugação a 3 500 rpm durante 10 minutos s __ ressuspensos suavements sm 5©0ml de tampão A (lômM HErfcS-K P pH 7?Θ? ijSfíiH MgCL.7 ? 10míi KCL e ©?5fnM DTT). Todos os passos subsequentes foram efectuados a 4°C. Os- esf erop 1 as tos foram lisados neste tampão hipotónico por 12-15 estacados com um pistão bem ajustado seguido de 15-2© estocados com um pistão mais laço num homogenizador Dounce a depois a concentração final de KCL foi ajustada a ©»2M com uma soluçõa fria de 2M KCL= 0 lisado foi agitado &m gelo durante 3© minutos e as detritos foram removidos por centrifugação a Í7 ©Θ© rpm durante 3© minutos. Adicionou-se gliceral até í©% em todos os tampões usados nos processos ds purificação subsequentes para estabilizar mais a aminopeptidase.

As fracçSes foram testadas quanto à actividade específica de substrato como descrito atrás» I.XÍHPLQ.J.

EiifiinCASlQ......DA AMI, HOPEPTIDASE.......ESPECÍFICA DE .jUBSTRAIQ

primeira cromatografia em DEAE-Sspharose CL-6B 0 lisado bruto foi concentrado para l@@ml usando uma membrana de ultrafiltraçSo PM-10 e dialisado tris vazes contra 2 litros de tampão H CΙΘοΗ HEPES-K ‘ ? pH 7?35? l„Smti ngCL._l3 DTT = 0 = 2% NaM_=? 10% qlicerol) suplementado para conter Θ3Θ5Μ KCL. %Í* * 0 lisado foi então aplicado numa coluna de CM-Bepharose CL-6B (2?5 κ 45cra> que tinha sido ligadaa uma coluna de DEAE-Sspharose CL---6B (2 = 5 κ 45cm) de tal forma que o eluato da coluna de Cn--Sapharose CL-6B foi aplicado contínuamante á coluna de DEAE-—Sepharose CL-óB ligada» Ambas as colunas tinham sido equilibradas com o mesmo tampão usado na diálise» Estas duas colunas ligadas foram lavadas com 2 litros de tampão H contendo Θ5Θ5Μ KCL» Em seguida foram desligadas» A coluna ds DEAE foi sluida com um gradiente linear de 0s05n (25@ml) a Θ?5Μ (250ml) em tampão H a Í7»3ml/hr„ As fracçSes (5?2ml> foram colhidas s testadas quanto à actividade aminopeptidase» As fracçSes que continham actividade de aminopeptidass foram reunidas (fracçSes 41-71 da um total de 148 fracçSess conductividade média 957ms> s concentradas para um volume ds IBml usando uma membrana ds ultraf11 tração ΡΜ-1Θ=

Segunda cromatografia em DEAE-Sepharose CL-6B 0 eluato concentrado da cromatografia em DEAE-Sepharose CL—óB atrás descrita foi dialisado trás vezes contra 1 litro de tampão H suplementado para conter ΘΡβ5π KCL e ao1 içado numa

segunda coluna de DEAE—Sepharose CL-6B <2?5 κ 45cra> equilibrada com o mesmo tampão usado na diáiise* A coluna foi eluida com um gradiente linear de 0?05Μ (250ml) a ®„2li í250ísI> !<CL em tampão H a ISml/hr. As fracçSes foram colhidas <4s5ml) s testadas quanto è. activida.de de aminopeptidase» Encontrou-se que as fracçSes 113-133 possuiam activida.de AP2? API e APX» Estas fracçSes foram reunidas (conductividade média iôs2is)« As fracçSes reunidas foram concentradas para 5ml com uma membrana de ultrafi1 tração PM-1Θ»

Cromatpgrafia. em hidrPK.ilagatite 0 eluato concentrado da cromatogr-afia em DEAE-Sepharose CL---6B atrás descrita foi dialisado tris vezes contra 1 litro de tampão fosfato de potássio,, pH 7515s 05õr! DTT5. 5mn !<CL? 10% glicerol» β.,02% NaN^. e aplicado numa coluna de hidroKilapatite equilibrada contra o mesmo templo usado na diálise» A coluna foi eluida com um gradiente linear de β,,ΘΙΜ (25®ml) a Θ55Μ C25®ml) tamplo fosfato de potássio.. pH 7,,15., 0?5mí1 DTTS 5mM KCL? 10% glicsrol5 Θ5β2% NaM-^p a Í8ml/hr= As fracçSes C455nil> foram colhidas e testadas quanto à actividade de aminopeptida.se.. A aminopeptida.se AP2 foi encontrada nas fracçSes 43-47 <conductivi— dade média 7s2ras)« A aminopeptidase APX foi encontrada nas fracçSes 67-75 (conductividade média 16?5ms)= A aminopeptidase API foi encontrada nas fracçSes 83-97 (conductividade media 23== Θ ms)„ As fracçSes contendo cada uma das aminopeptidases foram separadamente e concentradas para um volume de 5ml usando membrana de ultrafiltraçlo PM—10»

Cromatografia em Phgnyl-Sgpharosg......CL~4tà A aminopeptidase API foi ainda purificada usando cromatografia em Fhenyl—Sepharose CL-4B„ Q sd.ua to concentrado da cromatografia em hidroxilapatite atrás descrita foi dialisado tr@s veses contra i litro de tampão H <l@mM HEPES-K'= pH 7,35, Θ, 5oM DTT ? í,5mM rigCL._, , Θ , ©2% NaN^., 1©% glicerol} contendo & ,2n KCL= Adicionou-se um volume igual de solução saturada de sulfato de amónio a 8©%, l@mM HEPES-K*, pH 7,35, i©% glicerol, ©,©2%

NaN-., à solução contendo aminooeptidase= Esta mistura foi aplica-da a uma coluna de Pheny1-Sepharose CL-6B <1,2 κ 2©cm) equilibrada com uma soluçlo saturada de sulfata de amónio a 4@%, ΙΦιηΗ HEFES-K*, pH 7,35, 1©% glicerol, 0,25mfi DTT, ©, 1M KCL 0,02% NaN.,. A coluna foi primeiro eluida com 5oml do mesmo tampão descrito atrás s depois com um gradiente linear de 4©% a ®% <10®ml) de soluçlo de sulfato de amónio, l©mM HEPES-K*, pH 7,35, 1@% glicerol, ©,25m« DTT, ©,©2% NaN_, ΪΦΘοΜ KCL a 72,4ml/hr. As fracçSes de 3,62 foram colhidas e testadas quanto á activida.de da aminopeptidase» A aminopepfcidase ΑΡΣ foi encontrada nas fracçSes 1Φ3-ΙΙ3 de um total de 141 fracçSes| as fracçSes activas foram reunidas Iconductividade média de aproximadamente 26ms> e concentradas para 3ml usando uma membrana de ultrafiltração PM-1©.

Os perfis das fracçSes contendo actividade de aminope-piidase especifica de substrato estio apresentados na Tabela 1=

Tabela ϊ

Perfil de fracçSes contendo actividade «

Absorvãncia é a média das fracçSes activas reunidas

Coluna Result«Actividade Concen- Conduti- h rac- A414 tr-açlo dade Mé- ÇSO nis* de pro- dia das # tsina FracçSes 281 nmS Activas (me-) AP2 i a„DEAE-Sepharose CL-ÒB 41-71 Θ , 293 2,817 9,7 2â DEAE-Sepharose CL-òB 113-133 0 s 38 2 5 66 10,2 Ridroxilapatite 43-47 Θ,3Θ 2 , 25 7,2 1 lã»DEAE-Sepharose CL-6B 41-71 0,293 2,817 9,7 2ã = DEAE-Sspharosa CL-68 113-133 0,38 2,ÒÒ 10,2 Hidroxilapatite 83-97 0,797 0, 101 23,0 Pheny1-Sepharose CL-4B 1Θ3-113 0,36 0,123 2è, 0 APX lã=DEAE-Sepharose CL-ÒB 41-71 0,293 2,817 9,7 2ã,DEAE-Sepharose CL-ÒB 113-133 0,38 2,66 10,2 Hidroxilapatite Ò7-75 0,39 6,232 16,5

Num método alternativo para a purificação de API, obteve-se um extracto bruto de levedura a partir de 2 litros de células concentradas de acordo o má toda de Lin st al - , CLin, Rj, st al.,3. Biol, Chem, 26©s1478©-14792 (1985))» A API presente em tal amostra foi purificada até quase à homogsnidade pelo método ds nstz s Rohm íMetzs S» et al » nBiochs-m» Biophys» Acta 429g933--949 <1976))» De preferência amostras do eluato concentrado da crornatografia em Sepharose CL-6B foram aplicadas a três géis de SDS-PA0E (8%) com uma espessura de 1, 5ínm e com um poço de 12cm, sujeitas a electroforese e electroeluidos». como descrito por Hunkspiller» M»í4 = et al.„ (Hethods Ensymol» 91s227-247 (1983))» Quando este método de purificação alternativo foi empregue» os 2 litros de células concentradas continham aproximadaments 9©©pg ds API. Por este método conseguiu-se uma purificação de aproximada-mente 8Θ® vezes e um rendimento de ''“350pg ds API» API parcialmente purificada5 usando o passo de cromatoara fia em DEAE-Sepharass CL-68 ds Metz e Rohm \ rístz; 8= et al,,Biochsm» Biophys» Acta 429g933-949 (1976)) foi aplicada a uma coluna ds Sepharose CL-6B (2?® x 90cm)= A coluna foi eluida com tampão B <2®mk! HEPES-K*, pH 7,35, 5mn MqCL^, ©,5nM DTT, Ô,2M KCL, 0502% NaN.7) a 14ml/hr» 0 volume ds sluição da ensima foi determinado por A.-}i;j^n;Tí e actividade enzisnática e o peso molecular aparente da API de levedura foi calculado por comparação com os volumes ds eluição relativos de padrões proteicos incluindo tiraglohuiina (669 ©©©> „ apoferritina (443 ©©-©),, js-amilass (200 000)=, álcool-desidrogenase (15Θ ©00)» albumina do soro bovina (66 ©00) e anidras© carbónica (29 ©0©>,

Uma amostra de API purificada foi aplicada num gel de SDS-PASE (9%) s sujeita a electroforese em condições redutoras, como descrito por Laemfflli5 U,K»,Nature 227s69©~έ;85 (197©))» Para determinação da Mt_ das subunidades de enzima purificada usaram-ss como padrões de peso molecular miosina (2©5 ©©ΘΙ^ fi-galactosidass de E.cali, fosforilase de músculo de coelho (97 ΦΘΘ)3 albumina do

soro bovina (66 ΘΘΘ)s albumina do ovo C45 &&&) s anidrase carbónica (29 0ΘΦ)= As bandas ds proteína foram coradas com Coomassis Brillisnt Blue R* Os pesos moleculares aparentes da molécula nativa e das subunidades ds API (purificada ds acordo com ests método alternativo) eram indistintas dos valores obtidos quando API foi purificada ds acordo com o método preferido* EXEMPLO 3

CÁLCULO DQ PESO MOLECULAR SA AMINOPEPTIDASE

___POR ELECTROFORESE EM GEL DE 5D5-P0LIftCRILAMIDA A elsctroforess foi sfectuada ds acordo com o método de Laemmli, li.K, (Maturs 257;680-685 (197¾)) usando um gel ds i@%* 0 gel foi corado com azul Coomassis e o peso molecular aparente da aminopeptidase desnaturada foi calculado a partir da mobilidade relativa de padrões proteicos incluindo (1) miosina (2Θ5 ΦΘΘ)3 (2) bsta-galactosidass de E*coli (lló ®0®}r, (3) fosforilase ds músculo ds coelho (97 θ®θ>s (4) albumina tío soro bovina <ó6 000) e (5) albumina do ovo (45 Θ®Θ) e (6) anidrase carbónica (29 ®®®)„ 0 peso molecular aparente de AP2 foi de aproximadamente 93 ΟΘΘ e o peso molecular aparente de API foi de aprpKimadaments 5Θ ΘΘΘ* EXEMPLO 4

ESPECIFICIDADE DE SUBSTRATO

Fizeram-se trinta e seis peptideos para estudar a espscifIcidada do substrato das aminopsptidases purificadas do presente? ir?vento* Dezoito dos peptideos tinham resíduos ds aminoácidos N-terminais diferentes e os restantes dezoito psptí-deos tinham diferentes resíduos aminoácidos na penúltima posição amino-tsnninal * A solução de proteína 10μ1 a ser testada;, foi

adlecionada a ¥Θμ1 da solução contenda 4mri M-K—I-F-fc.-1 ou X-I-P--E-T, l&mri HEPES-!<% pH 7f35P 0?2mM CoCU,» 0»2M KCL5 l55mM MgCL0, 0?®2% WaM-s 3®pg de Díiidâse de L-aminoáeidos5 3pg de peronidase de rábano silvestre e 20pg de di-hidrocloreto de o-dianisidina» Todas as reacçSes foram efectuadas -à temperatura ambiente numa placa de microtitulação de 96 poços e a absorvSncia detectatía a 414 ou 45@nm« 0 desenvolvimento rápido de cSr indica a presença de aetividade peptidasa alta naquele peptídeo especifico» Os resultados destas eKperifncias estão apresentados nas tabelas 2 e 3« A identidade de X é designada pelas abreviaturas vulgarmente usadas de uma só letra para os aminoácidos vulgares§ V=Val, A-Aia5 R-Arg? D=Asp? C~Cis? E=61us Q=Slu? S=Sli5 H=His5 I=Ile5 L-Leu? K=Lis? M=Met5 F=Fen? p=Pro? S=Ser5 T=Tre e W=Trp« Os números nas tabelas 2 e 3 representam estimativas qualitativas das aetividadess 0 (nenhuma actividade)s 1 (·*·/—}» 2 (·*-}» 3 (4-4-/-)5 4 (*-*.)* 5 (4-4- -4-/-)5 o 6 (4-4-4-)«

Tabela 2

Substrato específicos M-X-I-P-E-T

Identidade de Xs VARDCEGSH ILKMFPSTW ENZIHAs AP2 0022Θ042222222000Θ API 043220Θ44422220402 APX 1 12122142222222122

Substrato específicos X- -I-P-E- -T Identidade de X g V A R D C E 0 e H I L K ri F P s T kl ENZIMÃs AP2 0 1 2 0 0 0 1 0 1 1 6 0 6 & 1 1 i 4 API 0 2 0 0 Θ 1 0 1 0 6 0 6 6 í 1 1 4 APX 1 1 2 0 0 0 1 1 1 i 6 0 6 ò 0 0 1 2 OIffiLO-5

PyRIFIÇftCgQ^SEGLUmift PROTEICA MH^-TERMIMAL ____Dft AMINPPEPTIDASE I DE LEVEDURA A aminopeotidase API foi purificada a partir de urn lisado celular de células na fase foq ii»et, ΑΙΛ.= Β-ΙΘ) como descrito atrás e usada na sequenciaçSo NH_~terminal da proteína= A subunidade da aminopeptidase foi purificada até á homogeneidade por SDS-PASE e sluída elsctroforeticamente (Bunkapiller, nJ, et a 1=,, Methods £nzvoo 1.91¾ 227’-247 (1983)), e a sua M__ determinada como sendo de aproximadamente 5® ΘΘ® ± 2 θ®@ = A quantidade de API e a sua composição em aminoácidos foi determinada usando um Beckrnan ó 3ΘΘ Assino Acid Analyser após 24h de hidrólise a 110°C em 6N HCL contendo ®,1% de fenol ÍMoore, 5», Chemistry and Biology of Pepetides,, Meienhofer, J „ , ed», Ann Arfaor Science, Ann Arbor, MI, pp = 629-652 (1972))=

Quinhentos pmoles da API purificada foram analisados usando um sequenciador de proteína Applied Biosystems 47®A s um Applied Biosystems 12Θ PTH Analyzer CBefeiick, R = li= et ah, J =

Biol= Chem= 256g799&~7997 ¢1981))=0 rendimento repetitivo médio foi. aproximadamente 92% a a quantidade inicial de proteína

dstectads no ciclo tíegradativo í foi de aprosíimadaraente 25® pmoIss= A sequência proteica terminal de API purificada está apresentada na Figura 1„

Quando5 no entanto, a subunidade foi purificada a partir de um lisado celular obtido a partir de uma cultura crescida até á fase estacionária (i»ec = 18-2®) em vez da fase logarítmica? a sequência Ní-f.-*—terminal de API começa em. 7irs o quarto resíduo de aminoácido do sktremo NH,,. mssEmji

CLDNABEW E SEQUESMCI Ac«Q DQ DMA SEN6M1C0 DE LEVEDURA CODIFICADOR DA Ari IIMOPEPTID ASE I

Sintetisaram-se duas sondas degeneradas baseadas na sequência N-terminal da aminopeptiriase I (Figura i? sondas a s b) e usaram-se sequenciadamente para faser o despiste de uma biblioteca genémica de levedura em Xgtli« As sondas oligonucleotidicas e iniciadoras foram sintetizadas num sintetizador de DMA Applied Biosystems 38®AS usando p-cianoeti1-fosforamidstos (Sinha P N=D= et al»c Mucleic Acids Rss» 15s4539-4557 (1984)) e purificados por electroforese em gel de poliacrilamida de acordes com o Applied Biosystems Manual ou por precipitação com stanol a partir de uma solução de oligonucleotideos contendo ΙΘιηΜ MgCL^.

Uma biblioteca genémica de levedura em Xtil foi despistada sequenciadamente usando duas sondas oligonucleotidicas marcadas com ['^Pl (Figura 1s sondas a e h>= As placas fágicas foram transferidas para filtros de nitrocslulose e lisadas (Maniatis, T-, et al.....Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Colo

Spring Barbar Laboratory5 Cold Spring Barbar;1 Neis? York (1932)) =

Os filtros foram incubados durante 2h a B®°C e depois incubados a

65 °C durante 3h em 2 ?; 1 litro de tampão de lavagem (€>s2 X S3C, 0P1% SD3>,

Os filtros lavados foram incubados em tampão de pré-hi— hridação (6 « SSCs 5 x solução de Denbardt3 Θ?5% SDS5 pirofosfato de sódio, i®0ug/ml de t~RNA de levedura e l®0pg/ml de DMA de esperma de salmão partido e desnaturado) durante 1.2 a iáh a ò5°C, Finalmente, a hihridação foi efectuada a 55 °C durante a noite usando o mesma tampão na presença dos oligonucleotídeos degenerados marcados com ATP usando palinucleatideo-ci·-· nass de T4 CWhitehead, A,S, et al, , Proc, Natl, Acad, Sei, USA 8®s31-35 <1983)), Os filtros da nitrocelulose foram lavados à temperatura ambiente durante 3® min em 6 x SSC antes da lavagem a 55°C (pressão elevada) durante 1® minutos, Após a lavagem final, o filtro foi exposto a filme Kodak XAR-5 a -7®°C,

Obtiveram-se de2assete clones positivos a partir de ;ν10Θ Θ0Φ placas, Três clones foram ainda analisados por mapeamen— to de restrição e verificou-ss serem idênticos, Uma das inserções foi suelonada em Bluescript Μ13-i-, e uma fraeção da sequência de DMA foi detrminada usando um iniciador de sequenciação de T7,

Esta sequência corresponde a uma sequência codificadora da sequência MH^-terminal da API purificada, mostrado na Figura 1, Com base na sequência de DMA adjacente ao promotor T7 sintetizou--•se ma is um ol igonucleotideo, a sonda c (5' CGAGCACAATTATGA88ATA-TTGC 3' ),, e usou-se para fazer o despiste de uma biblioteca genéínica de levedura com EM8L3A» Obtiveram-se quarenta e sete clones positivos a partir de “'50 ®®0 placas e três destes foram analisados por mapeamento de restriçlo, Um fragmento 8all (^14Kb) ds um destes clones foi subclonado em Bluescript Mi3* e o seu mapa de restrição parcial está apresentado na Figura 2, Os fragmentos de restrição PstI5 Xbal, Xbal/Pstl, rstl/EcoRI, EcoRI/Xbal s EcoRí foram subclonados em Blescript M13-K As 54 -· sequências de DMA foram obtidas a partir dos extremos 5' e 3' daqueles subclonss» Com base naquelas sequências de DNA5 iniciadores oligonucleotidsos adicionais foram sintetizados e usados para completar a sequência de ambas as cadeias» EXEMPLO 7 SEQUÊNCIA DE DNA E SEQUÊNCIA DE AI1IN0ÁCID0S ___DERIVADA DA AfliNQPEPTIDASE 1 A análise da sequência de nucleotídeos foi eísctuada por subclonagem de fragmentos de restrição no vector Bluescript Μ13-5-» o qual contem promotores T3 e T7 = Após desnaturação alcalina dos fragmentos contendo Bluescript M13* do gene clonado» usaram-se os iniciadores T3 ou T7 para iniciar a síntese ds DNA na presença de trifosfatos de desoxínucleotídeos (SangerP F» et al»» Proc. Natl. ficad. Sei, USA 74s5463-5467 (i?77)| Sanger, F» st al * » J» Hol » Biol» 143iilc>l-170 (1980))» Após obtenção de porções da sequência de DNA? sintetizaram-se iniciadores oligonu-clsotídicos homólogos de 17 bases para sequenciaçSo adicional usando o método de terminação de cadeias dideoxi de <Sanger? F = et ah, Proc, Natl» Acad» Sei. USA 74£5465-5467 (1977)p Sanger» F. et al» » J. nol, Biol, 143:161-178 ί198Θ))? modificado para sequenciaçSo de cadeia dupla por 6uo st aLs (Suo» L»H» et aL, Nuclsic» Acids, Rss» 13. s 5521-5559 (1983))= De terminou.-se a sequência de DNA completa de ambas as cadeias» A Figura 3 mostra a sequência ds DNA completa e a sequência, de proteína deduzida para API de levedura» A maior parte do ATB 5'" ? que obedece à lei de Kozak CKozak 5 M»s Nucleic» Acids» Res» 12§857-872 (1984)) presume-se ser o cotílo de iniciação» Uma grelha de leitura, aberta de 1542 nucleotídeos (codificadora da aminopeptidase I e da sua

pré-sequência) vai desde α codão de iniciação ATO até um codão de paragem ACT (marcado FIM). Os 1Θ5 primeiros oligonucleotídeos começando com um resíduo Hat na posição -45. A sequência da grelha de leitura aberta codifica uma proteína com 514 resíduos de aminoácidos e com um peso molecular calculada de 57 175 dal tons. A sequência NH„—terminal derivado análise da sequência de proteína dos 18 primeiros resíduos de aminoácidos da ftPI purificada condiz com os resíduos 1-18 da API deduzidos a partir da sequência de DMA» Estes dados são apoiados por resultados de "immuoblot" e indicam que existe um precursor de A PI., contendo uma. pré-sequência de 45 resíduos de aminoácidos5 a qual é removida durante a maturação da enzima.

Uma sequência tipo TATA. TATAAS5 está situada 1@2 bases a montante do codão de iniciação. CACAACCAACA. que está situado a cerca de 2S a 3® nucleotídeos do codão de iniciação pode ser um sítio de ligação ao ribosssoma (Montgomsry. D.L. et al= Proc. Natl. Acad. Sei. USA 778 541-545 <1980>§ Holland, M = J„ st a1.„ J. Biol. Chem. 256s1585-1395 (1981)). Ainda 15Θ bases a jusante do codão de paragemr, existe um sinal de poliadenilação putativos AAATAAA (Praudfoot5 N.J.et al.. Nature 2ès211-214 (1976))= Em adição, existem quatro potenciais locais de N-glico-lizaçlo £Parodi5 A.3.et al,^Biochem. Biophys. Ac ta 559s1-57 (1979)) indicados por asteriscos.

PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE DE ANTICORPOS PQLICLOMAIS __CONTRA AMIMOPEPT1DASE I PE LEVEDURA

Aminopeptidase purificada por SDS-PA8E e electroeluída (5®qq) foi injectatía por via intradérmica em adjuvante completo de Freund num coelho branco New Zealand tendo-se seguido duas

injecçSes <bi-ssnsanais) de 5Θ e 100pg respectivamente» Dez dias após a última imunização o animal foi sangrado» A imunoglobulina foi precipitada do soro (20ml) através da adxçio ds (ΝΗΛ 5,.,80., até 5®% ds saturaçSOp seguida de centrifugação a 1θ ΦΦΦ κ g durante 2Θ minutos» 0 sedimento de anticorpo <^5@mg> foi ressuspenso numa quantidade mínima de tampão salino de fosfatos íPBSp Φ515Ι1 NaCL5 12s5mli KH„P0., pH 7,4, 0,@2% NaM^5 e dialisado contra PBS. -C ·"*· ·ί:

Os anticorpos foram ainda purificados por uma coluna de afinidade (volume ds leitos lml> contenda 1θ@μς de AP1 purificada por BDS—PAGE e electroeluída ligada covalentemente a Sepharcs-e 4B activada com CNBr (Pharmacia)5 a qual fai preparada de acordo com as instruções do fabricante» Um mililitro da solução de anticorpo foi passado repefcidainente através da coluna tis afinidade à temperatura ambiente» Em seguida a coluna foi lavada com Θ,6π KCL em PBS até de e lua to ser <Θ?ΦΘ 5= Os anticorpos ligados foram eluidos com 3,5®! de i5omn NaCL, 05©2% NaN^. e 052M glicinsg pH 2 j* 4 e o e lua to foi neutralizado imediatamente com IN NaOH» Os anticorpos í„.75pg) foram recuperados e usados para a análise ds imunoiransferfncia» EXEHPtu 9 1HUNQDETEÇÃO DE AMINQPEPTIDASE I PURIFICADA _______________E PROTEÍNA total de levedura API purificada por SDS-PASE e electroeluída foi analisada por imunotransferfncia» Para conseguir isto, aminopeptidass 1 purificada e o exiracto total de proteína de levedura foram sujeitos a electroforsse num gel de SDS-ΡΑβΕ <8%> (LaemmliP U,K» (Wature 227s&B0-685 (197¾)) e depois transferidos electroforèti-caments para um filtro ds nxtroceiulose íToHhin, H»st aL„ Proc» Natl...,...........Acad» Sei» USA T6s4350-4354 (1979))»

Uma cultura de 2®ml da estirpe de levedura TD/l=a foi cul tivada a 3@°C até uma h,_. de S a. 1® = As células sedimentadas <0,2”©,3g> foram colhidas por centrifugação a 3 θ®@ κ g durante 5 minutos5 ressuspsnsas em 3ml de tampão A íl®mM Tris, pH 7,5, iM sorbitolj 5ti#1 MqCL.-,, 3mM DTT) contendo ®3lmg/ml de liticase e depois incubadas a 3®°C durante 3® minutos,, Os esferiplastos foram colhidos por centrifugação a 1 ΘΘΘ κ g durante 3 min e resuspensos em ® 3 8ml de tampão B contendo ®,3g de esferas de vidro (Θ,οίπαι diâmetro) e transferidas para um tubo de centrífuga de 2ml* As células foram rebentadas através de 6 ciclos de vortsK da 3® seg., cada seguido de 3Θ seg. em gelo. Adiceionou-se um volume igual de tampão de amostra com BBS 2 κ <2ã% glicerol, 5% mercaptoetamol, 4% SDS, ®,13n Tris, pH 6,8, ®,®1% (vol/vol) da azul de bromofenol) e ferveu-se durante Ϊ® minutos» 0 material não dissolvido foi removido por microcentrifugação durante 3 minutos á temperatura ambiente» 0 sobrenadante assim como os marcadores tís peso molecular, foram sujeitas a electroforese num gel de SDS-PABE 8% (Laemmli, U„K= (Nature 227s660-665 (197®))» As proteínas foram transferidas electroforèticamente para uma membrana de nitrocelulose íTo^bin, H.et al„ Proc- Natl» Hcad.,...^ci,a,.,JJSA...7èg4350-4354 í 1979) ).

Para tíetectar a aminopeptidase 1 e o seu precursor, a membrana contendo as proteínas transferidas reagiu com anticorpo monoclonal de coelho anti-aminopeptidase I purificada por afinidade a o anticorpo ligado foi detsetado com um !íi<itn de imuno-deteçSo picoBlue (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante» Qs pesos moleculares aparentes foram calculados usando padrões proteicos incluindo fosforilase de músculo de coelho (97 Θ0Θ), albumina da sara bovina <66 ®©Θ>, albumina do ovo (45 ®®0) e anidrase carbónica (29 0ΦΘ)„

A análise tís imunotransferincias ds API purificada detectou uma única proteina de Mtj= 5Θ &ΘΦ que ss liga a anticorpo poiiclonal ds coslho anti-API s a análise de immotransferfn-cias de um eKÍracto de proteina total de levedura detecta duas proteínas com da 5@ ΦΦΘ s 57 ΦΘ® respectivamente» EXEWPLQ 10

ANÁLISE DE TRANSFERÊNCIAS DE DMA GEMáriICO. E .CfiQMQSSóHICO

Fizeram-se análises ds transferfncias ds DMA genémico e cromossómieo» Para conseguir isto? isolou—se DMA total a partir da estirpe de levedura TD71»8 CSherman? F= et al»rlethods in Ysast Gsnstics, A Laboratorv Manual» Cold Spring Harbor Labora-tory3 Cold Spring Harbor5 Ms« York (1986))=. DMA CL®ug) foi digerido com EcoRI ou Xbal e sujeito a electroforese num gel de Θ?7% ds agarose» A transferfncia dos fragmentos de DMA digeridos do gel para um papel de nitroceluiose foi efectu.ada de acordo com o método de Southern CSoutherns E.M»? 3» Hol, Biol» ?8κ5®5-517 (1975))» 0 filtro foi lavado com 6 x SSC durante 5 minutos antes de ser incubado a 8®’-C durante 2h« 0 filtro foi ainda incubada a 65 °C durante 3 horas no tampão ds lavagem (051% SDS5 Θ?2% SSC)» 0 filtro foi então pré—hibridado em 6 x SSC» Θ,.05% pirofosfato de sódio5 ©»5% SDS5 10©pg/iil de t-RNA de levedura? solução ds Dsnhardt 5 x e 100pg/ml ds DMA de esperma de salmão desnaturado usando o mesmo tar??pSo na presença do fragmenta de restrição Pst I ("*2 kb> (Figura 2) sujeito !i a nick-translationi! (Rigby? PJ. J .et aL, 3» Mol Biol» 115s237~251 (1977))» 0 filtro foi lavado duas vezes durante 15 min com 6 x SSC5 Θ3Ι% SDS e 0,.05% pirofosfato de sódio à temperatura ambiente e depois lavado duas vezes a 65°C durante 1® min em ©52 x SSC5 0„1% SDS - Após a lavagem final, o filtro foi exposto a filme Kodak XAR-5 a -7©°C» 59

0 gel de agarose com DMA cromossómico de levedura <1»δ„5 um S£Saccharomyces chrDmo-di-hyhridizer” da Clontech) foi despistado com o fragmento de restrição PstI da gene da aminope-· ~%2~ — ptidase I de levedura marcado com í" F3 (Southerns b.» 11 » a J » HqL Biol 985503-517 (1975)5 Rigby, P.W^j.et al»J, Hol. Biol. 115s257-251 (1.977)) (Figura 2) de acordo com as instruções do fornecedor* Após a lavagem final5 d gel seco foi exposto a filme Kodak XÃR---5 a -70°C»

Detectaram—se tr@'s bandas principais na transferencia de DNA genómico digerido com EcoRI? correspondendo aos fragmentos de restrição EcoRI de cerca de 3P8kD» 0?9kb e ®55kb» Detectaram-—se duas bandas principais na transferência de DNA genómico digerido com Xbal5 correspondendo a fragmentos de restrição Xbal com cerca de 2,7kb e 2_H5kh» Estes resultados foram consistentes com os previstos a partir do mapa de restrição cio gene clonado (Figura 2). Os tamanhos dos dois fragmentos de restrição EcoRI pequenos (deduzidos a partir das sequãncias de DNA na Figura 3) esperava-se terem 92€>pb e 445pb» o que estava de acordo com os resultados obtidos» 0 fragmento adicional de 3»8kh foi previsto a partir do mapa de restrição (Figura 2> = mas o seu tamanho não pode ser calculado com precisão» 0 fragmento Xbal as 2?7kh foi previsto a partir do mapa de restrição (Figura 2)» 0 fragmento adicional de 2?5kb foi também previsto a partir do mapa ds restrição (Figura 2)„ mas novamente o seu tamanho não foi calculado com precisão» Estes resultados indicam a existãncia de uma única cópia do gene codificador de AP! no genoma de levedura» A análise de transferfncias de DMA cromossómico ds levedura mostrou que o gene API está situada no cromossoma XI de levedura» EXEnPLO 1,1

ESTRUTURA DA PRé-SEQUêNÇIA DA AHINQPEPTIDftSE I DE LEVEDURA A Figura 4 mostra os resíduos NH0—terminais -45 a —27 da proteína precursor de ΑΡΣ apresentados como uma hélice CSehif fer,, M =, et ah, Biophys. J» 7 s 121-135 (19675)» Os resíduos —45 a -42 não estão arranjados na hélice cu A presença de uma face hidrofóbica <consistindo principalmente em resíduos Leu e lie) e hidrofílica (consistindo em resíduos de Lis» Arg? SIu? Gin e Met) nesta hélice α prevista é característica de uma hélice a amfifílica CSeqrest? J J:'= et al., FEBS letters 58s247-258 (1974)). 0 programa de computador FASTP <Lipman? D = J» et ai.c Science 227 s 1455-· 1441 (1985)) foi usado para comparar a sequência de aminoácidos derivada da API de levedura com o banco de dados sobre sequências de proteínas da National Biomedical Research Foundation e naõ se encontrou qualquer semelhança significativa com quaisquer outras proteínas» 0 programa GAP (Mesdlsman, d = Eu et aL; J πποί . Biol» 48s443-453 (197Θ)) foi usado para comparar a sequência de API com a leucina-aminopeptidase bovina (Cuypers5 i-uT» st aL, J. Biol» Chem» 257;7Θ77-7Θ85 Í1982))P psptidass N as E° coli \HcCaroanP H»T. et aLs rfol, Gen» Benet. 204^148-155 (198à))s aminopeptidase de E»coli especifica de metionina (Ben--Bsssat, A» et al,, 1» Bacteriol 3.69s751-757 (1987)) e não se observou qualquer homologia significativa»

CARACTER i ST ICAS Dfl flM INDPEPTI BASE ftPI A aminopeptidase Ar‘l de levedura è uma enzima vacuolar que catalisa a remoção de aminoácidos do extremo NH0 de peptldeos e proteínas (Frey, J, et aL, Bioçhem. Bioshvs, Ac ta 527i31-41 <1978))= A sequência NH.^-terminal para os 18 primeiros resíduos da aminopeptidass I purificada por SD8-PA8E foi determinada s foram sintetizadas duas osndas de oligonucleotldeos sintéticas baseados nesta sequência de proteína e usadas para fazer o despiste de uma biblioteca genómiea de levedura em Sqt11, Usando uma sonda derivada de uma sequência de uma das inserções isoladas de >^çrci 15 DNA genémico de levedura codificador de aminopeptidase I foi clonado a partir de uma biblioteca de levedura em EHBL3A e sequenciado, A sequência de DMA codifica uma proteína precursor contendo 314 resíduos de aminoácidoSa A proteína "madura" cuja sequência NH„-terminal foi confirmada pela degradação automática de EDcnan s consiste ? baseado apenas na sequência de DMA? em 469 aminoácidos. Uma pré-sequência de 45 resíduos contem resíduos carregados positiva e negativamente assim como resíduos hidrofó— bicos e os seus resíduos NH-, foram arranlados numa hélice α ampifilica,, Esta pré-sequência difere das sequências sinal que dirigem as proteínas através da membrana plasmática bacteriana e do retículo endoplasmático ou para as mitocSndrias» Esta pré-sequência única com a sua mistura de resíduos carregados (positiva a negativamente) e de resíduos hidrofèbicos? dirige a aminope-ptidase I para vacuolos de levedura, Ainda? o gene da aminope— ofcidase 13 localizado préviamente por mapeamento genético no cromossoma XI de levedura e designou—se gene lap4 CTrumbly¥ R=J,et al, J,Bactsriol, 156g36-48 (1983)) foi determinado por análise de transferências de DNA como sendo um gene de uma única cópia situada no cromossoma XI,

.X A mobilidade relativa da enzima nativa (57Θ &Θ@> s da sua subunidade (5β #©Θ> está de acordo com os resultados de outros autores que deirminaram que a proteína se trata de uma çlicoproteína multimêrica (Johnson, M.J. , J. Biol. Chem. i57g575--586 (1941)5 Truiably, R.J.et ai, J.Bacteriol. 156g36™48 (1983)5 Frey, J, st a I,; Biochem. Bíophys. Ac ta 527g51-41 (1978)p netz, G„ et......ai-,.....Biochem. BioohySn Acta 429a935-949 <Í976>}„

EXB&OJS

CARACTERIZAÇÃO DA SEQUÊNCIA CLQNASA DQ GEME API 0 DMA qenómico clonado de API contem uma sequência tipo TATA a montante do codSo de iniciaçao e um sinal de poliads-nilaçSo a jusante do codao de paragem (Figura 3) = As análises- das transferencias de ONA genómico s cromossómico indicam que existe uma única cópia do gene API situada, no cromossoma XI de levedura, α que é consistente com o mapeamenio genético anterior do gene lap4 por Trumfoly e Bratiley CTrumbly, R.J-et al, J.Bacteriol, 156s36-48 (1983). A grelha de leitura aberta do DNA genómico contem 1542 nucleotidsos codificadiores de um precursor da API contendo 514 resíduos de amionoácidos. 0 peso molecular calculado do precursor é de 57 175 dal tons , o que está de acordo com a M _ do precursor calculada por análise de imunotransferências. Uma comparação desta sequência proteica deduzida com a sequência N-termínal da API purificada indicou que proteína purificada não possui 45 resíduos no extremo NrU da proteína precursores. Ainda, o peso molecular calculado da proteína precursora processada (sem os seus 45 resíduos de amincácidas terminais) é 51 663, o que está de acordo com a M da enzima purificada calculada por SDS-PAGE s análise de imunotransferências. No entanto, Metz s

Rohíu ínatz, G. st al, ,Biochem. Biophys. ftct,a_4^9a9^-949 <lV/6)) determinaram que API tem uma M de 51 ΘΘΘ (incluindo 12% de açúcar) e calculou que a partir da análise de aminoác idos que a proteína sera o açúcar tem um peso molecular de 44 8ΘΘ» Se assim f8r5 então o processamento C-terminal deve ocorrer de modo a gerar a proteína “madura”3 descrita par iletz e Rohm Crletz, G = et sL; Biochem* Biophvs·, Ac ta 429-5933-949 (1976))= Como e quando tais processamentos ocorrem e se são ou não mediados por protsa— ses vatuolares, tal como foi demonstrado para a maturação da proteinass B da levedura (Moshle, C = rL et al = 3 Mol „ Cell- Biol,, 7s4390-4399 C19S7)), ainda não foi esclarecido.

Em adição, foi observado que se a proteína fôr purificada a partir de células de levedura cultivadas até à fase estacionária, era vez de ser até à fase logarítmica como aconteceu com a proteína cuja sequência NH^-terminal está apresentada na Figura 1, a sequência N-terminal começa com Tir. situada no resídua 4. ssnSo está de acordo com a sequência proteica deduzi-da a

Ainda, o eMtremo NHL da pré-sequência contem um segmento de resíduos carregados (positiva e nsgativamente) e hidrofóbi— co5 capazes de adoptar uma conformação de hélice a amfifilica (Figura 4), que não é típica das pré-sequências associadas a outras- proteínas vacuolares de levedura, incluindo proteina.se A (Amisersr, g„ et al, , fiai. Cell. Biol. 6 = 2490-2499 (1986)), proteinass B (Moehle, C-n-et al., Mol, Cell. Biol, 7s4590-459? (1987)) e CPY (Hasilik, A. et ai.. Eur. J. Biochem. 85s599-608 C1978)) e outras proteínas eucariéticas secretadas (para uma revisão ver Briggs, M.S» et e.hs Adv» Prot- Chem. 38¾ 109-180 (1986))= As suas pré—sequências são compostas por um segmento de resíduos de sminoácidos apoiares, os quais são responsáveis pelo seu direccionamsnto para o retículo endoplasmâtico (para uma

revisão5 ver Blofoel, h„ et al. , fcmg Biomeffihranas,; vol = 'Zs Manson 5 L „ A „P sd» Plsnum? New York 5 pág„ 193-195 (1971)1. fí pré-sequência de ΑΡΣ também difere das pré-sequências mitocôndriais que são hélices a amfifílicas basicamente contendo resíduos carregados positivaroente (para uma revisSn,, ver Roi.se5 0= et ale„ J. Biol. Chem. 263s45Ô9-451i (1968)= Em adição, apesar tía pro-sequência de CPY de levedura se ter demonstrado direceio-nais CPY para o vacuolo de levedura (Johnson. !_ = Ii = et al = ,; Cel 1 43s875-885 (Í987)p Valls, L. A. st al.. Cell 48s87~997 (1987), nso existe sequência equivalente óbvia responsável pelo direccio-namento de API para os vacúolos.

Os elementos da pré-sequência de API responsáveis pela sua disposição intracelular podem ser avaliados usando proteínas de fusão»

Se bem que o que foi dito se refira a realizações particulares preferidas, compreender-se-à que o presente inventa não lhes está limitado. Os familiarizados com a matéria verão que podem ser feitas várias modificações às realizações descritas e que três modificações pretendem estar dentro do Imbito do presente invento.

Claims

•N -\ ’ BÊiviNDieassEs is=- Método para a recuperação de uma enzima aminopep— tidica especifica de substrato substãnciaimenta purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptídica entre um resíduo de metionina arnino·--terminal e qualquer penúltimo resíduo de amirioá--· eido amino-terminal seleccionado do grupo constituído pors Arg5 Asp5 Giu3 G1x3 Ile5 Leu5 Lis5 M-et e Fen5 a partir de uma amostra contendo a referida aminopeptidases caracterizsdo por compreender os seg u. i n tes passos g Ca) recuperação de aminopeptida.se bruta especifica, de substrato a partir de uma amostra contendo a referida aminopenti-dasep <h> sujeição da referida aminopeptidase bruta especifica de substrato do passo Ca) a criomatografia de permuta iènicap e Cc) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela referida cromatografia de permuta tónica, 2ên- Método de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por compreender ainda os passos deg Cd) sujeição da referida aminopeptidase recuperada específica de substrato do passo Cc) a cromatografia de hidroxil-apetites e <s) recuperação ds qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pela referida cromatografia em hidroxila-patite» 3ã.- Método de acordo com uma das reivindicação i ou 2, caractsrizadc? por se obter uma enzima aminopeptidase especifica de substrato substSncialmente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptídica entre um resídua amina-terminal X e um resíduo íle adjacente de um peptídeos em que X é um resíduo de aminoácida ssleccionada do grupa constituído por; Ala* Arg5 Gln? HiSj Ile9 Lsus fiets Fen? Pro? Ser 5 Tre e Trp = 41 = - fiétodo de acordo com uma das reivindicação 1 ou 3? caracterizado por se obter uma enzima aminopeptidase especifica de substrato que é a aminopeptidase AP2= 51 = - Método para a. recuperação de uma enzima aminopeptidase especifica de substrato substãncialmente purificada tenda capacidade para clivar a ligação peptídica entre um resíduo de metionina amino-terrainal e qualquer penúltima resíduo de aminaé-eido amino-terminal seleccionsdo do grupo constituído pors Ala? Arg5 Asps Cis5 Gli5 His5 Ile? Leu= Liss Met* Fen 5 Ser e TrpP a partir de uma amostra contendo a referida aminopeptidase csracte-rizado pelos seguintes passos; (a) recuperação de aminopeptidase bruta específica de substrato a partir ds uma amostra contendo a referida aminopep·-tidase 5 Cb) sujeição da referida aminopeptidase bruta específica de substrato do passo ía) a cromatografia de permuta iónicap e

(c> recuperação de qualquer aminopeptidase específica de substrato purificada pela referida cromatoorafia de permuta iónica» 63»- Método de acordo com a reivindicação caracteri-zado por compreender ainda os passos des (d) sujeição da referida aminopeptidase recuperada especifica de substrato do passo <c> a cromaioçrafia em hidroxil---apatites s <e) recuperação de qualquer aminopeptidase específica de substrato purificada pela referida cromatografia em hidronil-apatite» /Ss” Método de acordo com a reivindicaçlo 65 caracteri-zado por compreender ainda os passos des <f) sujeição da referida aminopeptidase recuperada especifica de substrato do passo (e) a cromatoqrafia em Phenyl--Seoharose CL---4B5 s (g) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada^ pela referida cromatografia em Phenyl---•Sepharose CL-4B Bâ=- Método de acordo com uma das reivindicações 5 a 7? caracterizado por se obter uma encima aminopeptidase especifica de substrato sufostSncia1mente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptidica entre um residuo ameno-terminal X e um resíduo Ile adjacente de um peptideo^ em que X é um resíduo da aminoâcido seleccionado do grupo constituído pors Ara ? Blns His=, Leu5 Mst5 Fsn? Pro5 SerP Tre e Trp»

= ujj.u~l.su- .. τ ___ ι_ε L|—A'=-p- Arq—Asp-Leu—lá ] -Lys—B1 u—Asd 5 3—Fr i.;—Fi 1 s—Lá 1: -Pr —A rq -1 y r-v-51 ? I I S~r;l í Sii- -- A r u —L su—A s π s Ά5μ· Hll 1 . . X, w- — Σ10—G1 v1—hp

'hr—i is—Si v—Pro- -Ssr--Leu-Ala-Ser~Gln % and "U1 y— v*-r;. 1— bys—Pris"*' F!Ne—As* r—ϋ 1 y—P Hyy u-Slu- -Gin- —pi r~ QG1 Li" -11 e—Leu-B 1 u -Gin —Leu -Lys-Lys- i hr-Lsu- —t “ i í i i-r L -Thr-Vãl- “L* X Li-T· 1* 0**—£3ir?t* -Lys “Η5Π -Asn-Gin — i 10*“Ή £ ê*i .n-Glu- -BI u·· -Lys-Slu·· - L. V “· “* L. v '5· *** L3 i Li “A=-n —BI u -Asn-Ser— Trp-Cys 11 tf—Leu I Met-tí1u-S1u-tíln-Arg-BIu-I1e-L -Leu-Sln-Met-Leu-Thr-Val—Glu—Pro-Ser-Ly« 1 □s =: - Método para a recupsraçSío d e uma encima amino rpS“ Dfcid-SSS’ £?S pbí3_iT.Lcs ds substrato substância 1 men te pu r i f içada tendi capacidade para c1xvar a ligação peptidica sntrs um rs Si. dUO metionina amino-termin al s qualquer penúlt imo resíduo ffç3 CT; ff: ] .5 iwC.1 cxdo amino —'csminai se ieccionado do grupo constituído por? V íãl r: fil Pi _ firo,, i - ·*« p » ·« y A‘Sp :: LIS5 B 1 u, Sln5 G1i s His = 11 Mei5 Fen 3 F" t U !| 1" s T 5-“ ETs CT« X V r*s , t w. _ . , p e

(a) recuperação da afisinopeptidase bruta especifica de substrato a partir de uma amostra contendo a referida aminopepti-tíasss íb) sujeição da referida e.s i nope ρ t i d ase bruta específica de substrato do passa <a) a cromatografia de permuta tónicas e (c) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica de substrato purificada pala referida cromatografia ds permuta iénica» 16! = -· Método de acordo com a reivindicação lo„ caracte— rizado por compreender ainda os passos de:; (d) sujeição da referida aminopeptidase recuperada especifica de substrato do passo (c) a cromatografia em hidroxil-apatite? e (e) recuperação de qualquer aminopeptidase especifica da substrato purificada pela referida cromatografia sm hidroxil— apatite» 1/1=- Método ds acordo com uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizado por se obter uma enzima aminopeptidase especifica de substrato substãnciaimente purificada tendo capacidade para clivar a ligação peptldica entre um resíduo amino-terminal X e um residuo Ils adjacente de um peptideo5 em que X é um resíduo de smínoâcido seleccionado do grupo constituído pors Val? Arg? Blu? BIi p His? Ile5 Leu? Met? Fens Tre e Trp = íSI = — Método de acordo com uma das reivindicações 15 a 17s caracterizado por se obter5 uma aminopeptidase especifica ds substrato que é a aminopeptidase AFX0 19§ = - Processo para a preparação de uma molécula de DMA recombinante caracterizado por se incluir na referida molécula uma sequência genética de codificar a aminopeptidase especifica de substrato da reivindicação 4= 2©ã«- Processo para a recuperação de uma molécula de DMA recombinante caracterizado por se incluir na referida molécula de DMA recombinante uma sequência genética capas de codificar a aminopeptidase especifica de substrato da reivindicação 9. 21â«- Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante caracterizado por ss incluir na referida molécula de DNA recombinante uma sequência genética capaz de codificar a aminopeptidase especifica de substrato da reivindicação 1©= 22i = ~ Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante caracterizado por se incluir na referida molécula de DNA recombinante uma sequência genética capas de codificar a pré-sequência de localização vacuolar de qualquer uma das reivindicações 11 ou 12= 23§=- Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante caracterizado por se incluir na referida molécula de DNA recombinante uma sequência genética capaz de codificar a proteína ou polipeptídeo heterólogo da reivindicação 1.3 = 24â«- Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante caracterizado por se incluir na referida molécula de DMA recombinante uma sequência genética capaz de codificar a aminoproteína específica de substrato da reivindicação 14« 25§=- Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante caracterizado por se incluir na referida molécula de

DMA recombinante uma sequência genética capas de codificar a aminoproteina especifica de substrato da reivindicação 18= 261 = - Processo para a obtenção da aminopsptidase especifica ds substrato AP2 da reivindicação 4, caracterizado por ser produzida através da expressão de uma molécula recombinante» 271»- Processo para a obtenção da aminopeptidass especifica de substrato API da reivindicação 9, caracterizado por ser produzida através da expressão ds uma molécula recombinante» 281»- Processo para a obtenção da aminopeptidase especifica de substrato API da reivindicação 1Φ, caracterizado por ser produzida através da expressão de uma molécula recombinante» 291»- Processo para a obtenção da proteina ou polipep— tideo heterólooo da reivindicação 13, caracterizado por ser produzida através da expressão de uma molécula recombinante» 3Θ1= - Processo para a obtenção da aminopeptidass especifica de substrato API da reivindicação 14, caracterizado por ser produzida através da expressão de uma molécula recombinante» 311»- Processo para a obtenção da aminopeptidass especifica de substrato API da reivindicação 18s caracterizado por ser produzida através da expressão de uma molécula recombinante» 321»- Método para a remoção de um residuo de metionina amino-terminal de um peptidea contendo o referido residuo amino-- terminal e contendo como penúltimo residuo de aminoácido, amino-terminal, um aminoácido seleccionado do grupo constituído pors Arg, Asp, 81u, 61i» His, Ile, Leu» Lis, Met e Fen, caracte-rizado por compreender a incubação do referido peptideo na

presença da aminapeptidase especifica de substrato Ar2 para assim remover o rsferido resíduo amino~terminal= 33ã«- Método para a remoção de um resíduo de mstionina amino-terminal de um peptideo contendo o referido resíduo amino— -terminal s contendo como penúltimo resíduo de aminoácido, amino-terminal, um aminoácido seleccionado do grupo constituído pors A1 a , Arq , Asp, Cis, Glir, His, íle, Leu , Lis, Met, Fen, Ser e Trp, caracteriEado por compreender a incubação do referido peptideo na presença da aminopeptidase especifica de substrato ΑΡΪ para assim remover o referido resíduo amino-terminal« 34â.,~ Método para a remoção de um resíduo da cuetianin® amino-terminal de um peptideo contendo o referido resíduo amino— -terminal, e contendo como penúltimo resíduo da aminoácido, amino-terminal, um aminoácido seleccionado do grupo constituído por5 Vai , Ala, Arg, ®asp, Cis, GIu, Gin, Gli, His, He, Leu, Lis, Met, Fsn, Pro, Ser, Tre e Trp, caracteriEado por compreender a incubação do referido peptideo na presença da aminopeptidase específica de substrato API para assim remover o referido resíduo amino-terminal= 35â a -- Método para a remoção de um resíduo X amino— -terminal de um peptideo contendo o referido resíduo terminal X a um resíduo ϊla adjacente, em que X é seleccionado do grupo constituído por Ala, Arg, Gin, His, lie, Leu, Met, Fen, Pro, Ser, Trs s Trp, caracteriaado por compreender a incubação do referido peptideo na presença dai aminopeptidase especifica de substrato APS para assim remover o referido resíduo amino—terminal= 361*- Método para a remoção de um resíduo amino-terminal X de um peptideo contendo o referido resíduo terminal X e um resídua Ile adjacente, em que X é seleccionado do grupo

constituída por Arg, Sln= His, Leu, llet, Fen, Pro, Ser5 Trs e Trp, csracterissdo por cosipresnder a incubação do referido peptídeo na presença da aminopeptidase especifica de substrato APX para assim remover o referido resíduo amino—terminal» 37ã = — Método para a remoção de um resíduo ensino-terminal X de um peptídeo contendo o referido resíduo terminal X e um resíduo lia adjacente, em que X é seleccionado do grupo constituído por Vai s Ala, Arq ?_ BIn, Gli, His, í le, Leu 5 Met ? Fen, Tre e Trps caractsrizado por compreender a incubação do referido peptídeo na presença de aminopeptidase especifica de substrato APX para assim remover o referido resíduo amino-terminal= 38§,- Hétodo de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-37, caracterizado por a referida aminopeptidase específica de substrato ser imobilizada num suporte sólido. Lisboa, 11 de Setembro de 19SV

Agente Oficiai da Prepriedads industrial «UA VICTOR CORD©N, 10-A, 1/ 1200 LISBGA