JPS61503035A - ポリペプチドとポリペプチド組成物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドとポリペプチド組成物 技術分野 本発明は、ポリペプチドとポリペプチドより成る組成物に関する。このポリペプ チドは、組換えＤ　Ｎ　Ａバイオチクロッジ−の技術により生産することができ る。

背景技術 食餌中の脂肪の分解は、高等動物の消化器系の重要な特徴である。この消化プロ セスは、脂肪が消化管を通過する間にトリグリセリドを加水分解してモノグリセ リド、ジグリセリド、グリセロール及び遊離脂肪酸を生じさせるのを触媒する酵 素によって可能になる。加水分解生成物は、消化管に並ぶ粘ＩＮ！細胞の皮膜を 通過することができる。一旦吸収されると、それらはキロミクロン（ｃｈｙｌｏ …１ｃｒｏｎ　）に入って、トリグリセリドを再合成するために使用される。キ ロミクロンはリンパ系によって、吸収部位から遠く離れた所に運ばれる。トリグ リセリドの加水分解を行う酵素は、リパーゼと呼ばれており、胃腸管中に分泌さ れる（デスヌエル１Ｐ、（Ｄｅｓｎｕｅｌｌ、Ｐ、　）　（１９７２）ザ・エン ザイムズ、第７巻、第３版、Ａｃａｄ、プレス、ニューヨークとロンドン、及び ベルガー、Ｒ５（Ｖｅｒｇｅｔ、Ｒ，）　（１９８０）メソソズ・イン・エンジ モロジー、６４．３４０−３９２　）。

トリグリセリドの加水分解に関与する酵素は、膵臓のリパーゼ（ＥＣ３，１，１ ，３）である。ブタは、酵素の便利な供給源であり、ブタの膵臓リパーゼは詳し く研究されている。これは、ブタの膵液中に全タンパク質の約２．５％存在して おり、均質に精製されている（ヘルガー、Ｒ２）他（１９６９）　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ　Ｂｊｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　１ＢＢ、２７２−２８２　）。この酵素の完全 なアミノ酸配列は決定されている（デ・力口、　Ｊ、　（Ｄｅ　Ｃａｒｏ、Ｊ、 　）他（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ　ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ　６７１、１２ ９−１３８　”）　、この酵素は、　４４９個のアミノ酸のタンパク質部分（？ １１１４９８５９）とアミノ酸配列中の１６６の位置にあるＡｓｎ残基に付着し ている炭水化物部分（１約２０００）より成る。従って、この酵素の全分子量は おおよそ５２０００である。膵臓リパーゼの触媒作用は、可溶性酵素と不溶性の トリグリセリド基質との間に相分離が存在しているため、複雑である。この酵素 が基質と相互作用するためには、コリパーゼと呼ばれる酵素が必要である。

コリパーゼは、低分子量のタンパク質であり、溶液／脂質の界面に吸着してリパ ーゼに対してアンカーとして作用し、酵素とその脂質基質とを相互作用させる。

膵臓のリパーゼは、トリグリセリドの消失又は′Ｍ離脂肪酸若しくはリセロール の精製の測定を含む様々な技法によって検定することができる（上記デスヌエル とベルガーの文献参照）。放射性同位元素による標識、加水分解中のプロトン放 出及び脂質単層の物性に対するリパーゼの作用もリパーゼ活性を検定するために 用いることができる。全ての場合で膵臓のリパーゼは、中性−アルカリ性のｐＨ 領域（即ちｐＨ７−ｐＨ９＞において最も活性である（上記ベルガー他参照）、 この酵素は、酸性のｐＨに対して非常に敏感であり、低いｐＨでは急速に不活性 化する。

ヒトの体の多（の吸収不良疾患は、膵臓のリパーゼの分泌量が減少するというこ とに特徴づけられている。！［宿性線維症に罹、っている約８０％の人達は、膵 液欠乏症に罹っている。膵臓のリパーゼ欠乏症は、誕生直後にその症状が現れ、 患者の一生を通して続く。

肝臓炎は、膵臓の機能が阻害されている状態である。肝臓炎は、慢性のアルコー ル中毒患者によく現れ、このため彼等は脂肪の吸収不良の結果として起こる栄養 不良に罹っている。

発育中の胎児は、炭水化物の割合の高い栄養に頼っており、少量の膵臓リパーゼ しか精製できない未発達の膵臓機能を持っている。誕生後、胎児期の炭水化物の 割合の高い栄養は、幼児が母親の母乳を飲み始めるようになったとき高脂肪食に 換わる。脂肪は、幼児のカロリー摂取の約半分にも達する。膵ｇ＆機能は、臨月 まで胎内にいた幼児ですら充分に働かず、特に予定日前に生まれた幼児達は、脂 肪を良く消化できず、このためひどい脂肪便（便中に消化されない脂肪が出るこ と）に罹っており、これはエネルギーの損失となっている。

膵臓リパーゼの欠乏症に患っている患者の現在の治療法は、ブタの膵臓の酵素か ら作った粗製製剤を非常に大量に経口投与することである。膵臓リパーゼは、低 いｐＨで不活性化する。胃ではこのような低いｐｌ＋状態が普通であり、この結 果経口投与された膵臓リパーゼは胃から腸へ通過する間に略完全に不活性化する 。このためこの低いｐｌ＋の影響は、酵素を多量に使用しても完全に克服できる ものではない。多くの患者にとって、このように投与された多量の薬は、不純で 味の悪いものであり、不適当である。成る種類の錠剤は、胃の酸性領域を通過し て空腸の比較的アルカリ性の雰囲気においてのみ酵素を放すように作られている （ガラ、Ｒ９（Ｇｏｗ＋Ｒ９）他（１９８１）ザ・ランセット、２ｊＪｋＳ皿匝 、１０７０−１０７４）。

しかし、膵臓障害に罹っている多くの患者の空腸は異常な酸性状態にあり、この ような錠剤は酵素を放すことができないため、有効に作用することができない。

膵臓リパーゼの欠乏症に罹っている患者に経口投与できるリパーゼの製剤に対す る大きな需要がある。

公告された欧州特許用＠　Ｎｏ、　Ｅ　Ｐ　−Ａ　Ｉ　−０１３１４１８には、 舌リパーゼより成る１つのこのような製剤が開示されており、これは舌に由来し 、胃の空腸で脂肪分解を行うことができる酸に安全なリパーゼである。本発明は 、胃のリパーゼより成る製剤を提供するものであり、このリパーゼは胃の組織に 由来し、また胃の内腔で脂肪分解を行うことができるものである。

本発明以前には、ヒトの胃のリパーゼの存在と酵素学的性質についての予備的研 究しか行われなかった。成る報文によれば、“胃リパーゼの件は未だ充分に研究 調査されていない”と述べられている（デスヌエル、Ｐ、（１９７１）　、ザ・ エンザイムズ、７巻、第３版、Ａｃａｄ、プレス、ニューヨークとロンドン）。

サフラン＋Ｚ、（Ｓｚａｆｒａｎ、ｚ、）他による一連の報文によれば、胃の粘 膜は酸に安定なリパーゼを分泌することが示されている（エンザイム、（１９８ ３）　、３０．１１５−１２１　；ディジェスチョン（１９７１３）１日、３１ ０−３１８　Ｆ及びエンザイム（１９７８）　、卦ｉ８７−１９３　”）。

この実験的根拠は、胃の粘膜組織と胃の吸引物の比較による酵素図（酵素活性を 調べるために染色されたタンパク質抽出物のポリアクリルアミドゲル）、及び患 者にペンタガストリン（ｐｅｔａｇａｓｔｒｉｎ　）（ペンタガストリンは胃粘 膜からの分泌液と酵素の分泌を刺激する）で処方した後、胃粘膜からペプシンと 水素イオンが明らかに共に分泌されることとリパーゼ活性についての研究に基づ いている。胃液と胃粘膜は共に、リパーゼ活性を調べる・ために染色するとよく 似た酵素図パターンを示す。しかし、十二指腸組織の酵素図は、胃の粘膜組織と は明らかに異なり、十二指腸組織はこの胃リパーゼを分泌しないことを示してい る。ペンタガストリンの投与量を段階的に変えて連続して投与した後、ヒトの胃 の吸引物中に現れるペプシン、水素イオン及びリパーゼ活性を測定した結果によ れば、明らかに分泌量が倍になっていることがわかる。この研究において、胃粘 膜からのリパーゼのタンパク質化学に関する情報は何も得られない。

ヒトの冑の吸引物（胃の内腔の液状物）からのリパーゼは、均一に精製されてい る（チルバチ、　Ｃ，（Ｔｉｒｕｐｐａｔｈｉ、Ｃ，とバルスプラマニアン、に 、Ａ、（Ｂａｌｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、に、Δ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈ ｙｓ。

Ａｃ（、ａ、（１，９８２）　７１２．６９２−６９７参照）。

この酵素は次の特性を有している。即ちａ８分子量が４５，０００である。

１）、酸性状Ｗ　（ｐＨ３，５６，５）で脂肪分解を行うことができる。

これにより、この酵素は舌リパーゼに類似しており、これらの研究五速によりそ の起源は舌の漿液腺であると考えられている。

しかし、Ｌ記の内容からこの酵素の未知の部分はヒトの胃の粘膜６ご由来ｔろと いう、二ともありうる。従って、ヒトの胃の吸引物に存在するりバーゼは、舌と 胃の酵素の混合物であるかも知れない。

我々は、ヒＩ・の胃の粘膜はリパーゼを分泌するこということを明らかにした。

このヒトの胃のリパーゼは、舌リパーゼに化学組成で略類似しているが、特定の 構造に関し２ては異なっていることがわかった。

上記した胃のリパーゼに関する全ての研究は学術的な性格を有しており、リパー ゼ欠乏症の治療のために胃のリパーゼを使用することに関しては（ＩＩ■等の示 唆もなされていない。我々は胃のリパーゼをそのように使用することができると 信じているが、それは仮に胃のリパービが大量に且つ比較的に安価に生産するこ とができて、そうすることが経済的に見合うときだけである。これを動物又はヒ １−の組織から抽出して行うことは明らかに実現不可能である。

発明の開示 我々は、本発明に基づき組換えＤＡＮ技術を使用して製造することにより、商業 的に価値のある量の胃リパーゼを提供するものである。

本発明の第１の態様に基づき、リパーゼ欠乏症の治療に使用するための胃リパー ゼタンパク質を提供する。

本明細書において使用するように、“胃のリパーゼタンパク質”という用語は、 本物の哺乳類の胃リパーゼ又は機能的に等しいタンパク質となるように変更され た又は置き換えられた本物の哺乳類の胃リパーゼを意味する。この胃すパーゼタ ンバタ質は、例えばＮ−末端メチオニンアミノ酸残基を有する哺乳類の胃リパー ゼタンパク質（メチオニン−胃リパーゼタンパク質）より成るものとすることが できる。好ましくは、この胃リパーゼタンパク質は、ヒトの胃リパーゼタンパク 質とする。

この胃リパーゼタンパク質は、組換えＤＮＡ技術で生産するのが有利である。

本発明の第２の態様において、メチオニン−胃リパーゼタンパク質のコードとな る遺伝子を含むベクタで形質転換された宿主生物中でこのタンパク質を生産する ことより成る、メチオニン−胃リバーセタンバク質を生産するための製法を提供 する。

遺伝子の発現を得るためには、この遺伝子は５’　ＡＴＧコドンを有していなけ ればならず、従って対応するポリペプチドはＮ−末端メチオニンアミノ酸を有し ていることになる。本明細書において使用するように、“メチオニン−胃リパー ゼタンパク質”は、Ｎ−末端メチニオンアミノ酸残基を持っている本物の哺乳類 の胃リパーゼ（又は機能的に等しいタンパク質となるように変更された又は置き 換えられた本物の哺乳類の胃リパーゼ）を意味する。

このメチオニン残基は本物の胃リパーゼのＮ−末端アミノ酸と隣り合っているこ とが好ましいが、このタンパク質が胃リパーゼの機能的活性を持っているのであ れば、そこから１つ又は２つ以上のアミノ酸を介して離れていても良い。好まし くは、この宿主生物（例えば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のような）細菌又は（例え ばサツカロミセス９セレビシエＣｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ　）のような）酵母とする。

本発明の第３の態様においては、前駆体タンパク質のコード（遺伝暗号）となる 遺伝子を含むベクターで形質転換された宿主生物中に胃リパーゼの前駆体タンパ ク質を生産し、そしてこの前駆体クンバク質を切断して胃リパーゼタンパク質を 生産することより成る、胃リパーゼタンパク質を生産するためその製法を提供す る。

好ましくは、この胃リパーゼ前駆体タンパク質は、前駆体リパーゼタンパク質と し、また宿主生物は前駆体リパーゼタンパク質を切断して胃リパーゼタンパク質 を生産することができるものとする。より好ましくは、この宿主生物は、前駆体 胃リパーゼを切断して、胃リパーゼタンパク質を培地に運ぶことができるものと する。

本発明の第３の態様の代わりとして、前駆体胃リパーゼタンパク質は、異種構造 のタンパク質と胃リパーゼタンパク質より成る融合タンパク質とする。この異種 構造のタンパク質は、全部又は部分的に宿主生物中に望ましくは多量に生産可能 なタンパク質とすることができる。適当なこのようなタンパク質には、β−グル コシダーゼ　クロラムフエミニコール　アセチル　トランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）とｔｒｐＥ遺伝子の生産物が含まれる。好ましくは、この融合タンパク質には 異種構造のタンパク質と胃リパーゼタンパク質問を選択的に化学的又は酵素的に 切断を行うことができる部位が含まれている。この異種製造のタンパク質は酵母 のシグナル配列とすることができ、また宿主生物は酵母とすることができる。こ の好ましい実施態様では、酵母の宿主生物は、都合良く融合タンパク質を切断し て成熟した胃リパーゼタンパク質を生産する。

本発明の第４の態様では、前駆体胃リパーゼタンパク質を提供する。

本発明の第５の態様では、メチオニン−胃リパーゼタンパク質を提供する。

本発明の第６図の態様では、異種構造のタンパク質と胃リパーゼタンパク質より 成る融合タンパク質を提供する。

本発明の第７の態様では、少なくとも胃リパーゼタンパク質のアミノ酸配列のコ ードとなる遺伝子を提供する。好ましくは、この遺伝子は、本発明の第４、第５ 又は第６の態様のタンパク質のコードとなるものとする。

更に、添付図面の第３図に示すように少なくともヒトの胃リパーゼ又はヒトの前 駆胃リパーゼのアミノ酸配列のコードとなるＤＮＡ配列を提供する。好ましくは 、このＤＮＡ配列は第３図に示すものとする。

本発明の第８の態様では、本発明の第７の態様の遺伝子を含むベクターを提供す る。このベクターは、所定の宿主生物中に適当な選択可能なマーカ、プロモータ 及び他の調節領域を与えることにより用途に応じて調整する。

本発明の第９の態様では、本発明の第８の態様に基づ（ベクターで形質転換した 宿主生物を提供する。この宿主生物は、胃リパーゼタンパク質のコードとなり、 且つその発現が生じる遺伝子を含むベクターにより形質転換され得る如何なる生 物でも良い。適当なこのような宿主生物には、細菌（例えばサツカロミセス・セ レビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　）及び組 織培養中の哺乳類細胞が含まれる。宿主生物が細菌又は酵母の場合、ベクターに はメチオニン−胃リパーゼ又は融合タンパク質のコードとなる遺伝子が含まれた ものが好ましくば、震だ宿主生物が組織培養の哺乳類細胞の場合、ベクターは前 駆胃リパーゼコードとなる遺伝子を含むものが好ましい。

本発明の第１０の態様では、胃リパーゼタンパク質の抗原決定基に対する特異性 を有する抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル 抗体とすることができるが、好ましくはモノクローナル抗体とする。この抗体は 、免疫検定で使用するため、例えば放射性同位元素のような検出可能なマーカで 標識しておくことができる。

本発明の第１１の態様では、胃リパーゼタンパク質と薬剤に使用ｉｉＪ能な賦形 剤より成る医薬組成物を提供する。好ましくは、このリパーゼタンパク質は、本 発明の第２又は第３の態様の製法により生産されたヒトの冑すノく−ゼとする。

この医薬組成物は、リパーゼ欠乏症の治療用に提供される。好ましくは、この組 成物ば経口ｔλ与用シこ調走ｊされノ、：ものとする。

この組成物は、例えば錠剤、カプセル又は糖衣錠のような単位投薬の形態とする ことができる。

単位投薬の形態とするため、安定な胃リパーゼをラクトース、サッカロース、ソ ルビｉ−ル、マントニトール、デンプンへセルロース誘導体又はゼラチン又は他 の同様な賦形剤のような、固形微粉で医薬的に不活性な担体と混合する。ステア リン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はポリエチレングリコール　ワ ックスのような潤滑剤も添加することができる。得られた組成物を押し固めて単 位投薬の形態とする。この単位量の薬剤は、タルク、二酸化チタニウム、ゼラチ ン又はアラビアゴムのような添加物の含まれた濃縮砂糖溶液でニア−）しておく ことができる。この単位量の薬剤は、ラッカーでコートしても良い。単位量の薬 剤を見分は易くするため、コート剤に着色料を添加しても良い。液状又は固形の 製剤となっている胃リパーゼをカプセル化するため、軟質又は硬質のカプセルを 使用することができる。

あるいは、この胃リパーゼは液状に調剤しておくこともできる。

す。この担体は、例えばシロップ剤又は懸濁液とすることができる。この液状剤 には着色剤、着香籾、甘味料及び／又は濃化剤を含めても良い。

本発明の他の態様では、胃リパーゼタンパク質を医薬的に使用可能な担体と一緒 にすることより成る医薬組成物の生産方法を提供する。本発明の更に他の態様で は、有効量の胃リパーゼタンパク質を投与することより成るリパーゼ欠乏症の治 療法を提供する。

また、本発明はプラスミドＰＧＬ１７、ｐｃＭＬｌ及びｐＭ　Ｇ　１９７も提供 する。

以下の明細書において、添付の図面を参照して組換えＤＮＡ技術を使用した胃リ パーゼの生産のためのプロトコールを説明する。

図面の簡単な説明 第１図はヒトの胃リパーゼの２つの調製物のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示 す６＋／−ンＡは精製したヒトの胃リパーゼ、レーンＢはヒトの胃リパーゼの多 少精製した抽出物、レーンＣは基準分子量のマーカである。

第２図はプラスミドｐ　Ｇ　Ｌ　１７の制限エンドヌクレアーゼ地図であり、ｔ ａ＋は制限地図、（ｋｌｌは第３図におけるＤＮＡ配列の範囲、（ｃｌは前駆又 はシグナル配列を意味する太線と共にヒトの胃すパーゼタンパク質配列の位置を それぞれ示す。

第３図はピ１−の前駆胃リパーゼ遺伝子のコート一部分のＤＮＡ配列と関連する アミン配列を示す。

第４図は、プラスミドｐ　ＣＭＬ　１の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。

第５図は、プラスミドｐ　Ｍ　Ｇ　１９７の制服エンドヌクレアーゼ地図を示す 。

第６図は、プラスミドｐ　Ｍ　Ｇ　１９７で形質転換した大腸菌中に生産された ヒトの胃リパーゼのウェスタンプロット分析の結果を示第７図は、プラスミドｐ 　Ｍ　Ｇ　１９７で形質転換した大腸菌中に生産されたヒトの胃リパーゼの５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す。

第８図は酵母プラスミドｐＹＣ３の制限エンドヌクレーゼ地図を示す。

第９図は、プラスミドｐＹＣ３で形質転換した酵母中に生産されたヒトの胃リパ ーゼのウェスタンプロット分析の結果を示す。

第１０図は、ｐＹＣ３で形質転換した酵母中に生産されたヒトの胃リパーゼのＳ 　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅによる分析結果を示す。

発明を実施するための最良の形態 用いた生産手段は、先ずヒトの胃の吸引物からヒトの胃リパーゼを精製すること であった。精製した酵素に対してＮ−末端アミノ酸配列と構造特性の分析を行い 、そしてポリクローナル抗体を生成させた。この酵素の遺伝子は、非常に均質な ラットの舌リパーゼより成るプローブを用いてヒトの胃の組織がら作られたｃＤ ＮＡライブラリをスクリーニングすることによりクローン化した。ヒトの胃リパ ーゼの完全な核酸／タンパク質の配列を決定した。本明ｗｉ書は、このヒトの胃 リパーゼクローンがどのように適当な微生物又は組識培養中の動物細胞中に発現 されて組換え体のヒトの胃リパーゼ生成物ができるかを説明する。

巨世からのヒトのｆｆｉベニガニ詰ｌｉヒトの胃リパーゼをチルバチ（Ｔｉｒｕ ｐｐａｔｈｔ）他の方法により胃の吸引物から精製した（チルバチ、他（１９８ ２）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｙｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　７１２．６９１６９７　）　、この方法によれば、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅの測定による分子量約５０．０００の純粋なヒトの胃リパーゼが得られた（ラ メリ　（Ｌａｍｍｅｌｉ　）　（１９７０）ネイチャー、２７７．６８−６８５ 　）　。

第１図は、ヒトの胃リパーゼ調製物のポリアクリルアミドＳＤＳゲルを示す。レ ーンＡは精製したヒトの胃リパーゼ（約５μｇ）、レーンＢはヒトの胃の吸引物 の多少ＩＮ製した抽出物（約１０μｇ）そしてレーンＣは一群の基準分子量のマ ーカを示す。この酵素は層ｇ当たり約６００リパーゼ単位の活性を持っている（ 単位−３７℃で１分間当たり生成するＭ離脂肪酸のマイクロモル）。

ポリクローナル　ウサギ　−ヒトｌパー上　血洩■ｍ上述したように単離し、電 気泳動により純粋にしたヒトの胃リパーゼの約１００μｇの調製物を１ｍｆｆの 完全なフロイントのアジュバントに入れ、ウサギに注射した。１４日後、不完全 なフロイントのアジュバントを使用して接種を繰り返した。２Ｂ−３０Ｅｔｌｌ 及び引き続いてその間隔を置いて、ウサギから採血して抗血清を作った。

抗血清の滴定は、標準的な免疫学的手法を用いて測定した。

のヒトの１リパーゼの　の１　、　の」だ均質に精製され、ＳＤＳポリアクリル アミドゲル中で電気泳動されたヒトの胃リパーゼは、単一のバンドとして移動し 、これは約５０，０００のはっきりとした分子量を持っていた（第１図）。セフ ァデックスＧ１５０による不純なヒトの胃リパーゼのゲル濾過によれば、ポリア クリルアミドゲル電気泳動法による値と略一致する計算に基づく分子量が得られ た。分子量の４５．０００は、セファデックスＧ１００によるゲル濾過を用いて 上述したようにチルバチ化（１９８２）によりめられたものである。従って、精 製されたヒトの胃リパーゼは、分子量約５０．０００のモノマーとして活性であ るという結論が得られる。

（支）ユ１．ヱｌ己１とヒトの町ノパーゼの　アミノ　Ｋ精製したヒトの胃リパ ーゼのＮ−精製アミノ酸配列は、スミス。

Ｍ、Ａ　（Ｓｍｉｔｈ、Ｍ、Ａ、）他の方法により決定された（スミス、　Ｍ、 Ａ、他ヒトの町ノパーゼのＮ−７”：／笠配歿Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　１．ｙ ｓ　Ｌｅｕ　−ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｍ ｅｔ２〇 −Ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ−Ｔｙｒ　 −Ａｓｎ　Ｇｉｎ （ダノシ１は決定されていないアミノ酸を示す）表　１ Ｌ−１・の胃リパーゼの部分的アミノ酸絹成へｓｐ＋　八ｓｎ　５２．２　４８ Ｔｈｒ　１９　１９ Ｓｅｒ　２８．８　２６ Ｇｌｕ−＋旧ｎ　３８．２　２９ １’ｒｏ　２４．９　２２ ｃｉｙ　２９．５　２３ ＾１ａ　２８．８　２４ Ｖａｌ　２８．７　２４ Ｍｅｔ　１０．６　９ ｔｉｅ　２２．２　２２ Ｌｅｕ　３６．０　３３ Ｔｙｒ　２１．５　２１ Ｐｈｅ　２５．５　２５ Ｌｙｓ　２１．２　２２ １１ｉｓ　１１．７　１１ ０Ａｒ　１０．６　１０ Ｃｙｓ　＋　ＴｒＶは確認されなかった。

■Δヒゼにおける糖タンパク化（グリコシレージョン工」鉱碓−落 アスパラギンが結合したＮ−グリコシレージョンの存在は、精製したヒトの胃リ パーゼをストレプトミセス・プリカラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｌｉｃ ａｔｕｓ）からのエンドグリコシダーゼＨ（エンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサ ミニダーゼＨ）を用いて分解することにより確認された。５０Ｉｌ１Ｍの酢酸ナ トリウム中１ｍｇ／ｍｌのヒトの胃リパーゼ溶液ｐＨ５，５，１ｍＭフェニルメ チル　スルホニルフルオリド、５０単位／ｍｌエンドグリコシダーゼＨを含む１ ０μＨペプスタチンＡを３７℃で培養した。あるいは、ヒトの胃リパーゼを０． ４％ＳＤＳで沸騰させ、次に上記培養の前に０．１％ＳＤＳに稀釈した。両方の 場合、ヒトの胃リパーゼの分解生成物を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次にクマシ ブル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ　）染色で目に見えるよ・うにした。ヒ トの胃リパーゼのエンドグリコシダーゼＨを用いた分解により、最小の分子量が 約４１，０００である一群のより低分子量の分解生成物が生じた。エンドグリシ ダーゼＨによる分解により、これらの残基を含む糖タンパク質からＮに結合した 炭水化物部分が除去された。この切断により、糖が取り除がれたタンパク質に当 たる分子量の明らかな低下が見られた。この分子量の低下は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ にかけて糖が俄り除かれたタンパク質の移動度が増加することにより目で見るこ とができる。

ヒトの胃リパーゼをエンドグリコシダーゼで処理することにより、分子量が約５ ０　、０００から４１，０００へと明らかに低下することは、（重量で）酵素の 約２０％が炭水化物より成っていることを示している。

巨Σ■１ユヱ：］ヱしツ辷−と乙Ｌ ヒトの胃リパーゼのコードとなる遺伝子を、ヒトの胃組織の試料から調製したｍ ＲＮＡから作ったｃＤＮＡのクローンバンクから単離した。ヒトの胃リパーゼク ローンは、公告された欧州特許出願Ｅ　Ｐ　−Ａ　１−０１３１４１８の記載に 従って従来得られているラットの舌リパーゼのＤＮＡクローンとの相同性によっ て同定した。

（その開示内容をここに参考のために記す）。入手した詐りの幅約２ｃｍのヒト の胃壁の組織の断片を液体窒素中に保存した。この断片には、完全な粘膜、筋及 び別膜の層が含まれていた。ＲＮＡは、凍結した基部の完全な組織をグアニジン 　イソシアナート（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　１ｓｏｅｙａｎａｔｅ　）を用い て抽出することにより調製した（マニ了チス（門ａｎｉａｔｉｓ）他（１９８２ ）　“モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ！ｏｎｉｎｇ）−実 験室のマニュアル”コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ）。ポリアデ ニル化したＲＮＡをこのオリゴ−ｄＴナセルースクロマトグラフィから単離した （ハリス、Ｔｊ、Ｒ，（ｅｌ　（１９７５）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ　２ ９．２９９−３１２　）。

酸に安全なリパーゼのコードとなるｍＲＮＡ種の存在は、ノーザン・プロット分 析によって示唆された（トーツス、　Ｐ、Ｓ、　（１９８０）ＰＮＡＳ　ＵＳＡ 、７７、５２０１−５２０５＞。この技術により、ポリアデニル化した胃のＲＮ Ａは、電気泳動法により分子量に基づき分離され、ニック・トランスレーション 法により標識されたラットの舌リパーゼ遺伝子のｃ　ＤＮＡクローンを用いて調 べられた（リグビー（Ｒｉｇｂｙ　）　Ｐ、Ｗ、Ｊ、他Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 、　１１３．２３７−２５１　＞。

特にこの標識化した遺伝子を約１５００塩基の大きさのｍＲＮＡ種と雑種（ハイ ブリッド）化させた。このｍＲＮＡ種は、このようなメツセージの翻訳されない ５′と３′配列と共に見掛は上ヒトの胃リパーゼの大きさのタンパク質をコード 化することができる大きさを有している。

ｃＤＮＡは、ヒトの胃ｍＲＮＡに対して調製した。第１の鎖はポリ　（ｄＴ）プ ライミングで合成し、伸長はＡＭＶ逆転写酵素で行った（レフツェル（Ｒｅｔｚ ｅｌ）　＋　Ｅ、Ｆ、他（１９８０）バイオケミストＩＪ　１．９５１３−５１ ８　）。第２の鎖は、上述のように、ＲＮエース１１、大腸菌ＤＮＡポリメラー ゼ■及び大腸菌ＤＮＡリガーゼの作用によって合成した（ガブラ（Ｇｕｂｌｅｒ ）　＋　Ｖ、とホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ　）　＋８、　（１９８３）ジーン（ Ｇｅｎｅ）　２５．２６３−２６９　）　、　２重鎖ｃＤＮＡは、ポリ　（ｄ　 Ｔ）により、３′末端に尾を付けたくビラーコマロフ（ν１ｌｌａ　−Ｋａｍａ ｒｏｆｆ）他（１９７８）　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、　７５：３７２７）。

尾の付いたフラグメントを、切断１７、Ｐｓｔ１部位にポリ　（ｄ　Ｇ）に付い たｐ　Ｂ　Ｒ３２２にアニールして入れた。これらの、、、　ｌ　、ノ、、　’ 、’は、形質転換能力のある大腸菌ＤＨＩに形質転換した（マニアチス他、（１ ９８２）　”モレキュラークローニング−実験室のマニュアル”コールド・スプ リング・ハーバ−・ラボラトリ）。形質転換体をニトロセルロース・フィルタ上 でコロニーハイブリダイゼーションを行うことによりスクリーニングした（ハナ ハン（Ｈａｎａｈａｎ　）　＋Ｄ、とメセルソン（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ）　、　Ｍ 、　（１９８０）ジーン、１０．６３−６７）。

ハイブリダイゼーションのプローブは、ニックトランスレーション法で標識した ラット舌リパーゼのコード化領域を含むＤＮＡフラグメントであった（リグビー 、　Ｐ、Ｗ、Ｊ、他（１９７７）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

旦ふ　２３７−２５２　）。

制服エンドヌクレアーゼ切断部位を探すため推定のヒトの胃リパーゼクローンの 地図を作成した後、クローン化した断片に対して丁度３′領域にハイブリッドし た合成の一重鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド・プライマを使用してＤＮＡ配 列を行った（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）　＋　Ｆ、Ｓ、他（１９７７）　ＰＮＡ Ｓ　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７　；スミス（Ｓｍｉｔｈ　）　、　Ａ、 Ｊ、Ｉｌ、　（１９８０）　’メソソズ・イン・エンジモロジー”アカデミツク プレス６５．　５６０−５８０　’）　、ラットの舌すパーゼｃＤＮＡ配列との 配列の相同性及びｃＤＮＡクローンからの予想配列を胃吸引物から単離した自然 のヒトの胃リパーゼのＮ−末端アミノ酸配列と比較することにより、クローンは 、リパーゼをコード化するこがわかった（表１と第３図）。１つのクローンは、 胃前駆リパーゼのための全コード化配列を含み、長さ約１４５０ｂ　ｐであるこ とが明らかとなった（ｐＧＬ１７）、クローンの５′末端は、このメツセージの ５′末端ヌクレオチドの２０ヌクレオチＦ内にあることがわかった。このことは 、プライマの伸長から得られた配列によって証明された。この技術において、合 成のオリゴう−オキシリポヌクレオチド・プライマは、特にＮ−末端タンパク質 配列をコード化するヒトの胃リパーゼｍＲＮＡの領域にバイブ、ド化させた。こ のプライマをｍＲＮＡの５′末端に伸長させた後、配列を決定した。ｐＧ　Ｌ　 １７の制限エンドメクレアーゼ地図を作成した。これを第２図の線ａに示す８こ の線の下の番号は、第３図に示す塩基の番号に対応する。第２図の線すは、第３ 図ζこ２１々ずＤＮＡ配列の範囲を示す。ヒトの胃リパーゼタンパ））質の配列 の位置を第２図の線Ｃに示す。“前駆”と書かれた太線は１．ヒトの胃リパーゼ の゛前駆”又はシグナル配列の位置を示す。（第２図において、１．す暗部位の 略号は次の通りである。Ｐ＝＋１ｓＬＬ　Ｅ＝ＩｉｃｏｌｌＶ　、、Ｒ＝Ｅｃｏ ＲＩ　、、、Ａ＝　Ａｎｕｌ、　Ｂ＝Ｂａｆ　ｌ　、　Ｂｃ＝Ｂｃ、’　Ｉ　、 Ａｈ＝　ＡｈａｌＵ）　。

４１１駆ヒｌの胃すパーゼ遺伝了のコード化成分のＤＮＡ配列を第３図に示す。

Ｄ　Ｎ　／’Ｌ配列の下の番号は、塩基番号を意味する。塩基ｌは、ｐ　Ｇ　Ｌ 　１７におりるクローン化されたヒトの胃リパーゼ配列のＭ＞Ｂのヌクレオチド である。★は、３′未翻訳領域が次に続く終止二】トンＴ　Ａ　＋：”；を示ず つ塩基の直ぐ」−の文字は、得られたアミツノ配列を意１．トシ、これらにおい て一般的な１文字のアミノ酸＝１−！を用いる（１１１ち、Ａ−アラニン、Ｒ− アルギニン、Ｎ＝−アスパラギン、Ｄ＝アスパラギン酸１．Ｃ；システィン、Ｅ ＝グルタミ＝／酸、Ｑ−グルタミン、Ｇ＝ニブリシンＨ＝ヒスチジン、■＝イソ ロイシン、■７−ロイシン、Ｋ＝リジン、Ｍ＝メチオニン、Ｆ−フェニルアラニ ン、Ｐ＝ニブロリンｓ＝セゾン、Ｔ＝スレオニン、Ｗ゛−トリプトファン、Ｙ− 千ロシン、■＝バリン）。

得られたアミノ酸配列の上の下線を引いた文字は、精製したヒトの胃リパーゼか ら直接得られたＮ−末端′アミノ酸配列を意味する。直接得られたアミノ配列中 の空白は、未決定のアミノ酸を意味する。アミノ酸の−１９から−１までは推定 のシグナル配列を意味し、＋１から　３７９までは、成熟した遺伝子のアミノ酸 配列を意味する。破線の下線は、潜在的な可能性のある糖タユノバク質化配列を 意味する。ＤＮＡ配列から予想されたアミノ酸配列は、成熟したヒトの胃リパー ゼは、３７９個のアミ、ノ酸タンパク質より成ることを示している。この成熟し たタンパク質の予想分子量は、４３．１６２であり、これ１．、ｊ　Ｓ　Ｄ　Ｓ −Ｐ　Ａ、　Ｇ　Ｅにより糖を取り除いた酵素について測定した分子量と良く一 致している。ｌ）　Ｎ　Ａ配列から作られたこの成熟した酵素の全アミノ酸組成 と単離したタンパク質から得られたものとを比較して表１に示す。成熟したヒト の胃すバーセ゛には、一般的な形式がＸ　ＡｓｎＸ　Ｔｈｒ又はＳｅｒである糖 タンパク化（グリコシレージョン）のための３つの潜在的な可能性のある部位が 含まれている。ヒトの胃すバ〜ゼは、ブタの膵臓リパーゼよりも７０個のアミ５ ノ酸分短く、この酵素に対して配列の相同性又はアミノ酸組成の類似性を持って いない。しかし、ブタの膵臓リパーゼの重曹なセリン−１５２領域においてはヒ トの胃リパーゼとブタの膵臓リパーゼとの間で良好な相同性が確かに存在する。

セリンは、膵臓リパーゼの脂質への界面固定に関与しており（グイドニ（Ｇｕｉ ｔｌｏｎｉ　）　＋　：へ、他（１９８１）　、Ｒｉｏｃｈｉｍ、Ｂｔｏｐｈｙ ｓ、Ａｃｔａ。

６６０、１４８−１５０　）　、ミセルのジエチル−ｐ−ニトロフェニルホスフ ェートとワ応する（ルアード（Ｒｏｕａｒｄ）　＋　Ｍ、他（１０７８）、Ｂｉ ｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　５３０、２２７−２３５　）　、こ れは、ブタの膵臓リパーゼにおける１５２　Ｇｌｙ　−ｔｉｉｓ　−５ｅｒ　− Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ配列及びヒトの胃リパーゼにおけるＧｌｙ−旧ｓ　−１５３５ ｅｒ　Ｇｌｙの第１次アミノ酸配列の良く似た位置に存在する。

ブタの膵臓リパーゼにおけるこの重要なセリン残基に近い他の１１似点は、ヒト の胃リパーゼのＡｓｎ〜１６６にも明らかに存在している１個だけの糖タンパク 化位置（Ａｓｎ　−１６６）である。

成μｍしたヒＩの胃リパーゼは、ラットの舌リパーゼと顕著なアミノ酸配列の相 同性（約７６％）を持っている（公告された欧州特許出願Ｅ　Ｐ−Ａ　！　−０ ０１３１４１８参照）。しかし、ヒトの胃リパーゼとラットの占リパーゼのシグ ナル配列のアミノ酸配列には、碑かな相違が見られろ。シグナル配列の５Ｎ−末 端と２０−末端アミノ酸残基のみが一致している。ヒトの胃リパーゼは、ラット の舌リパーゼと比べてＣｙｓ残基が１つ少なく、また潜在的に可能性のある糖タ ンパク化部位が１つ少ない。アミノ酸配列中のＣｙｓ残基と糖タンパク化部位は 、ヒトの胃リパーゼとラントの舌リパーゼの第１次アノミ配列において実質的に 等しい位置にある。

±Ｌとノｌ易亡゛、（１１）醇　、（ｉｉｉ）組　エ　したＩ　団臣店不キニヒ ｑ買リパーゼの良且 （１）大腸菌 成熟したメチニオニンーヒト胃リパーゼ（以降単にヒトの胃リパーゼと呼ぶ）の 発現のためのプラスミドベクタを、公告欧州特許出願Ｂ　Ｐ−Ａ　Ｉ　−０１２ １３８６に記載されている、２つの複製源を持ち、温度で誘導し得るベクター系 に基づいて作成した。（その出願の開示内容はここに参考のために記載されてい る）。このプラスミドは、クローン化した遺伝子のＡｈａＩ［ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａフ ラグメントに対してＩ’ｓｔｌの重要な前駆リパーゼ遺伝子を使用して作成した 。

この遺伝子の３′末端をＢｇｌ［フラグメントに対してＡｃｅ　Ｉとして！Ｆ離 し、５′末端をＡｃｃｌフラグメントに対してＦｏｋ　Ｔとして単離した（第４ 図参照）。これに対して、１組のリンカ−を５′Ｆｏｋ　Ｉ末端に付着させた。

これらのオリゴヌクレオチドはリパーゼ遺伝子の５′末端を修１にし、ΔＴＧ開 始部位を加え、シャインーダルガーノーＡＴＧ領域におけるＢｇβ■部位を与え 、そしてクローン化してｐＣＴ５４にするためのＣ４ａｌ部位を与える（エムタ ーゲ（Ｅｍｔａｇｅ）他Ｐｒｏｃ、　！Ｊａｔ１．　Ｓｃ、ｉ、（１９８３）　 ３６７１　３６７５に記載）、ｐＣＭＬＩは、Ｃｌ１ａｌとＢｃＡ　ｒを用いて ｐＣＴ５４を分解した後、次のようにして行う３つの合成手段によって作成した 。

（１）Ｃ１２ａ　Ｉ　／Ｂｃｌ！　Ｉベクター（２）ＩＪ’　ａ　Ｉ　／　Ａｃ ｃｒ５’末端＋３）　Ａｃｃ　Ｉ　／　Ｂｇ（！　Ｕ　３　’末端これによりシ ャイン・ダルガーノーＡＴＧの距離が１４ヌクレオチドであるｐＣＭＬ　１がで きる。

プラスミドｐｃＭＬ１の制限エンドヌクレアーゼ地図を第４図に示す。ヒトの胃 リパーゼ遺伝子のｔｒρプロモータと開始の領域におけるヌクレオチド配列を下 記に示す。

Ｃ１ａｌ　ＢｑｌｌＩ ＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＴ、、 １．、、。

シャインイーグルガーノ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ・・・・・・・・配列　ヒト の胃リパーゼの構造 遺伝子 大腸菌中でヒトの胃リパーゼを発現させるために使用されるプラスミドは、ｐ　 Ｍ　Ｇ　１９７と呼ばれている。このプラスミドは２つの複製源を持つベクタで ある９ＭＧ１６５に基づいており、これは公告欧州特許出願Ｅ　Ｐ　−Ａ　Ｉ　 −０１２１３８６に記載されている。ＢａｍＨＴとＰ３ｔＴを用いてｐｃＭＩを 分解することによりｐ　Ｍ　Ｇ　１９７を作成した後、ヒトの胃リパーゼ遺伝子 を有するフラグメントを１１Ｈした。（公告欧州特許出願Ｅ　Ｐ　−Ａ　ｌ　− ０１２１３８６に記載されているｐ　Ｍ　０１６５に関連する）ｐＭＧ１７１も Ｂａｍ１ｌＩとＰｓｔｌを用いて分解した後、フラグメントを含むヒトの胃リパ ーゼ遺伝子を挿入してｐ　Ｍ　Ｇ　１９５を形成した（第５図）。このプラスミ ドを単離した後、大腸菌Ｅ１０３（Ｓ）に入れて形質転換した。

公告欧州特許出願Ｅ　Ｐ−Ａ　ｌ−０１２１３８６に記載されているように、ｐ 　Ｍ　Ｇ　１９７を含む大腸菌を１０７！の発酵容器で培養した後１、細胞を遠 心分離で採セし、そして−２０℃で保存した６Ｅ’、１０３　（Ｓ　）　／　ｐ 　Ｍ　Ｇ　１９７に存在する全部：・′バる′質についての”つ１スタ゛・′　 プロット”分析し４２、ベーネ　）（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）の韻文に従って行った くバーネ７１・、　！４．！Ｌ　（１９８１）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１１２、１９５−２０３＞　、この分析で全タンパ′ノ瞥傅ｇＳＤ　Ｓ−Ｔ　Ａ 　Ｇ　Ｅで分離した浅：、、ニトロセルロース肱・２．：移した。しｌの胃１１ バーゼを自然のヒＩ・の胃リパーゼ（こ対する。（５＋＋りＩ’ｌ−ナル抗１立 り漬を使用し７て検出した１麦、この連合体を１２′−１ュータ゛・′バク質、 八を用い゛で標識ｊ−１た（第６図）。

矢印゛で示”Ｊ−Ｘ（＋／−ンＡ）は、自然のヒトの胃リパーゼの移動位置を示 す。矢印で示すＹは、公告欧州特許出願ＩＥ　Ｐ　−Ａ　ｌ　−０１２１３８６ の記載九こ従って温Ｗ二！、とよ乙＝、ち導をｉｌつだ後、Ｅ＜１０３（二３） ’ｐＭＧ１９７に生産された新規なり二、バク質を示３−．レーンのＢ、ｌ二Ｃ は、温度による誘導の３時間と２時間の後採取した細胞から抽出し７．＝　全タ ンパク質に対応する。誘導さ１１ていない細胞につい（７ユよ、レーアＵ）Ｌ： 、、示す。コノ分析により、ＥＦ、１０３　（Ｓ）　／ｐＭＧ１９７１、よ、＄ ＸＪ：ＩＢ、　ｏＯｏというはっきりとした分子量を持って移動する明白なタニ ′バイ！質としてヒトの胃リパーゼを発現することがわかった。自然のにＦの胃 すバーセ゛のは、つきすし、た〕η子量（約５０，０００）とに１１１や、し体 のヒＩ・の胃リパーゼの分子量（約３８，０００）との相違は、大腸菌が糖タン パク化４行うことができないことに帰ずことがごきる。糖タンパク化されていな いヒトの胃Ｉｌパーゼは２．Ｑ　Ｈ−ン化された遺伝子のＩ）　Ｎ　ｔ’、配列 に基づく？ミノ酸配列から予燃されるように４３．１６２の分子量を持っている 。

大腸菌からのヒトの胃リパーゼを多少精製した後、下記のよ・うに可溶化した。

、Ｅ　１０３　（Ｓ）　／ｐ　ＭＧ１９７の１０ｇの凍結細胞のペーストを５０ ＋＋＋　１の５０＋＋＋Ｍトリス、ｐ）１８．５０ＲＩＭ　ＮａＣｆｆ１．１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ。

０．１ｍＭ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ中に再懸濁した。全ての操作は、別の指示がない限 り、４℃で行った。懸濁した細胞を１．５００　ｐｓｉで動作しているフレンチ ・プレス中を３回通過させた。破砕した細胞の懸濁液を１２．０００で５分間遠 心分離した。」−清の試料は分析のため取っておき、べ１／ノド分画（不溶性の 形態でヒトの胃リパーゼ生成物を含む）を５０ｍ旧へリス、ｐＨ８，１，０ｍＭ 　Ｅ　Ｌ）　Ｔ　Ａ　０．５％トリトン×４００中で再懸濁した。不溶性のヒト の胃リパーゼ生成物を含む再懸濁したベレ／１分両を上述したようるこ再び遠心 分離した。不溶性のヒトの胃リパーゼは、英国特許明細Ｋ　Ｇ　Ｂ　２１００７ ３７　Ｂ、英国特許出回Ｇ　Ｂ　２１９８１０Ａ及びＧ　Ｂ　２１３８００４　 Ａの記載と似た方法により尿素又はアルカリを使用して可溶化！、た。不溶性の ヒトの胃リパーゼは、約１．　ｍｇ／　ｍｌの最終的なタンパク質濃度で５０１ トリスｐ１１Ｂ、８ｈ・１尿素中室温で溶解ｔ７た６、変成物は、ｐ、＋＋　１ ０．７の炭酸／重炭酸ツートリウム緩衝溶液に対して透析を行うことにより除去 した。沈澱したタンパク質は、遠心分離により除去した。

ヒトの胃リパーゼの発現とｒｉ′Ｊ溶化のＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析の結果を第７図 に示す。矢印シ：Ｌ、発現したヒトの胃リパーゼタンパク質を示す６Ｅ　１０３ （Ｓ）／ｐＭＧ１９７からの全タンパク質をレーンのＡに示す。定９的なゲルの 測定によれば、ヒトの胃リパーゼは全大腸菌タンパク質の約８％として発現する 。レーンＢは、洗浄１．た不溶性の細胞抽出物中に存在するタンパク質の組成を 示す。

ヒトの胃リパーゼは、遠心分離により生成したペレット中に存在する不溶性のタ ンパク質の大部分を占める。レーンのＣとＤは、それぞれ透析により尿素を除去 した後に存在する不溶性と可溶性のタンパク質を示す。これにより、ヒトの胃リ パーゼは、可溶性の抽出物中に存在する大部分のタンパク質を占めることがわか る。

略同様の技術を用いて、ヒトの前駆前リパーゼ又は胃リパーゼを含む融合タンパ ク質のコードとなる遺伝子を発現させることができる。クロラムフェニコール　 アセチル　トランスフ−ラーゼ）油含タンパ・り質のコードとなる遺伝子を発現 させることができる・−ｚ　イ１ターの調製法に関する記載については、例えば 公告欧州特許出願Ｅ　Ｐ　−Ａ　ｌ−１３１３６３の開示内容を参照されたい。

（１１）酸母茸−赴状不温」９１１し±二叉■奔冴メチオニン〜ヒトの胃リパー ゼを発現させるためのプラスミドベクターは、公告欧州特許出願Ｅ　Ｐ　Ａ　２ 　００７３６５３に記載されているように、プラスミドｐＭＡ９１　Ｃ９ＭＡ３ ０３１という名前によっても知られている）に基づいて作成した。これらのベク ターに〕ま、酵母のホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータとメチオ ニンーヒｉ−胃リパーゼ遺伝子を扶むＰＧＫ遺伝子３′末端の横にある配列を含 んでいる。プラスミドｐＭＢ１（図示せず）は、前駆ヒトの胃リパーゼ遺伝子の 全部を含むＢｇＡＩＴフラグメントを挿入することにより作成した。プラスミド ｐＹＣ３（第８図）は、リパーゼ遺伝子の３′末端を含むｐＭＢｌからＡｃｅ　 Ｉフラグメンに対してＢｇｆｆ■を除去することにより作成した後、（上記した ）ｐｃＭｌから得られた遺伝子の５′末端のＡｃｃ　Ｉフラグメントに対して連 結した。これをｐ　Ｍ　Ａ　３０１３のＢｇβ■部位に挿入してｐＹＣ３を作成 した。フラグメントｒ＋Ｙｃ３をディプロイド系統のＭＤ５０とハブロイドのＭ Ｄ４０／４Ｇに入れて形式転換した後、公告欧州特許出願Ｅ　Ｐ　−Ａ　２−０ ０７３６５３に記載されているように形質転換体を窒素を主体とする培地で増殖 させた。採取した細胞は一２０℃で保存した。

ｐＹＣ３を含む酵母細胞Ｍ　Ｄ　５０の凍結スラリを５０ｍＭ　）リスｐＨ１， ５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で再懸濁した。全ての操作は、４℃で行った。

細胞は、フレンチプレス中を１　、５００ｐｓ　ｉの圧力で３回通ずことにより 破砕し、た。残りの破砕されていない細胞は、８００ｇで５分間遠心分離を行う ことにより除去した。“全抽出物”と呼ばれるこの上清は、２０，０００ｇで５ 分間遠心分離して細胞断片を除去した。

“可溶性抽出物”と呼ばれる透明な上清ば、５ＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質 の分析のため保存した。小球状となった細胞断片は再懸濁と再遠心分離を行うこ とにより上記緩衝液中で洗浄した。

洗浄した細胞断片は、等量の上記緩衝液中で再懸濁した後、試料を５ＤＳ−ＰＡ ＧＥのために取った。上記操作をプラスミドｐＹＣ３を有する酵母ＭＤ４０／４ （Ｊ［［Ｉ胞について繰り返し、そして対照としてｐＹＣ３に対する同じプラス ミドを含んでいるが、ヒトの胃リパーゼ遺伝子を持っていない酵母Ｍ　Ｄ　５０ についても繰り返した。これらの細胞からの全タンパク質抽出物の５ＤＳ−ＰＡ ＧＥによる分析結果を第９図に示す。矢印は、組換え体ヒト胃リパーゼの移動位 置を示す。レーンのＡとＢは、それぞれ対照のプラスミドを含む酵母ＭＤ４０／ ４Ｃからの洗浄した細胞断片と可溶性抽出分画を示す。ヒトの胃リパーゼに対応 するタンパク質は見られない。レーンのＣとＤは、それぞれｐｙｃ３を含む酵母 ＭＤ／４０からの断片と可溶性抽出分画を示す。同様に、レーンのＥとＦは、酵 母Ｍ　Ｄ　５０からの同じ分画を示す。組換え体のヒトの゛　胃リパーゼにとっ ての予想位置を移動するｐＹＣ３を含む両酵母ＭＤ４０／４ＣとＭ　Ｄ　５０の 断片分画中にはっきりとしたタンパク質が見られる。ゲル測定によるこのタンパ ク質の定量化により、（発酵のバッチによるが）全タンパク質の発現レベルは】 ％〜３％であることがわかった。

酵母Ｍ　Ｄ　５０／　ｐＹ　Ｃ３に存在するタンパク質について、ウェスタン・ プロット分析を行った（第１０図）。矢印の付いたＸ（レーンＡ）は、自然のヒ トの胃リパーゼの移動位置を示す。矢印の付いたＹは、ＭＤ５０／ｐＹＣａ中に 生産されたタンパク質の位置を示す（第１０図）。レーンの１３、Ｃ及びＤはそ れぞれ全タンパク質、可溶性抽出物及び細ＩＩυ断片の分画の分析結果を示す。

全抽出物及び不溶性断片の分画中に約４０．０００のはっきりとした分子量を持 って移動するヒトの胃リパーゼの顕著なバンドが見られる。実際に、ヒトの胃リ パーゼは可溶性抽出物分画には検出されなかった。レーンのＥ、Ｆ及びＧは、ｐ ＹＣ３に対する同じプラスミドを含むがヒトの胃リパーゼ遺伝子を持っていない 酵母ＭＤ５０に・ついてのそれぞれ全タンパク質、可溶性抽出物及び断片分画の 分析結果を４１す。ヒトの胃すバー＝ゼは、こ１１らの対照細胞中には検出され なかった。この分析結果により、酵はＭ　Ｄ　５０／　ｐ　Ｙ　Ｃ３はヒトの胃 リパーゼを発現するということが確かめられた。ｐ￥Ｃ３を含む酵母Ｍ　Ｄ　４ ０／　４　Ｃについてもウェスタン・フロソト分析を繰り返して行ったが、同様 の結果が得られた。再び、自然のヒトの胃リパーゼ（約５０　、０００＞と組換 え体のヒトの胃リパーゼ（約４０，０００）との間乙こ明白な分子量の参■違が 見られる。これは、酵母が酵母の細胞内で・土産されたヒトの胃リパーゼを糖タ ンパク化（グリコシし−ション）できないことに因るかもしれないｅ酵母中の脂 肪を分解することができるヒトの胃すバ＝ゼの存在は、ヒトの胃すバービ活性検 定において、全細胞抽出物と可溶性及び不溶性分画を調べることによりわかる。

Ｍ　Ｄ　５０／　Ｐ　Ｙ　Ｃ３、ＭＤ４０（４Ｃ）ｐ　Ｙ　Ｃ３及びＭ　Ｄ　５ ０の対照の可溶性ルび不溶性抽出物は、上述したよ−うに０．０５Ｍ　トリス、 １ｍＭ　ＥＤＴＡの代わりに“クエン酸−リン酸”緩衝液（５０ｍＦＩクエン酸 を用いてｐｉ４５．４とした５０１Ｉｌ？ｌリン酸ナトリウム）を用いて作るこ とができる。上述したように、２５μ２の試料を３７℃でトリオレイン基質を使 用して検定から取った。表Ｈに示すように、組換え体のヒトの胃リパーゼの活性 を自然のヒトの胃リパーゼと比較した。全抽出物と可溶性及び不溶性の分画にお いて脂肪分解活性を検出した。この活性は、ヒトの胃リパーゼ遺伝子を欠く対照 細胞には存在しないものである。全ホモジネート及びヒトの胃リパーゼの発現レ ベルが全タンパク質の約３％であるということから、酵母のＭＤ４０／４ＣとＭ 　Ｄ　５０において生産されるヒトの胃リパーゼはぞれぞれ５％と１８％が酵素 的に活性であるということが算定できる。

ＭＤ４０／　４Ｃ／　ｐＹＣ３１４、９６７８，２５０８，７９２ＭＤ５０／　 ｐＹＣ３２７，４４５１４，３９４１２，０４０対照、？１Ｄ５０　２．６７７ 　１，７６１　１．３７４緩衝液のブランク　３．６３０　−　−青ｃ凹＝、　 １４ＣＦリオレインからの１４オレイン酸の生産量、反応条件は本明細書の記載 通り、１μｇの自然のヒトの胃リパーゼは、この検定において、７，９９５ｃｐ ｍに相当する。

略同様の技術を用いて、ヒトの前駆前リパーゼ又は胃リパーゼを含む融合タンパ ク質のコードとなる遺伝子の発現を実現させることができる。

（ｉｉｉ）組鳳澗夫支−そ難物ｊｌ証 ヒトの前駆前リパーゼを発現させるためのプラスミドベクタは、バブラキス、Ｇ 、Ｎ、　（Ｐａｖｌａｋｉｓ、Ｇ、Ｎ、　）とへイマ、　Ｄ、Ｈ，の韻文のベク ターに基づいて作成することができる（バブラキス、　Ｇ、Ｎ、とヘイマ、　Ｄ 、Ｉｌ、　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０ ゜３９７−４０１　）　、これらのベクターはメタロチオニン遺伝子のプロモー タを含み、前駆ヒトの胃リパーゼを発現する。この系で生産された酵素は、細胞 膜を通して分泌され、と述したように検定し、そして組織培養の培地から精製す る。組織培養した動物細胞は、成熟した胃リパーゼを生産するために必要な生産 機能を有することができる。

」二連した本発明は、純粋に例示として記載したものであり、本発明の趣旨を逸 脱しない範囲で細かな変更を加えることができることが当然のことながら理解さ れよう。

ＦＩＧ、　１ ｂ）□ ＦＩＧ、　２ ｃＭＬ１ 国際調を報告 Ｉｎ＋ａｍｉｎｅｎｓｌＡｗｋｍＬｍＮＬＰＣＴ／ＧＢ８５１００３６４

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．リパーゼ欠乏症の治療において使用するための胃リパーゼタンパク質。
2. ２．胃リパーゼタンパク質は、ヒトの胃リパーゼタンパク質である請求の範囲第 １項記載の胃リパーゼタンパク質。
3. ３．メチオニン−胃リパーゼタンパク質のコードとなる遺伝子を含むベクタを用 いて形質転換した宿主生物中でメチオニンー胃リパーゼタンパク質を生産するこ とより成る、メチオニンー胃リパーゼタンパク質の生産方法。
4. ４．前駆体タンパク質のコードとなる遺伝子を含むベクターを用いて形質転換し た宿主生物中で胃リパーゼ前駆体タンパク質を生産した後、該前駆体タンパク質 を切断して胃リパーゼタンパク質を生産することより成る胃リパーゼタンパク質 の生産方法。
5. ５．上記胃リパーゼ前駆体タンパク質は前駆胃リパーゼタンパク質であり、上記 宿主生物は上記前駆胃リパーゼタンパク質を切断して青リパーゼタンパク質を生 産することができる宿主生物である、請求の範囲第４項記載の胃リパーゼタンパ ク質の生産方法。
6. ６．上記宿主生物は、組織培養中の哺乳類細胞である、請求の範囲第５項記載の 胃リパーゼタンパク質の生産方法。
7. ７．上記胃リパーゼ前駆体タンパク質は、異種構造のタンパク質と胃リパーゼタ ンパク質より成る、請求の範囲第４項記載の胃リパーゼタンパク質の生産方法。
8. ８．前駆胃リパーゼタンパク質。
9. ９．メチオニン−胃リパーゼタンパク質。
10. １０．胃リパーゼタンパク質と異種構造のタンパク質より成る融合タンパク質。
11. １１．胃リパーゼタンパク質の少なくともアミノ酸配列より成るタンパク質のコ ードとなる遺伝子。
12. １２．請求の範囲第１項、第２項、第８項、第９項及び第１０項のいずれか１項 に基づくタンパク質のコードとなる請求の範囲第１１項記載の遺伝子。
13. １３．請求の範囲第１１項又は第１２項に基づく遺伝子を含むベクター。
14. １４．請求の範囲第１３項に基づくベクターで形質転換した宿主生物。
15. １５．胃リパーゼタンパク質の抗原決定基に対する特異性を持っている抗体。
16. １６．胃リパーゼタンパク質と医薬品として使用可能な賦形剤より成る医薬組成 物。
17. １７．上記胃リパーゼタンパク質は、請求の範囲第４項又は第５項の生産方法に より生産された請求の範囲第２項に基づく胃リパーゼタンパク質である、請求の 範囲第１６項に基づく医薬組成物。
18. １８．単位投薬の形態である、請求の範囲第１６項又は第１７項に基づく医薬組 成物。
19. １９．液状の形態である、請求の範囲第１６項又は第１７項記載に基づく医薬組 成物。
20. ２０．プラスミドｐＧＬ１７。
21. ２１．プラスミドｐＭＬ１。
22. ２２．プラスミドｐＭＧ１９７。