JPH03505677A

JPH03505677A - ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードするｄｎａ配列を含むプラスミド

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Publication number: JPH03505677A
Application number: JP2506833A
Authority: JP
Inventors: ルイス　マーティン　ケンダル; シュルツ　ジョン　ウィリアム
Original assignee: プロメガコーポレイション
Priority date: 1989-04-24
Filing date: 1990-04-18
Publication date: 1991-12-12
Anticipated expiration: 2015-02-14
Also published as: EP0422217A4; DK0422217T3; ATE162853T1; JP3009458B2; EP0422217B1; WO1990012881A1; AU5537790A; JP3366596B2; DE69031996T2; AU646803B2; DE69031996D1; JP2000078992A; ES2111537T3; EP0422217A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ａ）宿主細胞、ｂ）プロモーター、およびｃ＞ｙプロモーターの制御下にあるヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードする外来遺伝子配列、以上ａ）〜Ｃ）を含む細胞。

１０、前記外来遺伝子がｃＤＮＡ配列である請求の範囲９記載の宿主細胞。

１１、前記宿主細胞が大腸菌およびその誘導体からなる群から選ばれる請求の範囲９記載の組換え宿主細胞。

１２、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードする外来遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡｔＪｉ。

１３６前記プラスミドがｐＢＲ３２２、ｐＡＲＣ７、ｐＡｓ、ｐａｃ１２ＢＩ、ｐＧＰＤ−２、ｐＵＣおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる請求の範囲１２記載のプラスミド鎖。

１４、クローン化した活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを得る方法であって、ａ）ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを含むヒトの胎盤サンプルを得、ｂ）見かけ上物−になるまでヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを精製し、Ｃ）さらに工程ｂ）の産物を濃度勾配溶出吸着カラムにがけてヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターから混合物を除去し、ｄ）ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターに対する抗体を作製し、ｅ）工程ｄ）の抗体を用いてヒト胎盤組織のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、ｆ）工程ｅ）のライブラリーからヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターの遺伝子を単離し、ｇ）プラスミド中にヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターヲコードする遺伝子をサブクローニングし、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターからなるクローン化遺伝子産物が発現されるようなヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター／プラスミド構築物を作製し、かつｈ）工程ｇ）のプラスミド構築物を増殖し得る宿主細胞中に該プラスミド構築物を導入しヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを生産する、上記ａ）〜ｈ）の工程を含む方法。

１５、請求の範囲１４記載の方法で調製したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターの可溶化方法および再生方法であって、ａ）請求の範囲１４記載の不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを単離し、ｂ）工程ａ）の不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを可溶化し、かつＣ）可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを希釈することによりヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを活性化する、上記ａ）〜ｅ）の工程を含む方法。

１６、請求の範囲１５記載の方法で、工程ａ）の単離プロセスに、ａ）バッファ溶液中不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターの産生を誘導した細胞を懸濁し、ｂ）細胞溶解によりその細胞膜を破壊し、Ｃ）工程ｂ）の溶液からヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターのベレットを遠心により得、がっｄ）遠心したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターベレットから上清をデカンテーションする、上記ａ）〜ｄ〕の工程を含む方法。

１７、請求の範囲１６記載の方法で、十分量のリゾチームおよびＳＤＳを工程ａ）のサスペンションに添加し、遠心を約４℃、約１７，０００Ｘｇで行う方法。

１８、請求の範囲１５記載の方法で、工程ｂ）の可溶化プロセスが不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをバッファ溶液およびその溶液中でポリペプチド鎖を分離し得る化学試剤と合せることを含む方法。

１９、前記バッファが５０＋＊ＭトリスーＨＣ／、５ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ　　ＤＴＴを含み、かつそのｐＨが約７．５である請求の範囲１８記載の方法。

２０、前記化学試剤が約４Ｍ程度の濃度の尿素である請求の範囲１８記載の方法。

２１、請求の範囲１５記載の方法で、工程Ｃ）の活性化プロセスが可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをバッファ溶液で希釈し、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターが活性状態に再生するのに十分な時間維持することを含む方法。

２２６前記バツフア溶液が５０ｍＭトリス−ＭＣＩ、　５＋＊Ｍ　　ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ　　ＤＴＴを含み、かつそのｐＨが約７．５である請求の範囲２１記載の方法。

２３、前記希釈を１部の尿素に対し少なくとも２０部のバッファの１　　割合で行う請求の範囲２１記載の方法。

２４、請求の範囲１８記載の方法で、さらに可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター溶液を遠心して不溶性物質を除去することを含む方法。

２５、前記可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを約１０℃から２５℃の温度範囲で希釈する請求の範囲２１記載の方法。

２６、前記バッファ溶液のｐＨが約６．５と約８．５の間にあり、かつさらに０．５ｍＭ程度のＤＴＴを含んでいる請求の範囲２１記載の方法。

２７、前記バッファ溶液が水活性剤を含む請求の範囲２】記載の方法。

２８、前記水活性剤がスクロースおよびグリセリンからなる群から選ばれる請求の範囲２７記載の方法。

２９．１情求の＠１川２ｊ記載の可溶化および再生したヒト胎盤リボヌクレアーゼの精製方法であって、ａ）請求の範囲２１の再生ヒト胎ａｌＪボヌクレアーゼインヒビターを吸着カラムに導入し、がっ１））吸着物質に結合した？−；　性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを溶出する、上記ａ）および【））の工程を含む方法。

３０、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードする１、　（ｉ　ｋｂ以下のＤＮＡ配列。

３１、第３−３部図に示したヌクレオチド配列を有するヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをフードするＤＮＡ配列。

３２、実質的に純粋な組換えヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターで以下の性質：ａ）分子量：５１．（１００ダルトン、およびｂ）阻害型：非競合的を有するもの。

１　：（、不活性型のヒト胎盤リボヌクレーｒ−ゼインヒビターを中部する方法であって、ａ）バッファ溶液に不活性胎盤リボヌクレアーゼインヒビターの産生を誘導した細胞を懸濁し、ｂ）細胞溶解によりその細胞膜を破壊し、Ｃ）ステップ！））の溶液からヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターのベレットを遠心により得、かつ（１）遠心したヒトＩＭＦ　ｍリボヌクレアーゼインヒビターのベレットから上清をデカンテーションにより除去する、１記ａ）〜ｂ）の工程を含む方法。

３４、請求の範囲３３記載の方法で、■程ａ）のサスペンションに十分量のりゾチームおよびＳＤＳを加えて細胞膜を破壊し、かつ約４℃、約Ｉ７．ＯＯＯＸｇで遠心を行う方法。

３５゜不活性型のヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを可溶化、　　する方法であって、ａ）原料から不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを単離し、かつｂ）不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをバッファ溶液およびその溶液内でポリペプチド鎖を分離し得る化学試剤を合せる１、上記ａ）およびｂ）の工程を含む方法。

３６、前記バッファが５０ｍＭトリス−Ｈｃ７！、５ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ　　ＤＴＴを含み、かつそのｐＨ４ｔｔが約７．５である請求の範囲３５記載の方法や３７、前記化学試剤が約４Ｍ程度の濃度の尿素である請求の範囲３５記載の方法。

３日、不活性型のヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを活性化する方法で、単離し、かつ可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをバッファで希釈し、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターが活性状態に再生するのに十分な時間維持することを含む方法。

３９、前記ハフ　７７溶液が５０部Ｍ）’ＪスーＨＣｊ！、５ｍＭ　　Ｆ、ＤＴＡおよび０．５ａ＋Ｍ　　ＤＴＴを含み、かつそのｐｉｆ値が約７．５である請求の範囲３８記載の方法。

４０、前記希釈が１部の尿素に対し、少なくとも２０部のバッファの割合いで行なわれる請求の範囲３８記載の方法。

４１、請求の範囲３８記載の方法で、さらに可溶化したヒト胎盤すボヌクレアーゼインヒビターを遠心し、不溶性物質を除去することを含む方法。

４２、前記可溶化ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを約１０’Ｃから２５ ℃の温度範囲で希釈する請求の範囲３８記載の方法。

４３、前記バッファ溶液のｐＨが約６．５と約８．５の間にありかっ、さらに０．５１１ＩＭ程度のＤＴＴを含む請求の範囲３８記載の方法。

４４、前記バッファ溶液が水活性剤を含む請求の範囲３８記載の方法。

４５、前記水活性剤がスクロースおよびグリセリンからなる群から選ばれる請求の範囲４４記載の方法。

浄書（内容に変更なし）明細書組換えヒト胎盤性リボヌクレアーゼインヒビターおよびその製造方法Ｒ■Ω背員１、技術分野本発明は組換えＤＮＡ技術に関する。特に組換えヒト胎盤性リボヌクレアーゼインヒビターをコードするｃＤＮＡ遺伝子配列、この遺伝子を含むベクターおよび該ｃＤＮＡ遺伝子を含む宿主の作成に関する。

２、背景技術組換えＤＮＡ技術の発展を通して基本的にどの生物由来のＤＮＡ配列も異１１宿主において増殖するためのプラスミドまたはウィルスベクターに藺草にクローン化できるようになった。この形状にして！ｊｒ　Ｄ　Ｎ　Ａの配列、構造、コード容量またはその他の性質を研究し得る。またこれはサンプル中の相補配列の検出、修正型の遺伝子産物の生成、新しい生物への挿入による生物機能の調節など種々の用途に使用し得る。

組換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）技術の出現は抗体プローブを用いた相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）のコード配列の単離も可能にした。ヤング（Ｙｏｕｎｇ）　、Ｒ，Ａ、およびＲ，Ｗ、デービス（Ｄａｖｉｓ）　、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ−Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、８０．１１９４−１１９８　（１９８３）。

このシステムはどの生物のＤＮＡ由来のポリペプチド上の抗原決定基（エピトープ）でも最も良（検出し得る特性を有する。このシステムを用いてゲノムまたはｃＤＮＡ配列をうまく単離するにばｃＤＮＡライブラリーおよび適当な性質をもつ抗体プローブの両方が必要である。ミエレンドルフ（Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ）、ロノイート（Ｒｏｂｅｒｔ）　Ｃ、等、１抗体による〔ラムダ）ｇｔｌｌライブラリーのスクリーニングによる遺伝子の単＊’分子クローニング技術ガイド（Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　　、ユ」じシ４５８−４６９　（１９８７）。この技術を使用して特定のたんばく譬をコードする遺伝子を単離し、これに対する抗体を作る。しかしこの技術を用いた遺伝子の単離は決して保証されない、たとえば求められている構築物が宿主細胞、一般には大腸菌を殺してしまうことが分る場合がある。また特に大腸菌内で合成されるときたんばく質に炭水化物が付加している場合、主に目的たんばく質の炭水化物部分に対する抗体が生成することによりその遺伝子の単離が困難になる場合もある。このような場合、この抗体は検出に使用できない。さらに複雑なことにはイムノスクリーニングフィルター上の弱い陽性体の出現がある。この弱陽性体は免疫たんぽ（質請製物中の混入物に対する抗体により認識されるたんばく質である。この弱陽性体は目的のたんばく質と免疫原性を共有する別のたんばく質であることもある。

目的たんばく質がクローン化されたという確信は大腸菌内で合成された組換えたんばく質の活性に依存するしかしこれは多くの真核性たんばく質が大腸菌中では不正な折りたたみ型、不溶型および不活性型として合成されることから不可能なことがよくある。

ヘス（Ｈｏｅｓｓ）　、　Ａ、等、“イオン交換樹脂を用いた全細菌溶菌物からの可溶性で生物学的活性のある組換えたんばく質の回収”、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６．　１２１４−１２１７　（１９８８）。

不活性不溶性たんばく質は可溶化され、かつ活性な形に再生され得る場合がある。しかし活性型たんばく質の効率的回収に必要な条件の決定には再生プロセスに影響し得る多くのパラメーターを至適化する実験が必要である。マーストン（Ｍａｒｓｔｏｎ）　、　Ｆ、Ａ、Ｏ。

“大腸菌内で発現される真核性ポリペプチドの精製”、ＤＮＡクローニング、第ｍ巻、実際的方法、第４章、Ｄ、　Ｍ、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）編、ＩＲＬプレス版、１９８７およびここに引用されている参考文献参照。このように特定のたんばく質をコードするクローン化遺伝子のテストは実験を始めるまでは予測できない多くの因子に依存する。

一般にｃＤＮ八クワクローンなわちたんばく質に対するＲＮＡの情報に相当する二本鎖ＤＮＡの単離は第１に目的たんばく質の十分な精製およびウサギのような適当な動物での該たんばく質に対する抗体の発現に関すると考えられている。次のステップはその抗体を免疫プローブとして使用しそのようなたんばく質が発現されている組織のｃＤＮΔライブラリーをスクリーニングすることである。ｃＤＮＡライブラリーは通常バクテリオファージラムダベクターで構築され、特に抗体プローブがスクリーニングに使用可能な時はバクテリオファージベクターラムダｇｔｌｌで構築される。これはラムダｇｉｌｌが発現ベクターであるためで、融合たんばく質が大腸菌ベータガラクトシダーゼ、天然の大腸菌酵素およびｃｌ）ＮＡ挿入物由来のたんばく質の間で形成されることを意味する。ジェンドリサク（Ｊｅｎｄｒｉｓａｋ）　、　　シェリー（Ｊｅｒｒｙ）　。

等（＋９８７）　　“〔ラムダＩｇｔｌＯおよび〔ラムダ）ｇｌｌへのｃＤＮＡのクローニング”、「分子クローニング技術ガイド」（Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｌｅｃｌ＋ｎ１ｑｕｅｓ）　、　　１５２．　３５９−３７１　　＜１９８７）。Ｉ？ＮＡのＤＮＡコピー型として存在する目的たんばく質の遺伝子もラムダｇｉｌｌ中大腸菌プロモーターのコントｎ−ル下に存在する。

目的たんばく質をコードする組換えバクテリオファージを大腸菌に感染したとき、いくらかの組換え融合たんばく質が産生され、そのバクテリオファージのプラーク中細胞溶解により細胞から放出される。このたんばく質をニトロセルロースフィルターに取り上げ、目的たんばく質に対する抗体でそのたんばく質を検出する。

このスクリーニング操作を外来遺伝子をもつ均一なファージプラークが得られるまで反復する。それがらこの遺伝子をゲノム中のＤＮＡとは独立に複製し得る小さな環状ＤＮＡであるプラスミドにサブクローニングし発現させる。

この方法をヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（ＰＲＩ）に応用した。ブランクバーン（’Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）　、　　ビータ−（Ｐｅｔｅｒ）　。

等、“ヒト胎盤由来のりボヌクレアーゼインヒビターゝ、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　　２５２／　１６．　５９０４−５９］０　　（１９７７）、ブランクバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）等は可溶性ＰＲＩの調製法を公開した。ここではイオン交換およびアフィニティークロマトグラフィーを組合せて４０００倍に精製された。

ＰＲＩは分子量約５０．０００の酸性たんばく質であることが分った。

天然のＰＲＩはＲＮＡの分解を触媒する酵素リボヌクレアーゼ（ＲＮａ５ｅ）を特異的に阻害するヒト胎盤から単離されるたんばく質である。それは巾広いＲＮａ５ｅにしっかりと結合することにより機能し、ＲＮＡの保護に強いＲＮａｓｅ阻害が必要とされる場所で非常に有効である。ＰＲＩは研究での応用やその他の用途に非常に期待されるたんばく質である。このたんばく質の生理学的役割はまた明確ではないが最近のデータはこのたんばく質の生体内での役割は血管発育の調節であるらしいことを示している。シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）　、　　ロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）およびパート（Ｂｅｒｔ）　Ｌ　、バリー（νａｌｌｅｅ）、　　“ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターはアンギオゲニンのアンギオゲニン活性およびリボヌクレアーゼ活性の両方を阻害する’Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　８４，２２３８−２２４１　　（１９８７）、シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）およびバリー（Ｖａ−１１ｅｅ）　ハＰ　ＲＩとアンギオゲニンの関係を明らかにした。彼等の実験結果はＰＲＩおよび関連するインヒビターがＨＴ−２９ヒト：アデノカルシノーマ細胞由来の血管誘導たんばく質アンギオゲニンの生体内調節に関与していることを示している。ヒトＰＲＴはアンギオゲニンの生物学的および酵素活性の両方を阻害することが分った。したがってアンギオゲニン／ＰＲＩの相互作用が機能的に有意であることが確認された。腫瘍転移、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）およびリューマチ関節炎を含む多くの病気で起こる病理学的血管形成状態を作る上でのアンギオゲニンの関与のためＰＲＩとの強い相互作用およびＰＲＩによるアンギオゲニンの阻害は潜在的にこれらの病気を治療する有効な方法となり得るであろう。したがってＰＲＩは重要な機械学的、生理学的、医薬的および、または治療に適した特性を有している。またこのたんばく質の別の機能も発見されてくるであろう。

動物における該たんばく質ＰＲＩの役割を研究するためにはヒト胎盤源由来の調製物中に存在する不純物を含まない純粋なＰＲＩを必要とする。これらの不純物は哺乳類たんばく質、おそらくブリオン（ｐｒｉｏｎｓ）および哺乳類ＤＮＡであり、またその一部はＨＩＶおよび肝炎ウィルスなどウィルス由来のものである。残念なことに自然界から十分量の精製たんばく質を抽出するには比較的に高いコストがかかる。したがって基本的に不純物を含まない大量で廉価なヒ）ＰＲｌ源が必要である。

光里■旦！本発明に従うと不純物を含まないヒトＰＲＩのクローン化活性遺伝子産物を有用量得ることができる。この操作にはヒトＰＲＩサンプルから開始するヒ）ＰＲＩをコードする天然遺伝子の単離、クローン化遺伝子に関するＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ヒ）ＰＲＩプラスミド構築物の形成、宿主細胞へのプラスミド構築物の導入および細胞溶解と遠心によるヒトＰＲＩたんばく質の単離のステップを含む。

また本発明は単離したＰＲＩの精製、可溶化および再生法にも関しており、これらには上述の方法で得た粗ＰＲＩの遠心によるヒ）ＰＲＩの精製、化学試薬によるヒトＰＲＨの可溶化および可溶化ＰＲＩと十分量のバンファとの混合によるヒトＰＲ■の再生が含まれる。

また本発明にはヒ）ＰＲＩをコードする挿入ＤＮＡ遺伝子配列を含むベクター、ヒトＰＲＩをコードする挿入ＤＮＡ遺伝子配列を含むベクターに適合しこれを含む宿主、および分子量約５１，０００ダルトンの実質的に純粋な組換えヒ）ＰＲｌたんばく質が含まれる。このベクターにはたとえばヒ）ＰＲＩをコードする外来遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡ鎖が含まれる。

さらに本発明には宿主細胞、プロモーター、および該プロモーターのコントロール下にあるヒトＰＲＩをコードする外来遺伝子配列を含むヒ）ＰＲＩを発現し得る組換え宿主細胞が含まれる。

さらに本発明に従かい組換えヒトＰＲＩをコードする遺伝子配列が決定された。

さらに本発明の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明および図式から明らかとなるであろう。

凹皿■Ｈ巣ｆｋ所第１図はプラスミドｐＧＥＭ＠−７Ｚｆ　（＋）の部分的制限部位および機能マツプを示している。

第２図は挿入したＰＲＩコード遺伝子配列を有するブラスミＶｐＧＥＭ＠−７Ｚｆ　　（＋）の部分的制限部位および機能マツプを示している。

第３図〜第３Ｃ図はヒトＰＲＩをコードするクローン化遺伝子のヌクレオチド配列を示している。

第４図は挿入したＰＲＩをコードする遺伝子配列を有し発現するよう作成されたｐＢＲ３２２プラスミドの部分的制限部位および機能マツプを示している。

主夙■毘旦呈に所本発明はヒ）−ＰＲＩをコードする遺伝子を得る方法、該遺伝子産物の発現方法および組換えヒ）ＰＲＩの精製および再生方法に関する。ＰＲＩはＰＲＩたんばく質をコードする遺伝子を含むプラスミドを有する宿主細胞から得られる。またヒトＰＲＩの遺伝子のＤＮＡ配列も示されている。

本発明の重要な特徴には不活性組換えＰＲＩＯ単離、組換えＰＲＩの可溶化および可溶化組換えＰＲＩの活性化が含まれる。

宿主細胞に組換えＰＲＩをコードする遺伝子を導入するのに種々のベクターを使用し得る。使用するベクターにはｐＧＥＭ＠−７Ｚｆ　　（＋）　、ｐＢＲ３２２、ＰＡ３、ｐＢｃｌ　２Ｂ１、ｐＧＰＤ−２およびこれらの誘導体などの種々のプラスミドおよびラムダｇｔｌｌ、Ｔ７およびこれらの誘導体などのバタテリオファージが含まれる。

典型的宿主細胞には大腸菌などの原核生物およびイーストなどの真核生物の両方が含まれる。ベクターおよびそのプロモーターのコントロール下のＰＲＩをコードする外来遺伝子配列と合せた宿主細胞はヒトＰＲＩを発現し得る組換え宿主細胞を形成する。

組換ＰＲＩはいくつかの性質で特徴づけられる。

ａ）分子量：ｓｌ、ｏｏｏダルトンｂ）阻害型：非競合的さらに本発明の組換えＰＲＩはいくつがの特徴で天然のＰｔと区別される。たとえば天然のＰＲＩとは異なり組換えＰＲＩのＮ末端アミノ酸は特定される。さらに天然のＰＲＩとは異なり組換えＰＲＩは阻害を受けずかつアセチル化されることもない。さらに組換えＰＲＩをコードする遺伝子には哺乳類ＤＮＡ、プリオンおよびＨＩＶなどの潜在的に有害な物質を含まない。

不活性組換えＰＲＩは宿主細胞中封入体として存在する。一般的に封入体は密に詰った顆粒状たんばく賞である。宿主細胞からＰＲＩを単離するためその細胞膜を破壊しなければならない。いくつかの細胞溶解技術が使用し得るが好ましい方法には適当量のりゾチームの使用とそれにつづく遠心およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）による二次処理が含まれる。この方法で溶液として約０．１％の可溶性活性ＰＲＩと９９，９％の不溶性不活性ＰＲＩが生ずる。不溶性たんばく質は遠心により粗不活性たんばく質として除去する。このたんばく質はさらにバッファサスペンション／遠心法で精製する。

不活性ＰＲＴたんばく質を単離精製した後これを可溶化、すなわち溶液に入れた。可溶化はまず好ましくは溶液中でポリヌクレオチド鎖を互いに分離させるような化学試薬を含むバッファ液中で開始する。有用な化学試薬には尿素、塩酸グアニジンおよびＳＤＳが含まれるが尿が好ましい。使用前、この尿素溶液は遠心して望ましくない細胞分解物を除去することが好ましい、この可溶化ステップは比較的短かい時間、すなわちせいぜい３０分間で行うべきである。不活性ＰＲＩと化学試薬を合せる時間と活性ＰＲＩの最終収量の間には逆比例関係があることが分った。

活性化ステップにはＰＲＩを含む溶液をバッファ溶液で希釈し活性状態を再生するのに十分な時間維持することが含まれる。活性化状態にはいくつかの因子が重要である。たとえば希釈ステップは比較的素通く、すなわち２分以内、好ましくは３０秒以内で行うべきである。このバッファ溶液のｐｉは約６．５〜約８．５の範囲内でなければならず約７．５であることが好ましい。またバッファ溶、液にはグリセリンまたはスクロースのような活性剤を含めることが有効である。バッファ溶液中に十分量の活性剤を存在させると１）Ｒ１たんばく質再生能を増加させ得ることが発見された。また約１ｏｏｓのバッファ溶液に対してＰＲＩ溶液約１部の希釈率力月月（１再生を助ける上で最適であることが分った。

溶液希釈間約１０℃〜２５℃の温度に少なくとも８時間、好ましくは８〜１８時間静置しなければならない。この条件下でＩ＋旧たんばく質が再生されＩ’Ｒ１分子の約７％が活性となる。

以下の実施例はヒトＰＲ■をコードするクローン化遺伝子の生成法および活性組換えヒトＰＲＩの生成法の説明のために示されヒ）　Ｐ　ＲＩの遺伝子を含むラムダｇＬｌｌクローンの単離ヒｌ−Ｐ　ＲＩの遺伝子をクローン化する前に実質的に純粋な天然のヒ）ＰＲＩたんばく質を入手しなければならない。このヒトＰ　ＲＩたんばく質は精製法の説明のため参考として本明細書で引用しているブラックバーン（旧ａｃｋｂｕｒｎ）等（上述）の方法に従って調製する。簡単に云うとヒト胎盤からの可溶性リボヌクレアーゼインヒビターはブラックバーン（旧ａｃｋｂｕｒｎ）等（上述）により示されたイオン交換およびアフィニティークロマトグラフィーの組合せにより４．０００倍に精製し得る。

天然源からのＩ’ＲＩたんばく質を、ブラックバーンら（上述）に記載の方法により見掛は上向−性を示すまで精製した。このたんばく質はさらにＤ　Ｅ　Ａ　ＥセファロースＣＬ−（ｉｒ３への結合と勾配溶出により精製され、ゲル分析では明確に現れない機能性混入物が除去される。

実験動物のニューシーラント白ウサギを精製ＰＲＩたんばく質１ｍｇで免疫化し、つづいて二次免疫化を行った後１０週間飼育した。バタテリオファージラムダｇｔｌｌ中のヒト胎盤の市１１ＪｃＤＮＡライブラリー（クロンチク社、パロアルト、カリホルニア）をプロトプロットイムノスクリーニングマニュアル（プロメガ社、１９８７）　　（参考として本明細書で引用している）にリストしである方法に従ってスクリーニングした。簡単に云うとこのライブラリーをプレート当り５０，０００プラークの密度で大腸菌Ｙ］、０９０（ｒマイナス）採土にブレーティングし、その１０枚のプレート計５００，０００個のプラークをスクリーニングした。強い陽性を示すプラークを同定した。

このプレートに予めイソプロピル−ベーターＤ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＩＧ）に浸したニトロセルロースフィルターを乗せた。フィルターへのたんばく質の吸着につづいてそのフィルターを持ち上げ、フィルター上のたんばく質結合部位の残りを１％ｖ　／　ｖウシ血清アルブミンを含むバッファ中でインキュベーションすることによりブロックした。次にこのフィルターをウサギの抗体のバッファによる１０００倍希釈物に浸し、約３０分間室温で緩やかに振盪した。このフィルターをバッファで３回洗浄し市販のヤギ抗つサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体（プロメガ社）の１ニア５００希釈物に浸した。この“二次抗体 ”はフィルター上のＰＲＩ融合たんばく質に結合した一次抗体の存在を検出する。二次抗体存在下での室温３０分間のインキュベーションの後、フィルターをバッファで３回洗浄した。アルカリホスファターゼの基質溶液を加え発色させた０強い陽性を示すプラーク１個が５０，０００個のプラークのスクリーニングから観測された。

強い陽性のプラークを特定のファージが純粋となるまでプラークの切り出しとブレーティングを行うことにより均一となるまで精製した。

推定上のＰＲＩ遺伝子をもつ組換えラムダファージ由来のＯＮ八を市販のファージアブソーベント（ラムダソーブ、プロメガ社）を用いた免疫沈殿法により精製した。ファージＤＮＡの側限分析は単一の１．６キロベース（ｋｂ）挿入物の存在を示した。この挿入物は酵素ＥｃｏＲＩによる消化でファージＤＮＡから除去し肖た。

ＰＲＩたんばく質はそれをコードするのに１．４　ｂｐの遺伝子を必要とするのでこの挿入物は全ＰＲｆｉｌ！Ｉ伝子を担うのに適した大きさである。一般に真核生物のメツセンジャーＲＮΔはたんばく質コード配列に必要な大きさよりも長いが、これは５′非翻訳領域、３′非翻訳領域およびボＩＪ　Ａ領域により増加していることによる。

実施例１でＰＲＩ遺伝子を単一のＥｃｏＲＩフラグメントとしてラムダｇ（１１から取り出した。それゆえこのフラグメントを直接プラスミドｐＧＥＭ■−７２Ｆ（＋）（プロメガ社）にザブクローニングすることにした。第１図にはプラスミドｐＧＥＭ＠−’ｉｚｒ＜＋＞を示した。このフラグメントをｐ　Ｇ　ＥＭ＠ −７Ｚｒ（＋）プラスミドにザブクローニングすることにより、この１１１人物の正しい読み枠の発現ができた。

ｐＧＥＭ■−’ｔｚｒ＜＋＞プラスミドのＥｃｏＲ１部位における読み枠はバクテリオファージラムダｇｉｌｌのＥｃｏＲＩａＫ位のものき同じである。したがって、もしｃＤＮＡのコード配列がラムダｇ　１．　Ｉ　１で発現されるならばｐＧＥＭ＠−７２ｒ　（＋）プラスミド中でも発現されるであろう。

このフラグメントを正しい方向でベクター中に挿入したとき、このプラスミド上のプロモーター、すなわちｌａｃプロモーターはＰＲＩ挿入物の発現を誘導する。ＰＲＩたんばく質に付いているのはベータガラクトシダーゼの最初のアミノ酸敗残基、ｐｃｉ：ｈ＠−７２ｆ（＋）プラスミド中の多重クローニング領域およびＰＲＩたんばく質のＡＴＧの前にある挿入物中の５′非コード領域によってコードされる余分のアミノ酸である。

ＥｃｏＲＩ　　ＰＲＩ挿入物をもつバタテリオファージラムダｇｔｌｌをＥｃｏＲＩで消化し、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、（分子クローニング、ラボラトリ−マニュアル、（１９８２）、コールドスプリングハーバ−、ラボラトリ −プレス版、コールドスプリングハーバ−、ニエーヨーク）の標準クローニング法に従いｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　＠−７Ｚｆ（＋）プラスミドにサブクローニングした。この組換えプラスミドの地回として第２図を示す。

実施斑主ＧＥＭ＠−７Ｚｆ　（＋）７ラスミＦ　　（７）ＰＲＩ　　　　□）遣１ｐＧＥＭ＠−７２ｆ　　（＋）プラスミドに移したとき、この挿入物は発現の読み枠の状態にある。すなわちこのプラスミドのＥｃｏＲ１部位における発現読み枠はラムダｇｔｌｌ中のＥｃｏＲＩ部位の発現読み枠と同じである。それゆえ、このＰＲＩ融合たんばく質は直接大腸菌中で産生され得る。ｐＧＥＭ■−７Ｚｆ（＋）プラスミドのｌａｃプロモーターの誘導による発現の誘導につづいて約６０，０００ダルトンの見かけの分子量をもつ融合たんばく質をプローブとして天然のＰＲＩに対するウサギ−次抗体を用いたウェスタンプロット分析（トービン（Ｔｏｉｖｂｉｎ）、　　Ｈ，等、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７６、　４３５０　（１９７９）　）により検出した。

生成する融合たんばく質は天然のＰＲＩよりもいくぶん大きいことが期待される。事実この場合もこのことが観察され、ＰＲＩの全コード領域がこのＥｃｏＲＩ挿入物中に存在しているという仮定と一致した。

１也ウサギ　　７、　・ｒ″　におけるＰＲＩたんばく　のＰＲＩ挿入物のｐＧＥＭ＠−７２ｆ　　（＋）へのクローニングの後、このベクターはベクター上のＳＰ６プロモーターを用いたインビトロでの挿入物からのＲＮＡの合成に使用可能である。　ＲＮＡはこのプロモーターから合成され、ウサギ網状赤血球溶解物のプログラムに使用される。天然のＰＲＩたんばく質の大きさをもつ５１．０００ダルトンのたんばく質が合成された。再びこの結果は全ＰＲ１コード配列がこのクローン上に含まれていることを示している。

実施１ｉ工ＯＥＭの−ＩＺｒ（＋＞７ヲノじＬ白払盆揮入匂！シ＝ゴ乙と２ヱ久Ｐｔ遺伝子挿入物の５′および３′末端の最初のシーケンシングはｐＧＥＭ＠− ７２ｆ　　（＋）プラスミド中のクローンで行った。このシーケンシングデータはＥｃｏＲＩクローニング部位の数ヌクレオチド下流のＡＴＧコドンの存在およびクローニングされた遺伝子の３′末端にある長さ３６残基のポリ人テールの存在を示した。実施例４に従がって産生された融合たんばく質の大きさから、Ｐｔたんばく質コード配列の論理的開始点はシーケンシングクローン中に見い出される最初のＡＴＧコドンであると結論し得る。

さらにシーケンシングデータは市販の欠失システム（イレーズ・ア・ベース（ｌｉｒａｓｐ、−ａ・１ｅａｓｅｄ）システム、プロメガ社）を用いｔ、−ｐＧＥＭ＠−７Ｚｒ　（ト）クローンの連続的エキソヌクレアーゼ１■欠失により得られた。エクソヌクレア−・ゼ１１１は５′突出端または平滑端からＤＮＡを特異的に消化し、一方３′側は４塩基突出のまま残すのに用いられる。この酵素の消化速度一定性はその反応物から部分標本を取り出すことにより所定の間隔で欠失を生じさせ得る。この戦術で実質的にクローン化挿入物の全ヌクレＡチド配列を生成させた。このようにしで得たヒトｐＲｉのクローン化遺伝子のヌクレオチド配列を第３−３Ｇ図に示す。ここには誘導されたそのたんばく質の゛７ミノ酸配列を含めた。

もしヒトＰＲＩのクローン化遺伝子のヌクレオチド配列が与えられれば、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションによるｒ’Ｒ１ｍｍ壬子ｊｌｔ離を可能にするハイブリダイゼーションプローブの構築するのは本発明の範囲内となる。

遺伝子産物に結合した融合部分をもたない天然配列のたんばく質を合ｊ＆するため、クローンのシーケンシングで見つかったｒＴ？　初のΔＴＧコドンは天然の翻訳開始コドンであると仮定した。原核性リボゾーム結合部位をΔ′Ｉ’　Ｇ開始部位から６〜８塩基の場所に挿入しその開始部位が大腸菌内で機能するようにした。他の構築物のデータから８個の余分なアミノ末端アミノ酸をもつＩ’ＲＩキメラたんばく質は調節可能な大腸菌プロモーターから発現するとき致死的であるようだ。したがってスダシア（ＳＬｕｒｌｉｃｒ）　Ｆ、　　ライリアｌ−（Ｗ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ｉａｍ）およびバーバラ（口ａｒｂａｒａ）　Ａ、モフ７”／ト（ＭｏｌｌａＬＬ）　　（“りｒＪ−ン化遺伝子を選択的レベルで発現させるためのバタテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用”、Ｊ。

Ｍｏｌ、　１ｌｉｏｌ、　１８９．　　ｌ　ｌ　：３−１３０　（１！３８Ｇ）　）が述べているようにＴ７プロモーターを有するＩ）　ＲＩ　Ｅｌｌ壬子誘導することにした。

この構築物の完成後これを′ｒ　７　ＲＮ　Ａポリメラーゼを欠く大腸菌宿主内で増１１１シた。したがってこの遺伝子はそのＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主に移されるまで発現しない。このような発現システムが描案されてきており（スクジア（ＳＬｕｄｉｅｒ）　’４上述、およびローゼンベルグ（Ｒｏ９ｃｎｂｅｒｇ）、アラン（＾ｆａｎ）、　Ｉ−１，等、”Ｔ７ＲＮΔポリメラーゼによるクローン化ＤＮＡの選択的発現のためのベクター”Ｇｅｎｅ、５Ｇ、１２５− １３５　（１９８７））また基本的に本章で行なわれている。

好ましい構築物ではりボゾーム結合部位およびＡＴＧコドンの前の領域およびシャインダルガルノ配列の前につづく非翻訳リーダー配列はバクテリオファージエフ遺伝子ＩＯ、リーダーおよびリボゾーム結合部位に由来している。さらに′Ｉ゛７プロモーターがこのＲＮ　Ａを生産するために存在する。

ラムダｇ【１１山来のｒ’ＲＩ遺伝子のｐＧＥＭ＠　　７Ｚ　ｒ　（＋）プラスミドへの移行はこの遺伝子がこのプラスミド中の多重り［１−エング制限酵素部位に隣接していることがらｌ＋広いクローニング戦術を切り開いた。

ＰＲＩ遺伝子を１３ａｍｌ−１１−ΔａＬＩＩフラグメントとして切り出しプラスミドベクターｐＩ３Ｒ３２２のこれら２つの部位の間に入れた。ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）等（上述）によって示されかつ合成オリゴヌクレオチドとして合成された配列の１゛７ターミネーターをその遺伝子の後のＸ　ｈａ　ＩおよびＡａＬＩＪ部位の間に挿入した。

Ｘ　ｂａ　１部位はＢａｍ１ｌ　ｌ−ΔａＬＬＩ７ラグメントのＰＲＩ遺伝子の移行の際にｐＧＥＭ＠−７Ｚｆ　　（＋）　リンカ−から誘導されたものである。

合成オリゴヌクレオチドばＴ７プロモーターおよび遺伝子１０５′非翻訳配列および遺伝子１ｏシヤイン・ダルガルノ配列を含むものを合成した。

このヌクレオチドをクローンのＢａＩＩＩＨ■およびＢｓｔＸ　１部位の間のＰＲＩ遺伝子の始めに挿入した。ＰＲＩ挿入物の始めの配列分析で仮定される遺伝子配列の第３番目のコドンの後にＢｓｔＸ　Ｉ部位が存在することが明らかになった。ＢｓｔＸ　Ｉはコード配列を切り出すのでこれらのアミノ酸を置換するよう設計した。最終的構築物を第４図に示した。これは大腸菌で発現するように作製されたプラスミドｐＢＲ３２２中のＰＲＩ遺伝子を含んでいる。

この合成構築物中のＰＲＩ遺伝子を発現するため第４図に示したプラスミドをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを産生ずる大腸菌株の中に入れた。この株はスタツプ（Ｓｔｕｄｉｅｒ）等（上述）およびローゼンブルグ（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ）等（上述）の方法に従って構築した。大腸菌ＪＭ１０９株を野生型ファージラムダで溶原化した。この株をラムダベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子をもつ組換えラムダファージ（ラムダＤ６９−Ｔ７）怒染のための宿主として用いた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を大腸菌ＪＭ１０９− ＤＥ３株の染色体に挿入した。このクローンを１９９０年２月２１日ア、メリヵン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０１バークローンドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５０）に受理番号６８２３０号として登録された。

この培養物を光学濃度Ｊとなるまで増殖させ、ＩＰＴＧで誘導した。産生されたＰＲＩたんばく質は細菌たんばく質のポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）でモニターしくレムリ（Ｌａｅ■１１）。

Ｕ、　　Ｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　（ロンドン）、２２７，６８０　　（１９７０）、つづいてウェスタンブロッティング（トウービン（Ｔｏｗｂｉｎ）、　Ｈ，等、上述）およびＰＲＩたんばく質に対するウサギ−次抗体による検出を行った。

この分析でＩＰＴＧによるＰＲＩ培養物の誘導および４時間培養後培養物１リットル当り約４０＋ｇのＰＲＩが合成されたことが示された。

大施拠工腸　ＪＭ１０９における活性ＰＲＩの産生実施例６で述べたＰＲ’Ｉプラスミドをもつ大腸菌ＪＭ１０９−ＤＥ３は特定のレベルの活性ＰＲＩたんばく質を産生じ得る。はとんどのたんばく質は不活性でかつ不溶性の形で合成されるけれども全ＰＲｒたんばく質の約Ｏ０１％は可溶性でありかつ活性である。活性ＰＲＩたんばく質は結合し７たＲ　Ｎａ５ｅを含むアフィニティーマトリクスへのバッチ吸着を用い遠心したフレンチプレス化溶解物から精製する（スニープス（Ｓｃｏｐｅｓ）　＋　ロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）Ｋ。

“たんばく質の精製原則と実際”２版、２７．１９８７）。この方法で回収したＰＲＩはゲルによる分子量が天然のＰＲＩ、ブラックバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）等（上述）およびブラックバーン（上述）により報告されている非グリコジル化たんばく質と同じであり、かつ精製した天然産物とほぼ同じ比活性を有している。

大腸菌中で産生されるＰＲＩたんばく質のほとんどは不溶型として合成されるので活性組換えＰＲＩたんばく質を生産する経済的方法を見つけるためまず不溶性物質を可溶化し活性型に再生しなければならない。

叉盪燃工大盪皿工匹プ１ｊ二ｌり　　　におけるＰＲＩたんばく　の産ｐＴＴＱベクター中の強力な宿主プロモーターｐＴａｃの制御下（スターク（Ｓｔａｒｋ）、Ｊ、　　Ｊ、　Ｒ，、Ｇｅｎｅ、　　５１．　ｐｐ２５５−２６７゜１９８７）大腸菌中で天然のＰＲｌたんばく質が産生された。

ＰＦ？！挿入物をＳｐｈ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＢＲ３２２から取り出した。このフラグメントはＰＲＩ遺伝子の前に秀れたりボゾーム結合部位を含んでおり、ベクターｐＴＴＱ１９（アマ−ジャム）中のＳｐｔ＋ＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間にクローン化された。この構築物はビシストロンメツセージ上のＴａｃプロモーターによりＰＲＩ遺伝子が発現するよう設計されている。１つのりボゾーム結合部位は１）ＴＴＱベクターに由来し、もう１つはＰＲＩ挿入物に由来する。内部リボゾーム結合部位は大腸菌中でよく機能するので、融合たんばく質ではなく天然のＰＲｒたんばく質はこの構築物内に合成される。もっとも高いレベルの可溶性で、かつ活性のあるたんばく質を与える宿主をさがすためこの構築物をいくつかの様々な大腸菌に入れた。テストした宿主には大腸菌Ｃ６０００、ＪＭ１０９、ＮＭ５２２、ＢＳＪ　７２、Ｂ１２１およびＨＢＩＯＩが含まれる。少な（ともいつくかの可溶性で活性のあるＰＲＩがテストした各宿主で産生された。

実施上ｊ大男１に膚刃邊Ｐｔた紐ざ−仝ｌユ況誉ＰＲＩたんばく質は天然たんばく質のアミノ酸分析により分子当り３２個のシスティンをもつことがら多くのジスルフィド結合を存するであろう。これらの結合は細胞質の還元的環境下では正しく形成されていない可能性が高い。それゆえより酸化的条件下でジスルフィド結合が起こるように細菌の細胞周辺腔にこのたんばく質を分泌させるよう設計した。ＰＲＩ遺伝子の開始部位の前にある大腸菌ｏｍｐＡたんばく質のシグナル配列をコードする合成オリゴヌクレオチド（モバ（Ｍｏｖｖａ）、Ｎ、　Ｒ，等、　　Ｊ、　Ｍｏ１．旧ｏ１゜１．４３　ｐｐ、３１７−２３８．１９８０）を付加することによりｐＢＲ３２２−ＰＲＭを修正した。これらのリーグアミノ酸はたんばく質を分泌させるためのものであり、このたんばく質が細胞から分泌される際に大腸菌のシグナルベブチターゼにより切断される。この構築物においてＴ７プロモーターはｐＢＲ３２２−ＰＲＩにおけるのと同様にＰＲＩ遺伝子の転写のために働きつづけるが、ｏｍｐ　Ａシグナル配列が最初に作られる。結果的にＰＲＩが正しくプロセシング（シグナル配列の除去）を受は細胞から分泌されることが示された。分泌したＰＲＩたんばく譬は活性がないことが分った。さらにたんばく質レベルも細胞内で産生されるものの約１０分の１で培養物１リツトル当りわずか約４ｍｇであ、った。

去鷹１（Ｌｙ大届１国」仁どり丸ｉル立ヱ上ユ藷菟劣■拠ヒト組換えＰＲＩに有用な発現ベクターを構築する際これらの構築物が宿主細胞に対して致死的に働くことでＰＲＴたんばく質の発現が不可能となる状態がいくつがあった。１つはベクターｐＴＴＱＱ中１２個の余分なアミノ末端アミノ酸をもつＰＲＩ融合物の構築を企てた場合であり、もう１つは分泌発現ベクターＰＩ　　ＮｉｌＩＮ１１Ｉｏマスイ（Ｍａｓｕｉ）　＋　Ｙ　、等、“大腸菌における多目的発現クローニングベヒクル ”、“遺伝子発現の実験操作”、Ｍ、イノウニ（Ｉｎｏｕｙｅ）［、アカデミツクブレス版、１９８３）中のＰＲＩの発現の場合である。前者の場合、まずｐＴＴＱ９をＰｓｔｌで切断し末端をクレノーで平滑化したのちこのベクターを再びライゲーションした。ｐＧＥＭ＠−７２ｆ　　（＋）−ＰＲＩのＰｔ挿入物をＢａ＋ａＨＩ　−Ｓｐｈ　Ｉフラグメントとして取り出し、Ｐｓｔ１部位を平滑化したｐＴＴＱ９ベクターのＢａａＨｌおよびＥｃｏＲ１部位の間にクローン化した。５ａｉｌおよびＫｐｎｌによる切断とこれらの粘着末端のクレノー処理およびライゲーションでベクター上の強力なＴａｃプロモーターからの融合たんばく質の発現の読み枠に適合する場合にＰＲＩ遺伝子を位置させ得るであろう。しかし最終構築物が得られなかったことからこの発現システムは非誘導条件下でさえ致死量のＰＲＩ融合たんばく質を生成していると結論される。後になってこれと同じ融合たんばく質は基本的にｐＢＲ３２２−ＰＲＩと同じ構築物においてＴ７プロモーターの制御上生産し得るが、この場合はそのアミノ末端に余分の１２個のアミノ酸を組込むよう作製したクローンを用いていることが示された。発現システムにおける融合たんばく賞生産能の差はおそらく非誘導条件下の＋、＆システムのより強い抑制によるものであろう。

分泌ベクターｐｌＮ　　ＩＩＩｏｌｌｐＡへのＰＲＴ挿入物のクロー化においても致死が観察された。このＰＲ１挿入物をＢｓｔＸｌ−ＥｃｏＲ１フラグメントとしてｐＧＥＭ＠−７２ｆ　　（＋）−ＰＲＩから切り出しＥｃｏＲ１切断しリン酸化したｐ　ＩＮ　　Ｉ　Ｉ　ＩｏｍｐＡにクローン化した。このＰＲＩフラグメントは２つの方向に挿入され、その結果ベクターのＴａｃプロモーターに関しＰＲＩ遺伝子が前後に位置するようになる。しかし、唯一観察される構築物はＰＲＩ挿入物がこのプロモーターの後に位置するもので、従ってこの遺伝子の発現は起こらなかった。先に述べた理由で前置きの構築物は致死的であるようだ。

大施■上上で生産される＼ｒ　ＰＲＩの°　および口ＰＲＩ生産を誘導された大腸菌内で生成した不溶性ＰＲＩは以下のように回収し得る。

■、不活性ＰＲＩの生産を誘導された細胞を緩衝液に懸濁する。

適当な緩衝液は５０ｍＭ）リスＨＣＩｌ　（ｐＨ７、５）　、５　ｍＭ　ｆｉｌ）ＴＡおよび５ＭＭＤＴＴを含むＴ　Ｅ　Ｓ　Ｄ　”ｒ′！”バッファである。

ガスペンションは４（１（１ｍ７！のバッファ溶液中一般には凍結状態の細胞約２０グラムを含むのが適当である。このプロセスのスケールを変える事は本発明の範囲内にある。しかし１：２０の比（細胞グラム数／バッファ容積＋ｎｊ２）を維持することが好ましい。

２、　この→ノスペンジョンを氷中約１０分間激しく撹拌する。

３、細胞溶解により細胞膜を破壊する。ｌｆｆＩｇ／ｍｊ！の濃度で粉末リゾチーノ・を加え（シグマ、■級）水中で３０分間撹拌する細胞溶解法が好ましい。

撹拌間約４１１１１の１０％（ｖ／ｖ）　ドデシル硫酸す）　ＩＪウムを加え、再び水中で３０分間撹拌する。

４、　この→Ｊ゛スペンジョンを約４℃で約２０分間、約１７．０００　Ｘｇで遠心する。灰色の堅固な下層と、半透明で高粘性層および上清からなる二相ペレット状態が得られる。

５、　上清をペレットから注意深くデカンテーションで分離しペレットだけを残す。このペレットは粗ＰＲＩたんばく質である。

１、実施例ＩＩの条件下バッファに実施例１１で得た粗ＰＲ＋ペレットを再懸濁する。

２、　このサスペンションを約４℃、約２０分間および１７０００×ｇで遠心する。遠心後高粘性層ができる。

３、遠心混合物から上清をデカンテーションする。

４、　ペレットを攪拌しながらバッファに再懸濁する。このバッファ溶液はペレット２０グラム当り４００ｍ６のＴＥ５ＤＴＴであることが望ましい。このサスペンションを氷中約３０分間激しく攪拌する。

５、　このサスペンションを約４℃、約２０分間、およそ１７．ＯＯＯＸｇで遠心する。残ったペレットはうすい灰色をしている。

大施拠土主上且土■可主囮ペレットは以下のように懸濁し可溶化した。

１、最終ペレットを好ましくは２００ｔａｌのＴＥ５ＤＴＴバッファに懸濁し水中で約１２０分間攪拌する。乳白色のサスペンションが得られる。

２、　可溶化は好ましくは４Ｍはどの濃度で尿素を含むバッファ溶液中で開始する。バッファ溶液としてはＴＥ５ＤＴＴが適当である。尿素溶液は３６０ｇの尿素を含む８００ｆｆｌｊ！のＴＥ５ＤＴＴであることが望ましい。

３、　可溶化したＰＲＩは素速く攪拌しながら約１０℃から２５℃の温度で８００ｍＡのバッファ溶液に対し約２００ｍＡの割合で希釈する。この溶液を約３〜５分攪拌するといくかの細胞破片を含むほぼ透明な溶液となる。

４、　使用前この尿素溶液は遠心して不溶性物質を除去するのが好ましい。遠心は約４℃で約１５分間、６０００Ｘｇで行う。上清は無色透明となる。この上清が可溶化ＰＲＩを含んでいる。

大夾炎上土旦尺上皇盟１止この上清を１００１のバッファ溶液に素速く希釈し、十分な時間維持してＰＲＩを活性状態に再生させる。このバッファ溶液は水活性剤１０％（ｖ／ｖ）を含む ”ｌ’Ｅ５ＤＴＴであることが望ましい。スクロースも使用できるが水活性剤としてはグリセリンが望ましい。バッファ溶液のｐＨは約６．５〜約８．５の範囲にあり、７．５であることが好ましい。

この溶液を室温に約８〜１８時間放置した後、ＰＲＩたんばく１００１中の再生ＰＲＩはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）カラムリアクターで濃縮し得る。ＤＥＡＥカラムは再生ｒ’Ｒ＋を濃縮するだけでなくＩ’ＲＩたんばく質の再生プロセスを助ける点で有利であり、このことは本発明の利点となっている。代表的カラムには流速３０リットル／時間で使用するクツ（Ｃｕｎｏ＠）　３２００ＤＥΔＥカートリツジがある。以下に操作を示す。

１、　再生したＩ）Ｒ１をポンプでカートリッジに送り、０．５ＭＮａＣｆを含む′ｒ１シ５　Ｄ　”ｒｉ’で溶出する。

２、カラムからの溶出液を少なくとも１ｍｇ／ａ＋Ａ’の濃度で共有結合したＲＮａｓｅを含むアフィニティ樹脂に通した。活性Ｉ’ＲＩはＲＮａｓｅに吸着し、一方不活性で不正に再生した物質はこのアフィニティーカラムを素抜けしてしまう。

３、　このアフィニディー樹脂から５ｍＭ　　ＤＴＴを含む０．０５　Ｍ耐酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５，０）　＋３Ｍ　　Ｎａ（：β溶液で活性ＰＲＩを溶出する。この段階でＰＲＩは基本的に純粋であり、１〕ΔＧＥで均一である。

４、　　ＲＮａｓｅ混入が問題ならＤＥΔＥセファロースＣＬ−６Ｂへの結合と濃度勾配溶出によりさらにＰＲＩたんばく質から機能性不純物を除去できる。再生および精製スデップによる細胞２０グラムからのＰＲＩの収量は約３百万ユニツトである。

組換えたんばく質はその非保護のアミノ末端の存在で天然のたんばく質と区別し得る。天然のＰＲＩはそのアミノ末端がおそらくアセチル化で保護されていることからそのアミノ末端から配列決定することができない。組換えたんばく質のたんばく質配列決定で組換え体の非保護アミノ末端の存在が明らかになり、さらにＮ末端のメチオニンが大腸菌中で除去されたことが示された。

本発明は代表例として本明細書に示されている特定の態に制限されるのではなく以下の請求の範囲内での修正形を包含すると理解すべきである。

クローン化ＲＮａｓｉｎ挿入物のヌクレオチド配列ＦＩＧ、　　３ＴＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＧＣＴＣＡＧＡＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＡＴＡＴＴＴＴＧ　ＧＡＣＡＣＴＴＴＡＴＡＦ工Ｇ、　　３Ｃ手続補正書（方式）３，７．１１平成　　年　　月　　日１、事件の表示　　　平成２年特許願第５０６８３３号（ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０２１２２）３、補正をする者事件との関係　　出願人名　称　　　プロメガ　ニーポレイション５、補正命令の日付　　自　　　発代理権を証明する書面国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトの胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードする組換えＤＮＡ遺伝子配列を挿入したベクター。
２．ラムダｇｔ１１、Ｔ７、ｐＧＥＭ■−７Ｚｆ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＡＲＣ７、ｐＡＳ、ｐＢＣ１２ＢＩ、ｐＧＰＤ−２、ｐＵＣおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる請求の範囲１記載のベクター。
３．請求の範囲１記載のベクターに適合し、かつこれを含む宿主。
４．大腸菌、イーストおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる請求の範囲３記載の宿主。
５．前記ＤＮＡ遺伝子配列を発現し得る請求の範囲１記載のベクター。
６．請求の範囲５記載のベクターに適合し、かつこれを含む宿主。
７．大腸菌、イーストおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる請求の範囲６記載の宿主。
８．分子量約５１，０００ダルトンの実質的に純粋な組換えヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター。
９．ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを発現し得る組換え宿主細胞で、ａ）宿主細胞、ｂ）プロモーター、およびｃ）該プロモーターの制御下にあるヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードする外来遺伝子配列、以上ａ）〜ｃ）を含む細胞。
１０．前記外来遺伝子がｃＤＮＡ配列である請求の範囲９記載の宿主細胞。
１１．前記宿主細胞が大腸菌およびその誘導体からなる群から選ばれる請求の範囲９記載の組換え宿主細胞。
１２．ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードする外来遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡ鎖。
１３．前記プラスミドがｐＢＲ３２２、ｐＡＲＣ７、ｐＡＳ、ｐＢＣ１２ＢＩ、ｐＧＰＤ−２、ｐＵＣおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる請求の範囲１２記載のプラスミド鎖。
１４．クローン化した活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを得る方法であって、ａ）ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを含むヒトの胎盤サンプルを得、ｂ）見かけ上均一になるまでヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを精製し、ｃ）さらに工程ｂ）の産物を濃度勾配溶出吸着カラムにかけてヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターから混合物を除去し、ｄ）ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターに対する抗体を作製し、ｅ）工程ｄ）の抗体を用いてヒト胎盤組織のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、ｆ）工程ｅ）のライブラリーからヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターの遺伝子を単離し、ｇ）プラスミド中にヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードする遺伝子をサブクローニングし、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターからなるクローン化遺伝子産物が発現されるようなヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター／プラスミド構築物を作製し、かつｈ）工程ｇ）のプラスミド構築物を増殖し得る宿主細胞中に該プラスミド構築物を導入しヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを生産する、上記ａ）〜ｈ）の工程を含む方法。
１５．請求の範囲１４記載の方法で調製したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターの可溶化方法および再生方法であって、ａ）請求の範囲１４記載の不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを単離し、ｂ）工程ａ）の不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを可溶化し、かつｃ）可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを希釈することによりヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを活性化する、上記ａ）〜ｅ）の工程を含む方法。
１６．請求の範囲１５記載の方法で、工程ａ）の単離プロセスに、ａ）バッファ溶液中不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターの産生を誘導した細胞を懸濁し、ｂ）細胞溶解によりその細胞膜を破壊し、ｃ）工程ｂ）の溶液からヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターのベレットを遠心により得、かつｄ）遠心したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターベレットから上清をデカンテーションする、上記ａ）〜ｄ）の工程を含む方法。
１７．請求の範囲１６記載の方法で、十分量のリゾチームおよびＳＤＳを工程ａ）のサスベンジョンに添加し、遠心を約４℃、約１７，０００×ｇで行う方法。
１８．請求の範囲１５記載の方法で、工程ｂ）の可溶化プロセスが不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをバッファ溶液およびその溶液中でポリペプチド鎖を分離し得る化学試剤と合せることを含む方法。
１９．前記バッファが５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ　ＤＴＴを含み、かつそのｐＨが約７．５である請求の範囲１８記載の方法。
２０．前記化学試剤が約４Ｍ程度の濃度の尿素である請求の範囲１８記載の方法。
２１．請求の範囲１５記載の方法で、工程ｃ）の活性化プロセスが可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをバッファ溶液で希釈し、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターが活性状態に再生するのに十分な時間維持することを含む方法。
２２．前記バッファ溶液が５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ　ＤＴＴを含み、かつそのｐＨが約７．５である請求の範囲２１記載の方法。
２３．前記希釈を１部の尿素に対し少なくとも２０部のバッファの割合で行う請求の範囲２１記載の方法。
２４．請求の範囲１８記載の方法で、さらに可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター溶液を遠心して不溶性物質を除去することを含む方法。
２５．前記可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを約１０℃から２５℃の温度範囲で希釈する請求の範囲２１記載の方法。
２６．前記バッファ溶液のｐＨが約６．５と約８．５の間にあり、かつさらに０．５ｍＭ程度のＤＴＴを含んでいる請求の範囲２１記載の方法。
２７．前記バッファ溶液が水活性剤を含む請求の範囲２１記載の方法。
２８．前記水活性剤がスクロースおよびグリセリンからなる群から選ばれる請求の範囲２７記載の方法。
２９．請求の範囲２１記載の可溶化および再生したヒト胎盤リボヌクレアーゼの精製方法であって、ａ）請求の範囲２１の再生ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを吸着カラムに導入し、かつｂ）吸着物質に結合した活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを溶出する、上記ａ）およびｂ）の工程を含む方法。
３０．ヒト胎盤リボスクレアーゼインヒビターをコードする１、６ｋｂ以下のＤＮＡ配列。
３１．第３−３Ｃ図に示したヌクレオチド配列を有するヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードするＤＮＡ配列。
３２．実質的に純粋な組換えヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターで以下の性質：ａ）分子量：５１，０００ダルトン、およびｂ）阻害型：非競合的を有するもの。
３３．不活性型のヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを単離する方法であって、ａ）バッファ溶液に不活性胎盤リボヌクレアーゼインヒビターの産生を誘導した細胞を懸濁し、ｂ）細胞溶解によりその細胞膜を破壊し、ｃ）ステップｂ）の溶液からヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターのベレットを遠心により得、かつｄ）遠心したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターのベレットから上清をデカンテーションにより除去する、上記ａ）〜ｂ）の工程を含む方法。
３４．請求の範囲３３記載の方法で、工程ａ）のサスベンジョンに十分量のリゾチームおよびＳＤＳを加えて細胞膜を破壊し、かつ約４℃、約１７，０００×ｇで遠心を行う方法。
３５．不活性型のヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを可溶化する方法であって、ａ）原料から不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを単離し、かつｂ）不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをバッファ溶液およびその溶液内でポリペプチド鎖を分離し得る化学試剤を合せる、上記ａ）およびｂ）の工程を含む方法。
３６．前記バッファが５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ　ＤＴＴを含み、かつそのｐＨ値が約７．５である請求の範囲３５記載の方法。
３７．前記化学試剤が約４Ｍ程度の濃度の尿素である請求の範囲３５記載の方法。
３８．不活性型のヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを活性化する方法で、単離し、かつ可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをバッファで希釈し、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターが活性状態に再生するのに十分な時間維持することを含む方法。
３９．前記バッファ溶液が５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ　ＤＴＴを含み、かつそのｐＨ値が約７．５である請求の範囲３８記載の方法。
４０．前記希釈が１部の尿素に対し、少なくとも２０部のバッファの割合いで行なわれる請求の範囲３８記載の方法。
４１．請求の範囲３８記載の方法で、さらに可溶化したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを遠心し、不溶性物質を除去することを含む方法。
４２．前記可溶化ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを約１０℃から２５℃ の温度範囲で希釈する請求の範囲３８記載の方法。
４３．前記バッファ溶液のｐＨが約６．５と約８．５の間にありかつ、さらに０．５ｍＭ程度のＤＴＴを含む請求の範囲３８記載の方法。
４４．前記バッファ溶液が水活性剤を含む請求の範囲３８記載の方法。
４５．前記水活性剤がスクロースおよびグリセリンからなる群から選ばれる請求の範囲４４記載の方法。