JP2002512771A - 哺乳類のubr1をコードする核酸 - Google Patents
哺乳類のubr1をコードする核酸Info
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Abstract
Description
と呼ばれている(Varshavsky,Cell 64:13-15 (1991))。N-デクロンと命名された
ある一つの分解シグナルの必須成分が、タンパク質不安定化N-末端残基である(
Bachmairら、Science 234:179-186(1986))。異なる不安定化残基を含有する1組
のN-デグロンはN-末端法則と呼ばれ、これはタンパク質のインビボ半減期とその
N-末端残基の本質とを関連付ける(総説としてVarshavsky,Cell 69:725-735 (19
92)およびVarshavsky、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.60:461-478(1996)
を参照にされたい)。N-末端法則経路は、真正細菌である大腸菌(Escherichia. coli )、酵母であるサッカロミセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)お
よび哺乳動物細胞を含む調査したすべての種に見いだされた。このような生物の
N-末端法則は類似しているが、別個のものである。
細胞系の様々な複雑な機能に関与していることが明らかになった。そのような研
究は、N-末端法則経路を阻害またはモジュレートすることに分子レベルで介入す
る能力が、重要な治療的方法を提供することを示している。経路の比較的複雑な
酵素学を仮定すると、この成分を多量に利用できることが治療法の開発に必須で
ある。
関する。この核酸配列は緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号1の核酸
配列に特異的にハイブリダイズする能力が特徴である。そのような条件を以下に
定義する。別の観点では、本発明は緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番
号2の核酸配列に特異的にハイブリダイズする能力が特徴であるN-末端法則経路
の認識成分をコードする核酸配列に関する。別の態様は、上記の種類の核酸配列
を含有するDNA発現ベクター、ならびにそのような発現ベクターでトランスフェ
クトされた細胞に関する。本発明はまた、上記の組成物用の応用に関する。
ドする核酸の単離およびクローニングに基づく。Ubr1はE3αとも呼ばれているが
、ユビキチン−タンパク質リガーゼであり、これは特に筋肉組織のストレスが関
係する低下(消耗)に関連付けられてきた。
ビキチン−プロテアソーム経路を介して強化されたタンパク質溶解に主に起因す
ることが示された(MitchおよびGoldberg、N.Eng.J.Med.335:1897(1996))。ウサ
ギの骨格筋抽出物では、N-末端法則経路はタンパク質分解に関する主要な経路で
ある−可溶性タンパク質のアミノ酸への完全な分解を触媒する(Solomonら、J.B iol.Chem.271 :26690(1996))。ウサギの骨格筋組織の可溶性抽出物では、Ubr1遺
伝子産物の既知のインヒビターが、ATP-依存的な可溶性筋肉タンパク質のアミノ
酸への分解を、それらの125I-ユビキチンへの結合を遮断することにより減少す
ることが示された(Solomonら、1997 FASEBサマーミーティング、バーモントか
らのアブストラクト(1997))。
トラクト(1997))、筋肉のタンパク質溶解を特徴とする数々の病理状態に関連す
るタンパク質のユビキチン化の速度に於ける変化の同定を報告する。より詳細に
は、萎縮しているラットの筋肉において、全体的なタンパク質分解が上昇する時
(例えば、盲腸穿刺により誘発された敗血症をもつ敗血症ラット、甲状腺亢進症
ラット(トリヨードチロニンを用いて処理した)または腫瘍をもつラット(3〜
5日間、ヨシダ腹水ヘパトームを持つ)において)、可溶性タンパク質への125I
-ユビキチンの結合は、対照筋肉中で見いだされるレベルの2倍以上より多く増
大した。既知のインヒビターを導入することは、増大した125I-ユビキチンの複
合体を対照筋肉レベルに選択的に抑制することが見いだされた。さらに、125I-
リゾチームのユビキチン化(N-末端法則基質のモデル)は、上記の萎縮している
筋肉の抽出物中で、対照抽出物のレベルの2倍まで増加することも測定された。
下垂体切除術または甲状腺摘出術後、単離されたラット筋肉中でタンパク質分解
は低下することが示された。そのような筋肉の抽出物において、可溶性タンパク
質への125I-ユビキチンの結合は、タンパク質分解に平行して50%まで低下する
。さらにリシン−アラニンジペプチドは、125I-ユビキチンの可溶性タンパク質
への結合を抑制し、そして対照と下垂体切除または甲状腺摘出したラットの筋肉
抽出物との間で、このプロセスにおけるほとんどの差異を排除する。125I-リゾ
チームのユビキチン化もこのような抽出物中で減少し、N-末端法則経路の成分の
活性が下垂体切除および甲状腺摘出したラットの筋肉で低下したことを示した。
耗を特徴とする種々の疾患の処置と関連して有用になるであろうことを示唆する
。N-末端法則経路のある種のインヒビターは既知であるが(例えば、N-末端法則
の基質に似たジペプチド)、そのようなインヒビターのインビボでの利用性は限
定されている。このように本発明の1観点では、N-末端法則経路が媒介する筋肉
の低下を抑制する方法および組成物に関する。
制は、リステリア モノサイトジーンズ(Lysteria monocytogenes)およびエルジ
ニア エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)のような細胞内病原菌による
感染の処置のための介入手段として示される。この種の細胞内病原菌は感染した
細胞の細胞質を占領し、そして細胞を殺すことなく増殖する。生物はそのような
病原菌による感染自体を病原菌の構成タンパク質を細胞内で分解し、続いて細菌
タンパク質断片を宿主の免疫系に主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラス−I結
合細胞溶解性Tリンパ球エピトープを介して提示することにより排除するように
試みる。
モノサイトジーンズ(Lysteria monocytogenes)のエピトープのMHCが結合した提
示と関連して、N-末端法則経路の関与に焦点をあてている。より具体的には研究
者はp60、リステリア(Lysteria)−分泌ムレインヒドロラーゼの分解に注目し
た。おおよそ3%の分解したp60がp60 217-225、H-2Kd MHC クラスI分子により
結合される9量体を生じる。野生型残基を、N-末端法則に従い安定化または不安
定化するためのいずれかの既知のアミノ酸に置き換えるために、p60のN-末端残
基の突然変異誘発法により、p60がN-末端法則経路の基質であることが明らかに
示された。バリン置換は細胞質ゾルのp60分子を劇的に安定化するが、アスパラ
ギン酸置換は急速な分解をもたらした。
必須である。そのような分解が細胞内病原菌の場合は、N-末端法則経路により媒
介されるという事実は、回路の介入および操作がそのような感染を処置するため
に使用できることを示唆している。エル.モノサイトジーンズ(L.monocytogenes)
のような侵入する細菌の生活環においては、N-末端法則経路の重要性を決定的に
証明することが直接示されることが待たれるが、治療に関する解釈の基礎はエル
.モノサイトジーンズ(L.monocytogenes)のような細胞質ゾル内の寄生体がN-末端
法則経路と同時に進化したという事実である。したがって薬剤が媒介するこの経
路のパーターベーション(その阻害または活性化)は、このような細菌による感
染過程の影響に極めて似ている。
および細胞内病原菌による感染の例であり、これらはN-末端法則経路が関与する
分子介入による処置に反応しやすい。N-末端法則経路は十分に研究され、そして
それは幾つかの包括的な総説文献の主題である(例えばVarshavsky,Trends Bio chem.Sci.22 :383(1997)およびVarshavsky,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:12142(1
996)を参照にされたい)。
が1つのユビキチン部分であるか、または受容体タンパク質に共有結合したマル
チユビキチン鎖のいずれかである反応を触媒するユビキチン−特異的酵素を含む
。ユビキチンはアミド結合、イソペプチド結合と呼ばれるユビキチンのC−末端
(Gly-76)残基と受容体タンパク質中のリシン残基のε-アミノ基の間の結合を通
して他のタンパク質と複合体化する。
ついて活性化され、これはATP-加水分解をユビキチンのGly-76とE1の特異的シス
テイン残基との間の高エネルギーチオエステル結合の形成につながる。E1-連結
ユビキチン部分はエステル交換反応でE1からユビキチン−複合化酵素(E2)のシ
ステイン残基へ動かされ、そしてそこから最終的な受容体タンパク質のリシン残
基へ動かされ、ユビキチン-タンパク質共役体を生じる。この最後の段階には、E
3またはレコグニンと呼ばれる別の成分の参加が必要であり、これは分解シグナ
ルとの相互反応を介してユビキチン化するためにタンパク質を選択する。Ubr1p
、N-末端法則経路のE3は、E2と最終的なユビキチンの受容体との間の段階で作用
するボナ フィデ(bona fide)酵素である。これはさらにエステル交換反応を通し
て、ユビキチン部分が関連するE2酵素のシステイン残基からE3自体のシステイン
へ移動することを触媒する。
タンパク質複合体は、26Sプロテアソームと命名された約2,000kDaのATP-依存的
プロテアーゼにより特異的に分解される。この26Sプロテアソームは、20Sのコア
プロテアソームおよび20Sプロテアソームの両端でマルチプルATPアーゼを含有す
る複合体から成る。
タンパク質基質のN-末端で暴露されている「不安定化(destabilizing)」残基に
特異的である。Ubr1により認識される分解シグナルは、全ユビキチン系により認
識されるシグナルの比較的小さいサブセットのみを表すので、Ubr1の阻害(およ
びしたがってN-末端法則経路の阻害)は比較的穏やかな、非致死的治療的介入と
なるだろうが、全ユビキチン系の阻害は哺乳動物細胞では致死的であり、したが
って選択する治療としては望ましくない。
えば核酸レベルでは、Ubr1 mRNAに特異的にハイブリダイズする阻害分子はUbr1
mRNAと生理的条件下で接触させ、これによりUbr1 mRNAの翻訳を抑制することが
できる。あるいは翻訳されたUbr1遺伝子産物のインヒビターを導入することがで
きる。翻訳レベルでの抑制に関して、Ubr1 cDNA配列の知識は必須である。翻訳
されたUbr1遺伝子産物の阻害に関して、Ubr1をコードするクローン化された核酸
配列の利用性は、例えばスクリーニングアッセイに必要なUbr1の量を生産するた
めに事実上必要である。
する核酸配列に関する。本明細書に開示するのは、Ubr1のマウスおよびヒト形態
に対応するcDNA配列である。
んど任意の哺乳動物起源の完全長cDNAを単離することができるだろう。このよう
なcDNAを、組換えDNA法を使用してUbr1を生産するために真核または原核細胞発
現ベクターに挿入することができる。出願人の発明の範囲は、具体的に開示した
配列に限定されず、むしろそのような配列の変化を包含し、これは:1)緊縮条
件下で開示した配列にハイブリダイズし;そして2)機能的Ubr1タンパク質をコ
ードする。第1の基準に関して、緊縮ハイブリダイゼーション条件は、開示した
配列(またはそれらのタンパク質)が固体支持体に固定され、そして開示した配
列にハイブリダイズする能力について試験する第2DNA分子を検出できるように
標識し、そして本質的に50%ホルムアミド、5×SSPE(1×SSPEは0.15mM NaCl
、1mM Na-EDTA、10mM Na-ホスフェート(pH7.0)である)、5×デンハーツ溶液(
0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%Ficoll)から成るハイブリダイゼーションバ
ッファーに懸濁する。このハイブリダイゼーションバッファーは固体支持体と約
45℃で数時間、接触させる。次にハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして
非特異的に結合した核酸を1×SSCで温度を上げて(65℃まで)繰り返し洗浄す
ることにより除去する。第2基準に関しては、コードされる生成物の機能性を、
例えば以下に記載する任意のインビトロ法を含む種々のアッセイ技法により測定
することができる。
み合わせを目的の細胞に導入することにより行うことができる。あるいはUbr1 m
RNAの少なくとも1部分と相補的である転写産物をコードするアンチセンス遺伝
子構築物を使用してもよい。オリゴヌクレオチドを生物の細胞に導入することに
付随する固有の難しさ故に、アンチセンス遺伝子構築物の使用は治療的状況に好
適である。アンチセンス遺伝子構築物は、例えば二重鎖Ubr1 cDNAの少なくとも
1部分を、野生型の状況に比べてプロモーターに対して逆方向に発現ベクターに
挿入することにより生成することができる。発現ベクターは標的とする種類の細
胞中での使用に適するように選択される。ヒトを対象とした治療と関連して使用
するためには、真核ウイルスに基づくベクターが好ましい。好ましくは逆遺伝子
構築物によりコードされる核酸は、発現に関して重要であることが知られている
領域中のUbr1 mRNAに相補的である。典型的には最初の設計には翻訳開始部位、
スプライス部位および発現に関して重要な他の部位を含む。
るように設計する方法を採用する。例えば発現したUbr1遺伝子産物を、Ubr1遺伝
子産物に特異的に結合し、そしてその活性を阻害する分子と接触させることは好
適な阻害法である。
る。例えば発現可能なUbr1 cDNAを含有するDNA発現ベクターを使用して、Ubr1遺
伝子産物はインビトロで過剰に発現させることができる。インビトロ系は関連す
るユビキチン複合化酵素(E2)、哺乳動物ユビキチン活性化酵素(E1)、遊離ユ
ビキチンおよびATPを、N-末端法則経路の基質のユビキチン化を支持するために
十分な量で補足される。いったん樹立すれば、このインビトロ系は小分子ライブ
ラリーをATPおよびUbr1-依存的様式でそれらの効果を現すインヒビターを同定す
るためのスクリーニングに採用される。そのような小分子ライブラリーは、複雑
な小有機分子が豊富な起源から集成される。細菌および植物細胞抽出物は、その
ようなスクリーニングの目的で莫大な数の多様な有機分子を単離するために、し
ばしば使用される供給源である。
物細胞系でUbr1遺伝子産物の過剰発現が関与する。ここでも発現ベクターは好適
な哺乳動物細胞系と適合性があるように慎重に選択される。好適な態様では、使
用する細胞系はヒトの細胞系である。哺乳動物細胞系中でのUbr1遺伝子産物の過
剰発現は、細胞培養のN-末端法則経路の活性を上昇させるだろう。そのようなUb
r1−強化アッセイにおいて、インヒビターは野生型細胞系により提供されるもの
にはないはるかに大きな感度のレベルで検出可能である。
により、特異的インヒビターを同定するための好機も提供する。Ubr1 cDNAの利
用性は、ミリグラム量で組換えDNA技法によるUbr1遺伝子産物の生産を可能にす
る。組換え法で生産されたUbr1遺伝子産物は結晶化することができ、そしてその
構造をX−線回析法による原子的解像で決定することができる。そのような技法
を従来の分子モデリングと組み合わせて使用して、Ubr1遺伝子産物の特異的サブ
ドメインと反応するように設計された、合理的に設計された候補インヒビター分
子を設計し、そして試験する。
ク質カラムおよび記載されたようなジペプチドによる溶出を使用して網状赤血球
溶解物から精製した(ReissおよびHershko,J.Biol.Chem 265:3685-3690(1990))
。約20μg(〜100ピコモル)の精製したUbr1タンパク質およびUbr1活性の安定化
剤としてニワトリ卵白を含有するサンプル(50mM N-エチルモルホリン、pH8.5、
0.2mM CaCl2および10%イソプロパノール中)を、トリプシンを用いて1:20の酵
素−基質質量比で周囲温度にて24時間消化した。消化したサンプルは乾燥し、そ
して6M グアニジン−HCl、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)に再懸濁した。トリ
プシン消化ペプチドを、逆相HPLCによりC18カラムで分画し、そして0.1%TFA中
のアセトニトリル勾配を用いて溶出した。単離したペプチドは自動化エドマン分
解によりモデル470A/900/120A ガス相シークエンサー/オンラインアナライザー
(アプライドバイオシステムズ:Applied Biosystems)で標準的な化学を使用し
てシークエンシングした。異なるペプチドの14配列が得られた。
ntech)を鋳型として使用して縮重オリゴヌクレオチドを用いたペプチド内PCRは
、2つのPCRの内部領域に相当する独特なウサギ Ubr1 cDNA配列を増幅させるた
めに応用した(図1)。具体的には、PCR反応の開始直前に、PCRプライマーを1
分間煮沸し、そして氷上で直ちに冷却した。AmpliTaq DNA ポリメラーゼを含ま
ないPCR前混合物(100μlの反応容量)を、72℃でGeneAmp PCR システム9600(
パーキン-エルマー:Perkin-Elmer)中でプレインキューベーションし(3分間)
、そして次にAmpliTaq ポリメラーゼを前混合物を含有する各試験管に加えた。9
4℃で2分後、最初の4サイクルは94℃で1分、65℃で10分、そして72℃で1分
間行った。20サイクル後に、PCR中の因子は4回毎に次第に減少し:変性時間は5
0、30、25、20そして15秒;アニーリング温度は、62、58、55、50および45℃;
アニーリング時間は5、4、3、3そして2分;そして延長時間は50、30、25、
25そして25秒であった。次に最後の20サイクルを94℃で15秒、42℃で2分、そし
て72℃で25秒行った。増幅したペプチド内PCR生成物は、4%低融点アガロース
ゲルで電気泳動により分析し、PCR2.1ベクター(インビトロゲン:Invitrogen、
カリフォルニア州)にクローン化し、そして制限酵素で消化してスクリーニング
し、続いてシークエンシングした。
。陽性クローンに使用したPCRプライマー対は以下のように命名した:T122(前
部および逆);T120(前部および逆);およびT96(前部および逆)。このよう
な命名は上記のように決定した14のウサギペプチド配列の3つに割り当てた命名
に対応した。
用してペプチド内PCR生成物の独特な配列に対応するオリゴヌクレオチドを、2
つのペプチド間のUbr1 cDNA断片を得るために適用した(ペプチド間PCR)(図1
)。多くのプライマーの組み合わせの中でも、T120の独特な配列を含有するオリ
ゴヌクレオチドとT134(決定した14のウサギのペプチド配列の別のもの)に対応
する別の縮重オリゴヌクレオチドが、392bp断片を生成した。その後に392-ウサ
ギUbr1 cDNA断片に対応する392bp-マウスUbr1 cDNA断片を、マウスT120の独特な
ペプチド内PCRを含有するオリゴヌクレオチドおよびウサギT134に対応する縮重
オリゴヌクレオチドを使用して、マウスcDNAライブラリー(クローンテック)か
ら得た。392bp-マウスUbr1 cDNA断片は、以下に記載するようにマウスcDNAライ
ブラリーからのUbr1 cDNAのスクリーニング用のプローブとして使用した。
よび3'-RACEs λgt11肝臓cDNAライブラリー(クローンテック)を、大腸菌(Escherichia.co li ) Y1090(約3×104プラーク形成単位/150-mmプレート、全30プレート)のプ
レートにまき、そしてプラークをナイロン膜(Hybond-N、アマーシャム:Amersh
am)上に乗せ、そして[32P]dCTPで標識した392bp-マウスcDNA断片(ペプチド間P
CRから得た)とのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。推定され
る陽性クローンは、プラーク精製されるまで再スクリーニングした。λgt11肝臓
cDNAライブラリーを使用した最初のスクリーニングでは、2つの陽性プラークを
生じた。精製したDNAをEcoRIで消化し、そして次に1%アガロースゲルで分析し
た。選択した両方の陽性クローンは同一の2.45kbの挿入物を含むことが、λDNA
および392bp−プローブ特異的プライマーを用いて生成した溶出PCR生成物の部分
的シークエンシングにより判明した。2つのクローンのcDNA挿入物は、続いてpB
luescriptII SK+プラスミドベクター中にサブクローン化し、その1つ(MR3)は
両鎖をシークエンシングした。MR3の完全なシークエンシングにより、T120、T10
0およびT134に相当する392bp-マウスプローブの領域を含む縮重アミノ酸配列の
9領域が明らかとなり、これはウサギのペプチド配列と強い同一性(62%〜100
%)を示した。9つの領域の合計(196aa)の、ウサギペプチド配列との全同一性
および類似性は、それぞれ89%および90%であった。この事実はクローン化した
2.45kbの挿入物がウサギUbr1のマウス相同体をコードすることを示す。さらに全
相同性は比較的低いが(24%の同一性および50%の類似性)、クローン化した2.
45kb挿入物の推定アミノ酸配列(N-末端から812aa)は、エス.セルビシエ(S.ce revisiae )UBR1の配列(aa3〜960)とかなりの相同性を示し、さらにクローン化
した2.45kb挿入物がエス.セルビシエ(S.cerevisiae)UBR1のマウス相同体をコー
ドすることを支持していた。
、このATGコドンがマウスUbr1 ORFにおける開始コドンかもしれないことを示唆
していた。ATGコドンの下流に終結コドン、ポリ(A)付加シグナルまたはポリ(A
)テールは無く、観察される精製されたウサギUbr1(〜180kDa)のSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動(Reiss and Hershko,J.Biol.Chem 265:3685-3690))で
の分子量はエス.セルビシエ(S.cerevisiae)UBR1(225kDa)よりもわずかに小さ
いことを考えると、クローン化された2.45kb挿入物は部分的なマウスUbr1 ORFの
N-末端部分をコードしていることを示唆している。ATGコドンの上流に枠内の終
結コドンは無かったので、5'-RACE PCR(Frohmanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 5 :8998-9002(1988))を採用して、枠内終結コドンを含む上流領域を増幅し、これ
には2.45kbクローンに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびインビトロ
で生成した5'オリゴ(dA)域(tract)に相補的なプライマーを使用した。
マウスL-細胞から単離した500ngのポリ(A)+RNAを、ジエチルピロカルボネート-
処理した水と混合して最終容量を20μlとし、70℃で5分間インキューベーショ
ンし、そして氷上で冷却した。このサンプルに、マウスUbr1 ORF(配列番号1の
nt313〜338)のアンチセンス鎖に相当する20ピコモルのプライマー、2μlの10
×PCRバッファー(パーキン−エルマー:Perkin-Elmer)、2μlの0.1M ジチオ
スレイトール(DTT)、1μlの10mM dNTPs、1μlの25mM MgCl2および1μlのウ
シ血清アルブミン(BSA;2mg/ml)を加えた。サンプルを42℃で2分間インキュ
ーベーションし、続いて1μlのSuperscriptII逆転写酵素(ギブコ:Gibco-BRL
)を加え、そして42℃でさらに40分間インキューベーションした。温度を55℃ま
で上げて、続いて1μlのRNAase H(ギブコ-BRL;2単位/μl)を加え、そして
20分間インキューベーションした。生成したcDNA生成物は、QIAquick PCR精製キ
ット(キアジェン:QIAGEN)を用いて精製し、そして50μlの水で溶出した。cDNA
が連結した5'オリゴ(dA)延長を生成するために、5μlの精製したcDNAを11.5μ
lの水で希釈し、70℃で5分間インキューベーションし、氷上で冷却し、次に1
μlの10×PCRバッファー(0.5×の最終濃度に)、1μlの25mM MgCl2、0.5μlのB
SA(2mg/ml)、0.5μlの10mM dCTPおよび0.25μlのターミナルトランスフェラ
ーゼ(ベーリンリガーマンハイム:Boehringer Mannheim)と混合した。37℃で
5分間インキューベーションした後、酵素はサンプルを65℃で10分間加熱するこ
とにより不活性化した。第1回目のRACE-PCR増幅は、10μlの10×PCRバッファー
、2.5mM MgCl2、オリゴ(dC)に連結した5μlのcDNA、Ubr1 ORF(配列番号1のnt3
06〜332)のアンチセンス鎖に相当する20ピコモルのプライマーおよび20ピコモ
ルのオリゴ(dA)アンカープライマーを含む100μlのサンプルで行った。サンプル
を94℃で5分間、次に57℃で8分間インキューベーションし、続いてAmpliTaq D
NA ポリメラーゼ(パーキン−エルマー)を加え、そして72℃で8分間インキュー
ベーションして、相補的なcDNA鎖を生成した。その後に35サイクルの3段階 PCR
増幅を行った。各工程には94℃で30秒、57℃で1分、そして72℃で2分間の連続
的なインキューベーションが含まれた。2μlの第1回目のPCR生成物を、同じ総
容量で利用される0.4ナノモルのT-アダプタープライマー(T-アンカープレー
トと同じであるが、T17を欠く)、およびUbr1 ORF(配列番号1のnt271〜293)
のアンチセンス鎖に対応する0.4ナノモルのプライマーを第2回目のPCRに使用し
た。PCRが生成したDNA断片を、pCR2.1ベクター(インビトロゲン)に挿入した。
生成したクローンの2つは、ATGコドンの114bp上流配列を提供し、これは上記AT
Gコドンの48bpおよび93bp上流に2つの連続した枠内終結コドンを含み、推定され
るMet開始コドンがUbr1 ORFのインビボ開始コドンと同様であることを示唆して
いる。
挿入物がマウスUbr1 ORFの部分的N-末端部分をコードし、そして同じフィルター
とプローブとしてクローン化した2.45kb挿入物との別のハイブリダイゼーション
ではさらに陽性のクローンが得られなかったので、2.45kb挿入物の下流領域を増
幅してそれを次のcDNAライブラリースクリーニングのプローブとして使用するた
めに3'-RACEを採用した。5'-RACE(上記)と同様に行った3'-RACEでは(3'-RACE
にはホモポリマーテーリングを排除したことを除く)、1.3kbの生成物を得(配
列番号1のnt1985〜3313に対応する)、これは2.45kb配列と465bp重複していた。
1.3kbの3'-RACE生成物の配列に基づき、1回以上の3'-RACEを行い、そして1.2kb
を得(マウスUbr1 cDNA配列のnt3039〜3835に対応する)、ここでは797bpのUbr1
cDNA配列がマウスのグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)mRNAの3'-UTR領域
に融合し、これはアーティファクトであると思われる。
(クローンテック)を、大腸菌(Escherichia.coli) C600Hf1にまき、3'-RACEか
らの配列を基にPCRで合成した標識化998bp-プローブ(配列番号1のnt2470〜346
7)とハイブリダイズさせた。陽性プラーク溶解物(またはファージλDNA)のPC
R分析、続いて部分的シークエンシングにより、0.6から4.6kbの範囲のサイズの1
4個の独立した各陽性クローンの挿入物サイズおよび相対的位置を決定した。そ
れらの中で、互いに重なり、そして完全長cDNAを覆う5個のクローンをBluescri
ptII SK+キットにサブクローン化し(3.0kbサイズのMR16、2.8kbサイズのMR17、
2.2kbサイズのMR19、1.4kbサイズのMR20、および4.6kbサイズのMR23)、そして両
鎖をシークエンシングした。特にORF領域において、少なくとも2つの独立した
クローン(cDNAライブラリースクリーニング、5'-または3'-RACEから)をシーク
エンシングした。それらの中でMR16は、最初のクローン(2.45kb、上記参照)の
推定上のATG開始コドンを、ATGコドンの48bp上流に枠内終結コドンを含む57bp-
マウスUbr1 5'-UTRより前に含んだ。このMR16の57bp-5'-UTR領域は、360bpのマ
ウス18SリボソームRNA配列(EMBL、寄託番号X00686)に先行し、これはライブラ
リーの構築中のアーティファクトと考えられる。M19は酵母UBR1にかなりの相同
性を示すORF、続いて41bp下流のポリ(A)付加シグナルに先行する終結コドン、こ
れに続いて9bp下流のポリ(A21)テールを含み、MR19がUbr1 C-末端領域および3'
-UTRを含むことを示唆している。M20はM16の3'-領域およびMR19の5'-領域と重複
し、M16、MR20およびMR19がマウスUbr1 cDNAの完全長ORFならびにまた3'-および
5'-Ubr1領域を網羅することを示唆している。このような3つのクローン(M16、
MR20およびMR19)を、1つの連続的な断片に連結して、57bp-5'UTR、5271bpUbr1
ORF(1757残基)および58bp-3'-UTRを含むMR26を生成した。具体的にはMR20の1.
2kb-EcoRI-XbaI断片をpBluescriptII SK+にサブクローン化してMR24を得た。続
いてMR19の2.2kb-XbaI断片をMR24にサブクローン化してMR25を作成した。MR25の
3kb-MscI-NotI断片をM16に挿入して、配列番号1に示す完全長のマウスUbr1 ORF
を含むMR26を生成した。
を使用して単離した。第1鎖cDNAは500ngのポリ(A)+RNAから、オリゴ(dT)プライ
ミングおよびSuperscriptII逆転写酵素(ギブコ-BRL)を使用して合成し、続い
て2単位のRNAaseH(ギブコ-BRL)で処理し、そしてQIAquick PCR精製キット(
キアジェン)により精製した。30ngの合成したcDNAは、AmpliTAaq DNAポリメラ
ーゼ(パーキン-エルマー)およびマウスUbr1 cDNA配列に相当する幾つかの異な
るプライマーの組を用いてPCRに使用した。1つの反応では1kbの生成物を生じ
、これをpCR2.1ベクター(インビトロゲン)にサブクローン化し、そしてシークエ
ンシングした。部分的なヒトUBR1 cDNA断片の配列を、配列番号2に示す。
delity PCR システム(ベーリンガーマンハイム)およびエキソン特異的プライ
マーを用いたPCRに使用した。PCR生成物はpCR2.1ベクター(インビトロゲン)に
サブクローン化して、HR8(挿入サイズ6.3kb)、HR6-4(挿入サイズ5.8kb)、HR
2-25(挿入サイズ3.6kb)、HR7-2(挿入サイズ5.4kb)を得た。上記の4つの挿
入物を部分的DNAシークエンシングにより分析し、そして100〜150bpの重複を含
むヒトUBR1遺伝子の〜21kbを網羅することを示した。このエキソン/イントロン
結合は、部分的シークエンシングにより決定した。
リ(A)+RNA(クローンテック)を含むマウスおよびヒトの多組織ノーザンブロッ
トは、PCR後にゲルから溶出したP32-標識プローブとハイブリダイズさせた(ヒ
トのブロットには1kb-ヒト UBR1 cDNA断片、そしてマウスUbr1 cDNA配列(配列
番号1)中のnt116〜2124およびnt4738〜5385にそれぞれ対応する2kbおよび648
bpのマウスUbr1 cDNA断片。ハイブリダイゼーションは製造元の手順に提案され
ているように行った。ブロット上のRNAサンプルの完全性は、それらに提供され
ているβ-アクチンプローブを用いて検査した。サザンブロット分析については
、常法によりマウスL-細胞およびヒト293細胞から単離し、そして種々の制限酵
素で消化したゲノムDNAを、マウスブロットについては1228bpまたは1169bpのマ
ウスUbr1 cDNAプローブ(それぞれ配列番号1のnt105〜1332およびnt610〜1778
に対応する)と、またはヒトのブロットには1kbのヒトUBR1 cDNAプローブと、高
い緊縮条件下(最終洗浄;55℃で0.1×SSC/0.1% SDS)または低い緊縮条件下(
最終洗浄;42℃で0.2×SSC/0.1% SDS)のいずれかでハイブリダイズさせた。
し交配の子孫は、(C57BL/6J×エム.スプレタス(M.spretus))F1メスとC57BL/6J
オスを記載されているように交配することにより形成した(Copeland and Jekin
s,Trens Genet.7:113-118(1991))。Ubr1座をマップするために全部で205匹のN2 マウスを使用した(詳細はテキストを参照にされたい)。DNA単離、制限酵素消
化、アガロースゲル電気泳動、サザンブロット転写およびハイブリダイゼーショ
ンは、本質的に記載されているように行った(Jenkinsら、J.Virol.43:26-36(19
82))。すべてのブロットはHybond-N+ナイロン膜(アマーシャム)を用いて調製
した。nt610〜1778に相当するマウスcDNAの1169bp断片を、[α32P]dCTPを用いて
ランダム プライムド ラベリングキット(random primed labeling kit)(ストラ
タジーン:Stratagene)を使用して標識し;洗浄は最終的に1.0×SSC、0.1% SDS
、65℃の緊縮度で行った。5.6,5.4および4.3kbの断片をScaI消化C57BL/6J DNA
で検出し、そして15.0kbの断片をScaI消化エム.スプレタス(M.spretus)DNAに検
出した。15.0kbのScaI エム.スプレタス(M.spretus)-特異的断片の存在または不
在は、戻し交配マウスで追跡した。Thbs1およびB2mを含め、Ubr1に関連する座に
関するプローブおよびRFLPの説明は、既に報告された(Lawlerら、Genomics 11:
587-600(1991))。この種間戻し交配について、1つの座がこれまでに報告され
なかった。網状赤血球のタンパク質バンド4.2(Epb4.2)のプローブは、C57BL/6J
DNA中の7.8kbのSphI断片およびエム.スプレタス(M.spretus)DNA中の14.0kbのSph I 断片を検出するヒトcDNAの〜800bpのEcoRI断片であった。組換え距離(recombi
nation distance)は、マップマネージャー(Map Manager)、バージョン2.6.5を
使用して算出した。遺伝子順序は、対立遺伝子分布パターンを説明するために必
要な組換え回数を最小にすることにより決定した。
を、臍帯血から単離したリンパ球の同調培養から調製したヒト染色体で行った(
Hengら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9509-9513(1992))。ヒトの染色体は、部
分的ヒトUBR1 cDNA断片(1kb、配列番号1のnt2540〜3532)に相当するヒトUBR
1ゲノムDNA断片(〜21kb)を含むプラスミド混合物(HR8、HR6-4、HR2-25およびH
R7-2)を用いて釣り上げた。プローブはビオチン化dATPを用いて、BRL BioNick ラベリングキットを使用して標識し(15℃、1時間)、染色体スプレッドにハ
イブリダイズさせ、そしてFITC-アビジンで検出した。シグナルはビオチン化ヤ
ギ抗-アビジンとインキューベーションし、続いて第2回目のインキューベーシ
ョンをFITC-アビジンを用いて行った。染色体のバンドパターンは、クロマチン
−結合蛍光色素4'-6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いて得た。ヒト
UBR1の染色体の局在化は、ハイブリダイゼーションシグナルの写真とDAPIバンド
パターンの写真とを重ね合わせることにより作成した。
れたいかなるタンパク質とも、たとえエス.セルビシエ(S.cerevisiae)UBR1タ
ンパク質、ウサギUbr1タンパク質の対とも有為な相同性を示さなかった。第1の
方法に類似した方法を使用し(ReissおよびHershko,J.Biol.Chem 265:3685-3690
(1990))、網状赤血球に由来するウサギUbr1タンパク質の2回目の別個の精製、
続いてトリプシン処理ペプチド配列の決定を行い、そして1回目の方法のものと
同一の3つのペプチド配列(PEP1、PEP2およびPEP3)を得、精製したタンパク質
および決定した配列が確実であることが支持された。
重していない)を、ぺプチド配列の内部領域を増幅する縮重オリゴヌクレオチド
プライマーおよびペプチド内PCRを使用して得た(図1、および材料および方法
を参照にされたい)。独特な配列はペプチド内PCRから決定し、そして14のウサ
ギペプチド配列の幾つかをコードする配列の領域に対応した(例えば、T122、T1
20およびPEP2)。マウスλgt11肝臓cDNAに由来するT120のペプチド内PCRで、T12
0のウサギゲノムDNAからのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする独特な
配列(第3コドンに重複性を含む)を生じた。独特な配列PEP1は可変であった(8
クローン中、4つの異なる種類)。この可変性の独特な配列の理由は不明である
。続いて、ペプチド内PCRに由来する独特の配列を持つオリゴヌクレオチドPCRプ
ライマーを、元の縮重PCRプライマーと一緒に使用して、ウサギ肝臓cDNAライブ
ラリーに由来するペプチド配列間のウサギUbr1 cDNA断片の増幅に使用した(ペ
プチド間PCR)(図1)。ペプチド間PCRの1つは、T120およびT134を両末端に、
そしてまた内部にT100を持つ392bp-PCR生成物を生じ、ウサギUbr1 cDNA断片が精
製したタンパク質に相当することが確実であることを示している。392bp-ウサギ
UBR1 cDNA断片に相当する392bp-マウスUbr1 cDNA断片も、マウスcDNAライブラリ
ーから得られた(材料および方法を参照にされたい)。392bp-マウスUbr1 cDNA
断片のシークエンシングにより、392bp-ウサギUbr1 cDNA断片のT120、T100およ
びT134ペプチド配列に対応する3つの領域が明らかとなった。392bp-ウサギおよ
びマウスUbr1 cDNA断片は、ヌクレオチドおよびタンパク質配列とそれぞれ88%
および89%の同一性を共有した。それらは、エス.セルビシエ(S.cerevisiae)U
BR1を含むデータベース中の任意の配列に有意な相同性を示さなかった。
に基づくプローブを使用したスクリーニングでは、0.6〜4.6kbのサイズ範囲の幾
つかの陽性クローンを得た。その中で、ATG開始コドンの48bp上流に枠内終結コ
ドンを持つ57bp-5'-UTRの先にあるATG開始コドンを含む3.0kbサイズのMR16、Ubr
1 ORFの中央領域を含む1.4kbサイズのMR20、そしてUbr1 ORFのC-末端領域および
58bp-3'-UTRを含む2.2kbサイズのMR19がcDNA ORFの全長を覆った。MR23(4.6kb
の挿入物)の部分配列と他のクローン(MR3、MR16、MR20およびMR19)との比較
およびその配列の調査により、これが逆方向のFriend マウス白血病ウイルスの
ポリプロテイン配列により5'-領域が挟まれたUbr1 ORF(aa2703から)のC-末端
の半分を含むことが明らかとなり、これはアーティファクトの結果であると考え
られる。さらにMR23のUbr1 ORFに長い3'-UTR(1010bp)が続き、ここでMR19中のポ
リ(A)付加部位がバイパスしていたが、この意義は不明である。
(180kDa)と同様な1757-残基(200kDa)タンパク質をコードする5271bpから成った
(ReissおよびHershoko,J.Biol.Chem 265:3685-3690(1990))。48および93bp上
流の2つの枠内終結コドンに先行する推定の(第1)ATG開始コドンの上流配列
は、-3位のAおよび+4位のGという点でコザック則(Kozak's rules)にほぼ一致
した(Kozak,M.,J.Biol.Chem.266:19867-19870(1991))。第1ATGコドンのすぐ
下流に、2以上のATGコドンがある。この両第2および第3ATGコドン(OFR中第
6および第12アミノ酸)は、−3位にプリンを(それぞれGおよびA)、そして
+4位にGを有し、それらが可能な別の開始コドンであることを示している。OF
RのN-末端の1つの顕著な特徴は、OFRの初めの13残基の中で7個(6個の正およ
び1個の負)が変化したアミノ酸であることである。第2および第3ATGコドン
、ならびに高度に変化した(負)N-末端13残基の意味は、不明である。
て比較的低い全体的相同性を示したが(22%の同一性および48%の類似性)(エ
ス.セルビシエ(S.cerevisiae)UBR1配列に関しては、GeneBank寄託番号、P1981
2を参照にされたい)、特定のサブドメインが有意な相同性を示した。より詳細
には、6個の特別な相同性領域が同定され、2つのタンパク質の機能的関係を示
している。このような領域は任意に領域1〜VIと命名し、このような命名はN-末
端からC-末端への位置に基づく順序で割り当てた(すなわち領域Iは相同性のVI
領域の最もC-末端側である)。さらに、ナショナル センター フォー バイオテ
クノロジー インフォメーション(National Center for Biotechnology Informa
tion)を通じてBLASTプログラムを使用した配列データーベース中の利用可能なこ
のようなマウスUbr1配列の比較により(Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1
990))、有意な相同性を表す幾つかのタンパク質が明らかになった;1927 aa-カ
エノルハビディティス エレガンス(Caenorhabditis elegans) ORF(GeneBank 寄
託番号U88308)(32%の同一性および53%の類似性;シー.エレガンス(C.eleg ans ) Ubr12と命名)、1872 aa-エス.セルビシエ(S.cerevisiae) ORF(GeneBa
nk 寄託番号Z73196)(21%の同一性および47%の類似性; エス.セルビシエ( S.cerevisiae ) UBR2と命名)、2168 aa-シー.エレガンス(C.elegans)ORF(Ge
neBank 寄託番号U40029)(21%の同一性および45%の類似性;シー.エレガン
ス(C.elegans)Ubr2と命名)および792 aa-アラビドプシス サリアナ(Arabidops is thaliana ) CER3(エセリフェラム(eceriferum) 3:26%の同一性および49%の
類似性)。このようなタンパク質の外に、マウスUbr1のN-末端付近の領域に対応
するカンジダ アルビカンス(Candida albicans)の147 aa-部分的ORF(http://a
lces.med.umn.edu/bin/genelist?LUBR1;シー.アルビカンス(C.albicans)UBR1
と命名)、およびマウスUbr1のN-末端付近の領域に対応するシゾサッカロミセス
ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)の272 aa-部分ORF(GeneBank寄託番号M26
699;エス ポンベ(S.pombe)UBR2と命名)も、UBR1ファミリーの員に有意な相同
性を示した。このようなタンパク質の全体的な相同性は比較的低いが(17〜32%
の同一性)、それらのタンパク質配列の並び方は、幾つかの顕著な領域を明らか
とし、マウスUbr1および酵母UBR1はこれまでに機能的に知られていないそれらの
関連するタンパク質と一緒に、別個のUBR1ファミリーに属することを示唆してい
る。この事実は、本明細書に開示されたマウスおよびヒトUbr1配列の単離および
同定により排他的に認識が可能となった。
領域(領域I)であり、これはすべての領域の中でも最高の相同性を示す(マウ
スUbr1とシー.エレガンス(C.elegans)Ubr1との間で61%の同一性および75%の
類似性)。この領域は、他の既知の任意のCys/Hisリッチモチーフとは一致しな
い独特なCys/Hisリッチドメインを含む。このCys/Hisドメインは、マウスUbr1、
シー.エレガンス(C.elegans)Ubr1、エス.セルビシエ(S.cerevisiae) UBR1、
セルビシエ(S.cerevisiae) UBR2、シー.エレガンス(C.elegans)Ubr2およびカ
ンジダ アルビカンス(Candida albicans)の部分的N-末端ORF(http://alces.me
d.umn.edu/bin/genelist?LUBR1)(シー.アルビカンス(C.albicans)UBR1と命名
)を含め、すべてのUBR1ファミリーの員に保存されているが、領域VおよびVIの
みを含むアラビドプシス サリアナ(Arabidopsis thaliana)CER3は除く。このCys
/His構造はジンクフィンガーのようであるが、構造中のCysおよびHis残基の数お
よび間隔は、他の既知のジンクフィンガーとは一致しなかった。領域Vも、すべ
てのUBR1ファミリーの一員に保存されている独特なCys/Hisドメインを含む。こ
のCys/Hisドメインをこれまでに知られているCys/His構造と比較することにより
、領域V中のCys/HisドメインはRING-H2フィンガー、サブファミリーRINGフィン
ガーに属することが分かった(Borden および Freemont,Curr.Opin Struct.Biol 6 :395-401(1996))。RING-H2フィンガーを含有するタンパク質の幾つかの既知
の例は、PSMP、CELG、FAR1、PEP3およびPEP5(各配列に関する文献は、Freemont
,P.S.,Ann,NY Acad.Sci.684:174-192(1993)を参照にされたい)。UBR1ファミリ
ーのRING-H2の1つの明らかな特徴は、ループの長さ(53aa〜85aa)が既知のRIN
G-H2フィンガータンパク質(12aa〜35aa)よりも長いことである。UBR1タンパク
質間の他の広範囲の相同性は、C-末端付近の115-aa領域VI(マウスUbr1中)に観
察される(マウスUbr1の領域VIに対して24〜50%の同一性および46〜70%の類似
性)。シー.エレガンス(C.elegans)Ubr1の領域VIは、マウスUbr1と最高の相同
性を示した(50%の同一性および70%の類似性)。しかしマウスUbr1の相同体で
あるエス.セルビシエ(S.cerevisiae)UBR1の領域VIは、エス.セルビシエ(S.c erevisiae )UBR2、シー.エレガンス(C.elegans)Ubr2、エイ.サリアナ(A.thali ana )CER3およびエス.ポンベ(S.pombe)UBR2を含むUBR1ファミリーの員の中でも最
低の相同性を示した(24%の同一性および46%の類似性)。さらにすべての他の
関連するタンパク質の領域VIが各タンパク質のC-末端から4〜14aaに位置するが
、エス.セルビシエ(S.cerevisiae)UBR1は荷電残基が高度に豊富な(主に負)1
32および159残基テールをさらに有した(36%および33%)。このテールの意義
は不明である。領域IVはまた、シー.エレガンス(C.elegans)UBR2を除くすべて
のUBR1ファミリーの員に高い相同性を示す。BLASTを使用して調査した時、この
領域にかなりの相同性を示すタンパク質は無かった。
A配列のnt2218〜3227に相当する部分的なヒトUBR1 cDNA(1kb)を、ヒト293細
胞から単離されたポリ(A)+RNAを使用してRT-PCRによりクローン化した。ヌクレ
オチドおよび推定アミノ酸配列はマウスUbr1 cDNA配列とそれぞれ90%および93
%の同一性を共有した。1kbのcDNAおよび〜21kbのゲノムDNAに相当する部分的
ヒトUBR1ゲノムDNA断片(それぞれ6.3kb、5.8kb、3.6kbおよび5.4kbの挿入サイ
ズのHR8、HR6-4、HR2-25およびHR7-2、100〜150bpの重複を含む)を、鋳型とし
てヒト293細胞に由来するゲノムDNAおよびヒトUBR1 cDNA配列に基づくプライマ
ーを使用してゲノムPCRによりクローン化した。クローン化したゲノムDNA断片の
部分的DNAシークエンシングは、〜21kbのゲノムDNA領域が49bp〜155bpの長さの
範囲の11エキソンから成ることを示した。すべてのエキソン/イントロン結合は
、哺乳動物の核のmRNA前駆体スプライス部位の特徴であるコンセンサスGTおよび
AGジヌクレオチドを含んだ(ShapiroおよびSenapathy,Nucleic Acids Res.15:71
55-7174(1987))。
ゼーション マウスUbr1およびヒトUBR1の発現は、マウスのブロットについては2kb(N-末
端領域)または640bp(C-末端領域)マウスUbr1 cDNA断片を、そしてヒトのブロ
ットについては1kb-ヒトUBR1 cDNA断片を使用して、ノーザンブロット分析によ
り試験した。〜8.0kbのポリA+転写物はユビキチン的に種々のマウス組織中で、
いずれかのプローブ(N-またはC-末端領域)を使用して、骨格筋、心臓および脳
で比較的高く、そして腎臓で最低レベルで検出された。精巣で誘導されたUbr1 m
RNAは2種類で存在した:少ないものは他の組織の〜8.0kbのUbr1 mRNAと同時に
移動したが、主要なものは〜6kbの見掛け上のサイズを有し、これは精巣が誘導
するNtan1 mRNAのノーザンブロットに類似し、これは少ないものが他の組織の〜
1.4kbのNtan1 mRNAと同時に移動するが、主要なものは〜1.1kbの見掛け上のサイ
ズを有した(Grigoryevら、J.Biol.Chem.271:28521〜28532(1996))。精巣特異
的なUbr1およびNtan1ノーザンパターンが単離中のRNA分解、RNAの特異的開裂、
またはE214k mRNAのような2つの別の一次転写産物(異なるポリ(A)付加部位ま
たはスプライシングから)の結果であるかどうかは不明である。酵母N-末端法則
の成分であるエス.セルビシエ(S.cerevisiae)UBC2のマウス相同体であるマウ
スE214kも、骨格筋で最高のmRNA発現レベルを示す(Grigoryevら、J.Biol.Chem. 271 :28521〜28532(1996))。ウサギE214kORFの上流領域は、MyoD、筋肉−特異的
転写因子への幾つかの推定される結合部位を含む(Weintraubら、Genes Devel.5 :1377-1386(1991))。ヒトUBR1 mRNAは、マウスUbr1と類似のノーザンブロット
パターンを示した。
×SSC/0.1% SDS、55℃)または低い(最終洗浄:0.2×SSC/0.1% SDS、42℃)緊
縮条件下のいずれかで、やや単純なバンドパターンが明らかとなり、ゲノム中で
のUbr1遺伝子の1コピーの存在、およびヌクレオチドレベルでUbr1に緊密に関連
した構造を持つ遺伝子の不在が示唆される。しかしアミノ酸レベルでのみUbr1と
緊密に関連した哺乳動物のE3(s)の存在を排除することはできない。実際に幾つ
かの証拠では、ウサギ網状赤血球溶解物中のE3βの存在が示され、これはN-末端
法則で別の哺乳動物ユビキチン-タンパク質リガーゼが認識する小さい非荷電N-
末端(Ala、Ser、Thr:III型N-末端不安定化残基)であると考えられている(Gon
daら、J.Biol.Chem.264:16700-16712(1989))。それらは異なる基質特異性を有
するが、ウサギUbr1およびE3βは、幾つかの特性を共有する(HershkoおよびCie
chanover,Ann.Rev.Biochem.61:761-807(1992))。それゆえに、これら2種のタ
ンパク質配列は同様であるらしい。
×C57BL/6J]マウスの交配により誘導された子孫を使用して種間戻し交配分析に
より決定した。この種間戻し交配マッピングのパネルは、すべての常染色体なら
びにX染色体中によく分布している2400座にわたりタイプを決定した(Copeland
and Jenkins,Trens Genet.7:113-118(1991))。C57BL/6Jおよびエム.スプレタ
ス(M.spretus)DNAを数種の酵素で消化し、そして情報を提供する制限断片長多型
(RFLP)についてマウスcDNA Ubr1プローブを使用してサザンブロットハイブリダ
イゼーションにより分析した。15.0kb ScaIエム.スプレタス(M.spretus)RFLP(
材料および方法を参照にされたい)を使用して戻し交配マウスのUbr1座の分離を
追跡した。マッピングの結果は、Ubr1がThbs1、Epb4.2およびB2mに連結したマウ
ス染色体2の中央領域に位置することが示された。66匹のマウスを各マーカーに
ついて分析し、そして分離分析に示すが、最高133匹のマウスを幾つかのマーカ
ー対についてタイプを決定した。各座はさらなるデータを使用して、組換え頻度
について対に関する組み合わせを分析した。各対の座について分析したマウスの
総数に対して組換え体染色体を表すマウスの総数の比率および最も見込みのある
遺伝子順序は:セントロメア−Thbs1−4/133−Ubr1−0/113−Epb4.2−1/122−B2 m 。組換え頻度(センチモルガン(cM)±標準誤差での遺伝子距離として表す)は
、Thbs1−3.0+/-1.5−[Ubr1,Epb4.2]−0.8+/-0.8−B2m。タイプを決めた113匹の
動物において、Ubr1とEpb4.2の間で共通して検出された組換え体は無く、2つの
座が互いに2.7cM内にあることを示唆している(95%の上の信頼限界)。
ップ位置を報告する複合マウス関連マップと比較した(メリーランド州、バーハ
ーバーのザ ジャクスソン ラボラトリー(The Jackson Laboratory)で管理され
ているコンピューター化されたデーターであるマウスゲノムデータベースから提
供された)。Ubr1は、この座の改変が予想される表現型のマウス突然変異を欠く
複合マップの領域中にマップされた。マウス染色体2の中央領域は、ヒト染色体1
5qと相同性の領域を共有する。マウスこの間隔中でのUbr1の配置は、ヒト相同体
も15qにマップされることを示唆している。
ローブとしてヒトUBR1ゲノムクローン(HR8、HR6-4、HR2-25およびHR7-2)を使
用してFISHによりヒトUBR1の染色体マッピングにより正確にした。材料および方
法に記載した条件下で、ハイブリダイゼーション効率はこのようなプローブにつ
いて約91%であった(検査した100の分裂数で、それらの91が染色体の1対につ
いてシグナルを示した)。DAPIのバンド化は特異的な染色体を同定するために使
用したので、プローブからのシグナルと染色体15からのロングアームとの間の割
り当てが得られた。詳細な位置を10枚の写真をまとめることに基づきさらに決定
した。使用した条件下でFISH検出によりさらに取り上げられる座は無いので、UB
R1はヒト染色体の15q15-15q21.1に位置し、これはUbr1のマウス染色体マッピン
グの結果とよく一致する。
より、マウスUbr1 cDNAをクローニングするために使用した方法の該略図である
。
Claims (34)
- 【請求項1】 核酸配列が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号1
の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、N-末端法則経路の
認識成分をコードする核酸配列。 - 【請求項2】 核酸配列が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号2
の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、N-末端法則経路の
認識成分をコードする核酸配列。 - 【請求項3】 核酸配列が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号1
の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、N-末端法則経路の
認識成分をコードする核酸配列を含むDNA発現ベクター。 - 【請求項4】 核酸配列が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号2
の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、N-末端法則経路の
認識成分をコードする核酸配列を含むDNA発現ベクター。 - 【請求項5】 核酸配列が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号1
の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、N-末端法則経路の
認識成分をコードする核酸配列を含むDNA発現ベクターで形質転換された細胞。 - 【請求項6】 原核細胞である請求項5に記載の細胞。
- 【請求項7】 真核細胞である請求項5に記載の細胞。
- 【請求項8】 核酸配列が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号2
の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、N-末端法則経路の
認識成分をコードする核酸配列を含むDNA発現ベクターで形質転換された細胞。 - 【請求項9】 原核細胞である請求項8に記載の細胞。
- 【請求項10】 真核細胞である請求項8に記載の細胞。
- 【請求項11】 緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号1の核酸配
列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする核酸配列を使用して組換えDN
A発現法により生成されるN-末端法則経路の認識成分。 - 【請求項12】 緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号2の核酸配
列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする核酸配列を使用して組換えDN
A発現法により生成されるN-末端法則経路の認識成分。 - 【請求項13】 Ubr1遺伝子の発現を抑制することを含んで成る、N-末端法
則経路が媒介する筋肉低下の抑制法。 - 【請求項14】 発現がUbr1遺伝子をコードするmRNAを、生理学的条件下で
Ubr1 mRNAに特異的にハイブリダイズする抑制分子と接触させ、これによりUbr1
mRNAの翻訳を抑制することにより抑制される、請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 抑制分子が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号
1の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 抑制分子が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号
2の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、請求項14に記載の方法。 - 【請求項17】 UBR1遺伝子産物の活性を阻害することを含んで成る、N-末
端法則経路が媒介する筋肉低下の抑制法。 - 【請求項18】 UBR1遺伝子産物の活性が、発現したUbr1遺伝子産物をUbr1
遺伝子産物に特異的に結合する分子と接触させ、これによりその活性を阻害する
ことにより阻害される、請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 Ubr1遺伝子産物が、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
配列番号1の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする核酸配列
によりコードされる、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 Ubr1遺伝子産物が、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
配列番号2の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする核酸配列
によりコードされる、請求項18に記載の方法。 - 【請求項21】 Ubr1遺伝子産物の特異的インヒビターを同定する方法であ
って: a)機能的なUbr1遺伝子産物をコードする核酸を使用して組換えDNA発現法によ
り生成されるN-末端法則経路の認識成分を提供し;そして b)工程a)の認識部位に結合し、そして認識成分の活性を阻害する化合物につ
いて小有機分子をスクリーニングする、 ことを含んで成る上記方法。 - 【請求項22】 工程a)の核酸が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配
列番号1の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、請求項2
1に記載の方法。 - 【請求項23】 工程a)の核酸が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配
列番号2の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、請求項2
1に記載の方法。 - 【請求項24】 Ubr1遺伝子の発現を抑制することを含んで成る、細胞内病
原体の感染を処置する方法。 - 【請求項25】 Ubr1遺伝子をコードするmRNAを、生理学的条件下でUbr1 m
RNAに特異的にハイブリダイズする抑制分子と接触させ、これによりUbr1 mRNAの
翻訳を抑制することにより発現が抑制される、請求項24に記載の方法。 - 【請求項26】 抑制分子が、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番
号1の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、請求項25に記載の方法。 - 【請求項27】 抑制分子が、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番
号2の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、請求項25に記載の方法。 - 【請求項28】 Ubr1遺伝子の発現を抑制することを含んで成る、細胞内病
原体の感染を処置する方法。 - 【請求項29】 Ubr1遺伝子産物の活性が、発現したUbr1遺伝子産物とUbr1
遺伝子産物に特異的に結合する分子とを接触させ、これによりその活性を阻害す
ることにより阻害される、請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 Ubr1遺伝子産物が、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
配列番号1の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする核酸配列
によりコードされる、請求項29に記載の方法。 - 【請求項31】 Ubr1遺伝子産物が、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
配列番号2の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする核酸配列
によりコードされる、請求項29に記載の方法。 - 【請求項32】 ヒトUbr1の特異的インヒビターを同定する方法であって、
方法が: a)機能的なUbr1遺伝子産物をコードする核酸配列を提供し; b)工程a)の核酸配列を組換えDNA法を使用して細胞中で発現させ; c)遺伝子産物を結晶化し; d)タンパク質の原子構造をX−線回折法を使用して決定し;そして e)認識ドメインに特異的に結合する小分子を設計するために、合理的タンパク
質設計の原理を応用する、 ことを含んで成る上記方法。 - 【請求項33】 工程a)の核酸が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配
列番号1の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、請求項3
2に記載の方法。 - 【請求項34】 工程a)の核酸が緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配
列番号2の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、請求項3
2に記載の方法。
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