KR20240049267A - Dna 절단 활성의 증진을 나타내는 광범위한 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 발견된 스트렙토코커스 피오게네스 cas9에서의 신규한 돌연변이 - Google Patents
Dna 절단 활성의 증진을 나타내는 광범위한 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 발견된 스트렙토코커스 피오게네스 cas9에서의 신규한 돌연변이 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240049267A KR20240049267A KR1020247004048A KR20247004048A KR20240049267A KR 20240049267 A KR20240049267 A KR 20240049267A KR 1020247004048 A KR1020247004048 A KR 1020247004048A KR 20247004048 A KR20247004048 A KR 20247004048A KR 20240049267 A KR20240049267 A KR 20240049267A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cas9 protein
- crispr
- cas endonuclease
- endonuclease system
- isolated
- Prior art date
Links
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims abstract description 120
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 69
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 title description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 title description 5
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 title description 4
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 title description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 30
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 claims description 19
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 abstract 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 45
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102220469729 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit beta-2_D54K_mutation Human genes 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 102100023823 Homeobox protein EMX1 Human genes 0.000 description 2
- 101001048956 Homo sapiens Homeobox protein EMX1 Proteins 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102220555663 E3 ubiquitin-protein ligase UHRF1_A68D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102220546632 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit beta-2_S55N_mutation Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- -1 crRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102200009110 rs387907074 Human genes 0.000 description 1
- 102220018583 rs587776981 Human genes 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 사용하기 위한 돌연변이체 Cas9 핵산 및 단백질, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질에 관한 것으로서, 상기 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에서 활성이 있고, 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다. 본 발명은 또한 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타내는, 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 핵산, 리보뉴클레오단백질 복합체, 및 돌연변이체 Cas9 단백질을 갖는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템을 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 35 U.S.C. 119에 따라 "NOVEL MUTATIONS IN STREPTOCOCCUS PYOGENES CAS9 DISCOVERED BY BROAD SCANNING MUTAGENESIS DEMONSTRATE ENHANCEMENT OF DNA CLEAVAGE ACTIVITY"의 명칭으로, 2021년 7월 2일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/217,881호에 대한 우선권을 주장하고, 각 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 그 전체 내용은 본원에 참조로 통합된다. _________일자로 생성된, ASCII 카피는 파일명이 IDT01-020-PRO_ST25.txt이고, 크기는 _________ 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 Cas9 돌연변이체 유전자, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 및 부위 표적 절단 활성 (on-site targeted cleavage activity)을 개선하기 위한 CRISPR-Cas 시스템의 조성물에서 이의 용도에 관한 것이다.
SpCas9는 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) 적응 면역계를 활용하는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제이다. Cas9는 일반적으로 프로토스페이서 (protospacer)로 지칭되는 20개의 뉴클레오티드 DNA 표적 서열에 상보적인 RNA 가이드를 활용한다. SpCas9에 대한 정확한 DNA 표적을 인식하는데 중요한 것은 crRNA, 및 프로토스페이서 바로 하류의 3-bp 서열인 정준 "NGG" 프로토스페이서 인접 모티프 (protospacer adjacent motif: PAM)를 모두 포함한다. 상기 Cas9-gRNA 리보뉴클레오단백질 (ribonucleoprotein: RNP) 복합체는 이중가닥 DNA 절단 (double-stranded DNA break: DSB)을 매개하며, 그 다음에 이는 비-상동성 말단 결합 (non-homologous end joining: NHEJ, 전형적으로 절단 부위에 돌연변이 또는 indels을 도입함), 또는 적합한 주형 핵산이 존재하는 경우 정확한 편집을 위한 상동성 지시 복구 (homology directed repair: HDR) 시스템에 의해 복구된다.
현재, 온-타겟 효능 (on-target potency)에 대한 상당한 비용이 들지만, SpCas9의 특이성을 개선하여 오프-타겟 편집 (off-target editing)을 완화하기 위한 많은 점 돌연변이 (point mutations)가 확인되었다[1]. 그러나, 오프-타겟 편집이 덜 우려되는 응용 분야 (예: 고-처리량 유전자 스크린)의 경우, 모든 표적 가능한 부위에 걸쳐 균일한 편집 효율을 갖는 고활성 SpCas9가 바람직하다. 또한, 대체 PAM 선호도를 가진 많은 SpCas9 변이체가 개발되었지만, 이들의 활용은 감소된 온-타겟 효능으로 제한된다[3]. 돌연변이 유발을 통해 SpCas9의 온-타겟 활성을 증가시키면 RNP로서 전달되는 경우 인간 세포에서 이러한 PAM 변이체들의 성능 저하를 복구할 수 있다. 또한, SpCas9의 온-타겟 활성은 염기 편집 (base editing) 및 프라임 편집 (prime editing)과 같은 SpCas9를 기반으로 구축된 진보된 유전자 편집 플랫폼에 대한 속도-제한 단계인 것으로 제안되었다.
그러므로, Cas9 게놈 편집의 특이성을 개선하는 방법에 대한 필요성이 남아 있다. 구체적으로, 해당 분야에서 널리 채택되고 있는 다양한 유전자 편집 플랫폼의 성능을 개선하기 위해 SpCas9의 온-타겟 활성을 증진 또는 증가시키기 위한 신규한 점 돌연변이를 확인할 필요가 있다[4]. 이러한 개시내용은 해당 분야에서 널리 채택되고 있는 다양한 유전자 편집 플랫폼의 성능을 개선할 수 있는 SpCas9의 온-타겟 활성을 증진시키기 위해 신규한 점 돌연변이를 생성해야 한다는 오랫동안 느껴온 필요성에 대한 해결책을 제공한다[4].
발명의 간략한 요약
본 발명은 CRISPR 시스템에 사용하기 위한 Cas9 돌연변이체 유전자 및 폴리펩티드, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
제1 양상에서, 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질이 제공된다. 상기 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질은 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-결합된 단백질 엔도뉴클레아제 시스템 ("CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템")에서 활성이 있다. 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다.
제2 양상에서, 단리된 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체가 제공된다. 상기 RNP 복합체는 돌연변이체 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체를 포함한다. 상기 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템으로서 활성이 있고, 생성된 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다.
제3 양상에서, 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에서 활성이 있고, 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다.
제4 양상에서, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템이 제공된다. 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 돌연변이체 Cas9 단백질 및 gRNA를 포함한다. 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다.
제5 양상에서, 온-타겟 편집 활성이 증가된 유전자 편집 (gene editing)을 수행하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 적절한 gRNA와 복합체화된 돌연변이체 Cas9 단백질 (예: crRNA:tracrRNA 복합체 또는 sgRNA)을 갖는 활성 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템과 후보 편집 DNA 표적 부위 유전자좌를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 상호작용은 예를 들어, 살아있는 동물, 살아있는 세포, 또는 인 비트로 단리된 DNA에서와 같이 모든 상황에서 발생할 수 있다.
도 1은 자연 로그 스케일의 농축된 돌연변이 복제물 1 및 복제물 2의 예시되는 Pearson 상관관계를 나타낸다. 본 도면은 복제물들 간의 양호한 일치를 보여주며, 절단 활성이 증가한 SpCas9 돌연변이체의 단편을 나타낸다.
도 2는 미스매치된 가이드 RNA를 활용하여 DNA 절단을 증진시키는 개별 신규한 SpCas9 돌연변이의 예를 나타낸다. 절단 분석 (cleavage assay)은 돌연변이체가 야생형 SpCas9보다 선택 시에 더 높은 생존율을 나타내는 초기 스크리닝 과정의 검증을 보여준다. 대장균 (E. coli)의 생존은 독소-코딩 플라스미드의 의도된 표적 부위를 절단하는 Cas9의 능력에 의존하였다. 패널 A-M은 '미스매치 15' 가이드 RNA를 갖는 야생형 SpCas9 플라스미드 (A); 완전하게-일치된 가이드 RNA를 갖는 야생형 SpCas9 (B); 가이드 RNA가 없는 야생형 SpCas9 플라스미드 (C): 패널 D-M: '미스매치 15' 가이드 RNA로 돌연변이 유발 스크린에서 확인된 돌연변이체 단일 아미노산 돌연변이가 있는 SpCas9 폴리펩티드: SpCas9 D54W (D); SpCas9 D54K (E); SpCas9 N46L (F); SpCas9 S6T (G); SpCas9 T67D (H); SpCas9 S55N (I); SpCas9 D54A (J); SpCas9 R71W (K); SpCas9 A68D (L); 및 SpCas9 V16I (M)를 나타낸다.
도 3a는 인간 세포에서 온-타겟 편집 효율이 증진된 예시되는 SpCas9 돌연변이체를 나타낸다. 대장균 (E.coli) 활성 분석에서 유익한 효과가 있는 추정 돌연변이가 Hifi-Cas9 (R691A)의 배경에 도입되었다. 돌연변이체 단백질을 정제하고, 3개의 표적 부위를 편집하여 HEK293 세포에서 평가하였다. 신규한 Cas9 돌연변이체의 온-타겟 편집 효율. 점선은 각 표적에서 참조 단백질 (R691A)의 편집 효율을 강조한다.
도 3b는 참조 단백질 (R691A)에 대한 각 돌연변이체의 정규화된 편집 효율을 나타낸다. 주목할 만한 점은 D54A/K가 R691A의 온-타겟 활성을 유의미하게 증진시켜서, WT-SpCas9를 능가한다는 점이다.
도 3c는 EMX1 오프-타겟 부위에서 신규한 Cas9 돌연변이체의 오프-타겟 편집을 나타낸다. WT-SpCas9 만이 측정 가능한 오프-타겟 효과를 나타내었다. 모든 신규한 Cas9 돌연변이체는 매우 특이적인 상태를 유지하였다.
도 2는 미스매치된 가이드 RNA를 활용하여 DNA 절단을 증진시키는 개별 신규한 SpCas9 돌연변이의 예를 나타낸다. 절단 분석 (cleavage assay)은 돌연변이체가 야생형 SpCas9보다 선택 시에 더 높은 생존율을 나타내는 초기 스크리닝 과정의 검증을 보여준다. 대장균 (E. coli)의 생존은 독소-코딩 플라스미드의 의도된 표적 부위를 절단하는 Cas9의 능력에 의존하였다. 패널 A-M은 '미스매치 15' 가이드 RNA를 갖는 야생형 SpCas9 플라스미드 (A); 완전하게-일치된 가이드 RNA를 갖는 야생형 SpCas9 (B); 가이드 RNA가 없는 야생형 SpCas9 플라스미드 (C): 패널 D-M: '미스매치 15' 가이드 RNA로 돌연변이 유발 스크린에서 확인된 돌연변이체 단일 아미노산 돌연변이가 있는 SpCas9 폴리펩티드: SpCas9 D54W (D); SpCas9 D54K (E); SpCas9 N46L (F); SpCas9 S6T (G); SpCas9 T67D (H); SpCas9 S55N (I); SpCas9 D54A (J); SpCas9 R71W (K); SpCas9 A68D (L); 및 SpCas9 V16I (M)를 나타낸다.
도 3a는 인간 세포에서 온-타겟 편집 효율이 증진된 예시되는 SpCas9 돌연변이체를 나타낸다. 대장균 (E.coli) 활성 분석에서 유익한 효과가 있는 추정 돌연변이가 Hifi-Cas9 (R691A)의 배경에 도입되었다. 돌연변이체 단백질을 정제하고, 3개의 표적 부위를 편집하여 HEK293 세포에서 평가하였다. 신규한 Cas9 돌연변이체의 온-타겟 편집 효율. 점선은 각 표적에서 참조 단백질 (R691A)의 편집 효율을 강조한다.
도 3b는 참조 단백질 (R691A)에 대한 각 돌연변이체의 정규화된 편집 효율을 나타낸다. 주목할 만한 점은 D54A/K가 R691A의 온-타겟 활성을 유의미하게 증진시켜서, WT-SpCas9를 능가한다는 점이다.
도 3c는 EMX1 오프-타겟 부위에서 신규한 Cas9 돌연변이체의 오프-타겟 편집을 나타낸다. WT-SpCas9 만이 측정 가능한 오프-타겟 효과를 나타내었다. 모든 신규한 Cas9 돌연변이체는 매우 특이적인 상태를 유지하였다.
발명의 상세한 설명
본원에 기재된 본 발명의 방법 및 조성물은 CRISPR-Cas 시스템에 사용하기 위한 돌연변이체 SpyCas9 핵산 및 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 야생형 단백질에 비해 온-타겟 편집 활성이 증가된 신규한 Cas9 돌연변이체를 서술한다. 본 발명의 이러한 이점 및 다른 이점, 및 추가의 본 발명의 특징은 본원에 제공된 발명의 설명으로부터 자명할 것이다.
본 발명을 설명하는 문맥에서 (특히 하기 청구범위의 문맥에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 지시어의 사용은 본원에 달리 명시하지 않거나 또는 문맥에 분명히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포괄하는", 및 "함유하는"은 달리 명시하지 않는 한 개방 용어 (즉, "포함하지만, 이에 한정되지 않는"을 의미함)로 해석되어야 한다. 본원에서 수치들의 범위를 기재하는 것은 본원에 달리 명시하지 않는 한, 범위 내에 속하는 각 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로 제공하는 것으로 의도되고, 각 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 명시하지 않거나 또는 문맥에 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의 및 모든 예, 또는 예시되는 언어 (예: "예컨대")의 사용은 달리 주장하지 않는 한 단순히 본 발명을 보다 잘 설명하려는 의도이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 비-청구된 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
용어 "야생형 Cas9 단백질 (wild-type Cas9 protein)" ("WT-Cas9" 또는 "WT-Cas9 단백질")은 자연 발생 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 동일한 아미노산 서열 (예: 서열 번호: 1)을 갖고 적절한 가이드 RNA (예: sgRNA 또는 이중 crRNA:tracrRNA 조성물)와 조합하여 활성 CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제 시스템을 형성하는 경우 생화학적 및 생물학적 활성을 갖는 단백질을 포함한다.
용어 "야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템 (wild-type CRISPR/Cas endonuclease system)"은 야생형 Cas9 단백질 및 적절한 gRNA를 포함한 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템을 지칭한다.
문구 "활성 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다"는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템이 해당 표적 서열에 대해 동일한 gRNA를 포함하는 경우, 서열 번호: 1의 야생형 Cas9 단백질을 포함하는 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템의 온-타겟 편집 활성의 증진 또는 증가를 나타내는 돌연변이체 Cas9 단백질을 포함하는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템의 활성을 지칭한다. CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템의 바람직한 온-타겟 활성은 gRNA 및 관심 표적 서열에 의존하며; 돌연변이체 Cas9 단백질을 갖는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템의 이러한 바람직한 온-타겟 활성의 증가가 본원에 예시된다.
용어 "폴리펩티드 (polypeptide)"는 하나 초과의 아미노산을 포함하는 선형 또는 분지형 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 단백질 또는 이의 단편 또는 이의 융합체를 포함하며, 단 이러한 단백질, 단편 또는 융합체는 유용한 생화학적 또는 생물학적 활성을 유지한다.
융합 단백질은 전형적으로 단백질에 추가의 아미노산 정보가 공유 결합으로 부착된, 해당 단백질에 대해 본래의 것이 아닌 추가의 아미노산 정보를 포함한다. 이러한 추가의 아미노산 정보는 융합 단백질의 정제 또는 확인을 가능하게 하는 태그를 포함할 수 있다. 이러한 추가의 아미노산 정보는 융합 단백질을 세포 내로 수송하고 및/또는 세포 내에서 특정 위치로 수송되도록 할 수 있는 펩티드를 포함할 수 있다.
용어 "단리된 핵산 (isolated nucleic acid)"은 DNA, RNA, cDNA, 및 이를 코딩하는 벡터를 포함하고, 여기서 DNA, RNA, cDNA 및 벡터는 세포 구성성분과 같이, 이들이 유래되거나 또는 결합될 수 있는 다른 생물학적 물질이 존재하지 않는다. 전형적으로, 단리된 핵산은 세포 구성성분과 같이, 이들이 유래되거나 또는 결합될 수 있는 다른 생물학적 물질으로부터 정제될 것이다.
용어 "단리된 야생형 Cas9 핵산 (isolated wild-type Cas9 nucleic acid)"은 야생형 Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 핵산이다. 단리된 야생형 Cas9 핵산의 예로는 대장균 (E. coli) 또는 인간 세포에서 효율적인 발현을 위해 디자인된 코돈-최적화 버전, 예컨대 서열 번호: 2 및 3에 의해 코딩된 핵산을 포함한다.
용어 "단리된 돌연변이체 Cas9 핵산 (isolated mutant Cas9 nucleic acid)"은 돌연변이체 Cas9 단백질, 예컨대 R691A 돌연변이 (서열 번호: 4)를 갖는 Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 핵산이다. 단리된 돌연변이체 Cas9 핵산의 예로는 대장균 (E. coli) 또는 인간 세포에서 효율적인 발현을 위해 디자인된 코돈-최적화 버전, 예컨대 서열 번호: 5 및 6에 의해 각각 코딩된 핵산을 포함한다.
용어 "길이-변형된 (length-modified)"은 해당 용어가 RNA를 변형시키는 바와 같이, 뉴클레오티드 서열이 결여된 참조 RNA의 단축되거나 또는 절단된 형태 또는 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 참조 RNA의 연장된 형태를 지칭한다.
용어 "화학적으로-변형된 (chemically-modified)"은 해당 용어가 RNA를 변형시키는 바와 같이, 화학적으로-변형된 뉴클레오티드 또는 상기 RNA에 공유결합으로 연결된 비-뉴클레오티드 화학 기를 함유하는 참조 RNA의 형태를 지칭한다. 화학적으로-변형된 RNA는 본원에 기재된 바와 같이, 일반적으로 올리고뉴클레오티드 합성 절차를 사용하여 제조된 합성 RNA를 지칭하며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 RNA 올리고뉴클레오티드의 합성 중에 혼입된다. 그러나, 화학적으로-변형된 RNA는 또한, 합성 후에 적절한 변형제로 변형된 합성 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
용어 ALT-R®은 해당 용어가 RNA를 변형시키는 (예: crRNA, tracrRNA, 가이드 RNA, 또는 sgRNA) 바와 같이, 단리된, 화학적으로 합성된, 합성 RNA를 지칭한다.
용어 ALT-R®은 해당 용어가 단백질을 변형시키는 (예: Cas9 단백질) 바와 같이, 단리된, 재조합 단백질을 지칭한다.
적합 (competent) CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 이중 crRNA:tracrRNA 조합 또는 키메라 단일-분자 sgRNA 중 하나로부터 선택된 단리된 Cas9 단백질 및 단리된 가이드 RNA와 형성된 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체를 포함한다. 일부 구체예에서, crRNA 및 tracrRNA의 단리된 길이-변형된 및/또는 화학적으로-변형된 형태는 정제된 Cas9 단백질, Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 mRNA, 또는 발현 벡터에서 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자와 조합된다. 특정 분석법에서, crRNA 및 tracrRNA의 단리된 길이-변형된 및/또는 화학적으로-변형된 형태는 Cas9 유전자를 코딩하는 내인성 (endogenous) 발현 카세트로부터 Cas9 단백질을 안정하게 발현하는 세포주 내로 도입될 수 있다. 다른 분석법에서, crRNA 및 tracrRNA의 길이-변형된 및/또는 화학적으로-변형된 형태들의 혼합물은 돌연변이체 Cas9 mRNA 또는 돌연변이체 Cas9 단백질 중 어느 하나와 조합하여 세포 내로 도입될 수 있다.
온-타겟 유전자 편집 활성이 증가된 돌연변이체 Cas9 단백질
제1 양상에서, 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질이 제공된다. 상기 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질은 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-결합된 단백질 엔도뉴클레아제 시스템 ("CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템")에서 활성이 있다. 생성된 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다.
SpCas9의 박테리아-기반 유도 진화를 수행하여 절단 활성이 증진된 돌연변이를 확인하였다. SpCas9의 위치 1-75에 대한 아미노산 수준에서 가능한 모든 점 돌연변이를 함유하는 심층-스캐닝 돌연변이 유발 라이브러리 (deep-scanning mutagenesis library)를 처음에 형성하였고, 대부분의 클론은 하나의 돌연변이만을 함유한다[2]. 이러한 타입의 라이브러리를 사용하면 박테리아 스크린에서 야생형 (WT) 단백질에 대한 상대 생존율을 측정하여 각 점 돌연변이의 표현형을 직접 평가할 수 있다. SpCas9 활성은 일반적으로 대장균 (E.coli)에서 매우 높기 때문에, 절단 활성을 하향 조정하기 위해 미스매치가 있는 표적 부위 및 crRNA를 선택하여, 활성이 증진된 돌연변이체를 확인하는데 적합한 선택 압력을 형성하였다 (표 1).
고활성 돌연변이체를 확인하기 위해, 독소 플라스미드를 보유하는 스크리닝 균주를 SpCas9 라이브러리와 독소 플라스미드의 단일 부위를 표적으로 하는 미스매치 crRNA로 형질전환하였다. 회수 및 유도 후에, 세포를 유도와 함께 선택 배지에 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 생존 대장균 세포에 의해 운반된 SpCas9 발현 플라스미드를 추출 및 정제하였다. 유입 및 선택된 플라스미드 라이브러리 모두를 NGS로 서열 분석하여, 두 라이브러리 모두에서 SpCas9의 각 위치에서 돌연변이의 빈도를 결정하였다. 각 점 돌연변이의 상대 생존율은 선택된 라이브러리와 입력 라이브러리 사이의 정규화된 빈도의 비율로 계산하였다. 선택 시에 세포 생존 정도가 SpCas9의 절단 활성을 나타내므로, WT에 비해 선택 중에 농축된 모든 변이체는 활성이 증진된 변이체일 것이다.
표 2 및 도 1은 미스매치된 gRNA를 사용하여 절단 활성을 측정하는 박테리아 스크린에서 SpCas9의 266개의 점 돌연변이의 표현형을 요약하였다. 3가지 생물학적 복제물은 높은 컨시스턴시 (consistency)로 수행하였고, 이를 통해 증진된 활성을 가진 신규한 SpCas9 변이체의 대규모 컬렉션을 신뢰할 수 있게 단리할 수 있었다. 그러므로, 본 발명자들은 대장균 절단 분석과 관련하여 여러 후보를 선택적으로 검증하였다. 개별 돌연변이체 플라스미드를 클로닝하고, 미스매치된 gRNA의 존재하에 대장균 균주를 스크리닝하기 위해 전달하였다. 다수의 신규한 SpCas9 돌연변이체는 야생형 단백질에 비해 대장균에서 DNA 절단의 유의미한 개선을 나타내었고, 이는 선택 시에 생존율의 실질적인 증가로 표시된다 (도 2). 이러한 결과는 본 발명의 고-처리량 스크린의 결과가 매우 정확하다는 것을 시사하며, 이는 인간 세포의 맥락에서 추가 검증을 위한 대규모 후보 풀을 제공하였다.
다음, 본 발명자들은 인간 세포의 게놈 편집과 관련하여 신규한 Cas9 점 돌연변이의 성능을 평가하였다. 본 발명자들은 Hifi-Cas9 (R691A) (폴리펩티드 서열: 서열 번호: 4; 코돈-최적화된 핵산 서열: 서열 번호: 5 및 6)에 대한 대장균 스크린에서 확인된 9개의 점 돌연변이를 선택적으로 도입하였다. 각 돌연변이체 단백질을 대장균에서 발현시키고, 순차 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 각 돌연변이체의 온-타겟 편집 효율은 3개의 표적 부위에 대해 평가하였다 (표 3).
만족스럽게도, 이러한 점 돌연변이들은 Hifi-Cas9의 온-타겟 효능을 상승시켰고 (도 3a, b), 대장균에서 생성된 이전 결과를 검증하였다. 주목할 만한 점은 D54A는 구체적으로 Hifi-Cas9에 의해 잘 편집되지 않은 저활성 부위 (HPRT38231)에서 온-타겟 효능의 가장 유의미한 부스트를 초래하였다. 이러한 신규한 변이체 (D54A/R691A)의 활성은 WT-SpCas9보다 훨씬 더 높았다 (도 3a, b). 본 발명자들은 EMX1 오프-타겟 부위 1에서 신규한 Cas9 변이체의 오프-타겟 편집 수준을 추가로 연구하였다 (표 3). 놀랍게도, 어떤 돌연변이체도 오프-타겟 효과를 유의미하게 증가시키지 않았으며, 이는 이러한 신규한 돌연변이체들이 Hifi-Cas9 (R691A)에 적합하고 R691A와 다른 기전을 통해 온-타겟 및 오프-타겟 부위에서 전반적인 Cas9 단백질 활성에 영향을 준다는 것을 시사한다. 결론적으로, 본 발명의 데이터로부터 박테리아 스크린에서 발견한 신규한 점 돌연변이가 우수한 표적 특이성을 유지하면서 Hifi-Cas9의 온-타겟 성능을 증진시킬 수 있으며, 이는 인간 게놈 공학에서 WT-SpCas9를 직접 대체할 수 있음을 보여주었다.
바람직한 단일 돌연변이체 Cas9 단백질은 표 2에서 확인된 위치들 중 하나에 도입된 WT-Cas9에서 치환 돌연변이를 포함한다. 추가 치환 돌연변이가 단일 돌연변이체 Cas9 단백질 아미노산 서열의 아미노산 배경에 포함될 수 있으며, 단 생성된 돌연변이체 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템으로서 활성이 있어야 하고, 여기서 생성된 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다.
바람직한 이중 돌연변이체 Cas9 단백질은 표 2에 제시된 돌연변이들 중 하나와 조합된 R691에 도입된 WT-Cas9에서의 돌연변이를 포함한다. 매우 바람직한 이중 돌연변이체 Cas9 단백질은 표 2에 제시된 돌연변이들 중 하나와 조합된 R691A에 도입된 WT-Cas9에서의 돌연변이를 포함한다. 추가 치환 돌연변이가 이중 돌연변이체 Cas9 단백질 아미노산 서열의 아미노산 배경에 포함될 수 있으며, 단 생성된 돌연변이체 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템으로서 활성이 있어야 하고, 여기서 생성된 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다. 표 2에 제시된 예시되는 돌연변이는 예를 들어 2017년 10월 10일 및 2018년 4월 26일자로 각각 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 15/729,491 및 15/964,041 (각각 Attorney Docket Nos. IDT01-009-US 및 IDT01-009-US-CIP)에 개시된 것과 같은 다른 위치들에서 조합될 수 있으며, 이의 내용들은 본원에 참조로 통합된다.
제2 양상에서, 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체가 제공된다. 상기 RNP는 돌연변이체 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체를 포함한다. 제1 측면에서, 상기 gRNA는 crRNA 및 tracrRNA를 화학량론적 (1:1) 비율로 포함한다. 제2 측면에서, 상기 crRNA는 해당 유전자좌에 대해 특정 편집 표적 부위에 대한 Alt-R® crRNA (Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA (US))를 포함하고, 상기 tracrRNA는 Alt-R® tracrRNA (Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA (US))를 포함한다. 다른 측면에서, 상기 gRNA는 sgRNA를 포함한다. 바람직한 돌연변이체 Cas9 단백질은 전술된 바와 같은 것을 포함한다.
제3 양상에서, 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 바람직한 단리된 핵산은 전술된 바와 같은 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩한다. 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩하는 예시되는 단리된 핵산은 재조합 DNA 절차 또는 화학적 합성 방법을 사용하여 야생형 Cas9 단백질을 코딩하는 핵산으로부터 쉽게 생성될 수 있다. 이러한 목적에 바람직한 핵산은 박테리아 (예: 대장균) 또는 포유동물 (예: 인간) 세포에서 Cas9 단백질의 발현에 최적화된 것을 포함한다. 대장균 및 사람 세포에서 WT-Cas9 (서열 번호: 1)를 발현하는 예시되는 코돈-최적화된 핵산은 각각 서열 번호: 1 및 2를 포함한다. 대장균 및 인간 세포에서 돌연변이체 Cas9 단백질 (예: R691A 돌연변이체 Cas9 단백질; 서열 번호: 7)을 발현하는 예시되는 코돈-최적화된 핵산은 각각 서열 번호: 3 및 4를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 WT-Cas9 및 돌연변이체 Cas9의 융합 단백질에 관한 것으로서, 여기서 WT-Cas9 및 돌연변이체 Cas9의 코딩 서열은 진핵 세포에서 융합 단백질의 핵 국소화 ("NLS")를 위해 코딩하는 아미노산 서열 또는 상기 단백질의 정제를 촉진하는 아미노산 서열에 융합된다. 예시되는 융합 단백질은 WT-Cas9 아미노산 서열 또는 돌연변이체 Cas9 아미노산 서열 (예: R691A 돌연변이체 Cas9 단백질) 중 어느 하나를 포함한다.
제1 측면에서, 상기 단리된 핵산은 전술된 돌연변이체 Cas9 단백질들 중 하나를 코딩하는 mRNA를 포함한다. 제2 측면에서, 상기 단리된 핵산은 전술된 돌연변이체 Cas9 단백질들 중 하나에 대한 유전자를 코딩하는 DNA를 포함한다. 바람직한 DNA는 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자를 코딩하는 벡터를 포함한다. 이러한 전달 방법은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 바와 같은 플라스미드 및 다양한 바이러스 전달 벡터를 포함한다. 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은 또한 적절한 발현 벡터를 사용하여 세포에 안정하게 형질전환되어 돌연변이체 Cas9를 구성적으로 또는 유도적으로 발현하는 세포주를 생산할 수 있다. 전술된 방법은 또한 배아에 적용하여 돌연변이체 Cas9를 구성적으로 또는 유도적으로 발현하는 자손 동물을 생산할 수 있다.
제4 양상에서, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템이 제공된다. 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 돌연변이체 Cas9 단백질을 포함한다. 바람직한 돌연변이체 Cas9 단백질은 전술한 것을 포함한다. 제1 측면에서, 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 DNA 발현 벡터에 의해 코딩된다. 일 구체예에서, 상기 DNA 발현 벡터는 플라스미드-유래 벡터 (plasmid-borne vector)이다. 제2 구체예에서, 상기 DNA 발현 벡터는 박테리아 발현 벡터 및 진핵세포 발현 벡터로부터 선택된다. 제3 측면에서, 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 돌연변이체 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체를 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체를 포함한다. 제1 측면에서, 상기 gRNA는 crRNA 및 tracrRNA를 화학량론적 (1:1) 비율로 포함한다. 제2 측면에서, 상기 crRNA는 해당 유전자좌에 대한 특정 편집 표적 부위에 대한 ALT-R® crRNA (Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA (US))를 포함하고, 상기 tracrRNA는 ALT-R® tracrRNA (Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA (US))를 포함한다. 다른 측면에서, 상기 gRNA는 sgRNA를 포함한다.
제5 양상에서, 온-타겟 편집 활성이 증가된 유전자 편집을 수행하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 돌연변이체 Cas9 단백질을 갖는 활성 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템과 후보 편집 표적 부위 유전자좌를 접촉시키는 단계를 포함한다. 제1 측면에서, 상기 방법은 표 2에 제시된 위치들 중 하나에 도입된 서열 번호: 1의 WT-Cas9에 돌연변이를 갖는 단일 돌연변이체 Cas9 단백질을 포함한다. 추가 치환 돌연변이가 단일 돌연변이체 Cas9 단백질 아미노산 서열의 아미노산 배경에 포함될 수 있으며, 단 생성된 돌연변이체 Cas9 단백질은 상기 방법에서 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템으로서 활성이 있어야 하고, 여기서 생성된 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다.
다른 측면에서, 상기 방법은 표 2에 제시된 돌연변이들 중 하나와 조합된 위치 R691에 도입된 서열 번호: 1의 WT-Cas9에 돌연변이를 갖는 Cas9 단백질 변이체를 포함한다. 추가 치환 돌연변이가 이중 돌연변이체 Cas9 단백질 아미노산 서열의 아미노산 배경에 포함될 수 있으며, 단 생성된 돌연변이체 Cas9 단백질은 상기 방법에서 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템으로서 활성이 있어야 하고, 여기서 생성된 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타낸다.
Cas9-기반 툴 (Cas9-based tools)의 응용은 다수이고 다양하다. 이들은 식물 유전자 편집, 효모 유전자 편집, 포유동물 유전자 편집, 살아있는 동물의 장기에서 세포의 편집, 배아의 편집, 녹아웃 (knockout)/녹인 (knock-in) 동물 계통의 신속한 생성, 질병 상태의 동물 모델의 생성, 질병 상태의 교정, 리포터 유전자의 삽입, 및 전체 게놈 기능적 스크리닝을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
실시예 1
선택된 야생형 및 돌연변이체 Cas9 단백질들의 DNA 및 아미노산 서열.
하기 목록은 본 발명에 기재된 상이한 야생형 (WT) 및 돌연변이체 Cas9 뉴클레아제를 보여준다. 많은 경우 하나 초과의 코돈이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있기 때문에, 당업자는 많은 다양한 DNA 서열이 동일한 아미노산 (AA) 서열을 코딩/발현할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 하기에 나타낸 DNA 서열은 단지 예시로서만 제공되고, 동일한 단백질 (예: 동일한 아미노산 서열)을 코딩하는 다른 DNA 서열도 예상된다. 추가적인 특징, 요소 또는 태그들이 NLS 도메인 등과 같은 상기 서열에 추가될 수 있다는 것을 알 수 있다. WT Cas9 및 돌연변이체 R691A Cas9의 예는 해당 단백질의 아미노산 및 DNA 서열을 Cas9 단독 및 C-말단 및 N-말단 SV40 NLS 도메인 및 HIS-태그에 융합된 Cas9로 나타낸다. 다른 Cas9 돌연변이체의 경우, 아미노산 서열만이 제공되지만, 포유동물 세포에서 사용하기 위한 재조합 단백질 생산에 사용하기 용이하도록 NLS 및 His-태그 도메인을 유사하게 부가할 수 있을 것으로 사료된다. WT 서열과 상이한 돌연변이는 밑줄이 있는 진한 글꼴을 사용하여 확인된다.
서열 번호: 1
WT SpyCas9 AA 서열.
서열 번호: 2
WT SpyCas9 DNA 서열, 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈.
서열 번호: 3
WT SpyCas9 DNA 서열, H. 사피엔스 (H. sapiens)에서 발현을 위해 최적화된 코돈.
서열 번호: 4
R691A 돌연변이체 SpyCas9 AA 서열.
서열 번호: 5
R691A 돌연변이체 SpyCas9 DNA 서열, 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈.
서열 번호: 6
R691A 돌연변이체 SpyCas9 DNA 서열, H. 사피엔스에서 발현을 위해 최적화된 코돈.
본원에 인용된 출판물, 특허 출원, 및 특허를 포함하는 모든 참조문헌은 각 참조문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조에 의해 통합되는 것으로 표시되고 본원에 그 전체가 기재된 것과 동일한 범위로 참조에 의해 통합된다.
본 발명의 바람직한 구체예들이 본원에 기재되며, 여기에는 본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최상의 방식을 포함한다. 이러한 바람직한 구체예의 변형들은 전술한 설명을 읽으면 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련된 당업자가 그러한 변형을 적절하게 사용할 것으로 기대하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 설명된 것과는 다른 방식으로 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 준거법이 허용하는 한, 본원에 첨부된 청구범위에 기재된 주제 (subject matter)의 모든 수정 및 균등물을 포함한다. 또한, 본원에 달리 명시되지 않거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 전술한 요소들의 모든 가능한 변형의 조합이 본 발명에 포함된다.
Claims (24)
- 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질로서, 상기 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에서 활성이 있고, 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성 (on-target editing activity)의 증가를 나타내는 것인 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질은
(a) 표 2에 제시된 위치들 중 하나로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 단일 치환 돌연변이; 또는
(b) 표 2에 제시된 돌연변이와 조합된 위치: R691로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이
로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질. - 청구항 1에 있어서, 상기 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질은 표 2에 제시된 돌연변이들 중 하나와 조합된 위치 R691A로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 단리된 돌연변이체 Cas9 단백질.
- 돌연변이체 Cas9 단백질; 및
gRNA 복합체를 포함하는 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체 (ribonucleoprotein complex)로서,
상기 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템으로서 활성이 있고, 상기 생성된 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타내는 것인 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체. - 청구항 4에 있어서, 상기 gRNA는 crRNA 및 tracrRNA를 화학량론적 (1:1) 비율로 포함하는 것인 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체.
- 청구항 5에 있어서, 상기 gRNA는
해당 유전자좌에 대한 특정 편집 표적 부위에 대한 ALT-R® crRNA를 포함하는 단리된 crRNA; 및
ALT-R® tracrRNA를 포함하는 tracrRNA를 포함하는 것인 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체. - 청구항 5에 있어서, 상기 gRNA는 sgRNA를 포함하는 것인 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체.
- 청구항 5에 있어서, 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은
(a) 표 2에 제시된 위치들 중 하나로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 단일 치환 돌연변이; 또는
(b) 표 2에 제시된 돌연변이와 조합된 위치: R691로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이
로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체. - 청구항 5에 있어서, 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은 표 2에 제시된 돌연변이들 중 하나와 조합된 위치 R691A로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 단리된 리보뉴클레오단백질 복합체.
- 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에서 활성이 있고, 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타내는 것인 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
- 청구항 10에 있어서, 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은
(a) 표 2에 제시된 위치들 중 하나로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 단일 치환 돌연변이; 또는
(b) 표 2에 제시된 돌연변이와 조합된 위치: R691로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이
로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 핵산. - 청구항 11에 있어서, 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은 표 2에 제시된 돌연변이들 중 하나와 조합된 위치 R691A로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 돌연변이체 Cas9 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
- 돌연변이체 Cas9 단백질 및 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템으로서, 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타내는 것인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템.
- 청구항 13에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 DNA 발현 벡터에 의해 코딩되는 것인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템.
- 청구항 13에 있어서, 상기 DNA 발현 벡터는 플라스미드-유래 벡터 (plasmid-borne vector)를 포함하는 것인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템.
- 청구항 13에 있어서, 상기 DNA 발현 벡터는 박테리아 발현 벡터 및 진핵생물 발현 벡터로부터 선택되는 것인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템.
- 청구항 13에 있어서, 상기 gRNA는 crRNA 및 tracrRNA를 화학양론적 (1:1) 비율로 포함하는 것인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템.
- 청구항 17에 있어서, 상기 crRNA는 해당 유전자좌에 대한 특정 편집 표적 부위에 대한 ALT-R® crRNA를 포함하고, 상기 tracrRNA는 ALT-R® tracrRNA를 포함하는 것인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템.
- 청구항 13에 있어서, 상기 gRNA는 sgRNA를 포함하는 것인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템.
- 청구항 13에 있어서, 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은
(a) 표 2에 제시된 위치들 중 하나로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 단일 치환 돌연변이; 또는
(b) 표 2에 제시된 돌연변이와 조합된 위치: R691로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이
로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템. - 청구항 13에 있어서, 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은 표 2에 제시된 돌연변이들 중 하나와 조합된 위치 R691A로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템.
- 온-타겟 편집 활성이 증가된 유전자 편집 (gene editing)을 수행하는 방법으로서,
후보 편집 표적 부위 유전자좌를 돌연변이체 Cas9 단백질을 갖는 활성 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 활성 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 온-타겟 편집 활성의 증가를 나타내는 것인 유전자 편집을 수행하는 방법. - 청구항 22에 있어서, 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은
(a) 표 2에 제시된 위치들 중 하나로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 단일 치환 돌연변이; 또는
(b) 표 2에 제시된 돌연변이와 조합된 위치: R691로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이
로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 방법. - 청구항 22에 있어서, 상기 돌연변이체 Cas9 단백질은 표 2에 제시된 돌연변이들 중 하나와 조합된 위치 R691A로부터 선택된 서열 번호: 1의 WT-Cas9 단백질에 도입된 이중 치환 돌연변이로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163217881P | 2021-07-02 | 2021-07-02 | |
| US63/217,881 | 2021-07-02 | ||
| PCT/US2022/036079 WO2023278886A2 (en) | 2021-07-02 | 2022-07-05 | Novel mutations in streptococcus pyogenes cas9 discovered by broad scanning mutagenesis demonstrate enhancement of dna cleavage activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240049267A true KR20240049267A (ko) | 2024-04-16 |
Family
ID=82748576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020247004048A KR20240049267A (ko) | 2021-07-02 | 2022-07-05 | Dna 절단 활성의 증진을 나타내는 광범위한 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 발견된 스트렙토코커스 피오게네스 cas9에서의 신규한 돌연변이 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230203505A1 (ko) |
| EP (1) | EP4363567A2 (ko) |
| JP (1) | JP2024529260A (ko) |
| KR (1) | KR20240049267A (ko) |
| AU (1) | AU2022303346A1 (ko) |
| CA (1) | CA3224881A1 (ko) |
| WO (1) | WO2023278886A2 (ko) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL310721A (en) * | 2015-10-23 | 2024-04-01 | Harvard College | Nucleobase editors and their uses |
| AU2017339542A1 (en) * | 2016-10-07 | 2019-04-11 | Integrated Dna Technologies, Inc. | S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same |
| US11242542B2 (en) * | 2016-10-07 | 2022-02-08 | Integrated Dna Technologies, Inc. | S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same |
-
2022
- 2022-07-05 AU AU2022303346A patent/AU2022303346A1/en active Pending
- 2022-07-05 US US17/857,262 patent/US20230203505A1/en active Pending
- 2022-07-05 EP EP22748593.5A patent/EP4363567A2/en active Pending
- 2022-07-05 WO PCT/US2022/036079 patent/WO2023278886A2/en active Application Filing
- 2022-07-05 KR KR1020247004048A patent/KR20240049267A/ko unknown
- 2022-07-05 JP JP2023579717A patent/JP2024529260A/ja active Pending
- 2022-07-05 CA CA3224881A patent/CA3224881A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2022303346A1 (en) | 2024-01-18 |
| WO2023278886A3 (en) | 2023-03-02 |
| US20230203505A1 (en) | 2023-06-29 |
| JP2024529260A (ja) | 2024-08-06 |
| EP4363567A2 (en) | 2024-05-08 |
| WO2023278886A2 (en) | 2023-01-05 |
| CA3224881A1 (en) | 2023-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230133277A1 (en) | S. pyogenes cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same | |
| US11913014B2 (en) | S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same | |
| CN107922931B (zh) | 热稳定的Cas9核酸酶 | |
| AU2019222568B2 (en) | Engineered Cas9 systems for eukaryotic genome modification | |
| AU2019319230B2 (en) | Novel mutations that enhance the DNA cleavage activity of acidaminococcus sp. Cpf1 | |
| JP2022523189A (ja) | Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６のＣＡＳ１２Ａ変異型遺伝子およびそれらによってコードされるポリペプチド | |
| CN106754811A (zh) | 一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用 | |
| CN113249362A (zh) | 经改造的胞嘧啶碱基编辑器及其应用 | |
| KR20240049267A (ko) | Dna 절단 활성의 증진을 나타내는 광범위한 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 발견된 스트렙토코커스 피오게네스 cas9에서의 신규한 돌연변이 | |
| CN103275917A (zh) | 一种tev蛋白酶表达工程菌及其构建和应用 | |
| CN106459940B (zh) | 新型过氧化氢酶信号序列及利用其的过氧化氢酶表达方法 | |
| Swaminathan et al. | Molecular Cloning of the Three Base Restriction Endonuclease R. C viJI from Eukaryotic Chlorella Virus IL-3A | |
| AU2021240021A1 (en) | Methods and biological systems for discovering and optimizing lasso peptides | |
| JP2008043275A (ja) | 毒性を有するタンパク質の発現方法 | |
| EP4209589A1 (en) | Miniaturized cytidine deaminase-containing complex for modifying double-stranded dna | |
| Esquerra et al. | Identification of the EH CRISPR-Cas9 system on a metagenome and its application to genome engineering | |
| CN117701542A (zh) | 胞嘧啶脱氨酶SfSddA、包含其的碱基编辑器及应用 |