CN112011524B

CN112011524B - 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用

Info

Publication number: CN112011524B
Application number: CN202010479382.6A
Authority: CN
Inventors: 孙际宾; 陈久洲; 郑平; 朱成超; 郭轩; 周文娟; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2040-05-29
Also published as: CN112011524A; KR20200138089A; JP2020195375A

Abstract

本发明提供一种5‑氨基乙酰丙酸合成酶(ALA合成酶)，所述ALA合成酶的C端末位氨基酸残基缺失或为非丙氨酸，和/或所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1的第403位的氨基酸残基缺失或为非丙氨酸，和/或所述ALA合成酶的C端末位添加1‑N个任意氨基酸残基且具有ALA合成酶活性。本发明还提供了制备该酶的方法，含有该酶的表达载体、宿主细胞、该酶在ALA生产中的应用以及改造ALA合成酶以提高其活性的方法。

Description

5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及5-氨基乙酰丙酸合成酶的突变体及其宿主细胞和应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB12等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ALA在医药、农业、饲料和保健食品等领域应用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。近年来，利用微生物经C4途径发酵生产ALA已经得到了产业化应用。

5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALA合成酶)是C4途径合成ALA以及四吡咯化合物的关键酶和限速酶，其酶学性质的好坏直接影响ALA合成的效率。近年来，包括放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter，CN1322132C)、嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus，CN1974758B)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides，CN103146694B)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris，CN103981203B)等大量不同来源的ALA合成酶被克隆鉴定并用于ALA高产菌株的构建。然而，上述ALA合成酶均为不同生物体内天然存在的酶源，这些酶本身的活性不高(Menget al.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253；Menget al.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253)难以在工程菌中应用。

近年来，随着酶工程和蛋白质工程技术的快速发展，通过理性设计提高酶的催化活性等性质已被广泛应用。但是目前关于在ALA合成酶的理性设计和改造方面的研究并不多，现有的报道主要涉及真核生物来源的ALA合成酶，Turbeville等将两个小鼠来源的ALA合成酶融合表达后可提高其催化效率(Turbeville et al.Archives of Biochemistry&Biophysics,2011,511(1):107-117)，Lendrihas等通过构建小鼠红细胞中ALA合成酶II的突变体库，筛选得到了酶活提高的ALA合成酶突变体(Lendrihas et al.Journal ofBiological Chemistry,2010,285(18):13704)。上述研究虽然获得了酶活提高的ALA合成酶，但由于真核生物来源的ALA合成酶在细菌中表达活性较低，但并未用于ALA的生物合成。

此外，作为ALA合成过程中的关键酶，ALA合成酶活性的提高可以加快工程菌合成ALA的催化效率，减少自身蛋白合成和降解过程中能量的损耗，进而提升工程菌的稳定性和生产性能，降低ALA生产成本，对促进ALA在农牧等领域的应用有重要的价值。

因此，本领域急需开发活性高的ALA合成酶，实现ALA的低成本生物法生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活性改善的ALA合成酶，提高ALA合成酶活性的方法、以及利用得到的ALA合成酶进行ALA生产的方法。

在第一方面，本发明提供一种ALA合成酶或其活性片段，其特征在于：

a.所述ALA合成酶的氨基酸序列的C端末位的氨基酸残基缺失或为非丙氨酸；

和/或

b.所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第403位的氨基酸残基缺失或为非丙氨酸；

和/或

c.所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的第401位的氨基酸残基缺失或为非丙氨酸；

和/或

d.所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的第403位或407位的氨基酸残基缺失或为非丙氨酸；

和/或

e.所述ALA合成酶的C端末位添加1-N个任意氨基酸残基，优选添加1-10个、更优选添加1-6个、更优选添加1-3个、最优选添加1个氨基酸残基且具有ALA合成酶功能的多肽。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶通过突变获得。

在优选的实施方式中，突变前，所述ALA合成酶是氨基酸序列的第401、403、407位或C端末位的氨基酸残基是丙氨酸且具有ALA合成酶活性的多肽。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶可以来源于各种物种，包括但不限于放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；优选沼泽红假单胞菌。

在进一步优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有50％以上，优选60％以上，更优选70％以上，更优选80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性；或所述ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:42所示氨基酸序列具有80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性；或所述ALA合成酶的氨基酸序列与SEQID NO:43所示氨基酸序列具有80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性。在优选的实施方式中，所述ALA合成酶：

a.其第403位或C端末位的氨基酸残基或者对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第403位或C端末位的氨基酸残基缺失或为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met；

和/或

b.其第401位或C端末位的氨基酸残基或者对应于SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的第401位或C端末位的氨基酸残基缺失或为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met；

和/或

c.其第403或407位或C端末位的氨基酸残基或者对应于SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的第403或407位或C端末位的氨基酸残基缺失或为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met；

和/或

d.C端末位添加1-10个、更优选添加1-6个、更优选添加1-3个、最优选添加1个任意氨基酸残基且具有ALA合成酶功能的多肽，所述任意氨基酸残基为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Ala。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶：

和/或

d.所述ALA合成酶的C端末位添加1-6个、更优选添加1-3个、最优选添加1个任意氨基酸残基且具有ALA合成酶功能的多肽，所述任意氨基酸残基为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Ala。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶的C端末位添加的氨基酸残基是Glu或Gln。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且

a.第403位或C端末位的氨基酸残基缺失或为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val；

和/或

b.C端末位添加1-6个、更优选添加1-3个、最优选添加1个任意氨基酸残基且具有ALA合成酶功能的多肽，所述任意氨基酸残基为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Ala。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，且

a.第401位或C端末位的氨基酸残基缺失或为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val；

和/或

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示，且

a.第403位或407位或C端末位的氨基酸残基缺失或为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val；

和/或

在第二方面，本发明提供第一方面所述的ALA合成酶或其活性片段的编码核酸序列。

在第三方面，本发明提供包含第一方面所述的ALA合成酶或其活性片段的编码核酸序列的表达载体。

在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第一方面所述的ALA合成酶或其活性片段。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞包含第三方面所述的表达载体或在其基因组中整合有第二方面所述的编码核酸序列。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；更优选大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

在第五方面，本发明提供第一方面所述的ALA合成酶或其活性片段、或第二方面所述的编码核酸序列、或第三方面所述的表达载体、或第四方面所述的宿主细胞在生产ALA中的应用。

在第六方面，本发明提供一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：

a.培养第四方面所述的宿主细胞或将第四方面所述的宿主细胞制成休止细胞，使之产生ALA；和

b.任选从培养液中分离步骤a产生的ALA。

在第七方面，本发明提供一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：

a.利用权利要求1所述的ALA合成酶或其活性片段，催化从琥珀酰CoA和甘氨酸合成ALA；和

b.任选从以上反应体系中分离ALA。

在第八方面，本发明提供第一方面所述的ALA合成酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a.得到第一方面所述的ALA合成酶的编码序列；

b.将a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；

c.培养b得到的宿主细胞；

d.从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶。

在优选的实施方式中，所述方法还包括测定得到的ALA合成酶的活性及菌株的ALA产量。

在第九方面，本发明提供改造ALA合成酶以便提高其活性的方法，所述方法包括以下步骤：

a.相对于改造前的ALA合成酶的氨基酸序列，将待改造的ALA合成酶的氨基酸序列的第401、403或407位或C端末位的氨基酸残基缺失或替换为非丙氨酸，和/或将所述ALA合成酶的C端末位添加1-N个任意氨基酸残基，优选添加1-10个、更优选添加1-6个、更优选添加1-3个、最优选添加1个任意氨基酸残基；

和/或

将待改造的ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列作比对，并改造所述待改造ALA合成酶的编码序列，使得编码的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第403位或C端末位的氨基酸残基缺失或替换为非丙氨酸；

和/或

将待改造的ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:42所示氨基酸序列作比对，并改造所述待改造ALA合成酶的编码序列，使得编码的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的第403或407位或C端末位的氨基酸残基缺失或替换为非丙氨酸；

和/或

将待改造的ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:43所示氨基酸序列作比对，并改造所述待改造ALA合成酶的编码序列，使得编码的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的第401位或C端末位的氨基酸残基缺失或替换为非丙氨酸；

c.培养b得到的宿主细胞；和

d.任选从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶。

在优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列的第403位或C端末位的氨基酸残基或者对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第403位或C端末位的氨基酸残基缺失或为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met；

和/或

所述ALA合成酶的氨基酸序列的第403或407位或C端末位的氨基酸残基或者对应于SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的第403或407位或C端末位的氨基酸残基缺失或为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met；

和/或

所述ALA合成酶的氨基酸序列的第401位或C端末位的氨基酸残基或者对应于SEQID NO:42所示氨基酸序列的第401位或C端末位的氨基酸残基缺失或为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met；

和/或

所述ALA合成酶的C端末位添加1-N个任意氨基酸残基，优选添加1-10个、更优选添加1-6个、更优选添加1-3个、最优选添加1个任意氨基酸残基且具有ALA合成酶功能的多肽，所述任意氨基酸残基为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Ala。

在优选的实施方式中，所述方法还包括测定得到的ALA合成酶的活性以及包含所述ALA合成酶的工程菌株的ALA产量。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了荚膜红细菌(Rhodobacter capsulata)来源的ALA合成酶与琥珀酰辅酶A共结晶结构。其中，紫色标记为底物结合相关的区域；

图2显示了不同沼泽红假单胞菌不同亚种HemA的氨基酸序列比对结果；

图3显示了不同物种的ALA合成酶的氨基酸序列比对结果。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现已知的ALA合成酶虽然氨基酸序列的同源性较低，但其C端末位或者403位点均是丙氨酸。在进一步的研究后，出乎意料地发现将ALA合成酶的第403位或C端末位进行缺失或突变，或在ALA合成酶的C端末端添加若干个任意氨基酸残基，获得的ALA合成酶不仅提高了酶活性，并且可以提高工程菌株的ALA产量，具有较好的应用价值。

关于本发明，ALA合成酶可以是如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列对应的蛋白(MNYEAYFRRQLDGLHREGRYRVFADLERHAGSFPRATHHRPEGAGDVTVWCSNDYLGMGQHPAVLTAMHEALDSCGAGAGGTRNIAGTNHYHVLLEQELAALHGKESALLFTSGYVSNWASLSTLASRMPGCVILSDELNHASMIEGIRHSRSETRIFAHNDPRDLERKLADLDPHAPKLVAFESVYSMDGDIAPIAEICDVADAHNAMTYLDEVHGVGLYGPNGGGIADREGISHRLTIIEGTLAKAFGVVGGYIAGSSAVCDFVRSFASGFIFSTSPPPAVAAGALASIRHLRASSAERERHQDRVARLRARLDQAGVAHMPNPSHIVPVMVGDAALCKQISDELISRYGIYVQPINYPTVPRGTERLRITPSPQHTDADIEHLVQALSEIWTRVGLAKAA)，也可以不是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列对应的蛋白；换言之，本发明的ALA合成酶可以与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有较高的同源性，也可以具有较低的同源性。本发明的ALA合成酶可以来源于各种物种，包括但不限于放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，只要其具有ALA合成酶的活性，且其相应的第403位或C端末位氨基酸残基进行了缺失或突变，和/或在其C端末位添加了1-N个任意氨基酸氨基，相比自然状态活性有所提高的，也包括在本发明的范围内。特别是，本发明人在野生型ALA合成酶的氨基酸序列中发现了新的突变位点，从而为获得具备优异活性的新ALA合成酶开辟了新的思路，奠定了物质基础。在此基础上完成了本发明。

本文所用的术语“自然状态”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。

“ALA合成酶”

本文中的术语“5-氨基乙酰丙酸合成酶”和本发明的“ALA合成酶”和“本发明的多肽”可互换使用，并具有本领域普通技术人员通常理解的含义。本发明的ALA合成酶具有催化从琥珀酰CoA和甘氨酸合成ALA合成的活性。

具体地说，本发明的ALA合成酶的氨基酸序列的第403位或C端末位的氨基酸残基缺失或为非丙氨酸，或者所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第403位或C端末位的氨基酸残基缺失或为非丙氨酸；

和/或

所述ALA合成酶的C端末位添加1-N个任意氨基酸残基，优选添加1-10个、优选添加1-6个、更优选添加1-3个、最优选添加1个任意氨基酸残基且具有ALA合成酶功能的多肽。

本领域技术人员知晓，为提升活性而对野生型多肽进行突变，找到能实现所需目的的位点更为重要。因此，基于本发明的教导，本领域技术人员会对待改造的ALA合成酶的相应第403位或C端末位氨基酸残基进行缺失或突变、或在C端末位添加1-N个任意氨基酸残基，并检测突变体的相关活性。

在具体的实施方式中，本发明的ALA合成酶的第403位或C端末位的氨基酸残基可以缺失或突变为(但不限于)：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met。

此外，本领域普通技术人员也不难知晓，在多肽的某些区域，改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。

因此，本发明应包括本发明的ALA合成酶的保守性突变体。这些保守性突变体可以根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

ALA合成酶基因可以是在严格的条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43所示氨基酸序列制备的探针，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的部分或者整个序列互补的序列杂交的DMA，只要保持其初始功能即可。所述“严格的条件”是指可形成所谓的特异性杂交且未形成非特异性杂交的条件。例如，同源性较高的DNA，例如具有80％以上同源性的DNA彼此杂交，同源性低于80％的DNA彼此不杂交的条件，或者通常的Southern杂交的清洗条件，即在相当于60℃、1*SSC、0.1％SDS、优选60℃、0.1*SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1*SSC、0.1％SDS的盐浓度及温度下清洗1次、优选2-3次的条件。

此外，由于密码子的简并性因宿主而异，ALA合成酶基因中的任意密码子可以用相应的等价密码子替换，也就是说，ALA合成酶基因可以是由于遗传密码的简并性而在上面例如的任何ALA合成酶基因的突变。例如，ALA合成酶基因可以是经修饰的基因，使得其具有根据要使用的宿主中密码子频率的最佳密码子。

因此，在具体的实施方式中，所述ALA合成酶基因可以是与编码SEQ ID NO:1、SEQID NO:42、SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的DNA同源性或序列相同性在80％以上，优选85％以上，优选90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的DNA。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本文所用的术语“活性片段”与本领域技术人员常规理解的含义相同或相似，均是指该片段的氨基酸序列是完整蛋白或多肽的氨基酸序列的一部分，但该片段具备与完整蛋白或多肽相同或相似的功能或活性。具体地说，在本发明中，“活性片段”表示从本发明的ALA合成酶获得的具有ALA合成酶活性的任意氨基酸片段。

基于本发明的教导和本发明具体得到的ALA合成酶，本领域技术人员不难得到具有相同或相似活性或功能的活性片段，这样的活性片段当然应该落在本发明的保护范围内。

“对应于”

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位就可能是第17位。

如上所述，已知的ALA合成酶的氨基酸序列的同源性并不高，但其C端末位或者403位点基本均是丙氨酸。因此，本发明的ALA合成酶与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列并不一定要具备高序列同源性或相同性。例如，所述同源性或序列相同性可以是30％以上、40％以上、50％以上、60％以上或70％以上。在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上、90％以上，优选95％以上，更优选96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的同源性。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

宿主细胞

本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够产生本发明ALA合成酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的ALA合成酶能在该宿主细胞中表达。

例如，适用于本发明的宿主细胞来自(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；更优选大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

固定化酶

本文所用的术语“固定化酶”具有本领域普通技术人员常规理解的含义。具体地说，该术语表示水溶性酶经物理或化学方法处理后，使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中形成溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。

固定化的酶仍具有酶活性，在催化反应中以固相状态作用于底物。酶经固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。

本领域普通技术人员鉴于本文的教导，不难将本发明的ALA合成酶处理成固定化酶或以全细胞催化的形式，用于催化从甘氨酸和琥珀酰CoA产生ALA。

本发明的应用与优点

1.本发明的ALA合成酶可以在工业上应用以实现低成本产生ALA；

2.本发明的ALA合成酶具备高活性，在工业上的应用前景广阔；

3.本发明提供了改造ALA合成酶的点突变位点，这些位点的突变可以有效提高待改造的ALA合成酶的酶活。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

本发明实施例所用的DNA聚合酶购自大连宝生物公司的Pyrobest；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；

酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；甘氨酸和IPTG购自Promega公司；ALA和对二甲氨基苯甲醛等购自Sigma公司；高氯血红素、琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮氯仿以及其他常用化学试剂均购自国药。

质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，相关操作均严格按照说明书执行；

质粒构建测序验证由金唯智完成；

E.coil DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。

LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基中添加2％的琼脂粉。

M9培养基成分：Na₂HPO₄·12H₂O 17.1g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl1.0g/L，MgSO₄ 2mM，CaCl₂ 0.1mM，葡萄糖20g/L，酵母粉2g/L。

抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/mL、卡那霉素50μg/mL。

ALA的检测方法：200μL稀释的发酵液或酶活力测定反应终止后样品加入100μL pH4.6乙酸钠缓冲液，然后加入5μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15min，冷却至室温后加入等体积的Ehrlish’s试剂(42mL冰醋酸，8mL 70％高氯酸，1g二甲氨基苯甲醛)混匀，显色10min后测553nm波长下的吸光度。

粗酶活性测定步骤如下：

(1)将已经离心收集，-80℃保存菌体(OD₆₀₀＝25)用1mL Tris-HCl buffer(pH7.5，含100mM NaCl)重悬；

(2)MP破碎细胞：6M/S，30s，破碎7次；

(3)将上一步得到的细胞破碎液离心，收集上清。

(4)蛋白浓度测定参照说明书使用Thermo Scientific公司的BCA蛋白定量试剂盒完成。

酶活力测定：测定反应在总体积为200μL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，含100mM NaCl)体系中进行，酶反应体系中各组分如表1所示。加入10μL细胞破碎上清液，金属浴中37℃震荡反应6min后向体系中加入100μL的10％三氯乙酸溶液终止反应。

表1. ALA合成酶活性测定反应体系中各组分浓度

组分	加入体积
		甘氨酸(1M)	40μL
琥珀酰辅酶A(10mM)	5μL
		磷酸吡哆醛(10mM)	2μL
ALA合成酶(150μg/mL)	10μL
		Tris-HCl(50mM,pH 7.5，含100mM NaCl)	143μL

实施例1.ALA合成酶结构分析

文献报道了荚膜红细菌(Rhodobacter capsulata)来源的ALA合成酶(RcA)的蛋白结构(PDB数据库编号：2BWN)及其分别于底物甘氨酸(PDB数据库编号：2BWP)和琥珀酰辅酶A(PDB数据库编号：2BWO)共结晶的蛋白结构，其中，Arg374位点与甘氨酸直接作用，Thr365位点与琥珀酰辅酶A直接作用(Astner et al.EMBO Journal 2005；24:3166-3177)。对该酶的结构分析后发现，其氨基酸序列中332-348和358-374两段区域(紫色所示)与底物结合相关(如图1所示)，上述区域包括了与甘氨酸直接作用的Arg374位点以及与琥珀酰辅酶A直接作用的Thr365位点，而其柔性的C末端与上述两段区域的空间位置较近。本发明人推测该柔性的C末端残基的突变可能会对上述两段底物结构区域产生不同的相互作用，进而影响底物结合和ALA合成酶的活性。

此外，本发明人对沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)ATCC17001来源的HemA(RpA)的结构也进行了模拟预测，虽然该酶氨基酸序列与上述已经解析蛋白结构的荚膜红细菌ALA合成酶(RcA)的序列一致性仅为56％，但其模拟预测得到的蛋白结构与上述结构相似性较高，C末端(403位)也存在类似的柔性区域，进而推测其C末端403位的突变可能会影响底物结合和ALA合成酶的活性。

实施例2：不同物种来源ALA合成酶序列分析

首先，本发明人对已经报道的不同沼泽红假单胞菌亚种的HemA的氨基酸序列进行比对分析，发现不同菌株之间序列一致性非常高，达到了94％，且C末端403位的氨基酸残基保守性极高，均为丙氨酸(如图2所示)。

本发明人进一步扩大序列比对范围，以沼泽红假单胞菌ATCC17001HemA(RpA)氨基酸序列在NCBI进行Blast比对，对注释为ALA合成酶的序列进行分析。虽然已报道的ALA合成酶物种来源不同，但绝大部分ALA合成酶氨基酸序列C端末位或第403位为丙氨酸。具体比对结果如图3所示。

例如，蛋白质结构已经解析的荚膜红细菌的ALA合成酶(RcA)与沼泽红假单胞菌的RpA氨基酸序列一致性为59％，但其C端401位也是丙氨酸。再例如，ALA生物合成最常用的球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的ALA合成酶(RsA)与沼泽红假单胞菌的RpA氨基酸序列一致性为57％，但其403位和C末端407位仍然是丙氨酸。结合实施例1中的蛋白结构解析，本发明人进一步推测ALA合成酶C末端或403位的突变对不同物种来源的ALA合成酶活性都有提升作用。

实施例3.沼泽红假单胞菌ATCC17001HemA(RpA)突变载体的构建

利用Stratagene系列

XL-II定点突变试剂盒，设计39对引物(见表2)，以pEC-XK99E-hemA野生型质粒为模板(构建过程参考谷氨酸棒状杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的途径构建与发酵优化[J].生物技术通报,2017,33(01):148-156.)，利用上述引物进行PCR扩增，分别将沼泽红假单胞菌ATCC17001HemA(RpA)的第403位氨基酸残基突变为精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)。PCR反应条件为：95℃5min，10个循环(95℃30s,74℃-65℃30s,72℃4.5min)，13个循环(95℃30s,65℃30s,72℃4.5min)，72℃10min。PCR扩增体系(50μL)：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTP mix 4μL，5×

Fast Pfu Fly Buffer 10μL，灭菌的双蒸水32μL，

FastPfu Fly DNAPolymerase 1μL。采用胶回收试剂盒对上述PCR产物进行纯化和回收，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，转化子测序验证，正确的表达载体分别命为：p403R，p403N，p403D，p403C，p403Q，p403E，p403G，p403H，p403I，p403L，p403K，p403M，p403F，p403P，p403S，p403T，p403W，p403Y，p403V。

表2. 引物序列

实施例4.重组菌株构建及发酵验证

将构建正确的RpA突变的表达载体转化C.glutamicum ATCC13032菌株，获得工程菌株，对RpA突变体工程菌株进行24孔板ALA发酵，突变体工程菌株在含有酵母粉的M9培养基的24孔板中培养16h作为种子液，按照初始OD₆₀₀为0.5转接至含有M9培养基的24孔板中进行发酵验证，培养3h，添加诱导剂IPTG终浓度100μM，24h发酵结束，测ALA合成酶粗酶酶活以及ALA产量。粗酶酶活的检测方法、ALA的检测和葡萄糖分析方法如“材料与方法”部分所述。经检测，与野生型菌株相比，各突变体的粗酶活均有提高，各个重组菌株的ALA产量存在一定的差异，如表3所示，设野生型菌株的ALA产量为1。

结果显示，与野生型相比，RpA的403位点突变为非丙氨酸之外的任意氨基酸，均可提高ALA产量，提升幅度在3％-40％之间。

表3. 24孔板发酵验证RpA突变体对ALA合成的影响

实施例5.5L发酵罐验证

选择上述效果较好的突变体(403位点突变为Asp、Gln)表达菌株进行5L发酵罐验证，发酵培养基成分为：(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，玉米浆干粉2g/L，MgSO₄ 7H₂O 2g/L，盐酸硫胺素1mg/L，发酵过程控制温度30℃，pH 6.5，溶氧不低于30％。结果显示上述菌株ALA产量分别达到了20.6g/L、22g/L，分别比对照菌株(17.2g/L)提高了20％、28.4％，说明表达上述突变体的工程菌株在发酵罐水平也可以有效提高产物ALA的产量。

实施例6.荚膜红细菌ALA合成酶(RcA)C末端丙氨酸突变及效果验证

为了进一步确认ALA合成酶C末端401位非丙氨酸对ALA合成酶活性的重要作用，本发明人利用结构研究相对明确，且在ALA生物合成中也已成功应用的荚膜红细菌来源的ALA合成酶(RcA)(Yang et al.Applied and Environmental Microbiology 2016；82:2709-2717)，选择不同性质的3种氨基酸(Asp、His、Tyr)对其C末端进行突变测试。

首先，根据NCBI公布的上述RcA氨基酸序列(SEQ ID NO:43；GenBank:AML83926.1)，合成相应的DNA编码序列(SEQ ID NO:44)。根据DNA序列设计引物(如表4)，以上述合成的基因片段为模板，通过PCR扩增，获得将C末端第401位的丙氨酸分别替换为天冬氨酸(Asp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)的基因片段以及野生型基因片段，同时利用pEC-Rc-F/R引物反向扩增pEC-XK99E-hemA，获得去除原hemA基因的质粒片段。PCR反应条件为：95℃5min，10个循环(95℃30s,65℃-55℃30s,72℃4min)，20个循环(95℃30s,55℃30s,72℃4min)，72℃5min。PCR扩增体系(50μL)：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTP mix 4μL，5×

Fast Pfu Fly Buffer 10μL，灭菌的双蒸水32μL，

FastPfu FlyDNA Polymerase 1μL。采用胶回收试剂盒对上述PCR产物进行纯化和回收，并利用重组试剂盒分别将上述目标基因片段与质粒片段重组，并转化大肠杆菌T1感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，转化子测序验证，正确的重组载体分别命为：pRc401WT、pRc401D、pRc401H和pRc401Y。

随后，将上述载体转化C.glutamicum ATCC13032菌株，获得相应重组菌株。利用24孔板对上述菌株进行发酵验证，培养工艺及参数同实施例4。发酵结果显示，荚膜红细菌ALA合成酶(RcA)C末端401位丙氨酸突变为天冬氨酸、组氨酸和酪氨酸均可显著提升该酶的活性，重组菌株ALA产量分别比表达野生型酶的对照菌株提高19％、15％和11％。

表4. 引物序列

SEQ ID NO:43，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)ALA合成酶(RcA)氨基酸序列

MDYNLALDKAIQKLHDEGRYRTFIDIEREKGAFPKAQWNRPDGGKQDITVWCGNDYLGMGQHPVVLAAMHEALEAVGAGSGGTRNISGTTAYHRRLEAEIADLHGKEAALVFSSAYIANDATLSTLRVLFPGLIIYSDSLNHASMIEGIKRNAGPKRIFRHNDVAHLRELIAADDPAAPKLIAFESVYSMDGDFGPIKEICDIADEFGALTYIDEVHAVGMYGPRGAGVAERDGLMHRIDIFNGTLAKAYGVFGGYIAASAKMVDAVRSYAPGFIFSTSLPPAIAAGAQASIAFLKTAEGQKLRDAQQMHAKVLKMRLKALGMPIIDHGSHIVPVVIGDPVHTKAVSDMLLSDYGVYVQPINFPTVPRGTERLRFTPSPVHDLKQIDGLVHAMDLLWARCA

SEQ ID NO:44：荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)ALA合成酶(RcA)DNA序列

ATGGACTACAATCTCGCGCTCGACAAAGCGATCCAGAAACTCCACGACGAGGGACGTTACCGCACGTTCATCGACATCGAACGCGAGAAGGGCGCCTTCCCCAAGGCGCAGTGGAACCGCCCCGATGGCGGCAAGCAGGACATCACCGTCTGGTGCGGCAACGACTATCTGGGCATGGGCCAGCACCCGGTCGTTCTGGCCGCGATGCATGAGGCGCTGGAAGCGGTCGGGGCCGGTTCGGGCGGCACCCGCAACATCTCGGGCACCACGGCCTATCACCGCCGTCTGGAAGCCGAGATCGCCGATCTGCACGGCAAGGAAGCGGCGCTTGTCTTCTCCTCGGCCTATATCGCCAATGACGCGACGCTCTCGACGCTGCGGCTGCTTTTCCCCGGCCTGATCATCTATTCCGACAGCCTGAACCACGCCTCGATGATCGAGGGGATCAAGCGCAATGCCGGGCCGAAGCGGATCTTCCGTCACAATGACGTCGCCCATCTGCGCGAGCTGATCGCCGCTGATGATCCGGCCGCGCCGAAGCTGATCGCCTTCGAATCGGTCTATTCGATGGATGGCGACTTCGGCCCGATCAAGGAAATCTGCGACATCGCCGATGAATTCGGCGCGCTGACCTATATCGACGAAGTCCATGCCGTCGGCATGTATGGCCCCCGCGGCGCGGGCGTGGCCGAGCGTGACGGTCTGATGCACCGCATCGACATCTTCAACGGCACGCTGGCGAAAGCCTATGGCGTCTTCGGCGGCTACATCGCCGCTTCGGCGAAGATGGTCGATGCCGTGCGCTCCTATGCGCCGGGCTTCATCTTCTCGACCTCGCTGCCGCCGGCGATCGCCGCTGGCGCGCAGGCCTCGATCGCGTTTTTGAAAACCGCCGAAGGGCAGAAGCTGCGCGACGCGCAACAGATGCACGCGAAGGTGCTGAAAATGCGGCTCAAGGCGCTGGGGATGCCGATCATCGACCATGGCAGCCACATCGTTCCGGTGGTCATCGGTGACCCCGTGCACACCAAGGCGGTGTCGGACATGCTCCTGTCGGATTACGGCGTTTACGTGCAGCCGATCAACTTCCCGACGGTGCCGCGCGGCACCGAACGGCTGCGCTTCACCCCCTCGCCGGTGCATGACCTGAAACAGATCGACGGGCTGGTTCATGCCATGGATCTGCTCTGGGCGCGCTGTGCGTAA

实施例7.球形红细菌ALA合成酶(RsA)C末端及第403位突变及效果验证

为了再次确认C末端或第403位非丙氨酸对ALA合成酶活性的重要作用，本发明人进一步选择了ALA生物合成最常使用的球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)来源的ALA合成酶(RsA)(氨基酸序列见SEQ ID NO:42)，分别将其403位和C末端407位的丙氨酸替换成Asp，测试了其突变效果。

首先，根据文献(Meng et al.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253)公开的球形红细菌来源的RshemA基因的序列(SEQ ID NO:45)设计引物(如表5所示)，以pRsA(Chen et al.Biotechnology for Biofuels,2020,13:41)为模板，通过PCR扩增，获得分别将第403位和C末端第407位丙氨酸替换为天冬氨酸(Asp)的质粒片段。PCR反应条件为：95℃5min，10个循环(95℃30s,65℃-55℃30s,72℃4min)，20个循环(95℃30s,55℃30s,72℃4min)，72℃5min。PCR扩增体系(50μL)：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTP mix 4μL，5×

Fast Pfu Fly Buffer 10μL，灭菌的双蒸水32μL，

FastPfu FlyDNA Polymerase 1μL。采用胶回收试剂盒对上述PCR产物进行纯化和回收，并利用T4PNK对其磷酸化，然后经T4连接酶连接，转化大肠杆菌T1感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，转化子测序验证，正确的重组载体分别命为：pRs403D和pRs407D。

随后，利用24孔板对上述菌株及携带pRsA的对照菌株进行发酵验证。重组菌株利用LB培养基培养12h作为种子液，按照初始OD₆₀₀为0.1转接至含有M9培养基的24孔板中进行发酵验证，培养3h，添加终浓度50uM的IPTG诱导，20h发酵结束，检测ALA产量。发酵结果显示第403位和第407位丙氨酸突变为天冬氨酸均可显著提升球形红细菌ALA合成酶(RsA)的活性，重组菌株ALA产量分别比表达野生型酶的对照菌株提高11％和22％。

表5. 引物序列

引物名称	引物序列	SEQ ID NO
			RshemA-F	TAAGGATCCTCTAGAGTCGACCT	53
Rs407-Asp-R	ATCAACAACTTCCGCACGGTTCA	54
			Rs403-F	GAAGTTGTTGCGTAAGGATCCTC	55
Rs403-Asp-R	ATCACGGTTCAGCGCGCAGTGCTGCCACAGAA	56

SEQ ID NO:42，类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)ALA合成酶(RsA)氨基酸序列

MDYNLALDTALNRLHTEGRYRTFIDIERRKGAFPKAMWRKPDGSEKEITVWCGNDYLGMGQHPVVLGAMHEALDSTGAGSGGTRNISGTTLYHKRLEAELADLHGKEAALVFSSAYIANDATLSTLPQLIPGLVIVSDKLNHASMIEGIRRSGTEKHIFKHNDLDDLRRILTSIGKDRPILVAFESVYSMDGDFGRIEEICDIADEFGALKYIDEVHAVGMYGPRGGGVAERDGLMDRIDIINGTLGKAYGVFGGYIAASSKMCDAVRSYAPGFIFSTSLPPVVAAGAAASVRHLKGDVELREKHQTQARILKMRLKGLGLPIIDHGSHIVPVHVGDPVHCKMISDMLLEHFGIYVQPINFPTVPRGTERLRFTPSPVHDSGMIDHLVKAMDVLWQHCALNRAEVVA

SEQ ID NO:45，类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)ALA合成酶(RsA)DNA序列

ATGGACTACAACCTGGCGCTGGACACCGCGCTGAACCGTCTGCACACCGAAGGTCGTTACCGTACCTTCATCGACATCGAACGTCGTAAAGGTGCGTTCCCGAAAGCGATGTGGCGTAAACCGGACGGTTCTGAAAAAGAAATCACCGTTTGGTGCGGTAACGACTACCTGGGTATGGGTCAGCACCCGGTTGTTCTGGGTGCGATGCACGAAGCGCTGGACTCTACCGGTGCGGGTTCTGGTGGTACCCGTAACATCTCTGGTACCACCCTGTACCACAAACGTCTGGAAGCGGAACTGGCGGACCTGCACGGTAAAGAAGCGGCGCTGGTTTTCTCTTCTGCGTACATCGCGAACGACGCGACCCTGTCTACCCTGCCGCAGCTGATCCCGGGTCTGGTTATCGTTTCTGACAAACTGAACCACGCGTCTATGATCGAAGGTATCCGTCGTTCTGGTACCGAAAAACACATCTTCAAACACAACGACCTGGACGACCTGCGTCGTATCCTGACCTCTATCGGTAAAGACCGTCCGATCCTGGTTGCGTTCGAATCTGTTTACTCTATGGACGGTGACTTCGGTCGTATCGAAGAAATCTGCGACATCGCGGACGAGTTCGGTGCGCTGAAATACATCGACGAAGTTCACGCGGTTGGTATGTACGGTCCGCGTGGTGGTGGTGTTGCGGAACGTGACGGTCTGATGGACCGTATCGACATCATCAACGGTACCCTGGGTAAAGCGTACGGTGTTTTCGGTGGTTACATCGCGGCGTCTTCTAAAATGTGCGACGCGGTTCGTTCTTACGCGCCGGGTTTCATCTTCTCTACCTCTCTGCCGCCGGTTGTTGCGGCGGGTGCGGCGGCGTCTGTTCGTCACCTGAAAGGTGACGTTGAACTGCGTGAAAAACACCAGACCCAGGCGCGTATCCTGAAAATGCGTCTGAAAGGTCTGGGTCTGCCGATCATCGACCACGGTTCTCACATCGTTCCGGTTCACGTTGGTGACCCGGTTCACTGCAAAATGATCTCTGACATGCTGCTGGAACACTTCGGTATCTACGTTCAGCCGATCAACTTCCCGACCGTTCCGCGTGGTACCGAACGTCTGCGTTTCACCCCGTCTCCGGTTCACGACTCTGGTATGATCGACCACCTGGTTAAAGCGATGGACGTTCTGTGGCAGCACTGCGCGCTGAACCGTGCGGAAGTTGTTGCGTAA

实施例8.沼泽红假单胞菌ATCC17001HemA(RpA)403位缺失及发酵验证

为了验证ALA合成酶403位或C末端对ALA合成酶活性的重要性，本发明人以RpA为例，对其403位进行了缺失，测试了其缺失后的效果。以pEC-XK99E-hemA野生型质粒为模板(构建过程参考谷氨酸棒状杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的途径构建与发酵优化[J].生物技术通报,2017,33(01):148-156.)，设计引物(如表6所示)，利用上述引物进行PCR扩增，将RpA的第403位氨基酸残基突变为终止密码子(Stop)。PCR反应条件、扩增体系及转化验证同实施例3，获得正确的表达载体p403Stop，将该表达载体转化C.glutamicum ATCC13032菌株，获得工程菌株C.glutamicum ATCC13032/p403Stop，对其进行24孔板ALA发酵，并检测粗酶酶活以及ALA产量。孔板发酵步骤如实施例4所示，粗酶酶活的检测方法、ALA的检测和葡萄糖分析方法如“材料与方法”部分所述。经检测，与野生型菌株相比，突变为终止密码子(即403位缺失)的粗酶活有所提高，且403位缺失后ALA的产量比野生型提高了近10％。

表6. 引物序列

引物名称引物序列 SEQ ID NO

403Stop-F CAAGGCGTAATGACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC 40

403Stop-R CGGGTCATAACGCCTTGGCGAGACCGACGCGGGTCC 41

实施例9.不同来源ALA合成酶C端延长效果测试

基于以上数据和结果，发明人推测在不改变403位或C末端的氨基酸残基的情况下，C末端延长可能又有利于提高ALA合成酶的活性。为了验证上述推测，我们利用上述三种不同来源的ALA合成酶(RpA、RcA和RsA)，分别在其C末端随机添加一个谷氨酸(Glu)或谷氨酰胺(Gln)，测试C端延长的应用效果。

根据上述不同来源ALA合成酶的编码基因的序列设计引物(如表7所示)。分别以前述pEC-XK99E-hemA、pRcWT、pRsA为模板，通过PCR扩增，获得相应质粒片段。PCR反应条件为：95℃5min，10个循环(95℃30s,65℃-55℃30s,72℃4min)，20个循环(95℃30s,55℃30s,72℃4min)，72℃5min。PCR扩增体系(50μL)：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTP mix 4μL，5×

Fast Pfu Fly Buffer 10μL，灭菌的双蒸水32μL，

FastPfu FlyDNA Polymerase 1μL。采用胶回收试剂盒对上述PCR产物进行纯化和回收，并利用T4PNK对其磷酸化，然后经T4连接酶连接，转化大肠杆菌T1感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，转化子测序验证，正确的重组载体分别命为：pRpE、pRpQ、pRcE、pRcQ、pRsE、pRsQ。

利用24孔板对上述菌株及相应的对照菌株进行发酵验证，培养工艺及参数同实施例4。发酵结果显示不同物种来源的ALA合成酶C末端添加上述氨基酸残基后ALA产量均得到提升10％-25％。

表7. 引物序列

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用

<130> P2020-0994

<150> CN2019104733771

<151> 2019-05-31

<160> 63

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 403

<212> PRT

<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)

<400> 1

Met Asn Tyr Glu Ala Tyr Phe Arg Arg Gln Leu Asp Gly Leu His Arg

1 5 10 15

Glu Gly Arg Tyr Arg Val Phe Ala Asp Leu Glu Arg His Ala Gly Ser

20 25 30

Phe Pro Arg Ala Thr His His Arg Pro Glu Gly Ala Gly Asp Val Thr

35 40 45

Val Trp Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Ala Val

50 55 60

Leu Thr Ala Met His Glu Ala Leu Asp Ser Cys Gly Ala Gly Ala Gly

65 70 75 80

Gly Thr Arg Asn Ile Ala Gly Thr Asn His Tyr His Val Leu Leu Glu

85 90 95

Gln Glu Leu Ala Ala Leu His Gly Lys Glu Ser Ala Leu Leu Phe Thr

100 105 110

Ser Gly Tyr Val Ser Asn Trp Ala Ser Leu Ser Thr Leu Ala Ser Arg

115 120 125

Met Pro Gly Cys Val Ile Leu Ser Asp Glu Leu Asn His Ala Ser Met

130 135 140

Ile Glu Gly Ile Arg His Ser Arg Ser Glu Thr Arg Ile Phe Ala His

145 150 155 160

Asn Asp Pro Arg Asp Leu Glu Arg Lys Leu Ala Asp Leu Asp Pro His

165 170 175

Ala Pro Lys Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly Asp

180 185 190

Ile Ala Pro Ile Ala Glu Ile Cys Asp Val Ala Asp Ala His Asn Ala

195 200 205

Met Thr Tyr Leu Asp Glu Val His Gly Val Gly Leu Tyr Gly Pro Asn

210 215 220

Gly Gly Gly Ile Ala Asp Arg Glu Gly Ile Ser His Arg Leu Thr Ile

225 230 235 240

Ile Glu Gly Thr Leu Ala Lys Ala Phe Gly Val Val Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ser Ala Val Cys Asp Phe Val Arg Ser Phe Ala Ser Gly

260 265 270

Phe Ile Phe Ser Thr Ser Pro Pro Pro Ala Val Ala Ala Gly Ala Leu

275 280 285

Ala Ser Ile Arg His Leu Arg Ala Ser Ser Ala Glu Arg Glu Arg His

290 295 300

Gln Asp Arg Val Ala Arg Leu Arg Ala Arg Leu Asp Gln Ala Gly Val

305 310 315 320

Ala His Met Pro Asn Pro Ser His Ile Val Pro Val Met Val Gly Asp

325 330 335

Ala Ala Leu Cys Lys Gln Ile Ser Asp Glu Leu Ile Ser Arg Tyr Gly

340 345 350

Ile Tyr Val Gln Pro Ile Asn Tyr Pro Thr Val Pro Arg Gly Thr Glu

355 360 365

Arg Leu Arg Ile Thr Pro Ser Pro Gln His Thr Asp Ala Asp Ile Glu

370 375 380

His Leu Val Gln Ala Leu Ser Glu Ile Trp Thr Arg Val Gly Leu Ala

385 390 395 400

Lys Ala Ala

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

caaggcgcga tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cgggtcatcg cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

caaggcgaac tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cgggtcagtt cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

caaggcggat tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

cgggtcaatc cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

caaggcgtgc tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

cgggtcagca cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

caaggcgcag tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

cgggtcactg cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

caaggcggaa tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

cgggtcattc cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

caaggcgggg tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

cgggtcaccc cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

caaggcgcat tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

cgggtcaatg cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

caaggcgatc tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

cgggtcagat cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

caaggcgctt tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

cgggtcaaag cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

caaggcgaag tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

cgggtcactt cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

caaggcgatg tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

cgggtcacat cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

caaggcgttc tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

cgggtcagaa cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

caaggcgccc tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

cgggtcaggg cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

caaggcgtcc tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

cgggtcagga cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

caaggcgacc tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 33

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

cgggtcaggt cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

caaggcgtgg tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

cgggtcacca cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

caaggcgtac tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 37

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

cgggtcagta cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

caaggcggtc tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 39

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 39

cgggtcagac cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 40

caaggcgtaa tgacccgggg atcctctaga gtcgac 36

<210> 41

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 41

cgggtcataa cgccttggcg agaccgacgc gggtcc 36

<210> 42

<211> 407

<212> PRT

<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)

<400> 42

Met Asp Tyr Asn Leu Ala Leu Asp Thr Ala Leu Asn Arg Leu His Thr

1 5 10 15

Glu Gly Arg Tyr Arg Thr Phe Ile Asp Ile Glu Arg Arg Lys Gly Ala

20 25 30

Phe Pro Lys Ala Met Trp Arg Lys Pro Asp Gly Ser Glu Lys Glu Ile

35 40 45

Thr Val Trp Cys Gly Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Val

50 55 60

Val Leu Gly Ala Met His Glu Ala Leu Asp Ser Thr Gly Ala Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Thr Arg Asn Ile Ser Gly Thr Thr Leu Tyr His Lys Arg Leu

85 90 95

Glu Ala Glu Leu Ala Asp Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Val Phe

100 105 110

Ser Ser Ala Tyr Ile Ala Asn Asp Ala Thr Leu Ser Thr Leu Pro Gln

115 120 125

Leu Ile Pro Gly Leu Val Ile Val Ser Asp Lys Leu Asn His Ala Ser

130 135 140

Met Ile Glu Gly Ile Arg Arg Ser Gly Thr Glu Lys His Ile Phe Lys

145 150 155 160

His Asn Asp Leu Asp Asp Leu Arg Arg Ile Leu Thr Ser Ile Gly Lys

165 170 175

Asp Arg Pro Ile Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly

180 185 190

Asp Phe Gly Arg Ile Glu Glu Ile Cys Asp Ile Ala Asp Glu Phe Gly

195 200 205

Ala Leu Lys Tyr Ile Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Pro

210 215 220

Arg Gly Gly Gly Val Ala Glu Arg Asp Gly Leu Met Asp Arg Ile Asp

225 230 235 240

Ile Ile Asn Gly Thr Leu Gly Lys Ala Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr

245 250 255

Ile Ala Ala Ser Ser Lys Met Cys Asp Ala Val Arg Ser Tyr Ala Pro

260 265 270

Gly Phe Ile Phe Ser Thr Ser Leu Pro Pro Val Val Ala Ala Gly Ala

275 280 285

Ala Ala Ser Val Arg His Leu Lys Gly Asp Val Glu Leu Arg Glu Lys

290 295 300

His Gln Thr Gln Ala Arg Ile Leu Lys Met Arg Leu Lys Gly Leu Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ile Ile Asp His Gly Ser His Ile Val Pro Val His Val Gly

325 330 335

Asp Pro Val His Cys Lys Met Ile Ser Asp Met Leu Leu Glu His Phe

340 345 350

Gly Ile Tyr Val Gln Pro Ile Asn Phe Pro Thr Val Pro Arg Gly Thr

355 360 365

Glu Arg Leu Arg Phe Thr Pro Ser Pro Val His Asp Ser Gly Met Ile

370 375 380

Asp His Leu Val Lys Ala Met Asp Val Leu Trp Gln His Cys Ala Leu

385 390 395 400

Asn Arg Ala Glu Val Val Ala

405

<210> 43

<211> 401

<212> PRT

<213> 荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)

<400> 43

Met Asp Tyr Asn Leu Ala Leu Asp Lys Ala Ile Gln Lys Leu His Asp

1 5 10 15

Glu Gly Arg Tyr Arg Thr Phe Ile Asp Ile Glu Arg Glu Lys Gly Ala

20 25 30

Phe Pro Lys Ala Gln Trp Asn Arg Pro Asp Gly Gly Lys Gln Asp Ile

35 40 45

Thr Val Trp Cys Gly Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Val

50 55 60

Val Leu Ala Ala Met His Glu Ala Leu Glu Ala Val Gly Ala Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Thr Arg Asn Ile Ser Gly Thr Thr Ala Tyr His Arg Arg Leu

85 90 95

Glu Ala Glu Ile Ala Asp Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Val Phe

100 105 110

Ser Ser Ala Tyr Ile Ala Asn Asp Ala Thr Leu Ser Thr Leu Arg Val

115 120 125

Leu Phe Pro Gly Leu Ile Ile Tyr Ser Asp Ser Leu Asn His Ala Ser

130 135 140

Met Ile Glu Gly Ile Lys Arg Asn Ala Gly Pro Lys Arg Ile Phe Arg

145 150 155 160

His Asn Asp Val Ala His Leu Arg Glu Leu Ile Ala Ala Asp Asp Pro

165 170 175

Ala Ala Pro Lys Leu Ile Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly

180 185 190

Asp Phe Gly Pro Ile Lys Glu Ile Cys Asp Ile Ala Asp Glu Phe Gly

195 200 205

Ala Leu Thr Tyr Ile Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Pro

210 215 220

Arg Gly Ala Gly Val Ala Glu Arg Asp Gly Leu Met His Arg Ile Asp

225 230 235 240

Ile Phe Asn Gly Thr Leu Ala Lys Ala Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr

245 250 255

Ile Ala Ala Ser Ala Lys Met Val Asp Ala Val Arg Ser Tyr Ala Pro

260 265 270

Gly Phe Ile Phe Ser Thr Ser Leu Pro Pro Ala Ile Ala Ala Gly Ala

275 280 285

Gln Ala Ser Ile Ala Phe Leu Lys Thr Ala Glu Gly Gln Lys Leu Arg

290 295 300

Asp Ala Gln Gln Met His Ala Lys Val Leu Lys Met Arg Leu Lys Ala

305 310 315 320

Leu Gly Met Pro Ile Ile Asp His Gly Ser His Ile Val Pro Val Val

325 330 335

Ile Gly Asp Pro Val His Thr Lys Ala Val Ser Asp Met Leu Leu Ser

340 345 350

Asp Tyr Gly Val Tyr Val Gln Pro Ile Asn Phe Pro Thr Val Pro Arg

355 360 365

Gly Thr Glu Arg Leu Arg Phe Thr Pro Ser Pro Val His Asp Leu Lys

370 375 380

Gln Ile Asp Gly Leu Val His Ala Met Asp Leu Leu Trp Ala Arg Cys

385 390 395 400

Ala

<210> 44

<211> 1206

<212> DNA

<213> 荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)

<400> 44

atggactaca atctcgcgct cgacaaagcg atccagaaac tccacgacga gggacgttac 60

cgcacgttca tcgacatcga acgcgagaag ggcgccttcc ccaaggcgca gtggaaccgc 120

cccgatggcg gcaagcagga catcaccgtc tggtgcggca acgactatct gggcatgggc 180

cagcacccgg tcgttctggc cgcgatgcat gaggcgctgg aagcggtcgg ggccggttcg 240

ggcggcaccc gcaacatctc gggcaccacg gcctatcacc gccgtctgga agccgagatc 300

gccgatctgc acggcaagga agcggcgctt gtcttctcct cggcctatat cgccaatgac 360

gcgacgctct cgacgctgcg gctgcttttc cccggcctga tcatctattc cgacagcctg 420

aaccacgcct cgatgatcga ggggatcaag cgcaatgccg ggccgaagcg gatcttccgt 480

cacaatgacg tcgcccatct gcgcgagctg atcgccgctg atgatccggc cgcgccgaag 540

ctgatcgcct tcgaatcggt ctattcgatg gatggcgact tcggcccgat caaggaaatc 600

tgcgacatcg ccgatgaatt cggcgcgctg acctatatcg acgaagtcca tgccgtcggc 660

atgtatggcc cccgcggcgc gggcgtggcc gagcgtgacg gtctgatgca ccgcatcgac 720

atcttcaacg gcacgctggc gaaagcctat ggcgtcttcg gcggctacat cgccgcttcg 780

gcgaagatgg tcgatgccgt gcgctcctat gcgccgggct tcatcttctc gacctcgctg 840

ccgccggcga tcgccgctgg cgcgcaggcc tcgatcgcgt ttttgaaaac cgccgaaggg 900

cagaagctgc gcgacgcgca acagatgcac gcgaaggtgc tgaaaatgcg gctcaaggcg 960

ctggggatgc cgatcatcga ccatggcagc cacatcgttc cggtggtcat cggtgacccc 1020

gtgcacacca aggcggtgtc ggacatgctc ctgtcggatt acggcgttta cgtgcagccg 1080

atcaacttcc cgacggtgcc gcgcggcacc gaacggctgc gcttcacccc ctcgccggtg 1140

catgacctga aacagatcga cgggctggtt catgccatgg atctgctctg ggcgcgctgt 1200

gcgtaa 1206

<210> 45

<211> 1224

<212> DNA

<213> 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)

<400> 45

atggactaca acctggcgct ggacaccgcg ctgaaccgtc tgcacaccga aggtcgttac 60

cgtaccttca tcgacatcga acgtcgtaaa ggtgcgttcc cgaaagcgat gtggcgtaaa 120

ccggacggtt ctgaaaaaga aatcaccgtt tggtgcggta acgactacct gggtatgggt 180

cagcacccgg ttgttctggg tgcgatgcac gaagcgctgg actctaccgg tgcgggttct 240

ggtggtaccc gtaacatctc tggtaccacc ctgtaccaca aacgtctgga agcggaactg 300

gcggacctgc acggtaaaga agcggcgctg gttttctctt ctgcgtacat cgcgaacgac 360

gcgaccctgt ctaccctgcc gcagctgatc ccgggtctgg ttatcgtttc tgacaaactg 420

aaccacgcgt ctatgatcga aggtatccgt cgttctggta ccgaaaaaca catcttcaaa 480

cacaacgacc tggacgacct gcgtcgtatc ctgacctcta tcggtaaaga ccgtccgatc 540

ctggttgcgt tcgaatctgt ttactctatg gacggtgact tcggtcgtat cgaagaaatc 600

tgcgacatcg cggacgagtt cggtgcgctg aaatacatcg acgaagttca cgcggttggt 660

atgtacggtc cgcgtggtgg tggtgttgcg gaacgtgacg gtctgatgga ccgtatcgac 720

atcatcaacg gtaccctggg taaagcgtac ggtgttttcg gtggttacat cgcggcgtct 780

tctaaaatgt gcgacgcggt tcgttcttac gcgccgggtt tcatcttctc tacctctctg 840

ccgccggttg ttgcggcggg tgcggcggcg tctgttcgtc acctgaaagg tgacgttgaa 900

ctgcgtgaaa aacaccagac ccaggcgcgt atcctgaaaa tgcgtctgaa aggtctgggt 960

ctgccgatca tcgaccacgg ttctcacatc gttccggttc acgttggtga cccggttcac 1020

tgcaaaatga tctctgacat gctgctggaa cacttcggta tctacgttca gccgatcaac 1080

ttcccgaccg ttccgcgtgg taccgaacgt ctgcgtttca ccccgtctcc ggttcacgac 1140

tctggtatga tcgaccacct ggttaaagcg atggacgttc tgtggcagca ctgcgcgctg 1200

aaccgtgcgg aagttgttgc gtaa 1224

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 46

gatcctctag agtcgacctg ca 22

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 47

ctccttcgaa ttccatggtc tgtttcc 27

<210> 48

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 48

ccatggaatt cgaaggagat atagatatgg actacaatct cgcgctc 47

<210> 49

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 49

gtcgactcta gaggatctta cgcacagcgc gcccagagca gatc 44

<210> 50

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 50

gtcgactcta gaggatctta atgacagcgc gcccagagca gatc 44

<210> 51

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 51

gtcgactcta gaggatctta atcacagcgc gcccagagca gatc 44

<210> 52

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 52

gtcgactcta gaggatctta gtaacagcgc gcccagagca gatc 44

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 53

taaggatcct ctagagtcga cct 23

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 54

atcaacaact tccgcacggt tca 23

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 55

gaagttgttg cgtaaggatc ctc 23

<210> 56

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 56

atcacggttc agcgcgcagt gctgccacag aa 32

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 57

ttactgcgca cagcgcgccc agagcagatc 30

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 58

ttattccgca cagcgcgccc agagcagatc 30

<210> 59

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 59

ctgcgcaaca acttccgcac ggttca 26

<210> 60

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 60

ttccgcaaca acttccgcac ggttca 26

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 61

tgacccgggg atcctctaga 20

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 62

ctgggccgcc ttggcgagac cga 23

<210> 63

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 63

ttcggccgcc ttggcgagac cga 23

Claims

1.一种5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALA合成酶)，其特征在于：

所述ALA合成酶选自下组：

a. 所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且其C端末位的氨基酸残基缺失或突变为选自以下氨基酸的一种：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met；

b. 所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，并且其C端末位的氨基酸残基为选自以下氨基酸的一种：Asp、His、Tyr；

c. 所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示，并且其C端末位的氨基酸残基残基为以下氨基酸：Asp；

d. 所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、42或43所示，并且其C端末位添加1个氨基酸残基，所述氨基酸残基为选自以下氨基酸的一种：Gln、Glu。

2.权利要求1所述的ALA合成酶的编码核酸分子。

3.包含权利要求1所述的ALA合成酶的编码核酸分子的表达载体。

4. 一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求1所述的ALA合成酶，所述宿主细胞是大肠杆菌 (Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)或沼泽红假单胞菌 (Rhodopseudomonas palustris)。

5.如权利要求1所述的ALA合成酶、或权利要求2所述的编码核酸分子、或权利要求3所述的表达载体、或权利要求4所述的宿主细胞在生产ALA中的应用。

6. 一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 培养权利要求4所述的宿主细胞或将权利要求4所述的宿主细胞制成休止细胞，使之产生ALA；和

b. 任选从培养液中分离步骤a产生的ALA。

7. 一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 利用权利要求1所述的ALA合成酶，催化从琥珀酰CoA和甘氨酸合成ALA；和

b. 任选从步骤a得到的反应体系中分离ALA。

8.权利要求1所述的ALA合成酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a. 得到权利要求1所述的ALA合成酶的编码序列；

b. 将a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；

c. 培养b得到的宿主细胞；

d. 从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶；

所述宿主细胞是大肠杆菌 (Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)或沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。