JP2020195375A - 5−アミノレブリン酸シンテターゼ変異体およびその宿主細胞と応用 - Google Patents
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Abstract
【課題】生物体によって合成されるヘム、クロロフィル、VB12などのテトラピロール化合物の前駆体として、動物、植物、および微生物に広く存在する、5−アミノレブリン酸(5−minolevulinic acid,ALA)を生産するための、活性が改善された5−アミノレブリン酸シンテターゼ(ALAシンテターゼ)、ALAシンテターゼ活性を向上させる方法、および得られたALAシンテターゼによってALAを生産する方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有すALAシンテターゼまたはその活性断片。【選択図】なし
Description
本発明は、生物技術分野に関する。具体的に、本発明は、5−アミノレブリン酸シンテターゼの変異体およびその宿主細胞と応用に関する。
5−アミノレブリン酸(5−minolevulinic acid,ALA)は、生物体によって合成されるヘム、クロロフィル、VB12などのテトラピロール化合物の前駆体として、動物、植物、および微生物に広く存在する。ALAは、医薬、農業、飼料および健康食品などの分野で広く使用され、開発の価値が高い高付加価値バイオベースの化学物質である。近年、微生物を利用して、C4経路を介してALAの発酵生産が産業的に応用されてきた。
5−アミノレブリン酸シンテターゼ(ALAシンテターゼ)は、C4経路によってALAおよびテトラピロール化合物を合成するための重要な酵素と律速酵素であり、その酵素的性質の優劣はALA合成効率に直接影響を与える。近年、アグロバクテリウムラジオバクター(Agrobacterium radiobacter,CN1322132C)、ロドブラスタスアシドフィラス(Rhodoblastus acidophilus,CN1974758B)、ロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides,CN103146694B)、ロドシュードモナスパルストリス(Rhodopseudomonas palustris,CN103981203B)などを含む異なる由来の大量のALAシンテターゼをクローニングして同定してALA高収率菌株を構築した。しかし、前記ALAシンテターゼはすべて、異なる生物体内に天然的に存在する酵素のソースであり、これらの酵素自体の活性が高くないので(Meng et al. Biotechnology Letters, 2015, 37(11): 2247−2253;Meng et al. Biotechnology Letters, 2015, 37(11): 2247−2253)工学細菌(engineering bacteria)に応用するのは難しい。
近年、酵素工学、タンパク質工学技術の急速な発展に伴い、合理的な設計を通じた酵素の触媒活性などの性質の向上させることが広く応用されている。しかし、現在ALAシンテターゼの合理的な設計と改良に関する研究は多くなく、従来のレポートは、主に真核生物由来のALAシンテターゼに関するもので、Turbevilleらは、2つのマウス由来ALAシンテターゼを融合発現させた後、その触媒効率を増加させることができ(Turbeville et al. Archives of Biochemistry & Biophysics, 2011, 511(1): 107−117)、Lendrihasらは、マウス赤血球細胞内ALAシンテターゼIIの変異体のライブラリーを構築して、酵素活性の向上されたALAシンテターゼ変異体をスクリーニングして得た(Lendrihas et al. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(18): 13704)。上記の研究は、酵素活性が向上されたALAシンテターゼを得たが、真核生物由来のALAシンテターゼは、細菌の低発現活性を有するが、ALA生合成に使用されていなかった。
なお、ALA合成過程での重要な酵素としては、ALAシンテターゼ活性の向上は、工学細菌の触媒効率を加速して、独自のタンパク質の合成と分解の過程でエネルギー損失を減らすことによって、工学細菌の安定性と生産性能を向上させて、ALAの生産コストを削減し、農業と畜産などの分野でALAの応用を促進するに当たり、大きな価値がある。
したがって、ALAを低コスト生産法により生産するために、活性の高いALAシンテターゼを開発することが当技術分野で緊急に必要とされている。
本発明の目的は、活性が改善されたALAシンテターゼ、ALAシンテターゼ活性を向上させる方法、および得られたALAシンテターゼによってALAを生産する方法を提供するものである。
第1の態様において、本発明は、ALAシンテターゼまたはその活性断片を提供し、
a.前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列のC末端のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
b.前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第403番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
c.前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応する第401番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
d.前記ALAシンテターゼ的アミノ酸配列がSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第403番または407番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
e.前記ALAシンテターゼのC末端に1つまたは複数の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは1−10の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加することを特徴とする。
a.前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列のC末端のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
b.前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第403番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
c.前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応する第401番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
d.前記ALAシンテターゼ的アミノ酸配列がSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第403番または407番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
e.前記ALAシンテターゼのC末端に1つまたは複数の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは1−10の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加することを特徴とする。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼは、突然変異によって得られる。
好ましい実施形態において、突然変異の前に、前記ALAシンテターゼは、アミノ酸配列の第401番、第403番、第407番、またはC末端のアミノ酸残基はアラニンであり、ALAシンテターゼ活性を有するポリペプチドである。
好ましい実施形態において、突然変異の前に、前記ALAシンテターゼは、アミノ酸配列の第401番、第403番、第407番、またはC末端のアミノ酸残基はアラニンであり、ALAシンテターゼ活性を有するポリペプチドである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼは、様々な種から由来することができ、アグロバクテリウムラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)、ロドブラスタスアシドフィラス(Rhodoblastus acidophilus)、ロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドバクターカプスラータ(Rhodobacter capsulatus)、ロドシュードモナスパルストリス(Rhodopseudomonas palustris)を含むがこれらに限定されず、好ましくは、ロドシュードモナスパルストリスである。
より好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%、97%、98%、99%の相同性を有するか、前記前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列は、80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%、97%、98%、99%の相同性を有するか、前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列は、80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%、97%、98%、99%の相同性を有する。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼは、
a.その第403番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第403番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.その第401番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応する第401番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
c.その第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
d.C末端に1−10の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
a.その第403番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第403番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.その第401番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応する第401番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
c.その第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
d.C末端に1−10の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼは、
a.その第403番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第403番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.その第401番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応する第401番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
c.その第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
d.前記ALAシンテターゼのC末端に1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
a.その第403番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第403番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.その第401番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応する第401番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
c.その第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
d.前記ALAシンテターゼのC末端に1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのC末端に添加されるアミノ酸残基は、GluまたはGlnである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1に示され、
a.第403番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.C末端に1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1に示され、
a.第403番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.C末端に1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:43に示され、
a.第401番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.C末端に1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つ任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
a.第401番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.C末端に1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つ任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのC末端に添加されるアミノ酸残基は、GluまたはGlnである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:42に示され、
a.第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.C末端に1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つ任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:42に示され、
a.第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
b.C末端に1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つ任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのC末端に添加されるアミノ酸残基は、GluまたはGlnである。
第2の態様において、本発明は、第1の態様によるALAシンテターゼまたはその活性断片のコーディング核酸配列を提供する。
第2の態様において、本発明は、第1の態様によるALAシンテターゼまたはその活性断片のコーディング核酸配列を提供する。
第3の態様において、本発明は、第1の態様によるALAシンテターゼまたはその活性断片を含むコーディング核酸配列の発現担体を提供する。
第4の態様において、本発明は、第1の態様によるALAシンテターゼまたはその活性断片を含む宿主細胞を提供する。
第4の態様において、本発明は、第1の態様によるALAシンテターゼまたはその活性断片を含む宿主細胞を提供する。
好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、第3の態様による発現担体または第2の態様によるコーディング核酸配列が統合されたそのゲノムを含む。
好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、ロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドバクターカプスラータ(Rhodobacter capsulatus)、ロドシュードモナスパルストリス (Rhodopseudomonas palustris)であり、より好ましくは、大腸菌またはコリネバクテリウムグルタミカムである。
好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、ロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドバクターカプスラータ(Rhodobacter capsulatus)、ロドシュードモナスパルストリス (Rhodopseudomonas palustris)であり、より好ましくは、大腸菌またはコリネバクテリウムグルタミカムである。
第5の態様において、本発明は、第1の態様によるALAシンテターゼまたはその活性断片、または第2の態様によるコーディング核酸配列、または第3の態様による発現担体、またはALA生成における第4の態様による宿主細胞の応用を提供する。
第6の態様において、本発明は、ALAの製造方法を提供し、前記方法は、
第4の態様による宿主細胞を培養するか、第4の態様による宿主細胞を休止細胞に製造して、ALAを生成するステップaと、および
培養液からステップaで生成されたALAを選択的に分離するステップbとを含む。
第4の態様による宿主細胞を培養するか、第4の態様による宿主細胞を休止細胞に製造して、ALAを生成するステップaと、および
培養液からステップaで生成されたALAを選択的に分離するステップbとを含む。
第7の態様において、本発明は、ALAの製造方法を提供し、前記方法は、
第1の態様によるALAシンテターゼまたはその活性断片を利用して、サクシニルCoAおよびグリシンからのALA合成を触媒するステップaと、および
前記反応システムからALAを選択的に分離するステップbとを含む。
第1の態様によるALAシンテターゼまたはその活性断片を利用して、サクシニルCoAおよびグリシンからのALA合成を触媒するステップaと、および
前記反応システムからALAを選択的に分離するステップbとを含む。
第8の態様において、本発明は、第1の態様によるALAシンテターゼの製造方法を提供し、前記方法は、
第1の態様によるALAシンテターゼのコーディング配列を得るステップaと、
ステップaから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップbと、
ステップbから得られた宿主細胞を培養するステップcと、および
ステップcから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたALAシンテターゼを分離するステップdとを含む。
第1の態様によるALAシンテターゼのコーディング配列を得るステップaと、
ステップaから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップbと、
ステップbから得られた宿主細胞を培養するステップcと、および
ステップcから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたALAシンテターゼを分離するステップdとを含む。
好ましい実施形態において、前記方法は、得られたALAシンテターゼの活性および菌株のALA生産量を測定するステップをさらに含む。
第9の態様において、本発明は、改良ALAシンテターゼを提供してその活性を向上させる方法を提供し、前記方法は、
改良前のALAシンテターゼのアミノ酸配列に対して、改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列の第401番、第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換え、および/または前記ALAシンテターゼのC末端に1−N個の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは1−10の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基を添加し、および/または
改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応される第403番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるALAシンテターゼのコーディング配列を改良し、
改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応される第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるALAシンテターゼのコーディング配列を改良し、および/または
改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応される第401番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるALAシンテターゼのコーディング配列を改良するステップaと、
ステップaから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップbと、
ステップbから得られた宿主細胞を培養するステップcと、および
ステップcから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたALAシンテターゼを分離するステップdとを含む。
第9の態様において、本発明は、改良ALAシンテターゼを提供してその活性を向上させる方法を提供し、前記方法は、
改良前のALAシンテターゼのアミノ酸配列に対して、改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列の第401番、第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換え、および/または前記ALAシンテターゼのC末端に1−N個の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは1−10の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基を添加し、および/または
改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応される第403番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるALAシンテターゼのコーディング配列を改良し、
改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応される第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるALAシンテターゼのコーディング配列を改良し、および/または
改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応される第401番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるALAシンテターゼのコーディング配列を改良するステップaと、
ステップaから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップbと、
ステップbから得られた宿主細胞を培養するステップcと、および
ステップcから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたALAシンテターゼを分離するステップdとを含む。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列の第403番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第403番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列の第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列の第401番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第401番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
前記ALAシンテターゼのC末端に1−N個の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは1−10の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、より好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列の第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列の第401番またはC末端のアミノ酸残基またはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応する第401番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metから選択されるアミノ酸の1つであり、および/または
前記ALAシンテターゼのC末端に1−N個の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは1−10の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、より好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Met、Alaから選択されるアミノ酸の1つである。
好ましい実施形態において、前記ALAシンテターゼのC末端に添加されるアミノ酸残基は、GluまたはGlnである。
好ましい実施形態において、前記方法は、得られたALAシンテターゼの活性および前記ALAシンテターゼを含む工学菌株のALA生産量を測定するステップをさらに含む。
好ましい実施形態において、前記方法は、得られたALAシンテターゼの活性および前記ALAシンテターゼを含む工学菌株のALA生産量を測定するステップをさらに含む。
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下(例えば、実施例)に具体的に説明する各技術的特徴を互いに組み合わせて、新規または好ましい技術的解決手段を形成することができることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは繰り返しない。
発明者らは、広範かつ徹底的な研究を経て、既知のALA合成酵素がアミノ酸配列との相同性が比較的低いが、C末端または403番の部位がすべてアラニンであることを発見した。さらなる研究の後、ALAシンテターゼの第403番またはC末端で欠失または突然変異されるか、またはALAシンテターゼのC末端に複数の任意のアミノ酸残基を添加して、得られたALAシンテターゼは、酵素活性が向上するだけでなく、工学菌株のALA生産量を向上させることができ、これは優れた応用の価値を有することを予期せず発見した。
本発明に関して、ALAシンテターゼは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応するタンパク質であることができ(MNYEAYFRRQLDGLHREGRYRVFADLERHAGSFPRATHHRPEGAGDVTVWCSNDYLGMGQHPAVLTAMHEALDSCGAGAGGTRNIAGTNHYHVLLEQELAALHGKESALLFTSGYVSNWASLSTLASRMPGCVILSDELNHASMIEGIRHSRSETRIFAHNDPRDLERKLADLDPHAPKLVAFESVYSMDGDIAPIAEICDVADAHNAMTYLDEVHGVGLYGPNGGGIADREGISHRLTIIEGTLAKAFGVVGGYIAGSSAVCDFVRSFASGFIFSTSPPPAVAAGALASIRHLRASSAERERHQDRVARLRARLDQAGVAHMPNPSHIVPVMVGDAALCKQISDELISRYGIYVQPINYPTVPRGTERLRITPSPQHTDADIEHLVQALSEIWTRVGLAKAA)、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応するタンパク質ではないこともでき、言い換えれば、本発明のALAシンテターゼは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と比較的高い相同性を有することができ、比較的低い相同性を有することもできる。本発明的ALAシンテターゼは、様々な種から由来することができ、アグロバクテリウムラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)、ロドブラスタスアシドフィラス(Rhodoblastus acidophilus)、ロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドバクターカプスラータ(Rhodobacter capsulatus)、ロドシュードモナスパルストリス(Rhodopseudomonas palustris)を含むが、これに限定されず、ALAシンテターゼの活性を有し、対応する第403番またはC末端アミノ酸残基が欠失したり、突然変異され、および/またはそのC末端に1−N個の任意のアミノ酸残基を添加し、自然状態に比べて活性が向上されると、本発明の範囲内に属する。特に、本発明者らは、野生型ALAシンテターゼのアミノ酸配列から新しい突然変異部位を発見して、優れた活性を有するALAシンテターゼを得るために新しいアイデアを開拓して、物質の基盤を築いた。これに基づいて、本発明を完成した。
本明細書で使用される用語「自然状態」は、微生物で変形されていない状態のポリペプチドの活性、すなわち、自然状態での活性を指す。
「ALAシンテターゼ」
本明細書で使用される用語「5−アミノレブリン酸シンテターゼ」と、本発明の「ALAシンテターゼ」および「本発明のポリペプチド」は、相互交換して使用することができ、当業者に一般的に理解される意味を有する。本発明のALAシンテターゼは、サクシニルCoAおよびグリシンからのALA合成を触媒する活性を有する。
「ALAシンテターゼ」
本明細書で使用される用語「5−アミノレブリン酸シンテターゼ」と、本発明の「ALAシンテターゼ」および「本発明のポリペプチド」は、相互交換して使用することができ、当業者に一般的に理解される意味を有する。本発明のALAシンテターゼは、サクシニルCoAおよびグリシンからのALA合成を触媒する活性を有する。
具体的に、本発明のALAシンテターゼのアミノ酸配列の第403番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第403番またはC末端のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
前記ALAシンテターゼのC末端に1−N個の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは1−10、好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加する。
前記ALAシンテターゼのC末端に1−N個の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは1−10、好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加する。
当業者は、活性を向上させるため、野生型ポリペプチドを突然変異をさせることが必要な目的の部位を見つけることよりも重要であることを知っている。したがって、本発明の教示に基づいて、当業者は、改良されるALAシンテターゼの対応する第403番またはC末端アミノ酸残基を欠失させたりまたは突然変異させるか、またはC末端に1−N個の任意のアミノ酸残基を添加して、変異体の関連活性を測定した。
具体的な実施形態において、本発明のALAシンテターゼの第403番またはC末端のアミノ酸残基は、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Ile、Leu、Lys、Metに欠失したり、突然変異することができる(これに限定されない)。
なお、当業者は、ポリペプチドの特定の領域では、少数のアミノ酸残基を変化させることは生物学的活性を基本的に変化させず、例えば、特定のアミノ酸を適切に置き換えて得られた配列がその活性に影響を与えないことを知っているのは難しくない。(Watsonら,Molecular Biology of The Gene,第4版,1987,The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224を参照することができる)。したがって、当業者は、これらの代替を行い、得られた分子は、まだ所望の生物学的活性を有することを保証することができる。
したがって、本発明は、本発明のALAシンテターゼの保存的変異体を含む。これらの保存的変異体は、下記の表に示したようなアミノ酸置き換えによって生成されることができる。
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであることができ、追加のコーディングおよび/または非コーディング配列をさらに含むポリヌクレオチドであることもできる。
ALAシンテターゼ遺伝子は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に厳しい条件の下で製造されたプローブであることができ、例えば、初期機能を維持する限り、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列の一部または全体配列に相補的な配列と混成化されたDNAである。前記「厳しい条件」は、いわゆる特異的混成化が形成されることができ、非特異的混成化が形成されない条件を指す。例えば、高い相同性を有するDNA、例えば、80 %以上の相同性を有するDNAは互いに混成化され、80%未満の相同性を有するDNAは互いに混成化されていない条件、または通常のSouthern混成化洗浄条件、すなわち60 ℃、1 * SSC、0.1 %のSDS、好ましくは、60 ℃、0.1 * SSC、0.1 %のSDS、より好ましくは68 ℃、0.1 * SSC、0.1 %のSDSの塩濃度と温度下で1回洗浄し、好ましくは2〜3回洗浄する条件を意味する。
なお、コドンの変性は、宿主に応じて異なるので、ALAシンテターゼ遺伝子での任意のコドンは、対応される同等のコドンで置き換えることができ、すなわち、ALAシンテターゼ遺伝子は、遺伝子コードの変性により、上記の例の任意のALAシンテターゼ遺伝子の突然変異であることができる。例えば、ALAシンテターゼ遺伝子は、使用された宿主でのコドンの頻度に応じて最適のコドンを有するように変形された遺伝子であることができる。
したがって、具体的な実施形態において、前記ALAシンテターゼ遺伝子は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列をコードするDNAとの相同性または配列同一性が80%以上、好ましくは85%以上、好ましくは90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは96%、97%、98%、99%であるDNAであることができる。
したがって、本明細書で使用される「含有する」、「有する」または「含む」は、「含む」、「主に……からなる」、「基本的に……からなる」、および「……からなる」を含み、「主に……からなる」、「基本的に……からなる」、および「……からなる」は、「含有する」、「有する」または「含む」の下位概念に属する。
本明細書で使用される用語「活性断片」は、当業者に一般的に理解されるものと同一または類似の意味を持ち、すべての前記断片のアミノ酸配列が、完全なタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の一部であるが、前記断片は、完全な蛋白質またはポリペプチドと同一または類似の機能または活性を有することを指す。具体的に、本発明において、「活性断片」は、本発明のALAシンテターゼから得られたALAシンテターゼ活性を有する任意のアミノ酸断片を示す。
本発明の教示と、本発明によって具体的に得られたALAシンテターゼに基づいて、当業者は、同一または類似の活性または機能を有する活性断片を得ることが難しくなく、これらの活性断片は、もちろん、本発明の保護範囲内にある必要がある。
「対応する」
本明細書で使用される用語「対応する」は、当業者に一般的に理解される意味を有する。具体的に、「対応する」は、二本鎖の配列の相同性または配列同一性を比較した後、一本鎖配列が、他の一本の配列で指定された位置に対応する位置を示す。したがって、例えば、「SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第11番のアミノ酸残基」の場合には、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列の一端に6×Hisタグが添加されると、得られた変異体でSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応される第11番、第17番であることができる。
本明細書で使用される用語「対応する」は、当業者に一般的に理解される意味を有する。具体的に、「対応する」は、二本鎖の配列の相同性または配列同一性を比較した後、一本鎖配列が、他の一本の配列で指定された位置に対応する位置を示す。したがって、例えば、「SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第11番のアミノ酸残基」の場合には、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列の一端に6×Hisタグが添加されると、得られた変異体でSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応される第11番、第17番であることができる。
上述されたように、既知のALAシンテターゼのアミノ酸配列の相同性は高くないが、そのC末端または403番の部位は、基本的にアラニンである。したがって、本発明のALAシンテターゼは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と必ずしも高い配列相同性または同一性を持つ必要はない。例えば、前記相同性または配列同一性は30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、または70%以上であることができる。具体的な実施形態において、前記相同性または配列同一性は80%以上、90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の相同性であることができる。
当業者に公知された配列相同性または同一性を測定する方法は、コンピュータ分子生物学(Computational Molecular Biology)、Lesk、A.M.編集、オックスフォード大学出版社、ニューヨーク、1988;バイオコンピューティング:情報科学とゲノムプロジェクト(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)、Smith、D.W.編集、学術出版社、ニューヨーク、1993;シーケンスデータのコンピュータ分析(Computer Analysis of Sequence Data)、第1の部分、Griffin、A.M.とGriffin、H.G.編集、Humana Press、ニュージャージー州、1994;分子生物学での配列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)、von Heinje、G.、学術出版社、1987、および配列分析プライマー(Sequence Analysis Primer)、Gribskov、M.およびDevereux、J.編集M Stockton Press、ニューヨーク、 1991とCarillo、H.およびLipman,D.,SIAM J. Applied Math.,48:1073 (1988)を含むが、これに限定されない。相同性を測定する好ましい方法は、試験された配列の間で最大の一致を得るものである。同一性を測定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコンパイルされている。二本鎖の配列の間の同一性を測定する好ましいコンピュータプログラム方法は、GCGパッケージ(Devereux,J.ら,1984)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschul,S,F.ら,1990)を含むが、これらに限定されない。大衆はNCBIおよび他のソースからのBLASTXプログラムを得ることができる(BLAST手帳,Altschul,S.ら,NCBI NLM NIH Bethesda、Md. 20894;Altschul,S.ら,1990)。よく知られているSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を測定することもできる。
宿主細胞
本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、当業者に一般的に理解される意味を有し、すなわち、本発明のALAシンテターゼを生成することができる宿主細胞を指す。言い換えれば、本発明のALAシンテターゼが宿主細胞で発現することができる限り、本発明は、任意の宿主細胞を利用することができる。
本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、当業者に一般的に理解される意味を有し、すなわち、本発明のALAシンテターゼを生成することができる宿主細胞を指す。言い換えれば、本発明のALAシンテターゼが宿主細胞で発現することができる限り、本発明は、任意の宿主細胞を利用することができる。
例えば、本発明に適用される宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、ロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドシュードモナスパルストリス(Rhodopseudomonas palustris)由来することができ(これに限定されない)、より好ましくは、大腸菌またはコリネバクテリウムグルタミカムである。
固定化酵素
本明細書で使用される用語「固定化酵素」は、当業者に一般的に理解される意味を有する。具体的に、前記用語は、水溶性の酵素が物理的または化学的方法で処理された後、酵素が水不溶性巨大分子担体に結合されたり、酵素をその中に包埋されて、酵素が水で可溶性ゲルまたは半透膜マイクロカプセルを形成して流動性が減少されたことを示す。
本明細書で使用される用語「固定化酵素」は、当業者に一般的に理解される意味を有する。具体的に、前記用語は、水溶性の酵素が物理的または化学的方法で処理された後、酵素が水不溶性巨大分子担体に結合されたり、酵素をその中に包埋されて、酵素が水で可溶性ゲルまたは半透膜マイクロカプセルを形成して流動性が減少されたことを示す。
固定化された酵素は、まだ酵素活性を有し、触媒反応で固体状態での基質に作用する。酵素は、一般的に固定された後、安定性が増加し、反応システムから分離されやすく、制御が容易で、繰り返して複数回使用することができ、輸送と保管に便利で自動化生産に有利である。固定化酵素は、過去10年の間に開発された酵素応用技術で、工業生産、化学分析、医薬などの方面で魅力的な応用の見通しを持っている。
本明細書の教示を考慮すると、当業者は、本発明のALAシンテターゼをグリシンとサクシニルCoAからALAの生産を触媒するために、固定化酵素または全細胞触媒の形態に処理することは難しくない。
本発明の応用および利点
1.本発明のALAシンテターゼは、工業的に適用され、ALAの低コスト生産を実現することができ、
2.本発明のALAシンテターゼは活性が高く、工業界で広範囲の応用の見通しを有し、
3.本発明は、改良ALAシンテターゼの突然変異部位を提供し、これらの部位の突然変異は改良されるALAシンテターゼの酵素活性を効果的に向上させることができる。
1.本発明のALAシンテターゼは、工業的に適用され、ALAの低コスト生産を実現することができ、
2.本発明のALAシンテターゼは活性が高く、工業界で広範囲の応用の見通しを有し、
3.本発明は、改良ALAシンテターゼの突然変異部位を提供し、これらの部位の突然変異は改良されるALAシンテターゼの酵素活性を効果的に向上させることができる。
以下、具体的な実施例に結びつけて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を制限しないことを理解されたい。下記の実施例で具体的な実験条件を明示していない実験方法は通常の条件、例えばSambrookら、分子クローン:実験室ハンドブック(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)に基づく条件、または製造メーカーで提案される条件に従う。
材料と方法
本発明の実施例に使用されたDNAポリメラーゼは、Dalian Bao Biological CompanyのPyrobestから購入し、制限酵素およびDNAリガーゼなどはすべてFermentas社から購入し、
酵母粉末とペプトンは、英国Oxoid会社から購入された製品であり、グリシンとIPTGはPromega社から購入し、ALAとP−ジメチルアミノベンズアルデヒド(P−dimethylaminobenzaldehyde)などは、Sigma社から購入し、ペルクロルヘム、寒天粉末、抗生物質はBeijing Solarbioから購入し、グルコース、氷酢酸、過塩素酸、トリクロロ酢酸(trichloroacetic acid)、アセチルアセトンクロロホルム(acetylacetone chloroform)およびその他の一般的に使用される化学試薬はすべてTCMから購入した。
本発明の実施例に使用されたDNAポリメラーゼは、Dalian Bao Biological CompanyのPyrobestから購入し、制限酵素およびDNAリガーゼなどはすべてFermentas社から購入し、
酵母粉末とペプトンは、英国Oxoid会社から購入された製品であり、グリシンとIPTGはPromega社から購入し、ALAとP−ジメチルアミノベンズアルデヒド(P−dimethylaminobenzaldehyde)などは、Sigma社から購入し、ペルクロルヘム、寒天粉末、抗生物質はBeijing Solarbioから購入し、グルコース、氷酢酸、過塩素酸、トリクロロ酢酸(trichloroacetic acid)、アセチルアセトンクロロホルム(acetylacetone chloroform)およびその他の一般的に使用される化学試薬はすべてTCMから購入した。
プラスミド抽出キットとアガロースゲル電気泳動回収キットは、Shanghai Sangonから購入し、関連操作はマニュアルに従って厳しく実行され、
プラスミドの構築シーケンス検証はGENEWIZによって完了され、
E. coil DH5α適格細胞は、Beijing TransGen会社から購入した。
プラスミドの構築シーケンス検証はGENEWIZによって完了され、
E. coil DH5α適格細胞は、Beijing TransGen会社から購入した。
LB培地成分:5 g/Lの酵母粉末、10 g/Lのペプトン、10 g/LのNaCl、固体培地に2%の寒天粉末を添加した。
M9培地成分:17.1 g/LのNa2HPO4・12H2O、3.0 g/LのKH2PO4、0.5 g/LのNaCl、1.0 g/LのNH4Cl、2 mMのMgSO4、0.1 mMのCaCl2、20 g/Lのグルコース、2 g/Lの酵母粉末である。
M9培地成分:17.1 g/LのNa2HPO4・12H2O、3.0 g/LのKH2PO4、0.5 g/LのNaCl、1.0 g/LのNH4Cl、2 mMのMgSO4、0.1 mMのCaCl2、20 g/Lのグルコース、2 g/Lの酵母粉末である。
抗生物質の濃度は、100 μg/mLのアンピシリン(Ampicillin)、50 μg/mLのカナマイシン(Kanamycin)である。
ALAの検出方法:200μLの希釈された発酵液または酵素活性の測定反応が終了したサンプルを、100μLのpH4.6である酢酸ナトリウム(sodium acetate)緩衝液に添加した後、5μLのアセチルアセトン(acetylacetone)を入れて、100 ℃のウェトバス(water bath)で15分間インキュベーション(incubation)し、室温まで冷却した後、同じ体積のEhrlish’s試薬(42 mLの氷酢酸、8 mLの70%の過塩素酸、1 gのジメチルアミノベンズアルデヒド(dimethylaminobenzaldehyde)を入れて混合し、10分間発色させた後、553 nmの波長での吸光度を測定した。
ALAの検出方法:200μLの希釈された発酵液または酵素活性の測定反応が終了したサンプルを、100μLのpH4.6である酢酸ナトリウム(sodium acetate)緩衝液に添加した後、5μLのアセチルアセトン(acetylacetone)を入れて、100 ℃のウェトバス(water bath)で15分間インキュベーション(incubation)し、室温まで冷却した後、同じ体積のEhrlish’s試薬(42 mLの氷酢酸、8 mLの70%の過塩素酸、1 gのジメチルアミノベンズアルデヒド(dimethylaminobenzaldehyde)を入れて混合し、10分間発色させた後、553 nmの波長での吸光度を測定した。
粗酵素活性測定の手順は、下記の通りである。
(1)遠心分離して収集し、−80℃の温度に保持した菌体(OD600 = 25)を1 mLのTris−HCl buffer(pH7.5、100 mMのNaClを含有する)に再懸濁させ、
(2)MPで細胞破壊:6 M/S、30秒の条件で7回破壊し、
(3)上記のステップで得られた細胞破壊液を遠心分離して上澄み液を収集し、
(4)タンパク質濃度は、Thermo Scientific社のBCAタンパク質定量キットを使用してマニュアルを参照して、測定した。
(1)遠心分離して収集し、−80℃の温度に保持した菌体(OD600 = 25)を1 mLのTris−HCl buffer(pH7.5、100 mMのNaClを含有する)に再懸濁させ、
(2)MPで細胞破壊:6 M/S、30秒の条件で7回破壊し、
(3)上記のステップで得られた細胞破壊液を遠心分離して上澄み液を収集し、
(4)タンパク質濃度は、Thermo Scientific社のBCAタンパク質定量キットを使用してマニュアルを参照して、測定した。
酵素活性の測定:測定反応は総体積が200μLである50 mMのTris−HCl緩衝液(pH7.5、100 mMのNaClを含有)システムで実行され、酵素反応システムでは、各成分は、表1に示した通りである。10μLの細胞破壊上澄み液を入れて、金属バス(bath)で37 ℃の温度下で6分間振とう反応させた後、システムに100μLの10%のトリクロロ酢酸溶液を入れて反応を終了させた。
実施例1.ALAシンテターゼ構造分析
文献では、ロドバクターカプスラータ(Rhodobacter capsulatus)に由来するALAシンテターゼ(RcA)のタンパク質構造(PDBデータベース番号:2BWN)およびその基質であるグリシン(PDBデータベース番号:2BWP)およびスクシニル−CoA(PDBデータベース番号:2BWO)と共結晶化したそのタンパク質構造を報告している。ここで、Arg374部位はグリシンと直接相互作用し、Thr365部位はスクシニル−CoAと直接相互作用する(Astner et al. EMBO Journal 2005; 24: 3166−3177)。前記酵素の構造を分析した後、そのアミノ酸配列の2つの領域332−348および358−374(紫色で表示)が基質結合に関連し(図1を参照)、前記領域には、グリシンと直接相互作用するArg374部位と、スクシニル−CoAと直接相互作用するThr365部位が含まれ、その柔軟なC末端は前記2つの領域の空間位置に近いことを分かった。本発明者らは、前記柔軟なC末端残基の変異が前記基質構造の上記2つの領域間に異なる相互作用を引き起こし、それにより基質結合およびALAシンテターゼ活性に影響を及ぼし得ると推測した。
文献では、ロドバクターカプスラータ(Rhodobacter capsulatus)に由来するALAシンテターゼ(RcA)のタンパク質構造(PDBデータベース番号:2BWN)およびその基質であるグリシン(PDBデータベース番号:2BWP)およびスクシニル−CoA(PDBデータベース番号:2BWO)と共結晶化したそのタンパク質構造を報告している。ここで、Arg374部位はグリシンと直接相互作用し、Thr365部位はスクシニル−CoAと直接相互作用する(Astner et al. EMBO Journal 2005; 24: 3166−3177)。前記酵素の構造を分析した後、そのアミノ酸配列の2つの領域332−348および358−374(紫色で表示)が基質結合に関連し(図1を参照)、前記領域には、グリシンと直接相互作用するArg374部位と、スクシニル−CoAと直接相互作用するThr365部位が含まれ、その柔軟なC末端は前記2つの領域の空間位置に近いことを分かった。本発明者らは、前記柔軟なC末端残基の変異が前記基質構造の上記2つの領域間に異なる相互作用を引き起こし、それにより基質結合およびALAシンテターゼ活性に影響を及ぼし得ると推測した。
なお、本発明者らは、ロドシュードモナスパルストリス(Rhodopseudomonas palustris)ATCC17001に由来するHemA(RpA)の構造もシミュレーションしたが、前記酵素のアミノ酸配列は、前記タンパク質構造が解析されたロドバクターカプスラータALAシンテターゼの(RcA)の配列同一性はわずか56%であるが、シミュレーションで予測されたタンパク質構造は前記構造に似ており、C末端(403番)に類似の柔軟な領域があり、C末端403番の変異は基質結合とALAシンテターゼ活性に影響を与える可能性があると推測した。
実施例2.異なる種に由来するALAシンテターゼ配列分析
まず、本発明者らは、報告されている異なるロドシュードモナスパルストリス亜種のHemAのアミノ酸配列を比較および分析し、異なる株間の配列同一性が非常に高く、94%に達し、C末端403番のアミノ酸残基は高度に保存されており、すべてアラニンである(図2を参照)ことを発見した。
まず、本発明者らは、報告されている異なるロドシュードモナスパルストリス亜種のHemAのアミノ酸配列を比較および分析し、異なる株間の配列同一性が非常に高く、94%に達し、C末端403番のアミノ酸残基は高度に保存されており、すべてアラニンである(図2を参照)ことを発見した。
本発明者らは、さらに、配列アラインメントの範囲を拡大し、NCBIでロドシュードモナスパルストリスATCC17001 HemA(RpA)アミノ酸配列のBlastアラインメントを実行して、ALAシンテターゼと注釈された配列を分析した。報告されているALAシンテターゼ種の由来は異なるが、ALAシンテターゼのアミノ酸配列のC末端または第403番はほとんどはアラニンである。具体的なアラインメント結果は図3に示したとおりである。
例えば、タンパク質構造が解析されたロドバクターカプスラータのALAシンテターゼ(RcA)は、ロドシュードモナスパルストリスのRpAアミノ酸配列と59%同一であるが、C末端の401番もアラニンである。別の例として、ALA生合成で最も一般的に使用されているロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)のALAシンテターゼ(RsA)は、ロドシュードモナスパルストリスのRpAアミノ酸配列と57%同一であるが、その403番およびC末端407番はまだアラニンである。実施例1におけるタンパク質構造の解析を組み合わせると、本発明者らはさらに、ALAシンテターゼのC末端または403番における変異が、異なる種に由来するALAシンテターゼの活性を増強し得ると推測した。
実施例3.ロドシュードモナスパルストリスATCC17001 HemA(RpA)変異体担体の構築
StratageneシリーズQuikChange(登録商標)XL−II部位指定突然変異キットを使用して、39対のプライマー(表2参照)を設計し、pEC−XK99E−hemA野生型プラスミドをテンプレートとして(構築プロセスは、コリネバクテリウムグルタミカムによる5−アミノレブリン酸合成経路の構築と発酵の最適化[J]。生物技術通報,2017,33(01):148−156.を参照)、上記プライマーを利用してPCR増幅して、ロドシュードモナスパルストリスATCC17001 HemA(RpA)の第403番アミノ酸残基をそれぞれアルギニン(R)、アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、システイン(C)、グルタミン(Q)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、リジン(K)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、プロリン(P)、セリン(S)、トレオニン(T)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、バリン(V)に突然変異させる。PCR反応条件は、95 ℃の温度下で5 分間、10 回のサイクル(95 ℃で30 秒、74 ℃−65 ℃で30 秒、72 ℃で4.5 分間)、13 回のサイクル(95 ℃で30 秒、65 ℃で30 秒、72 ℃で4.5 分間)、72 ℃で10 分間行う。PCR増幅システム(50 μL)は、1μLのテンプレート、それぞれ1μLの上流および下流プライマー、4μLのdNTP mix、10μLの5×TransStart(登録商標) Fast Pfu Fly Buffer、32μLの滅菌された二重蒸留水、1μLのTransStart(登録商標) FastPfu Fly DNA Polymeraseである。上記PCR産物をゲル回収キットを使用して精製および回収し、大腸菌DH5α適格細胞に形質転換させ、カナマイシンを含有するLBプレートにコーティングして、37 ℃の温度下で一晩培養し、形質転換体のシーケンスによって検証し、正確な発現担体をそれぞれp403R、p403N、p403D、p403C、p403Q、p403E、p403G、p403H、p403I、p403L、p403K、p403M、p403F、p403P、p403S、p403T、p403W、p403Y、p403Vと命名した。
StratageneシリーズQuikChange(登録商標)XL−II部位指定突然変異キットを使用して、39対のプライマー(表2参照)を設計し、pEC−XK99E−hemA野生型プラスミドをテンプレートとして(構築プロセスは、コリネバクテリウムグルタミカムによる5−アミノレブリン酸合成経路の構築と発酵の最適化[J]。生物技術通報,2017,33(01):148−156.を参照)、上記プライマーを利用してPCR増幅して、ロドシュードモナスパルストリスATCC17001 HemA(RpA)の第403番アミノ酸残基をそれぞれアルギニン(R)、アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、システイン(C)、グルタミン(Q)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、リジン(K)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、プロリン(P)、セリン(S)、トレオニン(T)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、バリン(V)に突然変異させる。PCR反応条件は、95 ℃の温度下で5 分間、10 回のサイクル(95 ℃で30 秒、74 ℃−65 ℃で30 秒、72 ℃で4.5 分間)、13 回のサイクル(95 ℃で30 秒、65 ℃で30 秒、72 ℃で4.5 分間)、72 ℃で10 分間行う。PCR増幅システム(50 μL)は、1μLのテンプレート、それぞれ1μLの上流および下流プライマー、4μLのdNTP mix、10μLの5×TransStart(登録商標) Fast Pfu Fly Buffer、32μLの滅菌された二重蒸留水、1μLのTransStart(登録商標) FastPfu Fly DNA Polymeraseである。上記PCR産物をゲル回収キットを使用して精製および回収し、大腸菌DH5α適格細胞に形質転換させ、カナマイシンを含有するLBプレートにコーティングして、37 ℃の温度下で一晩培養し、形質転換体のシーケンスによって検証し、正確な発現担体をそれぞれp403R、p403N、p403D、p403C、p403Q、p403E、p403G、p403H、p403I、p403L、p403K、p403M、p403F、p403P、p403S、p403T、p403W、p403Y、p403Vと命名した。
実施例4.組換え菌株の構築と発酵検証
RpA突然変異の正確な発現担体を構築してC. glutamicum ATCC13032菌株に形質転換し、工学菌株を得て、RpA変異体工学菌株を24ウェルプレートでALA発酵させ、変異体工学菌株を酵母粉末を含有したM9培地の24ウェルプレートで16時間培養して、シード溶液(seed solutions)とし、0.5である初期OD600によりM9培地を含有した24ウェルプレートに移し、発酵を検証し、3時間培養し、誘導剤IPTG 100 μMの最終濃度で添加し、24時間後、発酵が終了し、ALAシンテターゼ粗酵素活性とALA生産量を測定した。粗酵素活性の検出方法は、ALAの検出とグルコース分析方法は、「材料と方法」に記載されている通りである。検出後、各変異体の粗酵素活性は、野生型菌株よりすべて向上され、それぞれの組換え菌株のALA生産量は一定の差があり、表3に示したように、野生型菌株のALA生産量を1に設定した。
RpA突然変異の正確な発現担体を構築してC. glutamicum ATCC13032菌株に形質転換し、工学菌株を得て、RpA変異体工学菌株を24ウェルプレートでALA発酵させ、変異体工学菌株を酵母粉末を含有したM9培地の24ウェルプレートで16時間培養して、シード溶液(seed solutions)とし、0.5である初期OD600によりM9培地を含有した24ウェルプレートに移し、発酵を検証し、3時間培養し、誘導剤IPTG 100 μMの最終濃度で添加し、24時間後、発酵が終了し、ALAシンテターゼ粗酵素活性とALA生産量を測定した。粗酵素活性の検出方法は、ALAの検出とグルコース分析方法は、「材料と方法」に記載されている通りである。検出後、各変異体の粗酵素活性は、野生型菌株よりすべて向上され、それぞれの組換え菌株のALA生産量は一定の差があり、表3に示したように、野生型菌株のALA生産量を1に設定した。
結果、野生型と比較して、RpAの403番が非アラニン以外の任意のアミノ酸に突然変異が、ALA生産量を向上させることができ、向上幅が3 %−40 %の間であることが分かった。
実施例5.5 Lの発酵タンクの検証
上記に記載された効果が良い変異体(403番がAsp、Glnに突然変異される)発現菌株を選択して、5 Lの発酵タンクを検証して、発酵培地成分は、5 g/Lの(NH4)2SO4、5 g/LのKH2PO4、2 g/Lのコーンスティープリカー乾燥粉末、2 g/LのMgSO4 7H2O、1 mg/Lのチアミン塩酸塩(Thiamine hydrochloride)であり、発酵過程の制御温度は、30 ℃であり、pH6.5であり、溶存酸素は30%以上である。結果、上記菌株のALA生産量がそれぞれ20.6 g/L、22 g/Lに達したが、対照菌株(17.2 g/L)よりそれぞれ20 %、28.4 %向上し、これは上記の変異体を発現する工学菌株が発酵タンクからのレベルで産物ALAの生産量を効果的に向上させることができることを示す。
上記に記載された効果が良い変異体(403番がAsp、Glnに突然変異される)発現菌株を選択して、5 Lの発酵タンクを検証して、発酵培地成分は、5 g/Lの(NH4)2SO4、5 g/LのKH2PO4、2 g/Lのコーンスティープリカー乾燥粉末、2 g/LのMgSO4 7H2O、1 mg/Lのチアミン塩酸塩(Thiamine hydrochloride)であり、発酵過程の制御温度は、30 ℃であり、pH6.5であり、溶存酸素は30%以上である。結果、上記菌株のALA生産量がそれぞれ20.6 g/L、22 g/Lに達したが、対照菌株(17.2 g/L)よりそれぞれ20 %、28.4 %向上し、これは上記の変異体を発現する工学菌株が発酵タンクからのレベルで産物ALAの生産量を効果的に向上させることができることを示す。
実施例6.ロドバクターカプスラータALAシンテターゼ(RcA)C末端アラニン突然変異とその効果の検証
ALAシンテターゼの活性に対するALAシンテターゼのC末端の401番の非アラニンの重要な役割をさらに確認するために、本発明者らは、構造研究を比較的明確で、ALA生合成で成功的に応用されたロドバクターカプスラータ由来のALAシンテターゼ(RcA)(Yang et al. Applied and Environmental Microbiology 2016; 82: 2709−2717)を使用し、異なる特性の3つのアミノ酸(Asp、His、Tyr)をC末端での変異テストに選択した。
ALAシンテターゼの活性に対するALAシンテターゼのC末端の401番の非アラニンの重要な役割をさらに確認するために、本発明者らは、構造研究を比較的明確で、ALA生合成で成功的に応用されたロドバクターカプスラータ由来のALAシンテターゼ(RcA)(Yang et al. Applied and Environmental Microbiology 2016; 82: 2709−2717)を使用し、異なる特性の3つのアミノ酸(Asp、His、Tyr)をC末端での変異テストに選択した。
まず、NCBIにより公表された前記RcAアミノ酸配列(SEQ ID NO:43;GenBank: AML83926.1)に従って、対応するDNAコーディング配列(SEQ ID NO:44)を合成した。上記の合成された遺伝子断片をテンプレートとして使用して、DNA配列に従ってプライマーを設計し(表4を参照)、PCR増幅により、C末端第401番のアラニンをアスパラギン酸(Asp)、ヒスチジン(His)、チロシン(Tyr)の遺伝子断片および野生型遺伝子断片にそれぞれ置換し、同時にpEC−Rc−F/Rプライマーを使用してpEC−XK99E−hemAを逆増幅し、元のheMA遺伝子が除去されたプラスミド断片を得た。PCR反応条件:95 ℃で5 分、10 サイクル(95 ℃で30 秒、65 ℃−55 ℃で30 秒、72 ℃で4分)、20 サイクル(95 ℃で30 秒、55 ℃で30 秒、72 ℃で4分)、72 ℃で5 分。PCR増幅システム(50 μL):テンプレート1μL、上流および下流プライマーそれぞれ1 μL、dNTPミックス4 μL、5×TransStart(登録商標)Fast Pfu Fly Buffer 10 μL、滅菌済み再蒸留水32 μL、TransStart(登録商標)FastPfu Fly DNA ポリメラーゼ1 μL。ゲル回収キットを用いて前記PCR産物を精製および回収し、組換えキットを用いて前記標的遺伝子断片およびプラスミド断片を組換え、大腸菌T1コンピテントセルに形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートでコーティングし、37 ℃で一晩インキュベートし、形質転換体を配列決定して、正しい組換えベクターをpRc401WT、pRc401D、pRc401H、およびpRc401Yと命名した。
続いて、前記ベクターをC. glutamicum ATCC13032株に形質転換し、対応する組換え株を得た。24ウェルプレートを用いた前記株を発酵検証し、培養プロセスおよびパラメーターは実施例4と同じであった。発酵結果は、ロドバクターカプスラータALAシンテターゼ(RcA)C末端401番アラニンのアスパラギン酸、ヒスチジン、チロシンへの変異が酵素の活性を大幅に高めることができ、組換え株ALA収量はそれぞれ野生型酵素を発現する対照株より19 %、15 %、11 %増加したことを示した。
SEQ ID NO:43、ロドバクターカプスラータ(Rhodobacter capsulatus)ALAシンテターゼ(RcA)アミノ酸配列
MDYNLALDKAIQKLHDEGRYRTFIDIEREKGAFPKAQWNRPDGGKQDITVWCGNDYLGMGQHPVVLAAMHEALEAVGAGSGGTRNISGTTAYHRRLEAEIADLHGKEAALVFSSAYIANDATLSTLRVLFPGLIIYSDSLNHASMIEGIKRNAGPKRIFRHNDVAHLRELIAADDPAAPKLIAFESVYSMDGDFGPIKEICDIADEFGALTYIDEVHAVGMYGPRGAGVAERDGLMHRIDIFNGTLAKAYGVFGGYIAASAKMVDAVRSYAPGFIFSTSLPPAIAAGAQASIAFLKTAEGQKLRDAQQMHAKVLKMRLKALGMPIIDHGSHIVPVVIGDPVHTKAVSDMLLSDYGVYVQPINFPTVPRGTERLRFTPSPVHDLKQIDGLVHAMDLLWARCA
SEQ ID NO:44:ロドバクターカプスラータ(Rhodobacter capsulatus)ALAシンテターゼ(RcA)DNA配列
ATGGACTACAATCTCGCGCTCGACAAAGCGATCCAGAAACTCCACGACGAGGGACGTTACCGCACGTTCATCGACATCGAACGCGAGAAGGGCGCCTTCCCCAAGGCGCAGTGGAACCGCCCCGATGGCGGCAAGCAGGACATCACCGTCTGGTGCGGCAACGACTATCTGGGCATGGGCCAGCACCCGGTCGTTCTGGCCGCGATGCATGAGGCGCTGGAAGCGGTCGGGGCCGGTTCGGGCGGCACCCGCAACATCTCGGGCACCACGGCCTATCACCGCCGTCTGGAAGCCGAGATCGCCGATCTGCACGGCAAGGAAGCGGCGCTTGTCTTCTCCTCGGCCTATATCGCCAATGACGCGACGCTCTCGACGCTGCGGCTGCTTTTCCCCGGCCTGATCATCTATTCCGACAGCCTGAACCACGCCTCGATGATCGAGGGGATCAAGCGCAATGCCGGGCCGAAGCGGATCTTCCGTCACAATGACGTCGCCCATCTGCGCGAGCTGATCGCCGCTGATGATCCGGCCGCGCCGAAGCTGATCGCCTTCGAATCGGTCTATTCGATGGATGGCGACTTCGGCCCGATCAAGGAAATCTGCGACATCGCCGATGAATTCGGCGCGCTGACCTATATCGACGAAGTCCATGCCGTCGGCATGTATGGCCCCCGCGGCGCGGGCGTGGCCGAGCGTGACGGTCTGATGCACCGCATCGACATCTTCAACGGCACGCTGGCGAAAGCCTATGGCGTCTTCGGCGGCTACATCGCCGCTTCGGCGAAGATGGTCGATGCCGTGCGCTCCTATGCGCCGGGCTTCATCTTCTCGACCTCGCTGCCGCCGGCGATCGCCGCTGGCGCGCAGGCCTCGATCGCGTTTTTGAAAACCGCCGAAGGGCAGAAGCTGCGCGACGCGCAACAGATGCACGCGAAGGTGCTGAAAATGCGGCTCAAGGCGCTGGGGATGCCGATCATCGACCATGGCAGCCACATCGTTCCGGTGGTCATCGGTGACCCCGTGCACACCAAGGCGGTGTCGGACATGCTCCTGTCGGATTACGGCGTTTACGTGCAGCCGATCAACTTCCCGACGGTGCCGCGCGGCACCGAACGGCTGCGCTTCACCCCCTCGCCGGTGCATGACCTGAAACAGATCGACGGGCTGGTTCATGCCATGGATCTGCTCTGGGCGCGCTGTGCGTAA
実施例7.ロドバクタースフェロイデスALAシンテターゼ(RsA)C末端および第403番の変異およびその効果の検証
ALAシンテターゼの活性におけるC末端または第403番での非アラニンの重要な役割を再確認するために、本発明者らはさらに、最も一般的に使用されるALA生合成であるロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)に由来するALAシンテターゼ(RsA)を選択し(アミノ酸配列は、SEQ ID NO:42を参照)、変異効果をテストするために、それぞれその403番およびC末端407番のアラニンをAspに置き換えた。
MDYNLALDKAIQKLHDEGRYRTFIDIEREKGAFPKAQWNRPDGGKQDITVWCGNDYLGMGQHPVVLAAMHEALEAVGAGSGGTRNISGTTAYHRRLEAEIADLHGKEAALVFSSAYIANDATLSTLRVLFPGLIIYSDSLNHASMIEGIKRNAGPKRIFRHNDVAHLRELIAADDPAAPKLIAFESVYSMDGDFGPIKEICDIADEFGALTYIDEVHAVGMYGPRGAGVAERDGLMHRIDIFNGTLAKAYGVFGGYIAASAKMVDAVRSYAPGFIFSTSLPPAIAAGAQASIAFLKTAEGQKLRDAQQMHAKVLKMRLKALGMPIIDHGSHIVPVVIGDPVHTKAVSDMLLSDYGVYVQPINFPTVPRGTERLRFTPSPVHDLKQIDGLVHAMDLLWARCA
SEQ ID NO:44:ロドバクターカプスラータ(Rhodobacter capsulatus)ALAシンテターゼ(RcA)DNA配列
ATGGACTACAATCTCGCGCTCGACAAAGCGATCCAGAAACTCCACGACGAGGGACGTTACCGCACGTTCATCGACATCGAACGCGAGAAGGGCGCCTTCCCCAAGGCGCAGTGGAACCGCCCCGATGGCGGCAAGCAGGACATCACCGTCTGGTGCGGCAACGACTATCTGGGCATGGGCCAGCACCCGGTCGTTCTGGCCGCGATGCATGAGGCGCTGGAAGCGGTCGGGGCCGGTTCGGGCGGCACCCGCAACATCTCGGGCACCACGGCCTATCACCGCCGTCTGGAAGCCGAGATCGCCGATCTGCACGGCAAGGAAGCGGCGCTTGTCTTCTCCTCGGCCTATATCGCCAATGACGCGACGCTCTCGACGCTGCGGCTGCTTTTCCCCGGCCTGATCATCTATTCCGACAGCCTGAACCACGCCTCGATGATCGAGGGGATCAAGCGCAATGCCGGGCCGAAGCGGATCTTCCGTCACAATGACGTCGCCCATCTGCGCGAGCTGATCGCCGCTGATGATCCGGCCGCGCCGAAGCTGATCGCCTTCGAATCGGTCTATTCGATGGATGGCGACTTCGGCCCGATCAAGGAAATCTGCGACATCGCCGATGAATTCGGCGCGCTGACCTATATCGACGAAGTCCATGCCGTCGGCATGTATGGCCCCCGCGGCGCGGGCGTGGCCGAGCGTGACGGTCTGATGCACCGCATCGACATCTTCAACGGCACGCTGGCGAAAGCCTATGGCGTCTTCGGCGGCTACATCGCCGCTTCGGCGAAGATGGTCGATGCCGTGCGCTCCTATGCGCCGGGCTTCATCTTCTCGACCTCGCTGCCGCCGGCGATCGCCGCTGGCGCGCAGGCCTCGATCGCGTTTTTGAAAACCGCCGAAGGGCAGAAGCTGCGCGACGCGCAACAGATGCACGCGAAGGTGCTGAAAATGCGGCTCAAGGCGCTGGGGATGCCGATCATCGACCATGGCAGCCACATCGTTCCGGTGGTCATCGGTGACCCCGTGCACACCAAGGCGGTGTCGGACATGCTCCTGTCGGATTACGGCGTTTACGTGCAGCCGATCAACTTCCCGACGGTGCCGCGCGGCACCGAACGGCTGCGCTTCACCCCCTCGCCGGTGCATGACCTGAAACAGATCGACGGGCTGGTTCATGCCATGGATCTGCTCTGGGCGCGCTGTGCGTAA
実施例7.ロドバクタースフェロイデスALAシンテターゼ(RsA)C末端および第403番の変異およびその効果の検証
ALAシンテターゼの活性におけるC末端または第403番での非アラニンの重要な役割を再確認するために、本発明者らはさらに、最も一般的に使用されるALA生合成であるロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)に由来するALAシンテターゼ(RsA)を選択し(アミノ酸配列は、SEQ ID NO:42を参照)、変異効果をテストするために、それぞれその403番およびC末端407番のアラニンをAspに置き換えた。
まず、文献(Meng et al. Biotechnology Letters, 2015, 37(11): 2247−2253)に開示されているロドバクタースフェロイデス由来のRshemA遺伝子の配列(SEQ ID NO:45)に基づいてプライマー(表5に示すように)を設計し、pRsA(Chen et al. Biotechnology for Biofuels, 2020, 13: 41)をテンプレートとして使用して、PCR増幅を実行し、それぞれ第403番とC末端の第407番アラニンをアスパラギン酸(Asp)に置換したプラスミド断片を得た。PCR反応条件:95 ℃で5 分、10サイクル(95 ℃で30 秒、65 ℃−55 ℃で30 秒、72 ℃で4 分)、20 サイクル(95 ℃で30 秒、55 ℃で30 秒、72 ℃で4 分)、72 ℃で5 分。PCR増幅システム(50 μL):テンプレート1 μL、上流および下流プライマーそれぞれ1 μL、dNTPミックス4 μL、5×TransStart(登録商標)Fast Pfu Fly Buffer 10 μL、滅菌済み再蒸留水32 μL、TransStart(登録商標)FastPfu Fly DNA ポリメラーゼ1 μL。ゲル回収キットを用いて前記PCR産物を精製および回収し、T4 PNKを使用してリン酸化した後、T4リガーゼでライゲーションして大腸菌T1コンピテントセルを形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートでコーティングし、37℃で一晩インキュベートし、形質転換体を配列決定して、正しい組換えベクターをpRs403DおよびpRs407Dと命名した。
続いて、前記株とpRsAを保有する対照株を24ウェルプレートを用いた発酵により検証した。組換え株をLB培地で12時間シード溶液として培養し、初期OD600が0.1のM9培地を含む24ウェルプレートに移して発酵を確認し、3時間培養した後、最終濃度50 uMのIPTGを添加して誘導し、20時間後発酵が完了し、ALA生産量を検出した。発酵の結果は、第403番および第407番のアラニンのアスパラギン酸への変異がロドバクタースフェロイデスALAシンテターゼ(RsA)の活性を大幅に高めることができ、組換え株ALA収量はそれぞれ野生型酵素を発現する対照株より11 %、22 %増加したことを示した。
SEQ ID NO:42、ロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)ALAシンテターゼ(RsA)アミノ酸配列
MDYNLALDTALNRLHTEGRYRTFIDIERRKGAFPKAMWRKPDGSEKEITVWCGNDYLGMGQHPVVLGAMHEALDSTGAGSGGTRNISGTTLYHKRLEAELADLHGKEAALVFSSAYIANDATLSTLPQLIPGLVIVSDKLNHASMIEGIRRSGTEKHIFKHNDLDDLRRILTSIGKDRPILVAFESVYSMDGDFGRIEEICDIADEFGALKYIDEVHAVGMYGPRGGGVAERDGLMDRIDIINGTLGKAYGVFGGYIAASSKMCDAVRSYAPGFIFSTSLPPVVAAGAAASVRHLKGDVELREKHQTQARILKMRLKGLGLPIIDHGSHIVPVHVGDPVHCKMISDMLLEHFGIYVQPINFPTVPRGTERLRFTPSPVHDSGMIDHLVKAMDVLWQHCALNRAEVVA
SEQ ID NO:45、ロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)ALAシンテターゼ(RsA)DNA配列
ATGGACTACAACCTGGCGCTGGACACCGCGCTGAACCGTCTGCACACCGAAGGTCGTTACCGTACCTTCATCGACATCGAACGTCGTAAAGGTGCGTTCCCGAAAGCGATGTGGCGTAAACCGGACGGTTCTGAAAAAGAAATCACCGTTTGGTGCGGTAACGACTACCTGGGTATGGGTCAGCACCCGGTTGTTCTGGGTGCGATGCACGAAGCGCTGGACTCTACCGGTGCGGGTTCTGGTGGTACCCGTAACATCTCTGGTACCACCCTGTACCACAAACGTCTGGAAGCGGAACTGGCGGACCTGCACGGTAAAGAAGCGGCGCTGGTTTTCTCTTCTGCGTACATCGCGAACGACGCGACCCTGTCTACCCTGCCGCAGCTGATCCCGGGTCTGGTTATCGTTTCTGACAAACTGAACCACGCGTCTATGATCGAAGGTATCCGTCGTTCTGGTACCGAAAAACACATCTTCAAACACAACGACCTGGACGACCTGCGTCGTATCCTGACCTCTATCGGTAAAGACCGTCCGATCCTGGTTGCGTTCGAATCTGTTTACTCTATGGACGGTGACTTCGGTCGTATCGAAGAAATCTGCGACATCGCGGACGAGTTCGGTGCGCTGAAATACATCGACGAAGTTCACGCGGTTGGTATGTACGGTCCGCGTGGTGGTGGTGTTGCGGAACGTGACGGTCTGATGGACCGTATCGACATCATCAACGGTACCCTGGGTAAAGCGTACGGTGTTTTCGGTGGTTACATCGCGGCGTCTTCTAAAATGTGCGACGCGGTTCGTTCTTACGCGCCGGGTTTCATCTTCTCTACCTCTCTGCCGCCGGTTGTTGCGGCGGGTGCGGCGGCGTCTGTTCGTCACCTGAAAGGTGACGTTGAACTGCGTGAAAAACACCAGACCCAGGCGCGTATCCTGAAAATGCGTCTGAAAGGTCTGGGTCTGCCGATCATCGACCACGGTTCTCACATCGTTCCGGTTCACGTTGGTGACCCGGTTCACTGCAAAATGATCTCTGACATGCTGCTGGAACACTTCGGTATCTACGTTCAGCCGATCAACTTCCCGACCGTTCCGCGTGGTACCGAACGTCTGCGTTTCACCCCGTCTCCGGTTCACGACTCTGGTATGATCGACCACCTGGTTAAAGCGATGGACGTTCTGTGGCAGCACTGCGCGCTGAACCGTGCGGAAGTTGTTGCGTAA
実施例8.ロドシュードモナスパルストリスATCC17001 HemA(RpA)403番欠失および発酵検証
本発明者らは、ALAシンテターゼの活性におけるALAシンテターゼ403番またはC末端の重要性を検証するために、RpAを例にとり、403番を欠失し、欠失後の効果を検証した。テンプレートとしてpEC−XK99E−hemA野生型プラスミドを使用して(構築プロセスについては、コリネバクテリウムグルタミカムで5−アミノレブリン酸を合成する経路の構築と発酵の最適化[J].生物技術通報、2017, 33(01): 148−156.を参照)、プライマーを設計し(表6に示したように)、前記プライマーを使用してPCR増幅を実行し、RpAの第403番のアミノ酸残基を停止コドン(Stop)に変異させた。PCR反応条件、増幅システム、および形質転換の検証は、実施例3と同じであり、正しい発現ベクターp403Stopを取得し、前記発現ベクターをC. glutamicum ATCC13032株に形質転換し、エンジニアリング株C. glutamicum ATCC13032/p403Stopを取得し、24ウェルプレートALA発酵を実行し、粗酵素活性とALA生産量を検出した。ウェルプレート発酵工程は実施例4に示したように、粗酵素活性の検出方法、ALA検出およびグルコース分析方法は、「材料および方法」のセクションに記載されている。検出後、野生型株と比較して、終止コドン(すなわち403番欠失)に変異した粗酵素活性が増加し、403番欠失後のALA生産量は野生株と比較して10%近く増加した。
MDYNLALDTALNRLHTEGRYRTFIDIERRKGAFPKAMWRKPDGSEKEITVWCGNDYLGMGQHPVVLGAMHEALDSTGAGSGGTRNISGTTLYHKRLEAELADLHGKEAALVFSSAYIANDATLSTLPQLIPGLVIVSDKLNHASMIEGIRRSGTEKHIFKHNDLDDLRRILTSIGKDRPILVAFESVYSMDGDFGRIEEICDIADEFGALKYIDEVHAVGMYGPRGGGVAERDGLMDRIDIINGTLGKAYGVFGGYIAASSKMCDAVRSYAPGFIFSTSLPPVVAAGAAASVRHLKGDVELREKHQTQARILKMRLKGLGLPIIDHGSHIVPVHVGDPVHCKMISDMLLEHFGIYVQPINFPTVPRGTERLRFTPSPVHDSGMIDHLVKAMDVLWQHCALNRAEVVA
SEQ ID NO:45、ロドバクタースフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)ALAシンテターゼ(RsA)DNA配列
ATGGACTACAACCTGGCGCTGGACACCGCGCTGAACCGTCTGCACACCGAAGGTCGTTACCGTACCTTCATCGACATCGAACGTCGTAAAGGTGCGTTCCCGAAAGCGATGTGGCGTAAACCGGACGGTTCTGAAAAAGAAATCACCGTTTGGTGCGGTAACGACTACCTGGGTATGGGTCAGCACCCGGTTGTTCTGGGTGCGATGCACGAAGCGCTGGACTCTACCGGTGCGGGTTCTGGTGGTACCCGTAACATCTCTGGTACCACCCTGTACCACAAACGTCTGGAAGCGGAACTGGCGGACCTGCACGGTAAAGAAGCGGCGCTGGTTTTCTCTTCTGCGTACATCGCGAACGACGCGACCCTGTCTACCCTGCCGCAGCTGATCCCGGGTCTGGTTATCGTTTCTGACAAACTGAACCACGCGTCTATGATCGAAGGTATCCGTCGTTCTGGTACCGAAAAACACATCTTCAAACACAACGACCTGGACGACCTGCGTCGTATCCTGACCTCTATCGGTAAAGACCGTCCGATCCTGGTTGCGTTCGAATCTGTTTACTCTATGGACGGTGACTTCGGTCGTATCGAAGAAATCTGCGACATCGCGGACGAGTTCGGTGCGCTGAAATACATCGACGAAGTTCACGCGGTTGGTATGTACGGTCCGCGTGGTGGTGGTGTTGCGGAACGTGACGGTCTGATGGACCGTATCGACATCATCAACGGTACCCTGGGTAAAGCGTACGGTGTTTTCGGTGGTTACATCGCGGCGTCTTCTAAAATGTGCGACGCGGTTCGTTCTTACGCGCCGGGTTTCATCTTCTCTACCTCTCTGCCGCCGGTTGTTGCGGCGGGTGCGGCGGCGTCTGTTCGTCACCTGAAAGGTGACGTTGAACTGCGTGAAAAACACCAGACCCAGGCGCGTATCCTGAAAATGCGTCTGAAAGGTCTGGGTCTGCCGATCATCGACCACGGTTCTCACATCGTTCCGGTTCACGTTGGTGACCCGGTTCACTGCAAAATGATCTCTGACATGCTGCTGGAACACTTCGGTATCTACGTTCAGCCGATCAACTTCCCGACCGTTCCGCGTGGTACCGAACGTCTGCGTTTCACCCCGTCTCCGGTTCACGACTCTGGTATGATCGACCACCTGGTTAAAGCGATGGACGTTCTGTGGCAGCACTGCGCGCTGAACCGTGCGGAAGTTGTTGCGTAA
実施例8.ロドシュードモナスパルストリスATCC17001 HemA(RpA)403番欠失および発酵検証
本発明者らは、ALAシンテターゼの活性におけるALAシンテターゼ403番またはC末端の重要性を検証するために、RpAを例にとり、403番を欠失し、欠失後の効果を検証した。テンプレートとしてpEC−XK99E−hemA野生型プラスミドを使用して(構築プロセスについては、コリネバクテリウムグルタミカムで5−アミノレブリン酸を合成する経路の構築と発酵の最適化[J].生物技術通報、2017, 33(01): 148−156.を参照)、プライマーを設計し(表6に示したように)、前記プライマーを使用してPCR増幅を実行し、RpAの第403番のアミノ酸残基を停止コドン(Stop)に変異させた。PCR反応条件、増幅システム、および形質転換の検証は、実施例3と同じであり、正しい発現ベクターp403Stopを取得し、前記発現ベクターをC. glutamicum ATCC13032株に形質転換し、エンジニアリング株C. glutamicum ATCC13032/p403Stopを取得し、24ウェルプレートALA発酵を実行し、粗酵素活性とALA生産量を検出した。ウェルプレート発酵工程は実施例4に示したように、粗酵素活性の検出方法、ALA検出およびグルコース分析方法は、「材料および方法」のセクションに記載されている。検出後、野生型株と比較して、終止コドン(すなわち403番欠失)に変異した粗酵素活性が増加し、403番欠失後のALA生産量は野生株と比較して10%近く増加した。
実施例9.異なる由来のALAシンテターゼC端伸長効果のテスト
上記のデータおよび結果に基づいて、発明者らは、403番またはC末端のアミノ酸残基を変化させることなく、C末端伸長がALAシンテターゼの活性を増加させるのに有益であり得ると推測した。上記の推測を検証するために、上記3つの異なる由来のALAシンテターゼ(RpA、RcA、およびRsA)を使用して、C末端にランダムにグルタミン酸(Glu)またはグルタミン(Gln)を追加し、C末端の伸長の応用効果をテストしました。
上記のデータおよび結果に基づいて、発明者らは、403番またはC末端のアミノ酸残基を変化させることなく、C末端伸長がALAシンテターゼの活性を増加させるのに有益であり得ると推測した。上記の推測を検証するために、上記3つの異なる由来のALAシンテターゼ(RpA、RcA、およびRsA)を使用して、C末端にランダムにグルタミン酸(Glu)またはグルタミン(Gln)を追加し、C末端の伸長の応用効果をテストしました。
上記異なる由来のALAシンテターゼをコードする遺伝子の配列に従ってプライマーを(表7に示すように)設計した。前述のpEC−XK99E−hemA、pRcWT、およびpRsAをテンプレートとして使用して、PCR増幅して、対応するプラスミド断片を得た。PCR反応条件:95 ℃で5 分、10 サイクル(95 ℃で30 秒、65 ℃−55 ℃で30 秒、72 ℃で4 分)、20 サイクル(95 ℃で30 秒、55 ℃で30 秒、72 ℃で4 分)、72 ℃で5 分。PCR増幅システム(50 μL):テンプレート1 μL、上流および下流プライマーそれぞれ1 μL、dNTPミックス4 μL、5×TransStart(登録商標)Fast Pfu Fly Buffer 10μL、滅菌済み再蒸留水32 μL、TransStart(登録商標)FastPfu Fly DNA ポリメラーゼ1 μL。ゲル回収キットを用いて前記PCR産物を精製および回収し、T4 PNKを使用してリン酸化した後、T4リガーゼでライゲーションして大腸菌T1コンピテントセルを形質転換し、カナマイシンを含むLBプレートでコーティングし、37 ℃で一晩インキュベートし、形質転換体を配列決定して、正しい組換えベクターをpRpE、pRpQ、pRcE、pRcQ、pRsE、pRsQと命名した。
24ウェルプレートを用いて上記株および対応する対照株を発酵検証し、培養プロセスおよびパラメーターは実施例4と同じである。発酵結果は、異なる種に由来するALAシンテターゼC末端に上記のアミノ酸残基を加えた後、ALA収率が10 %−25 %増加したことを示した。
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれている。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本願に添付された特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
Claims (9)
- 5−アミノレブリン酸シンテターゼ(ALAシンテターゼ)またはその活性断片であって、
a.前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列のC末端のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
b.前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応する第403番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
c.前記ALAシンテターゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応する第401番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
d.前記ALAシンテターゼ的アミノ酸配列がSEQ ID NO: 42に示されるアミノ酸配列に対応する第403番または407番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および/または
e.前記ALAシンテターゼのC末端に1つまたは複数の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは1−10の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは1−6つ、より好ましくは1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基およびALAシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加することを特徴とする、前記5−アミノレブリン酸シンテターゼ(ALAシンテターゼ)またはその活性断片。 - 請求項1に記載のALAシンテターゼまたはその活性断片のコーディング核酸配列。
- 請求項1に記載のALAシンテターゼまたはその活性断片のコーディング核酸配列を含む発現担体。
- 請求項1に記載のALAシンテターゼまたはその活性断片を含む宿主細胞。
- ALA生成における請求項1に記載のALAシンテターゼまたはその活性断片、または請求項2に記載のコーディング核酸配列、または請求項3に記載の発現担体、または請求項4に記載の宿主細胞の応用。
- ALAの製造方法であって、
請求項4に記載の宿主細胞を培養するか、請求項4に記載の宿主細胞を休止細胞に製造して、ALAを生成するステップaと、および
培養液からステップaで生成されたALAを選択的に分離するステップbとを含む、前記ALAの製造方法。 - ALAの製造方法であって、
請求項1に記載のALAシンテターゼまたはその活性断片を利用して、サクシニルCoAおよびグリシンからのALA合成を触媒するステップaと、および
前記反応システムからALAを選択的に分離するステップbとを含む、前記ALAの製造方法。 - 請求項1に記載のALAシンテターゼの製造方法であって、
請求項1に記載のALAシンテターゼのコーディング配列を得るステップaと、
ステップaから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップbと、
ステップbから得られた宿主細胞を培養するステップcと、および
ステップcから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたALAシンテターゼを分離するステップdとを含む、前記請求項1に記載のALAシンテターゼの製造方法。 - 改良ALAシンテターゼを提供してその活性を向上させる方法であって、
改良前のALAシンテターゼのアミノ酸配列に対して、改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列の第401番、第403番または第407番、またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換え、および/または前記ALAシンテターゼのC末端に1−N個の任意のアミノ酸残基を、好ましくは1−10、より好ましくは1−6つ、より好ましくは添加1−3つ、最も好ましくは1つの任意のアミノ酸残基を添加し、および/または
改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でSEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列に対応される第403番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるALAシンテターゼのコーディング配列を改良し、および/または
改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列に対応される第403番または第407番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるALAシンテターゼのコーディング配列を改良し、および/または
改良されるALAシンテターゼのアミノ酸配列とSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列に対応される第401番またはC末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるALAシンテターゼのコーディング配列を改良するステップaと、
ステップaから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップbと、
ステップbから得られた宿主細胞を培養するステップcと、および
ステップcから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたALAシンテターゼを分離するステップdとを含む、前記改良ALAシンテターゼを提供してその活性を向上させる方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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