CN109715815A - 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化合物的制造方法 - Google Patents

二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化合物的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了多种MVD的变异体。然后，对于变异体评价对于异戊二烯等烯烃化合物的生成的催化活性，结果发现，通过152位的甘氨酸被替换成其他氨基酸，上述催化活性提高。另外表明，除了152位之外进一步74位的精氨酸和209位的苏氨酸各自被替换成其他氨基酸的MVD也具有高的上述催化活性。

Description

二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化 合物的制造方法
技术领域
本发明涉及利用了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的烯烃化合物的制造方法。另外本发明涉及上述变异体及其制造方法，进一步还涉及编码上述变异体的DNA、和插入了该DNA的载体。另外本发明涉及利用导入了上述DNA或上述载体的宿主细胞的烯烃化合物的制造方法，进一步还涉及包含上述变异体、上述DNA或上述载体的用于促进烯烃化合物的生成的制剂。
背景技术
异戊二烯、异丁烯等烯烃化合物作为合成橡胶等各种合成聚合物的原料极为有用，这些化合物可以通过石油分馏这样的化学方法得到。
然而，即使在这样的化学方法中，其收率也低，花费制造成本，另外需要时间。进而考虑近来的环境问题，要求开发不浪费有限资源的、对环境温和的可持续的烯烃化合物的制造方法以代替化学方法。
鉴于这种状况，尝试了利用或改变微生物等的代谢途径来制造烯烃化合物。例如，开发了对参与甲羟戊酸途径的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶等导入变异，利用该变异酶的异戊二烯、异丁烯等的制造方法(专利文献1～3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2013/092567号
专利文献2：国际公开第2015/004211号
专利文献3：国际公开第2015/021045号
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于上述现有技术存在的课题而做出的，目的是提供能以高生产率制造烯烃化合物的酶。
用于解决课题的方法
本发明者们为了实现上述目的，构想了将以5-二磷酸甲羟戊酸为底物、由二磷酸甲羟戊酸脱羧酶参与的异戊烯基二磷酸的生成(参照下述式)应用于异戊二烯等烯烃化合物的制造。
即，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的氨基酸中导入1个或多个变异，使该酶(二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体)的底物特异性从原来的针对5-二磷酸甲羟戊酸变更为针对3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸等，从而经过如下述式所示的反应而制造异戊二烯等。
因此，本发明者们从前在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了约200个二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体。然后，对于这些变异体，评价了对于以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的催化活性。
其结果发现，74位的精氨酸被替换成组氨酸、且209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(R74HT209R)在约200个变异体的中出类拔萃地对于异戊二烯的生成显示极高的催化活性。
这次，本发明者们为了进一步获得对于异戊二烯的生成显示高催化活性的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体进行了深入研究，结果表明，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的152位的甘氨酸被替换成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(G152X)具有生成异戊二烯的高催化活性。令人惊讶地，在约200个变异体中，与通过将特定的2个部位各自替换成特定的氨基酸而唯一获得的R74HT209R同等的极高催化活性，能够通过将仅1个部位(152位)的氨基酸替换成其他氨基酸(半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)来实现。
接着，本发明者们制备了将前述的显示高催化活性的2种变异R74HT209R与G152X组合而成的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的3重氨基酸变异体，评价了对于异戊二烯的生成的催化活性。其结果对于这些变异体也确认了高催化活性。其中，74位的精氨酸被替换为组氨酸、152位的甘氨酸被替换为半胱氨酸、且209位的苏氨酸被替换为精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(R74HG152CT209R)，对于异戊二烯的生成的催化活性与野生型相比提高约100倍，与对应的单独氨基酸变异体和双重氨基酸变异体(G152C、R74HT209R)相比提高3～4倍。
另外，关于前述的单独氨基酸变异体和三重氨基酸变异体(G152X和R74HG152XT209R)，对于催化其他烯烃化合物(异丁烯)的生成的催化活性也进行了评价。其结果与异戊二烯生成时同样地确认了与野生型相比高的对于异丁烯的生成的催化活性，从而完成了本发明。即，即，本发明提供以下＜1＞～＜24＞。
＜1＞烯烃化合物的制造方法，包括：在序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶存在下，使下述式(1)所示的化合物与ATP反应的工序，
式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子，上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代。
＜2＞烯烃化合物的制造方法，包括：将导入了以下DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，采集该宿主细胞和/或其培养物中生成的烯烃化合物的工序，上述DNA编码序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的制造方法，在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸所变异成的其他氨基酸是半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞的任一项所述的制造方法，上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是进一步序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成其他氨基酸、且序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
＜5＞根据＜1＞～＜3＞的任一项所述的制造方法，上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是进一步序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成组氨酸、且序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
＜6＞根据＜1＞～＜5＞的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异戊二烯。
＜7＞根据＜1＞～＜5＞的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异丁烯。
＜8＞生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的制造方法，该制造方法包括：在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的工序。
＜9＞根据＜8＞所述的制造方法，在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸所变异成的其他氨基酸是半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
＜10＞根据＜8＞或＜9＞所述的制造方法，进一步包括：在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成其他氨基酸、且使序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的工序。
＜11＞根据＜8＞或＜9＞所述的制造方法，进一步包括：在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成组氨酸、且使序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成精氨酸的工序。
＜12＞根据＜8＞～＜11＞的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异戊二烯。
＜13＞根据＜8＞～＜11＞的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异丁烯。
＜14＞二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，其中，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸。
＜15＞根据＜14＞所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸所变异成的其他氨基酸是半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
＜16＞根据＜14＞或＜15＞所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，进一步序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成其他氨基酸、且序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸。
＜17＞根据＜14＞或＜15＞所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，进一步序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成组氨酸、且序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成精氨酸。
＜18＞DNA，编码＜14＞～＜17＞的任一项所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
＜19＞载体，包含＜18＞所述的DNA。
＜20＞宿主细胞，其中，导入了＜18＞所述的DNA或＜19＞所述的载体。
＜21＞二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制造方法，包括：培养＜20＞所述的宿主细胞，采集该宿主细胞中表达的蛋白质的工序。
＜22＞用于使下述式(1)所示的化合物与ATP反应、从而促进烯烃化合物的生成的制剂，包含＜14＞～＜17＞的任一项所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、编码该二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的DNA或插入了该DNA的载体，
式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子，上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代。
＜23＞根据＜22＞所述的制剂，上述烯烃化合物是异戊二烯。
＜24＞根据＜22＞所述的制剂，上述烯烃化合物是异丁烯。
发明的效果
根据本发明，可以提供能以高生产率制造烯烃化合物的酶、以及利用了该酶的烯烃化合物的制造方法。
附图说明
图1是显示对于将二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的152位的甘氨酸替换成其他氨基酸的变异体(G152X)分析对于以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物的异戊二烯的生成的酶活性而得的结果的图。其中，作为对照，合并显示将74位的精氨酸和209位的苏氨酸各自替换成组氨酸和精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体(R74HT209R)的分析结果。另外，纵轴和各条所附的数值显示将由各氨基酸变异体所生成的异戊二烯量以由二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(野生型)所生成的异戊二烯量作为基准(1)计算而得的相对值。另外，图中“G152N”等表示二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各变异体，数字表示在该酶中导入了伴有氨基酸替换的变异的部位(152位等)，数字左侧的字母表示替换之前的氨基酸(G/甘氨酸等)，数字右侧的字母表示替换之后的氨基酸(N/天冬酰胺等)(关于图中的标记在图2和3中也同样)。
图2是显示对于将二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的152位的甘氨酸替换成其他氨基酸、进一步将74位的精氨酸和209位的苏氨酸各自替换成组氨酸和精氨酸的变异体(R74HG152XT209R)分析对于以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸作为底物的异戊二烯的生成的酶活性的结果的图。其中，作为对照，合并显示R74HT209R的分析结果。
图3使显示对于G152X和R74HG152XT209R分析对于以β-羟基异戊酸为底物的异丁烯的生成的酶活性的结果的图。
具体实施方式
＜烯烃化合物的制造方法1＞
如后述的实施例中所示，发现通过将二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的152位的甘氨酸替换成其他氨基酸，促进生成烯烃化合物的下述反应的催化活性(也称为“生成烯烃化合物的催化活性”)提高。
因此，本发明提供烯烃化合物的制造方法，包括：在序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸(以下也仅称为“152位的甘氨酸”)变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(以下也称为“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体”)存在下，使上述式(1)所示的化合物与ATP(腺苷三磷酸)的工序。
本发明中“烯烃化合物”是指具有至少1个碳间双键的碳氢化合物，另外也可以导入羟基和/或羧基等取代基、卤素原子等原子。作为这样的化合物，可列举例如，异丁烯、乙烯、丙烯、2-甲基-1-丁烯、异戊二烯醇、3-羟基-3-甲基-4-戊烯酸等单烯烃化合物、异戊二烯、丁二烯(1,3-丁二烯)、1,3-戊二烯、2,3-二甲基丁二烯、1,3-己二烯、2-甲基-1,3-戊二烯、氯丁二烯、3-甲基-2,4-戊二烯酸这样的共轭二烯化合物等二烯烃化合物。
本发明中，在成为用于制造烯烃化合物的原料的下述式(1)所示的化合物中，对于R1和R2不特别限制，各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子(上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代)。
另外，本发明中，在制造共轭二烯化合物的情况下，如以下反应式所示，作为上述式(1)所示的化合物的更具体方式，优选使用下述式(4)所示的化合物。
上述式(4)所示的化合物中，对于R3、R4和R5不特别限制，各自独立地表示选自氢原子、碳数1～10的烷基、卤素原子、碳数2～15的烯基和碳数6～20的芳基中的取代基。
另外本发明中，作为碳数1～10的烷基，可列举例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、环丙基、环戊基、环己基、正庚基、正辛基、正癸基、(环己基)甲基、(1-甲基环己基)甲基、(1-甲基环戊基)甲基、(1-乙基环己基)甲基。另外，作为碳数2～15的烯基，可列举例如，乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-丁烯基、5-己烯基、7-辛烯基，作为碳数6～20的芳基，可列举例如，苯基、1-萘基、2-萘基、苊基、菲基、蒽基。另外，卤素原子表示氯原子、氟原子、溴原子、碘原子。
这样的上述式(1)所示的化合物可以如后述实施例中所示那样，作为市售的制品购买。另外，只要是本领域技术人员，就能够适当参考公知的合成方法(例如，TetrahedronLetters、1988年、20卷、15号、1763～1766页所记载的方法)进行合成。
在后述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的存在下，关于上述式(1)所示的化合物与ATP的反应的条件，只要是促进该反应、生成烯烃化合物的条件即可，只要是本领域技术人员，就能够适当调整反应液的组成、反应液的pH、反应温度、反应时间等来进行设定。
例如，在添加了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、以及作为其底物的上述式(1)所示的化合物和ATP的反应液中，通常可以包含作为二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的辅因子的镁离子1～50mM、优选包含5～20mM，关于其他组成，pH如前所述，只要不妨碍上述反应就不特别限制，优选pH7～8的缓冲液，更优选pH7～8的Tris-盐酸缓冲液。
另外，作为反应温度也只要不妨碍上述反应就不特别限制，通常为20～40℃，优选25～37℃。进而，作为反应时间，只要是能生成烯烃化合物的时间即可，不特别限制，通常为30分钟～7日，优选12小时～2日。
另外，这样的条件下生成的烯烃化合物一般容易气化，因而可以通过公知的挥发性气体的回收、纯化方法来采集。作为该采集方法，可列举汽提、分馏、吸附、脱附、渗透蒸发、利用热或真空使吸附于固相的异戊二烯从固相脱附、利用溶剂提取、或色谱(例如，气相色谱)等。另外，即使在生成的烯烃化合物为液体的情况下，也可以适当利用公知的回收、纯化方法(蒸馏、色谱等)来采集。进而，这些方法可以单独进行，也可以适当组合多阶段地实施。
＜烯烃化合物的制造方法2＞
另外，通过对进行了转化使其表达序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的宿主细胞进行培养，从而能够高生产率地制造烯烃化合物。因此，本发明还提供烯烃化合物的制造方法，包括培养导入了编码后述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA或载体的宿主细胞，采集该宿主细胞和/或其培养物中生成的烯烃化合物的工序。
关于宿主细胞的培养条件，如后所述，但优选在培养基中添加作为二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的底物的上述(1)式所示的化合物、作为辅因子的镁离子，更优选添加全部这些化合物。另外，培养温度可以根据所使用的宿主细胞的种类适当设计变更，通常为20～40℃，优选25～37℃。
另外，本发明中，“培养物”是含有通过将宿主细胞用培养基培养而得的增殖的宿主细胞、该宿主细胞的分泌产物和该宿主细胞的代谢产物等的培养基，包含它们的稀释物、浓缩物。
对于这样的从宿主细胞和/或培养物采集烯烃化合物，也不特别限制，可以使用上述公知的回收、纯化方法来进行。另外，采集的时期可以根据所使用的宿主细胞的种类适当调整，只要是能生成烯烃化合物的时间即可，但通常为30分钟～7日，优选12小时～2日。
＜二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体＞
接着，对于上述本发明的烯烃化合物的制造方法中使用的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体进行说明。本发明中“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”也称为MVD(Diphosphomevalonatedecarboxylase)，另外是作为EC号：4.1.1.33注册的酶，是催化从5-二磷酸甲羟戊酸和ATP生成异戊烯基二磷酸、ADP、磷酸和二氧化碳的下述反应的羧基裂合酶的一种。
本发明中，作为导入后述的变异的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶不特别限制，可以使用各种生物来源的酶。作为这样的酶，可列举例如，芽殖酵母(酿酒酵母，Saccharomycescerevisiae)来源的MVD(由序列号2所记载的氨基酸序列组成的蛋白质)、芽殖酵母(YJM7株)来源的MVD(UniProt受理号：A6ZSB7所特定的蛋白质)、芽殖酵母(RM11-1a株)来源的MVD(UniProt受理号：B3LPK0所特定的蛋白质)、假丝酵母(杜氏假丝酵母，Candidadubliniensis)来源的MVD(UniProt受理号：B9W6G7所特定的蛋白质)、毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母，Pichia pastoris)来源的MVD(UniProt受理号：C4QX63所特定的蛋白质)、裂殖酵母(粟酒裂殖酵母菌，Schizosaccharomyces pombe)来源的MVD(UniProt受理号：O139363所特定的蛋白质)、阿舒囊霉(棉阿舒囊霉，Ashbya gossypii)来源的MVD(UniProt受理号：Q751D8所特定的蛋白质)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)来源的MVD(UniProt受理号：Q6BY07所特定的蛋白质)、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)来源的MVD(UniProt受理号：Q54YQ9所特定的蛋白质)、米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的MVD(UniProt受理号：Q2UGF4所特定的蛋白质)、家兔脑胞内原虫(Encephalitozoon cuniculi)来源的MVD(UniProt受理号：Q8SRR7所特定的蛋白质)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)来源的MVD(UniProt受理号：B7S422所特定的蛋白质)、三叶橡胶树(Heveabrasiliensis)来源的MVD(UniProt受理号：A9ZN03所特定的蛋白质)、烟草(Nicotianalangsdorffii x Nicotiana sanderae)来源的MVD(UniProt受理号：B3F8H5所特定的蛋白质)、紫草(软紫草，Arnebia euchroma)来源的MVD(UniProt受理号：Q09RL4所特定的蛋白质)、粳稻(Oryza sativa subsp.japonica)来源的MVD(UniProt受理号：Q6ETS8所特定的蛋白质)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)来源的MVD(UniProt受理号：Q8LB37所特定的蛋白质)、番茄(Solanum lycopersicum)来源的MVD(UniProt受理号：A8WBX7所特定的蛋白质)、家蚕(Bombyx mori)来源的MVD(UniProt受理号：A5A7A2所特定的蛋白质)、斑马鱼(Danio rerio)来源的MVD(UniProt受理号：Q5U403所特定的蛋白质)、小鼠(Mus musculus)来源的MVD(UniProt受理号：Q99JF5或Q3UYC1所特定的蛋白质)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)来源的MVD(UniProt受理号：Q62967所特定的蛋白质)、牛(Bos taurus)来源的MVD(UniProt受理号：Q0P570所特定的蛋白质)、人(Homo sapiens)来源的MVD(UniProt受理号：P53602所特定的蛋白质)。其中，优选芽殖酵母来源的MVD，更优选由序列号2所记载的氨基酸序列组成的蛋白质。另外，容易理解在自然界中通过核苷酸序列变异，能够发生蛋白质的氨基酸序列的变化。
进而，本发明的“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”还可以是除了序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸以外还人工导入了变异的蛋白质。即，本发明的“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”中，也包含“由在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的氨基酸序列(序列号2所记载的氨基酸序列等)的152位以外还替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成的蛋白质”。其中，“数个”不特别限制，通常为2～80个、优选为2～40个、更优选为2～20个、进一步优选为2～10个(例如，2～8个、2～4个、2个)。
另外，本发明的“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”中，作为序列号2所述的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸以外的其他部位的氨基酸变异，只要具有生成烯烃化合物的催化活性就不特别限制，如后述的实施例所示，从该活性倾向于更高这样的观点出发，优选序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸(以下也仅称为“74位的精氨酸”)变异成其他氨基酸、且序列号2所述的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸。
本发明中，作为序列号2所述的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸所变异成的“其他氨基酸”不特别限制，如后述的实施例所示，从容易在烯烃化合物的生成中发挥高催化活性这样的观点考虑，优选为半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸或天冬酰胺。
进而，如后述的实施例所示，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，在导入变异的部位仅为序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸的情况下，从相同观点出发，作为该甘氨酸所变异成的“其他氨基酸”，更优选为半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或色氨酸，进一步优选为半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸，更优选为甲硫氨酸、半胱氨酸或亮氨酸，特别优选为半胱氨酸。
进而另外，如后述的实施例所示，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中的氨基酸变异除了序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸的氨基酸变异之外，至少序列号2所述的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成其他氨基酸、且序列号2所述的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的情况下，从相同观点出发，152位的甘氨酸所变异成的其他氨基酸更优选为半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、苏氨酸、谷氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或脯氨酸，进一步优选为半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸或苏氨酸，更优选为半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，特别优选为半胱氨酸。另外，该情况下，序列号2所述的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸所变异成的其他氨基酸从相同观点出发，优选为甲硫氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸，更优选为甲硫氨酸或组氨酸，进一步优选为组氨酸。进而，该情况下，序列号2所述的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸从相同观点出发，优选为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸，更优选为精氨酸。
此外，本发明中“对应的部位”是指，利用核苷酸和氨基酸序列分析软件(GENETYX-MAC、Sequencher等)、BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，将序列号2所记载的氨基酸序列与来源于其他品种的MVD等的氨基酸序列进行比对时，与序列号2所记载的氨基酸序列中的152位、74位或209位处于同一位置的部位。
另外“野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”是导入序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸的变异、以及前述的人工变异之前的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，可列举例如，上述芽殖酵母等各种生物来源的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及其天然变异体。
另外，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体是否具有生成烯烃化合物的催化活性，例如，如后述的实施例所示，可以通过用气相色谱质量分析(GC-MS)直接测定烯烃化合物的量来判定，进而也可以通过与野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中的量进行比较来判定是否与野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶相比生成烯烃化合物的催化活性更高。
本发明中，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体优选生成烯烃化合物的催化活性相对于野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶为2倍以上(例如，3倍以上、4倍以上)，更优选为5倍以上(例如，6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上)，进一步优选为10倍以上(例如，11倍以上、12倍以上、13倍以上、14倍以上、15倍以上、16倍以上、17倍以上、18倍以上、19倍以上)，更优选为20倍以上(例如，30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上)，特别优选为100倍以上。
另外，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体也可以直接或间接地添加其他化合物。作为所述添加不特别限制，可以是基因水平上的添加，也可以是化学上的添加。另外对于添加的部位也不特别限制，可以是二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的氨基末端(以下也称为“N末端”)和羧基末端(以下也称为“C末端”)的任一者，也可以是两者。基因水平的添加通过使用对编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA符合阅读框地添加编码其他蛋白质的DNA而得的DNA来实现。作为这样添加的“其他蛋白质”不特别限制，在为了使二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的纯化容易的情况下，优选使用多聚组氨酸(His-)标签(tag)蛋白质、FLAG-标签蛋白质(注册商标、Sigma-Aldrich社)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等纯化用标签蛋白质，另外在为了使二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的检测容易的情况下，优选使用GFP等荧光蛋白质、荧光素酶等化学发光蛋白质等检测用标签蛋白质。化学上的添加可以通过共价键也可以通过非共价键。作为“共价键”不特别限制，可列举例如，氨基与羧基的酰胺键、氨基与卤代烷基的烷基胺键、硫醇之间的二硫键、硫醇基与酰亚胺基或卤代烷基的硫醚键。作为“非共价键”，可列举例如，生物素-抗生物素蛋白之间的键。另外，作为这样化学地添加的“其他化合物”，在为了使二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的检测容易的情况下，优选使用例如，Cy3、罗丹明等荧光色素。
另外，本发明的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体也可以与其他成分混合使用。作为其他成分不特别限制，可列举例如，灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、溶解辅助剂、缓冲剂、蛋白酶抑制剂、保存剂。
＜编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体的DNA、和具有该DNA的载体＞
接着，对于编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA等进行说明。通过导入该DNA来转化宿主细胞，在该细胞中制造二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体，进而能够制造烯烃化合物。
本发明的DNA可以是在天然DNA中人为导入了变异的DNA，也可以是由人工设计的核苷酸序列组成的DNA。进而对于其形态不特别限制，除了cDNA之外，还包含基因组DNA、和化学合成DNA。这些DNA的制备对本领域技术人员来说可以利用常规手段来进行。基因组DNA可以如下制备：例如，从酿酒酵母等提取基因组DNA，制作基因组文库(作为载体，可以利用质粒、噬菌体、粘粒、BAC、PAC等)，将其展开，使用基于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的核苷酸序列(例如，序列号1所述的核苷酸序列)制备的探针进行菌落杂交或噬菌斑杂交。另外，还可以通过制作对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因特异的引物，利用该引物进行PCR来制备。另外，cDNA例如可以通过基于从酿酒酵母提取的mRNA合成cDNA，将其插入λZAP等载体中制作cDNA文库，将该文库展开，与上述同样地进行菌落杂交或噬菌斑杂交来制备，另外，也可以通过进行PCR来制备。
然后，关于对这样制备的DNA导入将二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸替换成其他氨基酸的变异，只要是本领域技术人员就能够通过利用公知的定点诱变法来进行。作为定点诱变法，可列举例如，Kunkel法(Kunkel,T.A.、Proc Natl Acad Sci USA、1985年、82卷、2号、488～492页)、SOE(splicing-by-overlap-extention)-PCR法(Ho,S.N.,Hunt,H.D.,Horton,R.M.,Pullen,J.K.,and Pease,L.R.、Gene、1989年、77卷、51～59页)。
另外，只要是本领域技术人员，就能够人工设计编码将二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的152位的甘氨酸替换成其他氨基酸的蛋白质的核苷酸序列，基于该序列信息使用自动核酸合成仪化学合成本发明的DNA。
当然，根据这些方法，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中除了152位的甘氨酸以外的其他部位的(例如，序列号2所述的氨基酸序列的74位和209位)氨基酸也可以人工替换成其他氨基酸。
进而，本发明的DNA从进一步提高所编码的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体在后述的宿主细胞中的表达效率这样的观点考虑，也可以根据该宿主细胞的种类采取将密码子最适化后的编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA的方式。
另外，本发明也提供能够在宿主细胞内复制前述的DNA的、插入了该DNA的载体。
本发明中“载体”可以以自身复制载体、即作为染色体外的独立体存在、其复制不依赖于染色体的复制的例如质粒为基础来构建。另外，载体在导入宿主细胞时，也可以是整合到该宿主细胞的基因组中，与整合了该载体的染色体一起复制的方式。
作为这样的载体，可列举例如，质粒、噬菌体DNA。另外，作为质粒，可列举大肠杆菌来源的质粒(pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、酵母来源的质粒(YEp13、YEp24、YCp50等)、枯草菌来源的质粒(pUB110、pTP5等)。作为噬菌体DNA可列举λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)。进而，如果宿主细胞是昆虫来源，则也可以使用杆状病毒等昆虫病毒载体作为本发明的载体，如果宿主细胞是植物来源，则也可以使用T-DNA等作为本发明的载体，如果宿主细胞是动物来源，则也可以使用逆转录病毒、腺病毒载体等动物病毒载体作为本发明的载体。另外，本发明的载体构建的步骤和方法可以使用在基因工程学领域惯用的方法。例如，为了将本发明的DNA插入载体，可采用首先将纯化后的DNA用适当的限制性酶切断，插入适当载体的限制性酶位点或多克隆位点并与载体连接的方法等。
另外，本发明的载体也可以是以能在宿主细胞内表达上述DNA所编码的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的状态包含的表达载体的方式。本发明所涉及的“表达载体”，为了将其导入宿主细胞并表达二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体，期望除了上述DNA之外，还包含控制其表达的DNA序列、用于选择被转化的宿主细胞的基因标志物等。作为控制表达的DNA序列，其中包含启动子、增强子、剪接信号、多聚A添加信号、核糖体结合序列(SD序列)和终止子等。启动子只要是在宿主细胞中显示转录活性就不特别限定，可以作为控制编码与宿主细胞同种或异种的任一蛋白质的基因的表达的DNA序列获得。另外，除了上述控制表达的DNA序列以外还可以包含诱导表达的DNA序列。作为该诱导表达的DNA序列，在宿主细胞为细菌的情况下，可列举能通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而诱导配置在下游的基因的表达的乳糖操纵子。本发明中的基因标志物可以根据被转化的宿主细胞的选择方法适当选择，可以利用例如编码耐药性的基因、辅助营养缺陷性的基因。
另外，本发明的DNA或载体可以与其他成分混合使用。作为其他成分不特别限制，可列举例如，灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、溶解辅助剂、缓冲剂、DNase抑制剂、保存剂。
＜用于促进烯烃化合物的生成的制剂＞
如上所述，通过使用二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、编码该变异体的DNA或插入了该DNA的载体，能够使下述式(1)所示的化合物与ATP反应，促进烯烃化合物的生成。因此，本发明还提供用于使下述式(1)所示的化合物与ATP反应、促进烯烃化合物的生成的制剂，至少包含序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、编码该二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的DNA或插入了该DNA的载体。
[式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子(上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意替换)]。
作为这样的制剂，只要包含上述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体等即可，也可以与其他成分混合使用。作为该其他成分不特别限制，可列举例如，灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、溶解辅助剂、缓冲剂、蛋白酶抑制剂、DNase抑制剂、保存剂。
另外，本发明还提供包含这样的制剂的试剂盒。本发明的试剂盒中，上述制剂也可以以导入了本发明的DNA等并被转化的后述的宿主细胞的方式包含。进而，除了这样的制剂之外，本发明的试剂盒还可以包含上述式(1)所示的化合物、用于导入本发明的DNA等的宿主细胞、用于培养该宿主细胞的培养基、和它们的使用说明书等。另外，这样的使用说明书是用于将本发明的制剂等在上述的烯烃化合物的制造方法中利用的说明书。说明书可以包含例如，本发明的制造方法的实验方法、实验条件、和涉及本发明的制剂等的信息(例如，显示载体的核苷酸序列等的载体图谱等信息、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的序列信息、宿主细胞的来源、性质、该宿主细胞的培养条件等信息)。
＜导入了编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA等的宿主细胞＞
接着，对于导入了本发明的DNA或载体的宿主细胞进行说明。如果使用通过导入前述的DNA或载体而被转化的宿主细胞，则可以制造二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体，进而还可以制造烯烃化合物。
对导入本发明的DNA或载体的宿主细胞不特别限定，可列举例如，微生物(大肠杆菌、芽殖酵母、裂殖酵母、枯草菌、放线菌、丝状菌等)、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞，但从利用比较的廉价的培养基、以短时间显示高的增殖性、进而有助于生产率高的烯烃化合物的制造这样的观点考虑，优选利用微生物作为宿主细胞，更优选利用大肠杆菌。
另外，本发明的DNA或载体的导入也可以按照本领域惯用的方法实施。例如，作为向大肠杆菌等微生物的导入方法，可列举热激法、电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法，作为对植物细胞的导入方法，可列举使用农杆菌的方法、基因枪法，作为对昆虫细胞的导入方法，可列举使用杆状病毒的方法、电穿孔法，作为对动物细胞的导入方法，可列举磷酸钙法、脂质体转染法、电穿孔法。
这样被导入宿主细胞内的DNA等在宿主细胞内可以通过随机插入其基因组DNA中而被保持，也可以通过同源重组而被保持，另外如果是载体，可以通过作为其基因组DNA外的独立体被复制而保持。
＜二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制造方法＞
如后述的实施例所示，通过培养导入了本发明的DNA等的宿主细胞，能够在该宿主细胞内制造二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体。因此，本发明还提供二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制造方法，包括培养前述的宿主细胞，采集在该宿主细胞中表达的蛋白质的工序。
本发明中，“培养宿主细胞”的条件只要是上述宿主细胞能够制造二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的条件即可，只要是本领域技术人员，就能够根据宿主细胞的种类、使用的培养基等适当调整温度、空气添加的有无、氧气的浓度、二氧化碳的浓度、培养基的pH、培养温度、培养时间、湿度等，进行设定。
作为该培养基，只要含有宿主细胞能够同化的物质即可，可列举碳源、氮源、硫源、无机盐类、金属、胨、酵母提取物、肉提取物、酪蛋白水解物、血清等作为含有物。另外，该培养基中可以添加例如，用于诱导编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA的表达的IPTG、对应于本发明所涉及的载体能够编码的耐药性基因的抗生素(例如，氨苄青霉素)、对应于辅助本发明所涉及的载体能够编码的营养缺陷性的基因的营养物(例如，精氨酸、组氨酸)。
然后，作为从这样培养的宿主细胞“采集在该细胞中表达的蛋白质”的方法，可列举例如，通过过滤、离心分离等从培养基回收宿主细胞，将回收的宿主细胞通过细胞溶解、磨碎处理或加压破碎等进行处理，进而通过超滤处理、盐析、硫酸铵沉淀等溶剂沉淀、色谱(例如，凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱)等对在宿主细胞中表达的蛋白质进行纯化、浓缩的方法。另外，对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体添加了前述的纯化标签蛋白质的情况下，也可以使用该标签蛋白质所吸附的底物来进行纯化、采集。进而，这些纯化、浓缩方法可以单独进行，另外也可以适当组合多阶段地实施。
另外，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体不限于上述生物学的合成，也可以使用本发明的DNA等和无细胞蛋白质合成系统制造。作为该无细胞蛋白质合成系统不特别限制，可列举例如，小麦胚芽来源、大肠杆菌来源、兔网织红细胞来源、昆虫细胞来源的合成系统。进而，只要是本领域技术人员，就能够使用市售的肽合成仪等，化学合成二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体。
另外，本发明还能够提供生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的制造方法，包括在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中至少使序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的工序。
“生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”是指通过在152位的甘氨酸等导入变异，从而与其导入前相比生成烯烃化合物的催化活性较高的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，其比较对象通常为上述芽殖酵母等各种生物来源的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及其天然变异体。
二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中的“其他氨基酸的变异”导入可以通过所编码的DNA的改变来进行。“DNA的改变”如上所述，可以使用本领域技术人员公知的方法、例如定点诱变法、基于改变后的序列信息的DNA的化学合成法来适当实施这样的DNA的改变。另外，“其他氨基酸的变异”导入如上所述，可以使用肽的化学合成法来进行。
另外，是否通过这样的变异导入而生成烯烃化合物的催化活性提高，如上所述，可以通过GC-MS分析等来评价。
实施例
＜二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制作和评价1＞
本发明者们为了能够以高生产率制造烯烃化合物，设想了通过在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(以下也称为“MVD”)的氨基酸中导入变异，将该酶(二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体)的底物特异性从本来的针对5-二磷酸甲羟戊酸变更为针对3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸等，从而经过如下述式所示的反应而制造异戊二烯等。
于是，本发明者们通过以下所示的方法等在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各种部位导入伴有氨基酸替换的变异，制备了多种二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体。然后，对于这些变异体，评价参与以5-二磷酸甲羟戊酸为底物生成异戊烯基二磷酸的催化活性、和参与以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的催化活性。
此外，本发明者们从前也制备了约200个二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的氨基酸变异体，对于以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸作为底物的异戊二烯的生成的催化活性进行了评价。于是其结果发现，74位的精氨酸被替换成组氨酸、且209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(R74HT209R)在约200个变异体中出类拔萃地对于异戊二烯的生成显示极高的催化活性。
＜质粒载体的制备＞
首先，为了用大肠杆菌高效地表达芽殖酵母来源的MVD(scMVD、由序列号2所记载的氨基酸序列组成的蛋白质)，将编码其的野生型核苷酸序列(序列号1所述的核苷酸序列)考虑大肠杆菌中的密码子的使用频率进行改变。接着，按照常规方法化学合成由该改变核苷酸序列(序列号3所记载的核苷酸序列)组成的DNA。然后，将这样制备的DNA插入到pET-22b(+)载体(Novagen社制)的多克隆位点(NdeI识别位点与BamHI识别位点之间)，从而将该野生型的scMVD以在其N末端融合多聚组氨酸标签的方式，制备能在大肠杆菌中表达的质粒载体(scMVD载体)。
接着，为了将伴有各部位的氨基酸替换的变异导入scMVD中，设计编码导入了各变异的氨基酸序列的引物，进行合成。然后，以上述scMVD载体作为模板，使用这样的引物和定点诱变试剂盒(制品名：site-DirectMutagenesis Kit、Agilent社制)，按照其试剂盒附带的方案，将导入了各变异的scMVD以在其N末端融合多聚组氨酸标签的方式，制备能在大肠杆菌中表达的质粒载体。
＜酶溶液的制备＞
将如上所述制备的质粒载体分别通过热激法导入大肠杆菌(BL21)中，制备表达野生型的scMVD或各scMVD变异体的转化体。接着，将这些转化体分别在添加了0.4mM的IPTG和氨苄青霉素的LB培养基中培养一晚。将该培养后的转化体通过离心分离集菌，加入添加有DNaseI的蛋白质提取试剂(制品名：B-PER、Thermo Fisher Scientific社制)，进行溶菌。对这样得到的各溶菌液进行离心分离，将所得的各上清添加到多聚组氨酸纯化用柱(制品名：TALON(注册商标)柱、Clontech社制)中。接着，在各柱中添加溶出液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、300mM NaCl、150mM咪唑)，使融合了各多聚组氨酸标签的scMVD溶出。然后，将各溶出液用缓冲液(20mMTris-HCl(pH7.4)、100mM NaCl)透析后，用超滤旋转柱(制品名：アミコンウルトラ、ミリポア社制)浓缩，制备酶溶液。另外，使用蛋白质定量试剂盒(制品名：BCAアッセイ试剂盒、TaKaRa社制)，按照附带的方案测定这样制备的溶液中的酶(融合了多聚组氨酸标签的scMVD或其变异体)的浓度。
＜酶活性的测定1＞
测定以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸作为底物的异戊二烯的合成中的各酶活性。
首先，在缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、100mM KCl)中添加0.5mM3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸和5mM ATP。接着，在气相色谱质量分析(GC-MS)用的10ml瓶中添加该反应液2.5ml和0.5mg的上述酶，然后立即封闭瓶盖，开始酶反应。该酶反应在37℃进行，在反应开始72小时后，为了样品平衡化而在50℃加热30分钟之后，通过GC-MS(制品名：GCMS-QP2010Ultra、岛津制作所社制)测定瓶的顶部空间中生成的异戊二烯量。然后，将所得的各变异体中的测定值以野生型中的该值作为基准(1)，计算出相对值。所得的结果的一部分示于图1和2。
如图1所示，表明了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的152位的甘氨酸被替换成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(G152X)具有生成异戊二烯的高催化活性。
特别是，与从前从约200个变异体中通过将特定的2个部位各自替换成特定的氨基酸而唯一获得的R74HT209R同等的极高的催化活性，通过将仅1个部位(152位)的氨基酸替换成其他氨基酸(半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)，就能够实现。
进而，制备将前述的显示高催化活性的2种变异R74HT209R和G152X组合而得的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的3重氨基酸变异体，评价对于异戊二烯的生成的催化活性。其结果如由图2所示的结果表明的那样，对于这些变异体也确认了高催化活性。尤其是74位的精氨酸被替换成组氨酸、152位的甘氨酸被替换成半胱氨酸、且209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(R74HG152CT209R)，对于异戊二烯的生成的催化活性与野生型相比提高约100倍，与对应的单独氨基酸变异体和双重氨基酸变异体(G152C、R74HT209R)相比提高3～4倍。
＜酶活性的测定2＞
接着，本发明者们对于在异戊二烯生成中显示极高的催化活性的前述的单独氨基酸变异体和三重氨基酸变异体(G152X和R74HG152XT209R)，确认了也能够在其他烯烃化合物的生成中利用。即，如下评价以β-羟基异戊酸为底物的异丁烯的合成(下述式所示的反应)中的各酶活性。
首先，在缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、100mM KCl)中添加0.5mMβ-羟基异戊酸(东京化成工业株式会社制、制品代码：H0701、β-Hydroxyisovaleric Acid)和5mM ATP。
然后，在GC-MS用的10ml瓶中添加该反应液2.5ml和10mg的上述酶，之后立即封闭瓶盖，开始酶反应。该酶反应在37℃进行，反应开始数日后(约2日后)，为了样品平衡化而在50℃加热30分钟后，通过GC-MS(制品名：GCMS-QP2010Ultra、岛津制作所社制)测定瓶的顶部空间中生成的异丁烯量。接着，将所得的各变异体中的测定值，以野生型中的测定值作为基准(1)，计算出相对值。所得的结果的一部分示于图3。
如由图3所示的结果表明的那样，上述单独氨基酸变异体和三重氨基酸变异体与异戊二烯生成时同样地，具有比野生型高的对于异丁烯的生成的催化活性。
产业可利用性
如以上说明的那样，根据本发明，可以提供能够以高生产率制造烯烃化合物的酶、以及使用该酶的烯烃化合物的制造方法。另外，根据本发明，能够不通过化学合成、而通过生物合成来制造烯烃化合物，因此对环境的负荷少。因此，本发明在异戊二烯、异丁烯这样的合成橡胶等各种合成聚合物的原料的制造中极为有用。
序列表自由文本
序列号：3
＜223＞为了大肠杆菌中的表达而进行了密码子最优化的序列

Claims (24)

1.烯烃化合物的制造方法，包括：在序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶存在下，使下述式(1)所示的化合物与ATP反应的工序，
式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子，上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代。
2.烯烃化合物的制造方法，包括：将导入了以下DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，采集该宿主细胞和/或其培养物中生成的烯烃化合物的工序，上述DNA编码序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸所变异成的其他氨基酸是半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的制造方法，上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是进一步序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成其他氨基酸、且序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
5.根据权利要求1～3的任一项所述的制造方法，上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是进一步序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成组氨酸、且序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异戊二烯。
7.根据权利要求1～5的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异丁烯。
8.生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的制造方法，该制造方法包括：在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸的工序。
9.根据权利要求8所述的制造方法，在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸所变异成的其他氨基酸是半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
10.根据权利要求8或9所述的制造方法，进一步包括：在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成其他氨基酸、且使序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的工序。
11.根据权利要求8或9所述的制造方法，进一步包括：在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成组氨酸、且使序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成精氨酸的工序。
12.根据权利要求8～11的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异戊二烯。
13.根据权利要求8～11的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异丁烯。
14.二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，其中，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸变异成其他氨基酸。
15.根据权利要求14所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，序列号2所记载的氨基酸序列的152位的甘氨酸或与该部位对应的甘氨酸所变异成的其他氨基酸是半胱氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
16.根据权利要求14或15所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，进一步序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成其他氨基酸、且序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸。
17.根据权利要求14或15所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，进一步序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成组氨酸、且序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成精氨酸。
18.DNA，编码权利要求14～17的任一项所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
19.载体，包含权利要求18所述的DNA。
20.宿主细胞，其中，导入了权利要求18所述的DNA或权利要求19所述的载体。
21.二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制造方法，包括：培养权利要求20所述的宿主细胞，采集该宿主细胞所表达的蛋白质的工序。
22.用于使下述式(1)所示的化合物与ATP反应、从而促进烯烃化合物的生成的制剂，包含权利要求14～17的任一项所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、编码该二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的DNA或插入了该DNA的载体，
式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳A数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子，上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代。
23.根据权利要求22所述的制剂，上述烯烃化合物是异戊二烯。
24.根据权利要求22所述的制剂，上述烯烃化合物是异丁烯。
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