CN102686734A - 使用二磷酸甲羟戊酸脱羧酶从甲羟戊酸生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法 - Google Patents
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Abstract
描述了使用甲羟戊酸作为底物,通过脱羧作用步骤将其酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶促生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法,以及能催化甲羟戊酸的脱羧作用的酶用于从甲羟戊酸生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。还描述了甲羟戊酸作为起始材料在酶促催化的反应中生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。也公开了生产异戊二烯的方法,所述方法包括使用甲羟戊酸作为底物并通过脱羧作用步骤将其酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法,并且还包括将生产的3-甲基丁-3-烯-1-醇转化为异戊二烯的步骤以及生产异戊醇的方法,所述方法包括使用甲羟戊酸作为底物并通过脱羧作用步骤将其酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法并还包括将生产的3-甲基丁-3-烯-1-醇转化为异戊醇的步骤。
Description
本发明涉及使用甲羟戊酸作为底物并通过脱羧作用步骤将其酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。本发明也涉及能够催化甲羟戊酸的脱羧作用的酶用于从甲羟戊酸生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。此外,其涉及在酶促催化反应中甲羟戊酸作为生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的起始材料的用途。
此外,本发明涉及生产异戊二烯的方法,所述方法包括使用甲羟戊酸作为底物并通过脱羧作用步骤将其酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法,并且还包括将生产的3-甲基丁-3-烯-1-醇转化为异戊二烯的步骤。
本发明也涉及生产异戊醇的方法,所述方法包括使用甲羟戊酸作为底物并通过脱羧作用步骤将其酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法,并且还包括将生产的3-甲基丁-3-烯-1-醇转化为异戊醇的步骤。
3-甲基丁-3-烯-1-醇对应式C5H10O。它能够用于生产异戊烯醇,异戊烯醇用于香料或在制药工业中作为构件使用。它是通过异丁烯和甲醛的化学缩合,生成3-甲基丁-3-烯-1-醇进一步被异构化为异戊烯醇生产的。
本文用于生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的路线涉及甲羟戊酸途径:生产甲羟戊酸,然后二磷酸化,然后脱羧-脱水至焦磷酸3-甲基丁-3-烯-1-醇酯,并最后两次脱磷酸至3-甲基丁-3-烯-1-醇(美国专利申请20080092829)。
3-甲基丁-3-烯-1-醇能够被转化为异戊二烯,异戊二烯是轮胎工业的关键化合物,并且也在粘合剂中有许多应用。它是使用若干种路线化学地生产的:
-从油中萃取蒸馏(C5切取馏分)
-异戊烯脱氢
-异戊烷的双脱氢
-异丁烯和甲醛反应
-丙酮和乙炔的反应
-丙烯二聚化
WO2009/076676报道了至异戊二烯的代谢途径。途径基于甲羟戊酸途径的下游中间体,即焦磷酸3-甲基丁-3-烯-1-醇酯或异戊烯基焦磷酸的脱磷酸-脱水。此方法的缺点是要求经历整个甲羟戊酸途径:甲羟戊酸双磷酸化,然后脱羧-脱水至焦磷酸3-甲基丁-3-烯-1-醇酯,再异构化为异戊烯基焦磷酸,并最后双脱磷酸/脱水至异戊二烯。
异戊醇是非常重要的化学制品,通常用作脂肪、油、树脂和生物碱的溶剂。在香料工业中,例如在用于香皂和化妆品香料的异戊醇水杨酸酯的制造中存在对异戊醇的需求。它也用于磷酸的制造。此外,它用于拟除虫菊酯的合成。生产异戊醇的商业方法包括杂醇油的分馏、烷烃的氯化和随后的水解以生产异构体的混合物以及正丁烯的低压羰基合成或加氢甲酰基化,然后氢化获得的异戊醛。
存在为生产上述化合物提供环境友好、有成本效益的和简单的方法的需求。如权利要求所述主题满足该需求。
因此,在第一个方面,本发明涉及从甲羟戊酸生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。特别地,本发明涉及从甲羟戊酸生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法,其特征为用具有脱羧酶活性的酶转化甲羟戊酸。因此,本方法包括甲羟戊酸的酶促催化的脱羧作用。当用于本发明背景时术语“脱羧作用”优选地指脱水性脱羧作用。
术语“甲羟戊酸”包含甲羟戊酸和甲羟戊酸的阴离子,所述阴离子是生物介质中的主要形式。甲羟戊酸是生产萜和类固醇的被称为甲羟戊酸途径的生物合成途径中的前体。甲羟戊酸是焦磷酸3-甲基丁-3-烯-1-醇酯的主要前体,后者反过来是所有类萜的基础。在图1中显示甲羟戊酸的结构式。
在本发明的背景中术语isoprenol(3-甲基丁-3-烯-1-醇)包含对应式C5H10O的化合物。isoprenol的IUPAC名称为3-甲基丁-3-烯-1-醇。3-甲基丁-3-烯-1-醇的异名是,例如,2-甲基-1-丁烯-4-醇、3-丁烯-1-醇-3-甲基、3-异戊烯基醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、异丁烯基甲醇、异丙烯基乙醇和甲代烯丙基甲醇。
在本发明的背景中术语“具有脱羧酶活性的酶”指能使甲羟戊酸脱羧,特别是根据图2给出的反应图解的酶。催化的反应是同时的脱水和脱羧作用。能够如所附的实施例1或7描述地测量此酶促活性。
在优选的实施方案中,具有脱羧酶活性的酶是分类为二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的酶,或是源自此类酶并具有使甲羟戊酸脱羧以生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的能力的酶。用EC号EC 4-1.1.33分类二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。二磷酸甲羟戊酸脱羧酶能催化甲羟戊酸二磷酸的脱羧作用。在此反应中,ATP和5-二磷酸甲羟戊酸被转化为ADP、磷酸、焦磷酸3-甲基丁-3-烯-1-醇酯和CO2。在图2中显示由二磷酸甲羟戊酸脱羧酶催化的反应。能够根据本领域已知的方法(例如在Reardon等(Biochemistry 26(1987),4717-4722)中的)测量二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的活性。优选地,如实施例1或7中描述的测量活性,其中使用二磷酸甲羟戊酸代替甲羟戊酸。
已经报道至少在一些情况下反应是二价阳离子依赖性的(参见,例如,Krepkiy等,Protein Science 13(2004),1875-1881;Michihara等,Biol.Pharm.Bull.25(2002),302-306)。
二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是这样的酶,其在其天然功能中是细菌中类异戊二烯合成的甲羟戊酸途径的部分,以及是真核生物中固醇生物合成途径的部分。已经从多种生物例如动物、真菌、酵母和细菌中鉴定并分离了它。它也被某些植物表达。
已经确定了若干二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的三维结构(参见,例如,Byres等(J.Mol.Biol.371(2007),540-553);Bonanno等(Proc.Natl Acad.Sci.USA 98(2001),12896-12901);Voynova等,Archives of Biochemistryand Biophysics 480(2008),58-67)),并且能够获得关于其活性位点、对催化反应和实际酶促反应决定性的氨基酸残基的可观的知识(参见例如Byres等(J.Mol.Biol.371(2007),540-553);Bonanno等(Proc.NatlAcad.Sci.USA 98(2001),12896-12901))。在大多数情况下酶由约300至400个氨基酸组成,并使用ATP作为共底物,ATP在脱羧作用反应中被转化为ADP和无机磷酸。
已经描述了多种生物的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶,并且编码它们的氨基酸和核苷酸序列也可以从多个来源获得。
原则上在本发明的背景中能够使用任何二磷酸甲羟戊酸脱羧酶,特别是来自原核或真核生物的。例如描述了动物(例如褐家鼠(Rattusnorvegicus)、原鸡(Gallus gallus)、人、小鼠(Mus musculus)、野猪(Sus scrofa)、黑腹果蝇(D.melanogaster)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)和布氏锥虫(Trypanosoma brucei)),植物(例如拟南芥、银杏(Ginkobiloba)、水稻、豌豆(Pisum sativum)),酵母(例如酿酒酵母和白假丝酵母(Candida albicans))的真核二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。也描述了多种原核二磷酸甲羟戊酸脱羧酶,例如螺杆菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytgenes)、柠檬明串珠菌、路氏乳杆菌,这仅是几例。表1提供了来自不同生物的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的序列表,指出了能够从各自的数据库检索到它们的登录号。
表1
在SEQ ID NO:1至19中给出了来自不同生物的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的实例。在本发明的优选的实施方案中,二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是包含选自SEQ ID NO:1至19的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至19的任一至少n%同一的序列并具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的活性的酶,其中n是10和100之间的整数,优选地是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。
优选地,同一性程度是通过将各自的序列与任一上述SEQ ID NO的氨基酸序列比较确定的。当被比较的序列长度不同时,同一性程度优选地指较短序列中与较长序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比,或者较长序列中与较短序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比。能够根据本领域熟知的方法,使用优选地适当的计算机算法例如CLUSTAL确定序列同一性程度。
当使用Clustal分析方法确定具体序列是否与参考序列例如80%同一时,可以使用默认设定,或者优选地设定如下:矩阵:blosum 30;开放空位罚分:10.0;延伸空位罚分:0.05;延迟趋异(delay divergent):40;空位分隔距离:8用于比较氨基酸序列。对核苷酸序列比较,延伸空位罚分优选地设定为5.0。
优选地,同一性程度是在序列的全长上计算的。
此外,如果在本发明的背景中使用术语“同源性”,该术语优选地表示“序列同一性”。
在优选的实施方案中,在根据本发明的方法中使用的脱羧酶是来自干燥嗜酸球菌(Picrophilus torridus)或进化上与干燥嗜酸球菌密切相关的生物的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。在另一个优选的实施方案中,二磷酸甲羟戊酸脱羧酶源自嗜酸球菌属、热原体属或铁质菌(Ferroplasma)属,更优选地来自干燥嗜酸球菌种、大岛泰郎嗜酸球菌种(Picrophilus oshimae)、火山热原体种、嗜酸热原体种、Ferroplasma acidamanus或聚铜铁质菌种(Ferroplasma cupricumulans)的生物。
在特别优选的实施方案中,在根据本发明的方法中使用的脱羧酶是包含如SEQ ID NO:6、16、17、18或19所述的氨基酸序列,或包含与SEQID NO:6、16、17、18或19的任一至少n%同一并具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的活性的氨基酸序列的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶,其中n是10和100之间的整数,优选地是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。显示如SEQ ID NO:6和16所示氨基酸序列的酶源自干燥嗜酸球菌。如实施例中所示,该酶在催化甲羟戊酸脱羧作用至3-甲基丁-3-烯-1-醇中特别有效率。在根据本发明的方法中使用的进一步优选的脱羧酶是源自与干燥嗜酸球菌系统发生紧密相关的生物(例如嗜酸球菌属的其他细菌(例如大岛泰郎嗜酸球菌)、铁质菌属的细菌(例如Ferroplasma acidarmanus(SEQ IDNO:19)),或者热原体属的细菌(例如嗜酸热原体(SEQ ID NO:18)和火山热原体(SEQ ID NO:17)))的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。嗜酸热原体(AC号Q9HIN1)的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶显示了与SEQ ID NO:6的38%的同源性,而火山热原体(AC号Q97BY2)的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶显示与SEQ ID NO:6的约42%的同源性。
在另一个特别优选的实施方案中,在根据本发明的方法中使用的脱羧酶是由如SEQ ID NO:20或21所示的核苷酸序列,或者由与SEQ ID NO:20或21的任一至少n%同一并编码具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶活性的酶的核苷酸序列编码的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶,其中n是10和100之间的整数,优选地是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。SEQ ID NO:20是编码来自干燥嗜酸球菌的包括N端His标签的MDP脱羧酶的天然核苷酸序列。SEQ ID NO:21是编码来自干燥嗜酸球菌的包括N端His标签的MDP脱羧酶的密码子优化的序列。
在根据本发明的方法中使用的脱羧酶(优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)能够是天然存在的脱羧酶(优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶),或者其能够是源自天然存在的脱羧酶(优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)的脱羧酶(优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶),例如通过引入突变或其他改变,例如改变或改善酶促活性、稳定性等。
在本申请的背景中术语“脱羧酶”、“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”、“具有脱羧酶活性的蛋白质/酶”或“具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶活性的蛋白质/酶”也覆盖源自能催化甲羟戊酸的脱羧作用,但对其天然底物(例如甲羟戊酸二磷酸)只具有低亲和性,或不再接受其天然底物(例如甲羟戊酸二磷酸)的脱羧酶(优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)的酶。优选的底物,特别是二磷酸甲羟戊酸的此类修饰允许提高甲羟戊酸转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇并减少可能存在的副产品焦磷酸3-甲基丁-3-烯-1-醇酯的生产。本领域技术人员熟知修饰和/或改善蛋白质的所需酶促活性的方法,并包括例如随机诱变或位点定向诱变以及随后对具有所需性质的酶的选择,或者所谓的“定向进化”、DNA改组或体内进化的方法。
例如,对原核细胞中的遗传工程,能够将编码脱羧酶,优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的核酸分子引入到通过DNA序列重组允许诱变或序列修饰的质粒中。标准方法(参见Sambrook和Russell(2001),MolecularCloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或者添加天然的或合成的序列。通过对片段应用衔接头和接头,能够将DNA片断彼此连接。此外,能够使用提供适当的限制性位点或者移除过量DNA或限制性位点的工程方法。在插入、缺失或替换是可能的那些情况下,能够使用体外诱变、“引物修复”、限制或连接。一般地,实施序列分析、限制分析和生物化学和分子生物学的其他方法作为分析方法。然后就它们的酶促活性和特别地就它们偏好甲羟戊酸而不是例如,甲羟戊酸二磷酸,作为底物的能力测试获得的脱羧酶,优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶,变体。
鉴定在生产3-甲基丁-3-烯-1-醇方面具有改善的酶促性质的变体的此类方法也可以在允许在酶的催化位点中的空间和/或电子互补的辅因子存在下实施,由于底物甲羟戊酸比天然底物(例如甲羟戊酸二磷酸,在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的情况下)短。此类辅因子的实例是膦酰基磷酸或膦酰胺基磷酸(见图7)或正磷酸盐。
接受或偏好甲羟戊酸作为底物但对其天然产物,例如甲羟戊酸二磷酸作为底物具有低亲和性或不再接受其天然产物例如甲羟戊酸二磷酸作为底物的脱羧酶(优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)的修饰的模型可以源自天然存在的脱羧酶(优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶),或者源自已经修饰、优化或人造合成的脱羧酶(优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)。
令人惊讶地发现二磷酸甲羟戊酸脱羧酶不仅能催化甲羟戊酸二磷酸的脱羧作用,也能接受甲羟戊酸作为底物并使其脱羧,尽管没有二磷酸基团。这特别令人惊讶因为研究了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的底物结合需求的Jabalquinto和Cardemil(Biochim.Biophys.Acta 996(1989),257-259)指出甲羟戊酸二磷酸的二磷酸部分对于该底物结合到酶的催化位点的重要性(见第259页)。在此背景下,注意甲羟戊酸与二磷酸甲羟戊酸的显著差异是重要的。甲羟戊酸只具有约148Da的分子量而二磷酸甲羟戊酸具有308Da的分子量并且磷酸基团携带三个额外的电荷。
在根据本发明的方法中使用的脱羧酶,优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶能够是蛋白质的天然模型或合成的蛋白质以及化学合成或者在生物系统中或通过重组方法生产的蛋白质。例如为改善它/它们的稳定性、耐受性(例如,对温度),为协助它/它们的纯化或其固定化在支持物上,脱羧酶,优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶也可以是化学修饰的。可以以分离的形式、纯化的形式、固定的形式、作为从合成酶的细胞获得的粗糙或部分纯化的提取物、作为化学合成的酶、作为重组生产的酶、以生产它们的生物/微生物的形式等使用脱羧酶,优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
可以在体外或体内实施根据本发明的方法。体外反应被理解为不使用细胞的反应,即无细胞反应。
为在体外实施方法,将反应的底物和酶在允许酶是活性的并且允许酶促转化发生的条件下(缓冲液、温度、共底物、辅因子等)孵育。允许反应进行足够生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的时间。能够用本领域已知的方法(例如层析法,例如薄层层析或者可能与质谱检测相连的液相或气相层析)测量3-甲基丁-3-烯-1-醇的生产。
酶可以是允许酶促反应发生的任何适当形式。它可以是纯化的或部分纯化的,或者是粗糙细胞提取物或部分纯化的提取物的形式。将酶固定在适当的载体上也是可能的。
如果需要,也添加共底物、辅因子或离子。描述了例如一些二磷酸甲羟戊酸脱羧酶使用ATP作为共底物,所述ATP在脱羧反应中被转化为ADP和无机磷酸。因此,在优选的实施方案中,在实施根据本发明的方法时向反应添加ATP。然而,能够向反应混合物添加任何其它适当的rNTP(三磷酸核糖核苷)或dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷)或这些的任何混合物代替ATP。添加焦磷酸盐或另一多磷酸盐或含有磷酸酐基团(POP)的分子也是可能的。此外,能够添加前述化合物的任何混合物。
此外,描述了一些二磷酸甲羟戊酸脱羧酶需要二价阳离子。因此,在优选的实施方案中,并且如果是必需的,在实施根据本发明的方法时向反应中添加适当量的适当二价阳离子。二价阳离子优选地是Mg2+、Mn2+或Co2+,但使用其它二价阳离子例如Ca2+也是可能的。当然,二价阳离子的种类取决于目的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的需要。
因为底物甲羟戊酸通常比酶使用的天然底物(例如二磷酸甲羟戊酸脱羧酶使用的甲羟戊酸二磷酸)短,向反应混合物添加允许在酶的催化位点中的空间和/或电子互补的辅因子可能是有利的。此类辅因子的实例,在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的情况下将是膦酰基磷酸或膦酰胺基磷酸(见图7)或正磷酸盐。
为在体内实施方法,使用适当的能提供底物,即甲羟戊酸的(一种或多种)生物/微生物,以及能催化甲羟戊酸的脱羧作用至3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶。在优选的实施方案中所述酶是二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。有两条可选择的途径通向焦磷酸3-甲基丁-3-烯-1-醇酯。一条是甲羟戊酸途径,在真核生物和某些原核生物,特别是硬壁菌(firmicute)门中观察到。因此全部这些生物生产甲羟戊酸。大部分细菌,包括大肠杆菌,使用另一条途径(DXP途径)并因此不生产甲羟戊酸。然而,后者可以被遗传修饰以生产甲羟戊酸。例如,在大肠杆菌中植入甲羟戊酸途径已经成功完成(Maury等,FEBS Lett.582(2008),4032)。在有或没有甲羟戊酸途径的生物中仅上游部分(硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶)的过量表达允许生产高水平的甲羟戊酸。
在优选的实施方案中,在根据本发明的方法中使用的生物是被遗传修饰以含有编码能催化甲羟戊酸的脱羧作用至3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶的外源核酸分子的生物,优选地微生物。在优选的实施方案中生物已经被遗传修饰以含有编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的外源核酸分子。术语“外源”在此背景中表示核酸分子不天然存在于所述生物/微生物中。这表示它不以相同的结构或在相同的位置存在于生物/微生物中。在一个优选的实施方案中,外源核酸分子是包含启动子和编码各自的酶(例如二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)的编码序列的重组分子,其中驱动编码序列表达的启动子相对于编码序列是异源的。在此背景中异源表示启动子不是天然地驱动所述编码序列表达的启动子而是天然地驱动不同的编码序列表达的启动子,即它源自另一个基因,或者是合成的启动子或嵌合的启动子。优选地,启动子是与生物/微生物异源的启动子,即不天然存在于各自的生物/微生物中的启动子。更优选地,启动子是可诱导的启动子。本领域技术人员熟知在不同类型的生物,特别是微生物中驱动表达的启动子。
在另一个优选的实施方案中,核酸分子对生物/微生物是外源的,在于所编码的酶(例如二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)对该生物/微生物不是内生的,即其在没有被遗传修饰时不被生物/微生物天然地表达。换言之,所编码的脱羧酶(例如二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)相对于生物/微生物是异源的。
外源核酸分子可以染色体外的形式(例如作为质粒)存在于生物微生物中,或稳定地整合到染色体中。稳定的整合是优选的。
在另一个优选的实施方案中生物/微生物的特征在于与相应的非遗传修饰的生物/微生物相比,在用外源核酸分子遗传修饰的生物/微生物中能催化甲羟戊酸脱羧作用至3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶,优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的表达/活性较高。“较高”的表达/活性表示酶,优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的表达/活性在遗传修饰的微生物中比在相应的非遗传修饰的微生物中高至少10%,优选地至少20%,更优选地至少30%或50%,更优选地至少70%或80%,特别优选地至少90%或100%。在更优选的实施方案中表达/活性的增加可为至少150%,至少200%或至少500%。
术语“较高”的表达/活性也覆盖了相应的非遗传修饰的生物/微生物不表达相应的酶(例如二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)如此使得非遗传修饰的生物/微生物中的相应的表达/活性是0的情况。
本领域技术人员熟知测量在细胞中给定的蛋白质的表达水平的方法。在一个实施方案中,表达水平的测量是通过测量相应的蛋白质的量完成的。本领域技术人员熟知相应的方法,包括蛋白质印迹、ELISA等。在另一个实施方案中表达水平的测量是通过测量相应的RNA的量完成的。本领域技术人员熟知相应的方法,包括例如RNA印迹。
本领域熟知测量上述酶,特别是二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的酶促活性的方法,并且上文已经描述。
在本发明的背景中使用的术语“生物”一般指任何可能类型的生物,特别是真核生物、细菌生物和古细菌。术语包括动物、植物、真菌、细菌和古细菌。术语也包括此类生物的分离的细胞或细胞集合物,例如组织或胝。
在一个优选的实施方案中,生物是微生物。术语“微生物”在本发明的背景中指原核细胞特别是细菌,以及真菌例如酵母,以及藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中,微生物是细菌。原则上能够使用任何细菌。根据本发明的方法使用的优选的细菌都是经典的生产菌株,对所述生产菌株已经开发了工程工具。在特别优选的实施方案中细菌属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属,更优选大肠杆菌种或枯草芽孢杆菌种。
在另一个优选的实施方案中微生物是真菌。根据本发明的方法使用的优选的真菌都是经典的生产菌株,对所述生产菌株已经开发了工程工具。更优选地真菌是酵母,优选地是酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属或克鲁维酵母属,更优选地是酿酒酵母种、粟酒裂殖酵母种、巴斯德毕赤酵母种或乳酸克鲁维酵母种。其他优选的真菌是木霉属或曲霉属,更优选地里氏木霉种或黑曲霉种。
仍在另一个优选的实施方案中微生物是光合活性的微生物例如能实施光合作用的细菌或微藻。
在特别优选的实施方案中微生物是藻类,更优选地属于硅藻的藻类。
当通过使用提供相应的酶活性的生物/微生物在体内实施根据本发明的方法时,在允许酶促反应发生的适当的培养条件下培养生物,优选地微生物。具体培养条件取决于使用的具体的生物微生物,但为本领域技术人员所熟知。通常以允许编码各自的反应的酶的基因表达的方式选择培养条件。本领域技术人员知晓在培养的特定阶段提高和微调特定基因的表达的多种方法,例如通过化学诱导物或通过温度变化诱导基因表达。
在另一个优选的实施方案中根据本发明的方法使用的生物是植物。原则上能够使用任何植物,即单子叶植物或双子叶植物。优选地使用能以农业上有意义的规模培养并允许生产大量生物质的植物。实例是禾本科植物例如黑麦草属,谷物例如黑麦、小麦、大麦、燕麦、小米、玉米,其他储淀粉植物例如马铃薯或储糖植物例如甘蔗或甜菜。使用烟草或蔬菜植物例如番茄、胡椒、黄瓜、茄子等也是可想到的。另一个可能性是使用储油植物例如油菜籽、橄榄等。使用树,特别是生长迅速的树例如桉树、白杨或橡胶树(巴西橡胶树)也是可想到的。
本发明也涉及表达能催化甲羟戊酸的脱羧作用的酶,优选地具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的活性的酶的生物,优选地微生物用于通过甲羟戊酸脱羧作用生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。
即,本发明也涉及如根据本发明的方法的背景中描述的生物/微生物用于生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。
此外,本发明也涉及组合物,所述组合物包含(i)甲羟戊酸;和(ii)能催化甲羟戊酸脱羧作用的酶。
对酶的优选实施方案,同样适用与根据本发明的方法相关的前述说明。
在特别优选的实施方案中,组合物也包含共底物(例如ATP)、辅因子和/或二价阳离子(例如Mn2+、Mg2+、Co2+或Ca2+)。
此外,本发明也涉及能催化甲羟戊酸的脱羧作用的酶,优选地二磷酸甲羟戊酸脱羧酶用于生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。
对酶的优选实施方案,同样适用与根据本发明的方法相关的前述说明。
本发明也涉及甲羟戊酸用于生产3-甲基丁-3-烯-1-醇,特别是通过脱羧作用步骤通过甲羟戊酸酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。在优选的实施方案中酶促转化是通过如与根据本发明的方法相关的前述的酶,更优选地用具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶促活性的酶实现的,最优选地转化是通过使用如根据本发明的方法的背景中描述的生物实现的。
此外本发明也涉及从甲羟戊酸生产异戊二烯的方法,所述方法包括如上所述的根据本发明的生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法,并还包括将生产的3-甲基丁-3-烯-1-醇转化为异戊二烯的步骤。能够通过本领域技术人员已知的手段和方法实现3-甲基丁-3-烯-1-醇转化为异戊二烯。特别地,各自的反应是脱水反应。
此外,本发明也涉及从甲羟戊酸生产异戊醇的方法,所述方法包括如上所述的根据本发明的生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法,并还包括将生产的3-甲基丁-3-烯-1-醇转化至异戊醇的步骤。能够通过本领域技术人员已知的手段和方法实现3-甲基丁-3-烯-1-醇转化至异戊醇。特别地,各自的反应是氢化反应。
图1:显示了甲羟戊酸的化学结构
图2:显示了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶在生理底物二磷酸甲羟戊酸和在前体甲羟戊酸上的反应
图3:显示了通过跟踪无机磷酸盐生产就甲羟戊酸脱羧酶活性筛选酶文库的实例。对照反应是用以缺少MDP脱羧酶基因的pET22b转化的大肠杆菌BL21(DE3)的提取物实施的。
图4:(a)显示了在大肠杆菌中干燥嗜酸球菌MDP脱羧酶表达的优化的结果。从天然干燥嗜酸球菌MDP脱羧酶DNA序列(第1至3道)和优化的基因(第4至6道)的表达获得的蛋白质的样品的SDS-PAGE分析。
(b)显示了从天然干燥嗜酸球菌MDP脱羧酶DNA序列和优化的基因的表达获得的大肠杆菌的粗糙裂解物的甲羟戊酸脱羧作用活性。对照反应是用以缺少MDP脱羧酶基因的pET22b转化的大肠杆菌BL21(DE3)的提取物实施的。通过无机磷酸盐生产的测量检测酶活性。
图5:显示了来自嗜酸球菌/热原体门的MDP脱羧酶间的甲羟戊酸脱羧作用活性的比较。通过无机磷酸盐生产测量的手段检测酶活性。
图6:显示产物形成作为甲羟戊酸浓度的函数。产物形成后进行高锰酸盐测定。
图7:显示膦酰基磷酸或膦酰胺基磷酸的结构。
以下实施例用于说明本发明。
实施例1:就甲羟戊酸脱羧作用活性筛选MDP脱羧酶文库
构建了编码MDP脱羧酶家族的酶的63个基因的文库并就甲羟戊酸作为底物测试活性。
克隆、细菌培养和蛋白质的表达
将编码甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶EC 4.1.1.33的基因在真核基因的情况下克隆到pET 25b载体(Novagen)中,在原核基因的情况下克隆到pET 22b(Novagen)中。在甲硫氨酸起始密码子后插入一段6个组氨酸密码子以提供用于纯化的亲和性标签。按照热休克程序用这些载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)。转化后的细胞在含有0.5M山梨醇、5mM betain、100μg/ml氨苄青霉素的极品肉汤(TB)培养基中在30℃下摇动(160rpm)生长直至600nm处OD值达到包含0.8至1之间。然后添加异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM并在20℃继续蛋白质表达过夜(约16h)。通过在4℃,10000rpm离心20min收集细胞并将沉淀冷冻于-80℃。
细胞裂解
将来自12ml培养细胞的沉淀在冰上融解并重悬在含有20mM KCl、0.5mM DTT、5mM MgCl2的1ml 50mM Tris/HCl pH7.4中。添加1微升lysonase(Novagen)。将细胞在室温下孵育10min然后放回冰上20min。通过超声处理15秒完成细胞裂解。然后通过在4℃,10000rpm离心20min澄清细菌提取物。
酶促反应
如下测试所需的酶促反应(甲羟戊酸转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇)。
反应介质含有100mM甲羟戊酸、40mM ATP、10mM MgCl2、20mMKCl、0.5mM DTT以及从0.01至0.05mg/ml的蛋白质的酶制剂。在pH从4至6的范围内使用50mM柠檬酸钠,对于pH 7和7.5使用50mMTris-HCl。平行实施没有酶的对照测定。在孵育72h后,根据钼酸铵法(Gawronski JD,Benson DR,Anal.Biochem.327(2004)114-118)用比色法定量无机磷酸盐。将50μl样品(含有不多于0.5微摩的磷酸盐)与含有50%v/v丙酮、1.25N H2SO4、2.5mM(NH4)6Mo7O24的150μl钼酸铵试剂混合并然后和10μl 1M柠檬酸混合。将混合物在室温孵育2分钟。在355nm处测量形成的钼磷酸铵的吸光度并使用以磷酸钾获得的校准曲线估计无机磷酸盐的量。
结果如图3所示。
在初始的筛选中,只有使用表达从干燥嗜酸球菌MDP脱羧酶序列推断的遗传构建体的重组菌株的测定引起高于背景水平的磷酸盐生产的可重复的增加。
实施例2:大肠杆菌中干燥嗜酸球菌MDP脱羧酶表达的优化
根据SDS-PAGE凝胶上可见的模糊的条带判断,大肠杆菌BL21中酶表达的初始水平低。用可以从http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/获得的“Optimizer”程序,如基于Sharp和Li的方法(Nucl.Acids Res.15(1987),1281-1295)测量的在大肠杆菌中表达的天然序列的密码子优化指数(CAI)给出的值低达0.23。
生成编码相同的蛋白质但含有更适于大肠杆菌中表达的密码子的基因序列。它以0.77的CAI为特征。
在SEQ ID NO:20(干燥嗜酸球菌(AAT43941)MDP脱羧酶的天然序列,包括His标签)和SEQ ID NO:21(干燥嗜酸球菌(AAT43941)MDP脱羧酶的优化序列,包括His标签)显示天然序列和优化的序列。通过寡核苷酸多联化合成优化的序列,并将其克隆到pET25b表达载体中。在转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株并诱导后,根据如实施例1所述的流程生产并在凝胶上分析蛋白质。用天然序列实施相同流程用于比较。
比较使用天然核苷酸序列或为大肠杆菌中表达优化的序列的表达水平。图4a中的结果显示在未纯化的细胞裂解物中对应于优化的基因的蛋白质(箭头)在凝胶上清晰可见(第4道),表明非常显著的表达增加。
如图4b所示,蛋白质的表达提高使得用优化的序列获得的粗糙裂解物含有甲羟戊酸作为底物的较高的酶活性。
实施例3:使用优化的干燥嗜酸球菌MDP脱羧酶的反应的表征
如下纯化重组酶:
蛋白质纯化和浓缩
将来自150ml培养细胞的沉淀在冰上融解并在含有300mM NaCl、5mM MgCl2和1mM DTT的5mL Na2HPO4 pH8中重悬。添加20微升lysonase(Novagen)。将细胞在室温下孵育10min然后放回冰上20min。通过超声处理3x15秒完成细胞裂解。然后通过在4℃,10000rpm离心20min澄清细菌提取物。将澄清的细菌裂解物装载到PROTINO-1000Ni-IDA柱上(Macherey-Nagel),允许带6-His标签的蛋白质被吸附。洗柱并用含有300mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、250mM咪唑的4ml的50mM Na2HPO4 pH8洗脱目标酶。然后在Amicon Ultra-410kDa过滤单元(Millipore)上将洗脱物浓缩并脱盐并在250μl含有0.5mM DTT和5mM MgCl2的50mM Tris-HCl pH7.4中重悬。根据Bradford方法定量蛋白质浓度。
如此纯化的蛋白质的纯度估计为约90%。
使用范围底物确认并进一步分析酶的活性:显示转化速率随甲羟戊酸浓度增加(图6)。
实施例4:通过使用辅因子优化反应条件
使用优化的干燥嗜酸球菌MDP脱羧酶的纯化制剂实施如实施例1所描述的相同的反应。在其中一个样品中添加膦酰基磷酸或膦酰胺基磷酸(图7)作为辅因子,浓度为100mM。
使用如实施例1描述的比色测定观测甲羟戊酸的转化。发现当存在辅因子时,随时间消耗的ATP量显著地更高。
实施例5:从干燥嗜酸球菌门筛选MDP脱羧酶同源物文库
如实施例1所述,生成从火山热原体(登录号Q97BY2)和嗜酸热原体(登录号Q9HIN1)的基因组推断的MDP脱羧酶的序列。如实施例3所述纯化蛋白质并用实施例1中描述的测定方法测定。从这些小瓶中观测到了磷酸盐生产的显著增加,表明这些酶也对甲羟戊酸是活性的。结果在图5中显示。
实施例6:从葡萄糖合成3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法
用携带来自酿酒酵母的硫解酶、HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶的基因的表达质粒转化大肠杆菌K12以过量生产甲羟戊酸。
用携带编码来自干燥嗜酸球菌的带His-标签模型的MDP脱羧酶的优化的基因的第二个,可相容的表达质粒进一步转化菌种。
然后将获得的重组细菌在含有葡萄糖的矿物营养培养基中,在氧气存在下和适度搅拌下在发酵罐中孵育。使用如下的TLC或GC/MS分析测量到显著生产3-甲基丁-3-烯-1-醇。
TLC分析
为TLC分析,将反应介质的等分试样点在用硅石包被的平板上并使用乙酸乙酯/庚烷1/1v/v作为洗脱液层析。使用甲羟戊酸、3-甲基丁-3-烯-1-醇、ATP、ADP作为内标。在干燥后,用碱性KMnO4试剂喷雾平板,发现3-甲基丁-3-烯-1-醇的Rf为0.57。
GC/MS分析
将反应介质的10μl的等分试样离心并将上清液转移到干净的小瓶中用于通过GC/MS检测3-甲基丁-3-烯-1-醇。使用DB-5柱通过GC分离1μl样品并通过质谱监测3-甲基丁-3-烯-1-醇的存在。
实施例7:测量甲羟戊酸脱羧酶活性和3-甲基-3-丁烯-1-醇(isoprenol)的生产
根据Campos等(Biochem.J.2001,353,59-67),用NaOH通过水解从甲羟戊酸内酯(Sigma)制备甲羟戊酸。
甲羟戊酸脱羧作用的完整测定包含反应缓冲液、100mM甲羟戊酸、40mM ATP、10mM MgCl2、20mM KCl、0.5mM DTT和浓度在0.01至0.05mg/ml蛋白质的酶制剂。在pH从4至6的范围内使用50mM柠檬酸钠,对于pH7和7.5使用50mM Tris-HCl。在没有酶、底物或辅因子的条件下实施对照试验。
3-甲基丁-3-烯-1-醇生产的进展是通过用薄层层析(TLC)、气相层析/质谱(GC/MS)和通过高锰酸盐测定的产物确定,通过分析在连续的时间间隔从在37℃孵育的反应混合物中取得的等分试样跟踪的。平行地,通过钼酸铵方法定量无机磷酸盐的释放。
高锰酸盐测定
含有双键的产物形成后用碱性高锰酸钾溶液氧化,导致420nm处吸光度的增加。
向用H2O稀释到120μl的反应混合物的等分试样中添加含有5mMKMnO4和50mM NaOH的80μl高锰酸盐试剂。将混合物在室温下保持20min并测量420nm处的吸光度。校准曲线是使用商购的3-甲基丁-3-烯-1-醇制备的。
无机磷酸盐定量
根据钼酸铵方法(Gawronski JD,Benson DR,Anal.Biochem.327(2004)114-118)通过分光比色法测量无机磷酸盐浓度。将来自反应测定的50μl等分试样(含有不多于0.5微摩尔磷酸盐)与含有50%体积的丙酮、1.25N H2SO4、2.5mM(NH4)6Mo7O24的150μl钼酸铵试剂混合,然后与10μl1M柠檬酸混合。然后将混合物在室温下孵育2分钟。在355nm处测量形成的磷钼酸铵的吸光度并使用以磷酸钾获得的校准曲线估计无机磷酸盐的量。
Claims (14)
1.生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法,其特征在于其包括用具有脱羧酶活性的酶将甲羟戊酸转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的步骤。
2.权利要求1的方法其中具有脱羧酶活性的酶是具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)活性的酶。
3.权利要求1或2的方法,其中具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶活性的酶包含选自SEQ ID NO:1至16所示的氨基酸序列的氨基酸序列,或者是包含与选自SEQ ID NO:1至16所示的氨基酸序列的氨基酸序列至少15%同一的氨基酸序列并显示二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的酶促活性的酶。
4.权利要求3的方法,其中具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶活性的酶包含SEQ ID NO:6、16、17、18或19的氨基酸序列,或者是包含与SEQ ID NO:6、16、17、18或19的氨基酸序列至少30%同一的氨基酸序列并显示二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的酶促活性的酶。
5.权利要求1至4任一项的方法,所述方法在体外实施。
6.权利要求1至5任一项的方法,其中添加共底物。
7.权利要求6的方法,其中共底物是ATP、rNTP、dNTP、多磷酸盐或焦磷酸盐,或这些化合物的任意混合物。
8.权利要求1至4任一项的方法,其特征在于酶促转化是由表达能催化甲羟戊酸脱羧作用至3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶的生物实现的。
9.权利要求8的方法,其中能催化甲羟戊酸脱羧作用至3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶是具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)活性的酶。
10.具有脱羧酶活性的酶用于通过甲羟戊酸脱羧作用从甲羟戊酸生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。
11.权利要求10的用途,其中具有脱羧酶活性的酶是具有二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)活性的酶。
12.甲羟戊酸用于生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。
13.从甲羟戊酸生产异戊二烯的方法,所述方法包括权利要求1至9任一项的方法,并还包括将生产的3-甲基丁-3-烯-1-醇转化为异戊二烯的步骤。
14.从甲羟戊酸生产异戊醇的方法,所述方法包括权利要求1至9任一项的方法,并还包括将生产的3-甲基丁-3-烯-1-醇转化为异戊醇的步骤。
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