ES2478844T3

ES2478844T3 - Procedimiento para la producción de isoprenol a partir de mevalonato, empleando una difosfomevalonato descarboxilasa

Info

Publication number: ES2478844T3
Application number: ES09799636.7T
Authority: ES
Inventors: Philippe Marliere; Maria Anissimova; Romain Chayot; Marc Delcourt
Original assignee: Global Bioenergies SA; Scientist of Fortune SA
Current assignee: Global Bioenergies SA; Scientist of Fortune SA
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2029-12-22
Also published as: DK2516656T3; IL220145A0; AU2009357243A1; BR112012017346A8; US20150376653A1; HK1175815A1; US20130052706A1; CA2785101C; AU2009357243B2; IL220145A; BR112012017346A2; US9752163B2; US9102952B2; CN102686734A; CA2785101A1; EP2516656A1; EP2516656B1; PL2516656T3; WO2011076261A1

Abstract

Un método para la producción de isoprenol, caracterizado por que comprende la etapa de convertir mevalonato con una enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa (EC 4.1.1.33) en isoprenol

Description

Procedimiento para la producción de isoprenol a partir de mevalonato, empleando una difosfomevalonato descarboxilasa.

La presente invención se refiere a un método para la producción de isoprenol utilizando mevalonato como sustrato y convirtiéndolo enzimáticamente en isoprenol mediante una etapa de descarboxilación. La presente invención también se refiere al uso de una enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa (EC 4.1.1.33) para la producción de isoprenol a partir de mevalonato. Además de ello, la presente invención se refiere a un método para la producción de isopreno, comprendiendo el método para la producción de isoprenol utilizando mevalonato como sustrato y convirtiéndolo enzimáticamente en isoprenol mediante una etapa de descarboxilación y que comprende, además, la etapa de convertir el isoprenol producido en isopreno. La presente invención también se refiere a un método para la producción de alcohol isoamílico que comprende el método para la producción de isoprenol utilizando mevalonato como sustrato y convirtiéndolo enzimáticamente en isoprenol mediante una etapa de descarboxilación en isoprenol y que comprende, además, la etapa de convertir el isoprenol producido en alcohol isoamílico.

Isoprenol responde a la fórmula C5H10O. Se puede utilizar para producir prenol, que se utiliza en perfumes o como un bloque de construcción en la industria farmacéutica. Es producido por la condensación química de isobuteno y formaldehído, que conduce a isoprenol que se isomeriza adicionalmente para formar prenol. La ruta que se utiliza actualmente para producir isoprenol implica la vía del mevalonato: se produce mevalonato y, a continuación, se difosforila, después se descarboxila-deshidrata en pirofosfato de isoprenilo, y finalmente se desfosforila dos veces para dar isoprenol (solicitud de patente de EE.UU. 20080092829).

El documento de NABETA, K. ET AL.: “Metabolism of RS-Mevalonic Acid-6,6,6-2H3by in Vitro Callus Culture of Perilla sp.” (AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 49, nº 10, 1985, páginas 3039-3040) describe un procedimiento para la preparación de isoprenol, que comprende la conversión de mevalonato en isoprenol, empleando un cultivo del tejido del callo derivado de Perilla sp.

Isoprenol se puede convertir en isopreno que es un compuesto clave para la industria del neumático, y también tiene muchas aplicaciones en los adhesivos. Se produce químicamente utilizando varias rutas:

-: Destilación extractiva del petróleo (corte C5)

-: Deshidrogenación de iso-amileno

-: Doble deshidrogenación de isopentano

-: Reacción de isobuteno y formaldehido

-: Reacción de acetona y acetileno

-: Dimerización de propileno

El documento WO 2009/076676 informa de una vía metabólica para formar isopreno. La vía se basa en la desfosforilación-deshidratación de productos intermedios aguas abajo en la vía del mevalonato, es decir, pirofosfato de isoprenilo o pirofosfato de prenilo. Este proceso tiene el inconveniente de requerir recorrer toda la vía del mevalonato: doble fosforilación de mevalonato, seguida de una descarboxilación-deshidratación en pirofosfato de isoprenilo, adicionalmente isomerizado para formar pirofosfato de prenilo y, finalmente, doble desfosforilación/deshidratación para dar isopreno. Alcohol isoamílico es un producto químico muy importante, comúnmente utilizado como disolventes para grasas, aceites, resinas y alcaloides. Existe una demanda de alcohol isoamílico en la industria de la perfumería, por ejemplo en la fabricación de salicilato de isoamilo utilizado en jabón y fragancias cosméticas. También se utiliza en la fabricación de ácido fosfórico. Además de ello, se utiliza en la síntesis de piretroides. Los procesos comerciales para la producción de alcohol isoamílico incluyen el fraccionamiento de aceites de fusel, la cloración de alcanos con subsiguiente hidrólisis para producir una mezcla de isómeros y un oxo-proceso a baja presión o la hidroformilación de n-butenos, seguida de hidrogenación del iso-valeraldehído resultante. Existe una necesidad de proporcionar métodos no contaminantes, económicos y sencillos para producir los compuestos mencionados anteriormente. Esta necesidad se satisface mediante la materia objeto tal como se expone en las reivindicaciones.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir isoprenol a partir de mevalonato. En particular, la presente invención se refiere a un método para producir isoprenol a partir de mevalonato, que se caracteriza por una conversión de mevalonato con una enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa (EC 4.1.1.33). Por lo tanto, el método comprende la descarboxilación catalizada enzimáticamente de mevalonato. El término "descarboxilación", cuando se utiliza en el contexto de la presente invención, se refiere a una descarboxilación deshidratante.

El término "mevalonato" comprende ácido mevalónico, así como el anión de ácido mevalónico, que es la forma predominante en medios biológicos. Ácido mevalónico es un precursor en la vía biosintética, conocida como la vía del mevalonato, que produce terpenos y esteroides. Mevalonato es el precursor principal de pirofosfato de isoprenilo, que es a su vez la base para todos los terpenoides. La fórmula estructural de ácido mevalónico se muestra en la Figura 1.

En el contexto de la presente invención, el término isoprenol comprende compuestos que responden a la fórmula C5H10O. El nombre IUPAC de isoprenol es 3-metilbut-3-en-1-ol. Sinónimos de isoprenol son, por ejemplo, 2-metil-1buten-4-ol, 3-buten-1-ol-3-metílo, alcohol 3-isopentenílico, 3-metil-3-buten-1-ol, isobutenilcarbinol, alcohol isopropeniletílico y metalil carbinol.

La expresión "enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa (EC 4.1.1.33)" en el contexto de la presente invención se refiere a una enzima que es capaz de descarboxilar mevalonato, en particular de acuerdo con el esquema de reacción dado en la Figura 2. La reacción catalizada es una deshidratación y descarboxilación simultáneas. Esta actividad enzimática se puede medir como se describe en los Ejemplos 1 ó 7 adjuntos. La enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa (EC 4.1.1.33) es una enzima que se clasifica como una difosfomevalonato descarboxilasa o es una enzima que se deriva de una enzima de este tipo y que tiene la capacidad de descarboxilar mevalonato a fin de producir isoprenol. Difosfomevalonato descarboxilasa está clasificada con el número EC 4.1.1.33. Una difosfomevalonato descarboxilasa es capaz de catalizar la descarboxilación de mevalonato difosfato. En esta reacción, ATP y 5-difosfomevalonato se convierten en ADP, fosfato, pirofosfato de isoprenilo y CO2. La reacción catalizada por una difosfomevalonato descarboxilasa se muestra en la Figura 2. La actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa se puede medir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, p. ej., en Reardon et al. (Biochemistry 26 (1987), 4717-4722). Preferiblemente, la actividad se mide como se describe en el Ejemplo 1 ó 7 en el que se utiliza difosfomevalonato en lugar de mevalonato. Se ha informado que, al menos en algunos casos, la reacción es dependiente de cationes divalentes (véase, p. ej., Krepkiy et al., Protein Science 13 (2004), 1875-1881; Michihara et al, Biol. Pharm. Bull. 25 (2002), 302-306). Difosfomevalonato descarboxilasa es una enzima que, en su función natural, es parte de la vía del mevalonato para la síntesis de isoprenoides en bacterias y de la vía de biosíntesis de esterol en eucariotas. Se ha identificado y aislado a partir de diversos organismos tales como animales, hongos, levaduras y bacterias. También se expresa en determinadas plantas. La estructura tridimensional de varias difosfomevalonato descarboxilasas ya ha sido determinada (véase, p. ej., Byres et al. (J. Mol. Biol. 371 (2007), 540-553); Bonanno et al. (Proc. Natl Acad. Sci. USA 98 (2001), 12896-12901); Voynova et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 480 (2008), 58-67)) y está disponible un considerable conocimiento acerca de su sitio activo, residuos aminoácidos cruciales para la reacción catalítica y la reacción enzimática real (véase, p. ej., Byres et al. (J. Mol. Biol. 371 (2007), 540-553); Bonanno et al. (Proc. Natl Acad. Sci. USA 98 (2001), 12896-12901)). En la mayoría de los casos la enzima está compuesta de aproximadamente 300 a 400 aminoácidos y utiliza ATP como co-sustrato, el cual se convierte durante la reacción de descarboxilación en ADP y fosfato inorgánico. Difosfomevalonato descarboxilasas se han descrito para diversos organismos y también secuencias de aminoácidos y nucleótidos que las codifican están disponibles para numerosas fuentes. En principio, en el contexto de la presente invención se puede utilizar cualquier difosfomevalonato descarboxilasa, en particular de organismos procariotas o eucariotas. Difosfomevalonato descarboxilasas eucariotas se describen, por ejemplo, para animales, tales como Rattus norvegicus, Gallus gallus, Homo sapiens, Mus musculus, Sus scrofa, D. melanogaster, C. elegans y Trypanosoma brucei, para plantas tales como Arabidopsis thaliana, Ginko biloba, Oryza sativa, Pisum sativum, para levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans. También se han descrito numerosas difosfomevalonato descarboxilasas, p. ej., para Helicobacter, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecium, Listeria monocytgenes, Leuconostoc citreum, Lactobacillus reuteri, por nombrar sólo algunos. La Tabla 1 proporciona una lista de secuencias de difosfomevalonato descarboxilasas de diferentes organismos que indican los números de acceso de los que se pueden recuperar de las respectivas bases de datos.

Tabla 1

Organismo: Número de Acceso Genbank

Bombyx mori: A5A7A2

Cepa YJM7 de Saccharomyces cerevisiae: A6ZSB7

Solanum lycopersicum: A8WBX7

Hevea brasilensis: A9ZN03

Nicotiana langsdotfii x Nicotiana sanderae: B3F8H5

Saccharomyces cerevisiae (cepa RM11-1a): B3LPK0

Phaeodactylum tricomutum CCAP 1055: B7S422

Candida dubliniensis: B9W6G7

Picchia pastoris: C4QX63

Ashbya gossypi: Q751D8

Bos taurus: Q0P570

Danio rerio: Q5U403

Dictyostelium doscoideum: Q54YQ9

Homo sapiens: P53602

Mus musculus: Q89JFS

Rattus norvegicus: Q62967

Schizosaccharomyces pombe: O13963

Saccharomyces cerevisiae: P32377

Arnebia euchroma: Q09RL4

Aspergillus oryzae: Q2UGF4

Mus musculus: Q3UYC1

Gingko biloba: Q5UCT8

Rattus norvegicus: Q642E5

Oryza sativa subsp. japonica: Q6ETS8

Arabidopsis thaliana: Q8LB37

Encephalitozoon cuniculi: Q8SRR7

Hevea brasilensis: Q944G0

5 Ejemplos de difosfomevalonato descarboxilasas de diferentes organismos se dan en SEQ ID NO: 1 a 19. En una forma de realización preferida de la presente invención, la difosfomevalonato descarboxilasa es una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 19 o una secuencia que es al menos n% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 19 y que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa, siendo n un número entero entre 10 y 100, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35,

10 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 , 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99.

Preferiblemente, el grado de identidad se determina comparando la secuencia respectiva con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs. arriba mencionados. Cuando las secuencias que se comparan no tienen la misma longitud, el grado de identidad se refiere preferiblemente al porcentaje de residuos aminoácidos

15 en la secuencia más corta que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia más larga o al porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia más larga que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia más corta. El grado de identidad de la secuencia puede determinarse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica utilizando preferiblemente algoritmos informáticos adecuados tal como CLUSTAL. Cuando se utiliza el método de análisis Clustal para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 80%

20 idéntica a una secuencia de referencia, se pueden utilizar ajustes por defecto o los ajustes son preferiblemente como sigue: Matriz: blosum 30; Abrir penalización para el hueco: 10,0; Extender penalización para el hueco: 0,05; Retrasar divergente: 40; Distancia de separación del hueco: 8 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, Extender penalización para el hueco se ajusta preferiblemente a 5,0.

25 Preferiblemente, el grado de identidad se calcula en la longitud completa de la secuencia. Además de ello, si el término "homología" se utiliza en el contexto de la presente invención, el término significa preferiblemente "identidad de la secuencia".

En una forma de realización preferida, la difosfomevalonato descarboxilasa empleada en el método de acuerdo con

30 la invención es una difosfomevalonato descarboxilasa de Picrophilus torridus o un organismo que está evolutivamente estrechamente relacionado con Picrophilus torridus. En una forma de realización preferida adicional, la difosfomevalonato descarboxilasa se origina a partir de un organismo del género Picrophilus, Thermoplasma o Ferroplasma, más preferiblemente de la especie Picrophilus torridus, Picrophilus oshimae, Thermoplasma volcanicum, Thermoplasma acidophilum, Ferroplasma acidarmanus o Ferroplasma cupricumulans.

35 En una forma de realización particularmente preferida, la difosfomevalonato descarboxilasa empleada en el método de acuerdo con la invención es una difosfomevalonato descarboxilasa que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 6, 16, 17, 18 ó 19, o que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos n% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 16, 17, 18 ó 19 y que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa, siendo n un número entero entre 10 y 100, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99. La enzima que muestra la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NOs: 6 y 16 procede de Picrophilus torridus. Tal como se muestra en los Ejemplos, esta enzima es particularmente eficaz en la catálisis de la descarboxilación del mevalonato a isoprenol. Difosfomevalonato descarboxilasas preferidas, a emplear en el método de acuerdo con la presente invención, son difosfomevalonato descarboxilasas que proceden de organismos que están filogenéticamente estrechamente relacionados con Picrophilus torridus tales como otras bacterias del género Picrophilus tal como Picrophilus oshimae, bacterias del género Ferroplasma, p. ej., Ferroplasma acidarmanus (SEQ ID NO: 19), o del género Thermoplasma tal como Thermoplasma acidophilum (SEQ ID NO: 18) y Thermoplasma volcanium (SEQ ID NO: 17). La difosfomevalonato descarboxilasa de Thermoplasma acidophilum (número AC Q9HIN1) muestra una homología del 38% con la SEQ ID NO: 6 y la de Thermoplasma volcanium (número AC Q97BY2) muestra una homología de aproximadamente 42% con la SEQ ID NO: 6. En otra forma de realización particularmente preferida, la difosfomevalonato descarboxilasa empleada en el método de acuerdo con la invención es una difosfomevalonato descarboxilasa que es codificada por una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 20 ó 21, o por una secuencia de nucleótidos que es al menos n% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 20 ó 21 y que codifica una enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa, siendo n un número entero entre 10 y 100, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75. 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99. La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de nucleótidos nativa que codifica la MDP descarboxilasa procedente de P. torridus que incluye una etiqueta His en el extremo N-terminal. La SEQ ID NO: 21 es una secuencia optimizado en el codón que codifica la MDP descarboxilasa procedente de P. torridus que incluyendo una etiqueta His en el extremo N-terminal.

La difosfomevalonato descarboxilasa empleada en el procedimiento de acuerdo con la invención puede ser una difosfomevalonato descarboxilasa de origen natural, o puede ser una difosfomevalonato descarboxilasa que se deriva de una difosfomevalonato descarboxilasa de origen natural (p. ej., mediante la introducción de mutaciones u otras alteraciones que, p. ej., alteran o mejoran la actividad enzimática, la estabilidad, etc.

La expresión "difosfomevalonato descarboxilasa" o "una proteína/enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa "en el contexto de la presente solicitud también abarca enzimas que se derivan de una difosfomevalonato descarboxilasa, que son capaces de catalizar la descarboxilación de mevalonato, pero que sólo tienen una baja afinidad por su sustrato natural, mevalonato difosfato, o que ya no aceptan su sustrato natural, mevalonato difosfato. Una modificación de este tipo del sustrato preferido de una difosfomevalonato descarboxilasa, permite mejorar la conversión de mevalonato en isoprenol y reducir la producción del sub-producto que posiblemente aparece, pirofosfato de isoprenilo. Métodos para modificar y/o mejorar las actividades enzimáticas deseadas de proteínas son bien conocidos por la persona experta en la técnica, e incluyen, p. ej., mutagénesis al azar o mutagénesis dirigida al sitio y la subsiguiente selección de enzimas que tienen las propiedades o los enfoques de la denominada “evolución dirigida" deseados, barajado de ADN o evolución in vivo Por ejemplo, para la ingeniería genética en células procarióticas, una molécula de ácido nucleico que codifica una difosfomevalonato descarboxilasa se puede introducir en plásmidos que permiten la mutagénesis o modificación de la secuencia por recombinación de secuencias de ADN. Los métodos estándares (véase Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU.) permiten realizar intercambios de bases o añadir secuencias naturales o sintéticas. Fragmentos de ADN se pueden conectar entre sí mediante la aplicación de adaptadores y enlazadores a los fragmentos. Además de ello, se pueden utilizar medidas de ingeniería que proporcionan sitios de restricción adecuados o que eliminan el ADN o sitios de restricción excedentes. En aquellos casos, en los que son posibles inserciones, deleciones o sustituciones, se puede utilizar la mutagénesis in vitro, una "reparación de cebadores", restricción o ligamiento. En general, como métodos de análisis se lleva a cabo un análisis de la secuencia, análisis de restricción y otros métodos de bioquímica y biología molecular. Las variantes de difosfomevalonato descarboxilasa se ensayan después en cuanto a su actividad enzimática y, en particular, a su capacidad para preferir mevalonato como sustrato en lugar de mevalonato difosfato.

Métodos de este tipo para identificar variantes con propiedades enzimáticas mejoradas en cuanto a la producción de isoprenol también pueden llevarse a cabo en presencia de un cofactor que permite una complementación estérica y/o electrónica en el sitio catalítico de la enzima debido al hecho de que el sustrato mevalonato es más corto que el sustrato natural mevalonato difosfato de difosfomevalonato descarboxilasa. Ejemplos de un cofactor de este tipo serían fosfono-fosfato o fosfonamido-fosfato (véase la Figura 7) u ortofosfato.

La versión modificada de la difosfomevalonato descarboxilasa que acepta o prefiere mevalonato como sustrato, pero que tiene una baja afinidad por su producto natural mevalonato difosfato como un sustrato o que no acepta su producto natural mevalonato difosfato, como un sustrato puede derivarse de una difosfomevalonato descarboxilasa de origen natural, o de una difosfomevalonato descarboxilasa ya modificada, optimizada o sintetizada sintéticamente.

Sorprendentemente, se ha encontrado que difosfomevalonato descarboxilasa no sólo es capaz de catalizar la descarboxilación de mevalonato difosfato, sino también puede aceptar mevalonato como sustrato y puede descarboxilarlo, a pesar de la ausencia del grupo difosfato. Esto es particularmente sorprendente, ya que Jabalquinto y Cardemil (Biochim. Biophys. Acta 996 (1989), 257-259), quienes investigaron los requisitos de unión del sustrato difosfomevalonato descarboxilasa vinculantes, señalaron la importancia del resto difosfórico de mevalonato difosfato en la unión de este sustrato al sitio catalítico de la enzima (véase la página 259). En este contexto, es importante señalar las diferencias sustanciales entre mevalonato y difosfomevalonato. Mevalonato sólo tiene un peso molecular de aproximadamente 148 Da, mientras que difosfomevalonato tiene un peso molecular de 308 Da y los grupos fosfato portan tres cargas adicionales.

La difosfomevalonato descarboxilasa empleada en el procedimiento de acuerdo con la presente invención puede ser una versión natural de la proteína o una proteína sintética, así como una proteína que ha sido sintetizada o producida químicamente en un sistema biológico o por procesos recombinantes. La difosfomevalonato descarboxilasa, también puede estar modificada químicamente, por ejemplo con el fin de mejorar su estabilidad, resistencia, p. ej. a la temperatura, para facilitar su purificación o su inmovilización sobre un soporte. La difosfomevalonato descarboxilasa se puede utilizar en forma aislada, forma purificada, en forma inmovilizada, como un extracto crudo o parcialmente purificado obtenido a partir de células que sintetizan la enzima, tal como una enzima químicamente sintetizada, como una enzima producida de forma recombinante, en forma de un organismo/microorganismos productores de las mismas, etc.

El método de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo in vitro o in vivo. Una reacción in vitro se entiende que es una reacción en la que no se emplean células, es decir, una reacción acelular. Para llevar a cabo el procedimiento in vitro los sustratos para la reacción y la enzima se incuban en condiciones (tampón, temperatura, co-sustratos, cofactores, etc.) que permiten que la enzima sea activa y se produzca la conversión enzimática. Se deja que la reacción prosiga durante un tiempo suficiente para producir isoprenol. La producción de isoprenol se puede medir por métodos conocidos en la técnica tales como cromatografía, p. ej., cromatografía en capa fina o cromatografía líquida o gaseosa, posiblemente vinculadas a la detección de espectrometría de masas. La enzima puede estar en cualquier forma adecuada que permita que se lleve a cabo la reacción enzimática. Puede estar purificada o parcialmente purificada o en forma de extractos celulares crudos o extractos parcialmente purificados. También es posible que la enzima esté inmovilizada sobre un soporte adecuado. Si se requiere, se añaden también un co-sustrato, un co-factor o iones. Se describe, por ejemplo, que algunas enzimas difosfomevalonato descarboxilasa utilizan ATP como un co-sustrato que se convierte en ADP y fosfato inorgánico durante la reacción de descarboxilación. Por lo tanto, en una realización preferida, el ATP se añade a la reacción cuando se lleva a cabo el método de acuerdo con la invención. Sin embargo, en lugar de ATP se puede añadir a la mezcla de reacción cualquier otro rNTP (ribonucleósido trifosfato) o dNTP (desoxirribonucleósido trifosfato) adecuado o cualquier mezcla de éstos. También es posible la adición de pirofosfato u otro polifosfato o una molécula que contiene un grupo fosfoanhídrido (POP). Además de ello, se puede añadir cualquier mezcla de cualquiera de los compuestos antes mencionados. Además de ello, se describe para algunas enzimas difosfomevalonato descarboxilasa que requieren cationes divalentes. Por lo tanto, en una realización preferida, y si es necesario, se añade una cantidad adecuada de un catión divalente adecuado a la reacción cuando se lleva a cabo el método de acuerdo con la invención. El catión divalente es preferiblemente Mg2+, Mn2+ o Co2+, pero es posible utilizar también otros cationes divalentes tales como Ca2+. Por supuesto, la naturaleza del catión divalente depende de la necesidad de la enzima difosfomevalonato descarboxilasa en cuestión. Dado que el sustrato mevalonato es, en general, más corto que el sustrato natural utilizado por la enzima, mevalonato difosfato utilizado por difosfomevalonato descarboxilasa, puede ser ventajoso añadir a la mezcla de reacción un cofactor que permita una complementación estérica y/o electrónica en el sitio catalítico de la enzima. Ejemplos de un cofactor de este tipo de difosfomevalonato descarboxilasa, serían fosfono-fosfato o fosfonamidofosfato (véase la Figura 7) u ortofosfato.

Para llevar a cabo el procedimiento in vivo se hace uso de un organismo/microorganismo(s) adecuado que sea/sean capaces de proporcionar el sustrato mevalonato, y una difosfomevalonato descarboxilasa. Hay dos vías alternativas que conducen a pirofosfato de isoprenilo. Una de ellas es la vía del mevalonato, observada en eucariotas y algunos procariotas, especialmente en el filo firmicutes. Así, todos estos organismos producen mevalonato. La mayoría de las bacterias, incluyendo E. coli, utilizan la otra vía (vía DXP) y, por lo tanto, no están produciendo mevalonato. Sin embargo, este último puede ser modificado genéticamente para producir mevalonato. Por ejemplo, la implementación de la vía del mevalonato en E. coli ya ha sido realizada con éxito (Maury et al., FEBS Lett. 582 (2008), 4032). La sobre-expresión de sólo la parte de aguas arriba (tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa) en organismos que tienen o que no tienen la vía del mevalonato permite la producción de altos niveles de mevalonato.

En una realización preferida, el organismo empleado en el método de acuerdo con la invención es un organismo, preferiblemente un microorganismo, que ha sido modificado genéticamente para que contenga una molécula de ácido nucleico extraño que codifica una difosfomevalonato descarboxilasa. El término "extraña" en este contexto significa que la molécula de ácido nucleico no se produce de forma natural en dicho organismo/microorganismo. Esto significa que no se produce en la misma estructura o en el mismo lugar en el organismo/microorganismo. En una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico extraño es una molécula recombinante que comprende un promotor y una secuencia codificadora que codifica la difosfomevalonato descarboxilasa, en que el promotor que impulsa la expresión de la secuencia codificadora de conducción es heterólogo con respecto a la secuencia codificadora. Heterólogo en este contexto significa que el promotor no es el promotor que impulsa de forma natural la expresión de dicha secuencia codificadora, sino que es un promotor que impulsa de forma natural la expresión de una secuencia codificadora diferente, es decir, que se deriva de otro gen, o es un promotor sintético o un promotor quimérico. Preferiblemente, el promotor es un promotor heterólogo para el organismo/microorganismo, es decir, un promotor que no se produce de forma natural en el respectivo organismo/microorganismo. Incluso más preferiblemente, el promotor es un promotor inducible. Promotores para impulsar la expresión en diferentes tipos de organismos, en particular en microorganismos, son bien conocidos por la persona experta en la técnica. En otra forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico es extraña para el organismo/microorganismo, debido a que la difosfomevalonato descarboxilasa codificada no es endógena al organismo/microorganismo, es decir, no es expresada de forma natural por el organismo/microorganismo cuando no es genéticamente modificado. En otras palabras, la difosfomevalonato descarboxilasa codificada es heteróloga con respecto al organismo/microorganismo. La molécula de ácido nucleico extraña puede estar presente en el organismo/microorganismo en forma extracromosómica, p. ej., como un plásmido, o puede estar integrada de manera estable en el cromosoma. Se prefiere una integración estable.

En una forma de realización preferida adicional, el organismo/microorganismo se caracteriza por que la expresión/actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa es mayor en el organismo/microorganismo genéticamente modificado con la molécula de ácido nucleico extraño en comparación con el correspondiente organismo/microorganismo no genéticamente modificado. Una expresión/actividad “elevada” significa que la expresión/actividad de la difosfomevalonato descarboxilasa en el microorganismo genéticamente modificado es al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 30% o 50%, incluso más preferiblemente al menos 70% o 80% y de manera particularmente preferida al menos 90% o 100% mayor que en el correspondiente organismo/microorganismo no genéticamente modificado. En formas de realización incluso más preferidas, el aumento en la expresión/actividad puede ser al menos 150%, al menos 200% o al menos 500%. La expresión expresión/actividad “elevada” también abarca la situación en la que el correspondiente organismo/microorganismo no genéticamente modificado no expresa una difosfomevalonato descarboxilasa, de manera que la correspondiente expresión/actividad en el organismo/microorganismo no genéticamente modificado es cero. Métodos para medir el nivel de expresión de una proteína dada en una célula son bien conocidos por la persona experta en la técnica. En una forma de realización, la medición del nivel de expresión se realiza mediante midiendo la cantidad de la proteína correspondiente. Métodos correspondientes son bien conocidos por la persona experta en la técnica e incluyen transferencia Western, ELISA, etc. En otra forma de realización, la medición del nivel de expresión se realiza midiendo la cantidad del ARN correspondiente. Métodos correspondientes son bien conocidos por la persona experta en la técnica e incluyen, por ejemplo, transferencia Northern. Métodos para medir la actividad enzimática de la difosfomevalonato descarboxilasa son conocidos en la técnica y ya han sido descritos anteriormente.

El término "organismo", tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, se refiere, en general, a cualquier posible tipo de organismo, en particular organismos eucariotas, organismos bacterianos y arqueas. El término incluye animales, plantas, hongos, bacterias y arqueas. El término también incluye células aisladas o agregados de células de estos organismos tal como el tejido o callos. En una forma de realización preferida, el organismo es un microorganismo. El término "microorganismo" en el contexto de la presente invención se refiere a células procariotas, en particular bacterias, así como a hongos tales como levaduras, y también a algas y arqueobacterias. En una forma de realización preferida, el microorganismo es una bacteria. En principio, se puede utilizar cualquier bacteria. Bacterias preferidas a emplear en el procedimiento de acuerdo con la invención son todas las cepas de producción clásicas para las que se han desarrollado herramientas de ingeniería. En una forma de realización particularmente preferida, la bacteria pertenece al género Escherichia o Bacillus, e incluso más preferida a la especie Escherichia coli o a la especie Bacillus subtilis. En otra forma de realización preferida, el microorganismo es un hongo. Hongos preferidos a emplear en el procedimiento de acuerdo con la invención son todas las cepas de producción clásicas para las que se han desarrollado las herramientas de ingeniería. Más preferiblemente, el hongo es una levadura, preferiblemente del género Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia o Kluyveromyces, e incluso más preferiblemente de la especie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris o de la especie Kluyveromyces lactis. Otros hongos preferidos son los del género Trichoderma o Aspergillus, más preferiblemente de la especie Trichoderma reesei o Aspergillus niger. Todavía en otra forma de realización preferida, el microorganismo es un microorganismo fotosintéticamente activo tal como bacterias que son capaces de llevar a cabo la fotosíntesis o micro-algas. En una forma de realización particularmente preferida, el microorganismo es un alga, más preferiblemente un alga que pertenece a la diatomeas.

Cuando el procedimiento de acuerdo con la invención se lleva a cabo in vivo o utilizando un

organismo/microorganismo que proporciona la actividad de difosfomevalonato descarboxilasa, el organismo, preferiblemente microorganismo, se cultiva bajo condiciones de cultivo adecuadas que permitan la aparición de la reacción enzimática. Las condiciones de cultivo específicas dependen del organismo/microorganismo específico empleado, pero son bien conocidas por la persona experta en la técnica. Las condiciones de cultivo se eligen generalmente de manera que permiten la expresión de los genes que codifican las enzimas para la reacción respectiva. Diversos métodos son conocidos por la persona experta en la técnica a fin de mejorar y perfeccionar la expresión de determinados genes en determinadas etapas del cultivo, tales como la inducción de la expresión génica por inductores químicos o por un cambio de temperatura.

En otra forma de realización preferida, el organismo empleado en el método de acuerdo con la invención es una planta. En principio, se puede utilizar cualquier planta posible, es decir, una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea. Es preferible utilizar una planta que se pueda cultivar en a escala agrícola significativa y que permita producir grandes cantidades de biomasa. Ejemplos son hierbas tales como Lolium, cereales tales como centeno, trigo, cebada, avena, mijo, maíz, otras plantas que almacenan almidón tales como patata o plantas que almacenan azúcar tales como la caña de azúcar o remolacha azucarera. También es concebible el uso de tabaco o de plantas de hortalizas tales como tomate, pimiento, pepino, berenjena, etc. Otra posibilidad es el uso de plantas oleaginosas tal como semillas de colza, aceitunas, etc. También es concebible el uso de árboles, en particular árboles de rápido crecimiento tal como el eucalipto, el álamo o el árbol del caucho (Hevea brasiliensis).

También se describe el uso de un organismo, preferiblemente un microorganismo, que expresa una enzima que es capaz de catalizar la descarboxilación de mevalonato, preferiblemente una enzima con la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa, para la producción de isoprenol por la descarboxilación de mevalonato. Es decir, también se describe el uso de un organismo/microorganismo tal como se describe en el contexto del método para la producción de isoprenol.

Además de ello, también se describe una composición que comprende (i) mevalonato; y (ii) una enzima que es capaz de catalizar la descarboxilación de mevalonato. Para las formas de realización preferidas de la enzima se aplica lo mismo a lo ya expuesto anteriormente. De manera particularmente preferida, la composición comprende también un co-sustrato (tal como ATP), un co-factor y/o cationes divalentes (tales como Mn2+, Mg2+, Co2+ o Ca2+).

Además de ello, la presente invención también se refiere al uso de una difosfomevalonato descarboxilasa para la producción de isoprenol. Para las formas de realización preferidas de la enzima se aplica lo mismo a lo ya expuesto anteriormente en relación con el método de acuerdo con la invención.

También se describe el uso de mevalonato para la producción de isoprenol, en particular, por la conversión enzimática de la mevalonato en isoprenol mediante una etapa de descarboxilación. Preferiblemente, la conversión enzimática se logra mediante una enzima como se describe anteriormente, más preferiblemente con una enzima que tiene la actividad enzimática de una difosfomevalonato descarboxilasa, y lo más preferiblemente la conversión se logra mediante el uso de un organismo tal como se describe en el contexto del método.

Además, la presente invención también se refiere a un método para la producción de isopreno a partir de mevalonato, que comprende el método para producir isoprenol de acuerdo con la invención según se describe arriba y que comprende, además, la etapa de convertir el isoprenol producido en isopreno. La conversión de isoprenol en isopreno puede lograrse por medios y métodos conocidos por la persona experta en la técnica. En particular, la reacción respectiva es una reacción de deshidratación.

Además de ello, la presente invención también se refiere a un método para producir alcohol isoamílico a partir de mevalonato que comprende el método para producir isoprenol de acuerdo con la invención tal como se describe arriba y que comprende, además, la etapa de convertir el isoprenol producido en alcohol isoamílico. La conversión de isoprenol en alcohol isoamílico se puede lograr por medios y métodos conocidos por la persona experta en la técnica. En particular, la reacción respectiva es una reacción de hidrogenación.

Figura 1: muestra la estructura química de mevalonato

Figura 2: muestra la reacción de difosfomevalonato descarboxilasa en el sustrato fisiológico y en el precursor mevalonato

Figura 3: muestra un ejemplo de rastreo de un banco de enzimas para la actividad de la mevalonato descarboxilasa tras la producción de fosfato inorgánico. La reacción de control se llevó a cabo con extracto de BL21 (DE3) de E. coli transformada con pET 22b que carece del gen MDP descarboxilasa.

Figura 4: (a) muestra los resultados de la optimización de la expresión de MDP descarboxilasa de P. torridus en E. coli. El análisis de SDS-PAGE de muestras de proteínas obtenidas a partir de la expresión de la secuencia de ADN de MDP descarboxilasa de P. torridus (pistas 1 a 3) y del gen optimizado (pistas 4 a 6).

(b) muestra la actividad de la descarboxilación de mevalonato de lisado bruto de E. coli, obtenida a partir de la expresión de la secuencia de ADN de MDP descarboxilasa de P. torridus y del gen optimizado. La reacción de control se llevó a cabo con el extracto de BL21 (DE3) de E. coli transformado con pET 22b que carecen del gen MDP descarboxilasa. La actividad enzimática se detectó a través de la medición de la producción de fosfato inorgánico.

Figura 5: muestra la comparación de la actividad de la descarboxilación de mevalonato entre MDP descarboxilasas del filo Picrophilus/Thermoplasma. La actividad enzimática se detectó mediante la medición de la producción de fosfato inorgánico.

Figura 6: muestra la formación de producto en función de la concentración de mevalonato. La formación de producto fue seguido por el ensayo de permanganato.

Figura 7: muestra la estructura de fosfono-fosfato y fosfonamido-fosfato.

Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención.

Ejemplo 1: Rastreo de un banco de MDP descarboxilasa para la actividad de descarboxilación de mevalonato

Se construyó un banco de 63 genes que codifican enzimas de la familia de la MDP descarboxilasa y se ensayó en cuanto a la actividad de mevalonato como sustrato.

Clonación, cultivos bacterianos y expresión de proteínas

Los genes que codifican mevalonato difosfato (MDP) descarboxilasa EC 4.1.1.33 se clonaron en el vector pET 25b (Novagen) en el caso de genes eucariotas y en pET 22b (Novagen) en el caso de genes procariotas. Se insertó un tramo de 6 codones de histidina después del codón de iniciación de metionina para proporcionar una etiqueta de afinidad para la purificación. Células competentes de BL21 (DE3) de E. coli (Novagen) se transformaron con estos vectores de acuerdo con el proceso de choque de calor. Las células transformadas se hicieron crecer con agitación (160 rpm) a 30ºC en medio de caldo terrific (TB) que contenía sorbitol 0,5 M, betaína 5 mM, 100 µg/ml de ampicilina hasta alcanzar una DO a 600 nm comprendida entre 0,8 y 1. A continuación se añadió isopropil-B-Dtiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y la expresión de proteínas se continuó a 20ºC durante una noche (aproximadamente 16 h). Las células se recogieron por centrifugación a 4ºC, 10.000 rpm durante 20 min y los sedimentos se congelaron a -80ºC.

Lisis celular

Los sedimentos a partir de 12 ml de células de cultivo se descongelaron en hielo y se resuspendieron en 1 ml de Tris/HCl 50 mM pH 7,4, que contenía KCl 20 mM, DTT 0,5 mM, MgCl2 5 mM. Se añadió un microlitro de lysonase (Novagen). Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se devolvieron al hielo durante 20 minutos. La lisis celular se completó mediante tratamiento por ultrasonidos durante 15 segundos. Los extractos bacterianos se clarificaron luego mediante centrifugación a 4ºC, 10.000 rpm durante 20 min.

Reacciones enzimáticas

La reacción enzimática deseada (conversión de mevalonato en isoprenol) se ensayó como sigue. El medio de reacción contenía mevalonato 100 mM, ATP 40 mM, MgCl2 10 mM, KCl 20 mM, DTT 0,5 mM y preparación enzimática que varía entre 0,01 y 0,05 mg/ml de proteína. Se utilizó citrato de sodio 50 mM en el intervalo de pH de 4 a 6 y Tris-HCl 50 mM para pH 7 y 7,5. Se llevaron a cabo en paralelo ensayos de control libres de enzimas. Después de 72 h de incubación, el fosfato inorgánico se cuantificó por colorimetría de acuerdo con el método de molibdato de amonio (Gawronski JD, Benson DR, Anal. Biochem. 327 (2004) 114-118). Una muestra de 50 µl (que no contiene más de 0,5 µmol de fosfato) se mezcló con 150 µl de reactivo molibdato de amonio que contiene 50% v / v de acetona, H2SO4 1,25 N, (NH4)5Mo7O24 2,5 mM y luego con 10 µl de ácido cítrico 1 M. La mezcla se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia de fosfomolibdato de amonio formado se midió a 355 nm y la cantidad de fosfato inorgánico se estimó utilizando una curva de calibración obtenida con fosfato de potasio. Los resultados se muestran en la Figura 3. Durante el rastreo inicial, sólo los ensayos que utilizan la cepa recombinante que expresa la construcción genética inferida de la secuencia de MDP descarboxilasa de Picrophilus torridus dieron lugar a un aumento reproducible en la producción de fosfato sobre el nivel de fondo.

Ejemplo 2: Optimización de la expresión de MDP descarboxilasa de P. torridus en E. coli (no de acuerdo con la invención)

El nivel inicial de expresión de la enzima en BL21 de E. coli era bajo, como se juzga a partir de la débil banda visible en geles de SDS-PAGE. El Índice de Optimización de Codones (CAI – siglas en inglés) de la secuencia nativa para la expresión en E. coli medidos con el programa "Optimizer", disponible en http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/, basado en el método de Sharp y Li (Nucl . Acids Res. 15 (1987), 1281 -1295) dio un valor tan bajo como 0,23. Se generó una secuencia de gen que codifica una proteína idéntica, pero que contienen codones mejor adaptados para la expresión en E. coli. Contaba con un CAI de 0,77. La secuencia nativa y la secuencia optimizada se muestran en SEQ ID NO: 20 (secuencia nativa de MDP descarboxilasa de P. torridus (AAT43941) que incluye la etiqueta His) y SEQ ID NO: 21 (secuencia optimizada de MDP descarboxilasa de P. torridus (AAT43941) que incluye la etiqueta His). La secuencia optimizada se sintetizó por concatenación de oligonucleótidos y se clonó en un vector de expresión pET25b. Después de la transformación de la cepa BL21 (DE3) de E. coli y de la inducción, las proteínas se produjeron y analizaron en un gel tal como se describe de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El mismo protocolo se llevó a cabo con la secuencia nativa para comparación. Se compararon los niveles de expresión utilizando la secuencia de nucleótidos nativa o la secuencia optimizada para la expresión en E. coli. Los resultados en la Figura 4a demuestran que la proteína (flecha) correspondiente al gen optimizado era claramente visible en el gel en el lisado de células no-purificado (pista 4), lo que indica un aumento muy notable en la expresión. La expresión de la proteína se mejoró de manera que el lisado bruto obtenido con la secuencia optimizada contenía una actividad enzimática más alta con mevalonato como sustrato tal como se muestra en la Figura 4b.

Ejemplo 3: Caracterización de la Reacción utilizando la MDP descarboxilasa de P torridus optimizada

La enzima recombinante se purificó como sigue:

Purificación y concentración de proteínas

Los sedimentos procedentes de 150 ml de células de cultivo se descongelaron en hielo y se resuspendieron en 5 ml de Na2HPO4 pH 8 que contenía NaCl 300 mM, MgCl2 5 mM y DTT 1 mM. Se añadieron veinte microlitros de lysonase (Novagen). Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se devolvieron a hielo durante 20 minutos. La lisis celular se completó mediante tratamiento por ultrasonidos durante 3 x 15 segundos. Los extractos bacterianos se clarificaron luego mediante centrifugación a 4ºC, 10.000 rpm durante 20 min. Los lisados bacterianos clarificados se cargaron en una columna de Ni-IDA PROTINO-1000 (Macherey-Nagel), permitiendo la adsorción de proteínas etiquetadas con 6-His. Las columnas se lavaron y las enzimas de interés se eluyeron con 4 ml de Na2HPO4 50 mM pH 8 que contenía NaCl 300 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, imidazol 250 mM. Los productos eluidos se concentraron y se desalaron en una unidad de filtro Amicon Ultra-4 de 10 kDa (Millipore) y se resuspendieron en 250 µl de Tris-HCl 50 M pH 7,4 que contenía DTT 0,5 mM y MgCl2 5 mM. Las concentraciones de proteína se cuantificaron de acuerdo con el método de Bradford. La pureza de las proteínas, así purificadas, se estimó como de aproximadamente 90%. La actividad de la enzima se confirmó y se analizó adicionalmente utilizando un sustrato gama: se demostró que la tasa de conversión aumentaba con la concentración de mevalonato (Figura 6).

Ejemplo 4: Optimización de las condiciones de reacción mediante el uso de un co-factor

Se llevó a cabo la misma reacción que la descrita en el Ejemplo 1 utilizando preparaciones purificadas de MDP descarboxilasa de P. torridus optimizadas. En una de las muestras, el fosfono-fosfato o fosfonamido-fosfato (Figura 7) se añade como cofactor a una concentración de 100 mM. La conversión de mevalonato se observa utilizando el ensayo colorimétrico descrito en el Ejemplo 1. Se ha encontrado que cuando está presente un cofactor, la cantidad de ATP consumida en el tiempo es notablemente mayor.

Ejemplo 5: Rastreo de un banco de homólogos de MDP descarboxilasa del filo de P. torridus

La secuencia de enzimas MDP descarboxilasa inferidas de los genomas de Thermoplasma volcanium (número de acceso Q97BY2) y Thermoplasma acidophilum (número de acceso Q9HIN 1) se generó como en el Ejemplo 1. Las proteínas se purificaron como se describe en el Ejemplo 3 y se sometieron a ensayo utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. Se observó un aumento significativo en la producción de fosfato a partir de estos viales, lo que indica que estas enzimas también eran activas hacia mevalonato. Los resultados se muestran en la Figura 5.

Ejemplo 6: Método para sintetizar isoprenol a partir de glucosa

K12 de E. coli se transformó con un plásmido de expresión que porta los genes de tiolasa, HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa a partir de Saccharomyces cerevisiae con el fin de sobreproducir mevalonato. La cepa se transforma adicionalmente con un segundo plásmido de expresión compatible portador del gen optimizado que codifica la versión etiquetada con His de MDP descarboxilasa procedente de Picrophilus torridus. Las bacterias recombinantes resultantes se incuban entonces en un fermentador en un medio de nutrientes minerales que contiene glucosa, en presencia de oxígeno y bajo agitación moderada. Se mide una producción significativa de isoprenol utilizando la TLC (siglas inglesas de cromatografía en capa fina) o análisis de GC/MS como sigue:

Análisis por TLC

Para el análisis de TLC de una parte alícuota de medio de reacción se esparce sobre una placa recubierto de sílice y se cromatografía utilizando como eluyente acetato de etilo/heptano 1/1 v/v Como patrones internos se utilizan mevalonato, isoprenol, ATP, ADP. Después del secado, las placas se pulverizan con reactivo de KMnO4 alcalino. Se encuentra que el Rf para isoprenol es 0,57.

Análisis GC / MS

Se centrifuga una parte alícuota de 10 µl de medio de reacción y el sobrenadante se transfiere a un vial limpio para la detección de isoprenol por GC/MS. Una muestra de 1 µL se separa por GC utilizando una columna DB-5 y la presencia de isoprenol se controla mediante espectrometría de masas.

Ejemplo 7: Medición de la actividad mevalonato descarboxilasa y producción de 3-metil-buten-1-ol (isoprenol) (no de acuerdo con la invención)

El mevalonato se prepara a partir de mevanolactona (Sigma) mediante hidrólisis con NaOH de acuerdo con Campos et al. (Biochem. J. 2001, 353, 59-67). El ensayo completo para la descarboxilación de mevalonato contiene tampón de reacción, mevalonato 100 mM, ATP 40 mM, MgCl2 10 Mm, KCl 20 mM, DTT 0,5 mM y preparación enzimática a una concentración que oscila entre 0,01 y 0,05 mg/ml de proteína. Citrato de sodio 50 mM se utiliza en el intervalo de pH de 4 a 6, y Tris-HCl 50 mM para pH 7 y 7,5. Las reacciones de control se llevan a cabo en ausencia de enzima, sustrato o cofactor. El progreso de la producción isoprenol es seguido por el análisis de partes alícuotas tomadas a intervalos de tiempo sucesivos a partir de una mezcla de reacción incubada a 37ºC mediante cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) y la determinación del producto mediante ensayo del permanganato. En paralelo, la liberación de fosfato inorgánico se cuantifica por el método de molibdato de amonio.

Ensayo de permanganato

La formación de productos que contienen dobles enlaces es seguida de oxidación con disolución de permanganato de potasio alcalino, dando como resultado un aumento de la absorbancia a 420 nm. A una parte alícuota de la mezcla de reacción diluida con H2O a 120 µl, se añaden 80 µl de reactivo de permanganato que contiene KMnO4 5 mM y NaOH 50 mM. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante 20 min y se mide la absorbancia a 420 nm. La curva de calibración se prepara utilizando isoprenol comercial.

Cuantificación de fosfato inorgánico

La concentración de fosfato inorgánico se mide por colorimetría espectroscópica de acuerdo con el método de molibdato de amonio (Gawronski JD, Benson DR, Anal. Biochem. 327 (2004) 114-118). Un parte alícuota de 50 µl procedente del ensayo de reacción (que no contiene más de 0,5 µmol de fosfato) se mezcla con 150 µl de reactivo de molibdato de amonio, que contiene 50% en volumen de acetona, H2SO4 1,25 N, (NH4)6Mo7O24 2,5 mM y luego con 10 µl de ácido cítrico 1 M. La mezcla se incuba a continuación durante 2 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia de fosfomolibdato de amonio formado se midió a 355 nm y la cantidad de fosfato inorgánico se estimó utilizando una curva de calibración obtenida con fosfato de potasio.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110>: Marliere, Philippe

5: <120> Método para la producción de isoprenol utilizando mevalonato como un sustrato

<130>: R1062 PCT S3

10: <160><170> 21 PatentIn versión 3.5

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un método para la producción de isoprenol, caracterizado por que comprende la etapa de convertir mevalonato con una enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa (EC 4.1.1.33) en isoprenol.
2.

El método de la reivindicación 1, en el que la enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 1 a 16, o es una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 1 a 16, y que muestra la actividad enzimática de una difosfomevalonato descarboxilasa.
3.

El método de la reivindicación 2, en el que la enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 16, 17, 18 ó 19, o es una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 16, 17, 18 ó 19, y que muestra la actividad enzimática de una difosfomevalonato descarboxilasa.
4.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se lleva a cabo in vitro.
5.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se añade un co-sustrato.
6.

El método de la reivindicación 5, en el que el co-sustrato es ATP, un rNTP, un dNTP, un polifosfato o pirofosfato, o una mezcla de cualquiera de estos compuestos.
7.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza por que la conversión enzimática se realiza por un organismo que expresa una enzima, que es capaz de catalizar la descarboxilación de mevalonato en isoprenol, y en el que dicha enzima es una enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa (EC 4.1.1.33).
8.

Uso de una enzima que tiene la actividad de una difosfomevalonato descarboxilasa (EC 4.1.1.33) para producir isoprenol a partir de mevalonato, mediante la descarboxilación de mevalonato.
9.

Un método para producir isopreno a partir de mevalonato, que comprende el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y que comprende, además, la etapa de convertir el isoprenol producido en isopreno.
10.

Un método para producir alcohol isoamílico a partir de mevalonato, que comprende el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y que comprende, además, la etapa de convertir el isoprenol producido en alcohol isoamílico.