KR101239666B1

KR101239666B1 - 베타 아가라아제의 대량생산방법

Info

Publication number: KR101239666B1
Application number: KR1020100104627A
Authority: KR
Inventors: 공광훈; 이대경
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-26
Filing date: 2010-10-26
Publication date: 2013-03-11
Also published as: KR20120048052A

Abstract

본 발명은 베타 아가라아제의 대량생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아가리보란스 알버스 유래의 베타 아가라아제의 대량 생산을 위해 염기 서열 일부를 변형하고, GST와 융합하여 재조합 단백질을 제조함으로써 대장균에서 대량 생산 효율을 높이고, GSH 친화력 크로마토그래피를 이용한 높은 정제도를 확보할 수 있다.

Description

베타 아가라아제의 대량생산방법{Mass production method beta agarase from Agarivorans albus}

본 발명은 베타 아가라아제의 대량생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아가리보란스 알버스 유래의 베타 아가라아제의 대량 생산을 위해 염기 서열 일부를 변형하고, GST와 융합하여 재조합 단백질을 제조함으로써 대장균에서 대량 생산 효율을 높이고, 글루타티온 친화력 크로마토그래피를 이용한 높은 정제도를 확보할 수 있는 베타 아가라아제의 대량생산방법에 관한 것이다.

해양 조류는 육상 식물의 전분이나 셀룰로오즈(cellulose)처럼 다양한 고분자 당 화합물을 형성하고 세포벽을 이루어 에너지를 저장한다. 그러나 육상 식물과는 다른 구조의 당 사슬을 이루어 한천(agar)이나 카라기난(carrageenan) 같은 황이 결합된 갈락탄(galactan)을 주로 형성한다. 이와 같은 고분자 당 화합물은 겔(gel)을 형성하는 성질을 갖고 있어서, 연구소와 산업적으로 주로 이용되고 특히 세포 배양을 위한 고체 평판 배지, 뉴클레오티드(nucleotide)의 전기영동, 젤리와 아이스크림 및 다이어트 식품 등의 식품공업에 사용된다.

우뭇가사리와 같은 홍조류의 세포벽은 주로 한천(agar)으로 구성되고 한천은 아가로오즈(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin) 으로 구성되어 있다. 그 중 아가로오즈는 3-O-linked β-D-galactopyranose와 4-O-linked 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose가 α-(1,3) 이나 β-(1,4)로 결합된 긴 사슬의 고분자 당 화합물이다.

한편 조류의 고분자 당 화합물은 해양 미생물의 결정적인 탄소 영양원으로 쓰인다. 특히 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 박테리오데테스(Bacteroidetes), 플랑크토마이세테스(Planctomycetes) 등의 해양 미생물은 고분자 당 가수분해 효소를 분비하여 해양 조류의 세포벽을 분해하여 탄소원으로 이용한다. 홍조류 바이오매스의 탄소 영양분 순환계에서는 다양한 한천분해 효소(agarase), 카라제나아제(carrageenase) 등을 생산한다. 따라서 이런 고분자 당 가수분해 분해 효소들은 식품이나 화장품 제약 등의 산업에 응용될 수 있는 가능성을 갖고 있다. 게다가 최근에는 아가로오즈 고분자 복합당을 분해하여 생산된 갈락토오즈(D-galactose) 발효를 통한 바이오알코올(bio-alcohol) 생산에 쓰이기도 한다.

최초의 한천 분해 세균은 20세기 초 해수에서 분리되었다. 그 후로 연구가 진행되면서 주로 홍조류와 관련이 있는 다양한 해양 미생물, 염분 높은 강 하구와 늪지뿐만 아니라 담수 및 심지어 토양에서 추출한 일부 미생물에서도 한천 분해 활성이 보고되었다. 이와 같은 미생물로부터 분리 추출된 한천 분해 효소는 아가로오즈의 β-(1,4) 연결 고리를 가수 분해하여 네오아가로바이오스 [O-3,6-anhydro-α-L-galactopyranosyl-(1,3)-D-galactose]를 생성하지만 알테로모나스 아가랄리티카(Alteromonas agaralytica)로부터 분리, 정제한 한천 분해 효소는 α-아가라아제의 활성을 보이는 것으로 보고되었다.

세포 밖으로 분비되는 endo-β-agarase I은 아가로오즈(agarose)를 갈락토오스(galactose) 4 분자가 중합한 형태인 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 로 분해하는 역할을 한다. 가장 대표적인 한천 분해균으로 보고된 슈도모나스알테로모나스 아트란티카(Pseudomonasalteromonas atlantica)는 endo-β-agarase I의 촉매 작용 후, 페리플라즘(periplasm)으로 분비되는 β-agarase II (혹은 neoagarotetraose hydrolase)와 네오아가로바이오스 가수분해 효소(neoagarobiose hydrolase)의 작용을 거쳐 최종적으로 3,6-anhydro-L-galactose 와 D-galactose 최종 생성물을 얻게 되고 생물체의 탄소 영양소로 쓰인다. 반면 비브리오 에스피(Vibrio sp.) 균은 아가로오즈로부터 네오아가로바이오스와 네오아가로테트라오즈(neoagrotetraose)로 각각 중간 생성물을 형성하는 두 종류의 β-agarase를 분비하고 페리플라즘에서 α-L-galactosidase의 두 중간 생성물에 대한 α-(1,3) 연결고리 가수 분해 작용을 거쳐 D-galactose를 생산하는 과정을 거친다.

아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) YKW-34는 비브리오균의 표현형을 근간으로 떨어져 나온 해양 미생물로서 홍조류의 일종인 우뭇가사리의 세포벽을 분해하는 특징을 나타낸다. 최근 아가리보란스균에 의한 아가 분해의 특징적인 현상이 보고되었다.

한천의 분해 산물인 네오아가올리고사카라이드(neoagarooligosaccharide)는 전분의 분해 속도를 늦추어 세포 성장 속도를 억제하고 심지어 항암, 항산화 효과까지 보이는 경우도 보고되었다. 뿐만 아니라 멜라노마 세포에 영향을 주어 보습 효과 등을 나타내는 것으로도 보고되었다. 따라서 이들을 활용한 제품은 부가가치가 높은 것으로 알려져 왔다. 이런 기능성 올리고당 생산을 위한 한천 분해 방법은 산 가수분해법과 한천 분해 효소를 이용한 효소 분해법이 있으며 산 가수분해법은 생산된 올리고당의 안정성에 문제가 있는 것으로 알려져 있다. 한천은 40℃ 이상의 온도에서 액체 상태를 유지하므로 40℃ 에서 열 안정성을 갖는 한천 분해 효소의 개발은 필수적이다. 또한 한천 분해 과정을 거쳐 생산된 단당류를 발효시킨 후 바이오 알코올을 생산하는 바이오에너지 등의 산업 분야에도 그 적용이 모색 중이나 열 안정성 및 pH 안정성 등의 문제로 아직 실용화 사례는 없다.

본 발명의 목적은 한천 (agar)이 고형화 되지 않는 40℃ 이상의 온도에서도 높은 활성을 유지하는 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 유래의 베타 아가라아제의 유전자 서열 일부를 변형하여 대량생산 효율을 높인 베타 아가라아제 유전자, 이로부터 코딩되는 융합단백질, 이를 포함하는 재조합 벡터, 이로부터 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 서열 일부가 변형된 베타 아가라아제의 융합단백질을 이용하여 대량생산 효율을 높이는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열목록 서열번호 1에 기재된 염기서열로 표시되는 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 베타 아가라아제 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 베타 아가라아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 또한

서열번호 1의 베타 아가라아제 유전자 및 글루타티온 전달효소(glutathione S-transferase) 유전자로부터 코딩되는 융합 단백질을 발현하는 형질전환체를 배양하는 단계; 및

글루타티온 친화력 크로마토그래피를 통해 상기 융합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 베타 아가라아제의 대량생산방법을 제공한다.

본 발명은 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus)의 베타 아가라아제의 염기서열 일부를 변형하고, GST 유전자의 융합 단백질을 제조함과 더불어 글루타티온 친화력 크로마토그래피를 통해 정제도를 높임으로써 대량생산 효율을 높이는 효과가 있다.

도 1a 및 1b는 본 발명의 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus)의 베타 아가라아제의 대량생산을 위한 재조합 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 pKG-AaAgaB 발현 플라스미드 작제물을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 재조합 벡터 pKG-AaAgaB를 아가로스 겔을 통해 확인한 결과로, M (λDNA/HindIII)은 사이즈 마커, 레인 1과 2는 pKG-AaAgaB 플라스미드, 레인 3과 4는 pKG-AaAgaB 플라스미드를 제한효소 HindIII 및 BamHI으로 절단한 결과로 상단 밴드들은 발현벡터를 나타내며 하단 밴드는 발현벡터에 삽입이 되어있던 AaAgaB 유전자를 나타낸다.
도 4는 정제된 AaAgaB의 SDS-PAGE 결과를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 재조합 AaAgaB의 카이네틱 파라미터를 측정하기 위한 Lineweaver-Burke 곡선을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 재조합 AaAgaB의 활성에 대한 최적 pH를 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 재조합 AaAgaB의 활성에 대한 최적 온도를 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 재조합 AaAgaB의 활성에 대한 pH 안정성을 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 재조합 AaAgaB의 활성에 대한 열 안정성을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 재조합 AaAgaB의 활성에 대한 다양한 금속 및 환원제의 효과를 측정한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 서열목록 서열번호 1에 기재된 염기서열로 표시되는 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 베타 아가라아제 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 베타 아가라아제 유전자는 AaAgaB (아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 균주 유래의 한천 분해 효소)를 코딩하고 있는 AaAgaB (Genebank No. ABW77762) 유전자를 대상으로, 첫째, 기존 서열에 대하여 대장균 선호 코돈 (codon usage)을 고려하여 발현율을 높이고, 둘째, 발현 벡터의 제한효소 자리를 본 서열의 5`와 3` 부분에 도입하며, 셋째, 한가지 염기만 반복되는 폴리뉴클레오티드를 줄이도록 설계되어 합성한 것으로 재조합 유전자의 발현시스템에서 대량생산 효율을 높인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 변형 유전자 서열을 대량생산 효율을 높이되, 상기 변형 유전자 서열로부터 코딩되는 아미노산 서열은 기존 AaAgaB 유전자로부터 코딩되는 베타 아가라아제 아미노산 서열과 동일하여 베타 아가라아제 자체의 효소 활성에 영향을 미치지 않는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, PCR을 위해 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 각각의 프라이머(예를 들어, 서열번호 2 및 3)는 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) AgaB 의 염기서열을 바탕으로 5′과 3′말단 영역의 염기들과 서로 상보적으로 쌍을 이루며 대장균에서 재조합 단백질을 효과적으로 발현시키기 위해 사용되는 융합 태그(fusion tag)의 일종인 GST (glutathione S-transfersae)를 포함하고 있는 발현 벡터인, pGEX-KG에 적합한 제한효소를 찾아 말단에 각각 BamH 1과 Hind III의 제한효소 자리를 포함하도록 설계한다. 또한 대장균에서 발현율을 높이기 위해 대장균 선호 코돈을 바탕으로 치환한다. 설계한 올리고뉴클레오티드들을 합성한다. 상기 올리고뉴클레오티드를 주형으로 하여 PCR을 통해 증폭할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 베타 아가라아제 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 베타 아가라아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 대장균에서 재조합 단백질을 효과적으로 발현시키기 위해 사용되는 융합 태그(fusion tag)의 일종인 GST (glutathione S-transfersae)를 포함하고 있는 대장균 균주 발현용 벡터에 상기 서열번호 1에 기재된 염기서열을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터로 pGEX-KG를 사용하였지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 균주 발현용 벡터인 pGEX-KG 벡터를 사용하여 본 발명의 AaAgaB 유전자를 포함하는 DNA 절편을 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였으며, 이를 "pKG-AaAgaB"라 명명하였다(도 2 참조).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터로부터 발현되는 단백질은 대량생산 효율을 높이기 위해 염기서열 일부가 변형된 서열번호 1의 베타 아가라아제 유전자와 글루타티온 전달효소 유전자에 의해 코딩되는 융합 단백질 형태로, 30 내지 50 ℃ 및 pH 7.0 내지 10에서 효소 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 30 내지 40℃, pH 8.0에서 최적 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵세포, 곤충세포, 식물세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.

상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 재조합 벡터 pKG-AaAgaB 를 대장균 균주 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환체를 제조한다.

본 발명은 또한

글루타티온 친화력 크로마토그래피를 통해 상기 융합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 베타 아가라아제의 대량생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 베타 아가라아제의 대량생산방법은 본 발명의 융합 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 글루타티온 친화력 크로마토그래피를 통해 높은 정제도로 융합 단백질을 분리 정제함으로써 베타 아가라아제의 대량생산 효율을 높이는 것을 특징으로 한다.

상기 융합 단백질은 본 발명의 서열번호 1의 베타 아가라아제 유전자 및 글루타티온 전달효소(glutathione S-transferase) 유전자로부터 코딩되는 단백질로서, 공지의 형질전환법을 통해 융합 단백질을 발현하는 형질전환체를 제조한다.

상기 형질전환체는 통상의 배양방법을 통해 배양될 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예를 들어, 대장균 발현 배지에서 배양할 수 있다.

상기 배양된 형질전환체를 분리 정제하는 방법은 특별히 제한하는 것은 아니나, 바람직하게는 글루타티온-친화 컬럼 크로마토그래피에서 실시하는 것이 좋다.

보다 구체적으로, 배양된 형질전환체를 균질화시키고, 초음파 파쇄기를 통해 세포막을 파괴한 다음, 원심분리를 통해 세포 불순물을 제거하고, 상층액을 KPB (pH 7.0)로 평형시킨 GSH-agarose 4B 친화 컬럼 크로마토그래피에 1 ㎖/min의 속도로 흘려주어 흡착시키며, 이때 크로마토그래피의 수율을 높이기 위해 흡착시킨 후의 여액을 받아 280 nm의 측정하여 그 값이 일정할 때까지 반복 흡착할 수 있다. 크로마토그래피에 흡착된 효소는 글루타티온 함유 용출용매를 사용하여 용출시켜 높은 정제도로 본 발명의 융합 단백질을 얻을 수 있다.

상기 융합 단백질은 베타 아가라아제의 효소 활성보다는 글루타티온 전달효소의 활성이 우세하므로 트롬빈과 반응시켜 융합 단백질로부터 글루타티온 전달효소를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 정제된 융합 단백질을 Tris-HCl 용매에서 투석시킨 후 트롬빈을 첨가하여 실온에서 반응시키고, 글루타티온-아가로즈 4B 컬럼에 흘려준 후 KPB로 용출시켜 글루타티온 전달효소가 제거된 베타 아가라아제를 얻을 수 있다.

융합 단백질로부터 글루타티온 전달효소가 제거된 베타 아가라아제는 기존 베타 아가라아제 수준의 효소 활성을 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<예비실험예 1> 기기, 시약, 균주 및 발현벡터

Polymerase Chain Reaction (PCR) 기기는 Thermo (Waltham, USA)사의 PCR Sprint를 이용하였고, DNA용 전기영동 장치는 Cosmo Bio co., Ltd. (Tokyo, Japan)의 Mupid-21을 사용하였다. 균을 다루기 위한 무균 작업대는 비전 Biotech. (Inchon, Korea)사의 클린 벤취를 이용하였다. 균 배양을 위해 Vision Scientific (Gyeonggi, Korea)사의 진탕 배양기를 이용하였고, 균체를 집균하기 위한 원심분리기는 한일사의 HMVC-250Ⅳ와 Micro-17R (Seoul, Korea)을 이용하였다. 균체를 분쇄하기 위한 초음파 파쇄기(sonicator)는 Sonics & Materials사의 VCX 400 (Danbury, USA)을 사용하였고, 볼텍스 믹서는 Vision Scientific (Gyeonggi, Korea)사의 KMC-1300V를 이용하였다. pH 미터는 EcoMet사의 pH/mv/TEMP Meter P25 (Waltham, USA)를 사용하였고, 기질과의 특성과 활성조사를 위해서 Hitachi사 (Tokyo, Japan) U-2000 UV/VIS 스펙트로포토미터를 이용하였다. 유전자 합성은 Genescript (USA) 에 의뢰하였다.

한천 분해 효소 (β-agarase)의 기질로 사용된 한천, 셀룰로오즈, 전분과 GST 활성에 이용된 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(1-chloro-2,4-dinitrobenzene, CDNB), 글루타티온 (GSH)은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) 제품을 사용하였다. PCR 작업을 위한 Ex-Taq 폴리머라아제와 DNA 라이게이션 용액, DNA 작업을 위한 T4 DNA 리가아제, 제한효소 BamH I과 Hind III, DNA 마커는 TaKaRa (Shiga, Japan) 제품을 사용하였고 올리고뉴클레오티드 합성과 유전자 서열 분석은 제노텍 (Xenotech) (Taejeon, Korea)에 의뢰하였다. 균주 배양을 위한 마린 브로스(Marine broth), 박토 트립톤(bacto tryptone), 박토 아가 효모 추출물(bacto agar yeast extract)는 Difco laboratories (Detroit, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 그 외 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), ,N,N,N',N‘-tetramethyl -ethylenediamine (TEMED), 소듐 라우릴 설페이트(SDS), trizma^?Base, 글리세롤, 카나마이신 모노설페이트는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) 제품을, 아크릴 아미드와 단백질 분석 시약은 Bio-Rad사 (Hercules, USA)의 제품을, 단백질 완전 마커(perfect protein marker)는 Novagen (Darmstadt, Germany) 제품을, DNA 정제를 위한 Wizard^?Plus SV Minipreps DNA 정제 키트는 Promega (Madison, USA) 제품을 사용하였다. 제1인산칼륨, 제2인산칼륨은 Kanto Chemical Co. (Tokyo, Japan) 제품을, 글루타티온 아가로스 4B는 엘피스 바이오텍 (Elpis Biotech) (Taejeon, Korea) 제품을, 부탄올, 염화 나트륨, 아세트산은 Duksan Pure Chemical Co. (Kyonggi, Korea) 제품을, 염화 칼륨, 글리신은 Daejung (Incheon, Korea) 제품을 사용하였다. QIAquick™ gel extraction kit 과 RNeasy^?plant mini kit 은 Qiagen (Hombrechtikon, Switzerland) 제품을 사용하였다. 융합 단백질(fusion protein)의 절단에 필요한 트롬빈(thrombin)은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) 제품을 사용하였다. 그 외 완충용액을 만들기 위한 시약과 사용한 모든 시약은 일급 및 특급 시약을 정제하여 사용하였다.

아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 균주는 생물자원센터 (Daejon, Korea)에서 분양받았으며, 대장균에서 재조합 단백질을 효과적으로 발현시키기 위해 사용되는 융합 태그(fusion tag)의 일종인 GST (glutathione S-transfersae)를 포함하고 있는 발현 벡터 pGEX-KG는 Ge-Health-Care (Milton keynes, UK)으로부터 구입하였고, 형질전환을 위한 숙주인 E. coli DH5α와 BL21(DE3)는 Pharmacial Biotech (Uppsala, Sweden)으로부터 구입하여 사용하였다.

<실시예 1> 대량생산을 위한 재조합 발현벡터 pKG-AaAgaB의 설계

AaAgaB (아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 균주 유래의 한천 분해 효소)를 암호하고 있는 AaAgaB (Genebank No. ABW77762) 유전자를 Genescript 사에 의뢰하여 합성하기 위해 크게 3 가지를 고려하였다. 첫째로 기존 서열에 대하여 대장균 선호 코돈 (codon usage)을 고려하여 발현율이 높아지도록 설계하였고, 둘째로 발현 벡터의 제한 효소 자리를 본 서열의 5`와 3` 부분에 도입하였으며, 셋째로 한 가지 염기만 반복되는 폴리뉴클레오티드를 줄이도록 설계하여 도 1a 및 1b에 나타내었다.

구체적으로 설명하면 다음과 같다. PCR을 위해 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. 각각의 프라이머는 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) AgaB 의 염기서열을 바탕으로 5′과 3′말단 영역의 염기들과 서로 상보적으로 쌍을 이루며 pGEX-KG에 적합한 제한효소를 찾아 말단에 각각 BamH 1과 Hind III의 제한효소 자리를 포함하도록 설계하였다. 또한 대장균에서 발현율을 높이기 위해 대장균 선호 코돈을 바탕으로 치환하였다. 설계한 올리고뉴클레오티드들은 GenoTech Co (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였다 (표 1).

PCR 반응은 합성한 주형 유전자 (Agarivorans albus DNA) 2 ㎕, 각 최종 농도 0.4 mM의 dNTP 혼합물 (TaKaRa), 0.2 μM의 합성한 프라이머, 10×Ex-Taq 완충용액 5 ㎕, Ex-Taq^?폴리머라아제 (TaKaRa) 0.5 ㎕, 0.2 mM MgCl₂를 포함하는 최종부피 50 ㎕를 반응액으로 하여 시행하였다. PCR 반응 조건은 먼저 이중사슬로 되어 있는 주형 DNA를 94℃에서 60초 동안 열 변성(denaturing) 시킨 후, 54℃에서 40초 동안 어닐링시켰다. 그런 후 폴리머라아제에 의한 유전자 합성은 72℃에서 90초 동안 실시하였다. 이 조건을 1 사이클로 하고, 이것을 반복하여 36 사이클 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1.0% 아가로스 겔 전기영동에 의해 증폭된 생성물을 확인하였다. 증폭된 DNA를 오려 내어 Takara Power gel extraction kit을 이용하여 추출하였다.

증폭된 유전자와 pGEX-KG는 재조합 플라스미드 제작을 위해 동일한 제한효소 BamH 1 과 Hind III 를 사용해 37℃에서 60분 동안 처리한 뒤, 94℃ 15분간 제한효소 실활 처리한 후, Takara Power gel extraction kit을 이용하여 추출하였다.

정제된 AgaB유전자와 pGEX-KG에 대해 T4 DNA 리가아제 (Shiga, Takara)를 사용하여 1:3의 몰 비율이 되도록 주입하여16℃에서 24시간 반응시켰다. 라이게이션 결과, 생성된 pKG-AaAgaB(도 2)를 50 mM CaCl₂로 컴피턴트(competent)화 한 DH5α에 형질전환 하였다. 형질전환은 다음과 같이 실시하였다.

라이게이션 시료 10 ㎕를 DH5α 컴피턴트 세포에 혼합한 후, 42℃에서 1분간 열 충격(heat shock)을 가해 세포막에 붙어 있던 유전자 pKG-AaAgaB가 DH5α의 세포 내로 들어가게 하였다.

이렇게 형질전환 한 시료를 항생제 선택법 (antibiotic selection)에 의해 pKG-AaAgaB/DH5α만 분리해 내기 위해서 50 ㎍/㎖의 암피실린, 50 ㎍/㎖의 클로람페니콜이 포함된 LB-아가 플레이트에서 12시간 배양하였다. 이때 자란 콜로니를 액체 LB 배지에 배양하고, Takara plasmid mini prep kit을 이용해 pKG-ApAAT 플라스미드 유전자를 분리하였다. 이 유전자를 BamH 1 과 Hind III 로 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동으로 AaAgaB 유전자를 확인하였다.

1.0% 아가로스 겔 전기영동 확인 결과 도 3과 같이 발현벡터 pGEX-KG는 약 5000 bp에서, AaAgaB 유전자는 약 1362 bp에서 각각의 띠를 확인하였다.

확인된 유전자는 대량발현을 위해 발현용 숙주 BL(DE3)에 다시 형질전환 하였다. 형질전환 여부를 알아보기 위하여 클로닝 단계와 같은 방법을 이용하였으며, 확인 후 정확하게 형질전환되어진 콜로니를 이용하여 대량발현에 이용하였다.

pKG-AaAgaB/BL21(DE3)의 대량 발현을 위해, 암피실린 (50 ㎍/㎖)이 포함된 LB 1000 ㎖에 37℃에서 배양하였다. UV 스펙트로포토미터로 OD₆₀₀(Optical density) 값을 측정하여 0.6에 이르면, 발현유도제인 IPTG를 최종농도가 1 mM 되도록 첨가한 뒤, 8-10시간 이상을 배양하여 대량발현을 유도하였다. 대량 발현된 배양액은 냉동원심분리기를 이용하여 4℃, 8,000g, 15분간 집균하였다.

위에서 작성된 pKG-AaAgaB/BL21(DE3)를 장기 보관을 위해 액체배양한 시료를 20% 글리세롤 스톡 상태로 만들어 -70℃에 냉동 보관하였다.

모든 실험 과정은 불 주위가 무균 상태라는 가정 아래 클린 벤취에서 진행하였고, 제노텍 (Xenotech) (Taejeon, Korea) 사에 유전자 서열 분석을 의뢰하였다. 유전자 서열 분석 결과 합성한 서열과 동일함을 확인하였다(도 1).

<실시예 2> 재조합 AaAgaB의 정제

대량 발현된 융합 단백질 (GST-AaAgaB) 균체를 20 mM KPB (pH 7.0)으로 균질화시킨 뒤, 초음파 파쇄기를 이용하여 4℃, 30~40 와트, 진폭 8% (보통의 E. coli 균 파괴 조건) 조건으로 10분간 세포막을 파괴하였다. 이때의 과정은 열이 많이 발생하므로 얼음 위에서 실시하였다. 균 파쇄 후 18,000g, 20분간 (4℃) 원심 분리하여 단백질과 다른 세포 불순물들을 분리하였다. 여기서 얻은 상층액을 앞에서 사용한 20 mM KPB (pH 7.0)로 평형시킨 GSH-agarose 4B 친화 컬럼 크로마토그래피에 1 ㎖/min의 속도로 흘려주어 흡착시켜주며, 이때 크로마토그래피에 수율을 높이기 위해 흡착시킨 후의 여액을 받아 280 nm의 측정하여 그 값이 일정할 때 까지 반복 흡착하였으며, 여액에 대해 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(1-chloro-2,4-dinitrobenzene, CDNB)과 글루타티온(glutathione, GSH)으로 융합 단백질인 글루타티온 전달효소 (GST)의 활성을 측정하여 그 값이 대조군인 20 mM KPB (pH 7.0)의 값과 거의 유사하게 나오는 것을 측정하여 융합 단백질이 컬럼 크로마토그래피에 확실히 흡착하였음을 확인하였다. 컬럼 내의 불필요한 단백질을 제거하기 위해 20 mM KPB (pH 7.0) 용액으로 흘려주어 OD₂₈₀의 흡수도가 일정할 때까지 씻어주었다. 이 값을 통하여 GSH 친화력 컬럼 크로마토그래피에 더 이상의 불순물이 포함되지 않음을 확인하였다. 15 mM 글루타티온 (GSH)를 첨가한 50 mM tris-HCl (pH 8.0)을 이용해 크로마토그래피에 붙어있던 효소를 1 ㎖/min의 속도로 용출시켜 분획을 얻었다. 각 분획에 대해 융합 단백질인 글루타티온 전달효소 활성을 측정하고 활성이 높은 분획만 합하여 이후의 정제 과정 단계로 이용하였다.

정제된 효소의 순수도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며, 모든 실험은 효소의 실활과 프로테아제(protease) 활성 저해, 아가라아제 활성이 의한 아가로스 비드 파괴를 고려해 4℃에서 진행하였다. 융합단백질 AaAgaB의 정제도는 표 2에 나타내었다.

특성 조사에 사용할 분획은 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 8시간씩 3번 투석하였다. 융합 단백질(GST-AaAgaB)로부터 GST 단백질을 제거한 순수 목적 단백질만을 얻기 위해 정량한 단백질에 단백질 mg 당 10 unit의 트롬빈(thrombin)을 첨가하여 25℃에서 16시간 동안 반응(incubation)시켰다. 이때 200 rpm 정도로 흔들어 줌으로써 골고루 반응이 일어날 수 있도록 하였다. 위의 반응물을 GSH-agarose 4B 컬럼에 흘려준 후 20 mM KPB (pH 7.0)로 흘려주면서 1분 간격으로 분획을 받아 목적 단백질(target protein)이 컬럼에 흡착하지 않고 완충 용액과 함께 나오는 것을 OD₂₈₀값을 통해 확인하였다.

단백질 정량은 Bradford (1976) 방법에 따라 보바인 씨럼 알부민(bovine serum albumin)을 표준단백질로 사용하여 595 nm에서 측정하였으며, 표준 곡선을 작성한 뒤, 단백질 농도를 측정하였다. Bio-Rad사의 단백질 정량 시약과 정제된 효소를 상온에서 10분간 반응시킨 후, OD 595 nm의 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 결정하였다.

조효소액(crude Extracts)과 GST 융합 단백질에 대한 아가라아제 비활성도(specific activity)는 낮게 나온 반면 GST를 절단 후 아가라아제 비활성도는 조효소액 대비 약 1,858배, 융합 단백질 대비 약 116배 높게 측정되었다. 그러나 이 값은 조효소액과 융합 단백질의 아가라아제 활성이 낮게 나타나 정제도 값으로 부족한 점이 있으므로, GST 비활성도 값을 보충하고 정제도를 확인하여 표 3에 나타내었다.

정제된 효소는 SDS-PAGE를 통해 순수도를 확인하였다. SDS-PAGE는 Laemmli (1970) 방법에 따라 12.5%의 겔(gel)을 만들어 사용하였다. 영동이 끝난 겔은 coomassie brilliant blue R-250을 사용하여 염색하였고, 충분한 탈색을 통해 효소의 순수도를 확인하였다. 이때 사용한 분자량 표준 단백질은 protein A (150 kDa), protein B (100 kDa), protein C (75 kDa), protein D (50 kDa), protein E (35 kDa), protein F (25 kDa), protein G (15 kDa)를 포함하고 있는 Novagen의 단백질 완전 마커(Perfect protein marker)를 사용하였다.

도 4에서 보는 바와 같이 레인 1, 2에서 세포막과 같은 불순물이 제거된 상층액을 얻어 CDNB 활성과 DNS((3,5-dinitrosalicylic acid)) 법을 이용한 한천 분해 효소 활성을 확인하였고 레인 3, 4는 침전물로 CDNB 활성과 한천 분해 효소 활성이 거의 나타나지 않았다. 레인 5는 GST-AaAgaB 융합 단백질을 얻은 것으로 GST 활성이 높게 나타난 반면 AaAgaB 활성은 낮게 나타났다. 레인 6은 트롬빈 처리 이후 GSH-agarose 친화력 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제한 것으로 50,000 Da에서 단일 띠를 확인하였고 이 띠에 해당하는 단백질 분획에 대한 한천 분해 효소 활성 측정을 통해 AaAgaB가 정제되었음을 확인하였다.

<실시예 3> 재조합 AaAgaB 활성에 대한 기질 특이성

AaAgaB의 기질 특이적인 특성을 측정하기 위해 세포를 구성하는 고분자 당 주요 성분인 셀룰로오즈 (cellulose), 한천 (agarose), 전분 (starch)의 효소 분해 반응을 통해 기질에 대한 활성을 측정하였다. 각 성분은 최종 농도 0.1 %로 30분간 42℃에서 반응 시켰고, 한천 분해 효소의 활성은 각 기질의 양을 동역학적으로 포화된 양 (50 mM)으로 하여 측정하였다. 한천을 기질로 하였을 때 상대적 활성을 100%로 보고 다른 기질의 상대 활성값을 도 5 및 표 4에 나타내었다.

그 결과, 한천을 제외한 다른 기질에 대하여 그 활성이 거의 나타나지 않음을 확인하였다.

<실시예 4> 기질 농도의 영향 (Kinetic parameter)

한천에 대한 한천 분해 효소의 카이네틱 파라미터(kinetic parameter)를 구하기 위해 기질의 농도를 변화시키면서 효소의 활성을 측정하였다. 반응은 한천을 최종 농도 0.1~50 ㎍/ml로 변화시키면서 42℃ 반응 후 DNS법을 적용하고, UV 스펙트로포토미터를 이용하여 농도 변화에 따른 활성도를 측정하였다. 그 결과를 통해 Michaelis-Menten 상수 (K _m)와 최대속도 (V _max)는 Lineweaver-Bulk plot를 통해 결정하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 재조합 AaAgaB의 아가로스에 대한 속도론적 상수는 K _m =0.97 mg/ml이며, V _max = 18.58 U/mg 이었다.

<실시예 5> 재조합 AaAgaB 활성에 대한 최적 pH

pH가 효소활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 각 pH에 해당하는 완충용액을 사용하여 활성을 측정하였다. pH 4.0~6.5 에서는 20 mM 소듐 아세테이트 완충용액을, pH 6.5~8.0 에서는 20 mM 포타슘 포스페이트 완충용액을, pH 8.0~9.5 에서는 20 mM tris-HCl 완충용액을 각각 사용하였다.

AaAgaB의 최적 활성은 pH 8.0에서 나타났으며, pH 10.0까지는 70% 정도의 활성을 나타내었다 (도 6).

<실시예 6> 재조합 AaAgaB 활성에 대한 최적 온도

20~80℃까지 각각의 다른 온도에서의 한천 분해 효소 활성을 측정하기 위해 10℃ 간격으로 변화시키면서 활성을 측정하였다. 표준 기질 용액으로는 0.1% 한천이 포함된 pH 8.0의 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액을 이용하여 각각 다른 온도에서 활성을 측정하였다.

도 7에는 가장 활성을 100%로 보았을 때 다른 온도에서의 잔존활성을 상대적으로 나타내었다. 30~40℃ 구간에서 AaAgaB의 활성이 가장 높았으며, 50℃ 에서도 효소의 활성을 60% 이상 유지하였다.

<실시예 7> 재조합 AaAgaB에 대한 pH 안정성

AaAgaB에 대한 pH 안정성을 확인하여 장기 보관 시 적합한 pH의 완충 용액을 정하기 위해 pH 4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 의 완충 용액상에서 20 분간 4℃ 정치 후 최적 조건에서 한천 분해 효소 활성을 측정 하였다. pH 4.0, 5.0, 6.0, 6.5 에서는 20 mM 소듐 아세테이트 용액을, pH 6.5, 7.0, 8.0 에서는 20 mM KPB (potassium phosphate buffer) 용액을, pH 8.0, 9.0, 9.5 에서는 20 mM tris-HCl 용액을 사용하였다.

결과적으로, AaAgaB의 잔존 활성은 pH 8.0에서 가장 높게 나타났으며, pH 9.5까지는 90% 정도 보존함을 확인하였다 (도 8).

<실시예 8> 재조합 AaAgaB에 대한 열 안정성

장기 보관과 온도에 따른 효소의 실활 정도를 확인하기 위해 20~80℃까지 10℃ 간격으로, 서로 다른 온도에서 AaAgaB를 20분간 정치 하였다. 각 온도에서 정치한 시료는 활성 측정 온도인 42℃까지 냉각시킨 후 최적 조건에서 효소를 반응 시킨 후 DNS 방법으로 측정 하였다.

도 9에는 활성 보존이 가장 높게 나타난 값을 100% 로 보았을 때 다른 온도에서의 잔존활성을 상대적으로 나타내었다. 30~40℃ 구간에서 AaAgaB의 활성이 가장 높았으며, 50℃ 에서도 효소의 활성을 60% 이상 유지하였으나 그 보다 높은 온도에서는 급격히 활성을 잃는 것이 확인되었다. 20~40℃ 까지 잔존 활성이 100%를 유지하는 결과는 최적 온도 결과를 고려해볼 때 한천이 고형화 되지 않는 온도 이상에서도 재조합 AaAgaB 활용 가치가 충분한 것을 시사한다.

<실시예 9> 재조합 AaAgaB 활성에 대한 금속 및 환원제 등의 영향

일반적으로 효소 활성에 영향을 줄 수 있는 시약 중 각종 금속 이온 및 환원제 등의 첨가에 따라 효소 활성에 영향을 주는지를 확인하기 위해 각 시약 100 ㎕를 첨가하고 30분 반응 시킨 후 효소 활성을 최적 활성값의 상대값으로 측정하였다. 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 마그네슘, 염화 칼슘, 염화 철의 금속염 시약은 각각 최종 농도 50 mM이 되도록 효소 반응액에 첨가하였으며, 우레아, DTT(Dithiothreol)의 환원제는 각각 최종 농도 10 mM이 되도록 첨가하였다. 착물을 형성하는 EDTA(Ethylenediaminetetraaceticacid) (pH 8.0)는 최종 농도 10 mM이 되도록 첨가하여 활성을 측정하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 나트륨, 칼륨, 칼슘의 금속 이온은 한천 분해 활성에 거의 영향을 주지 않음을 확인하였으나 마그네슘과 철 이온에 대하여 각각 45%, 79% 저해 효과가 확인되었고, EDTA(Ethylenediaminetetraaceticacid)도 활성에 영향을 주지 않았다, 우레아 역시 한천 분해 활성에 큰 영향을 끼치지 않았으나 DTT (Dithiothreol)의 환원제 시약은 효소 활성을 약 20 % 증진시키는 결과를 확인할 수 있었다. 즉, 본 실험에서 정제한 한천 분해 효소는 금속의 영향이 크지 않음이 확인되었다.

<실시예 10> 우뭇가사리에 대한 한천 분해 활성

실제 AaAgaB의 산업적 응용 가능성을 확인하기 위해 건조 중량 1 g 의 우뭇가사리를 잘게 썰고 증류수 100 ml 와 섞은 후 고온 고압 멸균기 (autoclave)에서 15분간 반응 시켜 한천 성분이 충분히 용해 되도록 하였다. 이 용액을 한천이 용액 상태를 유지하는 42℃까지 냉각 후 한천 분해 효소 활성 측정 방법을 적용하여 AaAgaB의 응용 가능성을 살펴보았다. 이때 우뭇가사리 속의 한천 외 성분들이 DNS 시약과 반응할 가능성이 있으므로 대조군으로서 1.0% 우뭇가사리 용액과 DNS 시약을 100℃, 10분간 반응 시키고 20분간 상온에 식힌 후 12,000g, 5분간 원심불리 하여 상층액을 546 nm 파장에서 분광학적으로 분석하였다.

상기 대조군과 종속군인 효소 반응액의 차이값을 뺀 후 고유 활성도를 구한 결과 14.75 U/mg이 확인되었다. 이 값은 순수하게 정제된 한천 기질 대비 약 79.4% 낮은 값으로 확인되었다 (표 5). 한편 우뭇가사리는 한천 외에 다양한 성분이 존재 하므로 효소의 활성 부위에 한천 기질이 접근하는 것을 가로 막는 입체 장애 효과로 인해 낮은 활성이 나타난 것으로 추정된다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Mass production method beta agarase from Agarivorans albus <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1362 <212> DNA <213> Agarivorans albus <400> 1 atgaaaggtt ttacgaaaca ttctattctg atggcttgca gcattggtct ggctattaac 60 gctacggcgg cggactggga caacattccg atcccggccg aactggatgc aggccagtct 120 tgggaactgc agcaaaacta cagtgactcc ttcaactaca gtggcaaaaa ctccaccttc 180 acgggtaaat ggaaagattc atacttccat tcgtggaccg gtccgggtct gacgcactgg 240 agctctgatg aatcttgggt gggcgacggt aacctgatta tctcagcctc gcgtcgccag 300 ggcaccaata aagtgaacgc aggtgttatc accagtaaaa cgaaagtgaa atatccgatc 360 ttcctggaag ccagcattaa agtttctaat ctggaactga gttccaactt ttggctgctg 420 agcgaaaatg atcagcgtga aatcgacgtt ctggaagtct atggcggtgc ccgccaagat 480 tggtacgcaa aaaatatgag caccaacttc catgtgtttt tccgtaacaa cgacaactcg 540 atcaaaaacg attataacga ccagacccat tttaccccga cgtggggcaa ctactggcgt 600 gatggctttc accgcttcgg tggttattgg aaatccccga ccgatgtcac gttctacatc 660 gacggccaga aaaccacgaa aggtggctgg agtcaagtgg ttatgaaaga taaagactat 720 accggcgcca ttctggataa atcccgttac aatatggacc aggaagcatt tattatcatt 780 gataccgaag acccatagcg gcgctctgaa gcgggtcaca tcgcgacgga tgccgacctg 840 gcagattcag acaaaaacaa aatgtacgac gattggattc gtgtgtacaa accgaccggc 900 ggttcgacca cgccgccgac cggtgatatt acgcgcccga gtggttatac gaatctgcag 960 ctggctcatt ccaaccgttg cgtcgatgtg attaatggcg cgctgtggaa cggttcaacc 1020 tatcagcaat actcgtgtaa tacgggtaac aataaccagc ggtttaaatt caccaaaatc 1080 gctaataacc agtacagcat taacgcgaaa gtctctcaac tgtgcatcga actggctagc 1140 ggctcatcgg ctaatggtgc gaaagttcag caatggatct gtaaccacgc aaatagtaac 1200 cagacctggt tcctagaaga taaaggctca aacacgttcg aaatccgtaa caaacaatcg 1260 ggtaaatgcc tggaagtggc taacagctct aaatgcgaac ggcggcagat tcgtcagtgg 1320 gcgtgtacgg gtgcgaccaa ccagcgtttc aaactgtaat aa 1362 <210> 2 <211> 452 <212> PRT <213> Agarivorans albus <400> 2 Met Lys Gly Phe Thr Lys His Ser Ile Leu Met Ala Cys Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ile Asn Ala Thr Ala Ala Asp Trp Asp Asn Ile Pro Ile Pro 20 25 30 Ala Glu Leu Asp Ala Gly Gln Ser Trp Glu Leu Gln Gln Asn Tyr Ser 35 40 45 Asp Ser Phe Asn Tyr Ser Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Gly Lys Trp 50 55 60 Lys Asp Ser Tyr Phe His Ser Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr His Trp 65 70 75 80 Ser Ser Asp Glu Ser Trp Val Gly Asp Gly Asn Leu Ile Ile Ser Ala 85 90 95 Ser Arg Arg Gln Gly Thr Asn Lys Val Asn Ala Gly Val Ile Thr Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Val Lys Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Ala Ser Ile Lys Val 115 120 125 Ser Asn Leu Glu Leu Ser Ser Asn Phe Trp Leu Leu Ser Glu Asn Asp 130 135 140 Gln Arg Glu Ile Asp Val Leu Glu Val Tyr Gly Gly Ala Arg Gln Asp 145 150 155 160 Trp Tyr Ala Lys Asn Met Ser Thr Asn Phe His Val Phe Phe Arg Asn 165 170 175 Asn Asp Asn Ser Ile Lys Asn Asp Tyr Asn Asp Gln Thr His Phe Thr 180 185 190 Pro Thr Trp Gly Asn Tyr Trp Arg Asp Gly Phe His Arg Phe Gly Val 195 200 205 Tyr Trp Lys Ser Pro Thr Asp Val Thr Phe Tyr Ile Asp Gly Gln Lys 210 215 220 Thr Thr Lys Gly Ala Trp Ser Gln Val Val Met Lys Asp Lys Asp Tyr 225 230 235 240 Thr Gly Ala Ile Leu Asp Lys Ser Arg Tyr Asn Met Asp Gln Glu Ala 245 250 255 Phe Ile Ile Ile Asp Thr Glu Asp His Ser Trp Arg Ser Glu Ala Gly 260 265 270 His Ile Ala Thr Asp Ala Asp Leu Ala Asp Ser Asp Lys Asn Lys Met 275 280 285 Tyr Val Asp Trp Ile Arg Val Tyr Lys Pro Thr Gly Gly Ser Thr Thr 290 295 300 Pro Pro Thr Gly Asp Ile Thr Pro Pro Ser Gly Tyr Thr Asn Leu Gln 305 310 315 320 Leu Ala His Ser Asn Arg Cys Val Asp Val Ile Asn Gly Ala Leu Trp 325 330 335 Asn Gly Ser Thr Tyr Gln Gln Tyr Ser Cys Asn Thr Gly Asn Asn Asn 340 345 350 Gln Arg Phe Lys Phe Thr Lys Ile Ala Asn Asn Gln Tyr Ser Ile Asn 355 360 365 Ala Lys Val Ser Gln Leu Cys Met Glu Leu Ala Ser Gly Ser Ser Ala 370 375 380 Asn Gly Ala Lys Val Gln Gln Trp Ile Cys Asn His Ala Asn Ser Asn 385 390 395 400 Gln Thr Trp Ser Leu Glu Asp Lys Gly Ser Asn Thr Phe Glu Ile Arg 405 410 415 Asn Lys Gln Ser Gly Lys Cys Leu Glu Val Ala Asn Ser Ser Asn Ala 420 425 430 Asn Gly Gly Gln Ile Arg Gln Trp Ala Cys Thr Gly Ala Thr Asn Gln 435 440 445 Arg Phe Lys Leu 450

Claims

서열목록 서열번호 1에 기재된 염기서열로 표시되는 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 베타 아가라아제 유전자 및 글루타티온 전달효소(glutathione S-transferase) 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 포함하는 베타 아가라아제 대량생산용 키트.
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서열목록 서열번호 1에 기재된 염기서열로 표시되는 아가리보란스 알버스(Agarivorans albus) 베타 아가라아제 유전자 및 글루타티온 전달효소(glutathione S-transferase) 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하는 단계; 및
글루타티온 친화력 크로마토그래피를 통해 상기 단계로부터 얻은 배양물로부터 베타 아가라아제 및 글루타티온 전달효소의 융합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 베타 아가라아제의 대량생산방법.
삭제
제5항에 있어서,
정제된 융합 단백질과 트롬빈을 반응시켜 융합 단백질로부터 글루타티온 전달효소를 제거하는 단계를 더 포함하는 베타 아가라아제의 대량생산방법.