JP6231011B2 - 3−ヒドロキシアルク−4−エノエートおよび/または3−ホスホノキシアルク−4−エノエートの酵素変換による1,3−ジエンの産生 - Google Patents
3−ヒドロキシアルク−4−エノエートおよび/または3−ホスホノキシアルク−4−エノエートの酵素変換による1,3−ジエンの産生 Download PDFInfo
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- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
- C12Y402/03027—Isoprene synthase (4.2.3.27)
Description
−油からの抽出性蒸留(C5カット)
−イソアミレンの脱水素
−イソペンタンの二重脱水素
−イソブテンおよびホルムアルデヒドの反応
−アセトンおよびアセチレンの反応
−プロピレン二量体化
WO2009/076676は、イソプレンへの代謝経路を報告する。この経路は、メバロン酸経路における下流中間体の脱リン酸化−脱水、すなわちイソプレニル−ピロリン酸またはプレニル−ピロリン酸に基づく。このプロセスには、全メバロン酸経路:メバロン酸の二重リン酸化、その後、脱炭酸−脱水してイソプレニル−ピロリン酸とし、さらに異性体化してプレニル−ピロリン酸にして、そして最終的に二重脱リン酸化/脱水でイソプレンにする経路を経ることを要する欠点がある。
Cn+1H2nO3
式中、3<n<7
に対応する分子を意味し、そして共通のモチーフとして3−ヒドロキシペント−4−エノエートを含み(図1B)、そして場合によって、炭素3および炭素4上にメチル置換を含む。
HO−CO−CH2−C(R1)(OH)−C(R2)=CH2またはO−−CO−CH2−C(R1)(OH)−C(R2)=CH2
式中、R1およびR2は独立に、水素原子およびメチル基からなる群より選択される
に対応する分子を意味する。
(i)3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を有する、第一の酵素;および
(ii)第一の酵素と異なり、そして脱炭酸反応によって、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を有する第二の酵素
によって、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートの前記1,3−ジエン化合物への変換を含む点で特徴付けられる。
に対応する分子を意味する。
Cn+1H2n+1O6P
式中、3<n<7
に対応する分子を意味し、そして共通のモチーフとして3−ホスホノキシペント−4−エノエートを含み(図1B)、そして場合によって、炭素3および炭素4上にメチル置換を含む。
HO−CO−CH2−C(R1)(O−PO3H2)−C(R2)=CH2またはO−−CO−CH2−C(R1)(O−PO3H2)−C(R2)=CH2
式中、R1およびR2は独立に、水素原子およびメチル基からなる群より選択される
に対応する分子を意味する。
HO−CO−CH2−C(R1)(O−PO3H2)−C(R2)=CH2
HO−CO−CH2−C(R1)(O−PO3H−)−C(R2)=CH2
HO−CO−CH2−C(R1)(O−PO3 2−)−C(R2)=CH2
O−−CO−CH2−C(R1)(O−PO3H2)−C(R2)=CH2
O−−CO−CH2−C(R1)(O−PO3H−)−C(R2)=CH2
O−−CO−CH2−C(R1)(O−PO3 2−)−C(R2)=CH2
炭素3はキラル(不斉)中心である。この定義は、2つの型の一方、例えばR型が天然に産生される主要な型であったとしても、2つのキラル型を含む。接尾辞「オエート(oate)」は、本明細書において、炭酸イオン(COO−)または炭酸(COOH)のいずれかを交換可能に意味しうる。これはエステルを意味するようには用いられない。
(A)配列番号16に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号16に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号16に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を示すタンパク質;
(B)配列番号17に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号17に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号17に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を示すタンパク質;
(C)配列番号18に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号18に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号18に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を示すタンパク質;および
(D)配列番号19に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号19に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号19に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を示すタンパク質
からなる群より選択される。
(a)配列番号12に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号12に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号12に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(b)配列番号22に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号22に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号22に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(c)配列番号23に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号23に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号23に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(d)配列番号1に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号1に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(e)配列番号7に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号7に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(f)配列番号24に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号24に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号24に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(g)配列番号25に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号25に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号25に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(h)配列番号26に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号26に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号26に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(i)配列番号27に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号27に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号27に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(j)配列番号28に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号28に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号28に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;および
(k)配列番号29に示すようなアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号29に示すアミノ酸配列に少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号29に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質
からなる群より選択される。
ジメチルアリル二リン酸→イソプレン+二リン酸
を触媒する酵素である。
(2E,6E)−ファルネシル二リン酸→(3E,6E)−アルファ−ファルネセン+二リン酸
を触媒する。
(2E,6E)−ファルネシル二リン酸→(E)ベータ−ファルネセン+二リン酸
を触媒する。
ゲラニル二リン酸→(E)−ベータ−オシメン+二リン酸
または
ゲラニル二リン酸→ミルセン+二リン酸
を天然に触媒する酵素である。
ゲラニル二リン酸→アルファ−ピネン+二リン酸
を天然に触媒する酵素である。
6,7−ジヒドロゲラニル二リン酸←→6,7−ジヒドロミルセン+二リン酸
である。
(i)3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを変換する活性を有する第一の酵素;および
(ii)第一の酵素とは異なり、そして脱炭酸反応によって、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を有する、第二の酵素。
クローニング、細菌培養およびタンパク質発現
研究する酵素をコードする遺伝子をpET 25bまたはpET 22bベクター(Novagen)中にクローニングした。一続きの6ヒスチジンコドンを、メチオニン開始コドン後に挿入して、精製用のアフィニティタグを提供した。熱ショック法にしたがって、コンピテント大腸菌BL21(DE3)細胞(Novagen)をこれらのベクターで形質転換した。形質転換細胞をZYM−5052自己誘導培地(Studier FW, Prot.Exp.Pur. 41, (2005), 207−234)上、振盪しながら(160rpm)37℃で6時間増殖させ、そしてタンパク質発現を28℃で一晩(およそ16時間)続けた。4℃、10,000rpmで20分間遠心分離することによって細胞を収集し、そしてペレットを−80℃で凍結した。
3−ヒドロキシペント−4−エノエートからの1,3−ブタジエン産生に関連するADPの放出を、ピルビン酸キナーゼ/乳酸脱水素酵素カップリングアッセイを用いて定量化した(図4)。Th.アシドフィルム、Th.ボルカニウムおよびS.ミティス由来の精製メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素を、これらが3−ヒドロキシペント−4−エノエートをリン酸化し、ADPを放出する能力に関して評価した。
50mM Tris−HCl pH7.5
10mM MgCl2
100mM KCl
5mM ATP
0.4mM NADH
1mM ホスホエノールピルビン酸
3U/ml 乳酸脱水素酵素
1.5U/ml ピルビン酸キナーゼ
50mM 3−ヒドロキシペント−4−エノエート
pHを7.5に調整した。
以下の条件下で、望ましい酵素反応を実行した:
50mM Tris−HCl pH7.5
10mM MgCl2
10mM KCl
20mM 3−ヒドロキシペント−4−エノエート
20mM ATP
0.2mg/mlのTh.アシドフィルム(突然変異体L200E)由来の精製MDP脱炭酸酵素
酵素を含まない、基質を含まない、およびATPを含まない対照反応を平行して実行した。アッセイを振盪せずに37℃で一晩インキュベーションした。典型的には、200μl反応のアリコットを取り除き、遠心分離し、そして上清を清潔なバイアル中に移した。陰イオンモードで、エレクトロスプレーイオン化インターフェースを伴うEsquire 3000(Bruker)イオン捕捉質量分析装置上で、MSスペクトルを得た。3−ホスホノキシペント−4−エノエートの存在を評価した。MS分析は、酵素を含有する試料から、対応する3−ホスホノキシペント−4−エノエートに対応するm/z 194,9での[M−H]−イオンを示したが、陰性対照からは示さなかった(図5、6)。
実施例2に記載するアッセイ条件下で、0〜30mMの間で基質濃度を変化させることによって、動力学的パラメータを決定した。
所望の酵素反応を、以下の条件下で行った:
50mM Tris HCl pH7.5
10mM MgCl2
20mM KCl
50mM ATP
200mM 3−ヒドロキシペント−4−エノエート
pHを7.5に調整した。
3−ホスホノキシペント−4−エノエートは、カスタム合成に特化した企業、Syntheval(フランス)によって合成される。
50mM Tris−HCl pH7.5
10mM MgCl2
0〜20mM KCl
5mM ATP
0〜250mM 3−ホスホノキシペント−4−エノエート
pHを7.5に調整する。
3−ヒドロキシ−3−メチルペント−4−エノエートからのイソプレン産生に関連するADPの放出を、ピルビン酸キナーゼ/乳酸脱水素酵素カップリングアッセイを用いて定量化する(図4)。精製メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素を、これらがこの基質をリン酸化し、ADPを放出する能力に関して評価する。
50mM Tris−HCl pH7.5
10mM MgCl2
100mM KCl
5mM ATP
0.4mM NADH
1mM ホスホエノールピルビン酸
3U/ml 乳酸脱水素酵素
1.5U/ml ピルビン酸キナーゼ
50mM 3−ヒドロキシ−3−メチルペント−4−エノエート
特定の酵素(0.05〜1mg/mlの濃度)の添加によって各アッセイを開始し、そして340nmでの吸光度を追うことによって、NADHの消失を監視する。
3−ヒドロキシ−4−メチルペント−4−エノエートからのイソプレン産生に関連するADPの放出を、ピルビン酸キナーゼ/乳酸脱水素酵素カップリングアッセイを用いて定量化する(図4)。精製メバロン酸二リン酸脱炭酸酵素を、これらがこの基質をリン酸化し、ADPを放出する能力に関して評価する。
50mM Tris−HCl pH7.5
10mM MgCl2
100mM KCl
5mM ATP
0.4mM NADH
1mM ホスホエノールピルビン酸
3U/ml 乳酸脱水素酵素
1.5U/ml ピルビン酸キナーゼ
50mM 3−ヒドロキシ−4−メチルペント−4−エノエート
特定の酵素(0.05〜1mg/mlの濃度)の添加によって各アッセイを開始し、そして340nmでの吸光度を追うことによって、NADHの消失を監視する。
研究する酵素反応を、37℃、以下の条件下で実施する:
50mM Tris−HCl pH7.5
10mM MgCl2
20mM KCl
5mM ATP
0〜200mM 3−ヒドロキシ−3−メチルペント−4−エノエート
pHを7.5に調整する。
研究する酵素反応を、37℃、以下の条件下で実施する:
50mM Tris−HCl pH7.5
10mM MgCl2
20mM KCl
5mM ATP
0〜200mM 3−ヒドロキシ−4−メチルペント−4−エノエート
pHを7.5に調整する。
クズ由来のゲノムから推測されるイソプレン・シンターゼの配列(Uniprot Q6EJ97)を、大腸菌のコドン用法に適合するオリゴヌクレオチド連結によって生成した。酵素のアミノ酸配列を配列番号30に示す。一続きの6ヒスチジンコドンを、メチオニン開始コドン後に挿入して、精製用のアフィニティタグを提供した。こうして合成した遺伝子をpET 25b(+)発現ベクター中にクローニングした(該ベクターはGeneArt AGによって構築された)。対応する酵素を大腸菌中で発現させ、そして実施例1に記載するように精製した。
Claims (18)
- 3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素(EC 4.1.1.33)の活性を有する酵素を用いて、1,3−ジエン化合物に変換する工程を含むことで特徴付けられる、1,3−ジエン化合物を産生するための方法であって、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有する酵素が、配列番号4〜12、14〜19および22〜29に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号4〜12、14〜19および22〜29に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%同一であり、そしてジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の酵素活性を示す酵素である、前記方法。
- 3−ヒドロキシアルク−4−エノエートが3−ヒドロキシペント−4−エノエートであり、そして産生される1,3−ジエン化合物が1,3−ブタジエンである、請求項1の方法。
- 3−ヒドロキシアルク−4−エノエートが3−ヒドロキシ−4−メチルペント−4−エノエートまたは3−ヒドロキシ−3−メチルペント−4−エノエートであり、そして産生される1,3−ジエン化合物がイソプレンである、請求項1の方法。
- ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有する酵素が、配列番号6、16、17、18または19のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号6、16、17、18または19のアミノ酸配列に少なくとも90%同一であり、そしてジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の酵素活性を示す、請求項1〜3のいずれか一項の方法。
- (i)3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を有する、第一の酵素;および
(ii)第一の酵素と異なり、そして脱炭酸反応によって、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を有する第二の酵素
によって、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートの前記1,3−ジエン化合物への変換を含む点で特徴付けられ、ここで
(i)3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエート化合物に変換する活性を有する第一の酵素が、
(A)配列番号16に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号16に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号16に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を示すタンパク質;
(B)配列番号17に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号17に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号17に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を示すタンパク質;
(C)配列番号18に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号18に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号18に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を示すタンパク質;および
(D)配列番号19に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号19に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号19に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を示すタンパク質、
からなる群より選択され、
(ii)前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを、前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を有する第二の酵素が、
(a)配列番号12に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号12に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号12に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(b)配列番号22に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号22に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号22に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(c)配列番号23に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号23に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号23に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(e)配列番号7に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号7に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(f)配列番号24に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号24に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号24に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(g)配列番号25に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号25に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号25に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(h)配列番号26に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号26に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号26に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(i)配列番号27に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号27に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号27に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;
(j)配列番号28に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号28に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号28に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質;および
(k)配列番号29に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号29に示すアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号29に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同程度に高い、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を示すタンパク質、
からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項の方法。 - (i)3−ヒドロキシアルク−4−エノエートを、対応する3−ホスホノキシアルク−4−エノエートに変換する活性を有する、第一の酵素;および
(ii)第一の酵素と異なり、そして脱炭酸反応によって、前記3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを前記1,3−ジエン化合物に変換する活性を有する第二の酵素
によって、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートの前記1,3−ジエン化合物への変換を含む点で特徴付けられ、
ここで第一の酵素が請求項5に定めるものであり、第二の酵素がテルペン・シンターゼである、請求項1〜3のいずれか一項の方法。 - 前記テルペン・シンターゼが、イソプレン・シンターゼ(EC 4.2.3.27)、モノテルペン・シンターゼ、アルファ−ファルネセン・シンターゼ(EC 4.2.3.46)、ベータ−ファルネセン・シンターゼ(EC 4.2.3.47)、ミルセン/(E)−ベータ−オシメン・シンターゼ(EC 4.2.3.15)およびピネン・シンターゼ(EC 4.2.3.14)からなる群より選択される、請求項6の方法。
- 脱炭酸および脱リン酸化を通じた変換を触媒可能な酵素を使用することによって、3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを、対応する1,3−ジエン化合物に酵素的に変換する工程を含む、1,3−ジエン化合物を産生するための方法であって、
前記酵素がテルペン・シンターゼまたは、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素(EC 4.1.1.33)の活性を有する酵素であって、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有する酵素が、配列番号4〜12、14〜19および22〜29に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号4〜12、14〜19および22〜29に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%同一であり、そしてジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の酵素活性を示す酵素である、前記方法。 - 前記テルペン・シンターゼが、イソプレン・シンターゼ(EC 4.2.3.27)、モノテルペン・シンターゼ、アルファ−ファルネセン・シンターゼ(EC 4.2.3.46)、ベータ−ファルネセン・シンターゼ(EC 4.2.3.47)、ミルセン/(E)−ベータ−オシメン・シンターゼ(EC 4.2.3.15)およびピネン・シンターゼ(EC 4.2.3.14)からなる群より選択される、請求項8の方法。
- 3−ホスホノキシアルク−4−エノエートが3−ホスホノキシペント−4−エノエートであり、そして産生される1,3−ジエンが1,3−ブタジエンである、請求項8または9の方法。
- 3−ホスホノキシアルク−4−エノエートが3−ホスホノキシ−4−メチルペント−4−エノエートまたは3−ホスホノキシ−3−メチルペント−4−エノエートであり、そして産生される1,3−ジエンがイソプレンである、請求項8または9の方法。
- in vitroで行われる、請求項1〜11のいずれか一項の方法。
- 補助基質が添加される、請求項1〜12のいずれか一項の方法。
- 補助基質がATP、rNTP、dNTP、ポリリン酸またはピロリン酸、あるいはこれらの化合物の任意の混合物である、請求項13の方法。
- 単数または複数の前記酵素を産生する微生物の使用によって実行される点で特徴付けられる、請求項1〜14のいずれか一項の方法。
- 微生物が、3−ヒドロキシアルク−4−エノエートおよび/または3−ホスホノキシアルク−4−エノエートを産生可能である、請求項15の方法。
- 3−ヒドロキシアルク−4−エノエートの脱リン酸化−脱炭酸によって3−ヒドロキシアルク−4−エノエートから1,3−ジエン化合物を産生するための、脱炭酸酵素の活性を有する酵素の使用であって、前記酵素がジホスホメバロン酸脱炭酸酵素(EC 4.1.1.33)の活性を有する酵素であって、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の活性を有する酵素が、配列番号4〜12、14〜19および22〜29に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号4〜12、14〜19および22〜29に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%同一であり、そしてジホスホメバロン酸脱炭酸酵素の酵素活性を示す酵素である、前記使用。
- 3−ホスホノキシアルク−4−エノエートの脱リン酸化−脱炭酸によって3−ヒドロキシアルク−4−エノエートから1,3−ジエン化合物を産生するための、テルペン・シンターゼの使用。
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