CN107922937B - 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化合物的制造方法 - Google Patents

二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化合物的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供能以高生产率制造烯烃化合物的方法、和用于该方法的酶，对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了多种MVD的变异体。然后，对于变异体评价参与异戊二烯等烯烃化合物的生成的催化活性，结果发现，209位的苏氨酸被替换成其他氨基酸的MVD具有上述催化活性，表明了除了209位以外进一步74位的精氨酸也被替换成其他氨基酸的MVD具有更高的上述催化活性。

Description

二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化 合物的制造方法
技术领域
本发明涉及利用了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的烯烃化合物的制造方法。另外本发明涉及上述变异体及其制造方法，进一步还涉及编码上述变异体的DNA、和插入了该DNA的载体。另外本发明涉及利用导入了上述DNA或上述载体的宿主细胞的烯烃化合物的制造方法，进一步还涉及包含上述变异体、上述DNA或上述载体的用于促进烯烃化合物的生成的制剂。
背景技术
异戊二烯、异丁烯等烯烃化合物作为合成橡胶等各种合成聚合物的原料极为有用，这些化合物可以通过石油分馏这样的化学方法得到。
然而，即使在这样的化学方法中，其收率也低，花费制造成本，另外需要时间。进而考虑近来的环境问题，要求开发不浪费有限资源的、对环境温和的可持续的烯烃化合物的制造方法以代替化学方法。
鉴于这种状况，尝试了利用或改变微生物等的代谢途径来制造烯烃化合物。例如，开发了对参与甲羟戊酸途径的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶等导入变异，利用该变异酶的异戊二烯、异丁烯等的制造方法(专利文献1～3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2013/092567号
专利文献2：国际公开第2015/004211号
专利文献3：国际公开第2015/021045号
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于上述现有技术存在的课题而做出的，目的是提供能以高生产率制造烯烃化合物的酶。
用于解决课题的方法
本发明者们为了实现上述目的，首先构想了将以5-二磷酸甲羟戊酸为底物、由二磷酸甲羟戊酸脱羧酶参与的异戊烯基二磷酸的生成(参照下述式)应用于异戊二烯等烯烃化合物的制造。
Figure BDA0001565159050000021
即，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的氨基酸中导入变异，使该酶(二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体)的底物特异性从原来的针对5-二磷酸甲羟戊酸变更为针对3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸等，从而经过如下述式所示的反应而制造异戊二烯等。
Figure BDA0001565159050000022
因此，本发明者们在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了多个二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体。然后，对于这些变异体，评价参与以5-二磷酸甲羟戊酸为底物生成异戊烯基二磷酸的催化活性、和以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的催化活性。
其结果表明，通过在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中导入变异，针对5-二磷酸甲羟戊酸的底物特异性总的来说降低。特别是发现，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的209位的苏氨酸被替换成其他氨基酸(丝氨酸、精氨酸、组氨酸等)的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶具有生成异戊二烯的催化活性。
进而表明，74位的精氨酸被替换成组氨酸、且209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(R74HT209R)出类拔萃地显示极高的参与异戊二烯的生成的催化活性。更具体地，通过对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶导入上述双重变异，参与异戊烯基二磷酸的生成的催化活性与野生型相比变为约3分之1，另一方面，参与异戊二烯的生成的催化活性与野生型相比提高到约60～80倍。另外，该参与异戊二烯的生成的催化活性如后述图3B和图4B所示，与其他变异体相比显著高。
另外，对于R74HT209R，也评价了参与其他烯烃化合物(异丁烯)的生成的催化活性。其结果与异戊二烯生成时同样地，发现了与野生型相比极高的参与异丁烯的生成的催化活性。
另外还发现，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，74位和209位分别不限于精氨酸和苏氨酸，即使替换成其他氨基酸(74位为甲硫氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸等、209位为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等)，在异戊二烯生成的催化剂反应中，总的来说也显示高于野生型的催化活性。
进而，在异戊二烯生成的催化活性中还确认，将上述R74HT209R与74位的精氨酸被替换成甲硫氨酸、且209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体(R74MT209R)相比较，结果R74MT209R显示与R74HT209R相比还高达1.28倍的催化活性。
进而还确认了在异丁烯的生成中R74MT209R也显示高催化活性。另外，与上述异戊二烯的生成同样地，确认了在异丁烯的生成中的催化活性R74MT209R也高于R74HT209R，从而完成了本发明。即，本发明提供以下＜1＞～＜24＞。
＜1＞烯烃化合物的制造方法，包括：在序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶存在下，使下述式(1)所示的化合物与ATP反应的工序，
Figure BDA0001565159050000041
式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基(alkenyl)、碳数6～20的芳基或卤素原子，上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代。
＜2＞烯烃化合物的制造方法，包括：将导入了以下DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，采集该宿主细胞和/或其培养物中生成的烯烃化合物的工序，所述DNA编码序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的制造方法，在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或组氨酸。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞的任一项所述的制造方法，上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸进一步变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
＜5＞根据＜4＞所述的制造方法，在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或丙氨酸，且序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸所变异成的其他氨基酸是甲硫氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。
＜6＞根据＜1＞～＜5＞的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异戊二烯。
＜7＞根据＜1＞～＜5＞的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是丁二烯。
＜8＞生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的制造方法，该制造方法包括：在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸。
＜9＞根据＜8＞所述的制造方法，在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或组氨酸。
＜10＞根据＜8＞或＜9＞所述的制造方法，进一步包括：在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，使序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸变异成其他氨基酸的工序。
＜11＞根据＜10＞所述的制造方法，在上述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或丙氨酸，且序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸所变异成的其他氨基酸是甲硫氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。
＜12＞根据＜8＞～＜11＞的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是异戊二烯。
＜13＞根据＜8＞～＜11＞的任一项所述的制造方法，上述烯烃化合物是丁二烯。
＜14＞二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，其中，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸。
＜15＞根据＜14＞所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或组氨酸。
＜16＞根据＜14＞或＜15＞所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸进一步变异成其他氨基酸。
＜17＞根据＜16＞所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的其他氨基酸是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或丙氨酸，且序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸所变异成的其他氨基酸是甲硫氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。
＜18＞DNA，编码＜14＞～＜17＞的任一项所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
＜19＞载体，包含＜18＞所述的DNA。
＜20＞宿主细胞，其中，导入了＜18＞所述的DNA或＜19＞所述的载体。
＜21＞二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制造方法，包括：培养＜20＞所述的宿主细胞，采集该宿主细胞中表达的蛋白质的工序。
＜22＞用于使下述式(1)所示的化合物与ATP反应、从而促进烯烃化合物的生成的制剂，包含＜14＞～＜17＞的任一项所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、编码该二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的DNA或插入了该DNA的载体，
Figure BDA0001565159050000061
式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子，上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代。
＜23＞根据＜22＞所述的制剂，上述烯烃化合物是异戊二烯。
＜24＞根据＜22＞所述的制剂，上述烯烃化合物是丁二烯。
发明的效果
根据本发明，可以提供能以高生产率制造烯烃化合物的酶、以及利用了该酶的烯烃化合物的制造方法。
附图说明
图1是显示对于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(图中用“Wt”表示)及其变异体分析参与以5-二磷酸甲羟戊酸为底物生成异戊烯基二磷酸的酶活性(图中在纵轴显示)和以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的酶活性(图中在横轴显示)的结果的图。其中，图中“T209H”等表示二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各变异体，数字表示在该酶中导入了伴随氨基酸替换的变异的部位(209位等)，数字左侧的字母表示替换前的氨基酸(T/苏氨酸等)，数字右侧的字母表示替换后的氨基酸(H/组氨酸等)。
图2是显示将强制表达二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的大肠杆菌(图中用“Wt”表示)、和强制表达209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的大肠杆菌(图中用“T209R”表示)进行培养，测定各自生成的异戊二烯的量的结果的图。
图3A是以横轴显示到1400μg/L来显示对于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(图中用“Wt”表示)及其变异体分析参与以5-二磷酸甲羟戊酸为底物生成异戊烯基二磷酸的酶活性(图中在纵轴显示)和参与以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的酶活性(图中在横轴显示)的结果的图。其中，在图3A和以下的图中，“T209R，I145F”等表示二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各氨基酸替换体的分析结果，数字表示该酶中导入了伴随氨基酸替换的变异的部位(145位、209位等)，数字左侧的字母表示替换前的氨基酸(T/苏氨酸、I/异亮氨酸等)，数字右侧的字母表示替换后的氨基酸(R/精氨酸、F/苯丙氨酸等)。另外，图中纵轴与横轴的交点附近密集的点群(图中用椭圆包围的点群)显示S120C、T46D、S121C、S153A、T209C、T209Q、T209E、T209A、T209Y、T209D、T75I、T209N、N28R、N28E、S153C、N28W、S108T、N28H、L63Q、G154I、G154L、S108C、S108D、N110M、N110Q、S108N、N110I、G154M、G154W、K22Y、T46C、R74W、L61E、L63E、R74Y、L63N、N110E、T48S、T46V、G154F、A119C、A122C、G154E、K22F、A123S、K22R、K22W的氨基酸替换体的分析结果。
图3B是以横轴显示到25000μg/L的方式显示对于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及其变异体分析参与以5-二磷酸甲羟戊酸为底物生成异戊烯基二磷酸的酶活性(图中在纵轴显示)和参与以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的酶活性(图中在横轴显示)的结果的图。
图4A是以横轴显示到1500μg/L的方式对于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及其变异体分析参与以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的酶活性的结果的图。其中，在图4A和B中，“超纯水”表示使用milliQ(注册商标)水代替二磷酸甲羟戊酸脱羧酶进行分析的结果(阴性对照)。
图4B是以横轴显示到30000μg/L的方式对于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及其变异体分析参与以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的酶活性的结果的图。
图5是显示将强制表达二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的大肠杆菌、和分别强制表达二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各变异体的大肠杆菌进行培养，测定各自生成的异戊二烯的量的结果的图。其中，图中“LB2＊无菌”显示作为阴性对照实验分析仅由LB培养基、底物和IPTG组成的样品的结果。
图6A是对于74位的精氨酸被替换成组氨酸、且209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(图中用“R74HT209R”表示)、和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，显示各自存在下的异戊二烯合成量的经时变化的图。纵轴显示合成的异戊二烯量，横轴显示反应时间。
图6B是将图6A中的纵轴转换为对数显示而得的图。
具体实施方式
＜烯烃化合物的制造方法1＞
如后述的实施例中所示，通过将二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的209位的苏氨酸替换成其他氨基酸，针对该酶本来的底物5-二磷酸甲羟戊酸的底物特异性降低。另外发现，该二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体具有促进生成烯烃化合物的下述反应的催化活性(也称为“生成烯烃化合物的催化活性”)。
Figure BDA0001565159050000091
因此，本发明提供烯烃化合物的制造方法，包括：在序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸(以下也仅称为“209位的苏氨酸”)变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(以下也称为“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体”)存在下，使上述式(1)所示的化合物与ATP(腺苷三磷酸)的工序。
本发明中“烯烃化合物”是指具有至少1个碳间双键的碳氢化合物，另外也可以导入羟基和/或羧基等取代基、卤素原子等原子。作为这样的化合物，可列举例如，异丁烯、乙烯、丙烯、2-甲基-1-丁烯、异戊二烯醇、3-羟基-3-甲基-4-戊烯酸等单烯烃化合物、异戊二烯、丁二烯(1,3-丁二烯)、1,3-戊二烯、2,3-二甲基丁二烯、1,3-己二烯、2-甲基-1,3-戊二烯、氯丁二烯、3-甲基-2,4-戊二烯酸这样的共轭二烯化合物等二烯烃化合物。
本发明中，在成为用于制造烯烃化合物的原料的下述式(1)所示的化合物中，对于R1和R2不特别限制，各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子(上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意取代)。
Figure BDA0001565159050000092
另外，本发明中，在制造共轭二烯化合物的情况下，如以下反应式所示，作为上述式(1)所示的化合物的更具体方式，优选使用下述式(4)所示的化合物。
Figure BDA0001565159050000101
上述式(4)所示的化合物中，对于R3、R4和R5不特别限制，各自独立地表示选自氢原子、碳数1～10的烷基、卤素原子、碳数2～15的烯基和碳数6～20的芳基中的取代基。
另外本发明中，作为碳数1～10的烷基，可列举例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、环丙基、环戊基、环己基、正庚基、正辛基、正癸基、(环己基)甲基、(1-甲基环己基)甲基、(1-甲基环戊基)甲基、(1-乙基环己基)甲基。另外，作为碳数2～15的烯基，可列举例如，乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-丁烯基、5-己烯基、7-辛烯基，作为碳数6～20的芳基，可列举例如，苯基、1-萘基、2-萘基、苊基、菲基、蒽基。另外，卤素原子表示氯原子、氟原子、溴原子、碘原子。
这样的上述式(1)所示的化合物可以如后述实施例中所示那样，作为市售的制品购买。另外，只要是本领域技术人员，就能够适当参考公知的合成方法(例如，TetrahedronLetters、1988年、20卷、15号、1763～1766页所记载的方法)进行合成。
在后述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的存在下，关于上述式(1)所示的化合物与ATP的反应的条件，只要是促进该反应、生成烯烃化合物的条件即可，只要是本领域技术人员，就能够适当调整反应液的组成、反应液的pH、反应温度、反应时间等来进行设定。
例如，在添加了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、以及作为其底物的上述式(1)所示的化合物和ATP的反应液中，通常可以包含作为二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的辅因子的镁离子1～50mM、优选包含5～20mM，关于其他组成，pH如前所述，只要不妨碍上述反应就不特别限制，优选pH7～8的缓冲液，更优选pH7～8的Tris-盐酸缓冲液。
另外，作为反应温度也只要不妨碍上述反应就不特别限制，通常为20～40℃，优选25～37℃。进而，作为反应时间，只要是能生成烯烃化合物的时间即可，不特别限制，通常为30分钟～7日，优选12小时～2日。
另外，这样的条件下生成的烯烃化合物一般容易气化，因而可以通过公知的挥发性气体的回收、纯化方法来采集。作为该采集方法，可列举汽提、分馏、吸附、脱附、渗透蒸发、利用热或真空使吸附于固相的异戊二烯从固相脱附、利用溶剂提取、或色谱(例如，气相色谱)等。另外，即使在生成的烯烃化合物为液体的情况下，也可以适当利用公知的回收、纯化方法(蒸馏、色谱等)来采集。进而，这些方法可以单独进行，也可以适当组合多阶段地实施。
＜烯烃化合物的制造方法2＞
另外，如后述的实施例所示，通过对进行了转化使其表达序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的宿主细胞进行培养，从而能够高生产率地制造烯烃化合物。因此，本发明还提供烯烃化合物的制造方法，包括培养导入了编码后述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA或载体的宿主细胞，采集该宿主细胞和/或其培养物中生成的烯烃化合物的工序。
关于宿主细胞的培养条件，如后所述，但优选在培养基中添加作为二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的底物的上述(1)式所示的化合物、作为辅因子的镁离子，更优选添加全部这些化合物。另外，培养温度可以根据所使用的宿主细胞的种类适当设计变更，通常为20～40℃，优选25～37℃。
另外，本发明中，“培养物”是含有通过将宿主细胞用培养基培养而得的增殖的宿主细胞、该宿主细胞的分泌产物和该宿主细胞的代谢产物等的培养基，包含它们的稀释物、浓缩物。
对于这样的从宿主细胞和/或培养物采集烯烃化合物，也不特别限制，可以使用上述公知的回收、纯化方法来进行。另外，采集的时期可以根据所使用的宿主细胞的种类适当调整，只要是能生成烯烃化合物的时间即可，但通常为30分钟～7日，优选12小时～2日。
＜二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体＞
接着，对于上述本发明的烯烃化合物的制造方法中使用的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体进行说明。本发明中“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”也称为MVD(Diphosphomevalonatedecarboxylase)，另外是作为EC号：4.1.1.33注册的酶，是催化从5-二磷酸甲羟戊酸和ATP生成异戊烯基二磷酸、ADP、磷酸和二氧化碳的下述反应的羧基裂合酶的一种。
Figure BDA0001565159050000121
本发明中，作为导入后述的变异的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶不特别限制，可以使用各种生物来源的酶。作为这样的酶，可列举例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的MVD(由序列号2所记载的氨基酸序列组成的蛋白质)、酿酒酵母(YJM7株)来源的MVD(UniProt受理号：A6ZSB7所特定的蛋白质)、酿酒酵母(RM11-1a株)来源的MVD(UniProt受理号：B3LPK0所特定的蛋白质)、杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)来源的MVD(UniProt受理号：B9W6G7所特定的蛋白质)、毕赤酵母(Pichia pastoris)来源的MVD(UniProt受理号：C4QX63所特定的蛋白质)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)来源的MVD(UniProt受理号：O139363所特定的蛋白质)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)来源的MVD(UniProt受理号：Q751D8所特定的蛋白质)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseni)来源的MVD(UniProt受理号：Q6BY07所特定的蛋白质)、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)来源的MVD(UniProt受理号：Q54YQ9所特定的蛋白质)、米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的MVD(UniProt受理号：Q2UGF4所特定的蛋白质)、家兔脑胞内原虫(Encephalitozoon cuniculi)来源的MVD(UniProt受理号：Q8SRR7所特定的蛋白质)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)来源的MVD(UniProt受理号：B7S422所特定的蛋白质)、三叶橡胶树(Heveabrasiliensis)来源的MVD(UniProt受理号：A9ZN03所特定的蛋白质)、烟草(Nicotianalangsdorffii x Nicotiana sanderae)来源的MVD(UniProt受理号：B3F8H5所特定的蛋白质)、软紫草(Arnebia euchroma)来源的MVD(UniProt受理号：Q09RL4所特定的蛋白质)、粳稻(Oryza sativa subsp.japonica)来源的MVD(UniProt受理号：Q6ETS8所特定的蛋白质)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的MVD(UniProt受理号：Q8LB37所特定的蛋白质)、番茄(Solanum lycopersicum)来源的MVD(UniProt受理号：A8WBX7所特定的蛋白质)、家蚕(Bombyx mori)来源的MVD(UniProt受理号：A5A7A2所特定的蛋白质)、斑马鱼(Daniorerio)来源的MVD(UniProt受理号：Q5U403所特定的蛋白质)、小鼠(Mus musculus)来源的MVD(UniProt受理号：Q99JF5或Q3UYC1所特定的蛋白质)、褐家鼠(Rattus norvegicus)来源的MVD(UniProt受理号：Q62967所特定的蛋白质)、牛(Bos taurus)来源的MVD(UniProt受理号：Q0P570所特定的蛋白质)、人(Homo sapiens)来源的MVD(UniProt受理号：P53602所特定的蛋白质)。其中，优选酿酒酵母来源的MVD，更优选由序列号2所记载的氨基酸序列组成的蛋白质。另外，容易理解在自然界中通过核苷酸序列变异，能够发生蛋白质的氨基酸序列的变化。
进而，本发明的“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”还可以是除了序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸以外还人工导入了变异的蛋白质。即，本发明的“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”中，也包含“由在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的氨基酸序列(序列号2所记载的氨基酸序列等)的209位以外还替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成的蛋白质”。其中，“数个”不特别限制，通常为1～80个、优选1～40个、更优选1～20个、进一步优选1～10个(例如，1～8个、1～4个、1～2个)。
另外，本发明的“二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”中，除了序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸以外，作为导入变异的部位，只要具有生成烯烃化合物的催化活性就不特别限制，如后述的实施例所示，从该活性倾向于更高这样的观点，优选为序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸(以下也仅称为“74位的精氨酸”)。
本发明中，作为序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸所变异成的“其他氨基酸”不特别限制，如后述的实施例所示，从容易在烯烃化合物的生成中发挥高催化活性这样的观点考虑，优选为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或组氨酸。
另外，如后述的实施例所示，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，在导入变异的部位仅为序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸的情况下，从与野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶相比，针对5-二磷酸甲羟戊酸的底物特异性低、且具有生成烯烃化合物的催化活性这样的观点考虑，优选为组氨酸、丝氨酸、精氨酸，进一步从与野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶相比生成烯烃化合物的催化活性高这样的观点考虑，更优选组氨酸。
另外，如后述的实施例所示，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，导入变异的部位除了序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸之外，至少还有序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸或与该部位对应的精氨酸的情况下，从容易在烯烃化合物的生成中具有更高的催化活性这样的观点考虑，209位的苏氨酸所变异成的其他氨基酸优选精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或丙氨酸，更优选精氨酸。进而，这种情况下，74位的精氨酸所变异成的其他氨基酸优选为甲硫氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸，更优选为甲硫氨酸或组氨酸。
此外，本发明中“对应的部位”是指，利用核苷酸和氨基酸序列分析软件(GENETYX-MAC、Sequencher等)、BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，将序列号2所记载的氨基酸序列与来源于其他品种的MVD等的氨基酸序列进行比对时，与序列号2所记载的氨基酸序列中的74位或209位处于同一位置的部位。
另外“野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”是导入序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸中的变异、以及前述的人工变异之前的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，可列举例如，上述酿酒酵母等各种生物来源的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及其天然变异体。
进而，是否与野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶相比“针对5-二磷酸甲羟戊酸的底物特异性”低，可以通过例如，如后述的实施例所示，使用比色检测试剂(制品名：Biomol(注册商标)Green试剂、Enzo Life Sciences社制)测定以5-二磷酸甲羟戊酸为底物的异戊烯基二磷酸的合成中生成的游离磷酸量，将该量在野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶与其氨基酸变异体之间进行比较，从而判定。此外，关于针对5-二磷酸甲羟戊酸的底物特异性，例如，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体中生成的游离磷酸量优选为野生型的该量的70％以下，更优选为50％以下，进一步优选为30％以下，更优选为10％以下，特别优选为1％以下。
另外，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体是否具有生成烯烃化合物的催化活性，例如，如后述的实施例所示，可以通过用气相色谱质量分析(GC-MS)直接测定烯烃化合物的量来判定，进而也可以通过与野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中的量进行比较来判定是否与野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶相比生成烯烃化合物的催化活性更高。
本发明中，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体优选生成烯烃化合物的催化活性相对于野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶为2倍以上(例如，3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上)，更优选为10倍以上(例如，20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上)，进一步优选为60倍以上，更优选为70倍以上，特别优选为80倍以上(例如，90倍以上、100倍以上)。
本发明中，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体优选具有后述的实施例所示的GC-MS分析的结果为具有每1mg该酶在37℃、12小时的孵育中能生产0.5mg/L以上的异戊二烯的催化活性，更优选具有能生产5mg/L以上的异戊二烯的催化活性，进一步优选具有能生产10mg/L以上的异戊二烯的催化活性，更优选具有能生产50mg/L以上的异戊二烯的催化活性。
此外，本发明中如上所述，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体优选与野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶相比生成烯烃化合物的催化活性更高。然而，即使该活性比野生型低，如后述的实施例所示，由于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体针对烯烃化合物的生物合成中本来的底物5-二磷酸甲羟戊酸的活性降低，因而作为结果，烯烃化合物的制造量能够比野生型的该量多。
进而，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体也可以直接或间接地添加其他化合物。作为所述添加不特别限制，可以是基因水平上的添加，也可以是化学上的添加。另外对于添加的部位也不特别限制，可以是二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的氨基末端(以下也称为“N末端”)和羧基末端(以下也称为“C末端”)的任一者，也可以是两者。基因水平的添加通过使用对编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA符合阅读框地添加编码其他蛋白质的DNA而得的DNA来实现。作为这样添加的“其他蛋白质”不特别限制，在为了使二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的纯化容易的情况下，优选使用多聚组氨酸(His-)标签(tag)蛋白质、FLAG-标签蛋白质(注册商标、Sigma-Aldrich社)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等纯化用标签蛋白质，另外在为了使二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的检测容易的情况下，优选使用GFP等荧光蛋白质、荧光素酶等化学发光蛋白质等检测用标签蛋白质。化学上的添加可以通过共价键也可以通过非共价键。作为“共价键”不特别限制，可列举例如，氨基与羧基的酰胺键、氨基与卤代烷基的烷基胺键、硫醇之间的二硫键、硫醇基与酰亚胺基或卤代烷基的硫醚键。作为“非共价键”，可列举例如，生物素-抗生物素蛋白之间的键。另外，作为这样化学地添加的“其他化合物”，在为了使二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的检测容易的情况下，优选使用例如，Cy3、罗丹明等荧光色素。
另外，本发明的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体也可以与其他成分混合使用。作为其他成分不特别限制，可列举例如，灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、溶解辅助剂、缓冲剂、蛋白酶抑制剂、保存剂。
＜编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体的DNA、和具有该DNA的载体＞
接着，对于编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA等进行说明。如后述的实施例所示，通过导入该DNA来转化宿主细胞，在该细胞中制造二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体，进而能够制造烯烃化合物。
本发明的DNA可以是在天然DNA中人为导入了变异的DNA，也可以是由人工设计的核苷酸序列组成的DNA。进而对于其形态不特别限制，除了cDNA之外，还包含基因组DNA、和化学合成DNA。这些DNA的制备对本领域技术人员来说可以利用常规手段来进行。基因组DNA可以如下制备：例如，从酿酒酵母等提取基因组DNA，制作基因组文库(作为载体，可以利用质粒、噬菌体、粘粒、BAC、PAC等)，将其展开，使用基于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的核苷酸序列(例如，序列号1所述的核苷酸序列)制备的探针进行菌落杂交或噬菌斑杂交。另外，还可以通过制作对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因特异的引物，利用该引物进行PCR来制备。另外，cDNA例如可以通过基于从酿酒酵母提取的mRNA合成cDNA，将其插入λZAP等载体中制作cDNA文库，将该文库展开，与上述同样地进行菌落杂交或噬菌斑杂交来制备，另外，也可以通过进行PCR来制备。
然后，关于对这样制备的DNA导入将二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸替换成其他氨基酸的变异，只要是本领域技术人员就能够通过利用公知的定点诱变法来进行。作为定点诱变法，可列举例如，Kunkel法(Kunkel,T.A.、Proc Natl Acad Sci USA、1985年、82卷、2号、488～492页)、SOE(splicing-by-overlap-extention)-PCR法(Ho,S.N.,Hunt,H.D.,Horton,R.M.,Pullen,J.K.,and Pease,L.R.、Gene、1989年、77卷、51～59页)。
另外，只要是本领域技术人员，就能够人工设计编码将二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的209位的苏氨酸替换成其他氨基酸的蛋白质的核苷酸序列，基于该序列信息使用自动核酸合成仪化学合成本发明的DNA。
当然，根据这些方法，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中除了209位的苏氨酸以外(例如，序列号2所记载的氨基酸序列的74位)的精氨酸也可以人工替换成其他氨基酸。
进而，本发明的DNA从进一步提高所编码的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体在后述的宿主细胞中的表达效率这样的观点考虑，也可以根据该宿主细胞的种类采取将密码子最适化后的编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA的方式。
另外，本发明也提供能够在宿主细胞内复制前述的DNA的、插入了该DNA的载体。
本发明中“载体”可以以自身复制载体、即作为染色体外的独立体存在、其复制不依赖于染色体的复制的例如质粒为基础来构建。另外，载体在导入宿主细胞时，也可以是整合到该宿主细胞的基因组中，与整合了该载体的染色体一起复制的方式。
作为这样的载体，可列举例如，质粒、噬菌体DNA。另外，作为质粒，可列举大肠杆菌来源的质粒(pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、酵母来源的质粒(YEp13、YEp24、YCp50等)、枯草菌来源的质粒(pUB110、pTP5等)。作为噬菌体DNA可列举λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)。进而，如果宿主细胞是昆虫来源，则也可以使用杆状病毒等昆虫病毒载体作为本发明的载体，如果宿主细胞是植物来源，则也可以使用T-DNA等作为本发明的载体，如果宿主细胞是动物来源，则也可以使用逆转录病毒、腺病毒载体等动物病毒载体作为本发明的载体。另外，本发明的载体构建的步骤和方法可以使用在基因工程学领域惯用的方法。例如，为了将本发明的DNA插入载体，可采用首先将纯化后的DNA用适当的限制性酶切断，插入适当载体的限制性酶位点或多克隆位点并与载体连接的方法等。
另外，本发明的载体也可以是以能在宿主细胞内表达可能上述DNA所编码的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的状态包含的表达载体的方式。本发明所涉及的“表达载体”，为了将其导入宿主细胞并表达二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体，期望除了上述DNA之外，还包含控制其表达的DNA序列、用于选择被转化的宿主细胞的基因标志物等。作为控制表达的DNA序列，其中包含启动子、增强子、剪接信号、多聚A添加信号、核糖体结合序列(SD序列)和终止子等。启动子只要是在宿主细胞中显示转录活性就不特别限定，可以作为控制编码与宿主细胞同种或异种的任一蛋白质的基因的表达的DNA序列获得。另外，除了上述控制表达的DNA序列以外还可以包含诱导表达的DNA序列。作为诱导该表达的DNA序列，在宿主细胞为细菌的情况下，可列举能通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而诱导配置在下游的基因的表达的乳糖操纵子。本发明中的基因标志物可以根据被转化的宿主细胞的选择方法适当选择，可以利用例如编码耐药性的基因、辅助营养缺陷性的基因。
另外，本发明的DNA或载体可以与其他成分混合使用。作为其他成分不特别限制，可列举例如，灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、溶解辅助剂、缓冲剂、DNase抑制剂、保存剂。
＜用于促进烯烃化合物的生成的制剂＞
如上所述，通过使用二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、编码该变异体的DNA或插入了该DNA的载体，能够使下述式(1)所示的化合物与ATP反应，促进烯烃化合物的生成。因此，本发明还提供用于使下述式(1)所示的化合物与ATP反应、促进烯烃化合物的生成的制剂，至少包含序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、编码该二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的DNA或插入了该DNA的载体。
Figure BDA0001565159050000191
[式(1)中，R1和R2各自独立地表示氢原子、碳数1～10的烷基、碳数2～15的烯基、碳数6～20的芳基或卤素原子(上述烷基和烯基各自独立地可以被羟基和/或羧基任意替换)]。
作为这样的制剂，只要包含上述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体等即可，也可以与其他成分混合使用。作为该其他成分不特别限制，可列举例如，灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、溶解辅助剂、缓冲剂、蛋白酶抑制剂、DNase抑制剂、保存剂。
另外，本发明还提供包含这样的制剂的试剂盒。本发明的试剂盒中，上述制剂也可以以导入了本发明的DNA等并被转化的后述的宿主细胞的方式包含。进而，除了这样的制剂之外，本发明的试剂盒还可以包含上述式(1)所示的化合物、用于导入本发明的DNA等的宿主细胞、用于培养该宿主细胞的培养基、和它们的使用说明书等。另外，这样的使用说明书是用于将本发明的制剂等在上述的烯烃化合物的制造方法中利用的说明书。说明书可以包含例如，本发明的制造方法的实验方法、实验条件、和涉及本发明的制剂等的信息(例如，显示载体的核苷酸序列等的载体图谱等信息、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的序列信息、宿主细胞的来源、性质、该宿主细胞的培养条件等信息)。
＜导入了编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA等的宿主细胞＞
接着，对于导入了本发明的DNA或载体的宿主细胞进行说明。如后述的实施例所示，如果使用通过前述的DNA或载体的导入而被转化的宿主细胞，则可以制造二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体，进而还可以制造烯烃化合物。
对导入本发明的DNA或载体的宿主细胞不特别限定，可列举例如，微生物(大肠杆菌、酿酒酵母、裂殖酵母、枯草菌、放线菌、丝状菌等)、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞，但从利用比较的廉价的培养基、以短时间显示高的增殖性、进而有助于生产率高的烯烃化合物的制造这样的观点考虑，优选利用微生物作为宿主细胞，更优选利用大肠杆菌。
另外，本发明的DNA或载体的导入也可以按照本领域惯用的方法实施。例如，作为向大肠杆菌等微生物的导入方法，可列举热激法、电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法，作为对植物细胞的导入方法，可列举使用农杆菌的方法、基因枪法，作为对昆虫细胞的导入方法，可列举使用杆状病毒的方法、电穿孔法，作为对动物细胞的导入方法，可列举磷酸钙法、脂质体转染法、电穿孔法。
这样被导入宿主细胞内的DNA等在宿主细胞内可以通过随机插入其基因组DNA中而被保持，也可以通过同源重组而被保持，另外如果是载体，可以通过作为其基因组DNA外的独立体被复制而保持。
＜二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制造方法＞
如后述的实施例所示，通过培养导入了本发明的DNA等的宿主细胞，能够在该宿主细胞内制造二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体。因此，本发明还提供二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制造方法，包括培养前述的宿主细胞，采集在该宿主细胞中表达的蛋白质的工序。
本发明中，“培养宿主细胞”的条件只要是上述宿主细胞能够制造二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的条件即可，只要是本领域技术人员，就能够根据宿主细胞的种类、使用的培养基等适当调整温度、空气添加的有无、氧气的浓度、二氧化碳的浓度、培养基的pH、培养温度、培养时间、湿度等，进行设定。
作为该培养基，只要含有宿主细胞能够同化的物质即可，可列举碳源、氮源、硫源、无机盐类、金属、胨、酵母提取物、肉提取物、酪蛋白水解物、血清等作为含有物。另外，该培养基中可以添加例如，用于诱导编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的DNA的表达的IPTG、对应于本发明所涉及的载体能够编码的耐药性基因的抗生素(例如，氨苄青霉素)、对应于本发明所涉及的载体能够编码的辅助营养缺陷性的基因的营养物(例如，精氨酸、组氨酸)。
然后，作为从这样培养的宿主细胞“采集在该细胞中表达的蛋白质”的方法，可列举例如，通过过滤、离心分离等从培养基回收宿主细胞，将回收的宿主细胞通过细胞溶解、磨碎处理或加压破碎等进行处理，进而通过超滤处理、盐析、硫酸铵沉淀等溶剂沉淀、色谱(例如，凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱)等对在宿主细胞中表达的蛋白质进行纯化、浓缩的方法。另外，对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体添加了前述的纯化标签蛋白质的情况下，也可以使用该标签蛋白质所吸附的底物来进行纯化、采集。进而，这些纯化、浓缩方法可以单独进行，另外也可以适当组合多阶段地实施。
另外，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体不限于上述生物学的合成，也可以使用本发明的DNA等和无细胞蛋白质合成系统制造。作为该无细胞蛋白质合成系统不特别限制，可列举例如，小麦胚芽来源、大肠杆菌来源、兔网织红细胞来源、昆虫细胞来源的合成系统。进而，只要是本领域技术人员，就能够使用市售的肽合成仪等，化学合成二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体。
另外，本发明还能够提供生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的制造方法，包括在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中至少使序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸或与该部位对应的苏氨酸变异成其他氨基酸的工序。
“生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶”是指通过在209位的苏氨酸等导入变异，从而与其导入前相比生成烯烃化合物的催化活性较高的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，其比较对象通常为上述酿酒酵母等各种生物来源的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及其天然变异体。
二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中的“其他氨基酸的变异”导入可以通过所编码的DNA的改变来进行。“DNA的改变”如上所述，可以使用本领域技术人员公知的方法、例如定点诱变法、基于改变后的序列信息的DNA的化学合成法来适当实施这样的DNA的改变。另外，“其他氨基酸的变异”导入如上所述，可以使用肽的化学合成法来进行。
另外，是否通过这样的变异导入而生成烯烃化合物的催化活性提高，如上所述，可以通过GC-MS分析等来评价。
实施例
＜二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制作和评价1＞
本发明者们为了能够以高生产率制造烯烃化合物，设想了通过在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(以下也称为“MVD”)的氨基酸中导入变异，将该酶(二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体)的底物特异性从本来的针对5-二磷酸甲羟戊酸变更为针对3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸等，从而经过如下述式所示的反应而制造异戊二烯等。
Figure BDA0001565159050000231
于是，本发明者们通过以下所示的方法等在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各种部位导入伴有氨基酸替换的变异，制备了多种二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体。然后，对于这些变异体，评价参与以5-二磷酸甲羟戊酸为底物生成异戊烯基二磷酸的催化活性、和参与以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的催化活性。
＜质粒载体的制备＞
首先，为了用大肠杆菌高效地表达酿酒酵母来源的MVD(scMVD、由序列号2所记载的氨基酸序列组成的蛋白质)，将编码其的野生型核苷酸序列(序列号1所述的核苷酸序列)考虑大肠杆菌中的密码子的使用频率进行改变。接着，按照常规方法化学合成由该改变核苷酸序列(序列号3所记载的核苷酸序列)组成的DNA。然后，将这样制备的DNA插入到pET-22b(+)载体(Novagen社制)的多克隆位点(NdeI识别位点与BamHI识别位点之间)，从而将该野生型的scMVD以在其N末端融合多聚组氨酸标签的方式，制备能在大肠杆菌中表达的质粒载体(scMVD载体)。
接着，如下述表1所示，为了将伴有各部位的氨基酸替换的变异导入scMVD中，设计编码导入了各变异的氨基酸序列的引物，进行合成。
表1
Figure BDA0001565159050000241
然后，以上述scMVD载体作为模板，使用这样的引物和定点诱变试剂盒(制品名：site-Direct Mutagenesis Kit、Agilent社制)，按照其试剂盒附带的方案，将导入了各变异的scMVD以在其N末端融合多聚组氨酸标签的方式，制备能在大肠杆菌中表达的质粒载体。
＜酶溶液的制备＞
将如上所述制备的质粒载体分别通过热激法导入大肠杆菌(BL21)中，制备表达野生型的scMVD或各scMVD变异体的转化体。接着，将这些转化体分别在添加了0.4mM的IPTG和氨苄青霉素的LB培养基中培养一晚。将该培养后的转化体通过离心分离集菌，加入添加有DNaseI的蛋白质提取试剂(制品名：B-PER、Thermo Fisher Scientific社制)，进行溶菌。对这样得到的各溶菌液进行离心分离，将所得的各上清添加到多聚组氨酸纯化用柱(制品名：TALON(注册商标)柱、Clontech社制)中。接着，在各柱中添加溶出液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、300mM NaCl、150mM咪唑)，使融合了各多聚组氨酸标签的scMVD溶出。然后，将各溶出液用缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、100mM NaCl)透析后，用超滤旋转柱(制品名：アミコンウルトラ、ミリポア社制)浓缩，制备酶溶液。另外，使用蛋白质定量试剂盒(制品名：BCAアッセイ试剂盒、TaKaRa社制)，按照附带的方案测定这样制备的溶液中的酶(融合了多聚组氨酸标签的scMVD或其变异体)的浓度。
＜酶活性的测定1＞
如下测定以5-二磷酸甲羟戊酸为底物的异戊烯基二磷酸的合成中的各酶活性。
首先，在缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2，100mM KCl)中添加25μM(R)-甲羟戊酸5-焦磷酸四锂盐(シグマ社制)和25μM ATP，制备酶反应液。
然后，将该反应液在37℃保温，对其100μL添加上述制备的各酶溶液(酶含量：50～100ng)，开始酶反应。接着，在该反应开始3分钟后，测定酶反应液中的游离磷酸量，计算出各酶活性。此外，游离磷酸量的测定通过在酶反应液中添加等量的比色检测试剂(制品名：Biomol(注册商标)Green试剂、Enzo Life Sciences社制)，在室温反应20分钟后，测定波长620nm的吸光度来进行。另外，基于这样测定的游离磷酸量(单位：μmol)，将每1mg各酶1分钟生成的反应产物量作为各酶的活性计算出。图1的纵轴显示所得的结果的一部分。
＜酶活性的测定2＞
如下测定以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物的异戊二烯的合成中的各酶活性。
首先，在缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、100mM KCl)中添加0.5mM3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸(目录号：EN300-181938、3-hydroxy-3-methylpent-4-enoicacid、Enamine Building Blocks社制)和5mM ATP。
此外，虽然在本实施例中没有进行，但为了介由NADH的氧化而作为酶活性检测异戊二烯的合成中生成的ADP，还可以添加0.4mM NADH、1mM磷酸烯醇丙酮酸、3U/ml乳酸脱氢酶和1.5U/ml丙酮酸激酶，制备酶反应液。即，通过该酶反应液，首先，以异戊二烯合成中生成的ADP和磷酸烯醇丙酮酸作为底物，通过丙酮酸激酶生成丙酮酸和ATP。进而，以生成的丙酮酸和NADH作为底物，通过乳酸脱氢酶生成乳酸和NAD+。因此，通过测定波长340nm的来源于NADH的吸光度减少，也可以检测酶活性。
然后，在气相色谱质量分析(GC-MS)用的10ml瓶中添加该反应液2.5ml和10mg的上述酶，然后立即封闭瓶盖，开始酶反应。该酶反应在37℃进行，反应开始数日后(约2日后)，通过GC-MS(制品名：GCMS-QP2010Ultra、岛津制作所社制)测定瓶的顶部空间中生成的异戊二烯量。基于所得的测定值，将每1mg各酶生成的反应产物量(单位：μg/L)作为各酶的活性计算出。图1的横轴显示所得的结果的一部分。
＜大肠杆菌培养液中的异戊二烯量的测定＞
对于表达二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的209位的苏氨酸替换成精氨酸的酶(以下也称为“T209R”)的转化体，在添加了氨苄青霉素的LB培养基中以37℃培养。接下来，将波长600nm的OD达到0.4～0.6的培养液2.5ml移至GC-MS用的10ml瓶，添加IPTG至其终浓度为0.4mM，进而添加3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸至其终浓度为0.5mM，封闭瓶盖，在25℃培养。其培养开始然后反应开始数日后(约2日后)，通过GC-MS直接测定瓶的顶部空间中的异戊二烯量。所得的结果示于图2。
由图1所示的结果可知，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶通过导入变异，从而针对5-二磷酸甲羟戊酸的底物特异性与野生型相比总的来说降低。进而确认，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的209位的苏氨酸替换成了其他氨基酸(丝氨酸、精氨酸、组氨酸等)的酶(二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体)具有参与异戊二烯的生成的催化活性。
另外如图1所示，T209R的参与异戊二烯的生成的催化活性本身低于野生型。然而，如图2所示，反映了图1中所示的针对5-二磷酸甲羟戊酸的底物特异性之低，从表达T209R的大肠杆菌产生的异戊二烯的量多于野生型。
即，虽然形成这样的结果的理由未必一定，但对于野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，由该酶的引入在底物之间(5-二磷酸甲羟戊酸与3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸之间)发生了拮抗，与此相对，对于T209R，5-二磷酸甲羟戊酸的引入降低，该拮抗被抑制，设想3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸作为底物更多地被该酶引入。并且，由该结果可以推论，虽然T209R的参与异戊二烯的生成的催化活性本身低于野生型，但作为由大肠杆菌生产的异戊二烯的量，多于野生型。
<二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制作和评价2>
通过上述<质粒载体的制备>和<酶溶液的制备>所记载的方法制备下述表2和3所示的进一步的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体，通过上述<酶活性的测定1>所记载的方法进行分析。将所得的结果的一部分示于图3A和B的纵轴。
表2
Y19A T48D N110D S153A S155A T209A Y19AN28A
Y19D T48S N110E S153C S155C T209C Y19AT209A
Y19E L61D N110I S153D S155D T209D Y19AT209V
Y19H L61E N110L S153E S155N T209E K22AT209A
Y19K L61I N110M S153F S155T T209F K22AT209V
Y19N L61N N110Q S153I R158A T209G N28AT209A
Y19Q L61Q A119C S153K R158C T209H N28AT209V
Y19R L63E A119G S153L R158D T209I R74HT209A
K22A L63I A119S S153M R158E T209K R74HT209C
K22F L63M S120C S153N R158H T209N R74HT209D
K22R L63N S120T S153Q R158K T209P R74HT209E
K22W L63Q S121C S153T R158N T209Q R74HT209G
K22Y D71N A122C S153W R158Q T209R R74HT209H
dR23-L27 D71Q A122S S153Y R158S T209S R74HT209K
dD24-L27 D71T A123C G154A R158T T209V R74HT209N
dT25-L27 R74F A123G G154C R158Y T209W R74HT209Q
表3
N28A R74H A123S G154D S208A T209Y R74HT209R
N28E R74K F125K G154E S208C M212A R74HT209S
N28F R74W F125R G154F S208D M212D R74HT209V
N28H R74Y F125W G154I S208E M212E R74HT209W
N28K T75D F125Y G154K S208H M212H R74HT209Y
N28L T75I I145F G154L S208K M212K R74HI145F
N28M T75N I145L G154M S208N M212N R74HI145FT209H
N28Q S108C I145V G154N S208Q M212Q R74HI145FT209R
N28R S108D I145W G154P S208R M212R R74KT209H
N28W S108N G154Q S208T M212Y R74KT209R
N28Y S108T G154R S208Y 1145FT209H
T46C G154S 1145FT209R
T46D G154T
T46N G154V
T46S G154W
T46V G154Y
此外，关于表中的记载，例如，“R74HI145FT209H”表示将scMVD的74位的精氨酸替换成组氨酸、145位的异亮氨酸替换成苯丙氨酸、209位的苏氨酸替换成组氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体。另外，例如，“dR23-L27”表示在scMVD中23位的精氨酸至27位的亮氨酸缺失的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体。
另外，关于表2和3所示的进一步的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体，使用以下方法测定以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物的异戊二烯的合成中的酶活性。
＜酶活性的测定3＞
首先，在缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、100mM KCl)中添加0.5mM3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸和5mM ATP。
然后，在GC-MS用的10ml瓶中添加该反应液2.5ml和0.5mg的上述酶，然后立即封闭瓶盖，开始酶反应。该酶反应在37℃进行，在反应开始一晚(12小时)后，为了样品平衡化而在50℃加热30分钟之后通过GC-MS测定瓶的顶部空间中生成的异戊二烯量。基于所得的测定值，计算出每1L各酶反应液生成的反应产物量(单位：μg/L)作为各酶的活性。将所得的结果的一部分示于图3A和B的横轴、以及图4A和B。
进而，对于产生表2和3所示的进一步的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的转化体的一部分，也使用上述＜大肠杆菌培养液中的异戊二烯量的测定＞中记载的方法进行分析。将所得的结果示于图5。
另外，对于scMVD、以及将其74位的精氨酸替换成组氨酸、进而将209位的苏氨酸替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体(以下、“R74HT209R”)，通过以下所记载的方法测定异戊二烯的合成量的经时变化。
＜酶活性的测定4＞
利用酶反应和GC-MS的测定与上述＜酶活性的测定3＞同样地进行，为了测定异戊二烯的合成量的经时变化，在各测定时刻通过对每个加入了酶反应液的瓶用液氮冷冻从而中断酶反应。然后，与上述同样地实施样品平衡化处理后，测定瓶的顶部空间中生成的异戊二烯量。将所得的结果示于图6A和B。
此外，图中对于scMVD(图中的“wt”)和R74HT209R的任一者也从测定开始时刻检测了异戊二烯，但这是由于如上所述，通过样品平衡化处理(50℃下30分钟)而酶反应进行了。
由图3A和B的横轴所示的结果可知，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶通过导入变异，针对5-二磷酸甲羟戊酸的底物特异性与野生型相比总的来说降低。
另一方面可知，以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸作为底物得到的异戊二烯的合成量在大多数制作的变异体中为1400μg/L以下，与此相对，74位的精氨酸替换成组氨酸、且209位的苏氨酸替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体(R74HT209R)除了唯一一组以外，均具有极高的参与异戊二烯的生成的催化活性(异戊二烯的合成量：约20000μg/L)。
进而还可知，如图4B所示，虽然进一步将145位的异亮氨酸替换成苯丙氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体(R74HI145FT209R)与没有进行该替换的变异体(R74HT209R)相比，异戊二烯的合成量差，但74位的精氨酸替换成组氨酸、且209位的苏氨酸替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体与其他多数变异体相比均具有极高的参与异戊二烯的生成的催化活性。
另外，如图5所示，反映上述极高的参与异戊二烯的生成的催化活性，从表达R74HT209R的大肠杆菌产生的异戊二烯的量，显著多于从表达其他二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的大肠杆菌产生的异戊二烯的量。
进而，如图6A和B所示，在R74HT209R和野生型二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中测定产生的异戊二烯量的经时变化，结果反映上述极高的参与异戊二烯的生成的催化活性，R74HT209R产生的异戊二烯与野生型产生的异戊二烯的量之差随着时间推移变得更加显著。另外，对于反应开始第24小时测定8次进行比较，结果任一次测定中R74HT209R产生的异戊二烯量均为野生型的60～80倍，与上述同样确认了R74HT209R具有极高的参与异戊二烯的生成的催化活性。
另外，专利文献3(国际公开第2015/021045号)中作为能够制造异戊二烯的酶公开了M3K(EC2.7.1.158)。于是，对于向异戊二烯的转换率(异戊二烯生产量/(底物量·酶量))进行比较，结果可见R74HT209R的转换率为M3K的1.2×103倍，与公知的酶相比也具有极高的参与异戊二烯的生成的催化活性。
此外，R74HT209R产生的异戊二烯量如上所述为野生型的约70倍(60～80倍)。另外，用于获得该异戊二烯量的R74HT209R的量为4.5μM，底物量为0.5mM。另一方面，根据专利文献3的图14等，M3K产生的异戊二烯量为野生型的约50倍。另外，用于获得该异戊二烯量的M3K的量为200μM，底物量为10mM。于是，基于这些数值，如上所述评价R74HT209R的向异戊二烯的转换率为M3K的1.2×103倍。
＜酶活性的测定5＞
接着，本发明者们对于在异戊二烯生成中显示极高的催化活性的上述的R74HT209R确认了也能够在其他烯烃化合物的生成中利用。即，如下评价以β-羟基异戊酸为底物的异丁烯的合成(下述式所示的反应)中的各酶活性。
Figure BDA0001565159050000301
首先，在缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、100mM KCl)中添加0.5mMβ-羟基异戊酸(东京化成工业株式会社制、制品代码：H0701、β-Hydroxyisovaleric Acid)和5mM ATP。
然后，在GC-MS用的10ml瓶中添加该反应液2.5ml和10mg的上述酶，之后立即封闭瓶盖，开始酶反应。该酶反应在37℃进行，反应开始数日后(约2日后)，为了样品平衡化而在50℃加热30分钟后，通过GC-MS(制品名：GCMS-QP2010Ultra、岛津制作所社制)测定瓶的顶部空间中生成的异丁烯量。接下来，计算出来源于所得的异丁烯的峰的面积值。此外，作为对照使用scMVD代替R74HT209R与上述同样地计算出面积值。另外，作为阴性对照使用超纯水(milliQ水)代替酶与上述同样地计算出面积值。所得的结果示于表4。
进而，使用3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸代替β-羟基异戊酸，与上述异丁烯同样地也评价异戊二烯的合成中的各酶活性。所得的结果示于表4。
表4
Figure BDA0001565159050000311
由表4所示结果表明，确认了与上述异戊二烯生成同样地，在异丁烯的生成中R74HT209R也显示高催化活性。
<二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制作和评价3>
通过上述<质粒载体的制备>和<酶溶液的制备>中记载的方法制备下述表5所示的进一步的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体，通过上述<酶活性的测定3>中记载的方法进行分析。所得的结果也示于表5。此外，表5中还显示各二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的异戊二烯生成量相对于野生型的异戊二烯生成量的相对比率。另外表中“-”表示未导入变异(209位仍为苏氨酸)。
表5
R74 I209 wt基准
M D 5.1倍
M E 4.5倍
M G 4.5倍
M A 4.6倍
Q R 6.2倍
K - 3.8倍
K R 2.4倍
由表5所示的结果表明，确认了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中74位和209位分别不限于精氨酸和苏氨酸，即使替换成其他氨基酸，在异戊二烯生成中的催化剂反应中也显示总的来说高于野生型的催化活性。
进而，通过上述<质粒载体的制备>和<酶溶液的制备>中记载的方法制备74位的精氨酸替换成甲硫氨酸、且209位的苏氨酸替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体(R74MT209R)。然后，通过上述<酶活性的测定3>中记载的方法进行分析，对于异戊二烯生成中的催化活性与上述的R74HT209R进行比较。其结果还确认了，R74MT209R与R74HT209R相比显示高达1.28倍的催化活性。
接着，对于在异戊二烯生成中显示极高的催化活性的这两种磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体(R74HT209R、R74MT209R)，通过上述<酶活性的测定5>中记载的方法评价异丁烯的生成中的催化活性。所得的结果示于表6。
表6
超纯水 wt R74HT209R R74MT209R
11232 63057 355800 401170
由表6所示的结果可知，确认了在异丁烯的生成中R74MT209R也显示高催化活性。另外，确认了与上述异戊二烯的生成同样地，R74MT209R比R74HT209R在异丁烯的生成中的催化活性高。
产业可利用性
如以上说明的那样，根据本发明，可以提供能够以高生产率制造烯烃化合物的酶、以及使用该酶的烯烃化合物的制造方法。另外，根据本发明，能够不通过化学合成、而通过生物合成来制造烯烃化合物，因此对环境的负荷少。因此，本发明在异戊二烯、异丁烯这样的合成橡胶等各种合成聚合物的原料的制造中极为有用。
序列表自由文本
序列号：3
<223>为了大肠杆菌中的表达而进行了密码子最优化的序列
Figure IDA0001565159130000011
Figure IDA0001565159130000021
Figure IDA0001565159130000031
Figure IDA0001565159130000041
Figure IDA0001565159130000051
Figure IDA0001565159130000061

Claims (8)

1.烯烃化合物的制造方法，包括：在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶存在下，使下述式(1)所示的化合物与ATP反应的工序，
所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸替换成精氨酸，并且74位的精氨酸替换成组氨酸或甲硫氨酸的蛋白质，
所述烯烃化合物是异戊二烯或异丁烯，
Figure FDA0003417059820000011
式(1)中，当所述烯烃化合物是异戊二烯的情况下，R1和R2分别为甲基和乙烯基，或分别为乙烯基和甲基；当所述烯烃化合物是异丁烯的情况下，R1和R2均为甲基。
2.烯烃化合物的制造方法，包括：将导入了以下DNA或包含该DNA的载体的宿主细胞进行培养，采集该宿主细胞和/或其培养物中生成的烯烃化合物的工序，所述DNA编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，
所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶是序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸替换成精氨酸，并且74位的精氨酸替换成组氨酸或甲硫氨酸的蛋白质，
所述烯烃化合物是异戊二烯或异丁烯。
3.生成烯烃化合物的催化活性提高了的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的制造方法，该制造方法包括：在为由序列号2所记载的氨基酸序列组成的蛋白质的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中，
使序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸替换成精氨酸，
使序列号2所记载的氨基酸序列的74位的精氨酸替换成组氨酸或甲硫氨酸的工序，所述烯烃化合物是异戊二烯或异丁烯。
4.二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，其中，
序列号2所记载的氨基酸序列的209位的苏氨酸替换成精氨酸，并且74位的精氨酸替换成组氨酸或甲硫氨酸。
5.DNA，编码权利要求4所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
6.载体，包含权利要求5所述的DNA。
7.宿主细胞，其中，导入了权利要求5所述的DNA或权利要求6所述的载体。
8.二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的制造方法，包括：培养权利要求7所述的宿主细胞，采集该宿主细胞中表达的蛋白质的工序。
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