WO2024090440A1 - フェルラ酸デカルボキシラーゼ、及びそれを用いた不飽和炭化水素化合物の製造方法 - Google Patents

フェルラ酸デカルボキシラーゼ、及びそれを用いた不飽和炭化水素化合物の製造方法 Download PDF

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dna
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智量 白井
裕太郎 森
義秀 谷地
弥生 松本
操 日座
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国立研究開発法人理化学研究所
日本ゼオン株式会社
横浜ゴム株式会社
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a ferulic acid decarboxylase and a method for producing an unsaturated hydrocarbon compound using the same. More specifically, the present invention relates to a ferulic acid decarboxylase having catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound or a combination of such ferulic acid decarboxylases, DNA encoding the ferulic acid decarboxylase or the combination, a vector into which the DNA is inserted, and a host cell into which the DNA or the vector is introduced. The present invention also relates to a method for producing an unsaturated hydrocarbon compound using the combination or the host cell. Furthermore, the present invention also relates to an agent for promoting the production of an unsaturated hydrocarbon compound, comprising the decarboxylase, the DNA, or the vector.
  • Butadiene (1,3-butadiene) is used as a raw material for various polymer compounds, such as various synthetic rubbers, including butadiene rubber, and polymer resins, including ABS resin, making it an extremely important organic compound in the chemical industry. Furthermore, these polymer compounds made from butadiene are widely used not only in industrial products, such as automobile tires, but also in everyday products, such as clothing. As a result, the demand for butadiene is increasing year by year, with annual demand reaching 13 million tons and a market size of 15 billion dollars.
  • Butadiene has traditionally been produced by refining the C4 fraction, a by-product of the production of ethylene and propylene from petroleum.
  • due to environmental issues such as the depletion of fossil fuels such as petroleum and global warming caused by greenhouse gas emissions, there is an increasing need to realize sustainable butadiene production in order to meet the ever-increasing demand for butadiene mentioned above.
  • As a response there has been active development of methods for producing butadiene using enzymes from materials derived from biomass resources, a renewable resource.
  • Patent Documents 1 and 2 the inventors have discovered that by introducing a mutation into the amino acid of FDC and changing the substrate specificity of the enzyme from the original ferulic acid to muconic acid or the like, butadiene or the like can be produced via a decarboxylation reaction as shown in the following formula (Patent Documents 1 and 2).
  • the present inventors have demonstrated that in a wild-type FDC (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2) derived from Saccharomyces cerevisiae, an FDC mutant in which the isoleucine at position 398 is substituted with glutamine or methionine has catalytic activity that is 9.3-fold and 16.4-fold higher than that of the wild-type. Furthermore, the present inventors have demonstrated that in an FDC mutant in which the isoleucine at position 398 is substituted with glutamine, when the phenylalanine at position 397 is substituted with histidine or methionine, the catalytic activity is improved by 75.1-fold and 33.8-fold, respectively, compared to that of the wild-type.
  • FDC amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2
  • the objective of the present invention is to provide an enzyme that enables the production of unsaturated hydrocarbon compounds such as butadiene with high productivity.
  • the present inventors have demonstrated that by substituting the isoleucine at position 398 with glutamine and the phenylalanine at position 397 with histidine in wild-type FDC derived from Saccharomyces cerevisiae (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2), the catalytic activity is improved by 75.1 times compared to the wild-type (Patent Document 2).
  • the present inventors have attempted to further improve the productivity of unsaturated hydrocarbon compounds such as butadiene using such FDC mutants and have conducted extensive research. Specifically, first, various single and double mutants of FDC were produced, and the above-mentioned catalytic activity was evaluated when these mutants were used in combination with the F397H/I398Q mutant.
  • the catalytic activity was improved by about 548 times when used in combination with the F397W/I398M/F440Y/I189W mutant compared to the wild type, and the catalytic activity was improved by about 623 times when used in combination with the F397W/I398M/F440Y/I189M mutant compared to the wild type.
  • the present invention provides the following aspects:
  • R 1 ", “R 2 “, “R 3 “ and “R 4” each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a hydroxyl group.
  • A represents an optionally substituted linear hydrocarbon group having 0 to 5 carbon atoms, and when the carbon number is 2 to 5, a double bond may be formed between adjacent carbon atoms].
  • [4] A combination of a host cell into which a DNA encoding at least one ferulic acid decarboxylase selected from (a) and (b) described in [1] or a vector containing said DNA has been introduced, and a host cell into which a DNA encoding a ferulic acid decarboxylase described in (c) of [1] or a vector containing said DNA has been introduced.
  • a method for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by the following formula (3) or a geometric isomer thereof comprising a step of decarboxylating an unsaturated hydrocarbon dicarboxylic acid compound represented by the following formula (1) or a geometric isomer thereof in the presence of a combination of ferulic acid decarboxylases described in [1].
  • R 1 ", “R 2 “, “R 3 “ and “R 4” each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a hydroxyl group.
  • A represents an optionally substituted linear hydrocarbon group having 0 to 5 carbon atoms, and when the carbon number is 2 to 5, a double bond may be formed between adjacent carbon atoms].
  • a method for producing an unsaturated hydrocarbon compound comprising the steps of culturing the host cell according to [4] and harvesting an unsaturated hydrocarbon compound represented by the following formula (3) or a geometric isomer thereof produced in the host cell and/or its culture.
  • R 1 ", “R 2 “, “R 3 “ and “R 4” each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a hydroxyl group.
  • A represents an optionally substituted linear hydrocarbon group having 0 to 5 carbon atoms, and when the carbon number is 2 to 5, a double bond may be formed between adjacent carbon atoms].
  • a method for producing an unsaturated hydrocarbon compound comprising the steps of culturing the combination of host cells described in [5] and harvesting the unsaturated hydrocarbon compound represented by formula (3) or a geometric isomer thereof produced in the combination of host cells and/or the culture product thereof.
  • R 1 ", “R 2 “, “R 3 “ and “R 4” each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a hydroxyl group.
  • A represents an optionally substituted linear hydrocarbon group having 0 to 5 carbon atoms, and when the carbon number is 2 to 5, a double bond may be formed between adjacent carbon atoms].
  • R 1 ", “R 2 “, “R 3 “ and “R 4” each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a hydroxyl group.
  • A represents an optionally substituted linear hydrocarbon group having 0 to 5 carbon atoms, and when the carbon number is 2 to 5, a double bond may be formed between adjacent carbon atoms].
  • An agent for decarboxylating an unsaturated hydrocarbon dicarboxylic acid compound represented by the following formula (1) or a geometric isomer thereof, and promoting the production of an unsaturated hydrocarbon compound represented by the following formula (3) or a geometric isomer thereof, comprising the ferulic acid decarboxylase according to [10], the DNA according to [11], or the vector according to [12]:
  • R 1 ", “R 2 “, “R 3 “ and “R 4” each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a hydroxyl group.
  • A represents an optionally substituted linear hydrocarbon group having 0 to 5 carbon atoms, and when the carbon number is 2 to 5, a double bond may be formed between adjacent carbon atoms].
  • the present invention makes it possible to provide an enzyme that enables the production of unsaturated hydrocarbon compounds such as butadiene with high productivity, as well as a method for producing unsaturated hydrocarbon compounds using the enzyme.
  • the present invention relates to a combination of at least one ferulic acid decarboxylase selected from (a) and (b) below and a ferulic acid decarboxylase described in (c) below.
  • the "corresponding site” refers to a site that is aligned with the isoleucine at position 398 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO:2 when aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO:2 using nucleotide and amino acid sequence analysis software (GENETYX-MAC, Sequencher, etc.) or BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
  • FDC Ferulic acid decarboxylase
  • FDC also has catalytic activity to produce unsaturated hydrocarbon compounds represented by the above formula (2) or (3), or geometric isomers thereof, because positions 397 and 398, etc., are specific amino acids, as shown in the Examples below.
  • the catalytic activity to produce such unsaturated hydrocarbon compounds can be evaluated, for example, by directly measuring the amount of unsaturated hydrocarbon compounds by gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), as shown in the Examples below.
  • GC-MS gas chromatography mass spectrometry
  • the FDC of the present invention in the embodiment of a combination of at least one FDC selected from (a) and (b) and the FDC described in (c), exhibits a catalytic activity for producing unsaturated hydrocarbon compounds that is higher than that of the FDC described in (c).
  • "high” means preferably at least three times, more preferably at least four times, even more preferably at least five times, even more preferably at least six times, even more preferably at least seven times, and even more preferably at least eight times, compared to the FDC described in (c).
  • the FDC of the present invention is preferably at least 200 times, more preferably at least 300 times, even more preferably at least 400 times, even more preferably at least 500 times, and even more preferably at least 600 times.
  • the FDCs of the present invention which also have such catalytic activity, include not only ferulic acid decarboxylases in which amino acids such as at position 397 have been artificially replaced with tryptophan or histidine, as shown in the Examples below (hereinafter also referred to as “ferulic acid decarboxylase mutants" or “ferulic acid decarboxylase modified products”), but also naturally occurring ferulic acid decarboxylases in which amino acids such as at position 397 are tryptophan or histidine, as shown in the Examples below (hereinafter also referred to as "ferulic acid decarboxylase homologs" or "natural ferulic acid decarboxylase mutants”).
  • the FDC of the present invention is not particularly limited with respect to its origin (e.g., Saccharomyces), but is preferably a protein containing an amino acid sequence that is 80% or more (e.g., 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more) identical to the Saccharomyces cerevisiae-derived FDC (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2), more preferably a protein containing an amino acid sequence that is 85% or more (e.g., 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more), even more preferably a protein containing an amino acid sequence that is 90% or more (e.g., 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more), and even more preferably a protein containing an amino acid sequence that is 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • identity refers to the percentage of
  • the FDC of the present invention may also be a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added, and/or inserted at sites other than positions 397 and 398 (and, for (a) and (b), positions 440 and 189) of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2.
  • the “multiple” used here is usually 2 to 100, preferably 2 to 50, more preferably 2 to 40, even more preferably 2 to 30, even more preferably 2 to 20, even more preferably 2 to 10 (e.g., 2 to 8, 2 to 4, 2).
  • the FDC of the present invention may have other compounds directly or indirectly added thereto. There is no particular restriction on the addition, and it may be added at the genetic level or chemically. There is also no particular restriction on the site of addition, and it may be either the amino terminus (hereinafter also referred to as the "N terminus”) or the carboxyl terminus (hereinafter also referred to as the "C terminus”) of the FDC of the present invention, or both. Addition at the genetic level is achieved by using DNA encoding the FDC of the present invention to which DNA encoding another protein has been added in a reading frame.
  • a purification tag protein such as a polyhistidine (His-) tag protein, a FLAG-tag protein (registered trademark, Sigma-Aldrich), or glutathione-S-transferase (GST) is preferably used, and in the case of facilitating the detection of the FDC of the present invention, a detection tag protein such as a fluorescent protein such as GFP or a chemiluminescent protein such as luciferase is preferably used.
  • the chemical attachment may be a covalent bond or a non-covalent bond.
  • covalent bond there is no particular limitation on the "covalent bond”, and examples thereof include an amide bond between an amino group and a carboxyl group, an alkylamine bond between an amino group and an alkyl halide group, a disulfide bond between thiols, and a thioether bond between a thiol group and a maleimide group or an alkyl halide group.
  • An example of a "non-covalent bond” is a biotin-avidin bond.
  • fluorescent dyes such as Cy3 and rhodamine are preferably used when the purpose is to facilitate detection of the FDC of the present invention.
  • the FDC of the present invention may be used in combination with other components.
  • other components include sterilized water, physiological saline, vegetable oil, surfactants, lipids, solubilizing agents, buffers, protease inhibitors, and preservatives.
  • the DNA of the present invention may be DNA in which a mutation has been introduced into natural DNA, or may be DNA consisting of an artificially designed nucleotide sequence, so long as it codes for the above-mentioned FDC of the present invention. Furthermore, there is no particular limitation on the form, and in addition to cDNA, genomic DNA and chemically synthesized DNA are included. These DNAs can be prepared using conventional methods for those skilled in the art.
  • Genomic DNA can be prepared, for example, by extracting genomic DNA from Saccharomyces, preparing a genomic library (vectors that can be used include plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc.), developing it, and performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the nucleotide sequence of the FDC gene (for example, the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1). It can also be prepared by preparing a primer specific to the FDC gene and performing PCR using the primer.
  • cDNA can be prepared, for example, by synthesizing cDNA based on mRNA extracted from Saccharomyces, inserting it into a vector such as ⁇ ZAP to prepare a cDNA library, developing the cDNA library, and performing colony hybridization or plaque hybridization as described above, or by performing PCR.
  • a person skilled in the art can introduce a mutation into the DNA thus prepared, substituting tryptophan or histidine for the amino acid at position 397 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid corresponding to said position, by using a known site-specific mutagenesis method.
  • site-specific mutagenesis methods include the Kunkel method (Kunkel, T.A., Proc Natl Acad Sci USA, 1985, vol. 82, no. 2, pp. 488-492) and the splicing-by-overlap-extension (SOE)-PCR method (Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K., and Pease, L.R., Gene, 1989, vol. 77, pp. 51-59).
  • Kunkel method Kunkel, T.A., Proc Natl Acad Sci USA, 1985, vol. 82, no. 2, pp. 488-492
  • SOE splicing-by-overlap-extension
  • a person skilled in the art can artificially design a nucleotide sequence that codes for a protein in which the amino acid at position 397 of FDC or the amino acid corresponding to said position is replaced with tryptophan or histidine, and chemically synthesize the DNA of the present invention using an automatic nucleic acid synthesizer based on the sequence information.
  • the DNA of the present invention may take the form of DNA encoding the FDC of the present invention in which the codons are optimized according to the type of the host cell.
  • the present invention may take the form of a vector into which the aforementioned DNA has been inserted so that the DNA can be replicated within a host cell.
  • a "vector" is a self-replicating vector, that is, a vector that exists as an independent entity outside of a chromosome and whose replication does not depend on chromosomal replication, and can be constructed, for example, based on a plasmid.
  • a vector may be one that, when introduced into a host cell, is incorporated into the genome of the host cell and replicated together with the chromosome into which it has been incorporated.
  • Such vectors include, for example, plasmids and phage DNA.
  • plasmids include plasmids derived from Escherichia coli (pET22, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, YCp50, etc.), and Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110, pTP5, etc.).
  • phage DNA include ⁇ phages (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.).
  • insect virus vectors such as baculovirus, etc.
  • the host cell is of plant origin, T-DNA, etc.
  • animal virus vectors such as retrovirus and adenovirus vectors, etc.
  • the procedures and methods for constructing the vector of the present invention can be those commonly used in the field of genetic engineering.
  • a method is employed in which the purified DNA is first cleaved with an appropriate restriction enzyme, and then inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate vector and ligated to the vector.
  • the vector of the present invention may be in the form of an expression vector that contains the FDC encoded by the DNA in a state that allows it to be expressed in a host cell.
  • the "expression vector" of the present invention contains, in addition to the DNA, a DNA sequence that controls the expression and a gene marker for selecting transformed host cells. Examples of DNA sequences that control expression include promoters, enhancers, splicing signals, polyA addition signals, ribosome binding sequences (SD sequences), and terminators.
  • the promoter is not particularly limited as long as it exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be obtained as a DNA sequence that controls the expression of a gene encoding either a protein of the same species or a protein of a different species from the host cell.
  • the vector may contain a DNA sequence that induces expression.
  • the host cell is a bacterium
  • an example of such a DNA sequence that induces expression is the lactose operon, which can induce the expression of a gene placed downstream by the addition of isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the genetic marker in the present invention may be appropriately selected depending on the method for selecting transformed host cells, but for example, a gene encoding drug resistance or a gene complementing auxotrophy can be used.
  • multiple types of FDCs are used in combination, and each of these FDCs may be encoded in one vector, or multiple FDCs may be encoded in one vector.
  • one vector encodes multiple FDCs for example, by using DNA encoding an IRES or 2A peptide sequence, it is possible to express these multiple FDCs polycistronically.
  • the DNA or vector of the present invention may be used in combination with other components.
  • other components There are no particular limitations on the other components, and examples of such components include sterilized water, physiological saline, vegetable oil, surfactants, lipids, solubilizing agents, buffers, DNase inhibitors, and preservatives.
  • the host cells into which the DNA or vector of the present invention is introduced are not particularly limited, and examples include microorganisms (Escherichia coli, budding yeast, Schizosaccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, actinomycetes, filamentous fungi, etc.), plant cells, insect cells, and animal cells.
  • microorganisms Esscherichia coli, budding yeast, Schizosaccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, actinomycetes, filamentous fungi, etc.
  • plant cells insect cells, and animal cells.
  • the host cell into which the DNA or vector of the present invention is introduced is preferably a cell that retains flavin prenyltransferase, from the viewpoint of inducing prenylation of flavin mononucleotide (FMN) and producing prFMN or its isomer that contributes to improving the productivity of the unsaturated hydrocarbon compound represented by the above formula (3) or its geometric isomer.
  • FMN flavin mononucleotide
  • the host cell into which the DNA or vector of the present invention is introduced is preferably a cell in which the pathway for biosynthesizing muconic acid from glucose via 3-dehydroshikimic acid and catechol is activated, from the viewpoint that muconic acid, which is the substrate of the FDC of the present invention, can be easily produced from glucose as a raw material.
  • Examples of such cells include cells in which the activity of phosphotransferase enzymes and pyruvate kinase is suppressed and which have an enzyme that enables the synthesis of aromatic compounds from chorismic acid or isochorismic acid (e.g., a microorganism described in WO 2017/033965), Escherichia coli described in Kruyer NS et al., Curr Opin Biotechnol. 2017, Jun; 45: 136-143, Pseudomonas putida, or Saccharomyces cerevisiae.
  • a microorganism described in WO 2017/033965
  • Escherichia coli described in Kruyer NS et al., Curr Opin Biotechnol. 2017, Jun; 45: 136-143
  • Pseudomonas putida or Saccharomyces cerevisiae.
  • the DNA or vector of the present invention can also be introduced according to methods commonly used in this field.
  • methods of introduction into microorganisms such as E. coli include the heat shock method, electroporation method, spheroplast method, and lithium acetate method
  • methods of introduction into plant cells include the Agrobacterium method and the particle gun method
  • methods of introduction into insect cells include the baculovirus method and the electroporation method
  • methods of introduction into animal cells include the calcium phosphate method, lipofection method, and electroporation method.
  • the DNA etc. introduced into the host cell in this way may be maintained within the host cell by being randomly inserted into the genomic DNA, or by homologous recombination, or, if it is a vector, it may be replicated and maintained as an independent entity outside the genomic DNA.
  • the FDC of the present invention has high catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound. Therefore, the present invention provides a method for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by the following formula (3) or a geometric isomer thereof, which comprises a step of decarboxylating an unsaturated hydrocarbon dicarboxylic acid compound represented by the following formula (1) or a geometric isomer thereof in the presence of the FDC of the present invention.
  • the "unsaturated hydrocarbon compound or a geometric isomer thereof" produced by the reaction means a hydrocarbon compound having at least one carbon-carbon double bond as shown in formula (3) above, and may have a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a hydroxyl group introduced therein.
  • examples of such compounds include butadiene (1,3-butadiene), 2,4-pentadienoic acid, isocrotonic acid, 3-methylisocrotonic acid, 3-pentenoic acid, and 10-undecenoic acid.
  • the "unsaturated hydrocarbon dicarboxylic acid compound or a geometric isomer thereof" that serves as the raw material for producing an unsaturated hydrocarbon compound means a hydrocarbon compound having at least one carbon-carbon double bond and at least two carboxyl groups, as shown in the above formula (1), and may have a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a hydroxyl group introduced therein.
  • Examples of such compounds include cis,cis-muconic acid, cis,trans-muconic acid, trans,trans-muconic acid, glutaconic acid, 2-methylglutaconic acid, 3-methylglutaconic acid, and traumatic acid.
  • the compounds represented by formula (1) and their geometric isomers can be purchased as commercial products, as shown in the examples below.
  • those skilled in the art can synthesize them by appropriately referring to known synthesis methods (for example, the method described in Kiyoshi Kudo et al., Journal of Petroleum Science, published on July 13, 1994, Vol. 38, No. 1, pp. 48-51).
  • R 1 ", “R 2 “, “R 3 “ and “R 4” each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a hydroxyl group.
  • Examples of "straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms” include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, s-butyl, t-butyl, n-pentyl, and i-pentyl groups.
  • Examples of "straight-chain or branched alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms” include methoxy, ethoxy, n-propoxy, i-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, s-butoxy, t-butoxy, n-pentyloxy, i-pentyloxy, n-pentyloxy, and 1,2-dimethyl-propoxy.
  • A represents a linear hydrocarbon group having 0 to 5 carbon atoms, which may be substituted.
  • linear hydrocarbon group having 0 carbon atoms, which may be substituted means that the carbon atoms bonded via "A" in the compounds represented by the formulas (1) to (3) and their geometric isomers are directly bonded to each other without "A”.
  • the linear hydrocarbon group having 2 to 5 carbon atoms, which may be substituted may form at least one double bond between adjacent carbon atoms.
  • examples of the substituent that the hydrocarbon group may have in "A” include linear or branched alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms, linear or branched alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms, hydroxyl groups, halogen atoms (e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine), nitro groups, cyano groups, amino groups, carboxyl groups, and formyl groups.
  • the conditions for decarboxylating an unsaturated hydrocarbon dicarboxylic acid compound in the presence of the FDC of the present invention may be any conditions that promote the decarboxylation and produce an unsaturated hydrocarbon compound, and a person skilled in the art can appropriately adjust and set the composition of the reaction solution, the pH of the reaction solution, the reaction temperature, the reaction time, etc.
  • the reaction solution to which the FDC of the present invention and its substrate, an unsaturated hydrocarbon dicarboxylic acid compound, are added is not particularly limited as long as it does not interfere with the reaction, but preferably includes a buffer solution of pH 6 to 8, more preferably a buffer solution containing potassium chloride and sodium phosphate of pH 6 to 7. Furthermore, from the viewpoint of facilitating the reaction, it is preferable that the solution contains prenylated flavin mononucleotide (prFMN) or an isomer thereof (prFMN ketimine , prFMN iminui ; for details of prFMN and its isomers, see Non-Patent Document 1).
  • the ratio of FDC used in the manufacturing method of the present invention is not particularly limited, but the molar ratio of the FDC described in (a) above and/or the FDC described in (b) above to the FDC described in (c) above is usually 0.1 to 10 mol/mol, preferably 0.5 to 5 mol/mol, and more preferably 1 to 2 mol/mol.
  • reaction temperature there are no particular limitations on the reaction temperature, so long as it does not interfere with the reaction, but it is usually 20 to 40°C, and preferably 25 to 37°C.
  • reaction time is not particularly limited as long as it is a time that allows the unsaturated hydrocarbon compound to be produced, and is usually 30 minutes to 7 days, and preferably 12 hours to 2 days.
  • the unsaturated hydrocarbon compounds produced under such conditions tend to vaporize easily, and can therefore be collected by known methods for recovering and purifying volatile gases.
  • collection methods include gas stripping, fractional distillation, adsorption, desorption, pervaporation, desorption of isoprene adsorbed on a solid phase from the solid phase by heat or vacuum, extraction with a solvent, or chromatography (e.g., gas chromatography).
  • chromatography e.g., gas chromatography
  • Even if the olefin compound produced is a liquid, it can be collected by appropriately utilizing known recovery and purification methods (distillation, chromatography, etc.). Furthermore, these methods may be carried out alone, or may be carried out in multiple stages in appropriate combinations.
  • the present invention also provides a method for producing an unsaturated hydrocarbon compound, comprising the steps of culturing a host cell into which a DNA or vector encoding the FDC of the present invention has been introduced, and collecting the unsaturated hydrocarbon compound represented by the above formula (3) or a geometric isomer thereof produced in the host cell and/or the culture product thereof.
  • the "host cells into which DNA or a vector encoding the FDC of the present invention has been introduced” are as described above.
  • examples include a combination of a host cell into which DNA encoding at least one FDC selected from (a) and (b) above or a vector containing said DNA has been introduced, and a host cell into which DNA encoding the FDC described in (c) above or a vector containing said DNA has been introduced.
  • the ratio of the number of host cells into which DNA encoding at least one FDC selected from (a) and (b) above or a vector containing said DNA has been introduced is usually 0.1 to 10, preferably 0.5 to 5, and more preferably 1 to 2, when the number of host cells into which DNA encoding the FDC described in (c) above or a vector containing said DNA has been introduced is taken as 1.
  • the culture of the host cells in the production method of the present invention is not limited to the co-culture, but may be a sole culture of the host cells into which DNA encoding at least one FDC selected from (a) and (b) above and DNA encoding the FDC described in (c) above have been introduced.
  • the ratio of DNA (or vector) introduced into the host cells is not particularly limited, but the molar ratio of the DNA encoding the FDC described in (a) above and/or the DNA encoding the FDC described in (b) above to the DNA encoding the FDC described in (c) above is usually 0.1 to 10 mol/mol, preferably 0.5 to 5 mol/mol, and more preferably 1 to 2 mol/mol.
  • the culture conditions for such cells are as described below, but it is preferable that the medium contains an unsaturated hydrocarbon dicarboxylic acid compound represented by the above formula (1), which is a substrate for the decarboxylase of the present invention, or a geometric isomer thereof.
  • the culture temperature can be appropriately designed according to the type of host cell used, but is usually 20 to 40°C, preferably 25 to 37°C.
  • the term "culture” refers to a medium obtained by culturing host cells in a medium, which contains proliferated host cells, secretory products of the host cells, metabolic products of the host cells, etc., and includes dilutions and concentrates thereof.
  • the collection time can be adjusted appropriately according to the type of host cells used, and can be any time that allows the unsaturated hydrocarbon compounds to be produced, but is usually 30 minutes to 7 days, and preferably 12 hours to 2 days.
  • the present invention therefore provides an agent for decarboxylating an unsaturated hydrocarbon dicarboxylic acid compound represented by the above formula (1) or a geometric isomer thereof, comprising the FDC of the present invention, DNA encoding the FDC, or a vector into which the DNA has been inserted, and promoting the production of an unsaturated hydrocarbon compound represented by the above formula (3) or a geometric isomer thereof.
  • Such an agent may contain the FDC of the present invention, but may also be used in combination with other components.
  • other components include sterilized water, physiological saline, vegetable oil, surfactants, lipids, solubilizing agents, buffers, protease inhibitors, DNase inhibitors, and preservatives.
  • the present invention can also provide a kit containing such an agent.
  • the agent may be included in the form of the host cell described above that has been transformed with the DNA of the present invention.
  • the kit of the present invention may also include a compound represented by the above formula (1) or a geometric isomer thereof, a host cell for introducing the DNA of the present invention, a medium for culturing the host cell, and instructions for use thereof.
  • such instructions are instructions for using the agent of the present invention in the method for producing an unsaturated hydrocarbon compound described above.
  • the instructions may include, for example, experimental techniques and experimental conditions for the production method of the present invention, and information on the agent of the present invention (for example, information such as a vector map showing the nucleotide sequence of the vector, sequence information of the FDC of the present invention, information on the origin and properties of the host cell, and information on the culture conditions of the host cell).
  • information on the agent of the present invention for example, information such as a vector map showing the nucleotide sequence of the vector, sequence information of the FDC of the present invention, information on the origin and properties of the host cell, and information on the culture conditions of the host cell.
  • Method of producing FDC of the present invention As shown in the Examples below, by culturing host cells into which DNA encoding the FDC of the present invention has been introduced, the FDC can be produced in the host cells.
  • the present invention can also provide a method for producing the FDC of the present invention, which comprises the steps of culturing a host cell into which DNA encoding the FDC of the present invention or a vector containing the DNA has been introduced, and harvesting the protein expressed in the host cell.
  • the conditions for "culturing host cells” may be any conditions under which the host cells can produce the FDCs of the present invention, and a person skilled in the art can appropriately adjust and set the temperature, the presence or absence of addition of air, the oxygen concentration, the carbon dioxide concentration, the pH of the medium, the culture temperature, the culture time, the humidity, etc., according to the type of host cells, the medium used, etc.
  • Such a medium may contain anything that can be utilized by the host cells, such as a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, inorganic salts, metals, peptone, yeast extract, meat extract, casein hydrolysate, serum, etc.
  • a medium may contain, for example, IPTG for inducing expression of DNA encoding the FDC of the present invention, an antibiotic (e.g., ampicillin) corresponding to a drug resistance gene that can be encoded by the vector of the present invention, or a nutrient (e.g., arginine, histidine) corresponding to a gene that complements an auxotrophy that can be encoded by the vector of the present invention.
  • an antibiotic e.g., ampicillin
  • a nutrient e.g., arginine, histidine
  • the method of "collecting the protein expressed in the host cells” from the host cells cultured in this manner includes, for example, recovering the host cells from the medium by filtration, centrifugation, etc., treating the recovered host cells by cell lysis, grinding, pressurized crushing, etc., and further purifying and concentrating the protein expressed in the host cells by ultrafiltration, salting out, solvent precipitation such as ammonium sulfate precipitation, chromatography (e.g., gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography), etc.
  • chromatography e.g., gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography
  • these purification and concentration methods may be performed alone, or may be performed in multiple stages in appropriate combinations.
  • the FDC of the present invention is not limited to the above biological synthesis, but can also be produced using the DNA of the present invention and a cell-free protein synthesis system.
  • cell-free protein synthesis systems There are no particular limitations on such cell-free protein synthesis systems, but examples include synthesis systems derived from wheat germ, Escherichia coli, rabbit reticulocytes, and insect cells.
  • a person skilled in the art can also chemically synthesize the FDC of the present invention using a commercially available peptide synthesizer, etc.
  • the present invention is not limited to the above embodiments.
  • FDC mutants other than the FDCs described in (a) and (b) above have been clarified, which can improve the catalytic activity for producing unsaturated hydrocarbon compounds by three times or more when used in combination with the FDC described in (c) above.
  • the following (d) to (m) can also be added, and at least one FDC selected from these can be used.
  • a ferulic acid decarboxylase in which the amino acid at or corresponding to position 397 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is tyrosine and the amino acid at or corresponding to position 398 is methionine, and which has a catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by formula (2) or (3) or a geometric isomer thereof.
  • a ferulic acid decarboxylase in which the amino acid at or corresponding to position 397 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is tyrosine, the amino acid at or corresponding to position 398 is methionine, and the amino acid at or corresponding to position 440 is tyrosine, and which has a catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by formula (2) or (3) or a geometric isomer thereof.
  • a ferulic acid decarboxylase in which the amino acid at or corresponding to position 397 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is tyrosine and the amino acid at or corresponding to position 398 is phenylalanine, and which has a catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by formula (2) or (3) or a geometric isomer thereof.
  • a ferulic acid decarboxylase in which the amino acid at or corresponding to position 397 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is tyrosine, the amino acid at or corresponding to position 398 is phenylalanine, and the amino acid at or corresponding to position 286 is leucine, and which has a catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by formula (2) or (3) or a geometric isomer thereof.
  • a ferulic acid decarboxylase in which the amino acid at or corresponding to position 397 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is tryptophan and the amino acid at or corresponding to position 398 is methionine, and which has a catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by formula (2) or (3) or a geometric isomer thereof.
  • a ferulic acid decarboxylase in which the amino acid at or corresponding to position 397 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is tryptophan, the amino acid at or corresponding to position 398 is methionine, and the amino acid at or corresponding to position 440 is tyrosine, and which has a catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by formula (2) or (3) or a geometric isomer thereof;
  • a ferulic acid decarboxylase in which the amino acid at or corresponding to position 397 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is tryptophan, the amino acid at or corresponding to position 398 is methionine, the amino acid at or corresponding to position 440 is phenylalanine, and the amino acid at or corresponding to position 286 is leucine, and which has a catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by formula (2) or (3) or a geometric isomer thereof.
  • (k) a ferulic acid decarboxylase in which the amino acid at or corresponding to position 397 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is tryptophan and the amino acid at or corresponding to position 398 is phenylalanine, and which has a catalytic activity for producing an unsaturated hydrocarbon compound represented by formula (2) or (3) or a geometric isomer thereof.
  • the present inventors have found that introducing a mutation involving amino acid substitution into ferulic acid decarboxylase (FDC) improves the catalytic activity for the production of butadiene using muconic acid as a substrate.
  • FDC ferulic acid decarboxylase
  • the present inventors have demonstrated that by substituting glutamine for isoleucine at position 398 and histidine for phenylalanine at position 397 in wild-type FDC derived from Saccharomyces cerevisiae (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2) (F397H/I398Q mutant), the catalytic activity is improved by 75.1 times compared to the wild-type.
  • the present inventors therefore attempted to further improve the productivity of unsaturated hydrocarbon compounds such as butadiene using such FDC mutants, and prepared various amino acid substitution mutants of FDC as shown below, and evaluated the catalytic activity when these mutants were used in combination with the F397H/I398Q mutant.
  • DNA consisting of such a modified nucleotide sequence was chemically synthesized according to standard methods.
  • the DNA thus prepared was then linked to a pET22b(+) vector (manufactured by Novagen) by the Gibson Assembly method (using the NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (registered trademark) kit from New England Biolabs) to prepare a plasmid vector (wild-type FDC vector) capable of expressing the wild-type FDC in E. coli.
  • vectors encoding FDCs into which various amino acid substitutions had been introduced were prepared. Specifically, primers encoding the amino acid sequences into which each mutation had been introduced were designed and synthesized. Then, using the wild-type FDC vector as a template and the primers, a plasmid vector (FDC mutant vector) capable of expressing the FDC into which each mutation had been introduced in a form fused to a polyhistidine tag at its C-terminus was prepared according to the Gibson Assembly protocol.
  • a gene (SEQ ID NO: 5) encoding flavin prenyltransferase (hereinafter also referred to as "UbiX") from an E. coli (K-12) strain was amplified by the Polymerase Chain Reaction method, and the DNA was linked to the pColADuet vector (Novagen) by the Gibson Assembly method to prepare a plasmid vector (UbiX vector) capable of expressing the wild-type UbiX in E. coli.
  • UbiX vector flavin prenyltransferase
  • each of these transformants was cultured for 6 hours in LB medium supplemented with ampicillin and kanamycin. Note that the growth of these transformants reaches a plateau after this 6-hour culture (preculture). Therefore, the amount of bacterial cells at the start of the enzyme reaction described below becomes uniform among these transformants.
  • lactose was added to a final concentration of 20 g/L to TB medium (12 g/L tryptone, 24 g/L yeast extract, 10 g/L glycerol, 9.4 g/L dipotassium hydrogen phosphate, 2.2 g/L potassium dihydrogen phosphate, 100 mg/L ampicillin, and 50 mg/L kanamycin), and the substrate cis,cis-muconic acid (Sigma-Aldrich) was further added to a final concentration of 5 g/L to prepare a medium for the enzyme reaction.
  • TB medium 12 g/L tryptone, 24 g/L yeast extract, 10 g/L glycerol, 9.4 g/L dipotassium hydrogen phosphate, 2.2 g/L potassium dihydrogen phosphate, 100 mg/L ampicillin, and 50 mg/L kanamycin
  • substrate cis,cis-muconic acid Sigma-Aldrich
  • HS/GSMS headspace gas chromatography mass spectrometer
  • the peak area representing the amount of butadiene (1,3-butadiene) produced in the headspace of the vial was measured by GC-MS (product name: GCMS-QP Ultra, manufactured by Shimadzu Corporation). Based on the measured values obtained, the amount of butadiene produced in co-culture of E. coli expressing the F397H/I398Q mutant with other FDC mutant-expressing E. coli was compared with that produced in monoculture of E. coli expressing the F397H/I398Q mutant.
  • Example 1 Combined use with single or double mutant of FDC
  • various single or double mutants of FDC were prepared, and the amount of butadiene produced when these mutants were combined with the F397H/I398Q mutant (co-cultured as described above) was evaluated.
  • the results are shown in Table 1.
  • the values in the table represent the ratio of the amount of butadiene produced in each co-culture when the amount produced in the sole culture of E. coli expressing the F397H/I398Q mutant was set to 1 (the same applies to Tables 2 and 3 below).
  • Example 2 Use in combination with triple mutant of FDC Furthermore, further amino acid substitutions were introduced based on the F397Y/I398M or F mutant and the F397W/I398M or F mutant to prepare various triple mutants of FDC. Then, co-culture was performed as described above, and the use in combination with the F397H/I398Q mutant was evaluated. The obtained results are shown in Table 2.
  • Example 3 Combination with FDC quadruple mutants Furthermore, based on these FDC triple mutants, further amino acid substitutions were introduced to prepare various FDC quadruple mutants. Then, co-culture was performed as described above, and the combination with the F397H/I398Q mutant was evaluated. The obtained results are shown in Table 3.
  • the amount of butadiene produced was increased by more than 7 times (7.3 times or 8.3 times) compared to when the F397H/I398Q mutant was used alone, and the amount of butadiene produced was 75.1 times that of the wild type.
  • the F397H/I398Q mutant when used alone, the amount of butadiene produced was increased by about 548 times compared to the wild type when used in combination with the F397W/I398M/F440Y/I189W mutant, and the amount of butadiene produced was increased by about 623 times compared to the wild type when used in combination with the F397W/I398M/F440Y/I189M mutant.
  • the present invention it is possible to provide an enzyme that enables unsaturated hydrocarbon compounds such as butadiene to be produced with high productivity, as well as a method for producing unsaturated hydrocarbon compounds using the enzyme. Furthermore, according to the present invention, unsaturated hydrocarbon compounds can be produced by biosynthesis rather than chemical synthesis, which places less strain on the environment. Therefore, the present invention is extremely useful in producing butadiene, a raw material for various synthetic polymers such as synthetic rubber.

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Abstract

（ａ）３９７位がトリプトファンであり、３９８位がメチオニンであり、４４０位がチロシンであり、１８９位がメチオニンである、ＦＤＣ、及び／又は、（ｂ）３９７位がトリプトファンであり、３９８位がメチオニンであり、４４０位がチロシンであり、１８９位がトリプトファンである、ＦＤＣと、（ｃ）３９７位がヒスチジンであり、３９８位がグルタミンである、ＦＤＣとを併用することによって、前記（ｃ）に記載のＦＤＣを単独にて用いた場合と比較して、不飽和炭化水素化合物生成に関する触媒活性は、顕著に向上することを見出し、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物を高い生産性にて製造することを可能とした。

Description

フェルラ酸デカルボキシラーゼ、及びそれを用いた不飽和炭化水素化合物の製造方法
　本発明は、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、及びそれを用いた不飽和炭化水素化合物の製造方法に関する。より詳しくは、不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性を有するフェルラ酸デカルボキシラーゼ又はかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせ、前記フェルラ酸デカルボキシラーゼ又は前記組み合わせをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡが挿入されているベクター、前記ＤＮＡ又は前記ベクターが導入された宿主細胞に関する。本発明はまた、前記組み合わせ又は前記宿主細胞を用いた、不飽和炭化水素化合物の製造方法に関する。さらに本発明は、前記デカルボキシラーゼ、前記ＤＮＡ又は前記ベクターを含む、不飽和炭化水素化合物の生成を促進するための剤にも関する。
　ブタジエン（１，３－ブタジエン）は、ブタジエンゴム等の各種合成ゴム、ＡＢＳ樹脂等のポリマー樹脂といった様々な高分子化合物の原料として用いられるため、化学産業において極めて重要な有機化合物と言える。また、これらブタジエンを原料とする高分子化合物は、自動車用タイヤ等の工業用品だけでなく、衣料品等の生活用品にも幅広く利用されている。そのため、ブタジエンの需要は年々増加しており、その年間需要は１３００万トンとなり、また市場規模も１５０億ドルに達している。
　ブタジエンは、従前より、主に石油からエチレン及びプロピレンを製造する際に副生するＣ４留分を精製することにより製造されてきた。しかしながら、石油等の化石燃料の枯渇や温室効果ガス排出による地球温暖化等の環境問題により、前述の増加の一途を辿るブタジエン需要に対応すべく、持続可能なブタジエン製造を実現する必要性が高まっている。そして、その対応策として、再生可能資源であるバイオマス資源由来物質から、酵素を利用して、ブタジエンを製造する方法の開発が盛んに行なわれている。
　その一方で、本発明者らによって、フェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）が関与する、フェルラ酸の脱炭酸反応による４－ビニルグアイヤコール（４ＶＧ）の生成（非特許文献１及び下記式　参照）を、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物の製造に応用できることが明らかとなっている（特許文献３）。
　すなわち、ＦＤＣのアミノ酸に変異を導入し、当該酵素の基質特異性を、元来のフェルラ酸からムコン酸等に対するものに変更することで、下記式に示すような脱炭酸反応を経て、ブタジエン等を製造できることが、本発明者らによって見出されている（特許文献１、２）。
　例えば、本発明者らは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミケス　セレビシエ）由来野生型ＦＤＣ（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）において、３９８位のイソロイシンをグルタミン又はメチオニンに置換したＦＤＣ変異体は、各々前記触媒活性が、野生型と比して、９．３倍及び１６．４倍に向上することを明らかにしている。さらに、かかる３９８位のイソロイシンをグルタミンに置換したＦＤＣ変異体において、３９７位のフェニルアラニンをヒスチジン又はメチオニンに置換した場合、野生型と比して、７５．１倍及び３３．８倍に前記触媒活性は各々向上することも、本発明者らは明らかにしている。また、かかる３９８位のイソロイシンをメチオニンに置換したＦＤＣ変異体において、３９７位のフェニルアラニンをヒスチジンに置換した場合、野生型と比して、３７．３倍に前記触媒活性は向上することも、本発明者らは明らかにしている（特許文献２）。
国際公開第２０１９／０２２０８３号 国際公開第２０２１／０５４４４１号
　本発明は、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物を高い生産性にて製造することを可能とする酵素を、提供することを目的とする。
　上記のとおり、サッカロミケス　セレビシエ由来野生型ＦＤＣ（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）において、３９８位のイソロイシンをグルタミンに置換し、３９７位のフェニルアラニンをヒスチジンに置換すること（Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体）によって、野生型と比して、上記触媒活性は７５．１倍も向上することを、本発明者らは明らかにしている（特許文献２）。
　そこで今回、本発明者らは、前記目的を達成すべく、かかるＦＤＣ変異体を用いたブタジエン等の不飽和炭化水素化合物の生産性をより向上させることを試み、鋭意研究を重ねた。具体的には先ず、ＦＤＣの一重変異体又は二重変異体を種々作製し、これら変異体とＦ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体とを併用した際の上記触媒活性を評価した。
　その結果、３９７位のフェニルアラニンをチロシンに置換し、３９８位のイソロイシンをメチオニン又はフェニルアラニンに置換した、ＦＤＣ二重変異体（Ｆ３９７Ｙ／Ｉ３９８Ｍ　ｏｒ　Ｆ変異体）と併用した場合、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体のみを用いた場合と比較して、上記触媒活性は５．０倍に向上することを見出した。また、３９７位のフェニルアラニンをトリプトファンに置換し、３９８位のイソロイシンをメチオニン又はフェニルアラニンに置換した、ＦＤＣ二重変異体（Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ　ｏｒ　Ｆ変異体）と併用した場合、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体のみを用いた場合と比較して、上記触媒活性は３．４倍に向上することも見出した。
　さらに、Ｆ３９７Ｙ／Ｉ３９８Ｍ　ｏｒ　Ｆ変異体及びＦ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ　ｏｒ　Ｆ変異体を基に、更なるアミノ酸置換を導入し、種々のＦＤＣ三重変異体を作製した。そして、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体との併用を評価した。
　その結果、Ｆ３９７Ｙ／Ｉ３９８Ｍ変異体において４４０位のフェニルアラニンをチロシンに置換した場合、又は、Ｆ３９７Ｙ／Ｉ３９８Ｆ変異体において２８６位のメチオニンをロイシンに置換した場合、前記５倍を超えて、上記触媒活性は更に向上することも見出した（５．９倍又は６．２倍）。
　また、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ変異体において４４０位のフェニルアラニンをチロシンに置換した場合（Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ変異体）、又は、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｆ変異体において２８６位のメチオニンをロイシンに置換した場合（Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｆ／Ｍ２８６Ｌ変異体）、前記３．４倍を超えて、上記触媒活性は更に向上することも見出した（４．６倍又は４．５倍）。
　さらに、これらＦＤＣ三重変異体を基に、更なるアミノ酸置換を導入し、種々のＦＤＣ四重変異体を作製した。そして、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体との併用を評価した。
　その結果、Ｆ３９７ＹのＦＤＣ三重変異体に更なるアミノ酸置換を導入しても、前記５．９倍又は６．２倍を超えることはなかった。
　一方、Ｆ３９７ＷのＦＤＣ三重変異体に関しては、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｆ／Ｍ２８６Ｌ変異体において、１８９位のイソロイシンをメチオニンに置換した場合、又は、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ変異体において、２８６位のメチオニンをロイシンに置換した場合、前記４．６倍又は４．５倍を超えて、上記触媒活性は更に向上した（５．６倍又は５．９倍）。
　さらにまた、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ変異体において、１８９位のイソロイシンをトリプトファン又はメチオニンに置換した結果、上記触媒活性は、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体のみを用いた場合と比較して、約７倍以上にも向上することを明らかにした（７．３倍又は８．３倍）。すなわち、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体の単独使用でも、野生型と比して７５．１倍であるため、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ／Ｉ１８９Ｗ変異体と併用した場合の前記触媒活性は、野生型と比して約５４８倍まで向上し、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ／Ｉ１８９Ｍ変異体と併用した場合の前記触媒活性は、野生型と比して約６２３倍まで向上することが、明らかになった。
　このように、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体と併用することによって、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性が、野生型と比して約５００倍以上も向上できる、更なるＦＤＣ変異体の作製に成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の態様を提供する。
　［１］　下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のフェルラ酸デカルボキシラーゼと、下記（ｃ）に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼとの組み合わせ
（ａ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
（ｂ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
（ｃ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がヒスチジンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がグルタミンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
［式（２）及び（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
　［２］　［１］に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせをコードするＤＮＡ。
　［３］　［１］に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせをコードするＤＮＡを含むベクター。
　［４］　［１］に記載の（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞と、［１］の（ｃ）に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞との組み合わせ。
　［５］　［１］に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞。
　［６］　［１］に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせの存在下、下記式（１）で表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物又はその幾何異性体を脱炭酸させる工程を含む、下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体の製造方法
［式（１）～（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
　［７］　［４］に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞及び／又はその培養物において生成された下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を採取する工程を含む、不飽和炭化水素化合物の製造方法
［式（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
　［８］　［５］に記載の宿主細胞の組み合わせを培養し、該宿主細胞の組み合わせ及び／又はその培養物において生成された前記記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を採取する工程を含む、不飽和炭化水素化合物の製造方法。
　［９］　［１］に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせ、当該組み合わせをコードするＤＮＡ、又は、当該ＤＮＡを含むベクターを含む、下記式（１）で表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物又はその幾何異性体を脱炭酸させ、下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体の生成を促進するための剤
［式（１）～（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
　［１０］　下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のフェルラ酸デカルボキシラーゼ
（ａ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
（ｂ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
［式（２）及び（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
　［１１］　［１０］に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ。
　［１２］　［１０］に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを含むベクター。
　［１３］　［１０］に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞。
　［１４］　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がヒスチジンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がグルタミンであり、かつ前記触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、当該フェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ、又は、当該ＤＮＡを含むベクターと組み合わせて用いられることを特徴とする、
　［１０］に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼ、［１１］に記載のＤＮＡ、又は、［１２］に記載のベクターを含む、下記式（１）で表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物又はその幾何異性体を脱炭酸させ、下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体の生成を促進するための剤
［式（１）～（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
　本発明によれば、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物を高い生産性にて製造することを可能とする酵素、並びに当該酵素を用いた不飽和炭化水素化合物の製造方法を提供することが可能となる。
　＜フェルラ酸デカルボキシラーゼ＞
　後述の実施例において示すように、（ａ）３９７位がトリプトファンであり、３９８位がメチオニンであり、４４０位がチロシンであり、１８９位がメチオニンである、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、又は、（ｂ）３９７位がトリプトファンであり、３９８位がメチオニンであり、４４０位がチロシンであり、１８９位がトリプトファンである、フェルラ酸デカルボキシラーゼと、（ｃ）３９７位がヒスチジンであり、３９８位がグルタミンである、フェルラ酸デカルボキシラーゼとを併用することによって、前記（ｃ）に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼを単独にて用いた場合と比較して、下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する下記反応を促進する触媒活性（以下、単に「不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性」とも称する）が高いということが明らかとなった。
　したがって、本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のフェルラ酸デカルボキシラーゼと、下記（ｃ）に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼとの組み合わせに関する。
（ａ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
（ｂ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
（ｃ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がヒスチジンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がグルタミンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ。
　なお、本発明において、「対応する部位」とは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を利用し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と整列させた際に、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における３９８位のイソロイシン等と同列になる部位のことである。
　「フェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）」とは通常、ＥＣ番号：４．１．１．１０２として登録されている酵素であり、フェルラ酸を脱炭酸して４－ビニルグアイヤコール（４ＶＧ）を生成する下記反応を、触媒する酵素を意味する。
　しかしながら、本発明において、ＦＤＣは、後述の実施例に示すとおり、３９７位及び３９８位等が各々特定のアミノ酸であることによって、上記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性も有する。なお、かかる不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性については、例えば、後述の実施例に示すとおり、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）にて、不飽和炭化水素化合物の量を直接測定することにより評価することができる。
　本発明のＦＤＣは、上記のとおり、前記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のＦＤＣと、前記（ｃ）に記載のＦＤＣとの組み合わせの態様に関し、前記（ｃ）に記載のＦＤＣと比較して高い不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性を奏せる。ここで「高い」とは、好ましくは前記（ｃ）に記載のＦＤＣと比較して３倍以上であり、より好ましくは４倍以上であり、さらに好ましくは５倍以上、より好ましくは６倍以上、さらに好ましくは７倍以上、より好ましくは８倍以上である。また、野生型のＦＤＣ（例えば、後述の配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）の不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性と比較して、本発明のＦＤＣのそれは、好ましくは２００倍以上であり、より好ましくは３００倍以上、さらに好ましくは４００倍以上、より好ましくは５００倍以上、さらに好ましくは６００倍以上である。
　かかる触媒活性も有する本発明のＦＤＣは、後述の実施例において示すような、３９７位等のアミノ酸が人工的にトリプトファン又はヒスチジン等に置換されたフェルラ酸デカルボキシラーゼ（以下、単に「フェルラ酸デカルボキシラーゼ変異体」又は「フェルラ酸デカルボキシラーゼ改変体」とも称する）のみならず、３９７位等のアミノ酸がトリプトファン又はヒスチジン等である、天然に存在するフェルラ酸デカルボキシラーゼ（以下、「フェルラ酸デカルボキシラーゼ相同体」又は「フェルラ酸デカルボキシラーゼ天然変異体」とも称する）を含むものである。
　本発明のＦＤＣは、その由来（例えば、サッカロミケス）等について、特に制限されるものではないが、好ましくは、サッカロミケス　セレビシエ由来のＦＤＣ（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）との同一性が、８０％以上（例えば、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上）であるアミノ酸配列を含むタンパク質が好ましく、８５％以上（例えば、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上）であるアミノ酸配列を含むタンパク質がより好ましく、９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上）であるアミノ酸配列を含むタンパク質がさらに好ましく、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であるアミノ酸配列を含むタンパク質がより好ましい。なお、本発明において「同一性」とは、前記サッカロミケス由来ＦＤＣのアミノ酸総数に対する、当該ＦＤＣと配列番号：２に記載のアミノ酸配列と一致したアミノ酸数の割合（％）を意味する。
　本発明のＦＤＣはまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の３９７位及び３９８位（（ａ）及び（ｂ）については、さらに４４０位及び１８９位）以外の部位において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む、タンパク質であってもよい。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２～１００個、好ましくは２～５０個、より好ましくは２～４０個、さらに好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、さらに好ましくは２～１０個（例えば、２～８個、２～４個、２個）である。
　本発明のＦＤＣは、他の化合物が直接又は間接的に付加されていてもよい。かかる付加としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの付加であってもよく、化学的な付加であってもよい。また付加される部位についても特に制限はなく、本発明のＦＤＣのアミノ末端（以下「Ｎ末端」とも称する）及びカルボキシル末端（以下「Ｃ末端」とも称する）のいずれかであってもよく、その両方であってもよい。遺伝子レベルでの付加は、本発明のＦＤＣをコードするＤＮＡに、他のタンパク質をコードするＤＮＡを読み枠を合わせて付加させたものを用いることにより達成される。このようにして付加される「他のタンパク質」としては特に制限はなく、本発明のＦＤＣの精製を容易にする目的の場合には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ－）タグ（ｔａｇ）タンパク質、ＦＬＡＧ－タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の精製用タグタンパク質が好適に用いられ、また本発明のＦＤＣの検出を容易にする目的の場合には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質等の検出用タグタンパク質が好適に用いられる。化学的な付加は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシル基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエーテル結合が挙げられる。「非共有結合」としては、例えば、ビオチン－アビジン間結合が挙げられる。また、このようにして化学的に付加される「他の化合物」としては、本発明のＦＤＣの検出を容易にする目的の場合には、例えば、Ｃｙ３、ローダミン等の蛍光色素が好適に用いられる。
　また、本発明のＦＤＣは、他の成分と混合して用いてもよい。他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、保存剤が挙げられる。
　＜ＦＤＣをコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡを有するベクター＞
　本発明のＦＤＣをコードするＤＮＡ等について説明する。かかるＤＮＡを導入することによって、宿主細胞の形質を転換し、本発明のＦＤＣを当該細胞において製造させること、ひいては不飽和炭化水素化合物を製造させることが可能となる。
　本発明のＤＮＡは、上述の本発明のＦＤＣをコードする限り、天然のＤＮＡに変異が導入されたＤＮＡであってもよく、人工的に設計されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡであってもよい。さらに、その形態について特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。これらＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、サッカロミケスからゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作製し、これを展開して、ＦＤＣ遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、ＦＤＣ遺伝子に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、サッカロミケスから抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、またＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。そして、このように調製したＤＮＡに、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の３９７位又は該部位に対応するアミノ酸等をトリプトファン又はヒスチジンに置換する変異等を導入することは、当業者であれば、公知の部異特異的変異導入法を利用することで行うことができる。部異特異的変異導入法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、１９８５年、８２巻、２号、４８８～４９２ページ）、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｂｙ－ｏｖｅｒｌａｐ－ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ　Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．、Ｇｅｎｅ、１９８９年、７７巻、５１～５９ページ）が挙げられる。また、当業者であれば、ＦＤＣの３９７位又は該部位に対応するアミノ等をトリプトファン又はヒスチジンに置換してあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を人工的に設計し、該配列情報に基づき、自動核酸合成機を用いて、本発明のＤＮＡを化学的に合成することもできる。
　さらに、本発明のＤＮＡは、コードするＦＤＣの発現効率を宿主細胞においてより向上させるという観点から、当該宿主細胞の種類に合わせて、コドンを最適化した本発明のＦＤＣをコードするＤＮＡの態様もとり得る。
　また、本発明においては、前述のＤＮＡを宿主細胞内において複製することができるよう、当該ＤＮＡが挿入されているベクターの態様もとり得る。本発明において「ベクター」は、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
　このようなベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージＤＮＡが挙げられる。また、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ２２、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）が挙げられる。ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、宿主細胞が昆虫由来であれば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを、植物由来であればＴ－ＤＮＡ等、動物由来であればレトロウイルス、アデノウイルスベクター等の動物ウイルスベクターも、本発明のベクターとして用いることもできる。また、本発明のベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。例えば、本発明のＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
　本発明のベクターは、前記ＤＮＡがコードするＦＤＣを宿主細胞内にて発現可能な状態で含んでなる発現ベクターの形態であってもよい。本発明の「発現ベクター」は、これを宿主細胞に導入して本発明のＦＤＣを発現させるために、前記ＤＮＡの他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換された宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）及びターミネーター等がこれに含まれる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、前記発現を制御するＤＮＡ配列以外に発現を誘導するＤＮＡ配列を含んでいてもよい。かかる発現を誘導するＤＮＡ配列としては、宿主細胞が細菌である場合には、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。本発明における遺伝子マーカーは、形質転換された宿主細胞の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
　また、本発明においては、上記のとおり、複数種のＦＤＣを組み合わせて用いるが、これらＦＤＣは各々１のベクターにコードされていてもよく、また複数のＦＤＣが１のベクターにコードされていてもよい。１のベクターが複数のＦＤＣをコードする場合、例えば、ＩＲＥＳ、２Ａペプチド配列をコードするＤＮＡ等を用いることにより、これら複数のＦＤＣをポリシストロニックに発現させることが可能となる。
　また、本発明のＤＮＡ又はベクターは、他の成分と混合して用いてもよい。他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられる。
　＜本発明のＤＮＡ等が導入された宿主細胞＞
　本発明のＤＮＡ又はベクターが導入された宿主細胞について説明する。上述のＤＮＡ又はベクターの導入によって形質転換された宿主細胞を用いれば、本発明のＦＤＣを製造することが可能となり、ひいては上記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を製造させることも可能となる。
　本発明のＤＮＡ又はベクターが導入される宿主細胞は特に限定されず、例えば、微生物（大腸菌、出芽酵母、分裂酵母、枯草菌、放線菌、糸状菌等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞が挙げられるが、比較的安価な培地にて、短時間にて高い増殖性を示し、ひいては生産性が高い、上記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体の製造に寄与し得るという観点から、微生物を宿主細胞として利用することが好ましく、大腸菌を利用することがより好ましい。
　また、本発明のＤＮＡ又はベクターが導入される宿主細胞は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のプレニル化を誘導し、上記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体の生産性向上に寄与するｐｒＦＭＮ又はそのアイソマーを産生するという観点から、フラビンプレニルトランスフェラーゼを保持する細胞であることが好ましい。
　また、本発明のＤＮＡ又はベクターが導入される宿主細胞は、ブタジエンの製造においては、本発明のＦＤＣの基質となるムコン酸を、グルコースを原料として生成し易いという観点から、グルコースから３－デヒドロシキミ酸及びカテコールを介してムコン酸を生合成する経路が活性化されている細胞が好ましい。かかる細胞としては、例えば、ホスホトランスフェラーゼ系酵素及びピルビン酸キナーゼの活性が抑制され、かつコリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素を有する細胞（例えば、国際公開２０１７／０３３９６５に記載の微生物）、Ｋｒｕｙｅｒ　ＮＳら、Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７年、Ｊｕｎ；４５：１３６～１４３ページに記載の大腸菌、シュードモナス・プチダ又は出芽酵母が挙げられる。
　本発明のＤＮＡ又はベクターの導入も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。例えば、大腸菌等の微生物への導入方法としては、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられ、植物細胞への導入方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法やパーティクルガン法が挙げられ、昆虫細胞への導入方法としては、バキュロウィルスを用いる方法やエレクトロポレーション法が挙げられ、動物細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられる。
　このようにして宿主細胞内に導入されたＤＮＡ等は、宿主細胞内において、そのゲノムＤＮＡにランダムに挿入されることによって保持されてもよく、相同組み換えによって保持されてもよく、またベクターであれば、そのゲノムＤＮＡ外の独立体として複製され保持し得る。
　＜不飽和炭化水素化合物の製造方法　１＞
　上述のとおり、本発明のＦＤＣは、高い不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性を有する。したがって、本発明のＦＤＣの存在下、下記式（１）で表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物又はその幾何異性体を脱炭酸させる工程を含む、下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体の製造方法を提供する。
　本発明において、前記反応によって生成される「不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体」は、前記式（３）に示すとおり、炭素間二重結合を少なくとも１つ有する炭化水素化合物を意味し、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基が導入されているものであってもよい。このような化合物としては、例えば、ブタジエン（１，３－ブタジエン）、２，４－ペンタジエン酸、イソクロトン酸、３－メチルイソクロトン酸、３－ペンテン酸、１０－ウンデセン酸が挙げられる。
　本発明において、不飽和炭化水素化合物生成の原料となる「不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物又はその幾何異性体」は、前記式（１）に示すとおり、炭素間二重結合を少なくとも１つ有し、かつカルボキシル基を少なくとも２つ有する炭化水素化合物を意味し、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基が導入されているものであってもよい。このような化合物としては、例えば、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ－ムコン酸、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ－ムコン酸、グルタコン酸、２－メチルグルタコン酸、３－メチルグルタコン酸、トラウマチン酸が挙げられる。
　このような前記式（１）で表される化合物、並びにそれらの幾何異性体は、後述の実施例において示すように、市販の製品として購入することができる。また、当業者であれば、公知の合成方法（例えば、Ｋｉｙｏｓｈｉ　Ｋｕｄｏら、石油学会誌、１９９４年０７月１３日発行、３８巻、１号、４８～５１ページに記載の方法）を適宜参酌しながら、合成することもできる。
　前記式（１）～（３）で表される化合物、並びにそれらの幾何異性体における「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。
　「炭素数１～５の直鎖状又は分枝状のアルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｉ－ペンチル基が挙げられる。
　「炭素数１～５の直鎖状又は分枝状のアルコキシ基」としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｉ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｉ－ブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ｉ－ペンチルオキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、１，２－ジメチル－プロポキシ基が挙げられる。
　また、前記式（１）～（３）で表される化合物、並びにそれらの幾何異性体における「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示す。なお、「置換されていてもよい炭素数０の直鎖状炭化水素基」とは、前記式（１）～（３）で表される化合物、並びにそれらの幾何異性体において「Ａ」を介して結合している炭素原子どうしが、「Ａ」を介さずに直接結合していることを意味する。さらに、置換されていてもよい直鎖状炭化水素基の炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を少なくとも１つ形成してもよい。また、「Ａ」において炭化水素基が有していてもよい置換基とは、例えば、炭素数１～５の直鎖状又は分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状又は分枝状のアルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基が挙げられる。
　本発明のＦＤＣの存在下、不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物を脱炭酸させる条件については、当該脱炭酸が促進され、不飽和炭化水素化合物が生成される条件であればよく、当業者であれば、反応液の組成、反応液のｐＨ、反応温度、反応時間等を適宜調整し、設定することができる。
　例えば、本発明のＦＤＣと、その基質である不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物が添加される反応液としては、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、好ましくはｐＨ６～８の緩衝液が挙げられ、より好ましくはｐＨ６～７の塩化カリウム及びリン酸ナトリウムを含む緩衝液が挙げられる。さらに、前記反応をより促進し易くなるという観点から、プレニル化されたフラビンモノヌクレオチド（ｐｒＦＭＮ）又はそのアイソマー（ｐｒＦＭＮｋｅｔｉｍｉｎｅ、ｐｒＦＭＮｉｍｉｎｉｕ、これらｐｒＦＭＮ及びそのアイソマーについては、非特許文献１参照のほど）が含まれていることが好ましい。
　本発明の製造方法において用いられるＦＤＣの比率としては、特に制限はないが、上記（ｃ）に記載のＦＤＣに対し、モル比率にて、上記（ａ）に記載のＦＤＣ及び／又は上記（ｂ）に記載のＦＤＣは、通常０．１～１０ｍｏｌ／ｍｏｌであり、好ましくは０．５～５ｍｏｌ／ｍｏｌであり、より好ましくは１～２ｍｏｌ／ｍｏｌである。
　反応温度としても、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、通常２０～４０℃であり、好ましくは２５～３７℃である。さらに、反応時間としては、前記不飽和炭化水素化合物が生成し得る時間であればよく、特に制限はないが、通常３０分～７日であり、好ましくは１２時間～２日である。
　また、このような条件にて生成される前記不飽和炭化水素化合物は、大概気化し易いため、揮発性ガスの公知の回収、精製方法により採取することができる。かかる採取方法としては、ガスストリッピング、分留、吸着、脱着、パーベーパレーション、固相に吸着させたイソプレンの熱若しくは真空による固相からの脱着、溶媒による抽出、又はクロマトグラフィー（例えば、ガスクロマトグラフィー）等が挙げられる。また、生成されるオレフィン化合物が液体である場合にも、公知の回収、精製方法（蒸留、クロマトグラフィー等）を適宜利用し、採取することができる。さらに、これらの方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
　＜不飽和炭化水素化合物の製造方法　２＞
　上述のとおり、本発明のＦＤＣを発現するように形質転換された宿主細胞を、培養することにより、不飽和炭化水素化合物を生産性高く製造することができる。したがって、本発明においては、本発明のＦＤＣをコードするＤＮＡ又はベクターが導入された宿主細胞を培養し、該宿主細胞及び／又はその培養物において生成された上記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を採取する工程を含む、不飽和炭化水素化合物の製造方法も提供される。
　「本発明のＦＤＣをコードするＤＮＡ又はベクターが導入された宿主細胞」については、上述のとおりであり、例えば、後述の実施例に示すように、上記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のＦＤＣをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞と、上記（ｃ）に記載のＦＤＣをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞との組み合わせが挙げられる。かかる組み合わせ（共培養）において、これら宿主細胞数の比率としては、上記（ｃ）に記載のＦＤＣをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞数を１とした場合、上記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のＦＤＣをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞数は、通常０．１～１０であり、好ましくは０．５～５であり、より好ましくは１～２である。
　また、本発明の製造方法における宿主細胞の培養は、前記共培養に限らず、上記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のＦＤＣをコードするＤＮＡと、上記（ｃ）に記載のＦＤＣをコードするＤＮＡとが導入された宿主細胞の単独培養であってもよい。かかる場合、当該宿主細胞において導入されるＤＮＡ（又はベクター）の比率としては、特に制限はないが、上記（ｃ）に記載のＦＤＣをコードするＤＮＡに対し、モル比率にて、上記（ａ）に記載のＦＤＣをコードするＤＮＡ及び／又は上記（ｂ）に記載のＦＤＣをコードするＤＮＡは、通常０．１～１０ｍｏｌ／ｍｏｌであり、好ましくは０．５～５ｍｏｌ／ｍｏｌであり、より好ましくは１～２ｍｏｌ／ｍｏｌである。
　また、かかる細胞の培養条件については、後述のとおりであるが、培地には、本発明にかかるデカルボキシラーゼの基質である上記式（１）にて表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物、又はそれらの幾何異性体が添加されていることが好ましい。培養温度は、用いる宿主細胞の種類に合わせて適宜設計変更し得るが、通常２０～４０℃であり、好ましくは２５～３７℃である。
　本発明において、「培養物」とは、宿主細胞を培地で培養することによって得られる、増殖した宿主細胞、該宿主細胞の分泌産物及び該宿主細胞の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。
　このような宿主細胞及び／又は培養物からの不飽和炭化水素化合物の採取についても、特に制限はなく、上述の公知の回収、精製方法を用いて行うことができる。また、採取の時期としては、用いる宿主細胞の種類に合わせて適宜調整され、不飽和炭化水素化合物が生成し得る時間であればよいが、通常３０分～７日であり、好ましくは１２時間～２日である。
　＜不飽和炭化水素化合物の生成を促進するための剤＞
　上述の通り、本発明のＦＤＣ、該ＦＤＣをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを用いることにより、上記式（１）で表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物、又はそれらの幾何異性体を脱炭酸させ、上記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体の生成を促進することが可能となる。
　したがって、本発明は、本発明のＦＤＣ、該ＦＤＣをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含む、上記式（１）で表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物若しくはその幾何異性体を脱炭酸させ、上記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物若しくはその幾何異性体の生成を促進するための剤を提供する。
　このような剤としては、本発明のＦＤＣ等を含むものであればよいが、他の成分と混合していても用いてもよい。かかる他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられる。
　また、本発明は、このような剤を含むキットをも提供することができる。本発明のキットにおいて、上記剤は、本発明のＤＮＡ等が導入され形質転換された、上述の宿主細胞の態様にて含まれていてもよい。さらに、このような剤の他、上記式（１）で表される化合物、又はそれらの幾何異性体、本発明にかかるＤＮＡ等を導入するための宿主細胞、該宿主細胞を培養するための培地、及びそれらの使用説明書等が、本発明のキットに含まれていてもよい。また、このような使用説明書は、本発明の剤等を上述の不飽和炭化水素化合物の製造方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の製造方法の実験手法や実験条件、及び本発明の剤等に関する情報（例えば、ベクターのヌクレオチド配列等が示されているベクターマップ等の情報、本発明のＦＤＣの配列情報、宿主細胞の由来、性質、当該宿主細胞の培養条件等の情報）を含むことができる。
　＜本発明のＦＤＣの製造方法＞
　後述の実施例に示すとおり、本発明のＦＤＣをコードするＤＮＡ等が導入された宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞内にて当該ＦＤＣを製造することができる。
　したがって、本発明は、本発明のＦＤＣをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、本発明のＦＤＣの製造方法をも提供することができる。
　本発明において、「宿主細胞を培養する」条件は、前記宿主細胞が本発明のＦＤＣを製造できる条件であればよく、当業者であれば、宿主細胞の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養温度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。
　かかる培地としては、宿主細胞が資化し得るものが含有されていればよく、炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類、金属、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、血清等が含有物として挙げられる。また、かかる培地には、例えば、本発明のＦＤＣをコードするＤＮＡの発現を誘導するためのＩＰＴＧや、本発明のベクターがコードし得る薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（例えば、アンピシリン）や、本発明のベクターがコードし得る栄養要求性を相補する遺伝子に対応する栄養物（例えば、アルギニン、ヒスチジン）を添加してもよい。
　そして、このようにして培養した宿主細胞から、「該細胞に発現したタンパク質を採取する」方法としては、例えば、宿主細胞を濾過、遠心分離等により培地から回収し、回収した宿主細胞を、細胞溶解、磨砕処理又は加圧破砕等によって処理し、さらに、限外濾過処理、塩析、硫安沈殿等の溶媒沈殿、クロマトグラフィー（例えば、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）等によって、宿主細胞において発現したタンパク質を精製、濃縮する方法が挙げられる。また、本発明のＦＤＣに、前述の精製タグタンパク質が付加されている場合には、該タグタンパク質が吸着する基質を用いて精製し、採取することもできる。さらに、これらの精製、濃縮方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
　また、本発明のＦＤＣは、上記生物学的合成に限定されることなく、本発明のＤＮＡ等及び無細胞タンパク質合成系を用いても製造することができる。かかる無細胞タンパク質合成系としては特に制限はないが、例えば、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来の合成系が挙げられる。さらに、当業者であれば、市販のペプチド合成機等を用い、本発明のＦＤＣを化学的に合成することもできる。
　以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、後述の実施例に示すとおり、上記（ｃ）の記載のＦＤＣと併用することによって、不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性が３倍以上向上することが可能な、上記（ａ）及び（ｂ）に記載のＦＤＣ以外のＦＤＣ変異体をも明らかにしている。よって、本発明においては、上記（ａ）及び（ｂ）のみならず、以下に示す（ｄ）～（ｍ）も加え、これらから選択される少なくとも１のＦＤＣも用いられ得る。
（ｄ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、
（ｅ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、
（ｆ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がフェニルアラニンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、
（ｇ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がフェニルアラニンであり、２８６位又は該部位に対応するアミノ酸がロイシンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、
（ｈ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、
（ｉ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、
（ｊ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がフェニルアラニンであり、２８６位又は該部位に対応するアミノ酸がロイシンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、
（ｋ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がフェニルアラニンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、
（ｌ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がフェニルアラニンであり、２８６位又は該部位に対応するアミノ酸がロイシンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、
（ｍ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がフェニルアラニンであり、２８６位又は該部位に対応するアミノ酸がロイシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、かつ前記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　本発明者らは、特許文献１及び２に示すとおり、フェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）にアミノ酸置換を伴う変異を導入することによって、ムコン酸を基質とするブタジエンの生成に関する触媒活性が向上することを見出している。特に、サッカロミケス　セレビシエ由来野生型ＦＤＣ（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）において、３９８位のイソロイシンをグルタミンに置換し、３９７位のフェニルアラニンをヒスチジンに置換すること（Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体）によって、野生型と比して、前記触媒活性は７５．１倍も向上することを、本発明者らは明らかにしている。
　そこで今回、本発明者らは、かかるＦＤＣ変異体を用いたブタジエン等の不飽和炭化水素化合物の生産性をより向上させることを試み、以下に示すとおり、ＦＤＣのアミノ酸置換変異体を種々作製し、これら変異体とＦ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体とを併用した際の前記触媒活性を評価した。
　＜プラスミドベクターの調製＞
　先ず、サッカロミケス　セレビシエ由来の野生型ＦＤＣを、大腸菌にて効率良く発現させるために、それをコードする野生型ヌクレオチド配列のＣ末端にポリヒスチジンタグを融合させた形態にて、大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して改変した（配列改変後のヌクレオチド配列を、配列番号：３に示す）。
　次いで、かかる改変ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを常法に沿って化学合成した。そして、このようにして調製したＤＮＡとｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社のキットＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（登録商標）を使用）により連結することによって、前記野生型のＦＤＣを、大腸菌において発現可能なプラスミドベクター（野生型ＦＤＣベクター）を調製した。
　さらに、このようにして得られた野生型ＦＤＣベクターを鋳型として、各種アミノ酸置換が導入されたＦＤＣをコードするベクターを作製した。具体的には、各変異が導入されたアミノ酸配列をコードするプライマーを設計し、合成した。そして、前記野生型ＦＤＣベクターを鋳型として、前記プライマーを用い、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法のプロトコールに従って、各変異が導入されたＦＤＣを、ポリヒスチジンタグをそのＣ末端に融合させた形態にて、大腸菌において発現可能なプラスミドベクター（ＦＤＣ変異体ベクター）を調製した。
　また同様にして、大腸菌（Ｋ－１２）株からフラビンプレニルトランスフェラーゼ（以下「ＵｂｉＸ」とも称する）をコードする遺伝子（配列番号：５）をＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法により増幅したＤＮＡとｐＣｏｌＡＤｕｅｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法により連結することにより、当該野生型のＵｂｉＸを大腸菌において発現可能なプラスミドベクター（ＵｂｉＸベクター）を調製した。
　＜酵素反応溶液の調製及び酵素活性の測定＞
　前記のとおり調製したベクター（５μｇのＦ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体ベクター又は５μｇの他のＦＤＣ変異体ベクターと、５μｇのＵｂｉＸベクター）を、大腸菌Ｃ４１（ＤＥ３）株（Ｌｕｃｉｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、１００μＬ）に、ヒートショック法により導入し、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体及びＵｂｉＸを共発現する形質転換体（以下、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体発現大腸菌とも称する）と、他のＦＤＣ変異体及びＵｂｉＸを共発現する形質転換体（以下、他のＦＤＣ変異体発現大腸菌とも称する）とを調製した。
　そして、これら形質転換体を各々、アンピシリン及びカナマイシンを添加したＬＢ培地にて６時間培養した。なお、かかる６時間の培養（前培養）により、これら形質転換体の増殖は頭打ちとなる。そのため、後述の酵素反応開始時点での菌体量は、これら形質転換体間において均一となる。
　また、ＴＢ培地（１２ｇ／Ｌ　トリプトン、２４ｇ／Ｌ　イーストエクストラクト、１０ｇ／Ｌ　グリセロール、９．４ｇ／Ｌ　リン酸水素二カリウム、２．２ｇ／Ｌ　リン酸二水素カリウム、１００ｍｇ／Ｌ　アンピシリン及び５０ｍｇ／Ｌ　カナマイシン）に、ラクトースを終濃度２０ｇ／Ｌを添加し、基質であるｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸（シグマアルドリッチ社製）を終濃度５ｇ／Ｌとなるよう更に添加し、酵素反応用培地を調製した。
　そして、ヘッドスペース型ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＨＳ／ＧＳＭＳ）用の１０ｍＬバイアルに、前記６時間培養した、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体発現大腸菌の培養液１００μＬ、又は、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体発現大腸菌の培養液　５０μＬ及び他のＦＤＣ変異体発現大腸菌の培養液　５０μＬを、前記酵素反応用培地１ｍＬに添加し、その直後にバイアルのキャップを閉め、３７℃、振盪速度１８０ｒｐｍにて更に培養した。当該培養を開始してから１８時間後にバイアルのヘッドスペース中に生成されたブタジエン（１，３－ブタジエン）量を表すピーク面積を、ＧＣ－ＭＳ（製品名：ＧＣＭＳ－ＱＰ　Ｕｌｔｒａ、島津製作所社製）によって測定した。そして、得られた測定値に基づき、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体発現大腸菌と他のＦＤＣ変異体発現大腸菌との共培養におけるブタジエン生成量を、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体発現大腸菌の単独培養におけるそれと比較した。
　（実施例１）　ＦＤＣの一重変異体又は二重変異体との併用
　先ず、ＦＤＣの一重変異体又は二重変異体を種々作製し、これら変異体とＦ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体とを併用（前記のように共培養）した際のブタジエン生成量を評価した。得られた結果を表１に示す。なお、表中の数値は、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体発現大腸菌の単独培養におけるブタジエン生成量を１とした際の各共培養におけるそれの比率を表す（下記表２及び３においても同様）。
　その結果、３９７位のフェニルアラニンをチロシンに置換し、３９８位のイソロイシンをメチオニン又はフェニルアラニンに置換した、ＦＤＣ二重変異体（Ｆ３９７Ｙ／Ｉ３９８Ｍ　ｏｒ　Ｆ）と併用した場合、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体のみを用いた場合と比較して、ブタジエン生成量は５．０倍に向上することを見出した。また、３９７位のフェニルアラニンをトリプトファンに置換し、３９８位のイソロイシンをメチオニン又はフェニルアラニンに置換した、ＦＤＣ二重変異体（Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ　ｏｒ　Ｆ）と併用した場合、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体のみを用いた場合と比較して、ブタジエン生成量は３．４倍に向上することも見出した。
　（実施例２）　ＦＤＣの三重変異体との併用
　さらに、Ｆ３９７Ｙ／Ｉ３９８Ｍ　ｏｒ　Ｆ変異体及びＦ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ　ｏｒ　Ｆ変異体を基に、更なるアミノ酸置換を導入し、種々のＦＤＣ三重変異体を作製した。そして、上記のように共培養を行い、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体との併用について評価した。得られた結果を表２に示す。
　その結果、Ｆ３９７Ｙ／Ｉ３９８Ｍ変異体において４４０位のフェニルアラニンをチロシンに置換した場合、又は、Ｆ３９７Ｙ／Ｉ３９８Ｆ変異体において２８６位のメチオニンをロイシンに置換した場合、実施例１にて示した上記５倍を超えて、ブタジエン生成量は更に向上することも見出した（５．９倍又は６．２倍）。
　また、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ変異体において４４０位のフェニルアラニンをチロシンに置換した場合（Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ変異体）、又は、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｆ変異体において２８６位のメチオニンをロイシンに置換した場合（Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｆ／Ｍ２８６Ｌ変異体）、実施例１にて示した上記３．４倍を超えて、ブタジエン生成量は更に向上することも見出した（４．６倍又は４．５倍）。
　（実施例３）　ＦＤＣの四重変異体との併用
　さらに、これらＦＤＣ三重変異体を基に、更なるアミノ酸置換を導入し、種々のＦＤＣ四重変異体を作製した。そして、上記のように共培養を行い、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体との併用について評価した。得られた結果を表３に示す。
　その結果、Ｆ３９７ＹのＦＤＣ三重変異体に更なるアミノ酸置換を導入しても、実施例２にて示した上記５．９倍又は６．２倍を超えることはなかった。
　一方、Ｆ３９７ＷのＦＤＣ三重変異体に関しては、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｆ／Ｍ２８６Ｌ変異体において、１８９位のイソロイシンをメチオニンに置換した場合、又は、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ変異体において、２８６位のメチオニンをロイシンに置換した場合、実施例２にて示した上記４．６倍又は４．５倍を超えて、ブタジエン生成量は更に向上した（５．６倍又は５．９倍）。
　さらにまた、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ変異体において、１８９位のイソロイシンをトリプトファン又はメチオニンに置換した結果、ブタジエン生成量は、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体のみを用いた場合と比較して、約７倍以上にも向上した（７．３倍又は８．３倍）。すなわち、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体の単独使用でも、野生型と比して７５．１倍であるため、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ／Ｉ１８９Ｗ変異体と併用した場合のブタジエン生成量は、野生型と比して約５４８倍まで向上し、Ｆ３９７Ｗ／Ｉ３９８Ｍ／Ｆ４４０Ｙ／Ｉ１８９Ｍ変異体と併用した場合のブタジエン生成量は、野生型と比して約６２３倍まで向上することが、明らかになった。
　このように、Ｆ３９７Ｈ／Ｉ３９８Ｑ変異体と併用することによって、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性が、野生型と比して約５００倍以上も向上できる、更なるＦＤＣ変異体の取得に成功した。
　以上説明したように、本発明によれば、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物を高い生産性にて製造することを可能とする酵素、並びに当該酵素を用いた不飽和炭化水素化合物の製造方法を提供することが可能となる。また、本発明によれば、化学合成によらず、生合成によって不飽和炭化水素化合物を製造できるため、環境への負荷が少ない。したがって、本発明は、ブタジエンといった、合成ゴム等の様々な合成ポリマーの原料の製造において極めて有用である。

Claims (13)

  1. 　下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のフェルラ酸デカルボキシラーゼ
    と、下記（ｃ）に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼとの組み合わせ
    （ａ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
    （ｂ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
    （ｃ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がヒスチジンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がグルタミンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
    ［式（２）及び（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
  2. 　請求項１に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせをコードするＤＮＡ。
  3. 　請求項１に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせをコードするＤＮＡを含むベクター。
  4. 　請求項１に記載の（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞と、
    請求項１の（ｃ）に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞との組み合わせ。
  5. 　請求項１に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞。
  6. 　請求項１に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせの存在下、下記式（１）で表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物又はその幾何異性体を脱炭酸させる工程を含む、下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体の製造方法
    ［式（１）～（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
  7. 　請求項４に記載の宿主細胞又は請求項５に記載の宿主細胞の組み合わせを培養し、前記宿主細胞及び／又はその培養物において生成された下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を採取する工程を含む、不飽和炭化水素化合物の製造方法
    ［式（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
  8. 　請求項１に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼの組み合わせ、当該組み合わせをコードするＤＮＡ、又は、当該ＤＮＡを含むベクターを含む、下記式（１）で表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物又はその幾何異性体を脱炭酸させ、下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体の生成を促進するための剤
    ［式（１）～（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
  9. 　下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１のフェルラ酸デカルボキシラーゼ
    （ａ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
    （ｂ）　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニンであり、４４０位又は該部位に対応するアミノ酸がチロシンであり、１８９位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンであり、かつ下記式（２）若しくは（３）で表される不飽和炭化水素化合物、又はそれらの幾何異性体を生成する触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ
    ［式（２）及び（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
  10. 　請求項９に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ。
  11. 　請求項９に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを含むベクター。
  12. 　請求項９に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞。
  13. 　配列番号：２に記載のアミノ酸配列の、３９７位又は該部位に対応するアミノ酸がヒスチジンであり、３９８位又は該部位に対応するアミノ酸がグルタミンであり、かつ前記触媒活性を有する、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、当該フェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ、又は、当該ＤＮＡを含むベクターと組み合わせて用いられることを特徴とする、
    　請求項９に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼ、請求項１０に記載のＤＮＡ、又は、請求項１１に記載のベクターを含む、下記式（１）で表される不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物又はその幾何異性体を脱炭酸させ、下記式（３）で表される不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体の生成を促進するための剤
    ［式（１）～（３）中、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」及び「Ｒ４」は、各々独立に、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「Ａ」は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい］。
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WO2019022083A1 (ja) * 2017-07-24 2019-01-31 国立研究開発法人理化学研究所 デカルボキシラーゼ、及びそれを用いた不飽和炭化水素化合物の製造方法
WO2021054441A1 (ja) * 2019-09-20 2021-03-25 国立研究開発法人理化学研究所 サッカロミケス由来フェルラ酸デカルボキシラーゼ変異体、及びそれを用いた不飽和炭化水素化合物の製造方法

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YUTARO MORI: "Direct bioproduction of 1,3-butadiene by the tailor-maid ferulic acid decarboxylase mutant", JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, NIPPON SEIKAGAKKAI, TOKYO, JP, vol. 94, no. 4, 25 August 2022 (2022-08-25), JP , pages 605 - 610, XP093165741, ISSN: 0037-1017, DOI: 10.14952/seikagaku.2022.940605 *

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