JP6995315B2 - ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体、及びそれを用いたオレフィン化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
<1> 配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位又は該部位に対応するグリシンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの存在下、下記式(1)で表される化合物とATPとを反応させる工程を含む、オレフィン化合物の製造方法
<2> 配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位又は該部位に対応するグリシンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA又は該DNAを含むベクターが導入された宿主細胞を、培養し、該宿主細胞及び/又はその培養物において生成されたオレフィン化合物を採取する工程を含む、オレフィン化合物の製造方法。
<3> 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる他のアミノ酸が、システイン、ロイシン又はメチオニンである、<1>又は<2>に記載の製造方法。
<4> 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが、更に配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位又は該部位に対応するアルギニンが他のアミノ酸に変異しており、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼである、<1>~<3>のうちのいずれか一に記載の製造方法。
<5> 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが、更に配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位又は該部位に対応するアルギニンがヒスチジンに変異しており、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位又は該部位に対応するスレオニンがアルギニンに変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼである、<1>~<3>のうちのいずれか一に記載の製造方法。
<6> 前記オレフィン化合物がイソプレンである<1>~<5>のうちのいずれか一に記載の製造方法。
<7> 前記オレフィン化合物がイソブテンである<1>~<5>のうちのいずれか一に記載の製造方法。
<8> オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの製造方法であって、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位又は該部位に対応するグリシンを他のアミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
<9> 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる他のアミノ酸が、システイン、ロイシン又はメチオニンである、<8>に記載の製造方法。
<10> 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位又は該部位に対応するアルギニンを他のアミノ酸に変異させ、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位又は該部位に対応するスレオニンを他のアミノ酸に変異させる工程を更に含む、<8>又は<9>に記載の製造方法。
<11> 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位又は該部位に対応するアルギニンをヒスチジンに変異させ、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位又は該部位に対応するスレオニンをアルギニンに変異させる工程を更に含む、<8>又は<9>に記載の製造方法。
<12> 前記オレフィン化合物がイソプレンである<8>~<11>のうちのいずれか一に記載の製造方法。
<13> 前記オレフィン化合物がイソブテンである<8>~<11>のうちのいずれか一に記載の製造方法。
<14> 配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位又は該部位に対応するグリシンが他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
<15> 配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる他のアミノ酸が、システイン、ロイシン又はメチオニンである、<14>に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
<16> 更に、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位又は該部位に対応するアルギニンが他のアミノ酸に変異しており、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異している、<14>又は<15>に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
<17> 更に、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位又は該部位に対応するアルギニンがヒスチジンに変異しており、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位又は該部位に対応するスレオニンがアルギニンに変異している、<14>又は<15>に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
<18> <14>~<17>のうちのいずれか一に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA。
<19> <18>に記載のDNAを含むベクター。
<20> <18>に記載のDNA又は<19>に記載のベクターが導入された宿主細胞。
<21> <20>に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法。
<22> <14>~<17>のうちのいずれか一に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、該ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA又は該DNAが挿入されているベクターを含む、下記式(1)で表される化合物とATPとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進するための剤
<23> 前記オレフィン化合物がイソプレンである<22>に記載の剤。
<24> 前記オレフィン化合物がイソブテンである<22>に記載の剤。
後述の実施例において示すように、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの152位のグリシンを他のアミノ酸に置換することによって、オレフィン化合物を生成する下記反応を促進する触媒活性(「オレフィン化合物を生成する触媒活性」とも称する)が向上することを見出した。
また、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位又は該部位に対応するグリシンが他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを発現するように形質転換された宿主細胞を、培養することにより、オレフィン化合物を生産性高く製造することができる。したがって、本発明においては、後述のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするDNA又はベクターが導入された宿主細胞を培養し、該宿主細胞及び/又はその培養物において生成されたオレフィン化合物を採取する工程を含む、オレフィン化合物の製造方法も提供される。
次に、上述の本発明のオレフィン化合物の製造方法において用いられる、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体について説明する。本発明において「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」とは、MVD(Diphosphomevalonate decarboxylase)とも称され、またEC番号:4.1.1.33として登録されている酵素であり、5-ジホスホメバロン酸及びATPからイソペンテニル二リン酸、ADP、リン酸及び二酸化炭素を生成する、下記反応を触媒とするカルボキシリアーゼの一種である。
次に、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするDNA等について説明する。かかるDNAを導入することによって、宿主細胞の形質を転換し、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を当該細胞において製造させること、ひいてはオレフィン化合物を製造させることが可能となる。
上述の通り、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体、該変異体をコードするDNA又は該DNAが挿入されているベクターを用いることにより、下記式(1)で表される化合物とATPとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進することが可能となる。したがって、本発明は、少なくとも配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位又は該部位に対応するグリシンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、該ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA又は該DNAが挿入されているベクターを含む、下記式(1)で表される化合物とATPとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進するための剤も提供する。
次に、本発明のDNA又はベクターが導入された宿主細胞について説明する。前述のDNA又はベクターの導入によって形質転換された宿主細胞を用いれば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を製造することが可能となり、ひいてはオレフィン化合物を製造させることも可能となる。
後述の実施例に示す通り、本発明のDNA等が導入された宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞内にてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を製造することができる。したがって、本発明は、前述の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法をも提供することができる。
本発明者らは、オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とすべく、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(以下「MVD」とも称する)のアミノ酸に変異を導入し、当該酵素(ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体)の基質特異性を、元来の5-ジホスホメバロン酸から3-ヒドロキシ-3-メチルペント-4-エノテート等に対するものに変更することで、下記式に示すような反応を経て、イソプレン等を製造することを着想した。
先ず、出芽酵母由来のMVD(scMVD、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質)を大腸菌にて効率良く発現させるために、それをコードする野生型ヌクレオチド配列(配列番号:1に記載のヌクレオチド配列)を、大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して改変した。次いで、かかる改変ヌクレオチド配列(配列番号:3に記載のヌクレオチド配列)からなるDNAを常法に沿って化学合成した。そして、このようにして調製したDNAを、pET-22b(+)ベクター(Novagen社製)のマルチクローニングサイト(NdeI認識サイトとBamHI認識サイトとの間)に挿入することにより、当該野生型のscMVDを、ポリヒスチジンタグをそのN末端に融合させた形態にて、大腸菌において発現可能なプラスミドベクター(scMVDベクター)を調製した。
前記の通り調製したプラスミドベクターを各々、大腸菌(BL21)に、ヒートショック法により導入し、野生型のscMVD又は各scMVD変異体を発現する形質転換体を調製した。次いで、これら形質転換体を各々、0.4mMのIPTGとアンピシリンとを添加したLB培地にて一晩培養した。当該培養後の形質転換体を遠心分離により集菌し、DNaseIを添加したタンパク質抽出試薬(製品名:B-PER、Thermo Fisher Scientific社製)を加え、溶菌した。このようにして得られた各溶菌液に遠心分離を施し、得られた各上清をポリヒスチジン精製用カラム(製品名:TALON(登録商標)カラム、Clontech社製)に添加した。次いで、各カラムに溶出液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、300mM NaCl、150mM イミダゾール)を添加し、各ポリヒスチジンタグが融合しているscMVDを溶出させた。そして、各溶出液を緩衝液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、100mM NaCl)にて透析した後、限外ろ過スピンカラム(製品名:アミコンウルトラ、ミリポア社製)によって濃縮し、酵素溶液を調製した。また、このようにして調製した溶液中の酵素(ポリヒスチジンタグが融合している、scMVD又はその変異体)の濃度を、タンパク質定量キット(製品名:BCAアッセイキット、TaKaRa社製)を用い、添付のプロトコールに沿って測定した。
3-ヒドロキシ-3-メチルペント-4-エノテートを基質とするイソプレンの合成における、各酵素活性を測定した。
次に、本発明者らは、イソプレン生成において極めて高い触媒活性を示した前述の単独アミノ酸変異体及び三重アミノ酸変異体(G152X及びR74HG152XT209R)に関し、他のオレフィン化合物の生成でも利用できることを確認した。すなわち、β-ヒドロキシイソ吉草酸を基質とするイソブテンの合成(下記式に示す反応)における、各酵素活性を以下のようにして評価した。
<223> 大腸菌における発現のためにコドンが最適化された配列
Claims (21)
- 配列番号:2に記載のアミノ酸配列において152位のグリシンがシステイン、ロイシン若しくはメチオニンに変異しているアミノ酸配列、又は、配列番号:2に記載のアミノ酸配列において152位のグリシンが、システイン、ロイシン若しくはメチオニンに変異しており、かつ152位以外の1~40個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質であるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの存在下、下記式(1)で表される化合物とATPとを反応させる工程を含む、オレフィン化合物の製造方法
- 配列番号:2に記載のアミノ酸配列において152位のグリシンがシステイン、ロイシン若しくはメチオニンに変異しているアミノ酸配列、又は、配列番号:2に記載のアミノ酸配列において152位のグリシンが、システイン、ロイシン若しくはメチオニンに変異しており、かつ152位以外の1~40個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質であるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを、コードするDNA又は該DNAを含むベクターが導入された宿主細胞を、培養し、該宿主細胞及び/又はその培養物において生成されたオレフィン化合物を採取する工程を含む、オレフィン化合物の製造方法。
- 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位のアルギニンが他のアミノ酸に変異しており、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位のスレオニンが他のアミノ酸に変異している、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位のアルギニンがヒスチジンに変異しており、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209のスレオニンがアルギニンに変異している、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項1~4のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記オレフィン化合物がイソブテンである請求項1~4のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
- オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの製造方法であって、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の152位のグリシンをシステイン、ロイシン又はメチオニンに変異させる工程を含む、製造方法。
- 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位のアルギニンを他のアミノ酸に変異させ、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位のスレオニンを他のアミノ酸に変異させる工程を更に含む、請求項7に記載の製造方法。
- 前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位のアルギニンをヒスチジンに変異させ、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位のスレオニンをアルギニンに変異させる工程を更に含む、請求項7に記載の製造方法。
- 前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項7~9のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記オレフィン化合物がイソブテンである請求項7~9のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
- 配列番号:2に記載のアミノ酸配列において152位のグリシンがシステイン、ロイシン若しくはメチオニンに変異しているアミノ酸配列、又は、配列番号:2に記載のアミノ酸配列において152位のグリシンが、システイン、ロイシン若しくはメチオニンに変異しており、かつ152位以外の1~40個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含む、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
- 配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位のアルギニンが他のアミノ酸に変異しており、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位のスレオニンが他のアミノ酸に変異している、請求項12に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
- 配列番号:2に記載のアミノ酸配列の74位のアルギニンがヒスチジンに変異しており、かつ配列番号:2に記載のアミノ酸配列の209位のスレオニンがアルギニンに変異している、請求項12に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
- 請求項12~14のうちのいずれか一項に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA。
- 請求項15に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項15に記載のDNA又は請求項16に記載のベクターが導入された宿主細胞。
- 請求項17に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、請求項12~14のうちのいずれか一項に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの製造方法。
- 前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項19に記載の剤。
- 前記オレフィン化合物がイソブテンである請求項19に記載の剤。
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