CN117025557A - 热稳定性更高酶活更强的环氧化酶Lsd18变体及其应用 - Google Patents

热稳定性更高酶活更强的环氧化酶Lsd18变体及其应用 Download PDF

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刘宁
关钰泽
钱军怡
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Abstract

本发明提供了具有改善的热稳定性、蛋白酶抗性和/或催化活性的环氧化酶Lsd18变体以及其在Lasa l oc i d(拉沙里菌素)合成中的作用。通过提高Lsd18的热稳定性与催化活性,使其能够更好的应用于蛋白质工程中的底物筛选,有望实现天然底物类似物的绿色有机合成与工业化生物合成,为制备生物新药拓宽了途径。与野生型环氧化酶Lsd18相比,所述变体具有更强的热稳定性、蛋白酶抗性、和/或更好的酶催化活性。本申请还提供了制备所述Lsd18变体的多核苷酸、重组载体、重组细胞、含有所述变体的组合物以及所述变体的应用。

Description

热稳定性更高酶活更强的环氧化酶Lsd18变体及其应用
参考序列表
本申请包含一个计算机可读形式的序列表,将其通过引用结合在此。
技术领域
本申请为生物技术和有机化学领域,具体涉及热稳定性提高的Lsd18突变体、包含该变体的组合物、编码该变体的多核苷酸、核酸构建体、载体和宿主细胞(包含细菌、真菌、植物和动物细胞),以及生产和使用该变体和组合物的方法。
背景技术
酶高热稳定性与高催化活性一直是工业生产过程中所追求的。随着国家经济实力的逐渐增强,追求生态环境可持续发展已经成为当下热点话题,这就迫使许多化学催化逐步转向生物催化。近年来,许多生物酶被用于制药、食品、工业以及生物分析的领域,提高酶的催化活性对提高工业生产来说无疑是巨大的潜在优势。
通过理性设计、半理性设计与随机突变构建热稳定性以及高酶活效率的突变体近年来一直被作为研究蛋白质工程领域的一个热点话题。多年来,尽管诸多研究者都为热稳定蛋白工程做出了贡献,但直至目前,依旧没有提出有效的改变蛋白质热稳定性的方法。导致目前形式的原因一方面是因为对于蛋白质的结构与功能方面的研究依旧不是很透彻,另一方面由于影响蛋白质稳定性的因素诸多,导致研究过程十分复杂。
Lasalocid(拉沙里菌素)属于二价聚醚类离子载体家族,主要从链霉菌和相关的革兰氏阳性丝状细菌中分离出来。
Lsd18作为合成Lasalocid过程中的环氧化酶,对合成Lasalocid有至关重要的作用。Lsd18作为环氧化酶,对催化底物类似物环氧化时可进行立体选择性。根据实验结果表明,取代基的不同,产生的(R,R)-环氧化产物对映体的比例也不相同。因此,Lsd18可应用于得到化学合成中比较难以得到的高立体选择性的环氧化产物,对合成天然产物具有重要的意义。通过提高Lsd18的热稳定性与催化活性,使其能够更好的应用于蛋白质工程中的底物筛选,有望实现天然底物类似物的绿色有机合成与工业化生物合成,为制备生物新药拓宽了途径。
本发明通过提供表达量高、稳定高且具有高酶活效率的Lsd18突变体来解决上述挑战。
发明内容
本发明提供了下述技术方案:
1.环氧化酶Lsd18的变体,其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%,甚至更优选至少97%,甚至更优选至少99%同一性程度的氨基酸序列;
与野生型环氧化酶Lsd18相比,所述变体具有更强的热稳定性、蛋白酶抗性、与FAD的结合能力、和/或更好的酶催化活性;
其中所述环氧化酶Lsd18变体的热稳定性与野生型相比提高了至少5%,优选提高了至少7%,更优选提高了至少10%,甚至更优选提高了至少11%;
其中所述环氧化酶Lsd18变体的酶催化活性在37℃以上的温度范围与野生型相比提高了至少25%,优选提高了至少30%,更优选至少35%,更优选至少40%,更优选至少45%,更优选至少50%,更优选至少55%;
所述温度范围优选为35℃-50℃,更优选37℃-45℃,更优选37℃-40℃;
与野生型相比,从变性的所述环氧化酶Lsd18变体中提取的FAD含量分别提高了至少25%,优选提高了至少30%,优选提高了至少35%,优选提高了至少40%,更优选提高了至少45%。
2.项1的环氧化酶Lsd18的变体,其包含在选自如下组中的一个或多个位置改变:S195、N433、A78、T189、S237、R473、E139、S391、G101、P326、R21、R51、D52、V64、S108、S237、H239;其中
(1)改变是独立地
(a)在占据该位置的氨基酸下游插入氨基酸,
(b)缺失占据该位置的氨基酸,或
(c)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸;
(2)该变体具有环氧化酶活性;和
(3)各位置编号对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
3.项1-2任一项的变体,其中该突变是:
选自S195M、N433L、A78M、T189M、S237M、R473D、E139M、S391L、G101P、P326A、P326S、R21G、R51W、D52S、V64D、S108V、S237V、H239L中的一个或多个位置的氨基酸替换。
4.项1-3任一项的变体,其中该突变是:
选自N433L,S391L,A78M,T189M,S237M,R473D,S195M,E139M,T189M-S195M,R51W-D52S-V64D,S108V-S237V-H239L的突变。
5.项1-4任一项的变体,其中该突变是:
T189M,S195M,或T189M-S195M。
6.权利要求1-5任一项的变体,其中该突变是:
T189M或S195M。
7.项1-6任一项的变体,其中该突变是T189M。
8.项1-6任一项的突变,其中该突变是S195M。
9.项1-5任一项的变体,其中该突变是T189M-S195M。
10.一种多核苷酸编码序列,其编码项1-9中任一项所述环氧化酶Lsd18的变体。
11.一种核酸构建体,它含有项10所述多核苷酸编码序列。
12.一种重组表达载体,其携带根据项11的核酸构建体。
13.根据项11的核酸构建体或根据项12的载体转化的细胞。
14.根据项13的细胞,它是细菌、真菌、动物细胞或植物细胞。
15.一种组合物,它含有项1-9任一项的环氧化酶Lsd18的变体。
16.一种试剂盒,其含有项12所述重组表达载体,项13或14所述细胞,或项16所述组合物。
17.项1-9任一项所述环氧化酶Lsd18变体在合成天然产物中的应用。
18.项17所述的应用,其中所述天然产物是Lasalocid(拉沙里菌素)。
本申请的技术方案实现的有益技术效果:
采用本申请的技术方案,与野生型Lsd18环氧化酶相比,显著提高了Lsd18环氧化酶的表达量,有效提升了Lsd18环氧化酶的热稳定性和对蛋白酶的抗性,并且提高了其催化效率,弥补了Lsd18环氧化酶野生型稳定性差的不足,为Lsd18环氧化酶在天然产物合成以及投入蛋白质工程奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍。显而易见的,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些具体实施例,然而应当理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反,提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明,并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
图1是重叠PCR的基本原理。其中“F”是Forward的简写,指正向引物;“R”是Reverse的简写,指反向引物;“Fm”是Forward middle的简写,指中间的正向引物;“Rm”是Reversemiddle的简写,指中间的反向引物。
图2是Lsd18野生型与突变型蛋白SDS-PAGE检测。其中“M/kD”中的“M”是Marker的简写,是蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳中用到的蛋白质分子量标记。其中的“kD”是kilodalton的简写,是蛋白质分子量单位“千道尔顿”。
图3是Lsd18野生型及突变型蛋白表达产量。1升Lsd18野生型和突变型大肠杆菌培养物中获得的蛋白产量(P****<0.0001,P***<0.001,P**<0.01)。
图4是Lsd18蛋白酶解测试。其中“M/kD”的含义见上述对图2的解释。
图5是标准FAD荧光光谱与标准曲线。其中的“Abs[A]”是Absorbance的简写,指光吸收度或吸光度。图5A是标准FAD荧光光谱;图5B是FAD标准曲线。
图6是Lsd18野生型与稳定突变型FAD荧光光谱。其中的“Abs[A]”是Absorbance的简写,指光吸收度。
图7是Lsd18野生型与稳定突变型FAD含量。其中P****<0.0001。
图8是Lsd18催化环氧化示意图。其中图8A是Lsd18催化天然产物环氧化;图8B是Lsd18催化底物类似物环氧化。
图9是Lsd18野生型与突变型酶活结果。其中测酶活时的四种反应温度和反应时间分别是:30℃反应10h、33℃反应10h、37℃反应10h、40℃反应10h。
详细描述
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,可按常规条件,如J·萨姆布鲁克(Sambrook,2001)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是,实现本发明的方法以及本发明保护的权利要求范围不应限于本发明实例所记载的具体方法步骤。
在本说明书和权利要求书中,使用氨基酸残基的常规单字母和3字母代码。在本说明书的上下文中,20种天然氨基酸中文全称、三字母缩写及其单字母缩写的对应关系为:精氨酸:Arg,R;组氨酸:His,H;赖氨酸,Lys,K;天冬氨酸,Asp,D;谷氨酸:Glu,E;丝氨酸,Ser,S;苏氨酸,Thr,T;天冬酰胺,Asn,N;谷氨酰胺:Gln,Q;半胱氨酸,Cys,C;甘氨酸,Gly,G;脯氨酸,Pro,P;丙氨酸,Ala,A;异亮氨酸,Ile,I;缬氨酸,Vla,V;亮氨酸,Leu,L;甲硫氨酸,Met,M;苯丙氨酸,Phe,F;酪氨酸,Tyr,Y;色氨酸,Trp,W。
氨基酸残基的特性:非极性氨基酸:Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Met,Trp;极性中性氨基酸(不带电荷):Tyr,Cys,Asn,Gln,Ser,Thr,Gly;带负电荷的氨基酸(含酸性R基的氨基酸):Asp,Glu;带正电荷的氨基酸(含碱性R基的氨基酸):Arg,Lys,His。
为了便于参照,本发明的环氧化酶Lsd18变体使用如下命名法描述:原始氨基酸:位置:取代氨基酸。根据该命名法,例如在第195位丝氨酸被用甲硫氨酸取代,表示为:Ser195Met或S195M;
在相同位置缺失丝氨酸表示为:Ser195*或S195*;
插入另一氨基酸残基,例如甘氨酸,表示为Ser195SerGly或S195SG;
多个突变用“-”号分开,即T189M-S195M,表示在第189位和195位分别用甲硫氨酸取代苏氨酸和丝氨酸的突变。
本发明的目的是提供多肽,例如酶,特别是环氧化酶,更特别是环氧化酶Lsd18,它相对于所述亲本多肽至少一种下列特性改变:蛋白表达量、与底物结合的特异性和稳定性、与FAD结合的稳定性、酶的热稳定性、抗蛋白酶降解能力、催化底物环氧化的酶活性。
Fre:黄素还原酶,在Lsd18催化的酶活反应中参与前半部分的反应。Fre特异性地与Lsd18相互作用,外源添加的FAD与内源FAD移动到Fre活性位点,在那里通过与异氧嘧啶环相互作用然后被NADH还原。关于Fre的更多信息可在下两文中找到:例如Xun L.Y.,Sandvik E.R.,Characterization of 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase(HpaB)ofEscherichia coli as a reduced flavin adenine dinucleotide-utilizingmonooxygenase[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(2):481-486;和Caux C.,et al.Membrane-bound flavocytochrome MsrQ is a substrate of theflavin reductase Fre in Escherichia coli[J].ACS Chem.Biol.,2021,16,2547-2559,它们的内容都通过引用并入本文。
FAD:黄素腺嘌呤二核苷酸,是维生素B2衍生的一种辅因子。正常表达的Lsd18含有天然的FAD,且FAD在酶促反应中有至关重要的作用。
多肽:根据本发明的多肽包括具有生物学活性、抗微生物活性,和酶活性的蛋白质。
本发明的发现可应用到与SEQ ID NO:2所示的野生型环氧化酶Lsd18具有至少60%同一性,优选至少70%同一性,更优选80%同一性,甚至更优选85%同一性,甚至更优选90%同一性,甚至更优选95%同一性,甚至更优选97%同一性,甚至更优选99%同一性的环氧化酶上,优选的是该发现可用于环氧化酶Lsd18上。
等位基因变体:术语“等位基因变体”意思指占据同一染色体基因座的一个基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生,并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无改变),或可以编码出具有改变的氨基酸序列的多肽。一种多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的一种多肽。
cDNA:术语“cDNA”意思指可以由从一个真核细胞获得的经过剪接的成熟mRNA分子通过反转录来制备的一种DNA分子。cDNA缺乏内含子序列,这些序列可以存在于相应的基因组DNA中。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体,其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工,包括剪接。
编码序列:术语“编码序列”是指多核苷酸,其直接明确多肽的氨基酸序列。编码序列的边界通常由一个开放阅读框确定,通常始于ATG起始密码子或替代起始密码子如GTG和TTG,并以终止密码子如TAA、TAG、和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多核苷酸。
表达:术语“表达”包括在多肽的产生中涉及的任何步骤,包括但不限于,转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体:术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了其表达的额外的核苷酸相连接的线性或环状DNA分子。
重组表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其能够方便地进行重组DNA程序,并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于载体与该载体待引入其中的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体,该重组表达载体可以包含一个或多个(若干个)合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或置换编码多肽的多核苷酸。可替代地,通过将该多核苷酸或者包含该序列的核酸构建体插入到用于表达的适当载体中可以表达该多核苷酸。在产生表达载体时,该编码序列是位于该载体中,由此使该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
载体可以是自主复制载体,即,作为染色体外实体存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制任何装置。可替代地,该载体可以是这样一种载体,当它被引入该宿主细胞中时,被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外,可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。
载体优选地包含允许便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等的一个或多个(若干个)选择性标记。选择性标记是基因,其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在一个丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌的bar基因。
载体优选包含其允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。对于整合到该宿主细胞基因组中,该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。作为替代方案,该载体可以包含引导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中染色体中的一个(多个)精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性,这些整合的元件应包含足够数量的核酸,例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对,这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外,这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面,通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。
对于自主复制,该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体在体内复制的多核苷酸。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个额外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个可扩增的选择性标记基因与该多核苷酸可以获得增加的多核苷酸拷贝数目,其中通过在适当选择性试剂存在下培养细胞可以选择包含扩增的选择性标记基因拷贝和由此额外的多核苷酸拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见,例如,萨姆布鲁克等人,1989,见上文)。
宿主细胞:术语“宿主细胞”意指容易被包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。本发明还涉及重组宿主细胞,该重组宿主细胞包含与指导本发明多肽产生的一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中,这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体,如早前所描述。该宿主细胞可以是适用于重组产生本发明的多肽的任何细胞,例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包含但不限于:芽孢杆菌、短芽孢杆菌、梭菌、土芽孢杆菌、乳杆菌、乳球菌、类芽孢杆菌、以及链霉菌。革兰氏阴性细菌包含大肠杆菌和假单胞菌。
该宿主细胞还可以是真核细胞,例如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
分离的多核苷酸:术语“分离的多核苷酸”意指被人手修饰的多核苷酸,相对于在自然中发现的多核苷酸。在一个方面,该分离的多核苷酸是至少1%纯的,例如至少5%纯的,更多至少10%纯的,至少20%纯的,至少40%纯的,至少60%纯的,至少80%纯的,至少90%纯的,以及至少95%纯的,如通过琼脂糖电泳所确定的。该多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成起源的,或其任意组合。
分离的多肽:术语“分离的多肽”意指被人手修饰的多肽,相对于在自然中发现的多肽。在一个方面,该多肽是至少1%纯的,例如至少5%纯的,至少10%纯的,至少20%纯的,至少40%纯的,至少60%纯的,至少80%纯的,以及至少90%纯的,如通过SDS-PAGE所确定的。
成熟的多肽:术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一个方面,Lsd18野生型成熟多肽是SEQ ID NO:2编号中的第17至488位氨基酸。
本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少60%,例如至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%、以及至少100%的环氧化酶活性。
成熟多肽编码序列:术语“成熟肽编码序列”意指编码一种具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面,野生型成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:1的编号中的第49-1464位核苷酸。在SEQ ID NO:1的编号中的第1-48位核苷酸编码一种His标签。
本发明的成熟多肽编码序列与SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列相比,具有至少60%同一性,优选至少70%,更优选至少80%,甚至更优选至少85%,甚至更优选至少90%,甚至更优选至少95%,甚至更优选至少97%,甚至更优选至少99%同一性,最优选100%同一性。
核酸构建体:术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链亦或双链的核酸分子。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需的控制序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
可操作地连接:术语“可操作地连接”意指如下构造,其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处,这样使得控制序列指导编码序列的表达。
序列一致性:用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的,使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施),1970,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度,如在EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice(赖斯)等人,2000,Trends Genet.(遗传学趋势)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5,及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)被用作百分比一致性,并且如下计算:
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的,使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施),1970,见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性的程度,如在EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(The EuropeanMolecularBiology Open Software Suite),Rice(赖斯)等人,2000,见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。使用的任选参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0.5,以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性,并且如下计算:
(一致的脱氧核糖核酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体:术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即,一个或多个(若干个)氨基酸残基置换、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。置换意指将占据某个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸;缺失意指去除占据某个位置的氨基酸;并且插入意指邻近占据某个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
优选地,氨基酸变化是一种次要性质的变化,即并不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸置换、缺失或插入;典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失;小氨基-或羧基-末端延伸,如一种氨基-末端甲硫氨酸残基;具有至多约20-25个残基的一种小连接肽;或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸,如一种聚组氨酸段、一种抗原表位或一种结合域。
保守置换的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)的组内。一般不改变比活性的氨基酸置换是本领域中已知的,并且(例如)由H.纽拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill),1979在蛋白(The Proteins)(学术出版社(Academic Press),纽约(New York))中描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
诱变/改组方法可以与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆、诱变的多肽的活性(内丝(Ness)等人,1999,自然生物技术(Nature Biotechnology)l7:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞,并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽,其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽,其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域中已知的,并且包含连接编码多肽的编码序列,以使得它们同框,并且融合多肽的表达受到相同的启动子和终止子的控制。融合蛋白还可以使用内蛋白技术构建,其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人,1993,欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583;道森(Dawson)等人,1994,科学266:776-779)。
融合多肽可以进一步包含两个多肽之间的一个切割位点。在融合蛋白分泌之后,该位点被裂解,从而释放出这两个多肽。
该多肽可以由包含对于His标记或HQ标记的编码的重组DNA序列来表达,以在任意翻译后修饰之后给出包含该His标记或HQ标记的全部或部分的成熟多肽。该HQ标记(具有序列-RHQHQHQ)可以在该翻译后修饰期间完全或部分裂解掉,得到例如另外的氨基酸,例如附接至该成熟多肽的N端的-RHQHQH、-RHQHQ、-RHQH、-RHQ、-RH或-R。该His标记(具有序列-RPHHHHHH)可以在该翻译后修饰期间完全或部分裂解掉,得到另外的氨基酸,例如附接至该成熟多肽的N端的-RPHHHHH、-RPHHHH、-RPHHH、-RPHH、-RPH、-RP或-R。
在本说明书中所使用的,“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的,当与单词“包含”一起使用时,单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
贯穿本申请,术语“约”或“大约”用于指示值包括装置的误差的固有变化,该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。
在一具体实施方式中,提供了一种工程化环氧化酶Lsd18,其中,该工程化Lsd18相对于参比Lsd18具有更高的热稳定性,其中参比Lsd18为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。在本说明书的上下文中,术语“热稳定性”是蛋白质稳定性的一个层面,用于表征蛋白质对热变性的抵抗程度。在此,SEQ IDNO.2所示的参比Lsd18是野生型Lsd18。其中第1-16位氨基酸是His标签,第17-488位氨基酸是野生型Lsd18成熟多肽的氨基酸序列。
本申请通过荧光热漂移实验、Trypsin处理、和/或分子动力学模拟分析测试环氧化酶的稳定性。
在又一具体实施方式中,提供了一种工程化环氧化酶Lsd18,其中,所述氨基酸替换为基于SEQ ID NO.2进行以下中的任意一种或任意多种氨基酸改变:S195M、N433L、A78M、T189M、S237M、R473D、E139M、S391L、G101P、P326A、P326S、R21G、R51W、D52S、V64D、S108V、S237V、H239L。
生产方法
本发明还涉及产生本发明多肽的方法,该方法包含:(a)培养细胞,该细胞处于其野生型形式,在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽;以及(b)回收该多肽。在优选的方面,细胞属于大肠杆菌属。在一个更优选方面,该细胞是大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法,该方法包含:(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞;以及(b)回收该多肽。
使用本领域熟知的方法,在适合产生该多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如,可以通过在合适的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下,在实验室或工业发酵罐中,进行摇瓶培养、以及小规模或大规模发酵(包含连续,分批,补料分批,或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序,在一种适合营养培养基中发生,该培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中,那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌,那么其可从细胞裂解液中进行回收。
以下的“核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产环氧化酶的方法”中提供了更多的细节。
该多肽可以使用本领域中已知的特定用于这些多肽的方法进行检测。这些检测方法可包含使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。举例来说,可以使用一种酶检验来测定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如,可以通过常规程序,包含,但不局限于离心,过滤,提取,喷雾干燥,蒸发,或沉淀,从营养培养基中回收该多肽。
可以通过本领域已知的多种方法纯化该多肽,该方法包含但不限于色谱法(例如,离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如,制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见,例如,蛋白纯化(Protein Purification),编者J.-C.詹森(Janson)和拉尔斯赖登(Lars Ryden),VCH出版公司,纽约,1989),以便获得基本上纯的多肽。
在替代性方面,不回收多肽,而是使用表达多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。
组合物:本发明还涉及包含本发明的环氧化酶的组合物。该组合物可以包含本发明的环氧化酶作为主要酶组分,例如单组分组合物。可替代地,该组合物含有其完成催化功能所需的别的化学成分,例如缓冲液、底物、NADH、NADPH、FAD、Protein(酶)、Fre、甲醇、MQ等中的一种或多种。这些组合物可以根据本领域中已知的方法制备,并且可以呈液体或干组合物的形式。例如,组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。该环氧化酶可以根据本领域中已知的方法稳定化。
应用:本发明还针对用于使用具有环氧化酶活性的多肽或其组合物的方法。优选的,所述方法是合成天然化合物;更优选的,所述方法是合成Lasalocid(拉沙里菌素)。
核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产环氧化酶的方法:本发明还涉及包含编码本发明的环氧化酶的这类多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
本发明还涉及产生环氧化酶的方法,包含(a)对包含这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养;并且(b)回收该蛋白。
该蛋白对于宿主细胞来说可以是天然的或异源的。属于“蛋白”在此并不是指特定长度的编码产物,并且包含肽、寡肽和蛋白。术语“蛋白”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白还包含杂合多肽和融合多肽。优选地,该蛋白是一种环氧化酶。
该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。
实施例
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例,然而应当理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反,提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明,并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1:环氧化酶Lsd18突变体的设计
为提高Lsd18蛋白的稳定性以及催化活性,以便于更好地应用于天然产物生物合成以及工业生产中,通过计算和半理性设计设计了18种Lsd18突变体,如表1所示:
表1:设计所得18种Lsd18突变体
序号 具体突变 序号 具体突变
1 S195M 10 P326A
2 N433L 11 P326S
3 A78M 12 R21G
4 T189M 13 R51W
5 S237M 14 D52S
6 R473D 15 V64D
7 E139M 16 S108V
8 S391L 17 S237V
9 G101P 18 H239L
实施例2:野生型与突变型Lsd18的克隆与表达
1.1Lsd18基因载体构建
Lsd18基因来源于Streptomyces lasalinesis。由NdeI和EcoRI作为酶切位点插入pCold I(Takara Bio)上,我们所用pCold I载体在N端插入6×His,用于后续实验过程中NI2+亲和层析柱的纯化。将伴侣编码载体pG-KJE8(Takara Bio)与Lsd18-pCold I质粒一起转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Sigma Aldrich)中。pG-KJE8载体编码dnaK、dnaJ、grpE、groES和groEL的伴侣蛋白,有助于蛋白质折叠,并且提高蛋白表达的可溶性。
1.2 Lsd18基因的定点突变及克隆
对于Lsd18基因的定点突变,我们采用的重叠PCR的技术。重叠PCR因其具有高效,错误率低的特性已成为定点突变的常用方法。使用重叠PCR进行定点突变需设计两对引物。一对全长基因的5'端正向引物(Lsd18-F-NdeI)以及3'反向引物(Lsd18-R-EcoRI),该引物设计完成后需加上保护碱基,避免引物之间进行互补配对;另一对引物为突变位置带有突变后碱基的互补引物,该引物通过PrimerX http://www.bioinformatics.org/primerx/ index.htm进行设计,设计完成后由生工公司进行引物的合成,表2为Lsd18的引物序列。引物浓度保存为10μM,使用时50μL体系中加入1μL。干粉状态的引物使用前需高速离心,然后加入灭过菌的超纯水,保存浓度为100μM。
表2 Lsd18引物设计
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重叠PCR的方法分为三步。首先以基因全长作为模板,以全长的F端引物与突变位置的R端引物,以及全长的R端引物与突变位置的F端引物进行PCR,获得在突变位置两侧具有相同片段的F端与R端。将F端与R端通过DNA胶回收后,以回收的F端与R端为模板,以全长的F与R端引物为引物进行PCR,最终获得基因的全长。重叠PCR的基本原理如图1所示。
PCR反应液的配置如表3所示。
表3 PCR反应液的配置
PCR反应条件如表4所示。在PCR过程中,条件2-4过程循环30次。
表4 PCR反应程序如下:
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每一步PCR结束之后,对扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。DNA marker选择的是250bp-10000bp规格。电泳结束,通过与DNA marker对比,找到目的片段之后,采用OMEGA胶回收试剂盒进行胶回收。将回收的目的基因Lsd18与载体pCold同时用Nde Ⅰ与EcoRⅠ进行双酶切;酶切完成之后,通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,目的基因直接进行回收处理。
DNA回收之后,取1μL用NanoDrop测DNA浓度并记录A260:A280的值。
载体跑胶结束后,参照上述胶回收的方法进行回收。回收后的载体片段进行去磷酸化处理,去磷酸化是为了除去5’端的磷酸基团,防止其自身连接。去磷酸化反应在37℃反应30min之后,将离心管取出进行DNA回收,回收参照上述DNA酶切后回收过程。
目的基因与载体金属浴16℃下过夜连接,从而获得pCold-Lsd18重组质粒。
第二天将连接完成后的重组质粒从金属浴上取下来放于冰上备用。将重组后的pCold-Lsd18转入克隆菌株DH5α中;将被pCold-Lsd18转化的DH5α细菌涂布于提前预热的含有氨苄青霉素钠抗性的培养基上;将培养基倒放于37℃过夜培养。第二天取出固体培养基,对单菌落挑菌摇菌,菌落PCR检测或提质粒酶切检测,之后琼脂糖凝胶电泳确定单克隆的准确性。
测序正确的Lsd18野生型基因序列如SEQ ID NO:1所示。
1.3野生型及突变型Lsd18与分子伴侣pG-KJE8共转
取1μL测序正确的pCold-Lsd18质粒与1μL pG-KJE8质粒共同转入表达菌株BL21(DE3)中,转化过程同上述重组质粒转DH5α过程。因pG-KJE8为氯霉素抗性,所以最终涂板时将菌液均匀的涂布于共同含有氨苄青霉素钠抗性与氯霉素抗性固体培养基上,37℃过夜孵育。取15mL灭菌离心管,加入5mL LB,5μL氨苄青霉素钠储存液,5μL氯霉素储存液备用。取出过夜孵育固体培养基,挑取单克隆至15mL离心管内,37℃,220rpm过夜培养。
对过夜培养的菌液保种。标记好的1.5mL灭菌离心管中加入500μL灭菌的50%甘油,500μL过夜培养菌液,混合均匀后冻-80℃备用。取用时将菌种置于冰上,待部分融化时,用枪取用,尽量避免全部融化反复冻溶。
1.4野生型及突变型Lsd18的异源表达
Lsd18野生型与Lsd18突变型都以相同的方式进行异源表达。在大量表达之前,我们首先挑取几个单克隆进行试表达,选取活性最好的菌进行大量表达。以Lsd18野生型为例进行介绍。
试表达过程:
(1)取3个50mL灭菌离心管加入20mL LB,20μL氨苄青霉素钠储存液,20μL氯霉素储存液。向离心管中加入20μL含有Lsd18-pCold I与pG-KJE8质粒的BL21(DE3);
(2)37℃,220rpm培养至OD600为0.6后,取1mL诱导前的样,记录好准确的OD600并保种;
(3)将离心管取出后置于冰上放置30min后,加入2μL 1M IPTG,2μL 50ng/μL四环素,40μL 25%L-阿拉伯糖诱导菌表达;
(4)15℃过夜培养20h,测诱导后的OD600,通过计算,取与诱导前相同数量的菌;
(5)12%SDS-PAGE跑胶确定每个菌的活性,挑取活性最好的菌进行试表达。
大量表达过程:
(1)取50mL灭菌离心管加入20mL LB,20μL氨苄青霉素钠储存液,20μL氯霉素储存液。向离心管中加入20μL含有Lsd18-pCold I and pG-KJE8质粒的BL21(DE3);
(2)37℃,220rpm过夜培养;
(3)将10mL过夜培养的菌液平均加到1L灭菌LB中,加入1mL氨苄青霉素钠储存液,1mL氯霉素储存液;
(4)37℃,220rpm,培养1.5h左右时开始测OD600,直至OD600为0.6;
(5)将培养瓶取出置于冰上30min后,加入100μL 1M IPTG,100μL 50ng/μL四环素,2mL 25%L-阿拉伯糖诱导菌表达;
(6)15℃过夜培养20h;
(7)将菌液平均倒入两个收集瓶中,4℃,6000rpm,离心20min;
(8)弃上清,收集菌泥,每1L菌液由30mL裂解液将菌泥重悬,重悬后的菌液置于-80℃保存备用。
1.5野生型及突变型Lsd18的蛋白纯化
对于Lsd18野生型以及突变型蛋白的纯化主要分为三部分:前处理,NI2+亲和柱纯化,分子筛纯化。以下是对上述三部分的详细介绍。
I.前处理:
(1)将冻于-80℃重悬菌泥的30mL裂解液取出,置于37℃使其融化;
(2)融化后的重悬液加入150μL 100mM PMSF与150μL 100mg/mL溶菌酶,混合均匀后置于冰上10min;
(3)将重悬液倒入50mL小烧杯中置于冰上,2s on,3s off,15%功率超声15min;
(4)将超声后的裂解液配平后,13000rpm 4℃离心45min;
(5)将上清倒出后用0.22μm滤膜过滤后备用。
II.NI2+亲和柱纯化:
Histrap HP 5mL:
(1)NI2+亲和柱纯化时采用恒流泵上样,所以在使用之前,用100mL的超纯水以最大流速清洗恒流泵;
(2)NI2+亲和柱保存在20%乙醇中,在使用之前将NI2+亲和柱洗到Lysis buffer(含有低浓度咪唑)中。首先以5mL/min流速洗5个柱体积过滤超声处理后的超纯水,其次5mL/min流速洗5个柱体积过滤超声处理后的Elution buffer,最后以5mL/min流速洗5个柱体积过滤超声处理后的Lysis buffer;(3)经恒流泵于柱子连接后,以1mL/min的流速,使过滤后的裂解液流经NI2+亲和柱。因目的蛋白含有6×His,可以与NI结合,不结合柱子的杂蛋白随buffer流出;
(4)将柱子连接AKTA-pure进行洗脱。首先以3mL/min流速的Lysis buffer冲洗柱子,将UV洗平,此时结合柱子弱的杂蛋白被洗脱下来;
(5)梯度洗脱目的蛋白。以2mL/min的流速,25min洗到50%的Elution buffer,再洗脱过程中,观察到UV上升过程即可收集,收集以1.3mL/管;
(6)将柱子保存在20%乙醇中。首先以5mL/min流速洗5个柱体积过滤超声处理后的Elution buffer,其次5mL/min流速洗5个柱体积过滤超声处理后的Lysis buffer,然后以5mL/min流速洗5个柱体积过滤超声处理后的超纯水,最后以5mL/min流速洗5个柱体积过滤超声处理后的20%乙醇;
(7)12%SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳。将收集的每管蛋白各取10μL,加入2.5μL 5×SDS loading buffer,金属浴95℃加热5min,离心后上样。我们所用蛋白非预染Marker IV(14.4~116kDa),marker上样8μL,变性后蛋白上样10μL,135V电泳60min,观察loading带所在位置。跑胶结束后,将蛋白胶取出后,用清水清洗,加入50mL染色液,染色20min后加入50mL脱色液进行脱色。
Ni beads纯化
(1)beads保存在4℃20%乙醇中。取出beads后将20%乙醇吸出,加10mL MQ混合均匀,静置或离心使beads沉淀下来,将水吸出,重复两次(除去乙醇);
(2)Beads与buffer 1:1比例混合,将buffer加到beads中,混合均匀,可以重复两次,除去水,保持buffer环境;
(3)在过滤好的备用蛋白溶液中加beads,按照每30mL蛋白溶液对应1mL beads的比例加入beads,在4℃环境下,用混匀仪孵育混匀,使蛋白与beads充分结合;
(4)将结合的supernatant全部加到重力柱上,收集流出液;
(5)用Lysis buffer洗脱,将部分不结合柱子和结合弱的杂蛋白洗脱下来,每次洗脱1mL,用1.5mL离心管收集,每管测浓度,直至在NanoDrop测得蛋白浓度接近于0;
(6)用Elution buffer洗脱,目的蛋白被洗脱下来,每次洗脱1mL,用1.5mL离心管收集,每管测浓度,直至在NanoDrop测得蛋白浓度接近于0;
(7)12%SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳。
(8)将beads保存于20%乙醇中。首先用3mL Elution buffer冲洗beads,其次用3mL Lysis buffer冲洗,再用3mL过滤后的超纯水冲洗,最后用3mL20%乙醇冲洗后置于4℃保存。
III.分子筛纯化(Superdex200 10/300GL)
根据NI2+亲和柱纯化后跑胶结果分析,杂蛋白的量比较少,并且目的蛋白与杂蛋白之间分子量相差较大,所以没有进行阴离子纯化,直接进行分子筛纯化。Lsd18的分子量为52515.63Da,我们采用Superdex200 10/300GL进行分子筛纯化,柱子分离范围为10000-600000Da。
(1)分子筛(Superdex200 10/300GL)的平衡。分子筛保存在20%乙醇中,所以在使用之前首先用过滤超声后的超纯水洗1个柱体积(25mL),将柱子中的乙醇清洗干净,然后再用1.5个柱体积分子筛buffer(20mM Tris,150mM NaCl,pH8.5)平衡柱子。
(2)上样。将浓缩好的蛋白通过上样环上样。上样后以0.3mL/min流速洗脱蛋白,当UV上升时开始收集。
(3)12%SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳。我们所用蛋白非预染Marker IV(14.4~116kDa),marker上样8μL,变性后蛋白上样10μL,135V电泳60min,观察loading带所在位置。跑胶结束后,将蛋白胶取出后,用清水清洗,染色液染色20min后,加入脱色液进行脱色。
1.6 Lsd18蛋白浓度测定
根据蛋白质跑胶脱色后结果,将纯度较高的蛋白进行收集,浓缩后使用NanoDrop测蛋白浓度并记录。在NanoDrop所测蛋白浓度并非准确数值,需要除以蛋白的消光系数。Lsd18消光系数为0.801,由此可计算出蛋白的真实浓度。测完浓度后将蛋白质以20μL/tube分装,用液氮速冻后置于-80℃备用。
经过野生型与突变型分子筛纯化以及SDS-PAGE跑胶(图2)之后,对纯度较高的目的蛋白进行回收。回收之后计算蛋白产量,部分突变体相对于野生型产量降低了,但Lsd18-T189M与Lsd18-S195M明显观察到产率提高了。对于两个较好的单突变进行组合以后,Lsd18-T189M-S195M产率也得到了明显的提高。
1L Lsd18-WT大肠杆菌培养物能够纯化6.9mg蛋白;1L Lsd18-T189M大肠杆菌能够纯化14.25mg蛋白,相比于野生型产量提高到2.1倍,提高了110.9%;1L Lsd18-S195M大肠杆菌培养物能够纯化17.8mg蛋白,相比于野生型产量提高到2.6倍,提高了158%;1LLsd18-T189M-S195M大肠杆菌培养物能够纯化18.6mg蛋白,相比于野生型产量提高到2.7倍,提高了169.6%。通过Graphpad软件中统计学进行比较,突变型蛋白的产量与野生型蛋白的产量存在显著差异,P<0.0001;Lsd18-T189M-S195M和Lsd18-S195M突变型蛋白的产量与Lsd18-T189M蛋白产量也存在差异,P值分别小于0.001和0.01(图3)。
实施例3:Lsd18野生型与突变型稳定性鉴定
采用三种方法测试或分析Lsd18野生型与突变型的稳定性,分别是:荧光热漂移实验、Trypsin酶解测试和分子动力学模拟分析。
3.1荧光热漂移实验
实验通过荧光热漂移实验(thermal shift assay)检测蛋白的稳定性。蛋白质稳定时,蛋白质的疏水性氨基酸被包裹于蛋白质内部。随着温度的升高,蛋白质变性,疏水性氨基酸暴露出来。实验过程中使用荧光染料(sypro-orange),该染料与疏水性氨基酸发生结合时会发出荧光,利用该染料的性质,可以检测蛋白的稳定性。在某一个位置,荧光值升高的最快时,即在该温度下蛋白质变性最快,称此温度为蛋白质溶解温度Tm。
经过克隆表达与纯化获得目的蛋白质后,对克隆并表达成功的蛋白质做荧光热漂移实验。通过实验结果,筛选出稳定性提高的突变。通过origin处理数据并绘制曲线。
荧光热漂移实验在进行检测时,每组实验平行三组。首先将购买的荧光染料由5000×稀释至50×备用,荧光染料避光置于4℃保存。荧光热漂移反应体系如表5所示:
表5 Thermal Shift Assay反应体系
将上述体系配好之后,平均分于三个PCR排管中低速离心,置于冰上避光保存备用。
(1)基于蛋白质三维结构使用FoldX软件设计得到突变体,通过每一个突变体返回自由能的变化以反映突变对蛋白质稳定性影响筛选出的10个突变体中,对表达成功的9个突变进行荧光热漂移实验。这9个突变体分别是:A78M、T189M、S195M、S391L、N433L、G101P、T139M、S237M、R473D。
通过对实验结果数据分析,我们发现Lsd18-T189M与Lsd18-S195M稳定性有明显提高,我们对稳定突变体进行组合后,获得Lsd18-T189M-S195M双突变体,并对Lsd18-WT、Lsd18-T189M、Lsd18-S195M以及Lsd18-T189M-S195M重新进行荧光热漂移实验获得以下结果,如表6所示:
表6:稳定突变体热稳定测试
蛋白质 ΔTm/℃
Lsd18野生型 0
Lsd18-T189M 3.0
Lsd18-S195M 4.5
Lsd18-T189M-S195M 4.8
Lsd18野生型溶解温度为42℃。Lsd18-T189M的溶解温度为45℃,Tm提高了3.0℃(提高了7.1%);Lsd18-S195M的溶解温度为46.5℃,Tm提高了4.5℃(提高了10.7%);Lsd18-T189M-S195M的溶解温度为46.8℃,Tm提高了4.8℃(提高了11.4%)。突变体在具有高表达量的基础上能够弥补Lsd18野生型稳定性差的不足,为Lsd18环氧化酶在天然产物合成以及投入蛋白质工程奠定基础。
(2)Lsd18-P326A与Lsd18-P326S突变体均未表达成功。
(3)考虑到Lsd18和底物相互作用与Lsd18和FAD的相互作用增强是否会提高酶活效率。我们基于结构的基础上,突变Lsd18与底物作用口袋处氨基酸以提高Lsd18和底物相互作用,从而获得三突变体Lsd18-S108V-S237V-H239L。突变Lsd18与FAD作用口袋处氨基酸以提高Lsd18和FAD相互作用,从而获得三突变体Lsd18-R51W-D52S-V64D。两个三突变体均表达成功,对其进行荧光热漂移实验。
从实验结果分析,两个三突变体Tm都降低了,稳定性变差。获得的三突变体与Lsd18底物类似物进行酶活实验,酶活效率降低。蛋白冻于-80℃保存一段时间后,蛋白发生降解。
3.2蛋白酶测试突变体稳定性
胰蛋白酶(Trypsin)是脊椎动物消化系统中发现的一种丝氨酸蛋白酶,可以消化蛋白质。胰蛋白酶的作用位点是精氨酸或赖氨酸(直接与脯氨酸结合)的羧酸基团。
将野生型和突变型Lsd18(0.4mg/mL)与胰蛋白酶(2μg/mL)在含有10mM CaCl2的20mM Tris PH8.5缓冲液中孵育45min后,用1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)结束反应。12%SDS-PAGE使蛋白质变性跑胶,然后用考马斯亮蓝染色。
Trypsin与蛋白进行孵育之后,我们对混合物进行12%SDS-PAGE跑胶鉴定,跑胶结果如图4所示。
由图4可以看出,与野生型相比,我们筛选出来的突变体都表现出了更好的抗蛋白酶解的能力。用胰蛋白酶(2μg/mL)孵育45min后,突变型Lsd18-T189M、Lsd18-S195M以及Lsd18-T189M-S195M与野生型Lsd18相比,显示出更高比例的完整蛋白(52kd)。
3.3分子动力学模拟验证突变体稳定性
每一个体系通过50ns的常规动力学模拟,使用AMBER16[75]在ff14SB力场下进行优化[76]。蛋白结构通过H++网站(http://biophysics.cs.vt.edu/)进行加氢处理。首先每一个蛋白结构放置在立方体水盒中,水盒中的任一原子距水盒边界钠离子与氯离子被加入到水盒中使水盒内呈电中性。首先,每一个准备好的模拟体系通过能量最小化以消除结构内部不合适的原子接触。能量最小后,体系在1ns内由0K升温至310K,接着在NVT系综中模拟1ns。最后,体系在NPT系综(NPT,T=310K and P=1atm)和周期性边界条件下模拟2ns。模拟中,范德华作用的截断半径设置为/>数据用AMBER18中的cpptraj程序分析得到。
通过对Lsd18-WT、Lsd18-T189M、Lsd18-S195M与Lsd18-T189M-S195M动力学模拟,模拟结果与实验结果一致。Lsd18-WT相对另外三个体系波动比较大,收敛较慢,Lsd18-S195M与Lsd18-T189M-S195M收敛最快最稳定(RMSD值最快达到平稳)。
实施例4:Lsd18野生型与稳定突变型体外酶活鉴定
4.1FAD含量测定
在自然界中,FAD能够以其他氧化还原状态存在,包括黄素-N(5)-氧化物[77]、FADH·(半醌形式)和FADH2(对苯二酚形式)。完全氧化的FAD具有芳香环系呈黄色,还原的FADH呈蓝色或红色,完全还原的FADH2没有FAD那样的芳香体系呈无色。FAD在自然界中与Lsd18结合,并且能够在Lsd18催化过程中被还原和氧化。
为了计算Lsd18与FAD含量的摩尔比,将标准FAD化合物溶解在含有20mM TrispH8.5、150mM氯化钠的缓冲液中,梯度浓度分别为5μM、10μM、50μM、80μM和100μM。标准品在紫外分光光度计300-500nm范围内扫描,FAD在362和451nm处可观察到特征吸收,451nm处峰最强。取200μL蛋白用NanoDrop测浓度后记录,100℃高温加热使蛋白变性10min后高速(>13000g)离心提取FAD。纯化的蛋白溶液提取的FAD样品也从300nm~500nm的紫外波长进行扫描,溶液中紫外吸收与FAD浓度呈成正比例关系。
Lsd18作为黄素依赖性单加氧酶,成功表达的Lsd18因含有FAD分子,所以蛋白是黄色的。对于稳定性提高的突变体,我们猜测相同浓度下的蛋白,FAD含量是会存在差距。通过对不同浓度标准FAD化合物在紫外分光光度计下进行扫描,获得FAD含量标准曲线,如图5所示。
溶液中紫外吸收强度与FAD浓度呈成比例关系。5μM的FAD在450nm处的吸光度为0.083;10μM的FAD为0.161;50μM的FAD为0.727;80μM的FAD为1.2977;100μM的FAD为1.529。根据这些测量结果,推导出FAD浓度与荧光吸收强度的标准曲线,方程为y=0.01552x-0.0013(图5B),其中450nm处的吸光度为y轴,FAD浓度(μM)为x轴,R2值为0.99643,说明该标准曲线非常可靠。
将纯化后的蛋白通过热变性高速离心提取FAD后,对提取出来的样品在300nm~500nm的紫外波长进行扫描,获得纯化后蛋白中FAD的曲线,如图6所示。
从变性的Lsd18中提取的FAD与标准FAD具有相同的光谱,这表明Lsd18野生型与突变型中都具有天然紧密结合形式的FAD(图6)。测定纯化后Lsd18野生型与突变型蛋白溶液在450nm处的吸光度,根据紫外吸收与FAD浓度推导出的标准公式,计算出蛋白中FAD含量,如图7所示。与野生型相比,从变性的Lsd18-T189M、Lsd18-S195M、Lsd18-T189M-S195M中提取的FAD含量分别提高了29.3%、46.7%、38.3%。
相同浓度蛋白下,Lsd18野生型蛋白中所含有天然FAD含量相对于稳定性突变型较低,有明显的统计学差异(P****<0.0001)。从柱状图观察到突变型之间FAD含量有略微差异,但差距不大,无统计学差异。
4.2酶活检测
Lsd18作为一种环氧化酶,负责Lasalocid生物合成过程中的环氧化(图8A)。因其天然底物结构复杂,所以我们选取了Lsd18天然底物类似物1检测Lsd18的催化活性(图8B)。底物类似物由实验室通过16步全合成拿到。
实验室合成底物与天然底物类似物具有相同的Lsd18催化部分以及芳香结构,所以可以用Lsd18催化底物类似物1检测Lsd18野生型与突变型的催化效果。酶活结束后,通过乙酸乙酯将产物萃取出来,真空挥发后用甲醇溶解上样。我们分别在30℃,33℃,37℃,40℃下测试Lsd18野生型与突变型的酶活效率,变体相比于野生型酶活提高率如表7所示,每组实验平行三组以确保实验的准确性(图9)。LC-MS运行结束后,通过安捷伦自带软件进行处理。
表7:变体相比于野生型酶活提高率
通过对Lsd18野生型与突变型在不同温度下的酶活实验发现,Lsd18野生型与稳定突变型在33℃具有最好的酶活效率。对于稳定突变型,在不同温度下的酶活效率都高于野生型。从整体上看,稳定性强的突变体表现出较高的催化活性。Lsd18-T189M虽然热稳定性相比于其它两个突变体较差,但在33℃时酶活效率高于Lsd18-S195M与Lsd18-T189M-S195M,这可能由于T189突变为甲硫氨酸之后,增加了与FAD的相互作用,能够更好的稳定分子内的FAD,有助于提高酶活效率。但当温度上升到40℃时,Lsd18-T189M反应活性降低,这可能与Lsd18-T189M的溶解温度(Tm)值有关。而对于稳定性最强的Lsd18-T189M-S195M,相对于野生型来说催化活性没有显著的增加,这可能是由于稳定性突变叠加之后改变了活性位点氨基酸的位置,导致酶活效率降低。
序列表
<110> 西北大学
<120> 热稳定性更高酶活更强的环氧化酶Lsd18变体及其应用
<130> TPF02264
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lsd18 WT
<400> 1
atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatcgaag gtaggcatat gacgaacacg 60
cgctcggcgg ttgtcctggg tggtggtatg gctggtatgc tggtctcatc aatgctggct 120
cgtcacgttg gctcagtgac cgttattgat cgtgacgcat ttccggcagg tccggatctg 180
cgcaaaggtg tcccgcaagc tcgtcatgcg cacattctgt ggtctggcgg tgcgcgtatc 240
gttgaagaac tgctgccggg taccacggat cgtctgctgg gtgcaggtgc tcatcgtatt 300
ggcatcccgg acggtcaggt gtcttatacc gcttacggtt ggcagcaccg ctttccggaa 360
gcacaattca tgattgcctg ctcccgcgca ctgctggatt ggaccgttcg tgaagaaacg 420
ctgcgtgaag aacgcatcgc cctggtcgaa aaaaccgaag tgctggctct gctgggtgat 480
gcaggtcgtg tgacgggcgt ccgtgtgcgt gaccaggaaa gcggtgaaga acgtgaagtt 540
ccggcggatc tggtggttga caccacgggt cgcggtagcc cgtctaaacg tctgctggca 600
gaactgggtc tgccggcacc ggaagaagaa tttgttgata gcggtatggt ctatgctacc 660
cgtctgtttc gtgcaccgga agcagcagca acgaacttcc cgctggtttc ggtccatgct 720
gatcaccgtg caggtcgtcc gggttgtaat gcagtgctga tgccgattga agacggccgc 780
tggatcgtga ccgttagtgg tacgcgtggc ggtgaaccgc cggcagatga cgaaggtttt 840
gcccgtttcg cacgtgatgg tgtgcgtcat ccgctggttg gtgaactgat cgcgaaagcc 900
cagccgctga ccagcgttga acgtagtcgc tccacggtca accgtcgcct gcactatgat 960
cgtctggcaa cctggccgga aggcctggtc gtgctgggtg acgcagtcgc tgcgtttaat 1020
ccggtgtacg gccatggcat gtcagcagca gctcactcgg tgctggcact gcgtagccag 1080
ctgggtcaac gtgcattcca gccgggtctg gcacgtgcag cacaacgtgc aattgctgtc 1140
gcggtggatg acgcctgggt gctggcaacc tctcatgata tcggttaccc gggttgccgt 1200
acccagacgc gtgacccgcg cctgacccgt cacgcaggcg aacgtcaacg cgttacggat 1260
ctggtcggtc tgaccgcaac gcgcaaccag gttgtcaatc gtgcagctgt ggcgctgaac 1320
accctgagcg ctggcatggc gtctatgcag gatccggcag tgatggcagc agttcgtcgc 1380
ggtccggaag ttccggcacc gaccgaaccg ccgctgcgcc cggatgaagt cgctcgtctg 1440
gtctctggtg ctggtgttac cgcttaa 1467
<210> 2
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lsd18 WT
<400> 2
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
1 5 10 15
Met Thr Asn Thr Arg Ser Ala Val Val Leu Gly Gly Gly Met Ala Gly
20 25 30
Met Leu Val Ser Ser Met Leu Ala Arg His Val Gly Ser Val Thr Val
35 40 45
Ile Asp Arg Asp Ala Phe Pro Ala Gly Pro Asp Leu Arg Lys Gly Val
50 55 60
Pro Gln Ala Arg His Ala His Ile Leu Trp Ser Gly Gly Ala Arg Ile
65 70 75 80
Val Glu Glu Leu Leu Pro Gly Thr Thr Asp Arg Leu Leu Gly Ala Gly
85 90 95
Ala His Arg Ile Gly Ile Pro Asp Gly Gln Val Ser Tyr Thr Ala Tyr
100 105 110
Gly Trp Gln His Arg Phe Pro Glu Ala Gln Phe Met Ile Ala Cys Ser
115 120 125
Arg Ala Leu Leu Asp Trp Thr Val Arg Glu Glu Thr Leu Arg Glu Glu
130 135 140
Arg Ile Ala Leu Val Glu Lys Thr Glu Val Leu Ala Leu Leu Gly Asp
145 150 155 160
Ala Gly Arg Val Thr Gly Val Arg Val Arg Asp Gln Glu Ser Gly Glu
165 170 175
Glu Arg Glu Val Pro Ala Asp Leu Val Val Asp Thr Thr Gly Arg Gly
180 185 190
Ser Pro Ser Lys Arg Leu Leu Ala Glu Leu Gly Leu Pro Ala Pro Glu
195 200 205
Glu Glu Phe Val Asp Ser Gly Met Val Tyr Ala Thr Arg Leu Phe Arg
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ala Ala Thr Asn Phe Pro Leu Val Ser Val His Ala
225 230 235 240
Asp His Arg Ala Gly Arg Pro Gly Cys Asn Ala Val Leu Met Pro Ile
245 250 255
Glu Asp Gly Arg Trp Ile Val Thr Val Ser Gly Thr Arg Gly Gly Glu
260 265 270
Pro Pro Ala Asp Asp Glu Gly Phe Ala Arg Phe Ala Arg Asp Gly Val
275 280 285
Arg His Pro Leu Val Gly Glu Leu Ile Ala Lys Ala Gln Pro Leu Thr
290 295 300
Ser Val Glu Arg Ser Arg Ser Thr Val Asn Arg Arg Leu His Tyr Asp
305 310 315 320
Arg Leu Ala Thr Trp Pro Glu Gly Leu Val Val Leu Gly Asp Ala Val
325 330 335
Ala Ala Phe Asn Pro Val Tyr Gly His Gly Met Ser Ala Ala Ala His
340 345 350
Ser Val Leu Ala Leu Arg Ser Gln Leu Gly Gln Arg Ala Phe Gln Pro
355 360 365
Gly Leu Ala Arg Ala Ala Gln Arg Ala Ile Ala Val Ala Val Asp Asp
370 375 380
Ala Trp Val Leu Ala Thr Ser His Asp Ile Gly Tyr Pro Gly Cys Arg
385 390 395 400
Thr Gln Thr Arg Asp Pro Arg Leu Thr Arg His Ala Gly Glu Arg Gln
405 410 415
Arg Val Thr Asp Leu Val Gly Leu Thr Ala Thr Arg Asn Gln Val Val
420 425 430
Asn Arg Ala Ala Val Ala Leu Asn Thr Leu Ser Ala Gly Met Ala Ser
435 440 445
Met Gln Asp Pro Ala Val Met Ala Ala Val Arg Arg Gly Pro Glu Val
450 455 460
Pro Ala Pro Thr Glu Pro Pro Leu Arg Pro Asp Glu Val Ala Arg Leu
465 470 475 480
Val Ser Gly Ala Gly Val Thr Ala
485
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lsd18-F-NdeI
<400> 3
ggaattccat atgacgaaca cgcgctc 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lsd18-R-EcoRI
<400> 4
ccggaattct taagcggtaa caccag 26
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S195M-F
<400> 5
cgcggtagcc cgatgaaacg tctg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S195M-R
<400> 6
cagacgtttc atcgggctac cgcg 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> N433L-F
<400> 7
caggttgtcc ttcgtgcagc tgtg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> N433L-R
<400> 8
cacagctgca cgaaggacaa cctg 24
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> A78M-F
<400> 9
gtctggcggt atgcgtatcg ttgaag 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> A78M-R
<400> 10
cttcaacgat acgcataccg ccagac 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T189M-F
<400> 11
gatctggtgg ttgacaccat gggtcg 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T189M-R
<400> 12
cgacccatgg tgtcaaccac cagatc 26
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S237M-F
<400> 13
cttcccgctg gttatggtcc atgc 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S237M-R
<400> 14
gcatggacca taaccagcgg gaag 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R473D-F
<400> 15
gaaccgccgc tggacccgga tgaag 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R473D-R
<400> 16
cttcatccgg gtccagcggc ggttc 25
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E139M-F
<400> 17
cgttcgtgaa atgacgctgc gtgaag 26
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E139M-R
<400> 18
cttcacgcag cgtcatttca cgaacg 26
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S391L-F
<400> 19
gtgctggcaa cccttcatga tatc 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S391L-R
<400> 20
gatatcatga agggttgcca gcac 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G101P-F
<400> 21
gctcatcgta ttcccatccc ggac 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G101P-R
<400> 22
gtccgggatg ggaatacgat gagc 24
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R21G-F
<400> 23
ggaattccat atgacgaaca cgggctcggc ggt 33
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P326A-F
<400> 24
ctggcaacct gggcggaagg cctg 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P326A-R
<400> 25
caggccttcc gcccaggttg ccag 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P326S-F
<400> 26
ctggcaacct ggtcggaagg cctg 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P326S-R
<400> 27
caggccttcc gaccaggttg ccag 24
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R51W-D52S-F
<400> 28
cgttattgat tggagcgcat ttccgg 26
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R51W-D52S-R
<400> 29
ccggaaatgc gctccaatca ataacg 26
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> V64D-F
<400> 30
gcgcaaaggt gacccgcaag ctcg 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> V64D-R
<400> 31
cgagcttgcg ggtcaccttt gcgc 24
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S237V-H239L-F
<400> 32
ccgctggttg tggtccttgc tgatcac 27
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S237V-H239L-R
<400> 33
gtgatcagca aggaccacaa ccagcgg 27
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S108V-F
<400> 34
cggtcaggtg gtttataccg c 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S108V-R
<400> 35
gcggtataaa ccacctgacc g 21

Claims (10)

1.环氧化酶Lsd18的变体,其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%,甚至更优选至少97%,甚至更优选至少99%同一性程度的氨基酸序列;
与野生型环氧化酶Lsd18相比,所述变体具有更强的热稳定性、蛋白酶抗性、与FAD的结合能力、和/或更好的酶催化活性;
其中所述环氧化酶Lsd18变体的热稳定性与野生型相比提高了至少5%,优选提高了至少7%,更优选提高了至少10%,甚至更优选提高了至少11%。
2.权利要求1的环氧化酶Lsd18的变体,其包含在选自如下组中的一个或多个位置改变:S195、N433、A78、T189、S237、R473、E139、S391、G101、P326、R21、R51、D52、V64、S108、S237、H239;其中
(1)改变是独立地
(a)在占据该位置的氨基酸下游插入氨基酸,
(b)缺失占据该位置的氨基酸,或
(c)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸;
(2)该变体具有环氧化酶活性;和
(3)各位置编号对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
3.权利要求1-2任一项的变体,其中该突变是:
选自S195M、N433L、A78M、T189M、S237M、R473D、E139M、S391L、G101P、P326A、P326S、R21G、R51W、D52S、V64D、S108V、S237V、H239L中的一个或多个位置的氨基酸替换;优选该突变是选自N433L,S391L,A78M,T189M,S237M,R473D,S195M,E139M,T189M-S195M,R51W-D52S-V64D,S108V-S237V-H239L的突变;更优选该突变是T189M,S195M,或T189M-S195M。
4.一种多核苷酸编码序列,其编码权利要求1-9中任一项所述环氧化酶Lsd18的变体。
5.一种核酸构建体,它含有权利要求10所述多核苷酸编码序列。
6.一种重组表达载体,其携带根据权利要求11的核酸构建体。
7.根据权利要求11的核酸构建体或根据权利要求12的载体转化的细胞;所述细胞优选是细菌、真菌、动物细胞或植物细胞。
8.一种组合物,它含有权利要求1-9任一项的环氧化酶Lsd18的变体。
9.一种试剂盒,其含有权利要求12所述重组表达载体,权利要求13或14所述细胞,或权利要求15所述组合物。
10.权利要求1-9任一项所述环氧化酶Lsd18变体在合成天然产物中的应用;所述天然产物优选是Lasalocid(拉沙里菌素)。
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