CN107988281A

CN107988281A - Aro8在催化生产l-蛋氨酸中的用途

Info

Publication number: CN107988281A
Application number: CN201711320517.9A
Authority: CN
Inventors: 布泰·朱利安; 休伊特·罗伯特; 尹胜; 王成涛; 吴平; 吴一平
Original assignee: Lan-Star Andy Su Nanjing Co Ltd
Current assignee: Lan-Star Andy Su Nanjing Co Ltd
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN107988281B

Abstract

本发明涉及食品和药品工业领域，具体涉及ARO8在催化生产L‑蛋氨酸中的用途，通过氨基供体与KMBA在ARO8的催化下生成L‑蛋氨酸，从而可以高效地将KMBA转化为L‑蛋氨酸。通过合适的氨基供体与KMBA的摩尔比例混合后，L‑蛋氨酸的转化率可以达到100%。这种高效的酶催化生产L‑蛋氨酸的新方法在工业上具有潜在的应用价值。

Description

ARO8在催化生产L-蛋氨酸中的用途

技术领域

本发明涉及食品和药品工业领域，具体涉及ARO8在催化生产L-蛋氨酸中的用途。

背景技术

正如在文献Johnson, D. (2015). Evaluation of methionine and cysteinerequirements of the French guinea fowl broiler，Amin, K. A., Hashem, K. S.,Al-muzafar, H. M., & Taha, E. M. (2014). Oxidative hepatotoxicity effects ofmonocrotaline and its amelioration by lipoic acid, S-adenosyl methionine andvitamin E. Journal of Complementary and Integrative Medicine, 11(1), 35-41，和Obata, F., & Miura, M. (2015). Enhancing S-adenosyl-methionine catabolismextends Drosophila lifespan. Nature communications, 6，Manta, B., & Gladyshev,V. N. (2017). Regulated methionine oxidation by monooxygenases. Free RadicalBiology and Medicine中所公开的那样，蛋氨酸是在动物营养、食品和药品工业中广泛使用的一种重要的含硫氨基酸。

目前，蛋氨酸主要通过化学合成来生产(Häffner, J., & Arbeitsgemeinschaftfür Wirkstoffe in der Tierernährung. (1998).Aminosäuren in der Tierernährung.Agrimedia.Li Y, Cong H, Liu B, et al. Metabolic engineering ofCorynebacterium glutamicum for methionine production by removing feedbackinhibition and increasing NADPH level[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2016, 109(9): 1185-1197.)，这通常产生L-蛋氨酸和不需要的D-蛋氨酸的外消旋混合物(Kumar,D., & Gomes, J. (2005). Methionine production by fermentation.Biotechnologyadvances, 23(1), 41-61.)。相反，酶催化可以产生光学纯的L-蛋氨酸。用于生产蛋氨酸的一种众所周知的工业操作方法是将N-乙酰基D, L-蛋氨酸通过酶转化成纯的L-形式(Hummel W, Geueke B, Osswald S, Weckbecker C, Huthmacher K (2005) Patent toDegussa: Methods of the preparation of L-amino acids from D-amino acids.US7217544(B2) Willke, T. (2014). Methionine production--a critical review.Applied microbiology and biotechnology, 98(24), 9893.)。除此之外，还可以通过微生物发酵生产L-蛋氨酸。但它的主要缺陷在于蛋氨酸的生物合成途径极为复杂，反馈存在有各种抑制作用(Willke, T. (2014). Methionine production--a critical review.Applied microbiology and biotechnology, 98(24), 9893)。因此，已付出了诸多努力来研发使用廉价的原材料来生产L-蛋氨酸的新的简单有效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的L-蛋氨酸的生产方法。

为了实现这一发明目的，我们公开了ARO8在催化生产L-蛋氨酸中的用途。

ARO8是一种转氨酶，其是由酿酒酵母克隆，并经过大肠杆菌过度表达获得的。

进一步地，我们公开了ARO8催化生产L-蛋氨酸的具体方法为：氨基供体与KMBA在ARO8的催化下生成L-蛋氨酸。优选地，氨基供体与KMBA在ARO8催化下，30℃培育30min生成L-蛋氨酸。

KMBA是指具有结构式的酮酸。

进一步优选地，我们具体公开氨基供体为氨基酸。其中优选为亮氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或者酪氨酸，其中最为优选的方案是采用谷氨酸。

另外，我们还进一步优选公开氨基供体与KMBA的摩尔比大于等于3:1。其中特别优选的是氨基供体与KMBA的摩尔比为3:1。

采用本发明所公开的技术方案后，可以高效地将KMBA转化为L-蛋氨酸。通过合适的氨基供体与KMBA的摩尔比例混合后，L-蛋氨酸的转化率可以达到100%。这种高效的酶催化生产L-蛋氨酸的新方法在工业上具有潜在的应用价值。

附图说明

图1 为酿酒酵母菌株中的转氨酶活性分析结果示意图。

图2为对来自大肠杆菌菌株的蛋白样品的SDS-PAGE分析结果示意图，其中M，蛋白标记；1，具有IPTG诱导的ARO8-BL21溶解产物的上清液；2，不具有诱导的ARO8-BL21溶解产物的上清液；3，具有诱导的BL21溶解产物的上清液。

图3为大肠杆菌菌株中的转氨酶活性分析结果示意图。

图4为经过纯化的重组ARO8蛋白的SDS-PAGE分析结果示意图，其中M，蛋白标记；1，经过纯化的ARO8。

图5为不同氨基酸作为氨基供体对蛋氨酸生产的影响分析结果示意图。

图6为不同摩尔比的谷氨酸与KMBA对蛋氨酸生产的影响分析结果示意图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1

本实例中所需要用到的菌株和质粒来源见表1：

【注1】Yin S, Lang T, Xiao X, et al. Significant enhancement of methionolproduction by co-expression of the aminotransferase gene ARO8 and thedecarboxylase gene ARO10 in Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS microbiologyletters, 2014, 362(5): fnu043.

将用于ARO8过度表达的野生型菌株S288c、含有空载体的重组菌株S0和具有pYES-pgk-ARO8的S8培养24小时，用于确定针对用于生产蛋氨酸的KMBA的转氨酶活性。如图1中的结果所示，S8展现最强的转氨酶活性，比S0和S288c高出2倍多，表明ARO8的过度表达使酶活性显著增加。

实施例2

如Sambrook & Russell (2001)所述进行标准的DNA操作技术。根据制造商说明(TIANGEN, Beijing, China)，使用酵母基因组DNA试剂盒从酵母中提取基因组DNA。根据制造商说明(TIANGEN, Beijing, China)，使用高纯度质粒小量提取试剂盒从大肠杆菌中分离质粒DNA。根据供应商的说明(TRANSGEN, Beijing, China)进行DNA接合。使用标准的热休克转化方法将质粒DNA引入大肠杆菌BL21 (DE3)中(Sambrook & Russell, 2001)。

基于ARO8基因(基因库登记号. NM_001181067.1)，设计用于PCR的特异性引物(F-ARO8：5’-ATGACTTTACCTGAATCAAAAGAC-3’；R-ARO8：5’- CTATTTGGAAATACCAAATTCTTC-3’)。通过PCR由酿酒酵母S288c的基因组DNA扩增ARO8基因。根据制造商推荐(Takara, China)，使用Takara引物SRTAR® MAX DNA聚合酶进行扩增反应。根据制造商推荐(Takara,China)，使用TaKaRa MiniBEST DNA片段纯化试剂盒纯化并回收扩增子。根据制造商推荐(TRANSGEN, China)，使用pEASY-Blunt E1表达试剂盒将经过纯化的扩增子连接至表达载体pEASY-Blunt E1，产生重组载体pEASY-ARO8。将DNA接合混合物转化为大肠杆菌Trans-T1并在含有200 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上筛选转化体。接着对阳性重组质粒进行测序，并针对基因库数据库用NCBI的DNAMAN 软件包和BLAST程序进行进一步分析。

重组后的DNA序列(ARO8基因核苷酸序列（1503 bp）)为SEQ ID NO:1:

1 ATGACTTTAC CTGAATCAAA AGACTTTTCT TACTTGTTTT CGGATGAAAC CAATGCTCGT

61 AAACCATCCC CATTGAAAAC CTGCATCCAT CTTTTCCAAG ATCCTAACAT TATCTTTTTG

121 GGTGGTGGCC TGCCATTAAA AGATTATTTC CCATGGGATA ATCTATCTGT AGATTCACCC

181 AAGCCTCCTT TTCCCCAGGG TATTGGAGCT CCAATTGACG AGCAGAATTG CATAAAATAC

241 ACCGTCAACA AAGATTACGC TGATAAAAGT GCCAATCCTT CCAACGATAT TCCTTTGTCA

301 AGAGCTTTGC AATACGGGTT CAGTGCTGGT CAACCTGAAC TATTAAACTT CATTAGAGAT

361 CATACCAAGA TTATCCACGA TTTGAAGTAT AAGGACTGGG ACGTTTTAGC CACTGCAGGT

421 AACACAAATG CCTGGGAATC TACTTTAAGA GTCTTTTGTA ACCGAGGTGA TGTCATCTTA

481 GTTGAGGCAC ATTCTTTTTC CTCTTCATTG GCTTCTGCAG AGGCTCAAGG TGTCATTACC

541 TTCCCCGTGC CAATTGACGC TGATGGTATC ATTCCTGAAA AATTAGCTAA AGTCATGGAA

601 AACTGGACAC CTGGTGCTCC TAAACCAAAG TTGTTATACA CTATTCCAAC GGGCCAAAAT

661 CCAACTGGTA CTTCCATTGC AGACCATAGA AAGGAGGCAA TTTACAAGAT CGCTCAAAAG

721 TACGACTTCC TAATTGTGGA AGATGAACCT TATTATTTCT TACAAATGAA TCCCTACATC

781 AAAGACTTGA AGGAAAGAGA GAAGGCACAA AGTTCTCCAA AGCAGGACCA TGACGAATTT

841 TTGAAGTCCT TGGCAAACAC TTTCCTTTCC TTGGATACAG AAGGCCGTGT TATTAGAATG

901 GATTCCTTTT CAAAAGTTTT GGCCCCAGGG ACAAGATTGG GTTGGATTAC TGGTTCATCC

961 AAAATCTTGA AGCCTTACTT GAGTTTGCAT GAAATGACGA TTCAAGCCCC AGCAGGTTTT

1021 ACACAAGTTT TGGTCAACGC TACGCTATCC AGGTGGGGTC AAAAGGGTTA CTTGGACTGG

1081 TTGCTTGGCC TGCGTCATGA ATACACTTTG AAACGTGACT GTGCCATCGA TGCCCTTTAC

1141 AAGTATCTAC CACAATCTGA TGCTTTCGTG ATCAATCCTC CAATTGCAGG TATGTTTTTC

1201 ACCGTGAACA TTGACGCATC TGTCCACCCT GAGTTTAAAA CAAAATACAA CTCAGACCCT

1261 TACCAGCTAG AACAGAGTCT TTACCACAAA GTGGTTGAAC GTGGTGTTTT AGTGGTTCCC

1321 GGTTCTTGGT TCAAGAGTGA GGGTGAGACG GAACCTCCTC AACCCGCTGA ATCTAAAGAA

1381 GTCAGTAATC CAAACATAAT TTTCTTCAGA GGTACCTATG CAGCTGTCTC TCCTGAGAAA

1441 CTGACTGAAG GTCTGAAGAG ATTAGGTGAT ACTTTATACG AAGAATTTGG TATTTCCAAA

1501 TAG

将重组质粒pEASY-ARO8转化为大肠杆菌BL21 (DE3) (TIANGEN, Beijing, China)并在含有200 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上筛选转化体。在37℃下伴随剧烈震荡将重组菌株BL21-ARO8在含有氨苄青霉素的LB培养基中以200 rpm培养过夜。接着将1%的新鲜培养物接种到20 mL含有氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，且在37℃下伴随剧烈震荡以200 rpm进行培养。当OD₆₀₀达到0.5时，向培养物中添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，最终浓度为0.5 mM。接着将培养物在20℃下伴随剧烈震荡以200 rpm培养7 h。通过在0℃下，在角状超声波破碎仪(225 W输出，SL-650D, Nanjing, China)中以2 s的间隔进行超声波处理10min来制备细胞提取物(Wu, T., Yu, X., Hu, A., Zhang, L., Jin, Y., & Abid, M.(2015). Ultrasonic disruption of yeast cells: underlying mechanism andeffects of processing parameters. Innovative Food Science & EmergingTechnologies, 28, 59-65.; Liu, D., Zeng, X. A., Sun, D. W., & Han, Z. (2013).Disruption and protein release by ultrasonication of yeast cells. InnovativeFood Science & Emerging Technologies, 18(2), 132-137.)。通过在4℃下以10000 g离心5分钟去除细胞碎片。接着制备蛋白质样品用于在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE分析(Sambrook & Russell, 2001)。由多光谱成像技术(USA)对凝胶进行扫描。根据UVP软件分析的O.D.值(Zhang, Y., Wei, X., Lu, Z., Pan, Z., Gou, X., & Venkitasamy, C.,et al. (2017). Optimization of culturing conditions of recombined escherichiacoli to produce umami octopeptide-containing protein. Food Chemistry,227, 78-84)计算重组蛋白的含量(CRP)。

实施例3

将实施例1中获得的序列进行分析，结果显示：由酿酒酵母S288c扩增的1503-bp ARO8与2-氨基乙二酸转氨酶基因(基因库登记号. NM_001181067.1)共享100%的一致性。通过将ARO8插入pEASY Blunt E1中构筑的重组表达载体pEASY-ARO8被转化为大肠杆菌BL21(DE3)，产生重组菌株BL21-ARO8（购于天根生化科技（北京）有限公司：）。通过SDS-PAGE分析在具有和不具有IPTG的情形下培养的BL21-ARO8和BL21的蛋白样品。如图2中所示，在具有IPTG诱导的BL21-ARO8样品中观察到大量分子质量为57 kDa的重组ARO8蛋白。与此形成鲜明对比的是，在不具有IPTG诱导的BL21-ARO8样品和野生型BL21样品中几乎未检测到目标蛋白。电泳结果表明，ARO8在具有IPTG诱导的大肠杆菌BL21 (DE3)中有效表达。此外，转氨酶活性分析表明具有IPTG诱导的BL21-ARO8的蛋白样品展现出最强活性，比不具有诱导的BL21-ARO8和BL21高出4.5倍多(图3)。这表明外来的ARO8蛋白在大肠杆菌BL21中正确折叠，而且对蛋氨酸生产具有转氨活性。

实施例4

为了获得高产率的ARO8蛋白，进行单因素试验和正交实验设计来优化诱导的蛋白表达。根据单因素试验结果(支持信息)，选择培育温度(20℃、25℃和30℃)、培育时间(5 h、7h和9 h)和IPTG浓度(0.5 mM、0.6 mM和0.7 mM)作为重要的影响因素，并使用正交实验设计L₉ (3³)进一步评估(表2和3)。定量分析在9种合并条件下的ARO8表达并显示在表3中。基于极差分析结果，最佳的蛋白表达条件确定为A₂B₁C₃组合，在这种条件下ARO8的重组蛋白含量(CRP)达到15.81%。因此，通过0.7 mM IPTG诱导，在25℃下细胞培养9小时来制备重组ARO8。

表2 L₉(3³)正交实验设计的因素和等级

A，培育温度；B，培育时间；C，IPTG浓度。

表3 用于优化ARO8的诱导表达的设计矩阵和实验数据

实施例5 ARO8蛋白的纯化

细胞碎片的透明上清液首先经过0.22 μm的多孔膜进行过滤。接着将经过过滤的上清液添加到含有Ni-NTA树脂的Ni柱上(TRANSGEN, Beijing, China)。添加麦芽糖以减少可能的非特异性结合蛋白。用裂解缓冲液清洗柱，去除未结合的蛋白。用洗涤缓冲液(50 mM磷酸钾溶液、2 mM EDTA、2 mM DTT、0.1 mM PLP、200 mM咪唑，pH7.5)洗提通过6×His标签附接到Ni柱中的Ni²⁺-螯合珠粒的重组ARO8蛋白。收集洗脱液进行SDS-PAGE分析。Zhang, Y.,Wei, X., Lu, Z., Pan, Z., Gou, X., & Venkitasamy, C., et al. (2017).Optimization of culturing conditions of recombined escherichia coli toproduce umami octopeptide-containing protein. Food Chemistry,227, 78-84.;Jiang, J., Zheng, J., She, Y., & Jia, Z. (2015). Expression and purificationof human wwp2 hect domain in escherichia coli. Protein Expression &Purification, 110, 95-101.; He W., Shu, J., Zhang, J., Liu, Z., Xu, J., &Jin, X., et al. (2017). Expression, purification and renaturation ofrecombinant peptide-based hiv vaccine in escherichia coli. Canadian Journalof Microbiology.)。

用含有200 mM咪唑的洗涤缓冲液(50 mM磷酸钾溶液、2 mM EDTA、2 mM DTT、0.1mM PLP、200 mM咪唑，pH7.5)从Ni柱洗提重组ARO8蛋白并由SDS-PAGE进行分析。电泳结果表明在洗提样品中检测到高浓度的57 kDa ARO8，而在同一泳道中几乎未观察到非特异性蛋白(图4)。蛋白含量测量表明，洗提样品中的ARO8浓度比未经纯化的样品高出10倍，证明重组ARO8成功纯化。经过纯化的ARO8然后用于蛋氨酸生产。

实施例6

将100 μL的纯化ARO8蛋白、700 μL的裂解缓冲液(50 mM potassium phosphate, 2 mMEDTA, 2 mM DTT, and 0.1 mM PLP, pH7.5) (Philippe P et al., 2006)、100 μL的10mM KMBA和100 μL的10 mM氨基供体混合并在30℃下培育30 min。使用BCA蛋白检测试剂盒(TIANGEN, Beijing, China)确定每种透明上清液样品的蛋白浓度。通过HPLC (SHIMADZU,Shanghai, China)确定蛋氨酸的量。从19种不同的氨基酸中通过评估它们对蛋氨酸生产的影响来筛选最佳的氨基酸供体。结果见图6。

在19种氨基酸中观察到显著的差异。如图5中所示，当分别使用亮氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸和酪氨酸作为氨基供体时，可以实现更高产率的蛋氨酸。

考虑到可用性和市场价格，选择工业上散装的化学谷氨酸作为最佳的氨基供体用于蛋氨酸生产。

实施例7

考察不同的KMBA与谷氨酸的摩尔比例与获得蛋氨酸的相关关系。

按照实施例5中公开的方法，我们以谷氨酸为氨基供体，通过添加与谷氨酸不同摩尔比的KMBA来考察谷氨酸与KMBA在L-蛋氨酸生产中的最佳摩尔比例。结果如图6所示。

可以看出，随着KMBA和谷氨酸的摩尔比增加，产生更多的蛋氨酸，而且当KMBA和谷氨酸的摩尔比高于3:1时，大约100% KMBA通过ARO8催化被转化成蛋氨酸。因此，在使用摩尔比为3:1的KMBA和谷氨酸作为底物供经过纯化的ARO8催化的最佳条件下，蛋氨酸达到约100%的转化率。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京蓝星安迪苏

<120> ARO8在催化生产L-蛋氨酸中的用途

<130> 20171206

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgactttac ctgaatcaaa agacttttct tacttgtttt cggatgaaac caatgctcgt 60

aaaccatccc cattgaaaac ctgcatccat cttttccaag atcctaacat tatctttttg 120

ggtggtggcc tgccattaaa agattatttc ccatgggata atctatctgt agattcaccc 180

aagcctcctt ttccccaggg tattggagct ccaattgacg agcagaattg cataaaatac 240

accgtcaaca aagattacgc tgataaaagt gccaatcctt ccaacgatat tcctttgtca 300

agagctttgc aatacgggtt cagtgctggt caacctgaac tattaaactt cattagagat 360

cataccaaga ttatccacga tttgaagtat aaggactggg acgttttagc cactgcaggt 420

aacacaaatg cctgggaatc tactttaaga gtcttttgta accgaggtga tgtcatctta 480

gttgaggcac attctttttc ctcttcattg gcttctgcag aggctcaagg tgtcattacc 540

ttccccgtgc caattgacgc tgatggtatc attcctgaaa aattagctaa agtcatggaa 600

aactggacac ctggtgctcc taaaccaaag ttgttataca ctattccaac gggccaaaat 660

ccaactggta cttccattgc agaccataga aaggaggcaa tttacaagat cgctcaaaag 720

tacgacttcc taattgtgga agatgaacct tattatttct tacaaatgaa tccctacatc 780

aaagacttga aggaaagaga gaaggcacaa agttctccaa agcaggacca tgacgaattt 840

ttgaagtcct tggcaaacac tttcctttcc ttggatacag aaggccgtgt tattagaatg 900

gattcctttt caaaagtttt ggccccaggg acaagattgg gttggattac tggttcatcc 960

aaaatcttga agccttactt gagtttgcat gaaatgacga ttcaagcccc agcaggtttt 1020

acacaagttt tggtcaacgc tacgctatcc aggtggggtc aaaagggtta cttggactgg 1080

ttgcttggcc tgcgtcatga atacactttg aaacgtgact gtgccatcga tgccctttac 1140

aagtatctac cacaatctga tgctttcgtg atcaatcctc caattgcagg tatgtttttc 1200

accgtgaaca ttgacgcatc tgtccaccct gagtttaaaa caaaatacaa ctcagaccct 1260

taccagctag aacagagtct ttaccacaaa gtggttgaac gtggtgtttt agtggttccc 1320

ggttcttggt tcaagagtga gggtgagacg gaacctcctc aacccgctga atctaaagaa 1380

gtcagtaatc caaacataat tttcttcaga ggtacctatg cagctgtctc tcctgagaaa 1440

ctgactgaag gtctgaagag attaggtgat actttatacg aagaatttgg tatttccaaa 1500

tag 1503

Claims

1.ARO8在催化生产L-蛋氨酸中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征是：氨基供体与KMBA在ARO8的催化下生成L-蛋氨酸。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征是：氨基供体为氨基酸。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征是：氨基供体与KMBA的摩尔比大于等于3:1。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征是：氨基供体与KMBA的摩尔比为3:1。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征是：氨基酸为亮氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或者酪氨酸。

7.根据权利要求2所述的用途，其特征是：氨基供体与KMBA在ARO8催化下，30℃培育30min生成L-蛋氨酸。