JP5600055B2 - 脂質分解酵素変異体 - Google Patents
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Description
本発明は、アミノ酸配列を修飾することによって脂質分解酵素の基質特異性を変える方法および、そのような修飾によって得られる脂質分解酵素変異体に関する。本発明はまた、脂質分解酵素のスクリーニング方法に関する。
脂質分解酵素(例えばリパーゼおよびホスホリパーゼ)は、基質中のカルボン酸エステル結合を加水分解して、カルボン酸を放出することができる。異なるエステル結合に対する加水分解活性は、種々の工業用途における脂質分解酵素の有用性のために重要である。
本発明者らは、脂質分解酵素の基質特異性が、所望の活性レベルを上げるか、または望ましくない活性レベルを下げるように、脂質分解酵素の所定の領域におけるアミノ酸配列を変更することによって修飾できることを見出した。かくして、本発明者らは、特定の用途のためにあつらえることができる基質特異性を有する、修飾されたアミノ酸配列を有する脂質分解酵素(以下では、脂質分解酵素変異体または、短く変異体と呼ぶ)を開発した。
a)基質および注目のエステル結合を選択すること、
b)親脂質分解酵素を選択すること、
c)以下に記載する親脂質分解酵素の活性部位の近くの領域、C-末端の近くの領域、またはふた領域に、少なくとも1つのアミノ酸残基を選択すること、
d)そのそれぞれがアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換である変更を行うこと、
e)任意的に、c)以外の1つ以上の位置で、そのそれぞれがアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換である変更を行うこと、
f)得られる変異体を製造すること、
g)基質中のエステル結合に対する変異体の活性を試験すること、および
h)エステル結合に対する変えられた活性を有する変異体を選択すること
を含む。
i) 脂質分解酵素の構造と、触媒的三つ組および阻害リン原子を含むリゾムコール ミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ構造4TGL (4TGL-inhP)とを、2つの構造の触媒的三つ組の原子間の偏差の二乗の合計を最小にするように位置を調整すること(aligning)、
ii) 4TGL-inhPに中心を有する、半径18オングストロームの球の内側にある脂質分解酵素の原子からなるセットAを規定すること、
iii) 4TGL-inhP、親脂質分解酵素の活性Ser残基のCα原子および親脂質分解酵素の活性Asp残基のCα原子により規定される第1の平面を形成し、親脂質分解酵素の活性His残基のCα原子とは第1の平面の同じ側にある原子からなる、セットAのサブセットとしてセットBを規定すること、
iv) 4TGL-inhP、親脂質分解酵素の活性Ser残基のCα原子および親脂質分解酵素の活性His残基のCα原子により規定される第2の平面を形成し、親脂質分解酵素の活性Asp残基のCα原子とは第2の平面の反対側にある原子からなる、セットAのサブセットとしてセットCを規定すること、
v)セットBとセットCとを合わせたものに属し、かつ15以上の溶媒アクセシビリティ(accessibility)を有するする原子からなるセットDを形成すること、ならびに
vi)セットDに属する原子または、セットBとセットCとを合わせたものに属し、セットDに属する原子から3.5オングストローム未満に配置される原子を含む構造中のアミノ酸残基からなるセットEを形成すること。
基質中の選択されたエステル結合に対する変えられた活性
親脂質分解酵素と比べて、本発明は、少なくとも1つの基質中の少なくとも1つの選択されたエステル結合に対する活性を変えること、すなわち、所望の活性を増加させ、望ましくない活性を減少させるか、または、望ましくない活性対所望の活性の比を減少させることにより基質特異性を変えることを目的とする。
本発明において使用されるべき脂質分解酵素は、エステル結合を加水分解することができるものである。そのような酵素としては、例えばリパーゼ、例えばトリアシルグリセロールリパーゼ(EC 3.1.1.3)、リポタンパク質リパーゼ(EC 3.1.1.34)、モノグリセリドリパーゼ(EC 3.1.1.23)、リゾホスホリパーゼ、フェルラ酸エステラーゼおよびエステラーゼ(EC 3.1.1.1, EC 3.1.1.2)を包含する。括弧中の数字は、酵素の酵素反応性のタイプに従って生化学国際連合の酵素委員会により割当てられた系統番号である。
すでに述べたように、親脂質分解酵素のアミノ酸配列は、基質トリグリセリドのグリセロール部分に近い位置で修飾され得る。この領域は、リパーゼの「アルコール結合部位」と称され;ブルゾゾウスキー(Brzozowski) A Mら、Nature, 351, 491 (1991);ウッペンベルグ(Uppenberg)ら、Biochemistry, 1995, 34, 16838-16851;A.スベンセン(Svendsen), Inform, 5(5), 619-623 (1994)に記載されている。
すでに述べたように、1つの態様においては、親脂質分解酵素は、活性Ser、活性Aspおよび活性His残基からなる触媒的三つ組を含む構造を有し、変更されるべきアミノ酸は、上記したある種の工程により定義されるセットに属する。構造は、開いた構造または閉じた構造であることができ、基質または阻害剤を含むか、または含まないことができる。
上記したように、活性His残基と末端との間のアミノ酸配列において、特に活性HisのC-末端側で12個のアミノ酸の間で、1つ以上の変更を行い得る。
上記したように、1つ以上の変更は、成熟タンパク質のC-末端からアミノ酸10個以内の位置で行われ得るか、
または、H. ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼのそのような位置に対応する位置、すなわちH. ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼの位置260-269で行われ得る。対応する位置は、本明細書で後に記載する2つの配列のアラインメントにより見出すことができる。
上記したように、親脂質分解酵素のアミノ酸配列は、親脂質分解酵素のふた領域中で修飾され得る。この領域は、ブラディ(Brady)ら、Nature, 343, 1990, 767-770およびブルゾゾウスキー(Brzozowski) A Mら、Nature, 351, 491 (1991)に記載されている。H. ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼにおいては、ふたは、位置80-100に配置され、修飾は特に、位置82-98、例えば91-98にてなされ得る。
本発明の脂質分解酵素変異体は、上記した任意の領域に1つ以上のアミノ酸残基変更を含む。各変更は、アミノ酸残基の欠失または置換であることができ、または、アミノ酸残基の前もしくは後への挿入であることができる。アミノ酸残基がC-末端にあるなら、挿入はC-末端伸長であり得る。挿入は典型的には、1〜5個、例えば1〜2個のアミノ酸残基からなり、C-末端伸長は、1〜50個または2〜10個のアミノ酸残基からなり得る。
フミコラ(Humicola)科の脂質分解酵素の変異体を製造するために、アミノ酸変更は特に、フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの20-25、56-64、81-85または255-269に対応する位置でなされ得る。かくして、変更は、A20、Y21、G23、K24、N25、V63、R81、G82、R84、A257、W260、Y261、F262またはG266(例えば、G23C、K24C、R81Cを除外する)に対応する位置での置換、欠失または挿入、C268またはL269に対応するアミノ酸の置換であることができる。
変異を定義するために本明細書で使用した命名法は、基本的には、WO92/05249に記載されたものである。かくして、G91Aは、位置91でGをAで置換することを示す。T267A,Qは、位置267で、TをAまたはQで置換することを示す。E1E,D,Aは、E1はそのままか、またはDもしくはAで置換されることを示す。
本発明の目的のためには、相同性の程度は、当技術分野で公知のコンピュータプログラム、例えばGCGプログラムパッケージ(ウィスコンシン パッケージのためのプログラム マニュアル(Program Manual for the Wisconsin Package)、バージョン8、1994年8月、ジェネティックス コンピュータ グループ(Genetics Computer Group)、575 サイエンス ドライブ(Science Drive)、マジソン(Madison)、ウィスコンシン(Wisconsin)、USA53711)(ニードルマン(Needleman), S. B. およびワンシュ(Wunsch), C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45)において提供されるGAPによって、ポリペプチド配列比較のための以下の設定:GAP創造ペナルティ(creation penalty)3.0およびGAP伸長ペナルティ(extension penalty)0.1を有するGAPを用いて、適当に決定され得る。
上記したように、本発明の変異体は、親脂質分解酵素より高いホスホリパーゼ活性を有することができる。本明細書において後で述べる単層法により、変異体は、pH5にて少なくとも0.1ナノモル/分のホスホリパーゼ活性を有し得る。
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの多くの変異体は、リパーゼ活性のためにアルカリ性pH最適条件および、ホスホリパーゼ活性のために酸性pH最適条件を有する(例えば、リパーゼのためにpH9〜10および、ホスホリパーゼのためにpH4〜6)。そのような変異体は、非常に低い付随的リパーゼ活性を有するホスホリパーゼとして、酸性pHで使用することができる(例えば、後に述べる油の脱ゴム(degumming)において)。
変異体の熱安定性は、示差走査熱量測定(DSC)によって便利に評価することができる。正確な変異に依存して、本発明の変異体は一般に、親脂質分解酵素と同様またはわずかに低い熱安定性を有する。
基質特異性に依存して、本発明の変異体は、例えばろ過の改善、植物油処理、パン焼き、洗剤またはリゾリン脂質の製造において使用することができる。
変異体で処理することによって、炭水化物起源の水性溶液またはスラリ−のろ過性を改善するために、リゾホスホリパーゼ活性を有する変異体を使用することができる。これは、でん粉加水分解物、特に小麦でん粉の加水分解物を含む溶液またはスラリーに特に適用できる。というのは、小麦でん粉の加水分解物は、ろ過しにくく、曇ったろ液が得られる傾向があるからである。この処理は、欧州特許第219,269号(CPCインターナショナル(international))と同様にして行うことができる。
ホスホリパーゼ活性を有する変異体を、食用油中のリン脂質含量を減らすためのプロセスにおいて使用することができ、このプロセスは、大部分のリン脂質を加水分解するように変異体で油を処理すること、および加水分解されたリン脂質を含む水相を油から分離することを含む。このプロセスは、リン脂質を含む任意の食用油、例えば植物油(例えば大豆油、菜種油およびヒマワリ油)の精製に適用できる。この処理は、酸性pH、例えばpH3〜5で行うことができる。有利には変異体は、2つの活性の異なるpH最適条件の故に、低pHで高いホスホリパーゼ活性および低いリパーゼ活性を有するように、選択されることができる。
例えば、欧州特許第870840号、特開平10-42884号公報、特開平4-135456号公報または特開平2-49593号公報に記載されたようにして、対応するリン脂質を変異体で処理することによって、リゾリン脂質(例えば、リゾ-レクチン)を製造するために、ホスホリパーゼ活性を有する変異体を使用することができる。変異体はまた、例えば欧州特許第628256号、同第398666号または同第319064号に記載されているように、マヨネーズを作るために使用することができる。
パン生地、パンおよびケーキの製造において、例えば生地の安定性および生地の取扱い特性を増進するために、またはパンもしくはケーキの弾性を改善するために、ホスホリパーゼ活性および/またはDGDGアーゼ活性を有する変異体を使用することができる。かくして、変異体を、パンを作るプロセスにおいて使用することができ、このプロセスは、生地の成分に変異体を添加すること、生地をこねること、および生地を焼いてパンを作ることを含む。これは、米国特許第4,567,046号(キョウワ ハッコウ(Kyowa Hakko))、特開昭60-78529号公報(QPコーポレーション(Corp.))、特開昭62-111629号公報(QPコーポレーション(Corp.))、特開昭63-258528号公報(QPコーポレーション(Corp.))、欧州特許第426211(ユニリーバー(Unilever))または国際特許出願公開WO99/53769(ノボ ノルディスク(Novo Nordisk))と同様にして行うことができる。
短鎖脂肪族アシル基への活性を有する変異体は、食品におけるフレーバー発生のために、例えばチーズの熟成において、M.ハンソン(Hanson), ZFL, 41(10), 664-666 (1990)に記載されているように、遊離の脂肪酸(FFA)を放出するために使用することができる。
変異体は、洗剤添加剤として、例えば0.001〜10(例えば0.01〜1)mg/g洗剤または0.001〜100(例えば0.01〜10)mg/リットル洗浄液の濃度(精製酵素タンパク質として表した)で使用することができる。
本発明の洗剤組成物は、例えば、染色された布の前処理のために適当な洗濯添加剤組成物およびリンス剤を加えた布用柔軟剤組成物を含む、手洗いもしくは機械洗濯用の洗剤組成物として処方することができ、または一般的な家庭用の硬質表面清浄作業における使用のための洗剤組成物として処方することができる。洗濯洗剤においては、変異体は、脂汚れの除去、白色維持および黒ずみの浄化のために有効であり得る。洗濯洗剤組成物は、WO97/04079、WO97/07202、WO97/41212、PCT/DK WO98/08939およびWO97/43375に記載されているようにして、処方することができる。
酵素をコードするDNA配列が分離され、変異のために望ましい部位が同定されたら、合成オリゴヌクレオチドを用いて、変異を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位を攻撃するヌクレオチド配列を含む。特定の方法においては、DNAの単鎖ギャップ(酵素をコードするDNA配列)が、酵素遺伝子を含むベクター中で作られる。次に、合成ヌクレオチド(所望の変異を有する)が、単鎖DNAの相同部分にアニールされる。残ったギャップは次に、DNAポリメラーゼI(クレノウフラグメント)を用いて満たされ、構築物は、T4リガーゼを用いて連結される。この方法の特定の例は、モリナガ(Morinaga)ら、(1984), Biotechnology 2, p. 646-639に記載されている。米国特許第4,760,025号は、カセットの小さい変更を行うことによる、多重変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、モリナガ(Morinaga)の方法によって、任意の一時に、非常に多くの種類の変異さえもが導入され得る。というのは、多重の種々の長さを有するオリゴヌクレオチドが導入され得るからである。
本発明に従って、上記した方法により、または当技術分野で公知の任意の代替的方法によって製造される変異体をコードするDNA配列は、酵素形態で、発現ベクターを用いて発現されることができ、発現ベクターは、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび任意的にリプレッサー遺伝子または種々のアクチベーター遺伝子をコードする調節配列を含む。
本発明の酵素変異体をコードするDNA配列を有する組換え発現ベクターは、組換えDNA操作に便利に供されることができる任意のベクターであることができ、ベクターの選択はしばしば、それが導入されるべき宿主細胞に依存する。ベクターは、宿主細胞に導入されるときに、宿主細胞ゲノムへ組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであり得る。適当な発現ベクターの例は、pMT838を含む。
ベクターにおいては、DNA配列は、適当なプロモーター配列に操作可能に接続されていなければならない。プロモーターは、選択される宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であることができ、宿主細胞に相同または非相同のタンパク質をコードする遺伝子から誘導されることができる。
本発明の発現ベクターはまた、適当な転写ターミネーターおよび、真核生物においては、本発明のα-アミラーゼ変異体をコードするDNA配列に操作可能に接続されたポリアデニル化配列を含むことができる。終止およびポリアデニル化配列は、プロモーターと同じ供給源から適当に誘導され得る。
本発明の細胞(先に定義した本発明のDNA構築物または発現ベクターを含む)は有利には、本発明の酵素変異体の組換え製造において宿主細胞として使用される。細胞は、便利には、宿主の染色体にDNA構築物(1つ以上のコピーで)を組み込むことによって、変異体をコードする本発明のDNA構築物を用いて形質転換されることができる。DNA配列が多分細胞中に安定に維持されるので、この組み込みは一般に有利であると考えられる。宿主染色体へのDNA構築物の組み込みは、慣用の方法に従って、例えば相同または非相同の組換えによって行うことができる。あるいは、細胞は、異なるタイプの宿主細胞と共に、上記した発現ベクターを用いて形質転換されることができる。
本発明はまた、回収可能な量でこの酵素を発現し、製造するように、本発明の変異体をコードするDNA配列を用いて形質転換された、トランスジェニック植物、植物の一部または植物細胞に関する。酵素は、植物または植物の一部から回収され得る。あるいは、組換え酵素を含む植物または植物の一部をそれ自体使用することができる。
トリブチリンに対するリパーゼ活性(LU)
乳化剤としてアラビアゴムを用いてトリブチリン(グリセリントリブチレート)を乳化することによって、リパーゼのための基質を調製する。30℃、pH7でのトリブチリンの加水分解を、pHスタット滴定実験で追跡する。1単位のリパーゼ活性(1LU)は、標準条件下で1分当たり1μモルの酪酸を放出することができる酵素の量に等しい。
脂質分解活性を、基質としてオリーブ油を用いて測定することができる。
ホスホリパーゼ活性(PHLU)は、レシチンからの遊離の脂肪酸の放出として測定される。50mMのHEPES、pH7中の50μlの4%L-アルファ-ホスファチジルコリン(アバンティ(Avanti)からの植物レシチン)、4%Triton X-100、5mMのCaCl2を、50mMのHEPES、pH7中で適当な濃度に希釈した50μlの酵素溶液に添加する。試料を30℃にて10分間インキュベートし、遠心分離(7000rpmにて5分)の前に、反応を95℃にて5分間停止する。ワコー ケミカルズ(Wako Chemicals)社からのNEFA Cキットを用いて、遊離の脂肪酸を測定し;25μlの反応混合物に250μlの試薬Aを添加し、37℃で10分間インキュベートする。次に、500μlの試薬Bを添加し、試料を再び37℃で10分間インキュベートする。HP 8452Aダイオードアレイ分光光度計を用いて、550nmでの吸収を測定する。試料は、少なくとも二重でランする。基質および酵素の結合(予備加熱された酵素試料(95℃で10分間)+基質)が含まれる。脂肪酸標準として、オレイン酸を使用する。1PHLUは、これらの条件下で1分当たり1μモルの遊離脂肪酸を放出することができる酵素の量に等しい。
一定のpHおよび温度下で、レシチンを加水分解し、遊離された脂肪酸の中和中の滴定剤(0.1N NaOH)消費速度として、ホスホリパーゼ活性を測定する。
緩衝溶液(10mMのグリシン、pH9.0または10mMのNaOAc、pH5.0;1mMのCaCl2、25℃)の徹底的に浄化した表面上に、ジ-デカノイルホスファチジルコリン(DDPC)の単層をクロロホルム溶液から広げる。単層を放置(クロロホルムの蒸発)後、表面圧を15mN/m(DDPCの平均分子面積(mean molecular area)約63オングストローム2/分子に相当する)に調整する。約60μg(マイクログラム)の酵素を含む溶液を、単層を通して、「ゼロ-次トラフ(zero-order trough)」内の反応区画の副相(subphase)(表面積2230mm2および反応体積56570mm3を有する注射器)に注入する。不溶性の基質分子がより水溶性の反応生成物へと加水分解されるので、一定の表面圧を維持するために、単層を圧迫する可動バリヤ(mobile barrier)の速度によって、酵素活性が表される。反応生成物(カプリン酸およびMDPC)の水溶性は、DDPCより著しく高いことが実証されているので、酵素によって1分当たり加水分解されたDDPC分子の数が、DDPCの平均分子面積(mean molecular area)(MMA)から見積られる。結果は、加水分解の最初の5分間にわたる平均バリヤ速度に基づいて計算される。
A)精製水中の2%アガロース50mlを、5分間溶解/撹拌し、60〜63℃に冷却する。
B) 30分間60℃にした、0.2MNaOAc、10mM CaCl2、pH5.5の中の2%植物L-α-ホスファチジル-コリン95%50mlを、ウルトラソラックス(ultrathorax)を用いて15秒間ブレンドする。
10gのアガロースを、電子レンジ中で沸騰させることによって550mlのH2O中に溶解させる。60〜70℃に冷却後、以下の成分を添加する:
250mlの0.4Mクエン酸塩緩衝液(pH4.5またはpH7.1)
200mlの、2% Triton X-100中3%レシチン(アバンティ(Avanti)からの)
2mlの2%クリスタルバイオレット
30mlの混合物を14cm径のペトリ皿に注ぐ。
単層アッセイ1
緩衝溶液(10mMのNaOAc、pH5.5;1mMのCaCl2、25℃;10mMのベータ-シクロデキストリン(シグマ(Sigma)C-4767))の徹底的に浄化した表面上に、DGDG(シグマ(Sigma)(D4651))の単層をクロロホルム溶液から広げる。単層を放置(クロロホルムの蒸発)後、表面圧を15mN/mに調整する。約60μg(マイクログラム)の酵素を含む溶液を、単層を通して、「ゼロ-次トラフ(zero-order trough)」内の反応区画の副相(subphase)(表面積2230mm2および反応体積56570mm3を有する注射器)に注入する。(ベータ-シクロデキストリンの存在下で)不溶性の基質分子がより水溶性の反応生成物へと加水分解されるので、一定の表面圧を維持するために、単層を圧迫する可動バリヤの増加する速度によって、酵素活性が表される。
緩衝溶液(約75ml、10mMのNaOAc、pH5.5;1mMのCaCl2、25℃;10mMのベータ-シクロデキストリン(シグマ(Sigma)C-4767))の徹底的に浄化した表面上に、DGDG(シグマ(Sigma)(D4651))の単層をクロロホルム溶液から広げて、表面圧約30mN/mにする。単層を放置(クロロホルムの蒸発)後、約30μg(マイクログラム)の精製酵素を含む溶液を、単層を通して、表面圧を連続して測定しながら、75mlの副相へと注入する。(ベータ-シクロデキストリンの存在下で)DGDGが水溶性の反応生成物へと加水分解されるので、表面圧低下の増加する速度によって、酵素活性が表される。
WO97/04079およびWO97/07205に記載された、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)YNG318:MATa leu2-D2 ura3-52 his4-539 pep4-D1[cir+]。
DNA断片および開いたベクター(opened vector)を混合し、標準の方法によって、酵母サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)YNG318へ形質転換する。
pJSO026(S. セレビシエ(cerevisiae)発現プラスミド)は、WO97/07205および、J.S.オッケルズ(Okkels)、(1996)「pYESベクターにおけるURA3-プロモーター欠失は、サッカロミセス セレビシエにおける菌類リパーゼの発現レベルを増加させる(A URA3-promoter deletion in a pYES vector increases the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae) 」 組換えDNAバイオテクノロジーIII:生物および工学科学の統合(Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences),ニューヨーク アカデミー オブ サイエンシーズ(New York Academy of Sciences)の会誌第782巻に記載されている。それは、pYES 2.0の誘導性GAL1-プロモーターを、構成的に発現されたサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からのTPI(トリオースホスフェートイソメラーゼ)-プロモーターで置換し(アルバート(Albert)およびカルワサキ(Karwasaki)、(1982)、J. Mol. Appl. Genet., 1, 419-434)、かつURA3プロモーターの一部を欠失することによって、pYES 2.0から誘導される。
H.ラヌジノサ(lanuginosa)脂質分解酵素の変異体の構成のために、市販のキット(カメレオン(Chameleon)二重鎖部位特異的変異誘発キット)を、製造業者の使用説明書に従って使用することができる。
プライマーno.7770を、選択プライマーとして使用した。
7770:5'p tct agc cca gaa tac tgg atc aaa tc 3'(アミノ酸配列を変えることなしに、H.ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼ遺伝子で見出されたScal部位を変える)。
酵母ライブラリーを、SC-ura寒天プレートのセルロースフィルター上に広げ、30℃で3〜4日間インキュベートする。
SC-ura培地
酵母窒素(アミノ酸なし) 7.5g
コハク酸 11.3g
NaOH 6.8g
カザアミノ酸(ビタミンなし) 5.6g
トリプトファン 0.1g
寒天、メルク(Merck) 20g
蒸留水 1000mlにした。
5%スレオニンの滅菌ストック溶液から4mlを、滅菌20%グルコース100mlと一緒に900mlの体積に添加する。
実施例1:フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼからの主鎖およびフサリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)ホスホリパーゼからのC-末端を用いた、PCR反応による変異体の構成
以下の変異体を、フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼからの主鎖のための鋳型として使用した:E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R およびSPIRR +G91A +D96W +E99K +Q249R。親リパーゼを、Q249RのないC-末端において断片を生成させるために使用した。C-末端ホスホリパーゼのための鋳型は、フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの変異体と同じベクターでクローン化した、フサリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)ホスホリパーゼであった。
PCR反応2:5'プライマーとしてのFOL14(SEQ ID NO:3)および3'プライマーとしてのFOL15(SEQ ID NO:4)および鋳型としてのフミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ(pos 249に変異なし)。
PCR反応4を行って、5'プライマーとしてのFOL14(SEQ ID NO:3)および3'プライマーとしてのAP(SEQ ID NO:2)および鋳型としてのPCR反応2および3を用いることによって、フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ変異体と、ホスホリパーゼからのC-末端との間の結合を作った。
H. ラヌジノサ(lanuginosa) リパーゼにおける位置205:75%R、25%S プライマーFOL15(SEQ ID NO:4)/FOL16(SEQ ID NO:5)
H. ラヌジノサ(lanuginosa) リパーゼにおける位置256:50%P、50%A
H. ラヌジノサ(lanuginosa) リパーゼにおける位置260:25%R、12.5%Q、12.5%H、12.5%C、12.5%Y、12.5%W、12.5%stop。
アミノ酸269、270、271、272、(273および274)後に停止して、変異体を作った。
反応2:5'プライマー4244(SEQ ID NO:1)および3'プライマーKBoj37(270後に停止)
反応3:5'プライマー4244(SEQ ID NO:1)および3'プライマーKBoj38(271後に停止)
反応4:5'プライマー4244(SEQ ID NO:1)および3'プライマーKBoj39(272後に停止)
得られる変異体の配列を決定し、以下の変更を有して、フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼに対応することを見出した。
ホスホリパーゼ活性を失うことなく、G91AまたはE99Kを除去することができる。得られる変異体の配列を決定し、以下の変更を有して、フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼに対応することを見出した。
位置256および位置263〜269での変異についての可能性を有する3つの異なるライブラリーを構築した。同時に、1、2、3または4個のアミノ酸でのC-末端の伸長の可能性が含まれていた。
ライブラリーB:5'プライマーとして4244(SEQ ID NO:1)および3'プライマーとしてKBoj32(SEQ ID NO:8)および鋳型としてE1A +G91A +D96W +E99K +Q249R またはE1A +G225Rを用いたPCR反応。このライブラリーからの変異体は、おそらくC-末端伸長を含むが、伸長の前に停止コドンを含むことができる。
以下の変異体が得られた:
pH5および9にて、上記した単層アッセイによって、実施例5に挙げた8つの変異体を、ホスホリパーゼ活性について分析した。結果は、すべての変異体がpH5および9でホスホリパーゼ活性を有することを示したが、それに対して、親リパーゼ(フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ)は、pH5または9で活性を示さなかった。変異体に依存して、pH5での活性は、pH9のときより高いかまたは低かった。
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)からの親リパーゼの変異体を製造し、上記したようにしてホスホリパーゼ活性を試験した。以下の変異体は、ホスホリパーゼ活性を有することがわかったが、それに対して、親リパーゼは、同じ方法によって、ホスホリパーゼ活性を有していなかった。
リゾムコール ミエヘイ(Rhizomucor miehei)からの親リパーゼの以下の2つの変異体を製造し、上記したようにしてホスホリパーゼ活性を試験した。変異体は、ホスホリパーゼ活性を有することがわかったが、それに対して、親リパーゼは、同じ方法によって、ホスホリパーゼ活性を有していなかった。
G266N
G266V
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)からの親リパーゼの変異体を製造し、異なる鎖長を有する2つのトリグリセリド基質:トリブチリン(C4:0)およびトリオレイン(C18:1)に対する加水分解活性について試験した。試験は、上記したLUおよびSLU法によって、pH9にて行った。以下の変異体が、親酵素(フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa) リパーゼ)より高い、トリオレイン活性対トリブチリン活性の比を有することがわかった:
フサリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)からの親リパーゼの変異体を製造し、先の実施例におけるように試験した。以下の変異体が、親酵素より高い、トリオレイン活性対トリブチリン活性の比を有することがわかった:
Y23S
Y260L
フサリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)からの親リパーゼの以下の変異体がまた、長鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有し得る:
R80H +S82T
S82T +A129T
リゾムコール ミエヘイ(Rhizomucor miehei)からの親リパーゼの以下の変異体は、長鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有し得る:
Y260W
Y28L
Y28C +H217N
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa) からの親リパーゼの変異体を製造し、先の実施例におけるように試験した。以下の変異体は、親酵素より高い、トリブチリン活性対トリオレイン活性の比(より低いSLU/LU比)を有することがわかった:
フサリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)からの親リパーゼの変異体を製造し、先の実施例におけるように試験した。以下の変異体は、親酵素より高い、トリブチリン活性対トリオレイン活性の比を有することがわかった:
Y23W
Y260D
Y260R
Y260C
Y260N
リゾムコール ミエヘイ(Rhizomucor miehei) からの親リパーゼの以下の変異体は、短鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有し得る:
Y260C
Y260G
Y260V
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa) からの親リパーゼの変異体を製造し、LU法により、pH7および9にてリパーゼ活性を測定した。以下の変異体は、親リパーゼより高い、pH9での活性対pH7での活性の比を有することがわかった:
R84L
R84W
Y21I
Y21V
Y261I
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa) からの親リパーゼの変異体を製造し、LU法により、pH7および9にてリパーゼ活性を測定した。以下の変異体は、親リパーゼより低い、pH9での活性対pH7での活性の比を有することがわかった:
Y261D
G266D/E
Y261W
本質的にWO98/18912(ノボ ノルディスク(Novo Nordisk))の実施例6に記載されたようにして、菜種油を、フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa) からのリパーゼの2つの変異体で処理した。
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)からのリパーゼの変異体を、以下のようにして、パン焼き試験において評価した。
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの変異体を、パン焼き試験で評価して、生地の寝かせ(proofing)時間の延長に対するそれの耐性を評価した。
異なる鎖長特異性を有するリパーゼからの異臭の発生を、全乳で評価した。発生した酪酸/酸敗臭を、加熱後に試料の匂いを嗅ぐことによって評価した。
+ 検出可能な臭い
++ 明らかでかつ特徴的な酪酸および/または酸敗臭
+++ 強い酪酸および/または酸敗臭
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼより高いSLU/LU比を有するフミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの3つの変異体は、親リパーゼより少ない悪臭を有することがわかった。
汚し
綿布を、本明細書に記載した乳製品で汚した。50mgのバターを、一様な点にして、約30cm2の面積にわたって施用した。汚れた布を、環境条件下で24時間放置した。
Terg-O-tometerにて、リパーゼを入れたおよび入れない(1250および5000LU/リットル)市販の洗剤(5g/リットル)を使用して、汚れた布の洗濯を行った。洗濯は、30℃で20分間100rpmにて行った。洗濯後、布を1晩放置して環境条件下で乾燥させた。
次の日、少なくとも10人の訓練した査定者からなる官能検査パネルによって、異臭を査定した。試料を、堅く閉まったガラスびん中に保持し、悪臭の蓄積のために、各評価の間少なくとも30分間あけた。布を取出し、布の悪臭を査定した。酪酸の悪臭を、以下の等級に従って評点を付けた。対照として、リパーゼなしで洗濯した試料を使用した。
1. 対照と同様
2. 対照より少し強い
3. 対照より明確に強い
4. 3より強い。
布の乳製品の汚れからの酪酸の強度はまた、器具による分析によって評価することができる:
1.ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによるか、または
2.布からの臭いの抽出、次いでガスクロマトグラフィーによる。
フミコラ ラヌジノサ(Humicola lanuginosa)からのリパーゼの6つの変異体を製造し、3%のバターを添加して、ヨーロッパ純生地法(European straight dough procedure)(347-SP-1217)によって焼いたパンにおいて評価した。0.2mgの酵素タンパク質/kg小麦粉を、変異体のそれぞれについて使用した。
+ 検出可能な臭い
++ 明らかでかつ特徴的な酪酸および/または酸敗臭
+++ 強い酪酸および/または酸敗臭。
Claims (11)
- 前記脂質分解酵素が、ジガラクトシルジグリセリドに対する高い加水分解活性を有する、請求項3記載の脂質分解酵素。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の脂質分解酵素をコードするDNA。
- 請求項5記載のDNAを含むベクター。
- 請求項5記載のDNAまたは請求項6記載のベクターを含む形質転換された宿主細胞。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の脂質分解酵素を製造する方法であって、
a)脂質分解酵素を発現するように、請求項7記載の細胞を培養し、そして
b)脂質分解酵素を回収すること
を含む方法。 - 前記a)における脂質分解酵素の発現が脂質分解酵素の分泌である、請求項8記載の方法。
- 生地または生地から製造される焼いた製品を製造する方法であって、請求項1〜4のいずれか1項記載の脂質分解酵素を生地に添加することを含む方法。
- 界面活性剤および請求項1又は2記載の脂質分解酵素を含む洗剤組成物。
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