JP3333521B2 - アブシジア リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸 - Google Patents
アブシジア リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸Info
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、アブシジア（Absidia）リパーゼ活性を有
するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関
する。本発明はまた、核酸構成体、ベクター、及び前記
核酸配列を含んで成る宿主細胞、並びに前記ポリペプチ
ドを製造するための組換え法にも関する。
するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関
する。本発明はまた、核酸構成体、ベクター、及び前記
核酸配列を含んで成る宿主細胞、並びに前記ポリペプチ
ドを製造するための組換え法にも関する。
関連する技術の記載 脂肪分解酵素を配合した洗剤は、脂肪性しみを除去す
るための改良された性質を有することが知られている。
たとえば、LIPOLASETM（Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd,D
enmark）、すなわち菌類サーモマイセス・ラヌギノサス
（Thermomyces lanuginosus）（また、ヒュミコラ・ラ
ヌギノサ（Humicola lanuginosa）と呼ばれる）から得
られる微生物リパーゼは、多くの市販洗剤中に導入され
ている。
るための改良された性質を有することが知られている。
たとえば、LIPOLASETM（Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd,D
enmark）、すなわち菌類サーモマイセス・ラヌギノサス
（Thermomyces lanuginosus）（また、ヒュミコラ・ラ
ヌギノサ（Humicola lanuginosa）と呼ばれる）から得
られる微生物リパーゼは、多くの市販洗剤中に導入され
ている。
シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）
（アメリカ特許第4,876,042号）、ストレプトマイセテ
ス（Streptomycetes）（WO 94/14940）、及びゴングロ
ネラ・ブトレリ（Gongronella butleri）株NRRL 3521
（アメリカ特許第3,634,195号；この株は以前はアブシ
ジア ブトレリ（Absidia butleri）と呼ばれた;K.H.Do
mschなど.,Compendium of Soil Fungi,Academic Press
1980,p.381を参照のこと）から他の微生物リパーゼもま
た、洗剤への使用のために提案されている。
（アメリカ特許第4,876,042号）、ストレプトマイセテ
ス（Streptomycetes）（WO 94/14940）、及びゴングロ
ネラ・ブトレリ（Gongronella butleri）株NRRL 3521
（アメリカ特許第3,634,195号；この株は以前はアブシ
ジア ブトレリ（Absidia butleri）と呼ばれた;K.H.Do
mschなど.,Compendium of Soil Fungi,Academic Press
1980,p.381を参照のこと）から他の微生物リパーゼもま
た、洗剤への使用のために提案されている。
アメリカ特許第3,634,195号は、アブシジア・シリン
ドロスポラ var.リゾモルファ（Absidia cylindrospor
a var.rhizomorpha）NRRL 2815及びアブシジア・ブラケ
スレアナ（Absidia blakesleeana）NRR 1305からのリパ
ーゼの製造を記載している。Koritalaなど．（1987,Jou
rnal of the American Oil Chemists Society 64:509−
513）は、大豆油が、アブシジア・コエルラ（Absidia c
oerula）NRRL 5926及びアブシジア ラモサ（Absidia r
amosa）NRRL 1309と共にインキュベートされる場合、一
部、加水分解されたことを開示する。Satyanarayana（1
981,Current Science 50:680−682）は、アブシジア・
コリムビフェラ（Absidia corymbifera）の株によるリ
パーゼの分泌を開示している。Aisakaなど．（1979,Agr
icultural Biological Chemistry 43:2125−2129）は、
アブシジア・ヒアロスポラ（Absidia hyalospora）株KY
303（現在、アブシジア・ブラケスレアナ（Absidia bla
kesleeana）として分類される）からのリポタンパク質
リパーゼの形成を記載する。
ドロスポラ var.リゾモルファ（Absidia cylindrospor
a var.rhizomorpha）NRRL 2815及びアブシジア・ブラケ
スレアナ（Absidia blakesleeana）NRR 1305からのリパ
ーゼの製造を記載している。Koritalaなど．（1987,Jou
rnal of the American Oil Chemists Society 64:509−
513）は、大豆油が、アブシジア・コエルラ（Absidia c
oerula）NRRL 5926及びアブシジア ラモサ（Absidia r
amosa）NRRL 1309と共にインキュベートされる場合、一
部、加水分解されたことを開示する。Satyanarayana（1
981,Current Science 50:680−682）は、アブシジア・
コリムビフェラ（Absidia corymbifera）の株によるリ
パーゼの分泌を開示している。Aisakaなど．（1979,Agr
icultural Biological Chemistry 43:2125−2129）は、
アブシジア・ヒアロスポラ（Absidia hyalospora）株KY
303（現在、アブシジア・ブラケスレアナ（Absidia bla
kesleeana）として分類される）からのリポタンパク質
リパーゼの形成を記載する。
多くの洗剤は、溶液においてアルカリ性であり（たと
えば、およそ10のpH）、Ca2+イオンを結合するビルダー
を含む。Ca2+の不在下では、高いpHで高い活性を有する
新規脂肪分解酵素の必要性がある。アブシジア属のリパ
ーゼはそれらの特徴を有し、そして従って、洗剤組成物
への使用のために非常に望まれる。しかしながら、これ
まで、それらの酵素を組換え的に製造する手段は存在し
ていない。
えば、およそ10のpH）、Ca2+イオンを結合するビルダー
を含む。Ca2+の不在下では、高いpHで高い活性を有する
新規脂肪分解酵素の必要性がある。アブシジア属のリパ
ーゼはそれらの特徴を有し、そして従って、洗剤組成物
への使用のために非常に望まれる。しかしながら、これ
まで、それらの酵素を組換え的に製造する手段は存在し
ていない。
それらの価値ある酵素の組換え製造法を提供すること
が本発明の目的である。
が本発明の目的である。
発明の要約 本発明は、下記から成る群から選択された、リパーゼ
活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
配列に関する： （ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号
８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するアブ
シジア株に対して内因性の（endogenous）ポリペプチド
をコードする核酸配列； （ｂ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配
列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は
（ii）それらの相補的鎖のいづれかと、中位の緊縮条件
下でハイブリダイズすることができるアブシジア株に対
して内因性の核酸配列； （ｃ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配
列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は
（ii）それらの相補的鎖のいづれかと、中位の緊縮条件
下でハイブリダイズすることができる核酸配列； （ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号
８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも
65％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、リパーゼ活
性を有するポリペプチドをコードする核酸配列； （ｅ）（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）の対立遺伝子
形；及び （ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）又は（ｅ）のフ
ラグメント。
活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
配列に関する： （ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号
８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するアブ
シジア株に対して内因性の（endogenous）ポリペプチド
をコードする核酸配列； （ｂ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配
列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は
（ii）それらの相補的鎖のいづれかと、中位の緊縮条件
下でハイブリダイズすることができるアブシジア株に対
して内因性の核酸配列； （ｃ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配
列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は
（ii）それらの相補的鎖のいづれかと、中位の緊縮条件
下でハイブリダイズすることができる核酸配列； （ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号
８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも
65％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、リパーゼ活
性を有するポリペプチドをコードする核酸配列； （ｅ）（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）の対立遺伝子
形；及び （ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）又は（ｅ）のフ
ラグメント。
本発明はまた、核酸構成体、ベクター、及び前記核酸
配列を含んで成る宿主細胞、並びに前記ポリペプチドを
製造するための組換え方法にも関する。
配列を含んで成る宿主細胞、並びに前記ポリペプチドを
製造するための組換え方法にも関する。
図面の簡単な説明 図１は、アブシジア・グリセオラ（Absidia griseol
a）からのリパーゼ特異的PCR生成物及びアブシジア・グ
リセオラ var.イグチ（Absidia griseola var.iguchi
i）ゲノムDNAのアガロースゲル精製を示す。レーン1:Hi
nd III−消化されたλDNA及びHea III−消化されたφX1
7RF−DNAサイズ標準；レーン2:アブシジア・グリセオラ
PCR生成物；及びレーン3:アブシジア・グリセオラ va
r.イグチPCR生成物。両PCR生成物は約870bpのサイズで
あるように思える。
a）からのリパーゼ特異的PCR生成物及びアブシジア・グ
リセオラ var.イグチ（Absidia griseola var.iguchi
i）ゲノムDNAのアガロースゲル精製を示す。レーン1:Hi
nd III−消化されたλDNA及びHea III−消化されたφX1
7RF−DNAサイズ標準；レーン2:アブシジア・グリセオラ
PCR生成物；及びレーン3:アブシジア・グリセオラ va
r.イグチPCR生成物。両PCR生成物は約870bpのサイズで
あるように思える。
図２は、アブシジア・グリセオラからの放射性ラベル
されたリガーゼ遺伝子セグメントによりプローブされた
いくつかのアブシジア種からのゲノムDNA消化物のサザ
ン・ハイブリダイゼーション分析からのオートラジオグ
ラムを示す。Hind III−消化されたλDNA及びHae III−
消化されたφX17RF−DNAサイズ標準のサイズが、オート
ラジオグラムの右側上に示される。レーン１〜3:アブシ
ジア・スポロホラ−バリアビリス（Absidia sporophora
−variabilis）DNA（それぞれ、EcoR I＋Asp718I,Asp71
8I及びEcoR I）；レーン４〜6:アブシジア コリムビフ
ェラ（Absidia corymbifera）DNA（それぞれ、EcoR I＋
Asp718I,Asp718I及びEcoR I）；レーン７〜9:アブシジ
ア ブラケスレアナ（Absidia blakesleeana）DNA（そ
れぞれ、EcoR I＋Asp718I,Asp718I及びEcoR I）；レー
ン10〜12:アブシジア グリセオラ var.イグチDNA（そ
れぞれ、EcoR I＋Asp718I,Asp718I、及びEcoR I）；及
びレーン13〜15:アブシジア グリセオラDNA（それぞ
れ、EcoR I＋Asp718I,Asp718I及びEcoR I）。
されたリガーゼ遺伝子セグメントによりプローブされた
いくつかのアブシジア種からのゲノムDNA消化物のサザ
ン・ハイブリダイゼーション分析からのオートラジオグ
ラムを示す。Hind III−消化されたλDNA及びHae III−
消化されたφX17RF−DNAサイズ標準のサイズが、オート
ラジオグラムの右側上に示される。レーン１〜3:アブシ
ジア・スポロホラ−バリアビリス（Absidia sporophora
−variabilis）DNA（それぞれ、EcoR I＋Asp718I,Asp71
8I及びEcoR I）；レーン４〜6:アブシジア コリムビフ
ェラ（Absidia corymbifera）DNA（それぞれ、EcoR I＋
Asp718I,Asp718I及びEcoR I）；レーン７〜9:アブシジ
ア ブラケスレアナ（Absidia blakesleeana）DNA（そ
れぞれ、EcoR I＋Asp718I,Asp718I及びEcoR I）；レー
ン10〜12:アブシジア グリセオラ var.イグチDNA（そ
れぞれ、EcoR I＋Asp718I,Asp718I、及びEcoR I）；及
びレーン13〜15:アブシジア グリセオラDNA（それぞ
れ、EcoR I＋Asp718I,Asp718I及びEcoR I）。
図３は、アブシジア グリセオラ var.イグチ リパ
ーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（そ
れぞれ、配列番号１及び２）。イントロンは実線により
示される。前に決定されたペプチド配列に対応する領域
は下線（__）が引かれている。
ーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（そ
れぞれ、配列番号１及び２）。イントロンは実線により
示される。前に決定されたペプチド配列に対応する領域
は下線（__）が引かれている。
図４は、アブシジア・ブラケスレアナ リパーゼのDN
A配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ、
配列番号３及び４）。イントロンは実線により示され
る。前に決定されたペプチド配列に対応する領域は下線
（__）が引かれている。
A配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ、
配列番号３及び４）。イントロンは実線により示され
る。前に決定されたペプチド配列に対応する領域は下線
（__）が引かれている。
図５は、アブシジア・コリムビフェラ リパーゼのDN
A配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ、
配列番号５及び６）。イントロンは実線により示され
る。前に決定されたペプチド配列に対応する領域は下線
（__）が引かれている。
A配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ、
配列番号５及び６）。イントロンは実線により示され
る。前に決定されたペプチド配列に対応する領域は下線
（__）が引かれている。
図６は、アブシジア・スポロホラバリアビリス リパ
ーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（そ
れぞれ、配列番号７及び８）。イントロンは実線により
示される。
ーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（そ
れぞれ、配列番号７及び８）。イントロンは実線により
示される。
図７は、アブシジア・レフレキサ（Absidia reflex
a）リパーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示
す（それぞれ、配列番号９及び10）。
a）リパーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示
す（それぞれ、配列番号９及び10）。
図８は、リゾムコル ミエヘイ（Rhizomucor miehe
i）リパーゼ（配列番号15）及びヒュミコラ ラヌギノ
サ（Humicola lanuginosa）リパーゼ（配列番号16）に
比較されるアブシジア リパーゼ間のアミノ酸配列相同
性の比較を示す。同一の残基はボックスで囲まれてい
る。
i）リパーゼ（配列番号15）及びヒュミコラ ラヌギノ
サ（Humicola lanuginosa）リパーゼ（配列番号16）に
比較されるアブシジア リパーゼ間のアミノ酸配列相同
性の比較を示す。同一の残基はボックスで囲まれてい
る。
図９は、pBANe6の制限地図を示す。
図10は、pKB2の制限地図を示す。
図11は、pRamB19の制限地図を示す。
発明の詳細な説明 核酸配列 第１の態様においては、本発明は、配列番号２、配列
番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示さ
れるアミノ酸配列を有し、リパーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする単離された核酸配列に関する。特定
の態様においては、核酸配列は、配列番号１、配列番号
３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に示され
る。本発明の核酸配列はまた、配列番号２、配列番号
４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示される
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、し
かし遺伝子コードの縮重により、それぞれ配列番号１、
配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９と
は異なる核酸配列も包含する。本発明はまた、それぞ
れ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
又は配列番号10のフラグメントをコードし、そしてリパ
ーゼ活性を保持する、配列番号１、配列番号３、配列番
号５、配列番号７又は配列番号９のサブ配列にも関す
る。好ましい態様においては、本発明の核酸配列は、そ
れぞれ、エッシェリシア・コリ（Eschericha coli）NRR
L B−21520,NRRL B−21521,NRR B−21522及びNRR B−21
523に含まれる、プラスミドpZL−NL1,pZL−NL61,pZL−N
L95及びpZL−NL124に含まれる核酸配列である。
番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示さ
れるアミノ酸配列を有し、リパーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする単離された核酸配列に関する。特定
の態様においては、核酸配列は、配列番号１、配列番号
３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に示され
る。本発明の核酸配列はまた、配列番号２、配列番号
４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示される
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、し
かし遺伝子コードの縮重により、それぞれ配列番号１、
配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９と
は異なる核酸配列も包含する。本発明はまた、それぞ
れ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
又は配列番号10のフラグメントをコードし、そしてリパ
ーゼ活性を保持する、配列番号１、配列番号３、配列番
号５、配列番号７又は配列番号９のサブ配列にも関す
る。好ましい態様においては、本発明の核酸配列は、そ
れぞれ、エッシェリシア・コリ（Eschericha coli）NRR
L B−21520,NRRL B−21521,NRR B−21522及びNRR B−21
523に含まれる、プラスミドpZL−NL1,pZL−NL61,pZL−N
L95及びpZL−NL124に含まれる核酸配列である。
用語“単離された核酸配列”とは、本明細書において
使用される場合、アガロース電気泳動により決定される
場合、他の核酸配列を実質的に含有しないか、たとえば
少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％
の純度、より好ましくは少なくとも約60％の純度、さら
により好ましくは少なくとも約80％の純度、及び最とも
好ましくは少なくとも約90％の純度である核酸配列に関
する。たとえば、単離された核酸配列は、核酸配列をそ
の位置から、それが再生されるであろう異なった部位に
再配置するために遺伝子工学に使用される標準のクロー
ニング方法により得られる。クローニング方法は、ポリ
ペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸
配列フラグメントの切断及び単離、前記フラグメントの
ベクター分子中への挿入、及び核酸配列の複数のコピー
又はクローンが複製されるであろう宿主細胞中への前記
組換えベクターの組込みを包含することができる。前記
核酸配列は、ゲノム、cDNA,RNA、半合成、合成起源、又
はそれらのいづれかの組合せのものであり得る。
使用される場合、アガロース電気泳動により決定される
場合、他の核酸配列を実質的に含有しないか、たとえば
少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％
の純度、より好ましくは少なくとも約60％の純度、さら
により好ましくは少なくとも約80％の純度、及び最とも
好ましくは少なくとも約90％の純度である核酸配列に関
する。たとえば、単離された核酸配列は、核酸配列をそ
の位置から、それが再生されるであろう異なった部位に
再配置するために遺伝子工学に使用される標準のクロー
ニング方法により得られる。クローニング方法は、ポリ
ペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸
配列フラグメントの切断及び単離、前記フラグメントの
ベクター分子中への挿入、及び核酸配列の複数のコピー
又はクローンが複製されるであろう宿主細胞中への前記
組換えベクターの組込みを包含することができる。前記
核酸配列は、ゲノム、cDNA,RNA、半合成、合成起源、又
はそれらのいづれかの組合せのものであり得る。
用語“リパーゼ”とは、Recommendations（1992）of
the International Union of Biochemistry and Molecu
lar Biology（IUBMB）に従って、酵素分類番号E.C.3.1.
1.−（カルボン酸エステルヒドロラーゼ）下で分類され
る脂肪分解酵素として定義される。従って、脂肪分解酵
素は、E.C.3.1.1.に言及されるエステル結合、たとえば
モノ−、ジ−及びトリグリセリド、リン脂質（すべての
種類）、チオエステル、コレステロールエステル、ワッ
クス−エステル、クチン、スベリン、合成エステル、等
に存在するエステル結合の少なくとも１つの型のエステ
ル結合に対して加水分解活性を示す。例として、本発明
の脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対する活性（リパ
ーゼ活性、E.C.3.1.1.3）、たとえば1,3−位置特異的リ
パーゼ活性を有することができる。
the International Union of Biochemistry and Molecu
lar Biology（IUBMB）に従って、酵素分類番号E.C.3.1.
1.−（カルボン酸エステルヒドロラーゼ）下で分類され
る脂肪分解酵素として定義される。従って、脂肪分解酵
素は、E.C.3.1.1.に言及されるエステル結合、たとえば
モノ−、ジ−及びトリグリセリド、リン脂質（すべての
種類）、チオエステル、コレステロールエステル、ワッ
クス−エステル、クチン、スベリン、合成エステル、等
に存在するエステル結合の少なくとも１つの型のエステ
ル結合に対して加水分解活性を示す。例として、本発明
の脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対する活性（リパ
ーゼ活性、E.C.3.1.1.3）、たとえば1,3−位置特異的リ
パーゼ活性を有することができる。
第２の態様においては、本発明は、配列番号１、配列
番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９に示さ
れる核酸配列、その相補的鎖又はそのサブ配列と高い、
中位の又は低い緊縮条件下でハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドプローブと高い、中位の又は低い緊縮条件
下でハイブリダイズすることができる、リパーゼ活性を
有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に
関する（J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,198
9,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d editio
n,Cold Spring Horbor,New York）。ハイブリダイゼー
ションは、類似する核酸が、標準のサザンブロット法に
従って、低い〜高い緊縮条件（たとえば、それぞれ５×
SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断されそして変性さ
れたサケ精子DNA、及びそれぞれ高い、中位の及び低い
緊縮性のための50,35又は25％のいずれかのホルムアミ
ドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハ
イブリダイゼーション）下で、配列番号１、配列番号
３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９に示され
る核酸配列の一部をコードするポリペプチドに対応する
オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすること
を示す。好ましい態様においては、核酸配列は、中位の
緊縮条件下で、そして最とも好ましくは、高い緊縮条件
下ハイブリダイズすることができる。もう１つの好まし
い態様においては、核酸配列は、配列番号１、配列番号
３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に示さ
れる核酸配列、又はその相補的鎖とハイブリダイズする
ことができる。
番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９に示さ
れる核酸配列、その相補的鎖又はそのサブ配列と高い、
中位の又は低い緊縮条件下でハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドプローブと高い、中位の又は低い緊縮条件
下でハイブリダイズすることができる、リパーゼ活性を
有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に
関する（J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,198
9,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d editio
n,Cold Spring Horbor,New York）。ハイブリダイゼー
ションは、類似する核酸が、標準のサザンブロット法に
従って、低い〜高い緊縮条件（たとえば、それぞれ５×
SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断されそして変性さ
れたサケ精子DNA、及びそれぞれ高い、中位の及び低い
緊縮性のための50,35又は25％のいずれかのホルムアミ
ドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハ
イブリダイゼーション）下で、配列番号１、配列番号
３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９に示され
る核酸配列の一部をコードするポリペプチドに対応する
オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすること
を示す。好ましい態様においては、核酸配列は、中位の
緊縮条件下で、そして最とも好ましくは、高い緊縮条件
下ハイブリダイズすることができる。もう１つの好まし
い態様においては、核酸配列は、配列番号１、配列番号
３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に示さ
れる核酸配列、又はその相補的鎖とハイブリダイズする
ことができる。
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７も
しくは配列番号９、及び配列番号２、配列番号４、配列
番号６、配列番号８もしくは配列番号10、又はそれらの
サブ配列は、当業界において良く知られている方法に従
って、異なった属又は種の他の株からリパーゼをコード
する相同遺伝子を単離するためのオリゴヌクレオチドプ
ローブを設計するために使用され得る。従って、そのよ
うな他の生物から調製されたゲノムDNA又はcDNAは、そ
こにおける対応する遺伝子を同定し、そして単離するた
めに、標準のサザンブロット方法に従って、そのような
プローブとハイブリダイズするDNAについてスクリーン
され得る。そのようなプローブは、完全な配列よりも相
当に短くあることができるが、しかし少なくとも15個、
好ましくは少なくとも25個、そしてより好ましくは、少
なくとも40個の長さのヌクレオチドであるべきである。
好ましくは1200個よりも多くない長さのヌクレオチドの
プローブもまた使用され得る。DNA及びRNAプローブの両
者が使用され得る。プローブは典型的には、対応する遺
伝子を検出するためにラベルされる（例えば、32P,3H、
ビオチン又はアジピンにより）。本明細書に言及される
変性プローブ及びアブシジア株からのゲノムDNA又は一
本鎖cDNAを用いてのPCR反応がまた、アブシジア リパ
ーゼ特異的生成物を生成することができ、この生成物は
次に、その対応するゲノム又はcDNAをクローン化するた
めのプローブとして使用され得る。
しくは配列番号９、及び配列番号２、配列番号４、配列
番号６、配列番号８もしくは配列番号10、又はそれらの
サブ配列は、当業界において良く知られている方法に従
って、異なった属又は種の他の株からリパーゼをコード
する相同遺伝子を単離するためのオリゴヌクレオチドプ
ローブを設計するために使用され得る。従って、そのよ
うな他の生物から調製されたゲノムDNA又はcDNAは、そ
こにおける対応する遺伝子を同定し、そして単離するた
めに、標準のサザンブロット方法に従って、そのような
プローブとハイブリダイズするDNAについてスクリーン
され得る。そのようなプローブは、完全な配列よりも相
当に短くあることができるが、しかし少なくとも15個、
好ましくは少なくとも25個、そしてより好ましくは、少
なくとも40個の長さのヌクレオチドであるべきである。
好ましくは1200個よりも多くない長さのヌクレオチドの
プローブもまた使用され得る。DNA及びRNAプローブの両
者が使用され得る。プローブは典型的には、対応する遺
伝子を検出するためにラベルされる（例えば、32P,3H、
ビオチン又はアジピンにより）。本明細書に言及される
変性プローブ及びアブシジア株からのゲノムDNA又は一
本鎖cDNAを用いてのPCR反応がまた、アブシジア リパ
ーゼ特異的生成物を生成することができ、この生成物は
次に、その対応するゲノム又はcDNAをクローン化するた
めのプローブとして使用され得る。
そのような他の生物からのゲノム又は他のDNAは、ア
ガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他
の分離技法により分離され得る。ライブラリーからのDN
A又は分離されたDNAは、ニトロセルロース又は他の適切
なキャリヤー材料上に移され、そして固定され得る。配
列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配
列番号９と相同であるクローン又はDNAを同定するため
に、キャリヤー材料が、サザンブロットに使用され、こ
こで前記キャリヤー材料は、最終的に、好ましくは40℃
よりも高くなく、より好ましくは45℃よりも高くなく、
より好ましくは50℃よりも高くなく、より好ましくは55
℃よりも高くなく、さらにより好ましくは60℃よりも高
くなく、特に65℃よりも高くない温度で、２×SSC、0.2
％SDS溶液を用いてそれぞれ30分間、３度、洗浄され
る。オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハ
イブリダイズする分子が、Ｘ−線フィルムを用いて検出
される。
ガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他
の分離技法により分離され得る。ライブラリーからのDN
A又は分離されたDNAは、ニトロセルロース又は他の適切
なキャリヤー材料上に移され、そして固定され得る。配
列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配
列番号９と相同であるクローン又はDNAを同定するため
に、キャリヤー材料が、サザンブロットに使用され、こ
こで前記キャリヤー材料は、最終的に、好ましくは40℃
よりも高くなく、より好ましくは45℃よりも高くなく、
より好ましくは50℃よりも高くなく、より好ましくは55
℃よりも高くなく、さらにより好ましくは60℃よりも高
くなく、特に65℃よりも高くない温度で、２×SSC、0.2
％SDS溶液を用いてそれぞれ30分間、３度、洗浄され
る。オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハ
イブリダイズする分子が、Ｘ−線フィルムを用いて検出
される。
本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号
５、配列番号７又は配列番号９に示される核酸配列に対
して、少なくとも約65％、好ましくは約70％、好ましく
は約75％、好ましくは約80％、より好ましくは約85％、
さらにより好ましくは約90％、最とも好ましくは約95％
及びさらに最とも好ましくは約97％の同一性レベルを有
する、活性ポリペプチドをコードする単離された核酸配
列にも関する。２つの核酸配列間の同一性の程度は、当
業界において知られているコンピュータープログラム、
たとえばGCGプログラムパッケージに供給されるGAPによ
り決定され得る（Needleman and Wunsch,1970,Journal
of Molecular Biology 48:443−453）。本発明のための
２つの核酸配列間の同一性の程度を決定するためには、
Clustal方法（DNASTAR,Inc.,Madison,WI）が、同一性の
表、10のギャップペナルティー及び10のギャップの長さ
と共に使用される。
５、配列番号７又は配列番号９に示される核酸配列に対
して、少なくとも約65％、好ましくは約70％、好ましく
は約75％、好ましくは約80％、より好ましくは約85％、
さらにより好ましくは約90％、最とも好ましくは約95％
及びさらに最とも好ましくは約97％の同一性レベルを有
する、活性ポリペプチドをコードする単離された核酸配
列にも関する。２つの核酸配列間の同一性の程度は、当
業界において知られているコンピュータープログラム、
たとえばGCGプログラムパッケージに供給されるGAPによ
り決定され得る（Needleman and Wunsch,1970,Journal
of Molecular Biology 48:443−453）。本発明のための
２つの核酸配列間の同一性の程度を決定するためには、
Clustal方法（DNASTAR,Inc.,Madison,WI）が、同一性の
表、10のギャップペナルティー及び10のギャップの長さ
と共に使用される。
第３の観点においては、本発明は、配列番号２、配列
番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示さ
れるアミノ酸配列に対して少なくとも約65％、好ましく
は約70％、好ましくは約75％、好ましくは約80％、より
好ましくは約85％、さらにより好ましくは約90％、最と
も好ましくは約95％及びさらに最とも好ましくは約97％
の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する、リパー
ゼ活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリペ
プチド（この後、“相同ポリペプチド”と称する）の活
性を定性的に保持する単離された核酸配列に関する。好
ましい態様においては、前記相同ポリペプチドは、配列
番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列
番号10に示されるアミノ酸配列とは、５個のアミノ酸、
好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミ
ノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、及び最と
も好ましくは１個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列
を有する。複数のアミノ酸配列間の同一性の程度は、当
業界において知られているコンピュータープログラム、
たとえばGCGプログラムパッケージに供給されるGAPによ
り決定され得る（Needleman and Wunsch,1970,Journal
of Molecular Biology 48:443−453）。本発明のための
２個のアミノ酸配列間の同一性の程度を決定するために
は、Clustal方法（DNASTAR,Inc.,Madison,WI）が、同一
性の表、10のギャップペナルティー及び10のギャップの
長さと共に使用される。
番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示さ
れるアミノ酸配列に対して少なくとも約65％、好ましく
は約70％、好ましくは約75％、好ましくは約80％、より
好ましくは約85％、さらにより好ましくは約90％、最と
も好ましくは約95％及びさらに最とも好ましくは約97％
の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する、リパー
ゼ活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリペ
プチド（この後、“相同ポリペプチド”と称する）の活
性を定性的に保持する単離された核酸配列に関する。好
ましい態様においては、前記相同ポリペプチドは、配列
番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列
番号10に示されるアミノ酸配列とは、５個のアミノ酸、
好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミ
ノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、及び最と
も好ましくは１個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列
を有する。複数のアミノ酸配列間の同一性の程度は、当
業界において知られているコンピュータープログラム、
たとえばGCGプログラムパッケージに供給されるGAPによ
り決定され得る（Needleman and Wunsch,1970,Journal
of Molecular Biology 48:443−453）。本発明のための
２個のアミノ酸配列間の同一性の程度を決定するために
は、Clustal方法（DNASTAR,Inc.,Madison,WI）が、同一
性の表、10のギャップペナルティー及び10のギャップの
長さと共に使用される。
本発明の核酸配列によりコードされる相同ポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入
又は欠失、及び／又は異なったアミノ酸残基による１又
は複数のアミノ酸残基の置換により、配列番号２、配列
番号４、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸
配列とは異なることができる。好ましくは、アミノ酸変
更はマイナーな性質のものであり、すなわちタンパク質
の折りたたみ及び／又は活性に有意に影響を及ぼさない
保存性アミノ酸置換；典型的には１〜約30個のアミノ酸
の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末端
延長、たとえばアミノ−末端メチオニン残基；約20〜25
個までの残基の小さなリンカーペプチド；又は実効電荷
又は他の機能、たとえばポリ−ヒスチジン系、抗原性エ
ピトープ、又は結合ドメインの変化により精製を促進す
る小さな延長のものである。
ドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入
又は欠失、及び／又は異なったアミノ酸残基による１又
は複数のアミノ酸残基の置換により、配列番号２、配列
番号４、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸
配列とは異なることができる。好ましくは、アミノ酸変
更はマイナーな性質のものであり、すなわちタンパク質
の折りたたみ及び／又は活性に有意に影響を及ぼさない
保存性アミノ酸置換；典型的には１〜約30個のアミノ酸
の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末端
延長、たとえばアミノ−末端メチオニン残基；約20〜25
個までの残基の小さなリンカーペプチド；又は実効電荷
又は他の機能、たとえばポリ−ヒスチジン系、抗原性エ
ピトープ、又は結合ドメインの変化により精製を促進す
る小さな延長のものである。
保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（たとえば、アル
ギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（たと
えば、グルタミン酸及びアルパラギン酸）、極性アミノ
酸（たとえば、グルタミン及びアスパラギン）、疎水性
アミノ酸（たとえば、ロイシン、イソロイシン及びバリ
ン）、芳香族アミノ酸（たとえば、フェニルアラニン、
トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸
（たとえば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン
及びメチオニン）のグループ内である。一般的に、比活
性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られて
おり、そしてたとえば、H.Neurath and R.L.Hill,1979,
The Proteins,Academic Press,New Yorkにより記載され
ている。最とも通常に存在する交換は次のものである:A
la/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser
/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/A
sn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,Asp/Gly及びそれらの塩。
ギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（たと
えば、グルタミン酸及びアルパラギン酸）、極性アミノ
酸（たとえば、グルタミン及びアスパラギン）、疎水性
アミノ酸（たとえば、ロイシン、イソロイシン及びバリ
ン）、芳香族アミノ酸（たとえば、フェニルアラニン、
トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸
（たとえば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン
及びメチオニン）のグループ内である。一般的に、比活
性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られて
おり、そしてたとえば、H.Neurath and R.L.Hill,1979,
The Proteins,Academic Press,New Yorkにより記載され
ている。最とも通常に存在する交換は次のものである:A
la/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser
/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/A
sn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,Asp/Gly及びそれらの塩。
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又
は配列番号９に示される核酸配列、その相補的鎖又はそ
の副配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロ
ーブとハイブリダイズすることができる本発明の単離さ
れた核酸配列は、いづれかの属の微生物、たとえば細菌
又は菌類源から得られるが、しかし好ましくは菌類細胞
及びより好ましくは糸状菌細胞又は酵母細胞から得られ
る。本発明のためには、用語“〜から得られる”（又は
〜に対して内因性の）とは、一定の源に関して本明細書
において使用される場合、ポリペプチドが、前記源によ
り、又は前記源からの遺伝子が挿入されている細胞によ
り生成されることを意味する。相同遺伝子のための好ま
しい源は、アブシジア属及び公的な受託所から入手でき
るその種の株である。さらに、相同遺伝子は、上記プロ
ーブを用いて、天源のもの（たとえば土壌、水、等）か
ら単離される微生物を包含する他の源から同定され、そ
して得られる。天然の生息地から微生物を単離するため
の技法は当業界において良く知られている。次に、核酸
配列は、他の微生物のcDNAライブラリーを同様にしてス
クリーニングすることによって誘導され得る。特に好ま
しい菌は、糸状菌、たとえばアクレモニウム（Acremoni
um）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオパシ
ジウム（Aureobasidium）、クリプトコーカス（Cryptoc
occus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリ
ウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、マグナポ
ルテ（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソ
ラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティックス（Neoc
allimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロ
マイセス（Paecilomyces）、ペリシリウム（Penicilliu
m）、ピロマイセス（Piromyces）、シゾフィラム（Schi
zophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモ
アスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、
トリポクラジウム（Tolypocladium）、又はトリコデル
マ（Trichoderma）株、又は酵母株、たとえばカンジダ
（Candida）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、
ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyce
s）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）又は
ヤロウィア（Yarrowia）株である。
は配列番号９に示される核酸配列、その相補的鎖又はそ
の副配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロ
ーブとハイブリダイズすることができる本発明の単離さ
れた核酸配列は、いづれかの属の微生物、たとえば細菌
又は菌類源から得られるが、しかし好ましくは菌類細胞
及びより好ましくは糸状菌細胞又は酵母細胞から得られ
る。本発明のためには、用語“〜から得られる”（又は
〜に対して内因性の）とは、一定の源に関して本明細書
において使用される場合、ポリペプチドが、前記源によ
り、又は前記源からの遺伝子が挿入されている細胞によ
り生成されることを意味する。相同遺伝子のための好ま
しい源は、アブシジア属及び公的な受託所から入手でき
るその種の株である。さらに、相同遺伝子は、上記プロ
ーブを用いて、天源のもの（たとえば土壌、水、等）か
ら単離される微生物を包含する他の源から同定され、そ
して得られる。天然の生息地から微生物を単離するため
の技法は当業界において良く知られている。次に、核酸
配列は、他の微生物のcDNAライブラリーを同様にしてス
クリーニングすることによって誘導され得る。特に好ま
しい菌は、糸状菌、たとえばアクレモニウム（Acremoni
um）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオパシ
ジウム（Aureobasidium）、クリプトコーカス（Cryptoc
occus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリ
ウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、マグナポ
ルテ（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソ
ラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティックス（Neoc
allimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロ
マイセス（Paecilomyces）、ペリシリウム（Penicilliu
m）、ピロマイセス（Piromyces）、シゾフィラム（Schi
zophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモ
アスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、
トリポクラジウム（Tolypocladium）、又はトリコデル
マ（Trichoderma）株、又は酵母株、たとえばカンジダ
（Candida）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、
ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyce
s）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）又は
ヤロウィア（Yarrowia）株である。
好ましい態様においては、本発明の核酸配列は、M.A.
A.Schipper,Persoonia,Vol.14,Part 2,pp.133−148（19
90）に記載されるようなアブシジア属の株、たとえばア
ブシジア・グリセオラ、アブシジア・スポロホラ−バリ
アビリス、アブシジア・グリセオラ var.イグチ、アブ
シジア・コリムビフェラ、又はアブシジア・ブラケスレ
アナの株から得られる。さらにより好ましい態様におい
ては、核酸配列は、アブシジア・ブラケスレアナNN1008
26（NRRL 1304）、たとえば配列番号３に示される核酸
配列；アブシジア コリムビフェラNN100062（IFO 808
4）、たとえば配列番号５に示される核酸配列；アブシ
ジア・グリセオラNN000987（ATCC 20430）；アブシジア
・グリセオラ var.イグチNN00591（ATCC 20431）、た
とえば配列番号１に示される核酸配列；アブシジア・ス
ポロホラ−バリアビリスNN102427（ATCC 36019）、たと
えば配列番号７に示される核酸配列；及びアブシジア・
レフレキサ（Absidia reflexa）NN102427（ATCC 4489
6）、たとえば配列番号９に示される核酸配列から得ら
れる。
A.Schipper,Persoonia,Vol.14,Part 2,pp.133−148（19
90）に記載されるようなアブシジア属の株、たとえばア
ブシジア・グリセオラ、アブシジア・スポロホラ−バリ
アビリス、アブシジア・グリセオラ var.イグチ、アブ
シジア・コリムビフェラ、又はアブシジア・ブラケスレ
アナの株から得られる。さらにより好ましい態様におい
ては、核酸配列は、アブシジア・ブラケスレアナNN1008
26（NRRL 1304）、たとえば配列番号３に示される核酸
配列；アブシジア コリムビフェラNN100062（IFO 808
4）、たとえば配列番号５に示される核酸配列；アブシ
ジア・グリセオラNN000987（ATCC 20430）；アブシジア
・グリセオラ var.イグチNN00591（ATCC 20431）、た
とえば配列番号１に示される核酸配列；アブシジア・ス
ポロホラ−バリアビリスNN102427（ATCC 36019）、たと
えば配列番号７に示される核酸配列；及びアブシジア・
レフレキサ（Absidia reflexa）NN102427（ATCC 4489
6）、たとえば配列番号９に示される核酸配列から得ら
れる。
アブシジア株内では、次の亜属、群、種及び株が好ま
しい。脂肪分解酵素を生成できる突然変異体もまた包含
される。多くのこれまで認識されている種の名称がSchi
pper,Op.cit.,により再分類され、そして便利さのため
に、いくつかの株のこれまで使用されて来た名称がま
た、下記に列挙される（ここで同じボックス内の複数の
番号は同じ株の複数の寄託物を示す）ことを注意するこ
と。
しい。脂肪分解酵素を生成できる突然変異体もまた包含
される。多くのこれまで認識されている種の名称がSchi
pper,Op.cit.,により再分類され、そして便利さのため
に、いくつかの株のこれまで使用されて来た名称がま
た、下記に列挙される（ここで同じボックス内の複数の
番号は同じ株の複数の寄託物を示す）ことを注意するこ
と。
上記株は、多くの培養物収集機関、たとえばAmerican
Type Culture Collection（ATCC）,Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）,
Centraalbureau Voor Schimmelcultures（CBS）、及びA
gricultural Research Service Patent Culture Collec
tion,Northern Regional Research Center（NRRL）から
容易に入手できる。
Type Culture Collection（ATCC）,Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）,
Centraalbureau Voor Schimmelcultures（CBS）、及びA
gricultural Research Service Patent Culture Collec
tion,Northern Regional Research Center（NRRL）から
容易に入手できる。
核酸配列が上記プローブにより検出されると、前記配
列は、当業者に良く知られている技法を用いて単離され
又はクローン化され得る（たとえば、Sambrookなど.,前
記を参照のこと）。核酸配列を単離し、又はクローン化
するために使用される既知の技法は、ゲノムDNAから単
離、cDNAからの調製、又はそれらの組合せを包含する。
そのようなゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクロー
ニングは、たとえば良く知られているポリメラーゼ鎖反
応（PCR）を用いることによってもたらされ得る。たと
えば、Innisなど.,1990,A Guide to Methods and Appli
cation,Academic Press,New Yorkを参照のこと。核酸配
列は、ポリペプチドを生成するアブシジア株、又は他の
又は関連する生物からクローン化され得、そして従っ
て、たとえば核酸配列のポリペプチドコード領域の対立
遺伝子性変異体又は種変異体であり得る。
列は、当業者に良く知られている技法を用いて単離され
又はクローン化され得る（たとえば、Sambrookなど.,前
記を参照のこと）。核酸配列を単離し、又はクローン化
するために使用される既知の技法は、ゲノムDNAから単
離、cDNAからの調製、又はそれらの組合せを包含する。
そのようなゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクロー
ニングは、たとえば良く知られているポリメラーゼ鎖反
応（PCR）を用いることによってもたらされ得る。たと
えば、Innisなど.,1990,A Guide to Methods and Appli
cation,Academic Press,New Yorkを参照のこと。核酸配
列は、ポリペプチドを生成するアブシジア株、又は他の
又は関連する生物からクローン化され得、そして従っ
て、たとえば核酸配列のポリペプチドコード領域の対立
遺伝子性変異体又は種変異体であり得る。
ポリペプチドをコードする核酸配列の修飾が、ポリペ
プチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために
必要である。用語、ポリペプチドに“実質的に類似す
る”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を意味す
る。それらのポリペプチドは、その生来の源から単離さ
れたポリペプチドとは、ある構築された手段において異
なることができる。たとえば、比活性、熱安定性、酸化
安定性、pH最適性又は同様のものにおいて異なる、ポリ
ペプチドの変異体を、たとえば特定部位の突然変異誘発
を用いて合成することが興味あることである。類似する
配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番
号７又は配列番号９のポリペプチドコード領域として与
えられる核酸配列、そのサブ配列に基づいて、及び／又
は核酸配列によりコードされるポリペプチドの他のアミ
ノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために
意図される宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオ
チド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列を生
ぜしめ得るヌクレオチド置換の導入により構成され得
る。ヌクレオチド置換の一般的な記載のためには、たと
えばFordなど.,1991,Protein Expression and Purifica
tion 2:95−107を参照のこと。
プチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために
必要である。用語、ポリペプチドに“実質的に類似す
る”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を意味す
る。それらのポリペプチドは、その生来の源から単離さ
れたポリペプチドとは、ある構築された手段において異
なることができる。たとえば、比活性、熱安定性、酸化
安定性、pH最適性又は同様のものにおいて異なる、ポリ
ペプチドの変異体を、たとえば特定部位の突然変異誘発
を用いて合成することが興味あることである。類似する
配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番
号７又は配列番号９のポリペプチドコード領域として与
えられる核酸配列、そのサブ配列に基づいて、及び／又
は核酸配列によりコードされるポリペプチドの他のアミ
ノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために
意図される宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオ
チド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列を生
ぜしめ得るヌクレオチド置換の導入により構成され得
る。ヌクレオチド置換の一般的な記載のためには、たと
えばFordなど.,1991,Protein Expression and Purifica
tion 2:95−107を参照のこと。
そのような置換が分子の機能に対して決定的な領域外
で行なわれるが、それでもなお活性ポリペプチドをもた
らすことは、当業者に明らかであろう。本発明の単離さ
れた核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に
不可欠であり、そして従って、置換を受けにくいアミノ
酸残基は、当業界において知られている方法、たとえば
特定部位の突然変異誘発又はアラニン−スキャンニング
突然変異誘発に従って同定され得る（たとえば、Cunnin
gham and Wells,1989,Science 244:1081−1085を参照の
こと）。後者の技法においては、突然変異は分子におけ
るあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子
が、その分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基
を同定するためにリパーゼ活性について試験される。基
質−酵素相互作用の部位はまた、核磁気共鳴分析、クリ
スタログラフィー又は光親和性ラベリングのような技法
により決定されるように、結晶構造の分析により決定さ
れ得る（たとえば、de Vosなど.,1992,Science 255:306
−312;Smithなど.,1992,Journal of Molecular Biology
224:899−904;Wlodaverなど.,1992,FEBS Letters 309:
59−64を参照のこと）。
で行なわれるが、それでもなお活性ポリペプチドをもた
らすことは、当業者に明らかであろう。本発明の単離さ
れた核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に
不可欠であり、そして従って、置換を受けにくいアミノ
酸残基は、当業界において知られている方法、たとえば
特定部位の突然変異誘発又はアラニン−スキャンニング
突然変異誘発に従って同定され得る（たとえば、Cunnin
gham and Wells,1989,Science 244:1081−1085を参照の
こと）。後者の技法においては、突然変異は分子におけ
るあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子
が、その分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基
を同定するためにリパーゼ活性について試験される。基
質−酵素相互作用の部位はまた、核磁気共鳴分析、クリ
スタログラフィー又は光親和性ラベリングのような技法
により決定されるように、結晶構造の分析により決定さ
れ得る（たとえば、de Vosなど.,1992,Science 255:306
−312;Smithなど.,1992,Journal of Molecular Biology
224:899−904;Wlodaverなど.,1992,FEBS Letters 309:
59−64を参照のこと）。
本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドは
また、他のポリペプチドが前記ポリペプチド又はそのフ
ラグメントのＮ−末端又はＣ−末端で融合される融合さ
れたポリペプチドも包含する。融合されたポリペプチド
は、本発明の核酸配列（又はその一部）に、他のポリペ
プチドをコードする核酸配列（又はその一部）を融合す
ることによって生成される。融合ポリペプチドを生成す
るための技法は、当業界において知られており、そして
ポリペプチドをコードするコード配列が読取り枠を整合
して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現が同
じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるよう
に前記コード配列を連結することを包含する。
また、他のポリペプチドが前記ポリペプチド又はそのフ
ラグメントのＮ−末端又はＣ−末端で融合される融合さ
れたポリペプチドも包含する。融合されたポリペプチド
は、本発明の核酸配列（又はその一部）に、他のポリペ
プチドをコードする核酸配列（又はその一部）を融合す
ることによって生成される。融合ポリペプチドを生成す
るための技法は、当業界において知られており、そして
ポリペプチドをコードするコード配列が読取り枠を整合
して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現が同
じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるよう
に前記コード配列を連結することを包含する。
本発明の核酸配列によりコードされる脂肪分解活性を
有するポリペプチドは、アルカリ性pH（約pH9〜10）
で、遊離Ca2+の不在下でさえ、高い活性を有することに
よって特徴づけられる。
有するポリペプチドは、アルカリ性pH（約pH9〜10）
で、遊離Ca2+の不在下でさえ、高い活性を有することに
よって特徴づけられる。
より特定には、それらのポリペプチドは、遊離Ca2+の
不在下で試験される場合、約９のpH又はそれ以上のpH
（pH8でよりもpH9でより高い活性を有する）で最適な脂
肪分解活性を有する。
不在下で試験される場合、約９のpH又はそれ以上のpH
（pH8でよりもpH9でより高い活性を有する）で最適な脂
肪分解活性を有する。
ある好ましい核酸配列は、遊離Ca2+を伴わないでpH9
で試験される場合、リパーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする。そのような脂肪分解酵素は、アブシジア
亜属ミコクラダス（Mycocladus）の株、たとえば上記で
列挙される種及び株から得られる。
で試験される場合、リパーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする。そのような脂肪分解酵素は、アブシジア
亜属ミコクラダス（Mycocladus）の株、たとえば上記で
列挙される種及び株から得られる。
他のグループの好ましい核酸配列は、Ca2+の不在下で
pH9よりもpH10で高い脂肪分解活性を有するポリペプチ
ドをコードする。そのような核酸配列は、アブシジア・
レフレキサNN102427（ATCC 44896）から得られる。
pH9よりもpH10で高い脂肪分解活性を有するポリペプチ
ドをコードする。そのような核酸配列は、アブシジア・
レフレキサNN102427（ATCC 44896）から得られる。
さらなるグループの好ましい核酸配列は、pH10で、45
℃で30分間のインキュベーションの後、90％以上の残留
活性を保持するポリペプチドをコードする。そのような
配列は、アブシジア・スポロホラ−バリアビリスの株、
たとえばアブシジア・スポロホラ−バリアビリスNN1024
27（ATCC 36019）から得られる。
℃で30分間のインキュベーションの後、90％以上の残留
活性を保持するポリペプチドをコードする。そのような
配列は、アブシジア・スポロホラ−バリアビリスの株、
たとえばアブシジア・スポロホラ−バリアビリスNN1024
27（ATCC 36019）から得られる。
核酸構成体 本発明はまた、制御配列と適合できる条件下で適切な
宿主細胞においてコード配列の発現を方向づけることが
できる１又は複数の制御配列に操作可能的に連結される
本発明の核酸配列を含んで成る核酸構造体にも関する。
宿主細胞においてコード配列の発現を方向づけることが
できる１又は複数の制御配列に操作可能的に連結される
本発明の核酸配列を含んで成る核酸構造体にも関する。
“核酸構成体”は、天然に存在する遺伝子から単離さ
れるか、又は他方では、天然に存在しない態様で組合さ
れ、そして並置される、核酸のセグメントを含むように
修飾された一本鎖か又は二本鎖の核酸分子として本明細
書において定義される。用語、核酸構造体は、その核酸
構造体が本発明のコード配列の発現のために必要とされ
るすべての制御配列を含む場合、用語、発現カセットと
類似語であり得る。用語“コード配列”とは、本明細書
において定義される場合、適切な制御配列の制御下に置
かれる場合、mRNAに転写され、そして本発明のポリペプ
チドに翻訳される配列である。そのコード配列の境界は
一般的に、５′末端での翻訳開始コドンATG及び３′末
端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列
は、DNA,cDNA、及び組換え核酸配列を包含することがで
きるが、但しそれらだけには限定されない。
れるか、又は他方では、天然に存在しない態様で組合さ
れ、そして並置される、核酸のセグメントを含むように
修飾された一本鎖か又は二本鎖の核酸分子として本明細
書において定義される。用語、核酸構造体は、その核酸
構造体が本発明のコード配列の発現のために必要とされ
るすべての制御配列を含む場合、用語、発現カセットと
類似語であり得る。用語“コード配列”とは、本明細書
において定義される場合、適切な制御配列の制御下に置
かれる場合、mRNAに転写され、そして本発明のポリペプ
チドに翻訳される配列である。そのコード配列の境界は
一般的に、５′末端での翻訳開始コドンATG及び３′末
端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列
は、DNA,cDNA、及び組換え核酸配列を包含することがで
きるが、但しそれらだけには限定されない。
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配
列は、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段
で操作され得る。ベクター中への挿入の前、ポリペプチ
ドをコードする核酸配列の操作は、発現ベクターに依存
して所望され、又は必要とされる。クローニング方法を
用いて核酸配列を修飾するための技法は、当業界におい
て良く知られている。
列は、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段
で操作され得る。ベクター中への挿入の前、ポリペプチ
ドをコードする核酸配列の操作は、発現ベクターに依存
して所望され、又は必要とされる。クローニング方法を
用いて核酸配列を修飾するための技法は、当業界におい
て良く知られている。
用語“制御配列”とは、核酸配列のコード配列の発現
のために必要であり、又は好都合であるすべての成分を
包含するものとして本明細書において定義される。個々
の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対
して生来のものであり、又は外来性のものであり得る。
そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配
列、ペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転
写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限
定されない。最小で、制御配列は、プロモーター、及び
転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、ポ
リペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配
列との連結を促進する特定の制限部位を導入するために
リンカーを供給され得る。
のために必要であり、又は好都合であるすべての成分を
包含するものとして本明細書において定義される。個々
の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対
して生来のものであり、又は外来性のものであり得る。
そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配
列、ペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転
写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限
定されない。最小で、制御配列は、プロモーター、及び
転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、ポ
リペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配
列との連結を促進する特定の制限部位を導入するために
リンカーを供給され得る。
制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸
配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列
であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現
を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、選択
の宿主細胞において転写活性を示すいづれかの核酸配列
であり、そして宿主細胞に対して相同又は非相同の細胞
外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ら
れる。
配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列
であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現
を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、選択
の宿主細胞において転写活性を示すいづれかの核酸配列
であり、そして宿主細胞に対して相同又は非相同の細胞
外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ら
れる。
特に細菌宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写
を方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリ
lacオペロン、ストレプトマイセス・コエリカラー（Str
eptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）、バ
シラス スブチリス（Bacillus subtilis）レバンスク
ラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス・リケニホルミス（Ba
cillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amy
L）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus st
earothermophilus）マルトゲン性アミラーゼ遺伝子（am
yM）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、
バシラス・リケニホルミス ペニシリナーゼ遺伝子（pe
nP）、バシラス スブチリスxylA及びxylB遺伝子、及び
原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモー
ター（Villa−Kamaroffなど.,1978,Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 75:3727−373
1）、及びtacプロモーター（DeBoerなど.,1983,Proceed
ings of the National Academy of Sciences USA 80:21
−25）である。さらなるプロモーターは、“Useful pro
teins from recombinant bacteria"in Scientific Amer
ica,1980,242:74−94;及びSambrookなど.,1989、前記に
記載される。
を方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリ
lacオペロン、ストレプトマイセス・コエリカラー（Str
eptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）、バ
シラス スブチリス（Bacillus subtilis）レバンスク
ラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス・リケニホルミス（Ba
cillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amy
L）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus st
earothermophilus）マルトゲン性アミラーゼ遺伝子（am
yM）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、
バシラス・リケニホルミス ペニシリナーゼ遺伝子（pe
nP）、バシラス スブチリスxylA及びxylB遺伝子、及び
原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモー
ター（Villa−Kamaroffなど.,1978,Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 75:3727−373
1）、及びtacプロモーター（DeBoerなど.,1983,Proceed
ings of the National Academy of Sciences USA 80:21
−25）である。さらなるプロモーターは、“Useful pro
teins from recombinant bacteria"in Scientific Amer
ica,1980,242:74−94;及びSambrookなど.,1989、前記に
記載される。
糸状菌宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写を
方向づけるための適切なプロモーターの例は、アスペル
ギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラー
ゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロティナー
ゼ、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）中
性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸性安定性
α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペル
ギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミ
ラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイ リパーゼ、ア
スペルギラス・オリザエ アルカリ プロテアーゼ ア
スペルギラス・オリザエ トリオースリン酸イソメラー
ゼ、アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidu
lans）アセトアミダーゼ、フサリウム・オキシスポラム
（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（ア
メリカ特許第4,288,627号に記載される（これは引用に
より本明細書に組込まれる））、及びそれらのハイブリ
ッドをコードする遺伝子から得られるプロモーターであ
る。糸状菌宿主細胞への使用のための特に好ましいプロ
モーターは、TAKAアミラーゼ、NA2−tpi（アスペルギラ
ス ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オ
リザエ トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺
伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びglaAプ
ロモーターである。
方向づけるための適切なプロモーターの例は、アスペル
ギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラー
ゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロティナー
ゼ、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）中
性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸性安定性
α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペル
ギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミ
ラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイ リパーゼ、ア
スペルギラス・オリザエ アルカリ プロテアーゼ ア
スペルギラス・オリザエ トリオースリン酸イソメラー
ゼ、アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidu
lans）アセトアミダーゼ、フサリウム・オキシスポラム
（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（ア
メリカ特許第4,288,627号に記載される（これは引用に
より本明細書に組込まれる））、及びそれらのハイブリ
ッドをコードする遺伝子から得られるプロモーターであ
る。糸状菌宿主細胞への使用のための特に好ましいプロ
モーターは、TAKAアミラーゼ、NA2−tpi（アスペルギラ
ス ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オ
リザエ トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺
伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びglaAプ
ロモーターである。
酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロ
ミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）エ
ノラーゼ（ENO−１）遺伝子、サッカロミセス・セレビ
シアエ ガラクトキナーゼ遺伝子（GAL1）、サッカロミ
セス・セレビシアエ アルコールデヒドロゲナーゼ／グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
（ADH2/GAP）、及びサッカロミセス・セレビシアエ ３
−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得られる。酵
母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romano
sなど.,1992,Yeast 8:423−488に記載される。哺乳類宿
主細胞において、有用なプロモーターは、ウィルスプロ
モーター、たとえばSimian Virus 40（SV40）、ラウス
肉腫ウィルス（RSV）、アデノウィルス、及びウシ乳頭
腫ウィルス（BPV）からのプロモーターである。
ミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）エ
ノラーゼ（ENO−１）遺伝子、サッカロミセス・セレビ
シアエ ガラクトキナーゼ遺伝子（GAL1）、サッカロミ
セス・セレビシアエ アルコールデヒドロゲナーゼ／グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
（ADH2/GAP）、及びサッカロミセス・セレビシアエ ３
−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得られる。酵
母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romano
sなど.,1992,Yeast 8:423−488に記載される。哺乳類宿
主細胞において、有用なプロモーターは、ウィルスプロ
モーター、たとえばSimian Virus 40（SV40）、ラウス
肉腫ウィルス（RSV）、アデノウィルス、及びウシ乳頭
腫ウィルス（BPV）からのプロモーターである。
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、す
なわち転写を終結するために宿主細胞により認識される
配列であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチド
をコードする核酸配列の３′末端に操作可能的に連結さ
れる。選択の宿主細胞において機能的であるいづれかの
ターミネーターが本発明において使用され得る。
なわち転写を終結するために宿主細胞により認識される
配列であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチド
をコードする核酸配列の３′末端に操作可能的に連結さ
れる。選択の宿主細胞において機能的であるいづれかの
ターミネーターが本発明において使用され得る。
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、
アスペルギラス オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギ
ラス・ニガー グルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニ
ジュランス アントラニル酸シンターゼ、アスペルギラ
ス・ニガーα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシ
スポラム トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝
子から得られる。
アスペルギラス オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギ
ラス・ニガー グルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニ
ジュランス アントラニル酸シンターゼ、アスペルギラ
ス・ニガーα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシ
スポラム トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝
子から得られる。
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サ
ッカロミセス セレビシアエ エノラーゼ サッカロミ
セス・セレビシアエ シトクロムＣ（CYC1）、又はサッ
カロミセス・セレビシアエ グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から得られ
る。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーター
は、Romanosなど.,1992、前記に記載される。ターミネ
ーター配列は、哺乳類宿主細胞のためには、当業界にお
いて良く知られている。
ッカロミセス セレビシアエ エノラーゼ サッカロミ
セス・セレビシアエ シトクロムＣ（CYC1）、又はサッ
カロミセス・セレビシアエ グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から得られ
る。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーター
は、Romanosなど.,1992、前記に記載される。ターミネ
ーター配列は、哺乳類宿主細胞のためには、当業界にお
いて良く知られている。
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち宿主
細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域で
もあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードす
る核酸配列の５′末端に操作可能的に連結される。選択
の宿主細胞において機能的であるいづれかのリーダー配
列が、本発明において使用され得る。
細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域で
もあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードす
る核酸配列の５′末端に操作可能的に連結される。選択
の宿主細胞において機能的であるいづれかのリーダー配
列が、本発明において使用され得る。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペ
ルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギラス
・オリザエ トリオースリン酸イソメラーゼをコードす
る遺伝子から得られる。
ルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギラス
・オリザエ トリオースリン酸イソメラーゼをコードす
る遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、サッカロミ
セス・セレビシアエ エノラーゼ（ENO−１）遺伝子、
サッカロミセス・セレビシアエ ３−ホスホグリセレー
トキナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシアエ α
−因子、及びサッカロミセス・セレビシアエ アルコー
ルデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH2/GAP）から得られる。
セス・セレビシアエ エノラーゼ（ENO−１）遺伝子、
サッカロミセス・セレビシアエ ３−ホスホグリセレー
トキナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシアエ α
−因子、及びサッカロミセス・セレビシアエ アルコー
ルデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH2/GAP）から得られる。
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸
配列の３′末端に操作可能的に連結され、そして転写さ
れる場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加
するためのシグナルとして宿主細胞により認識される配
列でもあり得る。選択の宿主細胞において機能するいづ
れかのポリアデニル化配列が、本発明において使用され
得る。
配列の３′末端に操作可能的に連結され、そして転写さ
れる場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加
するためのシグナルとして宿主細胞により認識される配
列でもあり得る。選択の宿主細胞において機能するいづ
れかのポリアデニル化配列が、本発明において使用され
得る。
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列
は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペ
ルギラス・ニガー グルコアミラーゼ、アスペルギラス
・ニジュランス アントラニル酸シンターゼ、及びアス
ペルギラス・ニガーα−アミラーゼをコードする遺伝子
から得られる。
は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペ
ルギラス・ニガー グルコアミラーゼ、アスペルギラス
・ニジュランス アントラニル酸シンターゼ、及びアス
ペルギラス・ニガーα−アミラーゼをコードする遺伝子
から得られる。
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、
Guo and Sherman,1995,Molecular Cellular Biology 1
5:5983−5990により記載される。ポリアデニル化配列
は、哺乳類宿主細胞のためには、当業界において良く知
られている。
Guo and Sherman,1995,Molecular Cellular Biology 1
5:5983−5990により記載される。ポリアデニル化配列
は、哺乳類宿主細胞のためには、当業界において良く知
られている。
制御配列はまた、細胞の分泌路中に発現されたポリペ
プチドを方向づけることができるポリペプチドのアミノ
末端に連結されるアミノ酸配列をコードするシグナルペ
プチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列
の５′末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコ
ード領域のセグメントと翻訳読取り枠を整合して天然に
おいて連結されるシグナルペプチドコード領域を本来、
含むことができる。他方では、コード配列の５′末端
は、分泌されたポリペプチドをコードするコード配列の
その部分に対して外来性であるシグナルペプチドコード
領域を含むことができる。その外来性シグナルペプチド
コード領域は、そのコード配列がシグナルペプチドコー
ド領域を通常含まない場合に必要とされ得る。他方で
は、その外来性シグナルペプチドコード領域は、そのコ
ード配列と通常関連する天然のシグナルペプチドコード
領域に関してリパーゼの増強された分泌を得るために天
然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換すること
ができる。シグナルペプチドコード領域は、アルペルギ
ラス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、
リゾムコル種からのリパーゼ又はプロティナーゼ遺伝
子、サッカロミセス・セレビシアエからのα−因子のた
めの遺伝子、バシラス種からのアミラーゼ又はプロテア
ーゼ遺伝子、又はウシプレプロキモシン遺伝子から得ら
れる。しかしながら、選択の宿主細胞の分泌路中に発現
されたリパーゼを方向づけることができるいづれかのシ
グナルペプチドコード領域が、本発明において使用され
得る。
プチドを方向づけることができるポリペプチドのアミノ
末端に連結されるアミノ酸配列をコードするシグナルペ
プチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列
の５′末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコ
ード領域のセグメントと翻訳読取り枠を整合して天然に
おいて連結されるシグナルペプチドコード領域を本来、
含むことができる。他方では、コード配列の５′末端
は、分泌されたポリペプチドをコードするコード配列の
その部分に対して外来性であるシグナルペプチドコード
領域を含むことができる。その外来性シグナルペプチド
コード領域は、そのコード配列がシグナルペプチドコー
ド領域を通常含まない場合に必要とされ得る。他方で
は、その外来性シグナルペプチドコード領域は、そのコ
ード配列と通常関連する天然のシグナルペプチドコード
領域に関してリパーゼの増強された分泌を得るために天
然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換すること
ができる。シグナルペプチドコード領域は、アルペルギ
ラス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、
リゾムコル種からのリパーゼ又はプロティナーゼ遺伝
子、サッカロミセス・セレビシアエからのα−因子のた
めの遺伝子、バシラス種からのアミラーゼ又はプロテア
ーゼ遺伝子、又はウシプレプロキモシン遺伝子から得ら
れる。しかしながら、選択の宿主細胞の分泌路中に発現
されたリパーゼを方向づけることができるいづれかのシ
グナルペプチドコード領域が、本発明において使用され
得る。
細菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコー
ド領域は、バシラス NCIB 11837からのマルトゲン性ア
ミラーゼ遺伝子、バシラス ステアロサーモフィラス
α−アミラーゼ遺伝子、バシラス リケニホルミス サ
ブチリシン遺伝子、バシラス・リケニホルミス β−ラ
クタマーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフィラス
中性プロテアーゼ遺伝子（nprT,nprS,nprM）、及びバシ
ラス・スブチリス prsA遺伝子から得られるシグナルペ
プチドコード領域である。さらなるシグナルペプチド
は、Simonen and Palva,1993,Microbiological Reviews
57:109−137により記載される。
ド領域は、バシラス NCIB 11837からのマルトゲン性ア
ミラーゼ遺伝子、バシラス ステアロサーモフィラス
α−アミラーゼ遺伝子、バシラス リケニホルミス サ
ブチリシン遺伝子、バシラス・リケニホルミス β−ラ
クタマーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフィラス
中性プロテアーゼ遺伝子（nprT,nprS,nprM）、及びバシ
ラス・スブチリス prsA遺伝子から得られるシグナルペ
プチドコード領域である。さらなるシグナルペプチド
は、Simonen and Palva,1993,Microbiological Reviews
57:109−137により記載される。
糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコ
ード領域は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ
遺伝子、アスペルギラス・ニガー 中性アミラーゼ遺伝
子、リゾムコル・ミエヘイ アスパラギン酸プロテアー
ゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサ セルラーゼ遺伝
子、又はリゾムコム・ミエヘイ リパーゼ遺伝子から得
られるシグナルペプチドコード領域である。
ード領域は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ
遺伝子、アスペルギラス・ニガー 中性アミラーゼ遺伝
子、リゾムコル・ミエヘイ アスパラギン酸プロテアー
ゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサ セルラーゼ遺伝
子、又はリゾムコム・ミエヘイ リパーゼ遺伝子から得
られるシグナルペプチドコード領域である。
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サ
ッカロミセス・セレビシアエ α−因子及びサッカロミ
セス・セレビシアエ インバーターゼのための遺伝子か
ら得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域
は、Romanosなど.,1992、前記により記載される。
ッカロミセス・セレビシアエ α−因子及びサッカロミ
セス・セレビシアエ インバーターゼのための遺伝子か
ら得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域
は、Romanosなど.,1992、前記により記載される。
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置す
るアミノ酸配列をコードするポリペプチドコード領域で
もあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプ
ロポリペプチド（又は幾らかの場合、チモーゲン）とし
て知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性で
あり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触
媒又は自己触媒切断により成熟活性ポリペプチドに転換
され得る。プロペプチドコード領域は、バシラス・スブ
チリス アルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE）、バシラ
ス・スブチリス 中性プロテアーゼ遺伝子（nprT）、サ
ッカロミセス・セレビシアエ α−因子遺伝子、又はミ
セリオプソラ・サーモフィラム（Myceliophthora therm
ophilum）ラッカーゼ遺伝子（WO 95/33836）から得られ
る。
るアミノ酸配列をコードするポリペプチドコード領域で
もあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプ
ロポリペプチド（又は幾らかの場合、チモーゲン）とし
て知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性で
あり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触
媒又は自己触媒切断により成熟活性ポリペプチドに転換
され得る。プロペプチドコード領域は、バシラス・スブ
チリス アルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE）、バシラ
ス・スブチリス 中性プロテアーゼ遺伝子（nprT）、サ
ッカロミセス・セレビシアエ α−因子遺伝子、又はミ
セリオプソラ・サーモフィラム（Myceliophthora therm
ophilum）ラッカーゼ遺伝子（WO 95/33836）から得られ
る。
本発明の核酸構成体または、ポリペプチドの発現にお
いて好都合である１又は複数の因子、たとえば活性化因
子（たとえば、トランス作用性因子）、カペロン（chap
erone）、及びプロセッシングプロテアーゼをコードす
る１又は複数の核酸配列を含んで成る。選択の宿主細胞
において機能的であるいづれかの因子が、本発明におい
て使用され得る。１又は複数のそれらの因子をコードす
る核酸は、ポリペプチドをコードする核酸配列と必ずし
もタンデムに存在する必要はない。
いて好都合である１又は複数の因子、たとえば活性化因
子（たとえば、トランス作用性因子）、カペロン（chap
erone）、及びプロセッシングプロテアーゼをコードす
る１又は複数の核酸配列を含んで成る。選択の宿主細胞
において機能的であるいづれかの因子が、本発明におい
て使用され得る。１又は複数のそれらの因子をコードす
る核酸は、ポリペプチドをコードする核酸配列と必ずし
もタンデムに存在する必要はない。
活性化因子は、ポリペプチドをコードする核酸配列の
転写を活性化するタンパク質である（Kudlaなど.,1990,
EMBO Journal 9:1355−1364;Jarai and Boxton,1994,Cu
rrent Genetics 26:2238−244;Verdier,1990,Yeast 6:2
71−297）。活性化因子をコードする核酸配列は、バシ
ラス・ステアロサーモフィラス NprA（nprA）、サッカ
ロミセス・セレビシアエ ヘム活性化因子タンパク質１
（hap1）、サッカロミセス・セレビシアエ ガラクトー
ス代謝タンパク質４（gal4）、及びアスペルギラス・ニ
ジュランス アンモニア調節タンパク質（areA）をコー
ドする遺伝子から得られる。さらなる例については、Ve
rdier,1990、前記、及びMackenzieなど.,1993,Journal
of General Microbiology 139:2295−2307を参照のこ
と。
転写を活性化するタンパク質である（Kudlaなど.,1990,
EMBO Journal 9:1355−1364;Jarai and Boxton,1994,Cu
rrent Genetics 26:2238−244;Verdier,1990,Yeast 6:2
71−297）。活性化因子をコードする核酸配列は、バシ
ラス・ステアロサーモフィラス NprA（nprA）、サッカ
ロミセス・セレビシアエ ヘム活性化因子タンパク質１
（hap1）、サッカロミセス・セレビシアエ ガラクトー
ス代謝タンパク質４（gal4）、及びアスペルギラス・ニ
ジュランス アンモニア調節タンパク質（areA）をコー
ドする遺伝子から得られる。さらなる例については、Ve
rdier,1990、前記、及びMackenzieなど.,1993,Journal
of General Microbiology 139:2295−2307を参照のこ
と。
カペロン（chaperon）は、もう１つのポリペプチドが
正しく折りたたまれるように助力するタンパク質である
（Hart1など.,1994,TIBS 19:20−25;Begeronなど.,199
4,TIBS 19:124−128;Demolderなど.,1994,Journal of B
iotechnology 32:179−189;Craig,1993,Science 260;19
02−1903;Gething and Sambrook,1992,Nature 355:33−
45;Puig and Cilbert,1994,Journal of Biological Che
mistry 269:7764−7771;Wang and Tsou,1993,The FASEB
Journal 7:1515−11157;Robinsonなど.,1994,Bio/Tech
nology 1:381−384）。カペロンをコードする核酸配列
は、バシラス・スブチリス GroEタンパク質、アスペル
ギラス・オリザエ タンパク質 ジスルフィド・イソメ
ラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエ カルネキシン
（Calnexin）、サッカロミセス・セレビシアエBiP/GRP7
8及びサッカロミセス・セレビシアエHsp70をコードする
遺伝子から得られる。さらなる例に関しては、Gething
and Sambrook,1992、前記及びHart1など.,1994、前記を
参照のこと。
正しく折りたたまれるように助力するタンパク質である
（Hart1など.,1994,TIBS 19:20−25;Begeronなど.,199
4,TIBS 19:124−128;Demolderなど.,1994,Journal of B
iotechnology 32:179−189;Craig,1993,Science 260;19
02−1903;Gething and Sambrook,1992,Nature 355:33−
45;Puig and Cilbert,1994,Journal of Biological Che
mistry 269:7764−7771;Wang and Tsou,1993,The FASEB
Journal 7:1515−11157;Robinsonなど.,1994,Bio/Tech
nology 1:381−384）。カペロンをコードする核酸配列
は、バシラス・スブチリス GroEタンパク質、アスペル
ギラス・オリザエ タンパク質 ジスルフィド・イソメ
ラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエ カルネキシン
（Calnexin）、サッカロミセス・セレビシアエBiP/GRP7
8及びサッカロミセス・セレビシアエHsp70をコードする
遺伝子から得られる。さらなる例に関しては、Gething
and Sambrook,1992、前記及びHart1など.,1994、前記を
参照のこと。
プロセッシングプロテアーゼは、生化学的に活性的な
成熟ポリペプチドを生成するためにプロペプチドを分解
するプロテアーゼである（Enderlin and Ogrydziak,199
4,Yeast 10:67−79;Fullerなど.,1989,Proceedings of
the National Academy of Sciences USA 86:1434−143
8;Juliusなど.,1984,Cell 37:1075−1089;Juliusなど.,
1983,Cell 32:839−852）。プロセッシングプロテアー
ゼをコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシ
アエ ジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロミセ
ス・セレビシアエ Kex2及びヤロウィア・リポリチカ
（Yarrowia lipolytica）二塩基性プロセッシングエン
ドプロテアーゼ（xpr6）をコードする遺伝子から得られ
る。
成熟ポリペプチドを生成するためにプロペプチドを分解
するプロテアーゼである（Enderlin and Ogrydziak,199
4,Yeast 10:67−79;Fullerなど.,1989,Proceedings of
the National Academy of Sciences USA 86:1434−143
8;Juliusなど.,1984,Cell 37:1075−1089;Juliusなど.,
1983,Cell 32:839−852）。プロセッシングプロテアー
ゼをコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシ
アエ ジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロミセ
ス・セレビシアエ Kex2及びヤロウィア・リポリチカ
（Yarrowia lipolytica）二塩基性プロセッシングエン
ドプロテアーゼ（xpr6）をコードする遺伝子から得られ
る。
宿主細胞の増殖に関してポリペプチドの発現の調節を
可能にする調節配列を付加することがまた所望される。
調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化
学又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現の開始又は停
止を引き起こすものである。原核系における調節システ
ムは、lac,tac及びtrpオペレーターシステムを包含す
る。酵母においては、ADH2システム又はGAL1システムが
使用され得る。糸状菌においては、TAKAα−アミラーゼ
プロモーター、アスペルギラス・ニガー グルコアミラ
ーゼプロモーター及びアスペルギラス・オリザエ グル
コアミラーゼプロモーターが、調節配列として使用され
得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするも
のである。真核系においては、それらはメトトレキセー
トの存在下で増殖されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝
子、及び重金属により増殖されるメタロチオネイン遺伝
子を包含する。それらの場合、ポリペプチドをコードす
る核酸配列は、調節配列とタンデムに配置される。
可能にする調節配列を付加することがまた所望される。
調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化
学又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現の開始又は停
止を引き起こすものである。原核系における調節システ
ムは、lac,tac及びtrpオペレーターシステムを包含す
る。酵母においては、ADH2システム又はGAL1システムが
使用され得る。糸状菌においては、TAKAα−アミラーゼ
プロモーター、アスペルギラス・ニガー グルコアミラ
ーゼプロモーター及びアスペルギラス・オリザエ グル
コアミラーゼプロモーターが、調節配列として使用され
得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするも
のである。真核系においては、それらはメトトレキセー
トの存在下で増殖されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝
子、及び重金属により増殖されるメタロチオネイン遺伝
子を包含する。それらの場合、ポリペプチドをコードす
る核酸配列は、調節配列とタンデムに配置される。
発現ベクター 本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及
び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベ
クターにも関する。上記種々の核酸及び制御配列は、１
又は複数の便利な制限部位を、そのような部位でのポリ
ペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能に
するために含むことができる組換え発現ベクターを生成
するために一緒に連結され得る。他方では、本発明の核
酸配列は、核酸配列又は前記配列を含んで成る核酸構造
体を発現のための適切なベクター中に挿入することによ
って発現され得る。発現ベクターを創造する場合、コー
ド配列がベクターに配置され、その結果、前記コード配
列は発現のために、及びたぶん分泌のために適切な制御
配列と共に操作可能的に連結される。
び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベ
クターにも関する。上記種々の核酸及び制御配列は、１
又は複数の便利な制限部位を、そのような部位でのポリ
ペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能に
するために含むことができる組換え発現ベクターを生成
するために一緒に連結され得る。他方では、本発明の核
酸配列は、核酸配列又は前記配列を含んで成る核酸構造
体を発現のための適切なベクター中に挿入することによ
って発現され得る。発現ベクターを創造する場合、コー
ド配列がベクターに配置され、その結果、前記コード配
列は発現のために、及びたぶん分泌のために適切な制御
配列と共に操作可能的に連結される。
組換え発現ベクターは、組換えDNA方法により便利に
ゆだねられ、そして核酸配列の発現を引き起こすことが
できるいづれかのベクター（たとえば、プラスミド又は
ウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、
ベクターが導入される宿主細胞とそのベクターとの適合
性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環され
た環状プラスミドであり得る。ベクターは、自律的に複
製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関
係である染色体外存在物、たとえばプラスミド、染色体
外要素、ミニ染色体又は人工染色体として存在するベク
ターであり得る。ベクターは、自己複製を確保するため
のいづれかの手段を含むことができる。他方では、ベク
ターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組込
まれ、そしてそれが組込まれている染色体と一緒に複製
されるものであり得る。ベクターシステムは、単一のベ
クター又はプラスミド、又は宿主細胞のゲノム中に導入
されるべき全DNAを一緒に含む複製のベクター又はプラ
スミド、又はトランスポゾンであり得る。
ゆだねられ、そして核酸配列の発現を引き起こすことが
できるいづれかのベクター（たとえば、プラスミド又は
ウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、
ベクターが導入される宿主細胞とそのベクターとの適合
性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環され
た環状プラスミドであり得る。ベクターは、自律的に複
製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関
係である染色体外存在物、たとえばプラスミド、染色体
外要素、ミニ染色体又は人工染色体として存在するベク
ターであり得る。ベクターは、自己複製を確保するため
のいづれかの手段を含むことができる。他方では、ベク
ターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組込
まれ、そしてそれが組込まれている染色体と一緒に複製
されるものであり得る。ベクターシステムは、単一のベ
クター又はプラスミド、又は宿主細胞のゲノム中に導入
されるべき全DNAを一緒に含む複製のベクター又はプラ
スミド、又はトランスポゾンであり得る。
本発明のベクターは、宿主細胞中に導入される場合、
宿主細胞ゲノム中に組込まれ得る。組込みのためには、
ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、又は
相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安
定した組込みのためのベクターのいづれか他の要素に依
存する。他方では、ベクターは、宿主細胞のゲノム中へ
の相同組換えによる組込みを方向づけるための追加の核
酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染
色体における正確な位置での宿主細胞ゲノム中へのベク
ターの組込みを可能にする。正確な位置での組込みの見
込みを高めるためには、組込み要素は好ましくは、相同
組込みの可能性を高めるためにその対応する標的配列と
高い相同性である十分な数の核酸、たとえば100〜1,500
の塩基対、好ましくは400〜1,500の塩基対、及び最とも
好ましくは800〜1,500の塩基対を含むべきである。組込
み要素は、宿主細胞のゲノムにおける核酸配列と相同で
あるいづれかの配列であり得る。さらに、組込み要素
は、非コード、又はコード核酸配列であり得る。他方で
は、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノム
中に組込まれ得る。それらの核酸配列は、宿主細胞のゲ
ノムにおける標的配列と相同であるいづれかの配列であ
り、そしてさらに、非コード又はコード配列であり得
る。
宿主細胞ゲノム中に組込まれ得る。組込みのためには、
ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、又は
相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安
定した組込みのためのベクターのいづれか他の要素に依
存する。他方では、ベクターは、宿主細胞のゲノム中へ
の相同組換えによる組込みを方向づけるための追加の核
酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染
色体における正確な位置での宿主細胞ゲノム中へのベク
ターの組込みを可能にする。正確な位置での組込みの見
込みを高めるためには、組込み要素は好ましくは、相同
組込みの可能性を高めるためにその対応する標的配列と
高い相同性である十分な数の核酸、たとえば100〜1,500
の塩基対、好ましくは400〜1,500の塩基対、及び最とも
好ましくは800〜1,500の塩基対を含むべきである。組込
み要素は、宿主細胞のゲノムにおける核酸配列と相同で
あるいづれかの配列であり得る。さらに、組込み要素
は、非コード、又はコード核酸配列であり得る。他方で
は、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノム
中に組込まれ得る。それらの核酸配列は、宿主細胞のゲ
ノムにおける標的配列と相同であるいづれかの配列であ
り、そしてさらに、非コード又はコード配列であり得
る。
自律複製のためには、ベクターは、問題の宿主細胞に
おいてベクターの自律的複製を可能にする複製の起点を
さらに包含することができる。複製の細菌起点の例は、
E.コリにおける複製を可能にするプラスミドpBR322,pUC
19,pACYC177及びpACYC184、及びバシラスにおける複製
を可能にするpUB110,pE194,pTA1060及びpAMβ１の複製
の起点である。酵母細胞への使用のための複製の起点の
例は、複製の２ミクロン起点、CEN6及びARS4の組合せ、
及びCEN3及びARS1の組合せである。複製の起点は、宿主
細胞においてその機能を感温性にする突然変異を有する
起点であり得る（例えば、Ehrlich,1978,Proceedings o
f the National Academy of Sciences USA 75:1433）。
特定の態様においては、発現ベクターは、pZL−NL1,pZL
−NL61,pZL−NL95又はpZL−NL124であり得る。
おいてベクターの自律的複製を可能にする複製の起点を
さらに包含することができる。複製の細菌起点の例は、
E.コリにおける複製を可能にするプラスミドpBR322,pUC
19,pACYC177及びpACYC184、及びバシラスにおける複製
を可能にするpUB110,pE194,pTA1060及びpAMβ１の複製
の起点である。酵母細胞への使用のための複製の起点の
例は、複製の２ミクロン起点、CEN6及びARS4の組合せ、
及びCEN3及びARS1の組合せである。複製の起点は、宿主
細胞においてその機能を感温性にする突然変異を有する
起点であり得る（例えば、Ehrlich,1978,Proceedings o
f the National Academy of Sciences USA 75:1433）。
特定の態様においては、発現ベクターは、pZL−NL1,pZL
−NL61,pZL−NL95又はpZL−NL124であり得る。
本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞
の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを
含む。選択マーカーは、殺生物又はウィルス耐性、重金
属に対する耐性、原栄養性〜栄養要求性及び同様のもの
を供給する生成物の遺伝子である。細菌選択マーカーの
例は、バシラス スブチリス又はバシラス リケニホル
ミスからのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、たとえばア
ンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又は
テトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。頻繁
に使用される哺乳類マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ遺伝子である。酵母宿主細胞のための適切なマーカ
ーは、ADE2,HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1及びURA3であり
得る。糸状菌宿主細胞への使用のための選択マーカー
は、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチン カ
ルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノト
リシン アセチルトランスフェラーゼ）、hygB（ヒグロ
マイシン ホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸塩
レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５′−リン酸デカ
ルボキシラーゼ）、sC（硫酸塩アデニルトランスフェラ
ーゼ）、trpC（アントラニル酸シンターゼ）、及びグル
ホシネート耐性マーカー、並びに他の種からの同等物か
ら成る群から選択され得るが、但しそれらだけには限定
されない。アスペルギラス細胞への使用のためには、ア
スペルギラス ニジュランス又はアスペルギラス オリ
ザエのamdS及びpyrGマーカー、及びストレプトミセス
ヒグロスコピカス（Streptmyces hygroscopicus）のbar
マーカーが好ましい。さらに、選択は、選択マーカーが
別のベクター上に存在する場合、WO 91/17243に記載さ
れるように、同時形質転換により達成され得る。
の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを
含む。選択マーカーは、殺生物又はウィルス耐性、重金
属に対する耐性、原栄養性〜栄養要求性及び同様のもの
を供給する生成物の遺伝子である。細菌選択マーカーの
例は、バシラス スブチリス又はバシラス リケニホル
ミスからのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、たとえばア
ンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又は
テトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。頻繁
に使用される哺乳類マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ遺伝子である。酵母宿主細胞のための適切なマーカ
ーは、ADE2,HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1及びURA3であり
得る。糸状菌宿主細胞への使用のための選択マーカー
は、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチン カ
ルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノト
リシン アセチルトランスフェラーゼ）、hygB（ヒグロ
マイシン ホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸塩
レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５′−リン酸デカ
ルボキシラーゼ）、sC（硫酸塩アデニルトランスフェラ
ーゼ）、trpC（アントラニル酸シンターゼ）、及びグル
ホシネート耐性マーカー、並びに他の種からの同等物か
ら成る群から選択され得るが、但しそれらだけには限定
されない。アスペルギラス細胞への使用のためには、ア
スペルギラス ニジュランス又はアスペルギラス オリ
ザエのamdS及びpyrGマーカー、及びストレプトミセス
ヒグロスコピカス（Streptmyces hygroscopicus）のbar
マーカーが好ましい。さらに、選択は、選択マーカーが
別のベクター上に存在する場合、WO 91/17243に記載さ
れるように、同時形質転換により達成され得る。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の１つ以
上のコピーが、その核酸配列の発現を増幅するために宿
主細胞中に挿入され得る。核酸配列の安定した増殖は、
当業界において良く知られている方法を用いて、前記配
列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノム中
に組込み、そして形質転換体について選択することによ
って得られる。
上のコピーが、その核酸配列の発現を増幅するために宿
主細胞中に挿入され得る。核酸配列の安定した増殖は、
当業界において良く知られている方法を用いて、前記配
列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノム中
に組込み、そして形質転換体について選択することによ
って得られる。
本発明の組換え発現ベクターを構成するための上記要
素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知
られている（たとえば、Sambrookなど.,1989、前記を参
照のこと）。
素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知
られている（たとえば、Sambrookなど.,1989、前記を参
照のこと）。
宿主細胞 本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成に都合良く
使用される、本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主
細胞にも関する。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生
じる突然変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の
いづれかの子孫を包含する。
使用される、本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主
細胞にも関する。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生
じる突然変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の
いづれかの子孫を包含する。
細胞は好ましくは、本発明の核酸配列を含んで成るベ
クターの宿主染色体中への組込みにより形質転換され
る。“形質転換”とは、本発明の核酸配列を含んで成る
ベクターを、そのベクターが染色体組込み体として又は
自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう、宿主
細胞中に導入することを意味する。組込みは一般的に、
核酸配列がより効果的に細胞において安定して維持され
る場合、好都合であると思われる。宿主染色体中へのベ
クターの組込みは、上記のように相同又は非相同組換え
を生ぜしめる。
クターの宿主染色体中への組込みにより形質転換され
る。“形質転換”とは、本発明の核酸配列を含んで成る
ベクターを、そのベクターが染色体組込み体として又は
自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう、宿主
細胞中に導入することを意味する。組込みは一般的に、
核酸配列がより効果的に細胞において安定して維持され
る場合、好都合であると思われる。宿主染色体中へのベ
クターの組込みは、上記のように相同又は非相同組換え
を生ぜしめる。
宿主細胞の選択は、ポリペプチド又はその源をコード
する遺伝子にかなりの程度依存するであろう。宿主細胞
は、単細胞微生物、たとえば原核生物又は非単細胞微生
物、たとえば真核生物であり得る。有用な単細胞は、細
菌細胞、たとえばグラム陽性細菌、たとえばバシラス細
胞、たとえばバシラス・アルカロフィラス（Bacillus a
lkalophilus）、バシラス・アミロリクエファシエンス
（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス
（Bacillus brevis）、バシラス・サーキュランス（Bac
illus circulans）、バシラス・コアギュランス（Bacil
lus coagulans）、バシラス・ファーマス（Bacillus fi
rmus）、バシラス・ラウタス（Bacillus lautus）、バ
シラス レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リ
ケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・
メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プ
ミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサー
モフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラ
ス・サブチリス（Bacillus subtilis）、及びバシラス
・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）；又は
ストレプトミセス細胞、たとえばストレプトミセス・リ
ビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミ
セス・ムリナス（Streptomyces murinus）、又はグラム
陰性細菌、たとえばE.コリ、及びプソイドモナス sp.
（Pseudomonas sp.）であるが、但しそれらだけには限
定されない。好ましい態様においては、細菌宿主細胞
は、バシラス・レンタス・バシラス・リケニホルミス、
バシラス・ステアロサーマフィラス又はバシラス・サブ
チリス細胞である。細菌宿主細胞の形質転換は、プロト
プラスト形質転換により（たとえば、Chang and Cohen,
1979,Molecular General Genstics 168:111−115を参照
のこと）、コンピテント細胞を用いることにより（たと
えば、Young and Spizizin,1961,Journal of Bacteriol
ogy 81:823−829、又はDubnau and Davidoff−Abelson,
1971,Journal of Molecular Biology 56:209−221を参
照のこと）、エレクトロポレーションにより（たとえ
ば、Shigekawa and Dower,1988,Biotechnigues 6:742−
751を参照のこと）、又は接合により（たとえば、Koehl
er and Thome,1987,Journal of Bacteriology 169:5771
−5278を参照のこと）、もたらされ得る。
する遺伝子にかなりの程度依存するであろう。宿主細胞
は、単細胞微生物、たとえば原核生物又は非単細胞微生
物、たとえば真核生物であり得る。有用な単細胞は、細
菌細胞、たとえばグラム陽性細菌、たとえばバシラス細
胞、たとえばバシラス・アルカロフィラス（Bacillus a
lkalophilus）、バシラス・アミロリクエファシエンス
（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス
（Bacillus brevis）、バシラス・サーキュランス（Bac
illus circulans）、バシラス・コアギュランス（Bacil
lus coagulans）、バシラス・ファーマス（Bacillus fi
rmus）、バシラス・ラウタス（Bacillus lautus）、バ
シラス レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リ
ケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・
メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プ
ミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサー
モフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラ
ス・サブチリス（Bacillus subtilis）、及びバシラス
・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）；又は
ストレプトミセス細胞、たとえばストレプトミセス・リ
ビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミ
セス・ムリナス（Streptomyces murinus）、又はグラム
陰性細菌、たとえばE.コリ、及びプソイドモナス sp.
（Pseudomonas sp.）であるが、但しそれらだけには限
定されない。好ましい態様においては、細菌宿主細胞
は、バシラス・レンタス・バシラス・リケニホルミス、
バシラス・ステアロサーマフィラス又はバシラス・サブ
チリス細胞である。細菌宿主細胞の形質転換は、プロト
プラスト形質転換により（たとえば、Chang and Cohen,
1979,Molecular General Genstics 168:111−115を参照
のこと）、コンピテント細胞を用いることにより（たと
えば、Young and Spizizin,1961,Journal of Bacteriol
ogy 81:823−829、又はDubnau and Davidoff−Abelson,
1971,Journal of Molecular Biology 56:209−221を参
照のこと）、エレクトロポレーションにより（たとえ
ば、Shigekawa and Dower,1988,Biotechnigues 6:742−
751を参照のこと）、又は接合により（たとえば、Koehl
er and Thome,1987,Journal of Bacteriology 169:5771
−5278を参照のこと）、もたらされ得る。
宿主細胞は、真核生物、たとえば哺乳類細胞、昆虫細
胞、植物細胞又は菌類細胞であり得る。有用な哺乳類細
胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa
細胞、子供ハムスター腎臓（BHK）細胞、COS細胞、又は
たとえばAmerican Type Calture Collectionから入手で
きるいづれかの数の他の不滅化された細胞系を包含す
る。
胞、植物細胞又は菌類細胞であり得る。有用な哺乳類細
胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa
細胞、子供ハムスター腎臓（BHK）細胞、COS細胞、又は
たとえばAmerican Type Calture Collectionから入手で
きるいづれかの数の他の不滅化された細胞系を包含す
る。
好ましい態様において、宿主細胞は菌類細胞である。
“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門ア
スコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Basidiom
ycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びザ
イゴミコタ（Zygomycota）（Hawksworthなど.,Ainswort
h and bisby's Dictionary of The Fungi,8th edition,
1995,CAB International,University Press,Cambridge,
UKにより定義されるような）、及びオーミコタ（Oomyco
ta）（Hawksworthなど.,1995、前記、171ページに引用
されるような）、並びにすべてのマイトスポリック菌類
（Hawksworthなど.,1995、前記）を包含する。アスコミ
コタの代表的な群は、たとえばニューロスポラ（Neuros
pora）、エウペニシリウム（Eupenicillium）（＝ペニ
シリウム）、エメリセラ（Emericella）（＝アスペルギ
ラス）、ユーロチウム（Eurotium）（＝アスペルギラ
ス）、及び上記に列挙される真の酵母を包含する。バシ
ジオミコタの例は、マッシルーム、サビ菌及び黒穂病菌
を包含する。キトリジオミコタの代表的な群は、たとえ
ばアロミセス（Allomyces）、ブラストクラジエラ（Bla
stocladiella）、コエロモミセス（Coelomomyces）及び
水性菌類を包含する。オーミコタの代表的な群は、たと
えばサプロレグニオミセトウス（Saprolegniomycetou
s）水性菌類（水性カビ）、たとえばアクリヤ（Achly
a）を包含する。マイトスポリック菌類の例は、アスペ
ルギラス、ペニシリウム、カンジダ及びアルテルナリア
（Alternaria）を包含する。ザイゴミコタの代表的な群
は、たとえばリゾパス（Rhizopus）及びムコル（Muco
r）を包含する。
“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門ア
スコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Basidiom
ycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びザ
イゴミコタ（Zygomycota）（Hawksworthなど.,Ainswort
h and bisby's Dictionary of The Fungi,8th edition,
1995,CAB International,University Press,Cambridge,
UKにより定義されるような）、及びオーミコタ（Oomyco
ta）（Hawksworthなど.,1995、前記、171ページに引用
されるような）、並びにすべてのマイトスポリック菌類
（Hawksworthなど.,1995、前記）を包含する。アスコミ
コタの代表的な群は、たとえばニューロスポラ（Neuros
pora）、エウペニシリウム（Eupenicillium）（＝ペニ
シリウム）、エメリセラ（Emericella）（＝アスペルギ
ラス）、ユーロチウム（Eurotium）（＝アスペルギラ
ス）、及び上記に列挙される真の酵母を包含する。バシ
ジオミコタの例は、マッシルーム、サビ菌及び黒穂病菌
を包含する。キトリジオミコタの代表的な群は、たとえ
ばアロミセス（Allomyces）、ブラストクラジエラ（Bla
stocladiella）、コエロモミセス（Coelomomyces）及び
水性菌類を包含する。オーミコタの代表的な群は、たと
えばサプロレグニオミセトウス（Saprolegniomycetou
s）水性菌類（水性カビ）、たとえばアクリヤ（Achly
a）を包含する。マイトスポリック菌類の例は、アスペ
ルギラス、ペニシリウム、カンジダ及びアルテルナリア
（Alternaria）を包含する。ザイゴミコタの代表的な群
は、たとえばリゾパス（Rhizopus）及びムコル（Muco
r）を包含する。
好ましい態様においては、菌類宿主細胞は、酵母細胞
である。“酵母”とは、本明細書において使用される場
合、子ノウ胞子性酵母（エンドミセタル（Endomycetal
s））、担子胞子性酵母、及び不完全菌類（ブラストミ
セテス（Blastomycetes）に属する酵母を包含する。子
ノウ胞子性酵母は、科スペルモフソラセアエ（Spermoph
thoraceae）及びサッカロミセタセアエ（Saccharomycet
aceae）に分けられる。後者は、４種の亜科、すなわち
シゾサッカロミコイデアエ（Schizosaccharomycoidea
e）（たとえば属シゾサッカロミセス（Schizosaccharom
yces））、ナドソニオイデアエ（Nadsonioideae）、リ
ポミコイデアエ（Lipomycoideae）及びサッカロミコイ
デアエ（Saccharomycoideae）（たとえば属ピチア（Pic
hia）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）及びサッカ
ロミセス）から成る。担子胞子性酵母は、属ロイコスポ
リジム（Leucosporidim）、ロドスポリジウム（Rhodosp
oridium）、スポリジオボラス（sporidibolus）、フィ
ロバシジアム（Filobasidium）及びフィロバシジエラ
（Filobasidiella）を包含する。不完全菌類に属する酵
母は、２種の科、すなわちスポロボロミセタセアエ（Sp
orobolomycetaceae）（たとえば属ソロボロミセス（Sor
obolomyces）及びブレラ（Ballera））及びクリプトコ
カセアエ（Cryptococcaceae）（たとえば属カンジダ）
に分けられる。酵母の分類は未来では変化するので、本
発明のためには、酵母は、Biology and Activities of
Yeast（Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,and Davenport,R.
R.,eds.,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,19
80）に記載されるようにして定義されるであろう。酵母
の生物学及び酵母遺伝学の操作は当業界において良く知
られている（たとえば、Biochemistry and Genetics of
Yeast,Bacil,M.,Horecker,B.J.,and Stopani,A.O.M.,e
ditors,2nd edition,1987;The Yeasts,Rose,A.H.,and H
arrison,J.S.,editors,2nd edition,1987;及びThe Mole
cular Biology of the Yeast Saccharomyces,Strathern
など.,editors,1981を参照のこと）。
である。“酵母”とは、本明細書において使用される場
合、子ノウ胞子性酵母（エンドミセタル（Endomycetal
s））、担子胞子性酵母、及び不完全菌類（ブラストミ
セテス（Blastomycetes）に属する酵母を包含する。子
ノウ胞子性酵母は、科スペルモフソラセアエ（Spermoph
thoraceae）及びサッカロミセタセアエ（Saccharomycet
aceae）に分けられる。後者は、４種の亜科、すなわち
シゾサッカロミコイデアエ（Schizosaccharomycoidea
e）（たとえば属シゾサッカロミセス（Schizosaccharom
yces））、ナドソニオイデアエ（Nadsonioideae）、リ
ポミコイデアエ（Lipomycoideae）及びサッカロミコイ
デアエ（Saccharomycoideae）（たとえば属ピチア（Pic
hia）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）及びサッカ
ロミセス）から成る。担子胞子性酵母は、属ロイコスポ
リジム（Leucosporidim）、ロドスポリジウム（Rhodosp
oridium）、スポリジオボラス（sporidibolus）、フィ
ロバシジアム（Filobasidium）及びフィロバシジエラ
（Filobasidiella）を包含する。不完全菌類に属する酵
母は、２種の科、すなわちスポロボロミセタセアエ（Sp
orobolomycetaceae）（たとえば属ソロボロミセス（Sor
obolomyces）及びブレラ（Ballera））及びクリプトコ
カセアエ（Cryptococcaceae）（たとえば属カンジダ）
に分けられる。酵母の分類は未来では変化するので、本
発明のためには、酵母は、Biology and Activities of
Yeast（Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,and Davenport,R.
R.,eds.,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,19
80）に記載されるようにして定義されるであろう。酵母
の生物学及び酵母遺伝学の操作は当業界において良く知
られている（たとえば、Biochemistry and Genetics of
Yeast,Bacil,M.,Horecker,B.J.,and Stopani,A.O.M.,e
ditors,2nd edition,1987;The Yeasts,Rose,A.H.,and H
arrison,J.S.,editors,2nd edition,1987;及びThe Mole
cular Biology of the Yeast Saccharomyces,Strathern
など.,editors,1981を参照のこと）。
より好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、カン
ジダ、クルイベロミセス、サッカロミセス、シゾサッカ
ロミセス、ピチア又はヤロウィアの種の細胞である。
ジダ、クルイベロミセス、サッカロミセス、シゾサッカ
ロミセス、ピチア又はヤロウィアの種の細胞である。
最とも好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、サ
ッカロミセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces ca
rlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Sacc
haromyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチ
カス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス
・ドウグラスチ（Saccharomyces douglastii）、サッカ
ロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サ
ッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensi
s）又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces
oviformis）細胞である。もう１つの最とも好ましい態
様においては、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラ
クチス（Kluyveromyces lactis）細胞である。もう１つ
の最とも好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、ヤ
ロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞で
ある。
ッカロミセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces ca
rlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Sacc
haromyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチ
カス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス
・ドウグラスチ（Saccharomyces douglastii）、サッカ
ロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サ
ッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensi
s）又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces
oviformis）細胞である。もう１つの最とも好ましい態
様においては、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラ
クチス（Kluyveromyces lactis）細胞である。もう１つ
の最とも好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、ヤ
ロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞で
ある。
好ましい態様において、菌類宿主細胞は糸状菌細胞で
ある。“糸状菌”は、細分割のユーマイコタ（Eumycot
a）及びオーミコタ（Oomycota）のすべての糸状形を包
含する（Hawksworthなど.,1995、前記により定義される
ような）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、
キトサン、マンナン及び他の複雑な多糖類から構成され
る活性菌糸体により特徴づけられる。活性増殖は、菌糸
拡張によるものであり、そして炭素異化作用は偏性好気
性である。対照的に、酵母、たとえばサッカロミセス
セレビシアエによる活性増殖は、単細胞葉状体の発芽に
よってであり、そして炭素異化作用は発酵性であり得
る。より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、
アクレモニウム、アスペルギラス、フサリウム、ヒュミ
コラ、ムコル、ミセリオプソラ、ネウロスポラ、ペニシ
リウム、チエラビア、トリポクラジウム及びトリコダー
マの種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されな
い。
ある。“糸状菌”は、細分割のユーマイコタ（Eumycot
a）及びオーミコタ（Oomycota）のすべての糸状形を包
含する（Hawksworthなど.,1995、前記により定義される
ような）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、
キトサン、マンナン及び他の複雑な多糖類から構成され
る活性菌糸体により特徴づけられる。活性増殖は、菌糸
拡張によるものであり、そして炭素異化作用は偏性好気
性である。対照的に、酵母、たとえばサッカロミセス
セレビシアエによる活性増殖は、単細胞葉状体の発芽に
よってであり、そして炭素異化作用は発酵性であり得
る。より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、
アクレモニウム、アスペルギラス、フサリウム、ヒュミ
コラ、ムコル、ミセリオプソラ、ネウロスポラ、ペニシ
リウム、チエラビア、トリポクラジウム及びトリコダー
マの種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されな
い。
さらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞
は、アスペルギラス細胞である。もう１つのさらにより
好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモ
ニウム細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様
においては、糸状菌宿主細胞はフサリウム細胞である。
もう１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌
宿主細胞はヒュミコラ細胞である。もう１つのさらによ
り好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ムコル
細胞である。もう１つのさらに好ましい態様において
は、糸状菌宿主細胞は、ミセリオプソラ細胞である。も
う１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌宿
主細胞は、ネウロスポラ細胞である。もう１つのさらに
より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はペリシ
リウム細胞である。さらにもう１つの好ましい態様にお
いては、糸状菌宿主細胞は、チエラビア細胞である。も
う１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞
はトリポクラジウム細胞である。もう１つのさらにより
好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、トリコダ
ーマ細胞である。
は、アスペルギラス細胞である。もう１つのさらにより
好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモ
ニウム細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様
においては、糸状菌宿主細胞はフサリウム細胞である。
もう１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌
宿主細胞はヒュミコラ細胞である。もう１つのさらによ
り好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ムコル
細胞である。もう１つのさらに好ましい態様において
は、糸状菌宿主細胞は、ミセリオプソラ細胞である。も
う１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌宿
主細胞は、ネウロスポラ細胞である。もう１つのさらに
より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はペリシ
リウム細胞である。さらにもう１つの好ましい態様にお
いては、糸状菌宿主細胞は、チエラビア細胞である。も
う１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞
はトリポクラジウム細胞である。もう１つのさらにより
好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、トリコダ
ーマ細胞である。
最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、
アスペルギラス アワモリ、アスペルギラス ホエチダ
ス、アスペルギラス ジャポニカス、アスペルギラス
ニジュランス、アスペルギラス ニガー又はアスペルギ
ラス オリザエ細胞である。もう１つの最とも好ましい
態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・セレ
アリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クローク
ウエレンセ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・
グラミネアラム（Fusarium gramicearum）、フサリウム
・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム
・サムブシナム（Fusarium sambucinum）又はフサリウ
ム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）細胞であ
る。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌
宿主細胞は、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola ins
olens）、又はヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanu
ginosa）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様に
おいては、糸状菌宿主細胞はムコリ・ミエヘイ細胞であ
る。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌
宿主細胞は、ミセリオプソラ・サーモフィラム（Myceli
ophthora thermophilum）細胞である。もう１つの最と
も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ネウロ
スポラ・クラサ（Neurospora crassa）細胞である。も
う１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細
胞は、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium pu
rpurogenum）細胞である。もう１つの最とも好ましい態
様においては、糸状菌宿主細胞は、チエラビア・テレス
トリス（Thielavia terrestris）細胞である。もう１つ
の最とも好ましい態様においては、トリコダーマ細胞
は、トリコダーマ・ハルジアナム（Trichoderma harzia
num）、トリコダーマ・コニンギ（Trichoderma koningi
i）、トリコダーマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma
longibrochiatum）、トリコダーマ・レセシ（Trichode
rma reesei）又はトリコダーマ・ビリデ（Trichoderma
viride）細胞である。
アスペルギラス アワモリ、アスペルギラス ホエチダ
ス、アスペルギラス ジャポニカス、アスペルギラス
ニジュランス、アスペルギラス ニガー又はアスペルギ
ラス オリザエ細胞である。もう１つの最とも好ましい
態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・セレ
アリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クローク
ウエレンセ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・
グラミネアラム（Fusarium gramicearum）、フサリウム
・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム
・サムブシナム（Fusarium sambucinum）又はフサリウ
ム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）細胞であ
る。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌
宿主細胞は、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola ins
olens）、又はヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanu
ginosa）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様に
おいては、糸状菌宿主細胞はムコリ・ミエヘイ細胞であ
る。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌
宿主細胞は、ミセリオプソラ・サーモフィラム（Myceli
ophthora thermophilum）細胞である。もう１つの最と
も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ネウロ
スポラ・クラサ（Neurospora crassa）細胞である。も
う１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細
胞は、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium pu
rpurogenum）細胞である。もう１つの最とも好ましい態
様においては、糸状菌宿主細胞は、チエラビア・テレス
トリス（Thielavia terrestris）細胞である。もう１つ
の最とも好ましい態様においては、トリコダーマ細胞
は、トリコダーマ・ハルジアナム（Trichoderma harzia
num）、トリコダーマ・コニンギ（Trichoderma koningi
i）、トリコダーマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma
longibrochiatum）、トリコダーマ・レセシ（Trichode
rma reesei）又はトリコダーマ・ビリデ（Trichoderma
viride）細胞である。
菌類細胞は、それ自体既知の態様でのプロトプラスド
形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を
包含する方法により形質転換され得る。アスペルギラス
細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許
第238023号及びYeltonなど.,1984,Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 81:1470−1474に記
載される。フサリウム種を形質転換するための適切な方
法は、Malardierなど.,1989,Gene 78:147−156又は継続
アメリカ特許出願番号08/269,449（それらは引用により
本明細書に組込まれる）により記載される。酵母は、Be
cker and Guarente,In Abelson,J.N.and Simon,M.I.,ed
itors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biolog
y,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182−187,Aca
demic Press,Inc.,New York,Itoなど.,1983,Journal of
Bacteriology 153:163;及びHinnenなど.,1978,Proceed
ings of the National Academy of Sciences USA 75:19
20により記載される方法を用いて形質転換され得る。哺
乳類細胞は、Graham and Van der Eb（1978,Virology 5
2:546）のリン酸カルシウム沈殿法を用いての直接的な
取り込みにより形質転換され得る。
形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を
包含する方法により形質転換され得る。アスペルギラス
細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許
第238023号及びYeltonなど.,1984,Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 81:1470−1474に記
載される。フサリウム種を形質転換するための適切な方
法は、Malardierなど.,1989,Gene 78:147−156又は継続
アメリカ特許出願番号08/269,449（それらは引用により
本明細書に組込まれる）により記載される。酵母は、Be
cker and Guarente,In Abelson,J.N.and Simon,M.I.,ed
itors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biolog
y,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182−187,Aca
demic Press,Inc.,New York,Itoなど.,1983,Journal of
Bacteriology 153:163;及びHinnenなど.,1978,Proceed
ings of the National Academy of Sciences USA 75:19
20により記載される方法を用いて形質転換され得る。哺
乳類細胞は、Graham and Van der Eb（1978,Virology 5
2:546）のリン酸カルシウム沈殿法を用いての直接的な
取り込みにより形質転換され得る。
生成方法 本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの発現の助けとな
る条件下で宿主細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペ
プチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプ
チドを生成するための方法にも関する。
る条件下で宿主細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペ
プチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプ
チドを生成するための方法にも関する。
それらの方法においては、細胞は、当業界において知
られている方法を用いてポリペプチドの生成のために適
切な栄養培地において培養される。たとえば、細胞は、
適切な培地において及びポリペプチドの発現及び／又は
単離を可能にする条件下で実施される実験室又は産業用
発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模
発酵（連続、バッチ、供給−バッチ又は固形状態発酵を
包含する）により培養され得る。培養は、炭素及び窒素
源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、
当業界において知られている方法を用いて実施される
（たとえば、細胞及び酵母のための文献;Bennett,J.W.a
nd LaSure,L.,editors,More Gene Manipulations in Fu
ngi,Academic Press,CA,1991を参照のこと）。適切な培
地は市販されており、又は公開された組成物（たとえ
ば、American Type Culture Cllectionのカタログにお
ける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地
中に分泌される場合、ポリペプチドはその培地から直接
的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、
それは細胞溶解物から回収される。
られている方法を用いてポリペプチドの生成のために適
切な栄養培地において培養される。たとえば、細胞は、
適切な培地において及びポリペプチドの発現及び／又は
単離を可能にする条件下で実施される実験室又は産業用
発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模
発酵（連続、バッチ、供給−バッチ又は固形状態発酵を
包含する）により培養され得る。培養は、炭素及び窒素
源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、
当業界において知られている方法を用いて実施される
（たとえば、細胞及び酵母のための文献;Bennett,J.W.a
nd LaSure,L.,editors,More Gene Manipulations in Fu
ngi,Academic Press,CA,1991を参照のこと）。適切な培
地は市販されており、又は公開された組成物（たとえ
ば、American Type Culture Cllectionのカタログにお
ける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地
中に分泌される場合、ポリペプチドはその培地から直接
的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、
それは細胞溶解物から回収される。
ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的で
ある、当業界において知られている方法を用いて検出さ
れ得る。それらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素
生成物の形成、又は酵素基質の消出を包含することがで
きる。たとえば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性
を決定するために使用され得る。リパーゼ活性の生成
は、当業界において知られているいづれかの方法により
決定され得る。１つの方法においては、１リパーゼ単位
（LU）は、基質としてトリブチリン及び乳化剤としてア
ラビアゴムを用いて、30℃、pH7.0（リン酸緩衝液）で
１分当たり1.0μモルの滴定できる脂肪酸を生成する酵
素の量である。pH7〜10の範囲での遊離Ca2+の非存在下
での脂肪分解酵素活性は、特定されたpHで、オリーブ
油:2％PVA溶液（1:3）の基質エマルジョンにより40℃で
10分間試験される。反応の最後で、反応混合物は、クロ
ロホルム：メタノール（1:1）により酸性条件下で抽出
され、そしてその反応の間に開放される脂肪酸はTLC−F
ID反応（Iatroscan）により測定される。1OPID単位（OP
IDU）は、１分当たり1.0μモルの脂肪酸の開放として取
られる。個々の試験においては、10mMのEDTAが、200mM
の緩衝液（pH7及び８でのトリス−HCl緩衝液、pH8,9及
び10でのジエタノールアミン緩衝液）と共に使用され
る。
ある、当業界において知られている方法を用いて検出さ
れ得る。それらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素
生成物の形成、又は酵素基質の消出を包含することがで
きる。たとえば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性
を決定するために使用され得る。リパーゼ活性の生成
は、当業界において知られているいづれかの方法により
決定され得る。１つの方法においては、１リパーゼ単位
（LU）は、基質としてトリブチリン及び乳化剤としてア
ラビアゴムを用いて、30℃、pH7.0（リン酸緩衝液）で
１分当たり1.0μモルの滴定できる脂肪酸を生成する酵
素の量である。pH7〜10の範囲での遊離Ca2+の非存在下
での脂肪分解酵素活性は、特定されたpHで、オリーブ
油:2％PVA溶液（1:3）の基質エマルジョンにより40℃で
10分間試験される。反応の最後で、反応混合物は、クロ
ロホルム：メタノール（1:1）により酸性条件下で抽出
され、そしてその反応の間に開放される脂肪酸はTLC−F
ID反応（Iatroscan）により測定される。1OPID単位（OP
IDU）は、１分当たり1.0μモルの脂肪酸の開放として取
られる。個々の試験においては、10mMのEDTAが、200mM
の緩衝液（pH7及び８でのトリス−HCl緩衝液、pH8,9及
び10でのジエタノールアミン緩衝液）と共に使用され
る。
得られるポリペプチドは、当業界において知られてい
る方法により回収され得る。たとえば、ポリペプチド
は、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴霧
−乾燥、蒸発又は沈殿（但しこれらだけには限定されな
い）法により栄養培地から回収され得る。次に、回収さ
れたポリペプチドはさらに、種々のクロマトグラフィー
方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、又は同様のものにより精製され得る。
る方法により回収され得る。たとえば、ポリペプチド
は、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴霧
−乾燥、蒸発又は沈殿（但しこれらだけには限定されな
い）法により栄養培地から回収され得る。次に、回収さ
れたポリペプチドはさらに、種々のクロマトグラフィー
方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、又は同様のものにより精製され得る。
本発明のポリペプチドは、当業界において知られてい
る種々の方法、たとえばクロマトグラフィー（たとえ
ば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシ
ング及びサイズ排除）、電気泳動方法（たとえば、分離
用等電点電気泳動（IEF））、示差溶解性（たとえば硫
酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（たとえば、Protein
Puritication,J.−C.Janson and Lars Ryden,editors,V
CH Publishers,New York,1989を参照のこと）（但し、
それらだけには限定されない）により精製され得る。
る種々の方法、たとえばクロマトグラフィー（たとえ
ば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシ
ング及びサイズ排除）、電気泳動方法（たとえば、分離
用等電点電気泳動（IEF））、示差溶解性（たとえば硫
酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（たとえば、Protein
Puritication,J.−C.Janson and Lars Ryden,editors,V
CH Publishers,New York,1989を参照のこと）（但し、
それらだけには限定されない）により精製され得る。
用途 本発明の核酸配列によりコードされる組換えポリペプ
チドは、特に高いpHで、脂肪分解酵素の従来の用途、た
とえば洗濯及び皿洗い用洗剤、研究及び産業用清浄及び
革の加工に使用され得る。
チドは、特に高いpHで、脂肪分解酵素の従来の用途、た
とえば洗濯及び皿洗い用洗剤、研究及び産業用清浄及び
革の加工に使用され得る。
本発明の脂肪分解酵素はまた、エステル交換、脂肪及
び油の完全な加水分解、及び光学異性体分解工程のため
にも使用され得る。
び油の完全な加水分解、及び光学異性体分解工程のため
にも使用され得る。
本発明は、次の例によりさらに記載されるが、但しそ
れらは本発明を限定するものではない。
れらは本発明を限定するものではない。
例 例1:ゲノムDNA抽出 アブシジア・グリセオラNN000987（ATCC 20430）、ア
ブシジア・スポロホラ−バリアビリスNN102427（ATCC 3
6019）、アブシジア・グリセオラvar.イグチNN000591
（ATCC 20431）、アブシジア・コリムビフェラNN100062
（IFO 8084）及びアブシジア・ブラケスレアナNN100826
（NRRL 1304）を、32℃及び250rpmで24時間、0.5％酵母
抽出物−２％グリコース（YEG）培地25mlにおいて個々
に増殖させた。次に、個々の培養物からの菌糸体を、Mi
racloth（Calbiochem,La Jolla,CA）を通しての濾過に
より集め、そして10mMのトリス−0.1MのEDTA（TE）緩衝
液25mlにより１度洗浄した。過剰の緩衝液を、菌糸体調
製物から排水し、続いて液体窒素により凍結した。凍結
された菌糸体調製物を電気コーヒーグラインダーにより
細かな粉末に粉砕し、そしてその粉末を、TE緩衝液20ml
及び20％w/vドデシル硫酸ナトリウム（SDS）5mlを含む
使い捨てプラスチック遠心分離管に個々に添加した。そ
の混合物を数回、軽く逆さにし、混合を確保し、そして
等体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコ
ール（25:24:1 v/v/v）により２度抽出した。酢酸ナト
リウム（3M溶液）を抽出されたサンプルに添加し、0.3M
の最終濃度にし、続いて2.5体積の氷冷却エタノールを
添加し、DNAを沈殿せしめた。管を15,000×ｇで30分
間、遠心分離し、DNAをペレット化した。DNAペレットを
30分間、空気乾燥せしめ、その後、0.5mlのTE緩衝液に
再懸濁した。DNアーゼフリーのリボヌクレアーゼＡを、
前記再懸濁されたDNAペレットに添加し、100μg/mlの濃
度にし、そしてその混合物を37℃で30分間インキュベー
トした。プロティナーゼＫ（200μg/ml）を添加し、そ
して個々の管をさらに１時間37℃でインキュベートし
た。最終的に、個々のサンプルをフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（25:24:1 v/v/v）により
２度抽出し、その後、酢酸ナトリウム及びエタノールに
よりDNAを沈殿せしめた。DNAペレットを真空下で乾燥せ
しめ、TE緩衝液に再懸濁し、そして４℃で貯蔵した。
ブシジア・スポロホラ−バリアビリスNN102427（ATCC 3
6019）、アブシジア・グリセオラvar.イグチNN000591
（ATCC 20431）、アブシジア・コリムビフェラNN100062
（IFO 8084）及びアブシジア・ブラケスレアナNN100826
（NRRL 1304）を、32℃及び250rpmで24時間、0.5％酵母
抽出物−２％グリコース（YEG）培地25mlにおいて個々
に増殖させた。次に、個々の培養物からの菌糸体を、Mi
racloth（Calbiochem,La Jolla,CA）を通しての濾過に
より集め、そして10mMのトリス−0.1MのEDTA（TE）緩衝
液25mlにより１度洗浄した。過剰の緩衝液を、菌糸体調
製物から排水し、続いて液体窒素により凍結した。凍結
された菌糸体調製物を電気コーヒーグラインダーにより
細かな粉末に粉砕し、そしてその粉末を、TE緩衝液20ml
及び20％w/vドデシル硫酸ナトリウム（SDS）5mlを含む
使い捨てプラスチック遠心分離管に個々に添加した。そ
の混合物を数回、軽く逆さにし、混合を確保し、そして
等体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコ
ール（25:24:1 v/v/v）により２度抽出した。酢酸ナト
リウム（3M溶液）を抽出されたサンプルに添加し、0.3M
の最終濃度にし、続いて2.5体積の氷冷却エタノールを
添加し、DNAを沈殿せしめた。管を15,000×ｇで30分
間、遠心分離し、DNAをペレット化した。DNAペレットを
30分間、空気乾燥せしめ、その後、0.5mlのTE緩衝液に
再懸濁した。DNアーゼフリーのリボヌクレアーゼＡを、
前記再懸濁されたDNAペレットに添加し、100μg/mlの濃
度にし、そしてその混合物を37℃で30分間インキュベー
トした。プロティナーゼＫ（200μg/ml）を添加し、そ
して個々の管をさらに１時間37℃でインキュベートし
た。最終的に、個々のサンプルをフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（25:24:1 v/v/v）により
２度抽出し、その後、酢酸ナトリウム及びエタノールに
よりDNAを沈殿せしめた。DNAペレットを真空下で乾燥せ
しめ、TE緩衝液に再懸濁し、そして４℃で貯蔵した。
例2:アブシジア・グリセオラNN000987及びアブシジア・
グリセオラvar.イグチNN000591リパーゼ遺伝子セグメン
トのPCR増幅 デンマーク特許出願95/00424（この内容は引例により
本明細書に組込まれる）においてGormsenなどにより開
示されるようにアブシジア・グリセオラNN000987リパー
ゼ及びアブシジア・グリセオラvar.イグチNN000591リパ
ーゼのアミノ酸配列に基づいて、下記に示されるオリゴ
ヌクレオチドプライマーを、アブシジア・グリセオラNN
000987及びアブシジア・グリセオラvar.イグチNN000591
からリパーゼ遺伝子フラグメントをPCR増幅するため
に、製造業者の説明書に従って、Applied Biosystems M
odel 394 DNA/RNA Synthesizerにより合成した（注:R＝
Ａ又はＧ、Ｉ−イノシン、Ｙ＝Ｔ又はＣ、Ｈ＝Ａ又はＴ
又はＣ、及びＮ＝Ａ又はＴ又はＣ又はＧ）： 1.前方向プライマー アミノ酸配列:GluThrGluIleGlnAlaHisThrPhe（配列番
号11） オリゴヌクレオチド（＋鎖）:5′−GARACIGARATHCARG
CICAYACITT−３′（配列番号12） 2.逆方向プライマー アミノ酸配列:ProProGlyAlaPheGlyPheLeu（配列番号1
3） オリゴヌクレオチド（−鎖）:5′−ARRAANCCRAAIGCNC
CIGGNGG−３′（配列番号14） 増幅反応物（100ml）を、約１μｇのアブシジア・グ
リセオラNN000987又はアブシジア・グリセオラvar.イグ
チNN000591ゲノムDNAを鋳型として用いて調製した。個
々の反応物は次の成分を含んだ:1μｇのゲノムDNA、40p
モルの前方向プライマー、40pモルの逆方向プライマ
ー、200mMの個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP、１×Taqポ
リメラーゼ緩衝液（Perkin−Elmer Corp.,Branchburg,N
J）、及び５単位のTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer Co
rp.,Branchburg,NJ）。無菌の鉱油（100μｌ）を個々の
反応混合物の上部に積層し、そしてその反応物を次のよ
うにプログラムされたPerkin−Elmer Model 480 Therma
l Cyclerにおいてインキュベートした：サイクル１＝95
℃で５分間、45℃で２分間、及び67℃で５分間；サイク
ル2:30〜95℃で２分間、45℃で２分間、及び67℃で２分
間、及び４℃でのソークサイクル。反応生成物を１％低
融点アガロースゲル（Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O）上で単離し、そして個々の反応からの主要PCR生成物
バンドを、製造業者の説明書に従って、β−アガラーゼ
（New England Biolabs,Beverly,MA）を用いてゲルから
切り出し、そして精製した。精製されたPCR生成物を続
いて、pCR IIベクタ（Invitrogen,San Diego,CA）中に
クローン化し、そしてDNA配列をlac前方向及び逆方向プ
ライマー（New England BioLabs,Beverly,MA）を用いて
決定した。
グリセオラvar.イグチNN000591リパーゼ遺伝子セグメン
トのPCR増幅 デンマーク特許出願95/00424（この内容は引例により
本明細書に組込まれる）においてGormsenなどにより開
示されるようにアブシジア・グリセオラNN000987リパー
ゼ及びアブシジア・グリセオラvar.イグチNN000591リパ
ーゼのアミノ酸配列に基づいて、下記に示されるオリゴ
ヌクレオチドプライマーを、アブシジア・グリセオラNN
000987及びアブシジア・グリセオラvar.イグチNN000591
からリパーゼ遺伝子フラグメントをPCR増幅するため
に、製造業者の説明書に従って、Applied Biosystems M
odel 394 DNA/RNA Synthesizerにより合成した（注:R＝
Ａ又はＧ、Ｉ−イノシン、Ｙ＝Ｔ又はＣ、Ｈ＝Ａ又はＴ
又はＣ、及びＮ＝Ａ又はＴ又はＣ又はＧ）： 1.前方向プライマー アミノ酸配列:GluThrGluIleGlnAlaHisThrPhe（配列番
号11） オリゴヌクレオチド（＋鎖）:5′−GARACIGARATHCARG
CICAYACITT−３′（配列番号12） 2.逆方向プライマー アミノ酸配列:ProProGlyAlaPheGlyPheLeu（配列番号1
3） オリゴヌクレオチド（−鎖）:5′−ARRAANCCRAAIGCNC
CIGGNGG−３′（配列番号14） 増幅反応物（100ml）を、約１μｇのアブシジア・グ
リセオラNN000987又はアブシジア・グリセオラvar.イグ
チNN000591ゲノムDNAを鋳型として用いて調製した。個
々の反応物は次の成分を含んだ:1μｇのゲノムDNA、40p
モルの前方向プライマー、40pモルの逆方向プライマ
ー、200mMの個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP、１×Taqポ
リメラーゼ緩衝液（Perkin−Elmer Corp.,Branchburg,N
J）、及び５単位のTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer Co
rp.,Branchburg,NJ）。無菌の鉱油（100μｌ）を個々の
反応混合物の上部に積層し、そしてその反応物を次のよ
うにプログラムされたPerkin−Elmer Model 480 Therma
l Cyclerにおいてインキュベートした：サイクル１＝95
℃で５分間、45℃で２分間、及び67℃で５分間；サイク
ル2:30〜95℃で２分間、45℃で２分間、及び67℃で２分
間、及び４℃でのソークサイクル。反応生成物を１％低
融点アガロースゲル（Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O）上で単離し、そして個々の反応からの主要PCR生成物
バンドを、製造業者の説明書に従って、β−アガラーゼ
（New England Biolabs,Beverly,MA）を用いてゲルから
切り出し、そして精製した。精製されたPCR生成物を続
いて、pCR IIベクタ（Invitrogen,San Diego,CA）中に
クローン化し、そしてDNA配列をlac前方向及び逆方向プ
ライマー（New England BioLabs,Beverly,MA）を用いて
決定した。
約870bpのリガーゼ遺伝子セグメントを、図１に示さ
れるように、上記リパーゼ特異的PRCプライマーにより
アブシジア グリセオラNN000987及びアブシジア グリ
セオラvar.イグチNN000591から増幅した。DNA配列分析
は、増幅された遺伝子セグメントがその対応するアブシ
ジア リパーゼ遺伝子の一部をコードすることを示し
た。さらに、DNA配列データは、それらの２つの遺伝子
生成物がたぶん同一であり、そしてリゾムコル ミエヘ
イ リパーゼと相同性の領域を共有することを確かめ
た。
れるように、上記リパーゼ特異的PRCプライマーにより
アブシジア グリセオラNN000987及びアブシジア グリ
セオラvar.イグチNN000591から増幅した。DNA配列分析
は、増幅された遺伝子セグメントがその対応するアブシ
ジア リパーゼ遺伝子の一部をコードすることを示し
た。さらに、DNA配列データは、それらの２つの遺伝子
生成物がたぶん同一であり、そしてリゾムコル ミエヘ
イ リパーゼと相同性の領域を共有することを確かめ
た。
例3:ゲノムDNAのハイブリダイゼーション分析 例１に記載される５種のアンブシジア株から調製され
た全細胞DNAサンプルを、サザンハイブリダイゼーショ
ン（Maniatisなど.,1982,Molecular Cloning,A Laborat
ory Manual,Cold Spirng Harbor Press,Cold Spring Ha
rbor New York）により分析した。約２〜５μｇの個々
のDNAサンプルを、EcoR I,Asp718I又はEcoR I＋Asp718I
により消化し、そして１％アガロースゲル上で分別し
た。ゲルを短い波長のUV光下で写真を取り、そして0.5M
のNaOH−1.5MのNaCl、続いて1.5MのNaCl−1Mのトリス−
HCl pH8において15分間ソークした。ゲルにおけるDNA
を、Davisなど（1980,Advanced Bacterial Genetics,A
Manual for Genetic Engineering,Cold Spirng Harbor
Press,Cold Spring Harbor,New York）に従って、20×S
SPE（3Mの塩化ナトリウム−0.2Mの二塩基性リン酸ナト
リウム−0.02Mの二ナトリウムEDTA）における細管ブロ
ットによりNytranQハイブリダイゼーション膜（Schleic
her ＆ Schuell,Keene,NH）上にトランスファーした。D
NAを、UV Stratalinker（Stratagene,La Jolla,CA）を
用いて膜上に架橋し、そして膜を、軽く撹拌しながら、
45℃で次のハイブリダイゼーション緩衝液において２時
間ソークした:5×SSPE、35％ホルムアミド（v/v）、0.3
％SDS、及び200mg/mlの変性され、そして剪断されたサ
ケ精子DNA。例２に記載されるアブシジア グリセオラN
N000987 PCR−クローンから単離されたリパーゼ特異的
プローブフラグメントを、〔32P〕dCTP（Amersham,Arli
gton Heights,IL）によるニックトランスレーションに
より放射性ラベルし（Maniatisなど.,1982、前記）、0.
1Mの最終濃度にNaOHを添加することによって変性し、そ
して緩衝液1ml当たり約１×106個のcpmの活性でハイブ
リダイゼーション緩衝液に添加した。混合物を、振盪水
溶において45℃で一晩インキュベートした。インキュベ
ーションに続いて、膜を0.1％のSDSを含む0.2×SSPEに
より45℃で１度洗浄し、続いて、0.2×SSPE（SDSを含ま
ない）により同じ温度で２度洗浄した。膜を、紙タオル
上で15分間、乾燥せしめ、次にSaran−WrapTMで包装
し、そして−70℃で一晩、Ｘ線フィルムに増強スクリー
ン（Kodak,Rochester,NY）を伴って照射した。
た全細胞DNAサンプルを、サザンハイブリダイゼーショ
ン（Maniatisなど.,1982,Molecular Cloning,A Laborat
ory Manual,Cold Spirng Harbor Press,Cold Spring Ha
rbor New York）により分析した。約２〜５μｇの個々
のDNAサンプルを、EcoR I,Asp718I又はEcoR I＋Asp718I
により消化し、そして１％アガロースゲル上で分別し
た。ゲルを短い波長のUV光下で写真を取り、そして0.5M
のNaOH−1.5MのNaCl、続いて1.5MのNaCl−1Mのトリス−
HCl pH8において15分間ソークした。ゲルにおけるDNA
を、Davisなど（1980,Advanced Bacterial Genetics,A
Manual for Genetic Engineering,Cold Spirng Harbor
Press,Cold Spring Harbor,New York）に従って、20×S
SPE（3Mの塩化ナトリウム−0.2Mの二塩基性リン酸ナト
リウム−0.02Mの二ナトリウムEDTA）における細管ブロ
ットによりNytranQハイブリダイゼーション膜（Schleic
her ＆ Schuell,Keene,NH）上にトランスファーした。D
NAを、UV Stratalinker（Stratagene,La Jolla,CA）を
用いて膜上に架橋し、そして膜を、軽く撹拌しながら、
45℃で次のハイブリダイゼーション緩衝液において２時
間ソークした:5×SSPE、35％ホルムアミド（v/v）、0.3
％SDS、及び200mg/mlの変性され、そして剪断されたサ
ケ精子DNA。例２に記載されるアブシジア グリセオラN
N000987 PCR−クローンから単離されたリパーゼ特異的
プローブフラグメントを、〔32P〕dCTP（Amersham,Arli
gton Heights,IL）によるニックトランスレーションに
より放射性ラベルし（Maniatisなど.,1982、前記）、0.
1Mの最終濃度にNaOHを添加することによって変性し、そ
して緩衝液1ml当たり約１×106個のcpmの活性でハイブ
リダイゼーション緩衝液に添加した。混合物を、振盪水
溶において45℃で一晩インキュベートした。インキュベ
ーションに続いて、膜を0.1％のSDSを含む0.2×SSPEに
より45℃で１度洗浄し、続いて、0.2×SSPE（SDSを含ま
ない）により同じ温度で２度洗浄した。膜を、紙タオル
上で15分間、乾燥せしめ、次にSaran−WrapTMで包装
し、そして−70℃で一晩、Ｘ線フィルムに増強スクリー
ン（Kodak,Rochester,NY）を伴って照射した。
アブシジア・グリセオラvar.イグチNN000591からのPC
R−由来のリパーゼ遺伝子セグメントプローブを用いて
の中位の緊縮性の条件下でのサザンブロットによるアブ
シジア種の個々からの全細胞DNAサンプルの分析は、試
験されたすべてのアブシジア種のリパーゼ遺伝子がプロ
ーブに交差ハイブリダイズしたことを示した（図２）。
試験されたすべての種はまた、約2.1kbのEcoR I消化物
における単一のハイブリダイゼーションシグナルを示
し、但し、4kbのバンドを有するハイブリダイゼーショ
ンシグナルを付与したアブシジア スポロホラ−バリア
ビリスNN102427を除く。さらに、試験されたすべての種
はそれらのゲノムにその対応するリパーゼ遺伝子の単一
コピーを含むと思われる。
R−由来のリパーゼ遺伝子セグメントプローブを用いて
の中位の緊縮性の条件下でのサザンブロットによるアブ
シジア種の個々からの全細胞DNAサンプルの分析は、試
験されたすべてのアブシジア種のリパーゼ遺伝子がプロ
ーブに交差ハイブリダイズしたことを示した（図２）。
試験されたすべての種はまた、約2.1kbのEcoR I消化物
における単一のハイブリダイゼーションシグナルを示
し、但し、4kbのバンドを有するハイブリダイゼーショ
ンシグナルを付与したアブシジア スポロホラ−バリア
ビリスNN102427を除く。さらに、試験されたすべての種
はそれらのゲノムにその対応するリパーゼ遺伝子の単一
コピーを含むと思われる。
例4:リパーゼクローンのDNAライブラリー及び同定 富化されたゲノムDNAライブラリーを、バクテリオフ
ァージ クローニングベクターIZipLox（Life Technolo
gies,Gaithersburg,MD）において構成した。最初に、全
細胞DNAをEcoR Iにより消化し、そして１％アガロース
ゲル上でサイズ分別した。例３に記載されるサザンブロ
ット上に、以前観察されたハイブリダイゼーションシグ
ナルに対応するサイズ範囲で移動するDNAフラグメント
を切り出し、そしてPrep−ａ−Gene試薬（BioRad Labor
atorise,Hercules,CA）を用いてゲルから溶離した。そ
れらの画分におけるDNAフラグメントのおおよそのサイ
ズは次の通りであった:1.9〜2.5kb（アブシジア・グリ
セオラvar.イグチNN000591）、1.9〜2.5kb（アスシジア
・ブラケスレアナNN100826）、1.9〜2.5kb（アブシジア
・コリムビフェラNN100062）及び2.5〜4.3kb（アブシジ
ア・スポロホラ−バリアビリスNN102427）。溶離された
DNAフラグメントをEcoR I−切断され、そして脱リン酸
酸化されたλZipLoxベクターアーム（Life Technologie
s,Gaithersburg,MD）により連結し、そしてその連結混
合物を市販のパッケージング抽出物（Stratagene,La Jo
lla,CA）を用いてパッケージした。そのパッケージされ
たDNAライブラリーをプレートし、そしてE.コリY1090ZL
細胞（Life Technologies,Gaithersburg,MD）において
増幅した。個々のライブラリーにおける組換えファージ
の力価は、1.3×5.4×105pfu/mlの範囲であった（DNAを
含まないバックグラウンド力価は1.7〜2.0×104pfu/ml
であった）。個々の増幅されていないライブラリーから
の約15,000〜30,000のプラークを、プローブとしてアブ
シジア グリセオラNN000987からのリパーゼ特異的PCR
フラグメントを用いてプラーク−ハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーンした（Davisなど.,1980、前記）。
プローブとの強いハイブリダイゼーションシグナルを付
与するプラークを、E.コリY1090DL細胞において２度精
製し、そして続いて、リパーゼ遺伝子をpZL1−誘導体
（D'Alessioなど.,1992,Focus 14:76）としてλZipLox
ベクターから切り出した。組換えDNAセグメントを前記
ベクターのファージミドpZL1部分内に挿入し、そしてそ
のクローン化された挿入体を有するファージミドを、E.
コリDH10Bzip細胞（Life Technologies,Gaithersburg,M
D）の感染によるインビボ切断を用いて自律的に複製す
るpZL1において回収した。この態様で単離されたリパー
ゼクローンを、Wizard 373 DNA精製キット（Promega,Ma
dison,WI）を用いて、DNA配列決定分析のために調製し
た。
ァージ クローニングベクターIZipLox（Life Technolo
gies,Gaithersburg,MD）において構成した。最初に、全
細胞DNAをEcoR Iにより消化し、そして１％アガロース
ゲル上でサイズ分別した。例３に記載されるサザンブロ
ット上に、以前観察されたハイブリダイゼーションシグ
ナルに対応するサイズ範囲で移動するDNAフラグメント
を切り出し、そしてPrep−ａ−Gene試薬（BioRad Labor
atorise,Hercules,CA）を用いてゲルから溶離した。そ
れらの画分におけるDNAフラグメントのおおよそのサイ
ズは次の通りであった:1.9〜2.5kb（アブシジア・グリ
セオラvar.イグチNN000591）、1.9〜2.5kb（アスシジア
・ブラケスレアナNN100826）、1.9〜2.5kb（アブシジア
・コリムビフェラNN100062）及び2.5〜4.3kb（アブシジ
ア・スポロホラ−バリアビリスNN102427）。溶離された
DNAフラグメントをEcoR I−切断され、そして脱リン酸
酸化されたλZipLoxベクターアーム（Life Technologie
s,Gaithersburg,MD）により連結し、そしてその連結混
合物を市販のパッケージング抽出物（Stratagene,La Jo
lla,CA）を用いてパッケージした。そのパッケージされ
たDNAライブラリーをプレートし、そしてE.コリY1090ZL
細胞（Life Technologies,Gaithersburg,MD）において
増幅した。個々のライブラリーにおける組換えファージ
の力価は、1.3×5.4×105pfu/mlの範囲であった（DNAを
含まないバックグラウンド力価は1.7〜2.0×104pfu/ml
であった）。個々の増幅されていないライブラリーから
の約15,000〜30,000のプラークを、プローブとしてアブ
シジア グリセオラNN000987からのリパーゼ特異的PCR
フラグメントを用いてプラーク−ハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーンした（Davisなど.,1980、前記）。
プローブとの強いハイブリダイゼーションシグナルを付
与するプラークを、E.コリY1090DL細胞において２度精
製し、そして続いて、リパーゼ遺伝子をpZL1−誘導体
（D'Alessioなど.,1992,Focus 14:76）としてλZipLox
ベクターから切り出した。組換えDNAセグメントを前記
ベクターのファージミドpZL1部分内に挿入し、そしてそ
のクローン化された挿入体を有するファージミドを、E.
コリDH10Bzip細胞（Life Technologies,Gaithersburg,M
D）の感染によるインビボ切断を用いて自律的に複製す
るpZL1において回収した。この態様で単離されたリパー
ゼクローンを、Wizard 373 DNA精製キット（Promega,Ma
dison,WI）を用いて、DNA配列決定分析のために調製し
た。
例5:リパーゼ遺伝子のDNA配列分析 例４に記載されるリパーゼクローンのDNA配列決定
を、色素−ターミネーター化学（Gieseckeなど.,1992,J
ournal of Virol.Methods 38:47−60）と共にプライマ
ーウォーキング技法（Primer walking technique）を用
いて、両鎖に対してApplied Biosystems Model 373A Au
tomated DNA Sequencer（Applied Biosystems,Inc.,Fos
ter City,CA）により実施した。オリゴヌクレオチド配
列決定プライマーを、製造業者の説明書に従って、Appl
ied Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer上で合
成した。
を、色素−ターミネーター化学（Gieseckeなど.,1992,J
ournal of Virol.Methods 38:47−60）と共にプライマ
ーウォーキング技法（Primer walking technique）を用
いて、両鎖に対してApplied Biosystems Model 373A Au
tomated DNA Sequencer（Applied Biosystems,Inc.,Fos
ter City,CA）により実施した。オリゴヌクレオチド配
列決定プライマーを、製造業者の説明書に従って、Appl
ied Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer上で合
成した。
アブシジア リパーゼをコードする遺伝子のヌクレオ
チド配列は、図３〜６に示される（配列番号1,3,5及び
７）。個々の遺伝子内のイントロンの割り当ては、
（ａ）ペプチドフラグメントに由来する既知のアミノ酸
配列（Boelなど.,1988,Lipids 23:701−706）、（ｂ）
リゾムコル・ミエヘイ リパーゼの推定されるアミノ酸
配列（配列番号15）との整合性（Gurrなど.,Kinghorn,
J.R.〔ed〕,Gene Structure in Eukaryotic Microbes,p
p.93−139,IRL Press,Oxford）、及び（ｃ）糸状菌のイ
ントロンについての既知のコンセンサス配列（von Heij
ne,1984,Journal of Molecular Biology 173:243−25
1）に基づいた。
チド配列は、図３〜６に示される（配列番号1,3,5及び
７）。個々の遺伝子内のイントロンの割り当ては、
（ａ）ペプチドフラグメントに由来する既知のアミノ酸
配列（Boelなど.,1988,Lipids 23:701−706）、（ｂ）
リゾムコル・ミエヘイ リパーゼの推定されるアミノ酸
配列（配列番号15）との整合性（Gurrなど.,Kinghorn,
J.R.〔ed〕,Gene Structure in Eukaryotic Microbes,p
p.93−139,IRL Press,Oxford）、及び（ｃ）糸状菌のイ
ントロンについての既知のコンセンサス配列（von Heij
ne,1984,Journal of Molecular Biology 173:243−25
1）に基づいた。
アブシジア・レフレキサ リパーゼをコードする遺伝
子を単離するために、アブシジア・レフレキサNN102427
（ATCC 44896）の株を、誘発成分としてホホバ油を含む
最適培地上で培養した。cDNAライブラリーをこの株から
調製し、そしてプローブとして上記アブシジア・コリム
ビフェラ遺伝子を用いて、cDNAクローンをコロニーハイ
ブリダイゼーションにより同定した。アブシジア・レフ
レキサ遺伝子の配列は図７（配列番号９）に供給されて
いる。このリパーゼは、アブシジア・スポロホラ−バリ
アビリス リパーゼと約99％の同一性を有する。
子を単離するために、アブシジア・レフレキサNN102427
（ATCC 44896）の株を、誘発成分としてホホバ油を含む
最適培地上で培養した。cDNAライブラリーをこの株から
調製し、そしてプローブとして上記アブシジア・コリム
ビフェラ遺伝子を用いて、cDNAクローンをコロニーハイ
ブリダイゼーションにより同定した。アブシジア・レフ
レキサ遺伝子の配列は図７（配列番号９）に供給されて
いる。このリパーゼは、アブシジア・スポロホラ−バリ
アビリス リパーゼと約99％の同一性を有する。
例6:アブシジア種からのリパーゼ遺伝子の比較 アブシジア・リパーゼ遺伝子間のイントロ−エキソン
構成は、表１に示されるように、すべてが７個のエキソ
ン及び６個のイントロンからすべて構成されることにお
いてひじょうに類似する。エキソン２〜６のサイズは、
厳密に保存される。最初のエキソンは、酵素のシグナル
ペプチド及びプロペプチド部分をコードする領域におけ
るいくらかの変動性のためにサイズのわずかな変化性を
示す。さらに、対応するエキソン間のヌクレオチド配列
相同性はまた、ひじょうに高く、そして85〜97％の同一
性を有する。対照的に、イントロンの長さは多様であ
り、そしてアブシジア・コリムビフェラNN100062及びア
ブシジア・スポロホラ−バリアビリスNN102427リパーゼ
遺伝子を除いて、対応するイントロン間での配列相同性
はほとんど存在しない。リパーゼ遺伝子の５′及び３′
側フランキング配列はまた、配列逸脱（divergence）を
示す。
構成は、表１に示されるように、すべてが７個のエキソ
ン及び６個のイントロンからすべて構成されることにお
いてひじょうに類似する。エキソン２〜６のサイズは、
厳密に保存される。最初のエキソンは、酵素のシグナル
ペプチド及びプロペプチド部分をコードする領域におけ
るいくらかの変動性のためにサイズのわずかな変化性を
示す。さらに、対応するエキソン間のヌクレオチド配列
相同性はまた、ひじょうに高く、そして85〜97％の同一
性を有する。対照的に、イントロンの長さは多様であ
り、そしてアブシジア・コリムビフェラNN100062及びア
ブシジア・スポロホラ−バリアビリスNN102427リパーゼ
遺伝子を除いて、対応するイントロン間での配列相同性
はほとんど存在しない。リパーゼ遺伝子の５′及び３′
側フランキング配列はまた、配列逸脱（divergence）を
示す。
推定されるアミノ酸配列（配列番号2,4,6,8及び10）
に基づいて、アブシジア リパーゼの生化学及び生物物
理学的性質の比較が、表２に示される。すべての４種の
リパーゼは、すべてが、17〜21個のアミノ酸のシグナル
ペプチド、52〜56個のアミノ酸のプロペプチド及び264
〜265個のアミノ酸の成熟酵素を含んで成り、そして、
グリコシル化されていないタンパク質について約29,000
の分子量を有する、337〜338個のアミノ酸のプレプロ酵
素として合成されることにおいて非常に類似する。計算
された等電点は6.10〜6.94であり、そして最ともアルカ
リ性は、アブシジア・スポロホラ−バリアビリスからの
リパーゼである。それらの計算された等電点は、たぶ
ん、すべての荷電された残基がタンパク質の暴露された
３次元表面上に存在するとはかぎらない結果として、IE
Fゲル（Gormsenなど.,デンマークの特許出願第95/00424
号を参照のこと）上に実験的に観察されるそれらの等電
値よりもかなり低い。
に基づいて、アブシジア リパーゼの生化学及び生物物
理学的性質の比較が、表２に示される。すべての４種の
リパーゼは、すべてが、17〜21個のアミノ酸のシグナル
ペプチド、52〜56個のアミノ酸のプロペプチド及び264
〜265個のアミノ酸の成熟酵素を含んで成り、そして、
グリコシル化されていないタンパク質について約29,000
の分子量を有する、337〜338個のアミノ酸のプレプロ酵
素として合成されることにおいて非常に類似する。計算
された等電点は6.10〜6.94であり、そして最ともアルカ
リ性は、アブシジア・スポロホラ−バリアビリスからの
リパーゼである。それらの計算された等電点は、たぶ
ん、すべての荷電された残基がタンパク質の暴露された
３次元表面上に存在するとはかぎらない結果として、IE
Fゲル（Gormsenなど.,デンマークの特許出願第95/00424
号を参照のこと）上に実験的に観察されるそれらの等電
値よりもかなり低い。
アブシジア リパーゼは、お互い間の広範なアミノ酸
配列相同性を87〜96％の同一性で共有し、そしてリゾム
コル・ミエヘイ リパーゼ（配列番号15）は53〜55％の
同一性の限定された相同性を有し、そしてヒュミコラ・
ラヌギノサ リパーゼ（配列番号16）は、22〜24％の同
一性の相同性を有する（表３及び図８に示される）。
配列相同性を87〜96％の同一性で共有し、そしてリゾム
コル・ミエヘイ リパーゼ（配列番号15）は53〜55％の
同一性の限定された相同性を有し、そしてヒュミコラ・
ラヌギノサ リパーゼ（配列番号16）は、22〜24％の同
一性の相同性を有する（表３及び図８に示される）。
系統分類的観点から、アブシジア リパーゼは、菌類
のザイゴミセート（Zygomycete）門の他のメンバーから
のリパーゼに最とも親密に関連している。酵母、細菌及
び哺乳類リパーゼ、並びに菌類クチナーゼは、あったと
しても、ひじょうに遠隔して関連しているように見え
る。
のザイゴミセート（Zygomycete）門の他のメンバーから
のリパーゼに最とも親密に関連している。酵母、細菌及
び哺乳類リパーゼ、並びに菌類クチナーゼは、あったと
しても、ひじょうに遠隔して関連しているように見え
る。
例7:アブシジア・コリムビフェラ リパーゼ遺伝子の発
現 上記アブシジア・コリムビフェラ リパーゼ遺伝子の
クローン及びヌクレオチド配列を、アスペルギラス宿主
における遺伝子のサブクローニング及び発現のために使
用した。PCRを、ヌクレオチド配列から企画されたプラ
イマーを用いて、単離されたゲノムクローンNL95Aから
のリパーゼ遺伝子（それ自体のプロモーターを有さな
い）をサブクローン化するために使用した。pBANe6と称
する発現ベクター（図９）中への遺伝子フラグメントの
サブクローニングを促進するために、前記遺伝子の５′
及び３′末端で、それぞれSwa I及びPac I制限酵素部位
を導入した。ベクターpBANE6は、調節配列として、TAKA
プロモーター、NA2−tpiリーダー及びAMGターネーター
を含んだ。プラスミドはまた、菌類形質転換のための選
択マーカーとしてアスペルギラス ニジュランスamdS遺
伝子を含んだ。次のプライマーが、PCR増幅のために使
用される： 前方向プライマー:5′−CCCATTTAAATATGCGTTTTTATTCAGT
AGTATCAT−３′（配列番号17） 逆方向プライマー:5′−CTCGGCTTAATTAAAATGGGTTATAAGC
AGAGACCAGTG−３′（配列番号18）。
現 上記アブシジア・コリムビフェラ リパーゼ遺伝子の
クローン及びヌクレオチド配列を、アスペルギラス宿主
における遺伝子のサブクローニング及び発現のために使
用した。PCRを、ヌクレオチド配列から企画されたプラ
イマーを用いて、単離されたゲノムクローンNL95Aから
のリパーゼ遺伝子（それ自体のプロモーターを有さな
い）をサブクローン化するために使用した。pBANe6と称
する発現ベクター（図９）中への遺伝子フラグメントの
サブクローニングを促進するために、前記遺伝子の５′
及び３′末端で、それぞれSwa I及びPac I制限酵素部位
を導入した。ベクターpBANE6は、調節配列として、TAKA
プロモーター、NA2−tpiリーダー及びAMGターネーター
を含んだ。プラスミドはまた、菌類形質転換のための選
択マーカーとしてアスペルギラス ニジュランスamdS遺
伝子を含んだ。次のプライマーが、PCR増幅のために使
用される： 前方向プライマー:5′−CCCATTTAAATATGCGTTTTTATTCAGT
AGTATCAT−３′（配列番号17） 逆方向プライマー:5′−CTCGGCTTAATTAAAATGGGTTATAAGC
AGAGACCAGTG−３′（配列番号18）。
PCRを、製造業者の規格に従って、Pwoポリメラーゼ
（Boehringer Mannheim,Indianapolis IN）を用いて実
施した。PCR増幅された生成物を、ゲル単離し、Swa I及
びPac I酵素により切断し、そしてゲル精製した。精製
されたフラグメントをpBANe6ベクター（Swa I及びPac I
によりすべて切断されている）に連結し、リパーゼ遺伝
子の転写がTAKAプロモーターの制御下にあるプラスミド
pKB2（図10）を生成した。プラスミドpKB2を用いて、E.
コリDH5細胞を形質転換した。pKB2プラスミドを含むE.
コリ形質転換体を単離し、そしてプラスミドDNAをアス
ペルギラスにおける形質転換及び発現のために調製し
た。
（Boehringer Mannheim,Indianapolis IN）を用いて実
施した。PCR増幅された生成物を、ゲル単離し、Swa I及
びPac I酵素により切断し、そしてゲル精製した。精製
されたフラグメントをpBANe6ベクター（Swa I及びPac I
によりすべて切断されている）に連結し、リパーゼ遺伝
子の転写がTAKAプロモーターの制御下にあるプラスミド
pKB2（図10）を生成した。プラスミドpKB2を用いて、E.
コリDH5細胞を形質転換した。pKB2プラスミドを含むE.
コリ形質転換体を単離し、そしてプラスミドDNAをアス
ペルギラスにおける形質転換及び発現のために調製し
た。
プロトプラストを、宿主株のamdS遺伝子が欠失されて
いるアスペルギラス オリザエ株BANe3から調製した。
プロトプラスト調製及び形質転換を、前に記載されたよ
うにして（Christensenなど.,前記）、実施した。アセ
トアミダーゼを発現するアスペルギラス オリザエ形質
転換体を、単独の窒素源としてアセトアミドを用いるそ
れらの能力に基づいて選択した。合計42の形質転換体を
生成し、そして胞子を選択プレート上で２度、精製し
た。胞子精製された形質転換体を、さらなる分析のため
に使用した。
いるアスペルギラス オリザエ株BANe3から調製した。
プロトプラスト調製及び形質転換を、前に記載されたよ
うにして（Christensenなど.,前記）、実施した。アセ
トアミダーゼを発現するアスペルギラス オリザエ形質
転換体を、単独の窒素源としてアセトアミドを用いるそ
れらの能力に基づいて選択した。合計42の形質転換体を
生成し、そして胞子を選択プレート上で２度、精製し
た。胞子精製された形質転換体を、さらなる分析のため
に使用した。
形質転換体を、１当たりマルトース50g、2.0gのMgS
O4・7H2O、10gのKH2PO4、2.0gのK2SO4、2.0gのクエン
酸、10gの酵母抽出物、0.5mlの微量金属溶液及び2.0gの
尿素を含む培地を用いて、振盪フラスコ（125mlのフラ
スコにおいて25mlの培地）における培養によりリパーゼ
発現のためにスクリーンした。微量金属溶液は、１当
たり14.3gのZnSO4・7H2O、2.5gのCuSO4・5H2O、0.5gのN
iCl2・6H2O、13.8gのFeSO4・7H2O、8.5gのMnSO4・H2O及
び3.0gのクエン酸から構成された。培地のpHを6.5に調
節し、その後、オートクレーブにより殺菌した。フラス
コを新しく収穫された胞子により接種し、そして34℃及
び200rpmでインキュベーターにおいてインキュベートし
た。培養物を、培養の48時間後、毎日、リパーゼ活性に
ついて毎日アッセイした。このリパーゼのための適切な
基質については何ら知られていないので、酵素活性を、
次の３種の方法によりアッセイした:i）基質としてオリ
ーブ油を用いてのリパーゼプレートアッセイ、ii）基質
としてｐ−ニトロフェニルブチレートの比色的使用、及
びiii）トリブチリン（酪酸のトリグリセリド）を用い
ての滴定。
O4・7H2O、10gのKH2PO4、2.0gのK2SO4、2.0gのクエン
酸、10gの酵母抽出物、0.5mlの微量金属溶液及び2.0gの
尿素を含む培地を用いて、振盪フラスコ（125mlのフラ
スコにおいて25mlの培地）における培養によりリパーゼ
発現のためにスクリーンした。微量金属溶液は、１当
たり14.3gのZnSO4・7H2O、2.5gのCuSO4・5H2O、0.5gのN
iCl2・6H2O、13.8gのFeSO4・7H2O、8.5gのMnSO4・H2O及
び3.0gのクエン酸から構成された。培地のpHを6.5に調
節し、その後、オートクレーブにより殺菌した。フラス
コを新しく収穫された胞子により接種し、そして34℃及
び200rpmでインキュベーターにおいてインキュベートし
た。培養物を、培養の48時間後、毎日、リパーゼ活性に
ついて毎日アッセイした。このリパーゼのための適切な
基質については何ら知られていないので、酵素活性を、
次の３種の方法によりアッセイした:i）基質としてオリ
ーブ油を用いてのリパーゼプレートアッセイ、ii）基質
としてｐ−ニトロフェニルブチレートの比色的使用、及
びiii）トリブチリン（酪酸のトリグリセリド）を用い
ての滴定。
リパーゼプレートアッセイを、次のものを含むプレー
ト培地を用いて実施した:0.1Mのトリス、pH9.0、0.1Mの
CaCl2、１％のTriton X−100、0.5％のオリーブ油及び
2.0％のアガロース。培地をオートクレーブし、そして
プレート当たり50〜60mlを用いて150mmのプレートに注
いだ。アガロースの固化の後、プレート当たり15のウェ
ルを製造し、そして培養物ブイヨン25mlを個々のウェル
に添加した。形質転換されたアスペルギラス オリザエ
株BANe3からの培養物ブイヨンを、対照として使用し
た。プレートを37℃で一晩インキュベートした。形質転
換体におけるリパーゼ活性の存在を、ウェルのまわりの
透明な領域として同定した。形質転換されていない株か
らの培養物ブイヨンにより負荷された対照ウェルは、そ
のような透明部分を示さず、これは形質転換体において
のみリパーゼ活性の存在を示す。
ト培地を用いて実施した:0.1Mのトリス、pH9.0、0.1Mの
CaCl2、１％のTriton X−100、0.5％のオリーブ油及び
2.0％のアガロース。培地をオートクレーブし、そして
プレート当たり50〜60mlを用いて150mmのプレートに注
いだ。アガロースの固化の後、プレート当たり15のウェ
ルを製造し、そして培養物ブイヨン25mlを個々のウェル
に添加した。形質転換されたアスペルギラス オリザエ
株BANe3からの培養物ブイヨンを、対照として使用し
た。プレートを37℃で一晩インキュベートした。形質転
換体におけるリパーゼ活性の存在を、ウェルのまわりの
透明な領域として同定した。形質転換されていない株か
らの培養物ブイヨンにより負荷された対照ウェルは、そ
のような透明部分を示さず、これは形質転換体において
のみリパーゼ活性の存在を示す。
リパーゼ活性をまた、基質としてｐ−ニトロフェニル
ブチレートを用いて、比色的に測定した。ｐ−ニトロフ
ェニルブチレートを、1.0mlのジメチルスルホキシド（D
MSO）及び0.1Mのトリス緩衝液（pH9.0）4.0mlにこの化
合物10mlを添加することによって調製した。適切に希釈
された培養物ブイヨン100μｌを個々のウェルに添加し
た。反応を、100mlのｐ−ニトロフェニルブチレート基
質を添加することによって開放し、そして吸光度を405n
mで３〜５分間、測定した。酵素活性を、対照としてヒ
ュミコラ ラヌギノサ リパーゼの既知量により製造さ
れた曲線から計算した。形質転換されていない株は、活
性をほとんど又はまったく生成せず、ところが、異なっ
た形質転換体は48時間の培養の後、リパーゼを生成し
た。
ブチレートを用いて、比色的に測定した。ｐ−ニトロフ
ェニルブチレートを、1.0mlのジメチルスルホキシド（D
MSO）及び0.1Mのトリス緩衝液（pH9.0）4.0mlにこの化
合物10mlを添加することによって調製した。適切に希釈
された培養物ブイヨン100μｌを個々のウェルに添加し
た。反応を、100mlのｐ−ニトロフェニルブチレート基
質を添加することによって開放し、そして吸光度を405n
mで３〜５分間、測定した。酵素活性を、対照としてヒ
ュミコラ ラヌギノサ リパーゼの既知量により製造さ
れた曲線から計算した。形質転換されていない株は、活
性をほとんど又はまったく生成せず、ところが、異なっ
た形質転換体は48時間の培養の後、リパーゼを生成し
た。
リパーゼ活性を、リパーゼにより触媒されるトリブチ
リンの加水分解に基づいての滴定によりさらに決定し
た。酪酸の生成に続いて、pH−安定装置においてアルカ
リ滴定した。アッセイを、選択された形質転換体及び形
質転換されていない対照株からの培養物ブイヨンに対し
て実施した。その結果は、形質転換されていない対照株
はリパーゼ活性を生成しないが、ところが形質転換体は
検出できるリパーゼ活性を生成したことを示した。
リンの加水分解に基づいての滴定によりさらに決定し
た。酪酸の生成に続いて、pH−安定装置においてアルカ
リ滴定した。アッセイを、選択された形質転換体及び形
質転換されていない対照株からの培養物ブイヨンに対し
て実施した。その結果は、形質転換されていない対照株
はリパーゼ活性を生成しないが、ところが形質転換体は
検出できるリパーゼ活性を生成したことを示した。
例8:アスペルギラス・オリザエにおけるアブシジア・ス
ポロホラ−バリアビリス リパーゼ遺伝子の発現 A.スポロホラ・バリアビリス リパーゼのコード領域
を、次の成分を含むPCR反応において、Pwoポリメラーゼ
（Boehringer−Mannheim Biochemicals,Indianapolis,I
N）のための鋳型として元のゲノムクローンを用いて増
幅した:61mlの無菌水、10mlの希釈された鋳型DNA（約5n
g/ml）、1mlのプライマー１（約30pモル:dATGATGCATTCT
CATTTTGTAGTCTTATTG、配列番号19）、1mlのプライマー
２（約25pモル:dGCTTAATTAATTATAAACAGAGACCAGTGTTCATG
TCAAG、配列番号20）、16mlのdATP,dCTP,dGTP及びdTTP
混合物（200mモルの最終濃度）、10mlのPwo緩衝液（10
×溶液;Boehringer−Mannheim Biochemicals）、及び1m
lのPwoポリメラーゼ（５単位）。増幅条件は次の通りで
ある：サイクル１、95℃で５分間、45℃で２分間及び67
℃で５分間；サイクル２〜30、95℃で２分間、45℃で１
分間、及び67℃で２分間；及び４℃でのソークサイク
ル。増幅されたリパーゼ遺伝子セグメントをPac Iによ
り消化し、そして分離用アガロースゲル電気泳動により
単離し、切り出し、そしてPrep−ａ−Gene試薬（BioRad
Laboratories,Hercules,CA）を用いて精製した。精製
されたフラグメントを、Swa I及びPac Iにより切断され
ているpBANe6により連結し、リパーゼ発現ベクターpRaM
B19（図11）を生成した。
ポロホラ−バリアビリス リパーゼ遺伝子の発現 A.スポロホラ・バリアビリス リパーゼのコード領域
を、次の成分を含むPCR反応において、Pwoポリメラーゼ
（Boehringer−Mannheim Biochemicals,Indianapolis,I
N）のための鋳型として元のゲノムクローンを用いて増
幅した:61mlの無菌水、10mlの希釈された鋳型DNA（約5n
g/ml）、1mlのプライマー１（約30pモル:dATGATGCATTCT
CATTTTGTAGTCTTATTG、配列番号19）、1mlのプライマー
２（約25pモル:dGCTTAATTAATTATAAACAGAGACCAGTGTTCATG
TCAAG、配列番号20）、16mlのdATP,dCTP,dGTP及びdTTP
混合物（200mモルの最終濃度）、10mlのPwo緩衝液（10
×溶液;Boehringer−Mannheim Biochemicals）、及び1m
lのPwoポリメラーゼ（５単位）。増幅条件は次の通りで
ある：サイクル１、95℃で５分間、45℃で２分間及び67
℃で５分間；サイクル２〜30、95℃で２分間、45℃で１
分間、及び67℃で２分間；及び４℃でのソークサイク
ル。増幅されたリパーゼ遺伝子セグメントをPac Iによ
り消化し、そして分離用アガロースゲル電気泳動により
単離し、切り出し、そしてPrep−ａ−Gene試薬（BioRad
Laboratories,Hercules,CA）を用いて精製した。精製
されたフラグメントを、Swa I及びPac Iにより切断され
ているpBANe6により連結し、リパーゼ発現ベクターpRaM
B19（図11）を生成した。
続いて、pRaMB19を用いて、標準の方法（Christensen
など,1988,Bio/Technology 1419−1422）によりアルカ
リプロテアーゼ−欠失アスペルギラス オリザエ宿主Ja
L142を形質転換した。形質転換コロニーを２度精製し、
そして次の成分を含むトリブチリン寒天プレート上での
画線培養によりリパーゼ発現について試験した:1当た
り、130gのマルトデキストリン、3gのMgSO4・7H2O、5g
のKH2PO4、4gのクエン酸、6gのK2SO4、0.5mlの微量金属
（例７に記載される）、5gの酵母抽出物、1Mの尿素166m
l、1MのNaNO3（35.3ml）、25gのNoble寒天、及び10gの
トリブチリン（pH4.5）。30℃での48時間のインキュベ
ーションの後、84の形質転換体のうち80が、細胞外リパ
ーゼ活性の生成を示す、トリブチリン寒天プレート上に
明確な透明領域を示した。それらの形質転換体のうち10
個を、次の成分を含むMY50培地の振盪フラスコ培養物に
おいてさらに試験した:1当たり、50gのマルトデキス
トリン、2gのMgSO4・7H2O、10gのKH2PO4、2gのクエン
酸、2gのK2SO4、0.5mlの微量金属溶液、10gの酵母抽出
物、2gの尿素（pH6.0）。37℃で48時間、振盪フラスコ
培養物をインキュベートした後、個々からの培養物濾液
を、例７に記載されるように基質としてｐ−ニトロフェ
ニルブチレートを用いて、細胞外リパーゼ活性について
アッセした。形質転換されていない対照細胞の培養物は
検出できるリパーゼ活性を生成しないが、ところがpRaM
B19形質転換体は検出できるリパーゼ活性を生成した。
など,1988,Bio/Technology 1419−1422）によりアルカ
リプロテアーゼ−欠失アスペルギラス オリザエ宿主Ja
L142を形質転換した。形質転換コロニーを２度精製し、
そして次の成分を含むトリブチリン寒天プレート上での
画線培養によりリパーゼ発現について試験した:1当た
り、130gのマルトデキストリン、3gのMgSO4・7H2O、5g
のKH2PO4、4gのクエン酸、6gのK2SO4、0.5mlの微量金属
（例７に記載される）、5gの酵母抽出物、1Mの尿素166m
l、1MのNaNO3（35.3ml）、25gのNoble寒天、及び10gの
トリブチリン（pH4.5）。30℃での48時間のインキュベ
ーションの後、84の形質転換体のうち80が、細胞外リパ
ーゼ活性の生成を示す、トリブチリン寒天プレート上に
明確な透明領域を示した。それらの形質転換体のうち10
個を、次の成分を含むMY50培地の振盪フラスコ培養物に
おいてさらに試験した:1当たり、50gのマルトデキス
トリン、2gのMgSO4・7H2O、10gのKH2PO4、2gのクエン
酸、2gのK2SO4、0.5mlの微量金属溶液、10gの酵母抽出
物、2gの尿素（pH6.0）。37℃で48時間、振盪フラスコ
培養物をインキュベートした後、個々からの培養物濾液
を、例７に記載されるように基質としてｐ−ニトロフェ
ニルブチレートを用いて、細胞外リパーゼ活性について
アッセした。形質転換されていない対照細胞の培養物は
検出できるリパーゼ活性を生成しないが、ところがpRaM
B19形質転換体は検出できるリパーゼ活性を生成した。
生物学的材料の寄託 次の生物学的材料を、Agricultural Research Servic
e Patent Culture Collection,Northern Regional Rese
arch Center,1815 University Street,Peoria,Illinoi
s,61604に、1996年１月18日に、ブタペスト条約に基づ
いて寄託し、そして次の受託番号を付与された。
e Patent Culture Collection,Northern Regional Rese
arch Center,1815 University Street,Peoria,Illinoi
s,61604に、1996年１月18日に、ブタペスト条約に基づ
いて寄託し、そして次の受託番号を付与された。
配列表 （２）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:2168塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：ゲノミックDNA （xi）配列の記載：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:336アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列の記載：配列番号:2: （２）配列番号:3の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:2149塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：ゲノミックDNA （xi）配列の記載：配列番号:3: （２）配列番号:4の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:336アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列の記載：配列番号:4: （２）配列番号:5の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:2102塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：ゲノミックDNA （xi）配列の記載：配列番号:5: （２）配列番号:6の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:338アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列の記載：配列番号:6: （２）配列番号:7の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1714塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：ゲノミックDNA （xi）配列の記載：配列番号:7: （２）配列番号:8の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:337アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列の記載：配列番号:8: （２）配列番号:9の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1115塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：ゲノミックDNA （xi）配列の記載：配列番号:9: （２）配列番号:10の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:338アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列の記載：配列番号:10: （２）配列番号:11の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:9アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列の記載：配列番号:11: （２）配列番号:12の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:23塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：ゲノミックDNA （xi）配列の記載：配列番号:12: （２）配列番号:13の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:8アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列の記載：配列番号:13: （２）配列番号:14の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：ゲノミックDNA （xi）配列の記載：配列番号:14: （２）配列番号:15の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:363アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列の記載：配列番号:15: （２）配列番号:16の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:291アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列の記載：配列番号:16:
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 ボーミナサン，カルパン シー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616，デイビス，フンボルト アベニ ュ 2233 (72)発明者 サンダル，トーマス デンマーク国，デーコー―2880 バグス バエルト，ノボ アレ，ノボ ノルディ スク アクティーゼルスカブ 審査官 高堀 栄二 (56)参考文献 Ｌｉｐｉｄ，Ｖｏｌ．23，Ｎｏ．７ （1988）ｐ．701−706 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (53)
- 【請求項１】（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号
６、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードする核酸配列； （ｂ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配
列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は
（ii）それらの相補的鎖のいずれかと、５×SSPE、0.3
％のSDS、200μg/mLの剪断されそして変性されたサケ精
子DNA及び35％ホルムアミドにおいて42℃でのプレハイ
ブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの条件
下でハイブダイズすることができるアブシジア（Absidi
a）の株に対して内因性の核酸配列； （ｃ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配
列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は
（ii）それらの相補的鎖のいずれかと、５×SSPE、0.3
％のSDS、200μg/mLの剪断されそして変性されたサケ精
子DNA及び35％ホルムアミドにおいて42℃でのプレハイ
ブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの条件
下でハイブダイズすることができる核酸配列； （ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号
８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列に対して、85
％以上の配列の同一性の範囲内での、１又は複数のアミ
ノ酸残基の挿入又は欠失及び／又は異ったアミノ酸残基
による置換により異るアミノ酸配列を有し、リパーゼ活
性を有するポリペプチドをコードする核酸配列； （ｅ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）の対立遺
伝子形；及び （ｆ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）のフラグ
メント、 から成る群から選択された、リパーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする単離された核酸配列。 - 【請求項２】前記核酸配列が、（ｉ）配列番号１、配列
番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に
示される核酸配列、又は（ii）それらの相補的鎖のいず
れか、又はそのフラグメントに対して、５×SSPE、0.3
％のSDS、200μg/mLの剪断されそして変性されたサケ精
子DNA及び35％ホルムアミドにおいて42℃でのプレハイ
ブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの条件
下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第１項
記載の核酸配列。 - 【請求項３】前記核酸配列が、（ｉ）配列番号１、配列
番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に
示される核酸配列、又は（ii）それらの相補的鎖のいず
れかに対して、５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mLの剪
断されそして変性されたサケ精子DNA及び35％ホルムア
ミドにおいて42℃でのプレハイブリダイゼーション及び
ハイブリダイゼーションの条件下でハイブリダイズする
ことができる請求の範囲第２項記載の核酸配列。 - 【請求項４】前記核酸配列が、配列番号１に示される核
酸配列又はその相補的鎖に対して、５×SSPE、0.3％のS
DS、200μg/mLの剪断されそして変性されたサケ精子DNA
及び35％ホルムアミドにおいて42℃でのプレハイブリダ
イゼーション及びハイブリダイゼーションの条件下でハ
イブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の
核酸配列。 - 【請求項５】前記核酸配列が、配列番号３に示される核
酸配列又はその相補的鎖に対して、５×SSPE、0.3％のS
DS、200μg/mLの剪断されそして変性されたサケ精子DNA
及び35％ホルムアミドにおいて42℃でのプレハイブリダ
イゼーション及びハイブリダイゼーションの条件下でハ
イブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の
核酸配列。 - 【請求項６】前記核酸配列が、配列番号５に示される核
酸配列又はその相補的鎖に対して、５×SSPE、0.3％のS
DS、200μg/mLの剪断されそして変性されたサケ精子DNA
及び35％ホルムアミドにおいて42℃でのプレハイブリダ
イゼーション及びハイブリダイゼーションの条件下でハ
イブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の
核酸配列。 - 【請求項７】前記核酸配列が、配列番号７に示される核
酸配列又はその相補的鎖に対して、５×SSPE、0.3％のS
DS、200μg/mLの剪断されそして変性されたサケ精子DNA
及び35％ホルムアミドにおいて42℃でのプレハイブリダ
イゼーション及びハイブリダイゼーションの条件下でハ
イブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の
核酸配列。 - 【請求項８】前記核酸配列が、配列番号９に示される核
酸配列又はその相補的鎖に対して、５×SSPE、0.3％のS
DS、200μg/mLの剪断されそして変性されたサケ精子DNA
及び35％ホルムアミドにおいて42℃でのプレハイブリダ
イゼーション及びハイブリダイゼーションの条件下でハ
イブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の
核酸配列。 - 【請求項９】前記核酸配列が、アブシジア（Absidia）
から得られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする請求の範囲第２項記載の核酸配列。 - 【請求項１０】前記核酸配列が、アブシジア・ブラケス
レアラ（Absidia blakesleeala）から得られるリパーゼ
活性を有するポリペプチドをコードする請求の範囲第９
項記載の核酸配列。 - 【請求項１１】前記核酸配列が、アブシジア・コリムビ
フェラ（Absidia corymbifera）から得られるリパーゼ
活性を有するポリペプチドをコードする請求の範囲第９
項記載の核酸配列。 - 【請求項１２】前記核酸配列が、アブシジア・グリセオ
ラ（Absidia gliseola）から得られるリパーゼ活性を有
するポリペプチドをコードする請求の範囲第９項記載の
核酸配列。 - 【請求項１３】前記核酸配列が、アブシジア・グリセオ
ラvar.イグチ（Absidia griseola var.iguchi）から得
られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
請求の範囲第９項記載の核酸配列。 - 【請求項１４】前記核酸配列が、アブシジア・レフレキ
サ（Absidia reflexa）から得られるリパーゼ活性を有
するポリペプチドをコードする請求の範囲第９項記載の
核酸配列。 - 【請求項１５】前記核酸配列が、アブシジア・スポロホ
ラ−バリアビリス（Absidia sporophora−variablis）
から得られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする請求の範囲第９項記載の核酸配列。 - 【請求項１６】前記核酸配列が、配列番号２、配列番号
４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示される
アミノ酸配列のいずれかに対して、85％以上の配列の同
一性の範囲内での、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又
は欠失及び／又は異ったアミノ酸残基による置換により
異るアミノ酸配列を有し、リパーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする核酸配列、あるいはそのフラグメン
トアミノ酸配列をコードする請求の範囲第１項記載の核
酸配列。 - 【請求項１７】前記核酸配列が、配列番号２、配列番号
４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示される
アミノ酸配列のいずれかに対して、85％以上の配列の同
一性の範囲内での、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又
は欠失及び／又は異ったアミノ酸残基による置換により
異るアミノ酸配列を有し、リパーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする核酸配列をコードする請求の範囲第
16項記載の核酸配列。 - 【請求項１８】前記核酸配列が、配列番号２、配列番号
４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示される
アミノ酸配列のいずれかに対して、90％以上の配列の同
一性の範囲内での、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又
は欠失及び／又は異ったアミノ酸残基による置換により
異るアミノ酸配列をコードする請求の範囲第17項記載の
核酸配列。 - 【請求項１９】前記核酸配列が、配列番号２、配列番号
４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示される
アミノ酸配列のいずれかに対して、95％以上の配列の同
一性の範囲内での、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又
は欠失及び／又は異ったアミノ酸残基による置換により
異るアミノ酸配列をコードする請求の範囲第18項記載の
核酸配列。 - 【請求項２０】前記核酸配列が、配列番号２に示される
アミノ酸配列に対して、95％以上の配列の同一性の範囲
内での、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失及び
／又は異ったアミノ酸残基による置換により異るアミノ
酸配列をコードする請求の範囲第19項記載の核酸配列。 - 【請求項２１】前記核酸配列が、配列番号２に示される
アミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の
範囲第20項記載の核酸配列。 - 【請求項２２】前記核酸配列が、配列番号１に示される
請求の範囲第21項記載の核酸配列。 - 【請求項２３】前記核酸配列が、配列番号４に示される
アミノ酸配列に対して、95％以上の配列の同一性の範囲
内での、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失及び
／又は異ったアミノ酸残基による置換により異るアミノ
酸配列をコードする請求の範囲第19項記載の核酸配列。 - 【請求項２４】前記核酸配列が、配列番号４に示される
アミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の
範囲第23項記載の核酸配列。 - 【請求項２５】前記核酸配列が、配列番号３に示される
請求の範囲第24項記載の核酸配列。 - 【請求項２６】前記核酸配列が、配列番号６に示される
アミノ酸配列に対して、95％以上の配列の同一性の範囲
内での、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失及び
／又は異ったアミノ酸残基による置換により異るアミノ
酸配列をコードする請求の範囲第19項記載の核酸配列。 - 【請求項２７】前記核酸配列が、配列番号６に示される
アミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の
範囲第26項記載の核酸配列。 - 【請求項２８】前記核酸配列が、配列番号５に示される
請求の範囲第27項記載の核酸配列。 - 【請求項２９】前記核酸配列が、配列番号８に示される
アミノ酸配列に対して、95％以上の配列の同一性の範囲
内での、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失及び
／又は異ったアミノ酸残基による置換により異るアミノ
酸配列をコードする請求の範囲第19項記載の核酸配列。 - 【請求項３０】前記核酸配列が、配列番号８に示される
アミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の
範囲第29項記載の核酸配列。 - 【請求項３１】前記核酸配列が、配列番号７に示される
請求の範囲第30項記載の核酸配列。 - 【請求項３２】前記核酸配列が、配列番号10に示される
アミノ酸配列に対して、95％以上の配列の同一性の範囲
内での、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失及び
／又は異ったアミノ酸残基による置換により異るアミノ
酸配列をコードする請求の範囲第19項記載の核酸配列。 - 【請求項３３】前記核酸配列が、配列番号10に示される
アミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の
範囲第32項記載の核酸配列。 - 【請求項３４】前記核酸配列が、配列番号９に示される
請求の範囲第33項記載の核酸配列。 - 【請求項３５】前記核酸配列が、アブシジア（Absidi
a）の株に対して内因性であり、そして配列番号１に示
される核酸配列又はその相補的鎖に対して５×SSPE、0.
3％のSDS、200μg/mLの剪断されそして変性されたサケ
精子DNA及び35％ホルムアミドにおいて42℃でのプレハ
イブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの条
件下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第１
項記載の核酸配列。 - 【請求項３６】E.コリNRRL B−21520に含まれるプラス
ミドpZL−NL1に含まれるアブシジア リパーゼをコード
する核酸配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の核酸
配列。 - 【請求項３７】E.コリNRRL B−21521に含まれるプラス
ミドpZL−NL61に含まれるアブシジア リパーゼをコー
ドする核酸配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の核
酸配列。 - 【請求項３８】E.コリNRRL B−21522に含まれるプラス
ミドpZL−NL95に含まれるアブシジア リパーゼをコー
ドする核酸配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の核
酸配列。 - 【請求項３９】E.コリNRRL B−21523に含まれるプラス
ミドpZL−NL124に含まれるアブシジア リパーゼをコー
ドする核酸配列を含んで成る請求の範囲第１項記の載核
酸配列。 - 【請求項４０】適切な発現宿主においてポリペプチドの
発現を指令することができる１又は複数の制御配列に作
用可能に連結される請求の範囲第１項記載の核酸配列を
含んで成る核酸構成体。 - 【請求項４１】請求の範囲第40項記載の核酸構成体、プ
ロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成
る組換え発現ベクター。 - 【請求項４２】選択マーカーをさらに含んで成る請求の
範囲第41項記載のベクター。 - 【請求項４３】請求の範囲第40項記載の核酸構成体を含
んで成る組換え宿主細胞。 - 【請求項４４】前記核酸構成体がベクター上に含まれる
請求の範囲第43項記載の細胞。 - 【請求項４５】前記核酸構成体が宿主細胞ゲノム中に組
込まれる請求の範囲第43項記載の細胞。 - 【請求項４６】前記宿主細胞が細菌細胞である請求の範
囲第43項記載の細胞。 - 【請求項４７】前記細菌細胞がバシラス、ストレプトミ
セス又はシュードモナス細胞である請求の範囲第46項記
載の細胞。 - 【請求項４８】前記宿主細胞が菌類細胞である請求の範
囲第43項記載の細胞。 - 【請求項４９】前記菌類細胞が糸状菌細胞である請求の
範囲第48項記載の細胞。 - 【請求項５０】前記糸状菌細胞が、アクレモニウム（Ac
remonium）、アスペルギラス（Aspergillas）、フサリ
ウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Mumicola）、ムコル
（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネウ
ロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicilliu
m）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（To
lypocladium）又はトコダーマ（Trichoderma）の種の細
胞である請求の範囲第49項記載の細胞。 - 【請求項５１】前記菌類細胞が酵母細胞である請求の範
囲第48項記載の細胞。 - 【請求項５２】前記酵母細胞が、カンジダ（Candid
a）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pi
chia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッ
カロミセス（Schizosaccharomyces）又はヤロウィア（Y
arrowia）の種の細胞である請求の範囲第51項記載の細
胞。 - 【請求項５３】リパーゼ活性を有するポリペプチドの製
造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現の助け
となる条件下で請求の範囲第43項記載の宿主細胞を培養
し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含
んで成る方法。
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