JPH11510395A

JPH11510395A - アブシジアリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸

Info

Publication number: JPH11510395A
Application number: JP9526906A
Authority: JP
Inventors: エム．ベルカ，ランディー; シー．ボーミナサン，カルパン; サンダル，トーマス
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-01-24
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 1999-09-14
Anticipated expiration: 2017-01-21
Also published as: JP3333521B2; WO1997027276A2; CN1209842A; AU1747797A; EP0876489A2; WO1997027276A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、アブシジアリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。本発明はまた、核酸構造体、ベクター、及び前記核酸配列を含んで成る宿主細胞、並びに前記ポリペプチドを生成するための方法にも関する。本発明はさらに、前記ポリペプチドを含んで成る組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】アブシジアリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸発明の背景発明の分野本発明は、アブシジア（Absidia）リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。本発明はまた、核酸構成体、ベクター、及び前記核酸配列を含んで成る宿主細胞、並びに前記ポリペプチドを製造するための組換え法にも関する。関連する技術の記載脂肪分解酵素を配合した洗剤は、脂肪性しみを除去するための改良された性質を有することが知られている。たとえば、LIPOLASE^TM（Novo Nordisk A/S，Bags vaerd，Denmark）、すなわち菌類サーモマイセス・ラヌギノサス(Thermomyces l anuginosus)(また、ヒュミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)とも呼ばれる)から得られる微生物リパーゼは、多くの市販洗剤中に導入されている。シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)(アメリカ特許第4,876,042 号)、ストレプトマイセテス(Streptomycetes)(WO 94／14940)、及びゴングロネラ・ブトレリ(Gongronella butleri)株NRRL 3521(アメリカ特許第3,634,195号；この株は以前はアブシジアブトレリ(Absidia butleri)と呼ばれた；K.H.Domsc hなど.，Compendium of Soil Fungi，Academic Press 1980，p.381を参照のこと）からの他の微生物リパーゼもまた、洗剤への使用のために提案されている。アメリカ特許第3,634,195号は、アブシジア・シリンドロスポラ var．リゾモルファ(Absidia cylindrospora var．rhizomorpha)NRRL 2815及びアブシジア・ブラケスレアナ（Absidia blakesleeana）NRR 1305からのリパーゼの製造を記載している。Koritalaなど．(1987，Journal of the American Oil Che mists Society 64: 509-513)は、大豆油が、アブシジア・コエルラ（Absidia co erula）NRRL 5926及びアブシジアラモサ(Absidia ramosa)NRRL 1309と共にインキュベートされる場合、一部、加水分解されたことを開示する。Satyanarayan a（1981，Current Science 50: 680-682）は、アブシジア・コリムビフェラ(Abs idia corymbifera)の株によるリパーゼの分泌を開示している。Aisakaなど．（1 979，Agricultural Biological Chemistry 43: 2125-2129）は、アブシジア・ヒアロスポラ（Absidia hyalospora）株KY303(現在、アブシジア・ブラケスレアナ（Absidia blakesleeana）として分類される)からのリポタンパク質リパーゼの形成を記載する。多くの洗剤は、溶液においてアルカリ性であり（たとえば、およそ10のpH）、 Ca²⁺イオンを結合するビルダーを含む。Ca²⁺の不在下では、高いpHで高い活性を有する新規脂肪分解酵素の必要性がある。アブシジア属のリパーゼはそれらの特徴を有し、そして従って、洗剤組成物への使用のために非常に望まれる。しかしながら、これまで、それらの酵素を組換え的に製造する手段は存在していない。それらの価値ある酵素の組換え製造法を提供することが本発明の目的である。発明の要約本発明は、下記から成る群から選択された、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する：（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するアブシジア株に対して内因性の（endo genous）ポリペプチドをコードする核酸配列；（ｂ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は（ii）それらの相補的鎖のいづれかと、中位の緊縮条件下でハイブリダイズすることができるアブシジア株に対して内因性の核酸配列；（ｃ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は（ii）それらの相補的鎖のいづれかと、中位の緊縮条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列；（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも65％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；（ｅ）（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）の対立遺伝子形；及び（ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）又は（ｅ）のフラグメント。本発明はまた、核酸構成体、ベクター、及び前記核酸配列を含んで成る宿主細胞、並びに前記ポリペプチドを製造するための組換え方法にも関する。図面の簡単な説明図１は、アブシジア・グリセオラ（Absidia griseola）からのリパーゼ特異的 PCR生成物及びアブシジア・グリセオラvar．イグチ（Absidia griseola var．ig uchii）ゲノムDNAのアガロースゲル精製を示す。レーン１：HindIII−消化されたλDNA及びHaeIII−消化されたφX17RF-DNAサイズ標準；レーン２：アブシジア・グリセオラPCR生成物；及びレーン３：アブシジア・グリセオラvar．イグチPCR生成物。両PCR生成物は約870bpのサイズであるように思える。図２は、アブシジア・グリセオラからの放射性ラベルされたリガーゼ遺伝子セグメントによりプローブされたいくつかのアブシジア種からのゲノムDNA消化物のサザン・ハイブリダイゼーション分析からのオートラジオグラムを示す。Hind III−消化されたλDNA及びHaeIII−消化されたφX17RF-DNAサイズ標準のサイズが、オートラジオグラムの右側上に示される。レーン１〜３：アブシジア・スポロホラ−バリアビリス（Absidia sporophora-variabilis）DNA（それぞれ、EcoR Ｉ＋Asp718I，Asp718I及びEcoRＩ）；レーン４〜６：アブシジアコリムビフェラ（Absidia corymbifera）DNA（それぞれ、EcoRＩ＋Asp718I，Asp7181及びEcoR Ｉ）；レーン７〜９：アブシジアブラケスレアナ(Absidia blakesleeana)DNA （それぞれ、EcoRI＋Asp718I，Asp718I及びEcoRＩ）；レーン10〜12：アブシジアグリセオラvar．イグチDNA(それぞれ、EcoRＩ＋Asp718I，Asp7181、及びEco RＩ)；及びレーン13〜15：アブシジアグリセオラDNA(それぞれ、EcoRＩ＋Asp7 18I，Asp718I及びEcoRＩ)。図３は、アブシジアグリセオラvar．イグチリパーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号１及び２）。イントロンは実線により示される。前に決定されたペプチド配列に対応する領域は下線（）が引かれている。図４は、アブシジア・ブラケスレアナリパーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号３及び４）。イントロンは実線により示される。前に決定されたペプチド配列に対応する領域は下線（）が引かれている。図５は、アブシジア・コリムビフェラリパーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号５及び６）。イントロンは実線により示される。前に決定されたペプチド配列に対応する領域は下線（）が引かれている。図６は、アブシジア・スポロホラバリアビリスリパーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号７及び８）。イントロンは実線により示される。図７は、アブシジア・レフレキサ(Absidia reflexa)リパーゼのDNA配列及び推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号９及び10）。図８は、リゾムコルミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ（配列番号15）及びヒュミコララヌギノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ（配列番号16）に比較されるアブシジアリパーゼ間のアミノ酸配列相同性の比較を示す。同一の残基はボックスで囲まれている。図９は、pBANe6の制限地図を示す。図10は、pKB2の制限地図を示す。図11は、pRamB19の制限地図を示す。発明の詳細な説明核酸配列第１の態様においては、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列を有し、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。特定の態様においては、核酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に示される。本発明の核酸配列はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、しかし遺伝子コードの縮重により、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９とは異なる核酸配列も包含する。本発明はまた、それぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10のフラグメントをコードし、そしてリパーゼ活性を保持する、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９のサブ配列にも関する。好ましい態様においては、本発明の核酸配列は、それぞれ、エッシェリシア・コリ（Eschericha coli）NRRL B-21520，NRRL B-21 521，NRR B-21522及びNRR B-21523に含まれる、プラスミドpZL-NL1，pZL-NL61， pZL-NL95及びpZL-NL124に含まれる核酸配列である。用語“単離された核酸配列”とは、本明細書において使用される場合、アガロース電気泳動により決定される場合、他の核酸配列を実質的に含有しないか、たとえば少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは少なくとも約60％の純度、さらにより好ましくは少なくとも約80％の純度、及び最とも好ましくは少なくとも約90％の純度である核酸配列に関する。たとえば、単離された核酸配列は、核酸配列をその位置から、それが再生されるであろう異なった部位に再配置するために遺伝子工学に使用される標準のクローニング方法により得られる。クローニング方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸配列フラグメントの切断及び単離、前記フラグメントのベクター分子中への挿入、及び核酸配列の複数のコピー又はクローンが複製されるであろう宿主細胞中への前記組換えベクターの組込みを包含することができる。前記核酸配列は、ゲノム、cDNA，RNA、半合成、合成起源、又はそれらのいづれかの組合せのものであり得る。用語“リパーゼ”とは、Recommendations（1992）of the International Unio n of Biochemistry and Molecular Biology（IUBMB）に従って、酵素分類番号E.C.3.1.1.−（カルボン酸エステルヒドロラーゼ）下で分類される脂肪分解酵素として定義される。従って、脂肪分解酵素は、E.C.3.1. 1.に言及されるエステル結合、たとえばモノ−、ジ−及びトリグリセリド、リン脂質（すべての種類）、チオエステル、コレステロールエステル、ワックス−エステル、クチン、スベリン、合成エステル、等に存在するエステル結合の少なくとも１つの型のエステル結合に対して加水分解活性を示す。例として、本発明の脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対する活性(リパーゼ活性、E.C.3.1.1.3)、たとえば１，３−位置特異的リパーゼ活性を有することができる。第２の態様においては、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９に示される核酸配列、その相補的鎖又はそのサブ配列と高い、中位の又は低い緊縮条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと高い、中位の又は低い緊縮条件下でハイブリダイズすることができる、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する(J.S ambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laborat ory Manual，2d edition，Cold Spring Horbor，New York)。ハイブリダイゼーションは、類似する核酸が、標準のサザンブロット法に従って、低い〜高い緊縮条件（たとえば、それぞれ５×SSPE、0.3％の SDS、200μｇ／mlの剪断されそして変性されたサケ精子DNA、及びそれぞれ高い、中位の及び低い緊縮性のための5 0，35又は25％のいづれかのホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション）下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９に示される核酸配列の一部をコードするポリペプチドに対応するオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることを示す。好ましい態様においては、核酸配列は、中位の緊縮条件下で、そして最とも好ましくは、高い緊縮条件下ハイブリダイズすることができる。もう１つの好ましい態様においては、核酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又はその相補的鎖とハイブリダイズすることができる。配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８もしくは配列番号10、又はそれらのサブ配列は、当業界において良く知られている方法に従って、異なった属又は種の他の株からリパーゼをコードする相同遺伝子を単離するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用され得る。従って、そのような他の生物から調製されたゲノムDNA又はcDNAは、そこにおける対応する遺伝子を同定し、そして単離するために、標準のサザンブロット方法に従って、そのようなプローブとハイブリダイズするDNAについてスクリーンされ得る。そのようなプローブは、完全な配列よりも相当に短くあることができるが、しかし少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、そしてより好ましくは、少なくとも40個の長さのヌクレオチドであるべきである。好ましくは1200個よりも多くない長さのヌクレオチドのプローブもまた使用され得る。DNA及びRNAプローブの両者が使用され得る。プローブは典型的には、対応する遺伝子を検出するためにラベルされる（たとえば、³²Ｐ，³Ｈ、ビオチン又はアビジンにより）。本明細書に言及される変性プローブ及びアブシジア株からのゲノムDNA又は一本鎖cDNAを用いてのPCR反応がまた、アブシジアリパーゼ特異的生成物を生成することができ、この生成物は次に、その対応するゲノム又はcDNAをクローン化するためのプローブとして使用され得る。そのような他の生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法により分離され得る。ライブラリーからのDNA又は分離されたDNAは、ニトロセルロース又は他の適切なキャリヤー材料上に移され、そして固定され得る。配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９と相同であるクローン又はDNAを同定するために、キャリヤー材料が、サザンブロットに使用され、ここで前記キャリヤー材料は、最終的に、好ましくは40℃よりも高くなく、より好ましくは45℃よりも高くなく、より好ましくは50℃よりも高くなく、より好ましくは55℃よりも高くなく、さらにより好ましくは60℃よりも高くなく、特に65℃よりも高くない温度で、２×SSC、0 .2％ SDS溶液を用いてそれぞれ30分間、３度、洗浄される。オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子が、Ｘ−線フィルムを用いて検出される。本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９に示される核酸配列に対して、少なくとも約65％、好ましくは約70％、好ましくは約75％、好ましくは約80％、より好ましくは約85％、さらにより好ましくは約90％、最とも好ましくは約95％及びさらに最とも好ましくは約97％の同一性レベルを有する、活性ポリペプチドをコードする単離された核酸配列にも関する。２つの核酸配列間の同一性の程度は、当業界において知られているコンピュータープログラム、たとえばGCGプログラムパッケージに供給されるGAPにより決定され得る（Needleman and Wunsch，1970，Journal of Molecular Biology 48: 4 43-453）。本発明のための２つの核酸配列間の同一性の程度を決定するためには、Clustal方法（DNASTAR，Inc.，Madison，WI）が、同一性の表、10のギャップペナルティー及び10のギャップの長さと共に使用される。第３の観点においては、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約65％、好ましくは約70％、好ましくは約75％、好ましくは約80％、より好ましくは約85％、さらにより好ましくは約90％、最とも好ましくは約95％及びさらに最とも好ましくは約97％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリペプチド（この後、“相同ポリペプチド”と称する）の活性を定性的に保持する単離された核酸配列に関する。好ましい態様においては、前記相同ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列とは、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、及び最とも好ましくは１個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有する。複数のアミノ酸配列間の同一性の程度は、当業界において知られているコンピュータープログラム、たとえばGCGプログラムパッケージに供給されるGAPにより決定され得る（Needleman and Wunsch，1970，Journal of Mo lecular Biology 48: 443-453）。本発明のための２個のアミノ酸配列間の同一性の程度を決定するためには、Clustal方法（DNASTAR，Inc.，Madison，WI）が、同一性の表、10のギャップペナルティー及び10のギャップの長さと共に使用される。本発明の核酸配列によりコードされる相同ポリペプチドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失、及び／又は異なったアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸残基の置換により、配列番号２、配列番号４、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列とは異なることができる。好ましくは、アミノ酸変更はマイナーな性質のものであり、すなわちタンパク質の折りたたみ及び／又は活性に有意に影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換；典型的には１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末端延長、たとえばアミノ−末端メチオニン残基；約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチド；又は実効電荷又は他の機能、たとえばポリ−ヒスチジン系、抗原性エピトープ、又は結合ドメインの変化により精製を促進する小さな延長のものである。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（たとえば、アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（たとえば、グルタミン酸及びアルパラギン酸）、極性アミノ酸（たとえば、グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（たとえば、ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（たとえば、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（たとえば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。一般的に、比活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、そしてたとえば、H.Neurath and R.L.Hill，1979，The Proteins，Academic Pre ss，New Yorkにより記載されている。最とも通常に存在する交換は次のものである： Ala／Ser，Val／Ile，Asp／Glu，Thr／Ser，Ala／Gly，Ala／Thr，Ser／A sn，Ala／Val，Ser／Gly，Tyr／Phe，Ala／Pro，Lys／Arg，Asp／Asn，Leu／Ile ，Leu／Val，Ala／Glu，Asp／Gly及びそれらの塩。配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９に示される核酸配列、その相補的鎖又はその副配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることができる本発明の単離された核酸配列は、いづれかの属の微生物、たとえば細菌又は菌類源から得られるが、しかし好ましくは菌類細胞及びより好ましくは糸状菌細胞又は酵母細胞から得られる。本発明のためには、用語“〜から得られる”（又は〜に対して内因性の）とは、一定の源に関して本明細書において使用される場合、ポリペプチドが、前記源により、又は前記源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味する。相同遺伝子のための好ましい源は、アブシジア属及び公的な受託所から入手できるその種の株である。さらに、相同遺伝子は、上記プローブを用いて、天源のもの（たとえば土壌、水、等）から単離される微生物を包含する他の源から同定され、そして得られる。天然の生息地から微生物を単離するための技法は当業界において良く知られている。次に、核酸配列は、他の微生物のcDNAライブラリーを同様にしてスクリーニングすることによって誘導され得る。特に好ましい菌は、糸状菌、たとえばアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス(Aspergill us)、アウレオバシジウム(Aureobasidium)、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（ Humicola）、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコル(Mucor)、ミセリオプソラ（My celiophthora）、ネオカリマスティックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（ Neurospora）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム(Penicillium )、ピロマイセス(Piromyces)、シゾフィラム(Schizophyllum)、タラロマイセス( Talaromyces)、サーモアスカス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、又はトリコデルマ(Trichoderma)株、又は酵母株、たとえばカンジダ(Candida)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、ピチア（Pi chia）、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharo myces)又はヤロウィア（Yarrowia）株である。好ましい態様においては、本発明の核酸配列は、M.A.A.Schipper，Persoonia ，Vol.14，Part 2，pp.133-148(1990)に記載されるようなアブシジア属の株、たとえばアブシジア・グリセオラ、アブシジア・スポロホラ−バリアビリス、アブシジア・グリセオラvar.イグチ、アブシジア・コリムビフェラ、又はアブシジア・ブラケスレアナの株から得られる。さらにより好ましい態様においては、核酸配列は、アブシジア・ブラケスレアナNNN100826（NRR L 1304）、たとえば配列番号３に示される核酸配列；アブシジアコリムビフェラNN100062(IF0 8084)、たとえば配列番号５に示される核酸配列；アブシジア・グリセオラNN000987（ATCC 20430）；アブシジア・グリセオラvar．イグチNN000 591(ATCC 20431)、たとえば配列番号１に示される核酸配列；アブシジア・スポロホラ−バリアビリス NN102427（ATCC 36019）、たとえば配列番号７に示される核酸配列；及びアブシジア・レフレキサ（Absidia reflexa）NN102427(ATCC 4 4896)、たとえば配列番号９に示される核酸配列から得られる。アブシジア株内では、次の亜属、群、種及び株が好ましい。脂肪分解酵素を生成できる突然変異体もまた包含される。多くのこれまで認識されている種の名称がSchipper，Op．cit.，により再分類され、そして便利さのために、いくつかの株のこれまで使用されて来た名称がまた、下記に列挙される（ここで同じボックス内の複数の番号は同じ株の複数の寄託物を示す）ことを注意すること。上記株は、多くの培養物収集機関、たとえばAmerican Type Cult ure Collection(ATCC)，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkult uren GmbH(DSM)，Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、及びAgricultu ral Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Resear ch Center（NRRL）から容易に入手できる。核酸配列が上記プローブにより検出されると、前記配列は、当業者に良く知られている技法を用いて単離され又はクローン化され得る（たとえば、Sambrookなど.，前記を参照のこと）。核酸配列を単離し、又はクローン化するために使用される既知の技法は、ゲノムDNAから単離、cDNAからの調製、又はそれらの組合せを包含する。そのようなゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクローニングは、たとえば良く知られているポリメラーゼ鎖反応(PCR)を用いることによってもたらされ得る。たとえば、Innisなど.，1990，A Guide to Methods and Applica tion，Academic Press，New Yorkを参照のこと。核酸配列は、ポリペプチドを生成するアブシジア株、又は他の又は関連する生物からクローン化され得、そして従って、たとえば核酸配列のポリペプチドコード領域の対立遺伝子性変異体又は種変異体であり得る。ポリペプチドをコードする核酸配列の修飾が、ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために必要である。用語、ポリペプチドに“実質的に類似する”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を意味する。それらのポリペプチドは、その生来の源から単離されたポリペプチドとは、ある構築された手段において異なることができる。たとえば、比活性、熱安定性、酸化安定性、pH最適性又は同様のものにおいて異なる、ポリペプチドの変異体を、たとえば特定部位の突然変異誘発を用いて合成することが興味あることである。類似する配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９のポリペプチドコード領域として与えられる核酸配列、そのサブ配列に基づいて、及び／又は核酸配列によりコードされるポリペプチドの他のアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図される宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列を生ぜしめ得るヌクレオチド置換の導入により構成され得る。ヌクレオチド置換の一般的な記載のためには、たとえばFordなど.，1991，Prote in Expression and Purification 2: 95-107を参照のこと。そのような置換が分子の機能に対して決定的な領域外で行なわれるが、それでもなお活性ポリペプチドをもたらすことは、当業者に明らかであろう。本発明の単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に不可欠であり、そして従って、置換を受けにくいアミノ酸残基は、当業界において知られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−スキャンニング突然変異誘発に従って同定され得る（たとえば、Cunningham and Wells，1989，Science 24 4: 1081-1085を参照のこと）。後者の技法においては、突然変異は分子におけるあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、その分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するためにリパーゼ活性について試験される。基質−酵素相互作用の部位はまた、核磁気共鳴分析、クリスタログラフィー又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、結晶構造の分析により決定され得る（たとえば、de Vosなど.，1992，Science 255: 306-312; Smi thなど.，1922，Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaverなど. ，1992，FEBS Letters 309: 59-64を参照のこと）。本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドはまた、他のポリペプチドが前記ポリペプチド又はそのフラグメントのＮ−末端又はＣ−末端で融合される融合されたポリペプチドも包含する。融合されたポリペプチドは、本発明の核酸配列（又はその一部）に、他のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を融合することによって生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知られており、そしてポリペプチドをコードするコード配列が読取り枠を整合して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるように前記コード配列を連結することを包含する。本発明の核酸配列によりコードされる脂肪分解活性を有するポリペプチドは、アルカリ性pH（約pH９〜10）で、遊離Ca²⁺の不在下でさえ、高い活性を有することによって特徴づけられる。より特定には、それらのポリペプチドは、遊離Ca²⁺の不在下で試験される場合、約９のpH又はそれ以上のpH（pH８でよりもpH９でより高い活性を有する）で最適な脂肪分解活性を有する。ある好ましい核酸配列は、遊離Ca²⁺を伴わないでpH９で試験される場合、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。そのような脂肪分解酵素は、アブシジア亜属ミコクラダス（Mycocladus）の株、たとえば上記で列挙される種及び株から得られる。他のグループの好ましい核酸配列は、Ca²⁺の不在下でpH９よりもpH10で高い脂肪分解活性を有するポリペプチドをコードする。そのような核酸配列は、アブシジア・レフレキサNN102427（ATCC 44896）から得られる。さらなるグループの好ましい核酸配列は、pH10で、45℃で30分間のインキュベーションの後、90％以上の残留活性を保持するポリペプチドをコードする。そのような配列は、アブシジア・スポロホラ−バリアビリスの株、たとえばアブシジア・スポロホラ−バリアビリス NN102427（ATCC 36019）から得られる。核酸構成体本発明はまた、制御配列と適合できる条件下で適切な宿主細胞においてコード配列の発現を方向づけることができる１又は複数の制御配列に操作可能的に連結される本発明の核酸配列を含んで成る核酸構造体にも関する。 “核酸構成体”は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は他方では、天然に存在しない態様で組合され、そして並置される、核酸のセグメントを含むように修飾された一本鎖か又は二本鎖の核酸分子として本明細書において定義される。用語、核酸構造体は、その核酸構造体が本発明のコード配列の発現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語、発現カセットと類似語であり得る。用語“コード配列”とは、本明細書において定義される場合、適切な制御配列の制御下に置かれる場合、mRNAに転写され、そして本発明のポリペプチドに翻訳される配列である。そのコード配列の境界は一般的に、５′末端での翻訳開始コドンATG及び３′末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、DNA，cDNA、及び組換え核酸配列を包含することができるが、但しそれらだけには限定されない。本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段で操作され得る。ベクター中への挿入の前、ポリペプチドをコードする核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して所望され、又は必要とされる。クローニング方法を用いて核酸配列を修飾するための技法は、当業界において良く知られている。用語“制御配列”とは、核酸配列のコード配列の発現のために必要であり、又は好都合であるすべての成分を包含するものとして本明細書において定義される。個々の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来のものであり、又は外来性のものであり得る。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、ペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最小で、制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを供給され得る。制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいづれかの核酸配列であり、そして宿主細胞に対して相同又は非相同の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。特に細菌宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、Ｅ．コリ lacオペロン、ストレプトマイセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子（dagA）、バシラススブチリス(Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)マルトゲン性アミラーゼ遺伝子（amyM）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloli quefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バシラス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バシラススブチリスxy1A及びxy1B遺伝子、及び原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（Villa-Kamaroffなど.，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727- 3731）、及びtacプロモーター（DeBoerなど.，1983，Proceedings of the Natio nal Academy of Sciences USA 80: 21-25）である。さらなるプロモーターは、 “Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific America，1980 ，242: 74-94; 及びSambrookなど.，1989、前記に記載される。糸状菌宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸性安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ(アメリカ特許第4,288,627 号に記載される(これは引用により本明細書に組込まれる))、及びそれらのハイブリッドをコードする遺伝子から得られるプロモーターである。糸状菌宿主細胞への使用のための特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi(アスペルギラスニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド )、及びglaAプロモーターである。酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシアエ（ Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ(ENO-1)遺伝子、サッカロミセス・セレビシアエガラクトキナーゼ遺伝子（GAL1）、サッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド− ３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2／GAP)、及びサッカロミセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanosなど.，1992，Yeast 8: 423-488に記載される。哺乳類宿主細胞において、有用なプロモーターは、ウィルスプロモーター、たとえばSimian Virus 40(SV40)、ラウス肉腫ウィルス(RSV)、アデノウィルス、及びウシ乳頭腫ウィルス(BPV)からのプロモーターである。制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するために宿主細胞により認識される配列であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３′末端に操作可能的に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいづれかのターミネーターが本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラスオリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロミセスセレビシアエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエシトクロムＣ（CYC1）、又はサッカロミセス・セレビシアエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Romanosなど.，1992、前記に記載される。ターミネーター配列は、哺乳類宿主細胞のためには、当業界において良く知られている。制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５′末端に操作可能的に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいづれかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKA アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ(ENO-1)遺伝子、サッカロミセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシアエ α−因子、及びサッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３ −リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2／GAP)から得られる。制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の３′末端に操作可能的に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞により認識される配列でもあり得る。選択の宿主細胞において機能するいづれかのポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、及びアスペルギラス・ニガーα−アミラーゼをコードする遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman，1995 ，Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載される。ポリアデニル化配列は、哺乳類宿主細胞のためには、当業界において良く知られている。制御配列はまた、細胞の分泌路中に発現されたポリペプチドを方向づけることができるポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の５′末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読取り枠を整合して天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を本来、含むことができる。他方では、コード配列の５′末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード配列のその部分に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。その外来性シグナルペプチドコード領域は、そのコード配列がシグナルペプチドコード領域を通常含まない場合に必要とされ得る。他方では、その外来性シグナルペプチドコード領域は、そのコード配列と通常関連する天然のシグナルペプチドコード領域に関してリパーゼの増強された分泌を得るために天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、アルペルギラス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、リゾムコル種からのリパーゼ又はプロティナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシアエからのα−因子のための遺伝子、バシラス種からのアミラーゼ又はプロテアーゼ遺伝子、又はウシプレプロキモシン遺伝子から得られる。しかしながら、選択の宿主細胞の分泌路中に発現されたリパーゼを方向づけることができるいづれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。細菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、バシラス NCIB 11837からのマルトゲン性アミラーゼ遺伝子、バシラスステアロサーモフィラス α−アミラーゼ遺伝子、バシラスリケニホルミスサブチリシン遺伝子、バシラス・リケニホルミス β−ラクタマーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフィラス中性プロテアーゼ遺伝子（nprT，nprS，nprM）、及びバシラス・スブチリス prsA遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen and Palva，1993，Microbiologic al Reviews 57: 109-137により記載される。糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子、又はリゾムコム・ミエヘイリパーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシアエ α−因子及びサッカロミセス・セレビシアエインバーターゼのための遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanosなど.，19 92、前記により記載される。制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするポリペプチドコード領域でもあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は幾らかの場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒又は自己触媒切断により成熟活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、バシラス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE）、バシラス・スブチリス中性プロテアーゼ遺伝子（nprT）、サッカロミセス・セレビシアエ α−因子遺伝子、又はミセリオプソラ・サーモフィラム（Myceliophthora thermophilum）ラッカーゼ遺伝子(WO 95／33836)から得られる。本発明の核酸構成体または、ポリペプチドの発現において好都合である１又は複数の因子、たとえば活性化因子（たとえば、トランス作用性因子）、カペロン（chaperone）、及びプロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで成る。選択の宿主細胞において機能的であるいづれかの因子が、本発明において使用され得る。１又は複数のそれらの因子をコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸配列と必ずしもタンデムに存在する必要はない。活性化因子は、ポリペプチドをコードする核酸配列の転写を活性化するタンパク質である（Kudlaなど.，1990，EMBO Journal 9: 1355-1364; Jarai and Buxto n，1994，Current Genetics 26: 2238-244; Verdier，1990，Yeast 6: 271-297 ）。活性化因子をコードする核酸配列は、バシラス・ステアロサーモフィラス NprA（nprA）、サッカロミセス・セレビシアエヘム活性化因子タンパク質１（ hap1）、サッカロミセス・セレビシアエガラクトース代謝タンパク質４（gal4 ）、及びアスペルギラス・ニジュランスアンモニア調節タンパク質（areA）をコードする遺伝子から得られる。さらなる例については、Verdier，1990、前記、及びMackenzieなど.，1993，Journal of General Microbiology 139: 2295-23 07を参照のこと。カペロン（chaperon）は、もう１つのポリペプチドが正しく折りたたまれるように助力するタンパク質である（Hartlなど.，1994，TIBS 19: 20-25; Bergeron など.，1994，TIBS 19: 124-128; Demolderなど.，1994，Journal of Biotechno logy 32: 179-189; Craig ，1993，Science 260; 1902-1903; Gething and Sambrook，1992，Nature 355: 33-45; Puig and Gilbert，1994，Journal of Biological Chemistry 269: 7764 -7771; Wang and Tsou，1993，The FASEB Journal 7: 1515-11157; Robinsonなど.，1994，Bio／Technology 1: 381-384)。カペロンをコードする核酸配列は、バシラス・スブチリス GroEタンパク質、アスペルギラス・オリザエタンパク質ジスルフィド・イソメラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエカルネキシン（Calnexin）、サッカロミセス・セレビシアエBiP／GRP78及びサッカロミセス・セレビシアエHsp70をコードする遺伝子から得られる。さらなる例に関しては、Gething and Sambrook，1992、前記及びHartlなど.，1994、前記を参照のこと。プロセッシングプロテアーゼは、生化学的に活性的な成熟ポリペプチドを生成するためにプロペプチドを分解するプロテアーゼである(Enderlin and Ogrydzia k，1994，Yeast 10: 67-79; Fullerなど.，1989，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Juliusなど.，1984，Cell 37: 1075 -1089; Juliusなど.，1983，Cell 32: 839-852)。プロセッシングプロテアーゼをコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシアエジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロミセス・セレビシアエ Kex2及びヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)二塩基性プロセッシングエンドプロテアーゼ（xpr6）をコードする遺伝子から得られる。宿主細胞の増殖に関してポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こすものである。原核系における調節システムは、lac，tac及びtrpオペレーターシステムを包含する。酵母においては、ADH2システム又はGAL1システムが使用され得る。糸状菌においては、TAKAα−アミラーゼプロモーター、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼプロモーター及びアスペルギラス・オリザエグルコアミラーゼプロモーターが、調節配列として使用され得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核系においては、それらはメトトレキセートの存在下で増殖されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列とタンデムに配置される。発現ベクター本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記種々の核酸及び制御配列は、１又は複数の便利な制限部位を、そのような部位でのポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするために含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明の核酸配列は、核酸配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、コード配列がベクターに配置され、その結果、前記コード配列は発現のために、及びたぶん分泌のために適切な制御配列と共に操作可能的に連結される。組換え発現ベクターは、組換えDNA方法により便利にゆだねられ、そして核酸配列の発現を引き起こすことができるいづれかのベクター（たとえば、プラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とそのベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環された環状プラスミドであり得る。ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である染色体外存在物、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体として存在するベクターであり得る。ベクターは、自己複製を確保するためのいづれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る。ベクターシステムは、単一のベクター又はプラスミド、又は宿主細胞のゲノム中に導入されるべき全DNAを一緒に含む複製のベクター又はプラスミド、又はトランスポゾンであり得る。本発明のベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ得る。組込みのためには、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、又は相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組込みのためのベクターのいづれか他の要素に依存する。他方では、ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組込みを方向づけるための追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体における正確な位置での宿主細胞ゲノム中へのベクターの組込みを可能にする。正確な位置での組込みの見込みを高めるためには、組込み要素は好ましくは、相同組込みの可能性を高めるためにその対応する標的配列と高い相同性である十分な数の核酸、たとえば100〜1,5 00の塩基対、好ましくは400〜1,500の塩基対、及び最とも好ましくは800〜1,500 の塩基対を含むべきである。組込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける核酸配列と相同であるいづれかの配列であり得る。さらに、組込み要素は、非コード、又はコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組込まれ得る。それらの核酸配列は、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同であるいづれかの配列であり、そしてさらに、非コード又はコード配列であり得る。自律複製のためには、ベクターは、問題の宿主細胞においてベクターの自律的複製を可能にする複製の起点をさらに包含することができる。複製の細菌起点の例は、Ｅ．コリにおける複製を可能にするプラスミドpBR322，pUC19，pACYC177 及びpACYC184、及びバシラスにおける複製を可能にするpUB110，pE194，pTA1060 及びpAMβ1の複製の起点である。酵母細胞への使用のための複製の起点の例は、複製の２ミクロン起点、CEN6及びARS4の組合せ、及びCEN3及びARS1の組合せである。複製の起点は、宿主細胞においてその機能を感温性にする突然変異を有する起点であり得る(たとえば、Ehrlich，1978，Proceedings of the National Acad emy of Sciences USA 75: 1433)。特定の態様においては、発現ベクターは、pZL -NL1，pZL-NL61，pZL-NL95又はpZL-NL124であり得る。本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、殺生物又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、原栄養性〜栄養要求性及び同様のものを供給する生成物の遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、バシラススブチリス又はバシラスリケニホルミスからのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、たとえばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。頻繁に使用される哺乳類マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子である。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2，HIS3，LEU2，LY S2，MET3，TRP1及びURA3であり得る。糸状菌宿主細胞への使用のための選択マーカーは、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hygB（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸塩レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸塩アデニルトランスフェラーゼ）、trpC（アントラニル酸シンターゼ）、及びグルホシネート耐性マーカー、並びに他の種からの同等物から成る群から選択され得るが、但しそれらだけには限定されない。アスペルギラス細胞への使用のためには、アスペルギラスニジュランス又はアスペルギラスオリザエのamdS及びpyrGマーカー、及びストレプトミセスヒグロスコピカス（Streptmyces hygr oscopicus）のbarマーカーが好ましい。さらに、選択は、選択マーカーが別のベクター上に存在する場合、WO 91／17243に記載されるように、同時形質転換により達成され得る。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の１つ以上のコピーが、その核酸配列の発現を増幅するために宿主細胞中に挿入され得る。核酸配列の安定した増殖は、当業界において良く知られている方法を用いて、前記配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノム中に組込み、そして形質転換体について選択することによって得られる。本発明の組換え発現ベクターを構成するための上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Sambrookなど.，1989、前記を参照のこと）。宿主細胞本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成に都合良く使用される、本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主細胞にも関する。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために親細胞と同一ではない、親細胞のいづれかの子孫を包含する。細胞は好ましくは、本発明の核酸配列を含んで成るベクターの宿主染色体中への組込みにより形質転換される。“形質転換”とは、本発明の核酸配列を含んで成るベクターを、そのベクターが染色体組込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう、宿主細胞中に導入することを意味する。組込みは一般的に、核酸配列がより効果的に細胞において安定して維持される場合、好都合であると思われる。宿主染色体中へのベクターの組込みは、上記のように相同又は非相同組換えを生ぜしめる。宿主細胞の選択は、ポリペプチド又はその源をコードする遺伝子にかなりの程度依存するであろう。宿主細胞は、単細胞微生物、たとえば原核生物又は非単細胞微生物、たとえば真核生物であり得る。有用な単細胞は、細菌細胞、たとえばグラム陽性細菌、たとえばバシラス細胞、たとえばバシラス・アルカロフィラス (Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus am yloliquefaciens）、バシラス・ブレビス(Bacillus brevis)、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagu lans）、バシラス・ファーマス(Bacillus firmus)、バシラス・ラウタス(Bacill us lautus)、バシラスレンタス(Bacillus lentus)、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium )、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バシラス・サブチリス(Bacillus subtili s)、及びバシラス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）；又はストレプトミセス細胞、たとえばストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces livida ns)又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）、又はグラム陰性細菌、たとえばＥ．コリ、及びプソイドモナスsp.(Pseudomonas sp.)であるが、但しそれらだけには限定されない。好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、バシラス・レンタス、バシラス・リケニホルミス、バシラス・ステアロサーモフィラス又はバシラス・サブチリス細胞である。細菌宿主細胞の形質転換は、プロトプラスト形質転換により（たとえば、Ch ang and Cohen，1979，Molecular General Genstics 168: 111-115を参照のこと）、コンピテント細胞を用いることにより（たとえば、Young and Spizizin，19 61，Journal of Bacteriology 81: 823-829、又はDubnau and Davidoff-Abelson ，1971，Journal of Molecular Biology 56: 209-221を参照のこと）、エレクトロポレーションにより（たとえば、Shigekawa and Dower，1988，Biotechnigues 6: 742-751を参照のこと）、又は接合により（たとえば、Koehler and Thome， 1987，Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照のこと）、もたらされ得る。宿主細胞は、真核生物、たとえば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞又は菌類細胞であり得る。有用な哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、H eLa細胞、子供ハムスター腎臓(BHK)細胞、COS細胞、又はたとえばAmerican Type Calture Collectionから入手できるいづれかの数の他の不滅化された細胞系を包含する。好ましい態様において、宿主細胞は菌類細胞である。“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ(Bas idiomycota)、キトリジオミコタ(Chytridiomycota)及びザイゴミコタ(Zygomycot a)(Hawksworthなど.，Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi，8th e dition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UKにより定義されるような)、及びオーミコタ(Oomycota)(Hawksworthなど.，1995、前記、1 71ページに引用されるような)、並びにすベてのマイトスポリック菌類（Hawkswo rthなど.，1995、前記）を包含する。アスコミコタの代表的な群は、たとえばニューロスポラ（Neurospora）、エウペニシリウム(Eupenicillium)(＝ペニシリウム)、エメリセラ(Emericella )(＝アスペルギラス)、ユーロチウム(Eurotium)(＝アスペルギラス)、及び上記に列挙される真の酵母を包含する。バシジオミコタの例は、マッシルーム、サビ菌及び黒穂病菌を包含する。キトリジオミコタの代表的な群は、たとえばアロミセス(Allomyces)、ブラストクラジエラ(Blastocladiella)、コエロモミセス（Co elomomyces）及び水性菌類を包含する。オーミコタの代表的な群は、たとえばサプロレグニオミセトウス（Saprolegniomycetous）水性菌類（水性カビ）、たとえばアクリヤ（Achlya）を包含する。マイトスポリック菌類の例は、アスペルギラス、ペニシリウム、カンジダ及びアルテルナリア（Alternaria）を包含する。ザイゴミコタの代表的な群は、たとえばリゾパス（Rhizopus）及びムコル(Mucor )を包含する。好ましい態様においては、菌類宿主細胞は、酵母細胞である。“酵母”とは、本明細書において使用される場合、子ノウ胞子性酵母(エンドミセタル(Endomyce tals))、担子胞子性酵母、及び不完全菌類(ブラストミセテス(Blastomycetes)に属する酵母を包含する。子ノウ胞子性酵母は、科スペルモフソラセアエ(Spermop hthoraceae)及びサッカロミセタセアエ（Saccharomycetaceae）に分けられる。後者は、４種の亜科、すなわちシゾサッカロミコイデアエ(Schizosaccharomycoi deae)(たとえば属シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces))、ナドソニオイデアエ(Nadsonioideae)、リポミコイデアエ(Lipomycoideae)及びサッカロミコイデアエ(Saccharomycoideae)(たとえば属ピチア（Pichia）、クルイベロミセス(Klu yveromyces)及びサッカロミセス)から成る。担子胞子性酵母は、属ロイコスポリジム(Leucosporidim)、ロドスポリジウム（Rhodosporidi um）、スポリジオボラス（Sporidibolus）、フィロバシジアム（Filobasidium）及びフィロバシジエラ（Filobasidiella）を包含する。不完全菌類に属する酵母は、２種の科、すなわちスポロボロミセタセアエ(Sporobolomycetaceae)(たとえば属ソロボロミセス(Sorobolomyces)及びブレラ(Ballera))及びクリプトコカセアエ(Cryptococcaceae)(たとえば属カンジダ)に分けられる。酵母の分類は未来では変化するので、本発明のためには、酵母は、Biology and Activities of Ye ast（Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds.，Soc.App.B acteriol.Symposium Series No.9，1980）に記載されるようにして定義されるであろう。酵母の生物学及び酵母遺伝学の操作は当業界において良く知られている（たとえば、Biochemistry and Genetics of Yeast，Bacil，M.，Horecker，B.J .，and Stopani，A.O.M.，editors，2nd edition，1987; The Yeasts，Rose，A. H.，and Harrison，J.S.，editors，2nd edition，1987; 及びThe Molecular Bi ology of the Yeast Saccharomyces，Strathernなど.，editors，1981を参照のこと）。より好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、カンジダ、クルイベロミセス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ピチア又はヤロウィアの種の細胞である。最とも好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス(Saccharomyc es diastaticus)、サッカロミセス・ドウグラスチ（Saccharomyces douglastii ）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)又はサッカロミセス・オビホルミス( Saccharomyces oviformis)細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)細胞である。好ましい態様において、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”は、細分割のユーマイコタ（Eumycota）及びオーミコタ（Oomycota）のすべての糸状形を包含する（Hawksworthなど.，1995、前記により定義されるような）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複雑な多糖類から構成される活性菌糸体により特徴づけられる。活性増殖は、菌糸拡張によるものであり、そして炭素異化作用は偏性好気性である。対照的に、酵母、たとえばサッカロミセスセレビシアエによる活性増殖は、単細胞葉状体の発芽によってであり、そして炭素異化作用は発酵性であり得る。より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギラス、フサリウム、ヒュミコラ、ムコル、ミセリオプソラ、ネウロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラジウム及びトリコダーマの種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。さらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はフサリウム細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はヒュミコラ細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ムコル細胞である。もう１つのさらに好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ミセリオプソラ細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ネウロスポラ細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はペニシリウム細胞である。さらにもう１つの好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、チエラビア細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はトリポクラジウム細胞である。もう１つのさらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、トリコダーマ細胞である。最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラスアワモリ、アスペルギラスホエチダス、アスペルギラスジャポニカス、アスペルギラスニジュランス、アスペルギラスニガー又はアスペルギラスオリザエ細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フサリウム・クロークウエレンセ（F usarium crookwellense）、フサリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearu m）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・サムブシナム(Fusarium sambucinum)又はフサリウム・スルフレウム(Fusarium sulph ureum)細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ヒュミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、又はヒュミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はムコリ・ミエヘイ細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ミセリオプソラ・サーモフィラム(Mycel iophthora thermophilum)細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ネウロスポラ・クラサ(Neurospora crassa)細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）細胞である。もう１つの最とも好ましい態様においては、トリコダーマ細胞は、トリコダーマ・ハルジアナム(T richoderma harzianum)、トリコダーマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコダーマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrochiatum)、トリコダーマ・レセシ（Trichoderma reesei）又はトリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。菌類細胞は、それ自体既知の態様でのプロトプラスド形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を包含する方法により形質転換され得る。アスペルギラス細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023号及びYe ltonなど.，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474に記載される。フサリウム種を形質転換するための適切な方法は、Ma lardierなど.，1989，Gene 78: 147-156又は継続アメリカ特許出願番号08／269, 449(それらは引用により本明細書に組込まれる)により記載される。酵母は、Bec ker and Guarente，In Abelson，J.N．and Simon，M.I.，editors，Guide to Ye ast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，p p 182-187，Academic Press，Inc.，New York，Itoなど.，1983，Journal of Ba cteriology 153: 163; 及びHinnenなど.，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920により記載される方法を用いて形質転換され得る。哺乳類細胞は、Graham and Van der Eb(1978，Virology 52: 546)のリン酸カルシウム沈殿法を用いての直接的な取り込みにより形質転換され得る。生成方法本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの発現の助けとなる条件下で宿主細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。それらの方法においては、細胞は、当業界において知られている方法を用いてポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。たとえば、細胞は、適切な培地において及びポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下で実施される実験室又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給−バッチ又は固形状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、当業界において知られている方法を用いて実施される（たとえば、細胞及び酵母のための文献；Bennett，J.W．and LaSure，L.，editors，M ore Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991を参照のこと）。適切な培地は市販されており、又は公開された組成物（たとえば、American T ype Culture Collectionのカタログにおける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドはその培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消出を包含することができる。たとえば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。リパーゼ活性の生成は、当業界において知られているいづれかの方法により決定され得る。１つの方法においては、１リパーゼ単位（LU）は、基質としてトリブチリン及び乳化剤としてアラビアゴムを用いて、30℃、pH 7.0 （リン酸緩衝液）で１分当たり1.0μモルの滴定できる脂肪酸を生成する酵素の量である。pH７〜10の範囲での遊離Ca²⁺の非存在下での脂肪分解酵素活性は、特定されたpHで、オリーブ油：２％ PVA溶液（１：３）の基質エマルジョンにより 40℃で10分間試験される。反応の最後で、反応混合物は、クロロホルム：メタノール（１：１）により酸性条件下で抽出され、そしてその反応の間に開放される脂肪酸はTLC-FID反応(Iatroscan)により測定される。１OPID単位(OPIDU)は、１分当たり1.0μモルの脂肪酸の開放として取られる。個々の試験においては、10m MのEDTAが、200mMの緩衝液（pH７及び８でのトリス−HCl緩衝液、pH８，９及び1 0でのジエタノールアミン緩衝液）と共に使用される。得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。たとえば、ポリペプチドは、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿（但しこれらだけには限定されない）法により栄養培地から回収され得る。次に、回収されたポリペプチドはさらに、種々のクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は同様のものにより精製され得る。本発明のポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、たとえばクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法(たとえば、分離用等電点電気泳動(IE F))、示差溶解性（たとえは硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出(たとえば、Prot ein Puritication，J.-C．Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers， New York，1989を参照のこと)(但し、それらだけには限定されない)により精製され得る。用途本発明の核酸配列によりコードされる組換えポリペプチドは、特に高いpHで、脂肪分解酵素の従来の用途、たとえば洗濯及び皿洗い用洗剤、研究及び産業用清浄及び革の加工に使用され得る。本発明の脂肪分解酵素はまた、エステル交換、脂肪及び油の完全な加水分解、及び光学異性体分解工程のためにも使用され得る。本発明は、次の例によりさらに記載されるが、但しそれらは本発明を限定するものではない。例例１：ゲノム DNA抽出アブシジア・グリセオラNN000987(ATCC 20430)、アブシジア・スポロホラ−バリアビリスNN102427(ATCC 36019)、アブシジア・グリセオラvar．イグチNN00059 1(ATCC 20431)、アブシジア・コリムビフェラNN100062(IFO 8084)及びアブシジア・ブラケスレアナNN100826（NRRL 1304）を、32℃及び250rpmで24時間、0.5％酵母抽出物−２％グリコース(YEG)培地25mlにおいて個々に増殖させた。次に、個々の培養物からの菌糸体を、Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)を通しての濾過により集め、そして10mMのトリス−0.1ＭのEDTA（TE）緩衝液25mlにより１度洗浄した。過剰の緩衝液を、菌糸体調製物から排水し、続いて液体窒素により凍結した。凍結された菌糸体調製物を電気コーヒーグラインダーにより細かな粉末に粉砕し、そしてその粉末を、TE緩衝液20ml及び20％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム(SDS)５mlを含む使い捨てプラスチック遠心分離管に個々に添加した。その混合物を数回、軽く逆さにし、混合を確保し、そして等体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１ｖ／ｖ／ｖ）により２度抽出した。酢酸ナトリウム（３Ｍ溶液）を抽出されたサンプルに添加し、0.3Ｍの最終濃度にし、続いて2.5体積の氷冷却エタノールを添加し、DNAを沈殿せしめた。管を15,000×ｇで30分間、遠心分離し、DNAをペレット化した。DNAペレットを30 分間、空気乾燥せしめ、その後、0.5mlのTE緩衝液に再懸濁した。DNアーゼフリーのリボヌクレアーゼＡを、前記再懸濁されたDNAペレットに添加し、100μｇ／ mlの濃度にし、そしてその混合物を37℃で30分間インキュベートした。プロティナーゼＫ（200μｇ／ml）を添加し、そして個々の管をさらに１時間37℃でインキュベートした。最終的に、個々のサンプルをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１ｖ／ｖ／ｖ）により２度抽出し、その後、酢酸ナトリウム及びエタノールによりDNAを沈殿せしめた。DNAペレットを真空下で乾燥せしめ、TE緩衝液に再懸濁し、そして４℃で貯蔵した。例２：アブシジア・グリセオラ NN000987及びアブシジア・グリセオラ var．イグチNN000591 リパーゼ遺伝子セグメントの PCR増幅デンマーク特許出願95／00424（この内容は引例により本明細書に組込まれる）においてGormsenなどにより開示されるようにアブシジア・グリセオラNN00098 7リパーゼ及びアブシジア・グリセオラvar．イグチNN000591リパーゼのアミノ酸配列に基づいて、下記に示されるオリゴヌクレオチドプライマーを、アブシジア・グリセオラNN000987及びアブシジア・グリセオラvar．イグチNN000591からリパーゼ遺伝子フラグメントをPCR増幅するために、製造業者の説明書に従って、A pplied Biosystems Model 394 DNA／RNA Synthesizerにより合成した（注：Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｉ−イノシン、Ｙ＝Ｔ又はＣ、Ｈ＝Ａ又はＴ又はＣ、及びＮ＝Ａ又はＴ又はＣ又はＧ）：１．前方向プライマーアミノ酸配列：GluThrGluIleGlnAlaHisThrPhe（配列番号11）オリゴヌクレオチド（＋鎖）：5′-GARACIGARATHCARGCICAYACITT- 3′（配列番号12）２．逆方向プライマーアミノ酸配列：ProProGlyAlaPheGlyPheLeu（配列番号13）オリゴヌクレオチド（−鎖）：5′-ARRAANCCRAAIGCNCCIGGNGG-3′ （配列番号14）増幅反応物(100ml)を、約１μｇのアブシジア・グリセオラNN000987又はアブシジア・グリセオラvar．イグチNN000591ゲノムDNAを鋳型として用いて調製した。個々の反応物は次の成分を含んだ：１μｇのゲノムDNA、40ｐモルの前方向プライマー、40ｐモルの逆方向プライマー、200mMの個々のdATP，dCTP，dGTP及びd TTP、１×Taqポリメラーゼ緩衝液（Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ）、及び５単位のTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ）。無菌の鉱油(100μｌ)を個々の反応混合物の上部に積層し、そしてその反応物を次のようにプログラムされたPerkin-Elmer Model 480 Thermal Cyclerにおいてインキュベートした：サイクル１＝95℃で５分間、45℃で２分間、及び67℃で５分間；サイクル２：30〜95℃で２分間、45℃で２分間、及び67℃で２分間、及び４℃でのソークサイクル。反応生成物を１％低溶融点アガロースゲル(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)上で単離し、そして個々の反応からの主要PCR生成物バンドを、製造業者の説明書に従って、β−アガラーゼ（New England Biolabs，Bever ly，MA）を用いてゲルから切り出し、そして精製した。精製されたPCR生成物を続いて、pCRIIベクタ(Invitrogen，San Diego，CA)中にクローン化し、そしてDN A配列をlac前方向及び逆方向プライマー（New England BioLabs，Beverly，MA）を用いて決定した。約870bpのリガーゼ遺伝子セグメントを、図１に示されるように、上記リパーゼ特異的PCRプライマーによりアブシジアグリセオラNN000987及びアブシジアグリセオラvar．イグチNN000591から増幅した。DNA配列分析は、増幅された遺伝子セグメントがその対応するアブシジアリパーゼ遺伝子の一部をコードすることを示した。さらに、DNA配列データは、それらの２つの遺伝子生成物がたぶん同一であり、そしてリゾムコルミエヘイリパーゼと相同性の領域を共有すことを確かめた。例３：ゲノム DNAのハイブリダイゼーション分析例１に記載される５種のアブシジア株から調製された全細胞DNAサンプルを、サザンハイブリダイゼーション(Maniatisなど.，1982，Molecular Cloning，A L aboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York )により分析した。約２〜５μｇの個々のDNAサンプルを、EcoRＩ，Asp718Ｉ又は EcoRＩ＋Asp718Ｉにより消化し、そして１％アガロースゲル上で分別した。ゲルを短い波長のUV光下で写真を取り、そして0.5ＭのNaOH−1.5ＭのNaCl、続いて1. 5ＭのNaCl−１Ｍのトリス−HCl pH８において15分間ソークした。ゲルにおけるD NAを、Davisなど(1980，Advanced Bacterial Genetics，A Manual for Genetic Engineering，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York）に従って、20×SSPE（３Ｍの塩化ナトリウム−0.2Ｍの二塩基性リン酸ナトリウム −0.02Ｍの二ナトリウムEDTA）における細管ブロットによりNytranQハイブリダイゼーション膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上にトランスファーした。D NAを、UV Stratalinker(Stratagene，La Jolla，CA)を用いて膜上に架橋し、そして膜を、軽く撹拌しながら、45℃で次のハイブリダイゼーション緩衝液において２時間ソークした：５×SSPE、35％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、0.3％ SDS、及び200mg／mlの変性され、そして剪断されたサケ精子DNA。例２に記載されるアブシジアグリセオラNN000987 PCR−クローンから単離されたリパーゼ特異的プローブフラグメントを、〔³²Ｐ〕dCTP(Amersham，Arlington Heights，IL )によるニックトランスレーションにより放射性ラベルし（Maniatisなど.，1982 、前記）、0.1Ｍの最終濃度にNaOHを添加することによって変性し、そして緩衝液１ml当たり約１×10⁶個のcpmの活性でハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。混合物を、振盪水溶において45℃で一晩インキュベートした。インキュベーションに続いて、膜を0.1％のSDSを含む0.2×SSPEにより45℃で１度洗浄し、続いて、0.2×SSPE(SDSを含まない)により同じ温度で２度洗浄した。膜を、紙タオル上で15分間、乾燥せしめ、次にSaran-Wrap^TMで包装し、そして−70℃で一晩、Ｘ線フィルムに増強スクリーン（Kodak，Rochester，NY）を伴って照射した。アブシジア・グリセオラvar．イグチNN000591からのPCR−由来のリパーゼ遺伝子セグメントプローブを用いての中位の緊縮性の条件下でのサザンブロットによるアブシジア種の個々からの全細胞DNAサンプルの分析は、試験されたすべてのアブシジア種のリパーゼ遺伝子がプローブに交差ハイブリダイズしたことを示した（図２）。試験されたすべての種はまた、約2.1kbのEcoRＩ消化物における単一のハイブリダイゼーションシグナルを示し、但し、４kbのバンドを有するハイブリダイゼーションシグナルを付与したアブシジアスポロホラ−バリアビリス NN102427を除く。さらに、試験されたすべての種はそれらのゲノムにその対応するリパーゼ遺伝子の単一コピーを含むと思われる。例４：リパーゼクローンの DNAライブラリー及び同定富化されたゲノムDNAライブラリーを、バクテリオファージクローニングベクターIZipLox（Life Technologies，Gaithersburg，MD）において構成した。最初に、全細胞DNAをEcoRＩにより消化し、そして１％アガロースゲル上でサイズ分別した。例３に記載されるサザンブロット上に、以前観察されたハイブリダイゼーションシグナルに対応するサイズ範囲で移動するDNAフラグメントを切り出し、そしてPrep-a-Gene試薬(BioRad Laboratorise，Hercules，CA) を用いてゲルから溶離した。それらの画分におけるDNAフラグメントのおおよそのサイズは次の通りであった：1.9〜2.5kb(アブシジア・グリセオラvar．イグチ NN000591)、1.9〜2.5kb(アブシジア・ブラケスレアナNN100826)、1.9〜2.5kb(アブシジア・コリムビフェラNN100062)及び2.5〜4.3kb(アブシジア・スポロホラーバリアビリスNN102427)。溶離されたDNAフラグメントをEcoRＩ−切断され、そして脱リン酸化されたλZipLoxベクターアーム(Life Technologies，Gaithersburg ，MD)により連結し、そしてその連結混合物を市販のパッケージング抽出物（Str atagene，La Jolla，CA）を用いてパッケージした。そのパッケージされたDNAライブラリーをプレートし、そしてＥ．コリY1090ZL細胞(Life Technologies，Gai thersburg，MD)において増幅した。個々のライブラリーにおける組換えファージの力価は、1.3〜5.4×10⁵pfu／mlの範囲であった(DNAを含まないバックグラウンド力価は1.7〜2.0×10⁴pfu／mlであった)。個々の増幅されていないライブラリーからの約15,000〜30,000のプラークを、プローブとしてアブシジアグリセオラNN000987からのリパーゼ特異的PCRフラグメントを用いてプラークーハイブリダイゼーションによりスクリーンした(Davisなど.，1980、前記)。プローブとの強いハイブリダイゼーションシグナルを付与するプラークを、Ｅ．コリY1090ZL 細胞において２度精製し、そして続いて、リパーゼ遺伝子をpZL1−誘導体(D'Ale ssioなど.，1 換えDNAセグメントを前記ベクターのファージミドpZL1部分内に挿入し、そしてそのクローン化された挿入体を有するファージミドを、Ｅ．コリDH10Bzip細胞(L ife Technologies，Gaithersburg，MD)の感染によるインビボ切断を用いて自律的に複製するpZL1において回収した。この態様で単離されたリパーゼクローンを、Wizard 373 DNA精製キット（Promega，Madison，WI）を用いて、DNA配列決定分析のために調製した。例５：リパーゼ遺伝子の DNA配列分析例４に記載されるリパーゼクローンのDNA配列決定を、色素−ターミネーター化学(Gieseckeなど.，1992，Journal of Virol.Methods 38: 47-60)と共にプライマーウォーキング技法（Primer walking technique）を用いて、両鎖に対して Applied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequencer（Applied Biosystem s，Inc.，Foster City，CA）により実施した。オリゴヌクレオチド配列決定プライマーを、製造業者の説明書に従って、Applied Biosystems Model 394 DNA／RN A Synthesizer上で合成した。アブシジアリパーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、図３〜６に示される（配列番号１，３，５及び７）。個々の遺伝子内のイントロンの割り当ては、（ａ）ペプチドフラグメントに由来する既知のアミノ酸配列(Boelなど.， 1988，Lipids 23: 701-706)、（ｂ）リゾムコル・ミエヘイリパーゼの推定されるアミノ酸配列（配列番号15）との整合性(Gurrなど.，Kinghorn，J.R．〔ed 〕，Gene Structure in Eukaryotic Microbes，pp.93-139，IRL Press，Oxford) 、及び（ｃ）糸状菌のイントロンについての既知のコンセンサス配列(von Heijn e，1984，Journal of Molecular Biology 173: 243-251)に基づいた。アブシジア・レフレキサリパーゼをコードする遺伝子を単離するために、アブシジア・レフレキサNN102427(ATCC 44896)の株を、誘発成分としてホホバ油を含む最適培地上で培養した。cDNAライブラリーをこの株から調製し、そしてプローブとして上記アブシジア・コリムビフェラ遺伝子を用いて、cDNAクローンをコロニーハイブリダイゼーションにより同定した。アブシジア・レフレキサ遺伝子の配列は図７（配列番号９）に供給されている。このリパーゼは、アブシジア・スポロホラ−バリアビリスリパーゼと約99％の同一性を有する。例６：アブシジア種からのリパーゼ遺伝子の比較アブシジア・リパーゼ遺伝子間のイントロン−エキソン構成は、表１に示されるように、すべてが７個のエキソン及び６個のイントロンからすべて構成されることにおいてひじょうに類似する。エキソン２〜６のサイズは、厳密に保存される。最初のエキソンは、酵素のシグナルペプチド及びプロペプチド部分をコードする領域におけるいくらかの変動性のためにサイズのわずかな変化性を示す。さらに、対応するエキソン間のヌクレオチド配列相同性はまた、ひじょうに高く、そして85〜97％の同一性を有する。対照的に、イントロンの長さは多様であり、そしてアブシジア・コリムビフェラNN100062及びアブシジア・スポロホラ−バリアビリスNN102427リパーゼ遺伝子を除いて、対応するイントロン間での配列相同性はほとんど存在しない。リパーゼ遺伝子の５′及び３′側フランキング配列はまた、配列逸脱（divergence）を示す。推定されるアミノ酸配列（配列番号２，４，６，８及び10）に基づいて、アブシジアリパーゼの生化学及び生物物理学的性質の比較が、表２に示される。すべての４種のリパーゼは、すべてが、17〜21個のアミノ酸のシグナルペプチド、 52〜56個のアミノ酸のプロペプチド及び264〜265個のアミノ酸の成熟酵素を含んで成り、そして、グリコシル化されていないタンパク質について約29,000の分子量を有する、337〜338個のアミノ酸のプレプロ酵素として合成されることにおいて非常に類似する。計算された等電点は6.10〜6.94であり、そして最ともアルカリ性は、アブシジア・スポロホラーバリアビリスからのリパーゼである。それらの計算された等電点は、たぶん、すべての荷電された残基がタンパク質の暴露された３次元表面上に存在するとはかぎらない結果として、IEFゲル(Gormsenなど. ，デンマークの特許出願第95／00424号を参照のこと)上に実験的に観察されるそれらの等電値よりもかなり低い。アブシジアリパーゼは、お互い間の広範なアミノ酸配列相同性を87〜96％の同一性で共有し、そしてリゾムコル・ミエヘイリパーゼ（配列番号15）は53〜 55％の同一性の限定された相同性を有し、そしてヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ（配列番号16）は、22〜24％の同一性の相同性を有する（表３及び図８に示される）。系統分類的観点から、アブシジアリパーゼは、菌類のザイゴミセート（Zygo mycete）門の他のメンバーからのリパーゼに最とも親密に関連している。酵母、細菌及び哺乳類リパーゼ、並びに菌類クチナーゼは、あったとしても、ひじょうに遠隔して関連しているように見える。例７：アブシジア・コリムビフェラリパーゼ遺伝子の発現上記アブシジア・コリムビフェラリパーゼ遺伝子のクローン及びヌクレオチド配列を、アスペルギラス宿主における遺伝子のサブクローニング及び発現のために使用した。PCRを、ヌクレオチド配列から企画されたプライマーを用いて、単離されたゲノムクローンNL95Aからのリパーゼ遺伝子（それ自体のプロモーターを有さない）をサブクローン化するために使用した。pBANe6と称する発現ベクター（図９）中への遺伝子フラグメントのサブクローニングを促進するために、前記遺伝子の５′及び３′末端で、それぞれSwaＩ及びPacＩ制限酵素部位を導入した。ベクターpBANE6は、調節配列として、TAKAプロモーター、NA2-tpiリーダー及びAMGターネーターを含んだ。プラスミドはまた、菌類形質転換のための選択マーカーとしてアスペルギラスニジュランスamdS遺伝子を含んだ。次のプライマーが、PCR増幅のために使用された：前方向プライマー： 5′-CCCATTTAAATATGCGTTTTTATTCAGTAGTATCAT- 3′（配列番号17）逆方向プライマー： 5′-CTCGGCTTAATTAAAATGGGTTATAAGCAGAGACCAG TG-3′（配列番号18）。 PCRを、製造業者の規格に従って、Pwoポリメラーゼ（Boehringer Mannheim，I ndianapolis IN）を用いて実施した。PCR増幅された生成物を、ゲル単離し、Swa Ｉ及びPacＩ酵素により切断し、そしてゲル精製した。精製されたフラグメントをpBANe6ベクター(SwaＩ及びPacＩによりすでに切断されている)に連結し、リパーゼ遺伝子の転写がTAKAプロモーターの制御下にあるプラスミドpKB2（図10）を生成した。プラスミドpKB2を用いて、Ｅ．コリDH5細胞を形質転換した。pKB2プラスミドを含むＥ．コリ形質転換体を単離し、そしてプラスミドDNAをアスペルギラスにおける形質転換及び発現のために調製した。プロトプラストを、宿主株のamdS遺伝子が欠失されているアスペルギラスオリザエ株BANe3から調製した。プロトプラスト調製及び形質転換を、前に記載されたようにして(Christensenなど.，前記)、実施した。アセトアミダーゼを発現するアスペルギラスオリザエ形質転換体を、単独の窒素源としてアセトアミドを用いるそれらの能力に基づいて選択した。合計42の形質転換体を生成し、そして胞子を選択プレート上で２度、精製した。胞子精製された形質転換体を、さらなる分析のために使用した。形質転換体を、１ｌ当たりマルトース50ｇ、2.0ｇのMgSO₄・7H₂O、10ｇのKH₂P O₄、2.0ｇのK₂SO₄、2.0ｇのクエン酸、10ｇの酵母抽出物、0.5mlの微量金属溶液及び2.0ｇの尿素を含む培地を用いて、振盪フラスコ(125mlのフラスコにおいて2 5mlの培地)における培養によりリパーゼ発現のためにスクリーンした。微量金属溶液は、１ｌ当たり14.3ｇのZnSO₄・7H₂O、2.5ｇのCuSO₄・5H₂O、0.5ｇのNiCl₂ ・6H₂O、13.8ｇのFeSO₄・7H₂O、8.5ｇのMnSO₄・H₂O及び3.0ｇのクエン酸から構成された。培地のpHを6.5に調節し、その後、オートクレーブにより殺菌した。フラスコを新しく収穫された胞子により接種し、そして34℃及び200rpmでインキュベーターにおいてインキュベートした。培養物を、培養の48時間後、毎日、リパーゼ活性について毎日アッセイした。このリパーゼのための適切な基質については何ら知られていないので、酵素活性を、次の３種の方法によりアッセイした：ｉ）基質としてオリーブ油を用いてのリパーゼプレートアッセイ、ii）基質としてｐ−ニトロフェニルブチレートの比色的使用、及びiii）トリブチリン（酪酸のトリグリセリド）を用いての滴定。リパーゼプレートアッセイを、次のものを含むプレート培地を用いて実施した：0.1Ｍのトリス、pH 9.0、0.1ＭのCaCl₂、１％のTriton X-100、0.5％のオリーブ油及び2.0％のアガロース。培地をオートクレーブし、そしてプレート当たり5 0〜60mlを用いて150mmのプレートに注いだ。アガロースの固化の後、プレート当たり15のウェルを製造し、そして培養物ブイヨン25mlを個々のウェルに添加した。形質転換されたアスペルギラスオリザエ株BANe3からの培養物ブイヨンを、対照として使用した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。形質転換体におけるリパーゼ活性の存在を、ウェルのまわりの透明な領域として同定した。形質転換されていない株からの培養物ブイヨンにより負荷された対照ウェルは、そのような透明部分を示さず、これは形質転換体においてのみリパーゼ活性の存在を示す。リパーゼ活性をまた、基質としてｐ−ニトロフェニルブチレートを用いて、比色的に測定した。ｐ−ニトロフェニルブチレートを、1.0mlのジメチルスルホキシド（DMSO）及び0.1Ｍのトリス緩衝液(pH 9.0)4.0mlにこの化合物10mlを添加することによって調製した。適切に希釈された培養物ブイヨン100μｌを個々のウェルに添加した。反応を、100mlのｐ−ニトロフェニルブチレート基質を添加することによって開放し、そして吸光度を405nmで３〜５分間、測定した。酵素活性を、対照としてヒュミコララヌギノサリパーゼの既知量により製造された曲線から計算した。形質転換されていない株は、活性をほとんど又はまったく生成せず、ところが、異なった形質転換体は48時間の培養の後、リパーゼを生成した。リパーゼ活性を、リパーゼにより触媒されるトリブチリンの加水分解に基づいての滴定によりさらに決定した。酪酸の生成に続いて、pH−安定装置においてアルカリ滴定した。アッセイを、選択された形質転換体及び形質転換されていない対照株からの培養物ブイヨンに対して実施した。その結果は、形質転換されていない対照株はリパーゼ活性を生成しないが、ところが形質転換体は検出できるリパーゼ活性を生成したことを示した。例８：アスペルギラス・オリザエにおけるアブシジア・スポロホラ−バリアビリスリパーゼ遺伝子の発現Ａ．スポロホラ・バリアビリスリパーゼのコード領域を、次の成分を含むPC R反応において、Pwoポリメラーゼ（Boehringer-Man nheim Biochemicals，Indianapolis，IN）のための鋳型として元のゲノムクローンを用いて増幅した：61mlの無菌水、10mlの希釈された鋳型DNA(約５ng／ml）、１mlのプライマー１（約30ｐモル：dATGATGCATTCTCATTTTGTAGTCTTATTG、配列番号19）、１mlのプライマー２（約25ｐモル：dGCTTAATTAATTATAAACAGAGACCAGTGTT CATGTCAAG、配列番号20）、16mlのdATP，dCTP，dGTP及びdTTP混合物(200ｍモルの最終濃度)、10mlのPwo緩衝液（10×溶液；Boehringer-Mannheim Biochemicals ）、及び１mlのPwoポリメラーゼ（５単位）。増幅条件は次の通りである：サイクル１、95℃で５分間、45℃で２分間及び67℃で５分間；サイクル２〜30、95℃ で２分間、45℃で１分間、及び67℃で２分間；及び４℃でのソークサイクル。増幅されたリパーゼ遺伝子セグメントをPacＩにより消化し、そして分離用アガロースゲル電気泳動により単離し、切り出し、そしてPrep-a-Gene試薬(BioRad Lab oratories，Hercules，CA)を用いて精製した。精製されたフラグメントを、Swa Ｉ及びPacＩにより切断されているpBANe6により連結し、リパーゼ発現ベクターp RaMB19(図11)を生成した。続いて、pRaMB19を用いて、標準の方法(Christensenなど，1988，Bio／Techno logy 1419-1422)によりアルカリプロテアーゼ−欠失アスペルギラスオリザエ宿主JaL142を形質転換した。形質転換コロニーを２度精製し、そして次の成分を含むトリブチリン寒天プレート上での画線培養によりリパーゼ発現について試験した：１ｌ当たり、130ｇのマルトデキストリン、３ｇのMgSO₄・7H₂O、５ｇのKH₂ PO₄、４ｇのクエン酸、６ｇのK₂SO₄、0.5mlの微量金属（例７に記載される）、５ｇの酵母抽出物、１Ｍの尿素166ml、１ＭのNaNO₃(35.3ml)、25ｇのNoble寒天、及び10ｇのトリブチリン（pH 4.5）。30℃での48時間のインキュベーションの後、84の形質転換体のうち80が、細胞外リパーゼ活性の生成を示す、トリブチリン寒天プレート上に明確な透明領域を示した。それらの形質転換体のうち10個を、次の成分を含む MY50培地の振盪フラスコ培養物においてさらに試験した：１ｌ当たり、50ｇのマルトデキストリン、２ｇのMgSO₄・7H₂O、10ｇのKH₂PO₄、２ｇのクエン酸、２ｇのK₂SO₄、0.5mlの微量金属溶液、10ｇの酵母抽出物、２ｇの尿素（pH 6.0）。37 ℃で48時間、振盪フラスコ培養物をインキュベートした後、個々からの培養物濾液を、例７に記載されるように基質としてｐ−ニトロフェニルブチレートを用いて、細胞外リパーゼ活性についてアッセした。形質転換されていない対照細胞の培養物は検出できるリパーゼ活性を生成しないが、ところがpRaMB19形質転換体は検出できるリパーゼ活性を生成した。生物学的材料の寄託次の生物学的材料を、Agricultural Research Service Patent Culture Colle ction，Northern Regional Research Center，1815 University Street，Peoria ，Illinois，61604に、1996年１月18日に、ブダペスト条約に基づいて寄託し、そして次の受託番号を付与された。寄託物受託番号Ｅ．コリDH10B(pZL-NL1)−アブシジア・ブラケスレアナ NRRL B-21520 Ｅ．コリDH10B(pZL-NL61)−アブシジア・コリムビフェラ NRRL B-21521 Ｅ．コリDH10B(pZL-NL95)−アブシジア・グリセオラ−イグチ NRRL B-21522 Ｅ．コリDH10B(pZL-NL124)−アブシジア・スポロホラ−バリアビリス NRRL B-21523

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/20 9/20 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:65） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:69） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボーミナサン，カルパンシー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，フンボルトアベニュ 2233 (72)発明者サンダル，トーマスデンマーク国，デーコー―2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号 10に示されるアミノ酸配列を有する、アブシジア株に対して内因性のポリペプチドをコードする核酸配列；（ｂ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は（ii）それらの相補的鎖のいづれかと、中位の緊縮条件下でハイブダイズすることができるアブシジア株に対して内因性の核酸配列；（ｃ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は（ii）それらの相補的鎖のいづれかと、中位の緊縮条件下でハイブダイズすることができる核酸配列；（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも65％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；（ｅ）（ａ），（ｂ），（ｃ）又（ｄ）の対立遺伝子形；及び（ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）のフラグメント、から成る群から選択された、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列。２．前記核酸配列が、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は（ii）それらの相補的鎖のいづれか、又はそのフラグメントに対して、中位の緊縮条件下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第１項記載の核酸配列。３．前記核酸配列が、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号９に示される核酸配列、又は（ii）それらの相補的鎖のいづれかに対して、中位の緊縮条件下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第２項記載の核酸配列。４．前記核酸配列が、配列番号１に示される核酸配列又はその相補的鎖に対して、中位の緊縮性条件下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の核酸配列。５．前記核酸配列が、配列番号３に示される核酸配列又はその相補的鎖に対して、中位の緊縮性条件下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の核酸配列。６．前記核酸配列が、配列番号５に示される核酸配列又はその相補的鎖に対して、中位の緊縮性条件下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の核酸配列。７．前記核酸配列が、配列番号７に示される核酸配列又はその相補的鎖に対して、中位の緊縮性条件下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の核酸配列。８．前記核酸配列が、配列番号９に示される核酸配列又はその相補的鎖に対して、中位の緊縮性条件下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の核酸配列。９．前記核酸配列が、アブシジアから得られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求の範囲第２項記載の核酸配列。 10．前記核酸配列が、アブシジア・ブラケスレアナから得られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求の範囲第９項記載の核酸配列。 11．前記核酸配列が、アブシジア・コリムビフェラから得られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求の範囲第９項記載の核酸配列。 12．前記核酸配列が、アブシジア・グリセオラから得られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求の範囲第９項記載の核酸配列。 13．前記核酸配列が、アブシジア・グリセオラvar．イグチから得られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求の範囲第９項記載の核酸配列。 14．前記核酸配列が、アブシジア・レフレキサから得られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求の範囲第９項記載の核酸配列。 15．前記核酸配列が、アブシジア・スポロホラーバリアビリスから得られるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求の範囲第９項記載の核酸配列。 16．前記核酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示されるアミノ酸配列のいづれか、又はそのフラグメントと少なくとも65％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第１項記載の核酸配列。 17．前記核酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示されるアミノ酸配列のいづれかと少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第16項記載の核酸配列。 18．前記核酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示されるアミノ酸配列のいづれかと少なくとも75％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第17項記載の核酸配列。 19．前記核酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示されるアミノ酸配列のいづれかと少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第18項記載の核酸配列。 20．前記核酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示されるアミノ酸配列のいづれかと少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第19項記載の核酸配列。 21．前記核酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示されるアミノ酸配列のいづれかと少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第20項記載の核酸配列。 22．前記核酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号10に示されるアミノ酸配列のいづれかと少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第21項記載の核酸配列。 23．前記核酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第22項記載の核酸配列。 24．前記核酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第23項記載の核酸配列。 25．前記核酸配列が、配列番号１に示される請求の範囲第24項記載の核酸配列。 26．前記核酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第22項記載の核酸配列。 27．前記核酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第26項記載の核酸配列。 28．前記核酸配列が、配列番号３に示される請求の範囲第27項記載の核酸配列。 29．前記核酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第22項記載の核酸配列。 30．前記核酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第29項記載の核酸配列。 31．前記核酸配列が、配列番号５に示される請求の範囲第30項記載の核酸配列。 32．前記核酸配列が、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第22項記載の核酸配列。 33．前記核酸配列が、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第32項記載の核酸配列。 34．前記核酸配列が、配列番号７に示される請求の範囲第33項記載の核酸配列。 35．前記核酸配列が、配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第22項記載の核酸配列。 36．前記核酸配列が、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする請求の範囲第35項記載の核酸配列。 37．前記核酸配列が、配列番号９に示される請求の範囲第36項記載の核酸配列。 38．前記核酸配列が、アブシジア株に対して内因性であり、そして配列番号１に示される核酸配列又はその相補的鎖に対して中位の緊縮性条件下でハイブリダイズすることができる請求の範囲第１項記載の核酸配列。 39．Ｅ．コリ NRRL B-21520に含まれるプラスミドpZL-NL1に含まれるアブシジアリパーゼをコードする核酸配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の核酸配列。 40．Ｅ．コリ NRRL B-21521に含まれるプラスミドpZL-NL61に含まれるアブシジアリパーゼをコードする核酸配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の核酸配列。 41．Ｅ．コリ NRRL B-21522に含まれるプラスミドpZL-NL95に含まれるアブシジアリパーゼをコードする核酸配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の核酸配列。 42．Ｅ．コリ NRRL B-21523に含まれるプラスミドpZL-NL124に含まれるアブシジアリパーゼをコードする核酸配列を含んで成る請求の範囲第１項記の載核酸配列。 43．適切な発現宿主においてポリペプチドの発現を指令することができる１又は複数の制御配列に操作可能的な連結される請求の範囲第１項記載の核酸配列を含んで成る核酸構成体。 44．請求の範囲第43項記載の核酸構成体、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクター。 45．選択マーカーをさらに含んで成る請求の範囲第44項記載のベクター。 46．請求の範囲第43項記載の核酸構成体を含んで成る組換え宿主細胞。 47．前記核酸構成体がベクター上に含まれる請求の範囲第46項記載の細胞。 48．前記核酸構成体が宿主細胞ゲノム中に組込まれる請求の範囲第46項記載の細胞。 49．前記宿主細胞が細菌細胞である請求の範囲第46項記載の細胞。 50．前記細菌細胞がバシラス、ストレプトミセス又はシュードモナス細胞である請求の範囲第49項記載の細胞。 51．前記宿主細胞が菌類細胞である請求の範囲第46項記載の細胞。 52．前記菌類細胞が糸状菌細胞である請求の範囲第51項記載の細胞。 53．前記糸状菌細胞が、アクレモニウム、アスペルギラス、フサリウム、ヒュミコラ、ムコル、ミセリオプソラ、ネウロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラジウム又はトコダーマの種の細胞である請求の範囲第52項記載の細胞。 54．前記菌類細胞が酵母細胞である請求の範囲第46項記載の細胞。 55．前記酵母細胞が、カンジダ、クルイベロミセス、ピチア、サッカロミセス、シゾサッカロミセス又はヤロウィアの種の細胞である請求の範囲第54項記載の方法。 56．リパーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現の助けとなる条件下で請求の範囲第46項記載の宿主細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。