JP2003524386A

JP2003524386A - 脂質分解酵素変異体

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Publication number: JP2003524386A
Application number: JP2000585389A
Authority: JP
Inventors: ボイセン，キルステン; スベンセン，アラン; クローネフグルサン，クラウス; パトカーシャムカント，アナント; ボーチ，キム; ビン，イェスペオ; ペトリ，アンドレアス; シュレーデオグラッド，サンネ; ブドルフセン，ジッテ
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1998-11-27
Filing date: 1999-11-29
Publication date: 2003-08-19
Anticipated expiration: 2019-11-29
Also published as: EP2716753A1; AU785464B2; JP5600055B2; AU1376300A; BR9915711A; EP2290058A1; CA2715086A1; CA2353379C; ATE441704T1; JP2014138591A; EP2302044A1; CN100374556C; EP2287298A1; DK2290059T3; ES2328429T3; CA2353379A1; EP2302043A3; JP2011083285A; AU2007229338B2; EP2113563A3

Abstract

(57)【要約】脂質分解酵素の基質特異性は、所望の活性のレベルを上げるように、または望ましくない活性のレベルを低下させるように、脂質分解酵素の所定の領域のアミノ酸配列を変更することによって、変えることができる。かくして、本発明者らは、特定の用途のためにああつらえることができる基質特異性を有する、修飾されたアミノ酸配列を有する脂質分解酵素変異体を開発した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、アミノ酸配列を修飾することによって脂質分解酵素の基質特異性を
変える方法および、そのような修飾によって得られる脂質分解酵素変異体に関す
る。本発明はまた、脂質分解酵素のスクリーニング方法に関する。

【０００２】発明の背景脂質分解酵素（例えばリパーゼおよびホスホリパーゼ）は、基質中のカルボン
酸エステル結合を加水分解して、カルボン酸を放出することができる。異なるエ
ステル結合に対する加水分解活性は、種々の工業用途における脂質分解酵素の有
用性のために重要である。

【０００３】かくして、高いホスホリパーゼ活性を有する酵素が、広範囲の用途、例えばパ
ン焼き（米国特許第4,567,046号）、小麦粉でん粉加水分解物のろ過（米国特許
第5,264,367号）およびリン脂質含量を減らすための植物油の処理（米国特許第5
,264,367号）において有用である。植物油の処理のためには、酵素は、低いリパ
ーゼ活性を有していなければならない。すなわち、トリグリセリドのエステル結
合に対して低い加水分解活性を有していなければならない。

【０００４】国際特許出願公開WO98/45453号は、ジガラクトシルジグリセリド(DGDG)に対す
る高加水分解活性を有する酵素がパン焼きにおいて有用であることを示す。洗濯洗剤にリパーゼを添加して、脂汚れを除去するのを助けることはよく知ら
れている（例えば欧州特許第258,068号）。遊離の脂肪酸(FFA)としての短鎖脂肪酸の放出は、食品、例えばチーズ熟成に
おけるフレーバー発生のために望ましくあり得る（M.ハンソン(Hanson)、ZFL, 4
1(10), 664-666 (1990)）。

【０００５】幾つかの脂質分解酵素の三次元(3D)構造が知られており、幾つかの構造は、活
性部位を覆う、開いた状態または閉じた状態にあることができる、いわゆる「ふ
た」を含むことが知られている。ブラディ(Brady)ら、Nature, 343, 767-770 (1
990)。ブルゾゾウスキー(Brzozowski) A Mら、Nature, 351, 491 (1991)。デレ
ベンダ(Derewenda)ら、Biochemistry, 31(5), 1532-1541 (1992)。

【０００６】 F.ハラ(Hara)ら、JAOCS, 74(9), 1129-32 (1997)は、幾つかのリパーゼが、あ
る種のホスホリパーゼ活性を有するが、それに対して、ほとんどのリパーゼはリ
ン脂質にほとんどまたは全く活性を有さないことを示す。かくして、ホスホリパ
ーゼ活性は、モルモット膵臓、フサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporu
m)およびスタフィロコッカスヒーカス(Staphylococcus hyicus)からのリパー
ゼにおいて記載されており、ホスホリパーゼ活性をリパーゼの構造に関連づける
試みがなされた。国際特許出願公開WO98/26057号；M.D. ファンカンペン(van
Kampen)ら、Chemistry and Physics of Lipids, 93 (1998), 39-45；ヒョルス(H
jorth)ら、Biochemistry 1993, 32, 4702-4707。

【０００７】従来技術は、リゾプスデレマル(Rhizopus delemar)からのリパーゼにおいて
アミノ酸置換による鎖長選択性への影響を記載した。かくして、R.D.ジョージャ
ー(Joerger)ら、Lipids, 29(6), 377-384 (1994)は、変異体F95D、F112WおよびV
209Wが、Ｃ₄酸およびＣ₈酸とは異なる好ましさを有することを示す。R.R.クライ
ン(Klein)ら、JAOCS, 74(11), 1401-1407 (1997)は、変異体V206T＋F95Dが、Ｃ₈ 酸に対するより高い選択性を有することを示す。R.R.クライン(Klein)ら、Lipid
s, 32(2), 123-130 (1997)は、変異体V209W＋F112W、V94WおよびF95D＋F214Rが
、Ｃ₄酸およびＣ₈酸へのより高い加水分解活性を有することを示し、中間の鎖長
特異性のための構造決定子が、アシル結合溝の遠位端にあり得ることを示唆する
。発明の概要本発明者らは、脂質分解酵素の基質特異性が、所望の活性レベルを上げるか、
または望ましくない活性レベルを下げるように、脂質分解酵素の所定の領域にお
けるアミノ酸配列を変更することによって修飾できることを見出した。かくして
、本発明者らは、特定の用途のためにあつらえることができる基質特異性を有す
る、修飾されたアミノ酸配列を有する脂質分解酵素（以下では、脂質分解酵素変
異体または、短く変異体と呼ぶ）を開発した。

【０００８】したがって、本発明は、脂質分解酵素変異体の製造方法およびこの方法によっ
て製造される脂質分解酵素変異体を提供する。この方法は、 a)基質および注目のエステル結合を選択すること、 b)親脂質分解酵素を選択すること、 c)以下に記載する親脂質分解酵素の活性部位の近くの領域、Ｃ-末端の近くの領
域、またはふた領域に、少なくとも１つのアミノ酸残基を選択すること、 d)そのそれぞれがアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換である変更を行うこと
、 e)任意的に、c)以外の１つ以上の位置で、そのそれぞれがアミノ酸残基の挿入、
欠失、または置換である変更を行うこと、 f)得られる変異体を製造すること、 g)基質中のエステル結合に対する変異体の活性を試験すること、および h)エステル結合に対する変えられた活性を有する変異体を選択することを含む。

【０００９】かくして、１つの態様においては、親脂質分解酵素は、sn2位置を持つグリセ
ロール部分を有するアルコール結合部位を有し、アミノ酸の変更は、基質トリグ
リセリドのグリセロール部分のsn2位置のＣ原子の10オングストローム以内にあ
る。別の態様においては、親脂質分解酵素は、活性Ser、活性Aspおよび活性His残
基からなる触媒的三つ組を含む構造を有し、変更されるべきアミノ酸は、触媒的
残基の活性His残基とＣ-末端との間に配置されるか、または以下の工程により定
義されるセットEに属する： i) 脂質分解酵素の構造と、触媒的三つ組および阻害リン原子を含むリゾムコ
ールミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ構造4TGL (4TGL-inhP)とを、２つ
の構造の触媒的三つ組の原子間の偏差の二乗の合計を最小にするように位置を調
整すること(aligning)、 ii) 4TGL-inhPに中心を有する、半径18オングストロームの球の内側にある脂
質分解酵素の原子からなるセットAを規定すること、 iii) 4TGL-inhP、親脂質分解酵素の活性Ser残基のＣα原子および親脂質分解
酵素の活性Asp残基のＣα原子により規定される第１の平面を形成し、親脂質分
解酵素の活性His残基のＣα原子とは第１の平面の同じ側にある原子からなる、
セットAのサブセットとしてセットBを規定すること、 iv) 4TGL-inhP、親脂質分解酵素の活性Ser残基のＣα原子および親脂質分解酵
素の活性His残基のＣα原子により規定される第２の平面を形成し、親脂質分解
酵素の活性Asp残基のＣα原子とは第２の平面の反対側にある原子からなる、セ
ットAのサブセットとしてセットCを規定すること、 v)セットBとセットCとを合わせたものに属し、かつ15以上の溶媒アクセシビリ
ティ(accessibility)を有するする原子からなるセットDを形成すること、ならび
に vi)セットDに属する原子または、セットBとセットCとを合わせたものに属し、
セットDに属する原子から3.5オングストローム未満に配置される原子を含む構造
中のアミノ酸残基からなるセットEを形成すること。

【００１０】第３の態様においては、脂質分解酵素は、活性His残基を含む活性部位を有し
、変更は、活性His残基とＣ-末端との間のアミノ酸配列においてなされる。本発明のなお別の態様においては、アミノ酸の変更は、Ｃ-末端の10個のアミ
ノ酸残基間でなされる。さらなる態様においては、親脂質分解酵素はふたを有し、変更はふたの中でな
される。

【００１１】本発明はまた、変異体をコードするDNA配列、DNA配列を含む発現ベクター、DN
A配列または発現ベクターを含む形質転換された宿主細胞および、変異体を製造
するように形質転換された宿主細胞を培養し、得られたブロスから変異体を回収
することによって変異体を製造する方法を提供する。本発明者らはまた、リパーゼおよびホスホリパーゼ活性ならびに、ジガラクト
シルジグリセリドへの活性を有する脂質分解酵素が、パン焼きにおける使用のた
めに特に有効であることを見出し、これらの活性を試験することにより、脂質分
解酵素のスクリーニング方法を設計した。発明の詳細な説明基質中の選択されたエステル結合に対する変えられた活性親脂質分解酵素と比べて、本発明は、少なくとも１つの基質中の少なくとも１
つの選択されたエステル結合に対する活性を変えること、すなわち、所望の活性
を増加させ、望ましくない活性を減少させるか、または、望ましくない活性対所
望の活性の比を減少させることにより基質特異性を変えることを目的とする。

【００１２】かくして、増加されたホスホリパーゼ活性を有する酵素が、例えばパン焼きま
たは植物油の精製において有用であり得る。パン焼きにおける使用のために、ジ
ガラクトシルジグリセリド(DGDG) に対する加水分解活性を増加させることが望
ましくあり得る。リーパゼが使用される任意の工業的使用のために、リパーゼ活性を増加するこ
とが望ましくあり得る。洗剤またはパン焼きにおける使用のためには、長鎖（Ｃ ₁₆ 〜Ｃ₂₀）トリグリセリドに対する活性を増加することが望ましくあり得、短鎖
または中間鎖（Ｃ₄〜Ｃ₈）脂肪酸に対する活性対長鎖脂肪酸に対する活性の比を
減少させることによって、長鎖脂肪酸についての特異性を増加させることが望ま
しくあり得る。

【００１３】食品における使用、または食品においてフレーバーを発生させること（例えば
チーズの熟成）における使用のためには、短鎖もしくは中間鎖（Ｃ₄〜Ｃ₈）トリ
グリセリドに対するリパーゼ活性を増加させることが望ましくあり得る。植物油の精製におけるホスホリパーゼとしての使用のためには、長鎖（Ｃ₁₆〜
Ｃ₂₀）トリグリセリドに対するリパーゼ活性対ホスホリパーゼ活性の比を減少さ
せることが望ましくあり得る。親脂質分解酵素本発明において使用されるべき脂質分解酵素は、エステル結合を加水分解する
ことができるものである。そのような酵素としては、例えばリパーゼ、例えばト
リアシルグリセロールリパーゼ(EC 3.1.1.3)、リポタンパク質リパーゼ(EC 3.1.
1.34)、モノグリセリドリパーゼ(EC 3.1.1.23)、リゾホスホリパーゼ、フェルラ
酸エステラーゼおよびエステラーゼ(EC 3.1.1.1, EC 3.1.1.2)を包含する。括弧
中の数字は、酵素の酵素反応性のタイプに従って生化学国際連合の酵素委員会に
より割当てられた系統番号である。

【００１４】親脂質分解酵素は、原核生物、特に細菌の酵素、例えばシュードモナス(Pseud
omonas)からの酵素であり得る。例は、シュードモナス(Pseudomonas)リパーゼ、
例えば、P.セパシア(cepacia)（米国特許第5,290,694号、pdb ファイル10IL）
、P.グルマエ(glumae)（N.フレンケン(Frenken)ら、(1992)、Appl. Envir. Micr
obiol. 58 3787-3791, pdb ファイル1TAHおよび1QGE）、P.シュードアルカリゲ
ネス(pseudoalcaligenes)（欧州特許第334,462号）およびシュードモナス(Pseud
omonas)種株SD 705(FERM BP-4772)（国際特許出願公開WO 95/06720、欧州特許第
721,981号、WO 96/27002、欧州特許第812,910号）からのシュードモナス(Pseudo
monas)リパーゼである。P.グルマエ(glumae)リパーゼ配列は、クロモバクテリウ
ムビスコサム(Chromobacterium viscosum)のアミノ酸配列と同一である（ドイ
ツ国特許出願3908131 A1）。他の例は、例えばシュードモナス(Pseudomonas)、
例えばP.メンドシナ(mendocina)（米国特許第5,389,536号）またはP.プティダ(p
utida)（国際特許出願公開WO88/09367）からの、細菌クチナーゼである。

【００１５】あるいは、親脂質分解酵素は、真核生物、例えば菌類の脂質分解酵素、例えば
フミコラ(Humicola)科および接合菌網(Zygomycetes)科の脂質分解酵素および菌
類クチナーゼであり得る。菌類クチナーゼの例は、フサリウムソラニピシ(Fusarium solani pisi)（
S.ロンギ(Longhi)ら、Journal of Molecular Biology, 268(4), 779-799 (1997)
）およびフミコラインソレンス(Humicola insolens)（米国特許第5,827,719号
）のクチナーゼである。

【００１６】フミコラ(Humicola)科の脂質分解酵素は、H.ラヌジノサ(lanuginosa)株DSM 41
09からのリパーゼおよび、該リパーゼと50％より上の相同性を有するリパーゼか
らなる。H.ラヌジノサ(lanuginosa)からのリパーゼ（異名、サーモミセスラヌ
ジノサス(Thermomyces lanuginosus)）は、欧州特許第258,068号および欧州特許
第305,216号に記載されており、米国特許第5,869,438号のSEQ ID NO:2の位置1-2
69に示されたアミノ酸配列を有する。

【００１７】フミコラ(Humicola)科はまた、以下の脂質分解酵素を含む：ペニシリウムカ
メンベルティ(Penicillium camembertii)からのリパーゼ(P25234)、フサリウム
オキシスポラム(Fusarium oxysporum)からのリパーゼ／ホスホリパーゼ（欧州
特許第130064号、国際特許出願公開WO98/26057号）、F.ヘテロスポラム(heteros
porum)からのリパーゼ（R87979）、アスペルギルスホエティダス(Aspergillus
foetidus)からのリゾホスホリパーゼ(W33009)、A.オリザエ(oryzae)からのホス
ホリパーゼA1（特開平10-155493号公報）、A.オリザエ(oryzae)からのリパーゼ(
D85895)、A.ニガー(niger)からのリパーゼ／フェルラ酸エステラーゼ(Y09330)、
A.ツビンゲンシス(tubingensis)からのリパーゼ／フェルラ酸エステラーゼ(Y093
31)、A.ツビンゲンシス(tubingensis)からのリパーゼ（WO98/45453）、A.ニガー
(niger)からのリゾホスホリパーゼ（WO98/31790）、等電点6.9および見かけ上の
分子量30kDaを有する、F.ソラニイ (solanii)からのリパーゼ（WO96/18729）。

【００１８】接合菌網(Zygomycetes)科は、リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)の
リパーゼ(P19515）と少なくとも50％の相同性を有するリパーゼを含む。この科
はまた、アブシディアリフレキサ(Absidia reflexa)、A.スポロフォラ(sporop
hora)、A.コリンビフェラ(corymbifera)、A.ブラケスレーアナ(blakesleeana)、
A.グリセオラ(griseola)（すべてWO96/13578およびWO97/27276に記載されている
）およびリゾプスオリザエ(Rhizopus oryzae)からのリパーゼ(P21811)を含む
。括弧中の数字は、公開番号または、EMBL、GenBank、GeneSeqpまたはSwiss-Pro
tデータベースへの受入番号を示す。

【００１９】全くまたはほとんどホスホリパーゼ活性を有さない（例えば0.1 PHLU/LUより
下または50 PHLU/mgより下の、ホスホリパーゼ活性対リパーゼ活性の比に相当す
る）親脂質分解酵素からホスホリパーゼ活性を有する変異体を誘導することは、
特に興味深い。アルコール結合部位付近の変更すでに述べたように、親脂質分解酵素のアミノ酸配列は、基質トリグリセリド
のグリセロール部分に近い位置で修飾され得る。この領域は、リパーゼの「アル
コール結合部位」と称され；ブルゾゾウスキー(Brzozowski) A Mら、Nature, 35
1, 491 (1991)；ウッペンベルグ(Uppenberg)ら、Biochemistry, 1995, 34, 1683
8-16851；A.スベンセン(Svendsen), Inform, 5(5), 619-623 (1994)に記載され
ている。

【００２０】リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)については、アルコール結合部
位の範囲は、インターネット(http://www.rcsb.org/pdb/)でタンパク質の構造分
類(Structural Classification of Proteins)(SCOP)において入手可能なPDBファ
イル「5tgl.pdb」から見出すことができ、阻害剤n-ヘキシルホスホネートエチル
エステル（基質をまねる）との複合体を示している。それは、デレウェンダ(Der
ewenda)ら（前出）、ブルゾゾウスキー(Brzozowski) ら（前出）およびブラディ
ら（前出）に記載されている。このモデルのsn2位置は、原子CE2である。

【００２１】変異体は典型的には、アルコール結合部位に10個以下の変更、例えば１、２、
３、４、５または６個の変更を含む。変更は特に、Ｃ-末端の20位置以内（例えば10位置以内）にくるアルコール結
合部位のその部分にあり得る。すでに述べたように、親脂質分解酵素のアミノ酸配列は、基質トリグリセリド
のグリセロール部分のsn2位置のＣ原子の10オングストローム以内（例えば8オン
グストローム以内、特に6オングストローム以内）にある位置で修飾され得る。
以下のアミノ酸位置は、リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ
のsn2位置の10オングストローム以内にある：25、28、80-84、88、143-146、175
、203、205、254-255、257-259、264-267。以下は8オングストローム以内にある
：81-83、144、257-258、265-267、かつ、以下は6オングストローム以内にある
：82、144、257、266。

【００２２】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼにおいては、以下の位
置が、sn2位置の10オングストローム以内にある：18、21、81-85、89、145-148
、172、201、203、255-256、258-260、264-267。以下は8オングストローム以内
にある：82-84、89、146、258-259、265-267、かつ以下は6オングストローム以
内にある：83、146、258、266。触媒的三つ組付近の変更すでに述べたように、１つの態様においては、親脂質分解酵素は、活性Ser、
活性Aspおよび活性His残基からなる触媒的三つ組を含む構造を有し、変更される
べきアミノ酸は、上記したある種の工程により定義されるセットに属する。構造
は、開いた構造または閉じた構造であることができ、基質または阻害剤を含むか
、または含まないことができる。

【００２３】この工程は、ソフトウェア、例えばMSI's Insight IIを用いて簡単に行われる
。それは、ジエチルp-ニトロフェニルホスフェートによって不可逆的に阻害され
るリゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)からのリパーゼの結晶構造であ
る4TGLとのアラインメントを含む。これは、インターネットでhttp://www.rcsb.
org/pdb/にて、タンパク質の構造分類(Structural Classification of Proteins
)(SCOP)において入手可能であり、デレウェンダ(Derewenda)ら（前出）に記載さ
れている。リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼは、アミノ酸
残基S144、D203およびH257からなる触媒的三つ組を含む。

【００２４】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼについては、構造1tib
を使用することができ；それは、インターネットで、タンパク質の構造分類(Str
uctural Classification of Proteins)(SCOP)において入手可能である。この構
造を用いると、この工程により定義されたセットは、以下の位置を含む：10-23
、26、40、55-64、80-87、116-117、119、145-149、151、168、170、194、196-2
01、220-222、224-227および254-269。活性His残基のＣ-末端側での変更上記したように、活性His残基と末端との間のアミノ酸配列において、特に活
性HisのＣ-末端側で12個のアミノ酸の間で、１つ以上の変更を行い得る。

【００２５】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼは、H258に活性Hisおよ
びL269にＣ-末端を有し、よって、この領域は、位置259-269を含む。P.セパシア
(cepacia)リパーゼは、活性H286および、残基297にＣ-末端を有し、よってこの
領域は、残基287-297を含む。Ｃ-末端付近の変更上記したように、１つ以上の変更は、成熟タンパク質のＣ-末端からアミノ酸1
0個以内の位置で行われ得るか、または、H. ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼのそのような位置に対応する位
置、すなわちH. ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼの位置260-269で行われ得る。
対応する位置は、本明細書で後に記載する２つの配列のアラインメントにより見
出すことができる。

【００２６】脂質分解酵素変異体は、Ｃ-末端の最初の1、2、3、4、5または6位置に対応す
るアミノ酸残基を欠失することによって先端を切り取られる(truncated)ことが
できる。先端を切り取られた(truncated)変異体は、熱安定性が改善され得る。あるいは、変異体は、Ｃ-末端および／またはＮ-末端にペプチド伸長を含むこ
とができる。Ｃ-末端伸長は、１〜10個のアミノ酸残基、例えばA、P、AG、DG、P
G、AGG、PVGF、AGRF、PRGF、AGGFまたはAGGFSからなることができ；または、そ
れは、40〜50個の残基、例えばフサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporu
m)リパーゼの48個のＣ-末端残基、AGGFSWRRYRSAESVDKRATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYV
KNNQARSからなることができる。Ｃ-末端伸長は、ホスホリパーゼ活性を増加させ
得る。

【００２７】アルコール結合部位と重複する領域における幾つかの変更が、以下に記載され
る。特定の変更は、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼにおけ
るG266に対応する位置での、特に、中間の大きさのアミノ酸、例えばA、C、D、N
、L、I、S、T、PまたはVでの置換である。そのような変更だけがホスホリパーゼ
活性を増加させるのに十分であることが見出された。

【００２８】他の特定の変更は、三次構造を、例えばかさ高い側鎖の導入によって、または
結合角を妨害することによって、例えばProを導入することによって、変えると
いったようなものである。そのような変更は、フミコララヌジノサ(Humicola
lanuginosa)リパーゼの位置G263、L264、I265、T267またはL269に対応する位置
でなされ得る。幾つかの特定の置換は、G263A,E,Q,R；L264A,C,P,Q；I265L,N,T
；T267A,QまたはL269Nである。ふたにおける変更上記したように、親脂質分解酵素のアミノ酸配列は、親脂質分解酵素のふた領
域中で修飾され得る。この領域は、ブラディ(Brady)ら、Nature, 343, 1990, 76
7-770およびブルゾゾウスキー(Brzozowski) A Mら、Nature, 351, 491 (1991)に
記載されている。H. ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼにおいては、ふたは、位
置80-100に配置され、修飾は特に、位置82-98、例えば91-98にてなされ得る。

【００２９】変異体は典型的には、ふた領域に５個以下の変更を有する；それは、0、1、2
または3個の変更を含み得る。特異的変更は、フミコララヌジノサ(Humicola l
anuginosa)リパーゼにおいてG91、L93、N94、D96、K98、L97および／またはE99
に対応するアミノ酸の、中性または正に帯電したアミノ酸での置換、例えばG91A
,T、L93K、N94D、D96S,W,G、L97Q、K98D,F,Eおよび／またはE99K,Dに対応する置
換である。

【００３０】特に、ふた領域に変更を有する変異体はまた、触媒的三つ組の近く、基質結合
部位の近く、またはＣ-末端の近くに１つ以上の変更を含む。脂質分解酵素変異体本発明の脂質分解酵素変異体は、上記した任意の領域に１つ以上のアミノ酸残
基変更を含む。各変更は、アミノ酸残基の欠失または置換であることができ、ま
たは、アミノ酸残基の前もしくは後への挿入であることができる。アミノ酸残基
がＣ-末端にあるなら、挿入はＣ-末端伸長であり得る。挿入は典型的には、1〜5
個、例えば1〜2個のアミノ酸残基からなり、Ｃ-末端伸長は、1〜50個または2〜1
0個のアミノ酸残基からなり得る。

【００３１】上記領域での変更の総数は典型的には20以下、例えば10以下、または5以下で
あり、上記領域での１または2の変更程度であり得る。さらに、本発明の脂質分解酵素変異体は、親酵素の他の修飾、典型的には10以
下、例えば5以下のそのような修飾を任意的に含むことができる。変異体は一般に、少なくとも80％、たとえば少なくとも85％、典型的には少な
くとも90％または少なくとも95％の、親脂質分解酵素との相同性を有する。

【００３２】本発明の変異体は、Ｎ-末端での、例えば1〜15個（特に4〜10個）のアミノ酸
残基からなる、特に1、2または3個の正に帯電したアミノ酸を含むペプチド伸長
をさらに含むことができる。幾つかの特定のＮ-末端ペプチド伸長は、AS、SPIRR
、E1RP、E1SPIRPRP、E1SPPRRPおよびE1SPIRPRPである。さらに、WO97/04079およ
びWO97/07202に記載されている任意のペプチド伸長を使用することができる。特定の変異体フミコラ(Humicola)科の脂質分解酵素の変異体を製造するために、アミノ酸変
更は特に、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの20-25、56-6
4、81-85または255-269に対応する位置でなされ得る。かくして、変更は、A20、
Y21、G23、K24、N25、V63、R81、G82、R84、A257、W260、Y261、F262またはG266
（例えば、G23C、K24C、R81Cを除外する）に対応する位置での置換、欠失または
挿入、C268またはL269に対応するアミノ酸の置換であることができる。

【００３３】幾つかの特定の変更は、H. ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼにおける以下に
対応する置換：Y21V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T、V60V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T
、 G61V/I//L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T、D62E/A/V、S83T、R84K/L/W、P256A、G263E,Q,
R,F、L264A,C,P,F,G,I、I265L,N,F、G266D/EもしくはT267A,Q,P,S,Eまたは、T26
7GSもしくはT267GLに対応する挿入である。

【００３４】トリグリセリド中の短鎖（Ｃ₄〜Ｃ₈）脂肪酸に対する活性を変えるために、Y2
1、E56、D57、V60、G61、D62、R81、S83、R84、L259、Y261またはG266に対応す
る位置で変更を行うことができ、例えばY21V/I、V60G、D62E/A/V、S83T、R84K/L
/WまたはG266D/Eに対応する置換を行うことができる。 DGDGに対する活性を増加させるために、Y21、G23、N26、D57、D62、R81、S83
、R84、S85、G266、T267またはL269に対応する位置で変更を行うことができ、例
えば２つ以上のそのような変更を、例えばふた領域での１つ以上の変更と一緒に
行うことができる。ホスホリパーゼ活性を増加させるために、R81、R84、S85ま
たは263-267（例えばG266またはT267）に対応する位置で変更を行うことができ
る。

【００３５】シュードモナス(Pseudomonas)リパーゼの変異体を製造するために、P.セパシ
ア(cepacia)リパーゼにおける12-13、16-34、45-52、59-66、68、86-87、107-10
9、111、143-153、155、157-158、207-212、228、230、242-249、264、279-280
、282-297、301-302、304-305、307-308、特に、P.セパシア(cepacia)／P.グル
マエ(glumae)リパーゼにおいてL17/L17、T18/A18、Y29/Y29、L287/L286、E289/E
288、I290/I289、Q292/Q291またはL293/L292に対応する位置で、アミノ酸修飾を
行うことができる。

【００３６】 H. ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼの特定の変異体は、実施例に開示されて
いる。対応する変更を、他の親脂質分解酵素において行うことができる。さらな
る変異体は、位置1、106、186、225、232、237、239または274でのアミノ酸修飾
を省くことによって、これらから誘導することができる。274Sを有する変異体は
任意的に、完全な、または先端を切り取られた形で、WRRYRSAESVDKRATMTDAELEKK
LNSYVQMDKEYVKNNQARS（F.オキシスポラム(oxysporum)リパーゼのＣ-末端に対応
する）のさらなるＣ-末端伸長を有することができる。アミノ酸変更についての命名変異を定義するために本明細書で使用した命名法は、基本的には、WO92/05249
に記載されたものである。かくして、G91Aは、位置91でGをAで置換することを示
す。T267A,Qは、位置267で、TをAまたはQで置換することを示す。E1E,D,Aは、E1
はそのままか、またはDもしくはAで置換されることを示す。

【００３７】 T267stopは、停止コドンを示す。すなわち、T267およびすべての以下のアミノ
酸（すなわちC268およびL269）の欠失を示す。270P,271Vは、PVのＣ-末端伸長（
すなわち、新たな位置270および271での）を示す。-G266は、位置266でのGの欠
失を示す。括弧は、変更が任意であること、または実施例においては変更が不確
実であることを示す。SPIRRは、Ｎ-末端伸長を示す。D266は、位置または、任意
のアミノ酸（Dを除く）での置換をいう。

【００３８】 E1SPPCGRRPまたはSPPCGRRP(-E)は、E1をSPPCGRRPで置換すること、すなわちＮ
-末端でのペプチド付加を示す。T267GSは、T267をGSで置換することを示し、ま
たは、言い換えれば、置換T267GおよびG267とG268の間へのSの挿入を示す。相同性およびアラインメント本発明の目的のためには、相同性の程度は、当技術分野で公知のコンピュータ
プログラム、例えばGCGプログラムパッケージ（ウィスコンシンパッケージの
ためのプログラムマニュアル(Program Manual for the Wisconsin Package)、
バージョン8、1994年８月、ジェネティックスコンピュータグループ(Geneti
cs Computer Group)、575 サイエンスドライブ(Science Drive)、マジソン(M
adison)、ウィスコンシン(Wisconsin)、USA53711）（ニードルマン(Needleman),
S. B. およびワンシュ(Wunsch), C. D., (1970), Journal of Molecular Biolo
gy, 48, 443-45）において提供されるGAPによって、ポリペプチド配列比較のた
めの以下の設定：GAP創造ペナルティ(creation penalty)3.0およびGAP伸長ペナ
ルティ(extension penalty)0.1を有するGAPを用いて、適当に決定され得る。

【００３９】本発明においては、リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)(rhimi)、リ
ゾプスデレマル(Rhizopus delemar)(rhidl)、サーモミセスラヌジノサ(ther
momyces lanuginosa)（旧；フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)）(SP4
00)、ペニシリウムカメンベルティ(Penicillium camembertii)(Pcl)およびフ
サリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)(FoLnp11)のリパーゼ配列にお
ける対応する（または相同の）位置は、図１に示したアラインメントによって定
義される。

【００４０】アラインメントに示されていないリパーゼ配列における相同の位置を見出すた
めに、注目の配列を、図１に示した配列に対してアライニングする。GAPプログ
ラムによって見出されたほとんどの相同配列に対するGAPアラインメントを用い
て、新しい配列を、図１の本発明のアラインメントに対しアライニングする。GA
Pは、GCGプログラムパッケージ（ウィスコンシンパッケージのためのプログラ
ムマニュアル(Program Manual for the Wisconsin Package)、バージョン8、1
994年８月、ジェネティックスコンピュータグループ(Genetics Computer Gr
oup)、575 サイエンスドライブ(Science Drive)、マジソン(Madison)、ウィ
スコンシン(Wisconsin)、USA53711）（ニードルマン(Needleman), S. B. および
ワンシュ(Wunsch), C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-4
5）において提供される。ポリペプチド配列比較のために、以下の設定が使用さ
れる：GAP創造ペナルティ(creation penalty)3.0およびGAP伸長ペナルティ(exte
nsion penalty)0.1。ホスホリパーゼ活性を有する変異体上記したように、本発明の変異体は、親脂質分解酵素より高いホスホリパーゼ
活性を有することができる。本明細書において後で述べる単層法により、変異体
は、pH5にて少なくとも0.1ナノモル／分のホスホリパーゼ活性を有し得る。

【００４１】本明細書において後で述べるPHLU法により、変異体は、少なくとも100 PHLU/m
g（精製酵素タンパク質のmg）、特に少なくとも500 PHLU/mgのホスホリパーゼ活
性を有し得る。変異体は、少なくとも0.1 PHLU/LU、例えば少なくとも0.5 PHLU/
LU、特に少なくとも2 PHLU/LUのホスホリパーゼ活性対リパーゼ活性（両方共pH7
で測定した）の比を有する。

【００４２】 PHLU法により証明されるように、本発明の変異体は、完全なリン脂質を加水分
解する能力を有し得る。本発明の変異体はA₁および／またはA₂活性を有すること
ができ、それでリン脂質中の脂肪族アシル基の１つまたは両方を加水分解するこ
とができる。 pH最適条件フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの多くの変異体は、リ
パーゼ活性のためにアルカリ性pH最適条件および、ホスホリパーゼ活性のために
酸性pH最適条件を有する（例えば、リパーゼのためにpH9〜10および、ホスホリ
パーゼのためにpH4〜6）。そのような変異体は、非常に低い付随的リパーゼ活性
を有するホスホリパーゼとして、酸性pHで使用することができる（例えば、後に
述べる油の脱ゴム(degumming)において）。

【００４３】しかしながら、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの幾つ
かの変異体（置換G266D,Eを含む変異体）は、pH5〜6付近でリパーゼおよびホス
ホリパーゼの両方の活性に最適なpHを有する。そのような変異体は、リパーゼお
よびホスホリパーゼの両方の活性が望ましいとき、例えばパン焼きにおいては、
酸性pHで使用され得る。熱安定性変異体の熱安定性は、示差走査熱量測定(DSC)によって便利に評価することが
できる。正確な変異に依存して、本発明の変異体は一般に、親脂質分解酵素と同
様またはわずかに低い熱安定性を有する。

【００４４】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)からのリパーゼの変性ピーク（
Ｔ_d）の頂点温度は、pH5で90℃／時間で加熱したときには、70℃のすぐ上（=Ｔ_d ）である。本発明の変異体のＴ_dは一般に、5〜10℃低い。変異体の使用基質特異性に依存して、本発明の変異体は、例えばろ過の改善、植物油処理、
パン焼き、洗剤またはリゾリン脂質の製造において使用することができる。ろ過の改善変異体で処理することによって、炭水化物起源の水性溶液またはスラリ−のろ
過性を改善するために、リゾホスホリパーゼ活性を有する変異体を使用すること
ができる。これは、でん粉加水分解物、特に小麦でん粉の加水分解物を含む溶液
またはスラリーに特に適用できる。というのは、小麦でん粉の加水分解物は、ろ
過しにくく、曇ったろ液が得られる傾向があるからである。この処理は、欧州特
許第219,269号（CPCインターナショナル(international)）と同様にして行うこ
とができる。植物油処理ホスホリパーゼ活性を有する変異体を、食用油中のリン脂質含量を減らすため
のプロセスにおいて使用することができ、このプロセスは、大部分のリン脂質を
加水分解するように変異体で油を処理すること、および加水分解されたリン脂質
を含む水相を油から分離することを含む。このプロセスは、リン脂質を含む任意
の食用油、例えば植物油（例えば大豆油、菜種油およびヒマワリ油）の精製に適
用できる。この処理は、酸性pH、例えばpH3〜5で行うことができる。有利には変
異体は、２つの活性の異なるpH最適条件の故に、低pHで高いホスホリパーゼ活性
および低いリパーゼ活性を有するように、選択されることができる。

【００４５】油処理のためのプロセスは、当技術分野で公知の原理に従って行うことができ
、例えば米国特許第5,264,367号（メタルゲゼルシャフト(Metallgesellschaft)
、ローム(Rohm)）；K.ダールケ(Dahlke)＆H.ブホルド(Buchold), INFORM, 6(12)
, 1284-91 (1995)；H. ブホルド(Buchold),Fat Sci. Technol., 95(8), 300-304
(1993)；特開平2-153997号公報（ショーワサンギョウ(Showa Sangyo)）；ま
たは欧州特許第654,527号（メタルゲゼルシャフト(Metallgesellschaft)、ロー
ム(Rohm)）と同様にして行うことができる。ホスホリパーゼの多方面にわたる用途例えば、欧州特許第870840号、特開平10-42884号公報、特開平4-135456号公報
または特開平2-49593号公報に記載されたようにして、対応するリン脂質を変異
体で処理することによって、リゾリン脂質（例えば、リゾ-レクチン）を製造す
るために、ホスホリパーゼ活性を有する変異体を使用することができる。変異体
はまた、例えば欧州特許第628256号、同第398666号または同第319064号に記載さ
れているように、マヨネーズを作るために使用することができる。

【００４６】例えば欧州特許第567,662号（ネスレ(Nestle)）、欧州特許第426,211号（ユニ
リーバー(Unilever)）、欧州特許第166,284号（ネスレ(Nestle)）、特開昭57-18
9638号公報（ヤクルト(Yakult)）または米国特許第4,119,564号（ユニリーバー(
Unilever)）に記載されているように、乳製品および他の食品の加工において、
ホスホリパーゼ活性を有する変異体を使用することができる。

【００４７】変異体は、特開平7-177884号公報（カオー(Kao)）に記載されているように、
皮革処理に使用することができる。パン焼きパン生地、パンおよびケーキの製造において、例えば生地の安定性および生地
の取扱い特性を増進するために、またはパンもしくはケーキの弾性を改善するた
めに、ホスホリパーゼ活性および／またはDGDGアーゼ活性を有する変異体を使用
することができる。かくして、変異体を、パンを作るプロセスにおいて使用する
ことができ、このプロセスは、生地の成分に変異体を添加すること、生地をこね
ること、および生地を焼いてパンを作ることを含む。これは、米国特許第4,567,
046号（キョウワハッコウ(Kyowa Hakko)）、特開昭60-78529号公報（QPコーポ
レーション(Corp.)）、特開昭62-111629号公報（QPコーポレーション(Corp.)）
、特開昭63-258528号公報（QPコーポレーション(Corp.)）、欧州特許第426211（
ユニリーバー(Unilever)）または国際特許出願公開WO99/53769（ノボノルディ
スク(Novo Nordisk)）と同様にして行うことができる。

【００４８】変異体を腐敗抵抗性(anti-staling)エンド-アミラーゼと一緒に使用して、任
意的にまた、リン脂質を添加して、パンの腐敗を減らし、特に、焼いた後最初の
24時間のパンの柔らかさを改善することが特に有利である。エンド-アミラーゼ
は、マルトゲン(maltogenic)α-アミラーゼ（例えば、バチルス(Bacillus)種か
らのもの、例えばノボノルディスク(Novo Nordisk)からのNovamyl（商標））
または菌類もしくは細菌のα-アミラーゼ（例えば、アスペルギルス (Aspergill
us)もしくはバチルス(Bacillus)、特にA.オリザエ(oryzae)、B.リチェニホルミ
ス(licheniformis)もしくはB.アミロリクエファシエンス(amyloliquefaciens)か
らのもの）であり得る。

【００４９】パン焼きにおいて、変異体は、短鎖または中間鎖（Ｃ₄〜Ｃ₈）に対する低い活
性、例えばSLU/LU比が３より上に相当する活性を有し得る。そのような変異体を
使用すると、短鎖脂肪酸の放出による望ましくないフレーバーの発生を避けるか
または抑制することができる。この変異体は、トリグリセリドおよびリン脂質な
らびにDGDGに対する活性を有し得る。チーズフレーバー短鎖脂肪族アシル基への活性を有する変異体は、食品におけるフレーバー発生
のために、例えばチーズの熟成において、M.ハンソン(Hanson), ZFL, 41(10), 6
64-666 (1990)に記載されているように、遊離の脂肪酸(FFA)を放出するために使
用することができる。

【００５０】乳脂肪から、長鎖脂肪酸に比べて短鎖脂肪酸の放出が増加される脂質分解酵素
変異体は、例えばフレーバー増加のために、または、チェダーもしくはパルメザ
ンのような熟成チーズの熟成時間を短くするために、チーズ製造において有用で
ある。そのような脂質分解酵素変異体の別の用途は、プロセスチーズ、ドレッシ
ングおよび軽食を含む種々の食品のための味付けとして使用するための、酵素変
性したチーズ(EMC)のための用途である。

【００５１】酪酸のような短鎖脂肪酸の放出は、チーズフレーバーの発生のために必須であ
るが、それに対して、オレイン酸のような長鎖脂肪酸の放出は、異臭を生じる。
チーズ用途のための脂質分解酵素変異体（EMCを含む）は、0.5未満、例えば0.25
未満、最も好ましくは0.1未満のSLU/LU比を有していなければならない。洗剤における使用変異体は、洗剤添加剤として、例えば0.001〜10（例えば0.01〜1）mg／g洗剤
または0.001〜100（例えば0.01〜10）mg／リットル洗浄液の濃度（精製酵素タン
パク質として表した）で使用することができる。

【００５２】洗剤においては、変異体は、脂汚れの除去を改善するために、長鎖トリグリセ
リド（Ｃ₁₆〜Ｃ₂₀）に対する高い活性を有し得る。変異体は、ホスホリパーゼ活
性を有し得る。変異体は、トリグリセリド中の短鎖（Ｃ₄〜Ｃ₈）脂肪酸に対する
低い活性、例えばSLU/LU比が10より上に相当する活性を有し得る。そのような変
異体を使用すると、短鎖脂肪酸の発生による望ましくない臭いの発生を避けるか
または抑制することができる。

【００５３】アルカリ性pHでリパーゼおよびホスホリパーゼの両方の活性を有する変異体は
、洗剤において使用することができる。洗剤組成本発明の洗剤組成物は、例えば、染色された布の前処理のために適当な洗濯添
加剤組成物およびリンス剤を加えた布用柔軟剤組成物を含む、手洗いもしくは機
械洗濯用の洗剤組成物として処方することができ、または一般的な家庭用の硬質
表面清浄作業における使用のための洗剤組成物として処方することができる。洗
濯洗剤においては、変異体は、脂汚れの除去、白色維持および黒ずみの浄化のた
めに有効であり得る。洗濯洗剤組成物は、WO97/04079、WO97/07202、WO97/41212
、PCT/DK WO98/08939およびWO97/43375に記載されているようにして、処方する
ことができる。

【００５４】本発明の洗剤組成物は特に、例えば英国特許2,247,025号（ユニリーバー(Unil
ever)）またはWO99/01531（プロクター＆ガンブル(Procter&Gamble)）に記載さ
れているように、手または機械での食器洗い操作のために処方することができる
。食器洗い組成物においては、変異体は、脂／油性汚れの除去のために、非常に
着色された部品による食器および食器のプラスチック部品の着色／変色の防止の
ために、および食器への石灰石鹸の堆積の回避のために有効であり得る。

【００５５】本発明の洗剤組成物は、任意の便利な形態、例えば棒、錠剤、粉末、顆粒、ペ
ーストまたは液体の形態であり得る。液体洗剤は、典型的には70％までの水およ
び0〜30％の有機溶媒または非水性溶媒を含む、水性液体であり得る。洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤を含み、これは、非イオン性（半極性を
含む）および／またはアニオン性および／またはカチオン性および／または両イ
オン性であることができる。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％、例えば0
.5〜40重量％、例えば1〜30重量％、典型的には1.5〜20重量％の濃度で存在する
。

【００５６】含まれるときには、洗剤は通常、約1％〜約40％のアニオン性界面活性剤、例
えば直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファ-オレフィンスルホネート、
硫酸アルキル（脂肪族アルコールサルフェート）、アルコールエトキシサルフェ
ート、第２級アルカンスルホネート、アルファ-スルホ脂肪酸メチルエステル、
アルキル-もしくはアルケニルコハク酸または石鹸を含む。

【００５７】含まれるときには、洗剤は通常、約0.2〜約40％の非イオン性界面活性剤、例
えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポ
リグリコシド、アルキルジメチルアミン-オキシド、エトキシル化脂肪酸モノエ
タノール-アミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪
酸アミドまたは、グルコサミンのN-アシル誘導体（「グルカミド」）を含む。

【００５８】本発明はまた、本発明の変異体を含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤なら
びに洗剤組成物は、１種以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチ
ナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナ
ーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラ
ッカーゼおよび／またはペルオキシダーゼを含むことができる。

【００５９】一般に、選ばれた酵素の特性は、選ばれた洗剤と適合性でなければならず（す
なわち、pH最適条件、他の酵素および非酵素成分との適合性等）、酵素は有効な
量で存在しなければならない。プロテアーゼ：適当なプロテアーゼは、動物、植物または微生物起源のものを
含む。微生物起源が好ましい。化学的に変性された、またはタンパク質操作され
た変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテ
アーゼ、例えばアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼ
であり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシン、特にバチルス(Bac
illus)から誘導されたもの、例えばサブチリシンノボ(subtilisin Novo)、サ
ブチリシンカールスバーグ(subtilisin Carlsberg)、サブチリシン309、サブ
チリシン147およびサブチリシン168（WO89/06279に記載されている）である。ト
リプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば豚または牛起源）および、
WO89/06270およびWO94/25583に記載されたフサリウム (Fusarium)プロテアーゼ
である。

【００６０】有用なプロテアーゼの例は、WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116およびWO98
/34946に記載された変異体、特に、以下の位置の１つ以上に置換を有する変異体
である：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、
218、222、224、235および274。特定の市販の入手可能なプロテアーゼとしては、Alcalase（商標）、Savinase
（商標）、Primase（商標）、Duralase（商標）、Esperase（商標）およびKanna
se（商標）（ノボノルディスク(Novo Nordisk)A/S）、Maxatase（商標）、Max
acal（商標）、Maxapem（商標）、Properase（商標）、Purafect（商標）、Pura
fect OxP（商標）、FN2（商標）およびFN3（商標）（ジェネンコールインター
ナショナル(Genencor International)社）を包含する。

【００６１】セルラーゼ：適当なセルラーゼは、細菌または菌類起源のものを含む。市販の
変性された、またはタンパク質操作された変異体が含まれる。適当なセルラーゼ
としては、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、フミコラ(
Humicola)属、フサリウム(Fusarium)属、チエラビア(Thielavia)属、アクレモニ
ウム(Acremonium)属からのセルラーゼ、例えば、米国特許第4,435,307号、同第5
,648,263号、同第5,691,178号、同第5,776,757号およびWO89/09259に開示された
、フミコラインソレンス(Humicola insolens)、ミセリオフトラサーモフィ
ラ(Myceliophthora thermophilla)およびフサリウムオキシスポラム(Fusarium
oxysporum)から生成された菌類セルラーゼを包含する。

【００６２】特に適当なセルラーゼは、カラーケアベネフィット(colour care benefit
)を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例
は、欧州特許第0,495,257号、欧州特許第0,531,372号、WO96/11262、WO96/29397
、WO98/08940に記載されたセルラーゼである。他の例は、WO94/07998、欧州特許
第0,531,315号、米国特許第5,457,046号、同第5,686,593号、同第5,763,254号、
WO95/24471、WO98/12307およびPCT/DK98/00299に記載されたようなセルラーゼ変
異体である。

【００６３】市販の入手可能なセルラーゼとしては、Celluzyme（商標）およびCarezyme（
商標）（ノボノルディスク(Novo Nordisk)A/S）、Clazinase（商標）およびPu
radax HA（ジェネンコールインターナショナル(Genencor International)社）
ならびにKAC-500(B) （商標）（カオーコーポレーション(Kao Corporation)）
を包含する。

【００６４】ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは
、植物、細菌または菌類起源のものを含む。化学的に変性された、またはタンパ
ク質操作された変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプ
リナス(Coprinus) 、例えばC.シネレウス(cinereus)からのペルオキシダーゼお
よび、WO93/24618、WO95/10602およびWO98/15257に記載されたようなその変異体
を包含する。

【００６５】市販の入手可能なペルオキシダーゼとしては、Guardzyme（商標）（ノボノ
ルディスク(Novo Nordisk)A/S）を包含する。洗剤酵素は、１種以上の酵素を含む別々の添加剤を加えることによって、また
は、これらの酵素をすべて含む、一緒にした添加剤を加えることによって、洗剤
組成物中に含まれることができる。本発明の洗剤添加剤（すなわち、別々の添加
剤または一緒にした添加剤）は、例えば顆粒、液体、スラリー等として処方され
ることができる。特定の洗剤添加剤処方物は、顆粒、特に粉塵の出ない(nondust
ing)顆粒、液体、特に安定化された液体またはスラリーである。

【００６６】粉塵の出ない(nondusting)顆粒は、例えば米国特許第4,106,991号および同第4
,661,452号に開示されたようにして製造することができ、任意的に当技術分野で
公知の方法によってコーティングされることができる。蝋質コーティング材料の
例は、平均分子量1000〜20000を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエ
チレングリコール、PEG）；16〜50個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ
ル化ノニルフェノール；エトキシル化脂肪族アルコール（アルコールが12〜20個
の炭素原子を有し、かつ15〜80個のエチレンオキシド単位がある）；脂肪族アル
コール；脂肪酸；ならびに、脂肪酸のモノ-およびジ-およびトリグリセリドであ
る。流動床技術による適用のために適当な膜形成コーティング材料の例は、英国
特許第1483591号に与えられている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方
法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖もしくは糖アルコー
ル、乳酸またはホウ酸を添加することによって安定化され得る。保護された酵素
は、欧州特許第238,216号に開示された方法に従って製造することができる。

【００６７】洗剤は、0〜65％の洗剤ビルダーまたは錯化剤、例えばゼオライト、ジホスフ
ェート、トリホスフェート、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリ
ロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル-
もしくはアルケニルコハク酸、可溶性シリケートまたは層をなす(layered)シリ
ケート（例えばヘキスト(Hoechst)からのSKS-6）を含むことができる。

【００６８】洗剤は、１種以上のポリマーを含むことができる。例は、カルボキシメチルセ
ルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビ
ニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン-N-オキシド）、ポリ（ビニルイミダ
ゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アク
リル酸コポリマーおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである
。

【００６９】洗剤は、漂白系を含むことができ、これは、Ｈ₂Ｏ₂源、例えばパーボレートま
たはパーカーボネートを含むことができ、過酸生成漂白活性化剤、例えばテトラ
アセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホネートと組合
せることができる。あるいは、漂白系は、アミド、イミドまたはスルホンタイプ
のペルオキシ酸を含むことができる。

【００７０】本発明の洗剤組成物の酵素は、慣用の安定化剤、例えばポリオール、例えばプ
ロピレングリコールまたはグリセロール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ
酸もしくはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステルまたはフェニルホウ酸(b
oronic acid)誘導体、例えば4-ホルミルフェニルホウ酸(boronic acid)を用いて
安定化することができ、組成物は、例えばWO92/19709およびWO92/19708に記載さ
れたようにして処方することができる。

【００７１】洗剤はまた、他の慣用の洗剤成分、例えばクレーを含む布用コンディショナー
、発泡促進剤、泡立ち抑制剤、腐食防止剤、汚れ懸濁剤(soil-suspending agent
)、汚れ再沈積防止剤(anti-soil redeposition agent)、染料、殺菌剤、蛍光漂
白剤、屈水性誘発物質、曇り防止剤または香料を含むことができる。洗剤組成物においては、任意の酵素、特に本発明の変異体が、洗浄液１リット
ル当たり0.01〜100mgの酵素タンパク質、例えば洗浄液１リットル当たり0.05〜5
mgの酵素タンパク質、特に洗浄液１リットル当たり0.1〜1 mgの酵素タンパク質
に相当する量で添加され得ることが目下予想される。

【００７２】本発明の変異体は追加的に、WO97/07202に開示された洗剤処方中に組み込まれ
得る。この公報は、参照することによって本明細書に組入れられる。酵素変異体の製造方法本発明の酵素変異体は、例えばWO97/04079（ノボノルディスク(Novo Nordis
k)）に記載されているような当技術分野で公知の方法によって製造することがで
きる。以下は、酵素をコードするDNA配列のクローニング方法、次いで酵素をコ
ードする配列内の特定部位に変異を生じさせる方法を記載する。酵素をコードするDNA配列のクローニング親酵素をコードするDNA配列を、問題の酵素を生成する任意の細胞または微生
物から、当技術分野でよく知られている種々の方法を用いて、分離することがで
きる。まず、研究されるべき酵素を生成する生物からの染色体DNAまたはメッセ
ンジャーRNAを用いて、ゲノムDNAおよび／またはcDNAライブラリーを構築しなけ
ればならない。次に、酵素のアミノ酸配列が知られているなら、標識したオリゴ
ヌクレオチドプローブを合成し、問題の生物から調製したゲノムライブラリーか
ら、酵素をコードするクローンを同定するのに使用することができる。あるいは
、別の公知の酵素遺伝子に相同の配列を含む標識したオリゴヌクレオチドプロー
ブを、ハイブリダイゼーションおよび低いストリンジェンシー(stringency)の洗
浄条件を用いて、酵素をコードするクローンを同定するためにプローブとして使
用することができる。

【００７３】酵素をコードするクローンを同定するためのなお別の方法は、ゲノムDNAの断
片を発現ベクター、例えばプラスミドへ挿入すること、得られるゲノムDNAライ
ブラリーを用いて酵素なしの細菌を形質転換すること、および次いで、酵素のた
めの基質（すなわち、マルトース）を含む寒天上で形質転換した細菌を培養し、
それによって酵素を発現するクローンを同定することを可能にすることを含む。

【００７４】あるいは、確立された標準の方法、例えばS.L.ビューケージ(Beaucage)および
M.H.カルサーズ(Caruthers)(1981), Tetrahedron Letters 22, p.1859-1869に記
載されているホスホルアミダイト法または、マセス(Matthes)ら、(1984), EMBO
J. 3, p. 801-805に記載された方法によって、酵素をコードするDNA配列を合成
的に製造することができる。ホスホルアミダイト法においては、オリゴヌクレオ
チドが、例えば自動DNA合成機で合成され、精製され、アニールされ、連結され
、そして適当なベクター中でクローン化される。

【００７５】最後に、混合されたゲノムおよび合成の起源、混合された合成およびcDNAの起
源、または混合されたゲノムおよびcDNAの起源のDNA配列が、標準の技術に従っ
て、合成、ゲノムまたはcDNAの起源の断片（適当には、全DNA配列の種々の部分
に対応する断片）を連結することによって製造される。DNA配列はまた、例えば
米国特許第4,683,202号またはR.K.サイキ(Saiki)ら、(1988)Science 239, 1988,
pp. 487-491に記載されたような特定のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)によって製造することができる。部位特異的変異誘発酵素をコードするDNA配列が分離され、変異のために望ましい部位が同定され
たら、合成オリゴヌクレオチドを用いて、変異を導入することができる。これら
のオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位を攻撃するヌクレオチド配列を含む。
特定の方法においては、DNAの単鎖ギャップ（酵素をコードするDNA配列）が、酵
素遺伝子を含むベクター中で作られる。次に、合成ヌクレオチド（所望の変異を
有する）が、単鎖DNAの相同部分にアニールされる。残ったギャップは次に、DNA
ポリメラーゼI（クレノウフラグメント）を用いて満たされ、構築物は、T4リガ
ーゼを用いて連結される。この方法の特定の例は、モリナガ(Morinaga)ら、(198
4), Biotechnology 2, p. 646-639に記載されている。米国特許第4,760,025号は
、カセットの小さい変更を行うことによる、多重変異をコードするオリゴヌクレ
オチドの導入を開示する。しかしながら、モリナガ(Morinaga)の方法によって、
任意の一時に、非常に多くの種類の変異さえもが導入され得る。というのは、多
重の種々の長さを有するオリゴヌクレオチドが導入され得るからである。

【００７６】酵素をコードするDNA配列に変異を導入するための別の方法は、ネルソン(Nels
on)およびロング(Long)、(1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151に
記載されている。それは、化学的に合成されたDNA鎖を、PCR反応におけるプライ
マーの１つとして用いて導入された所望の変異を含むPCR断片の３段階生成を含
む。PCRで生成された断片から、変異を含むDNA断片が、制限エンドヌクレアーゼ
を用いる開裂によって分離され、発現プラスミドへ再挿入され得る。

【００７７】さらに、シールクス(Sierks)ら、（1989）「アスペルギルスアワモリのグル
コアミラーゼの活性部位Trp120における部位特異的変異誘発(Site-directed mut
agenesis at the active site Trp 120 of Aspergillus awamori glucoamylase)
」、Protein Eng., 2, 621-625；シールクス(Sierks)ら、(1990)、「アスペルギ
ルスアワモリからの酵素におけるAsp176、Glu179およびGlu180の変異誘発によ
り規定される菌類グルコアミラーゼの触媒メカニズム(Catalytic mechanism of
fungal glucoamylase as defined by mutagenesis of Asp176, Glu179 and Glu1
80 in the enzyme from Aspergillus awamori)」、Protein Eng., 3巻、193-198
；はまた、アスペルギルス(Aspergillus)のグルコアミラーゼにおける部位特異
的変異誘発について記載する。酵素変異体の発現本発明に従って、上記した方法により、または当技術分野で公知の任意の代替
的方法によって製造される変異体をコードするDNA配列は、酵素形態で、発現ベ
クターを用いて発現されることができ、発現ベクターは、典型的には、プロモー
ター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび任意的にリ
プレッサー遺伝子または種々のアクチベーター遺伝子をコードする調節配列を含
む。発現ベクター本発明の酵素変異体をコードするDNA配列を有する組換え発現ベクターは、組
換えDNA操作に便利に供されることができる任意のベクターであることができ、
ベクターの選択はしばしば、それが導入されるべき宿主細胞に依存する。ベクタ
ーは、宿主細胞に導入されるときに、宿主細胞ゲノムへ組み込まれ、それが組み
込まれた染色体と共に複製されるものであり得る。適当な発現ベクターの例は、
pMT838を含む。プロモーターベクターにおいては、DNA配列は、適当なプロモーター配列に操作可能に接続
されていなければならない。プロモーターは、選択される宿主細胞において転写
活性を示す任意のDNA配列であることができ、宿主細胞に相同または非相同のタ
ンパク質をコードする遺伝子から誘導されることができる。

【００７８】本発明の酵素変異体をコードするDNA配列の転写を指示するのに適当なプロモ
ーターの例は、特に細菌宿主においては、大腸菌(E. coli) のlacオペロンのプ
ロモーター、ストレプトミセスコエリカラー(Streptomyces coelicolor)のア
ガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、バチルスリチェニホルミス(Bacillus lich
eniformis)のα-アミラーゼ遺伝子(amyL)のプロモーター、バチルスステロサ
ーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)のマルトゲンアミラーゼ遺伝子(am
yM)のプロモーター、バチルスアミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliqu
efaciens)のα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)のプロモーター、バチルスサブチリス
(Bacillus subtilis)のxylAおよびxylB遺伝子のプロモーター等である。菌類宿
主における転写のためには、有用なプロモーターの例は、A.オリザエ(oryzae)の
TAKAアミラーゼをコードする遺伝子から誘導されたもの、S.セレビシエ(cerevis
iae)（アルバー(Alber)ら、(1982), J. Mol. Appl. Genet. 1, p. 419-434）、
リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)のアスパラギン酸プロテイナーゼ
、A.ニガー(niger)の中性α-アミラーゼ、A.ニガー(niger)の酸性の安定α-アミ
ラーゼ、A.ニガー(niger)のグルコアミラーゼ、リゾムコールミエヘイ(Rhizom
ucor miehei)のリパーゼ、A.オリザエ(oryzae)のアルカリプロテアーゼ、A.オリ
ザエ(oryzae)のトリオースホスフェートイソメラーゼまたはA.ニドゥランス(nid
ulans)のアセトアミダーゼからのTPI（トリオースホスフェートイソメラーゼ）
プロモーターである。発現ベクター本発明の発現ベクターはまた、適当な転写ターミネーターおよび、真核生物に
おいては、本発明のα-アミラーゼ変異体をコードするDNA配列に操作可能に接続
されたポリアデニル化配列を含むことができる。終止およびポリアデニル化配列
は、プロモーターと同じ供給源から適当に誘導され得る。

【００７９】ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてベクターの複製を可能にするDNA
配列を含み得る。そのような配列の例は、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110
、pE194、pAMB1およびpIJ702の複製の起源である。ベクターはまた、選択可能なマーカー、例えばその生成物が宿主細胞において
欠陥を補完する遺伝子、例えばB. サブチリス(subtilis)もしくはB. リチェニホ
ルミス(licheniformis)からのdel遺伝子、または抗生物質抵抗性、例えばアンピ
シリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン抵抗性
を与える遺伝子を含むことができる。さらには、ベクターは、アスペルギルス (
Aspergillus)選択マーカー、例えばamdS、argB、niaDおよびsC、ヒグロマイシン
抵抗性を生じるマーカーを含むことができるか、または選択は、例えばWO91/172
43に記載されたようにして、共-形質転換(co-transformation)によって達成され
得る。

【００８０】酵素変異体、プロモーター、ターミネーターおよび他の要素をそれぞれコード
する本発明のDNA構築物を連結し、かつそれらを、複製のために必要な情報を含
む適当なベクターに挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている
（例えばサムブルック(Sambrook)ら、分子クローニング：実験室マニュアル(Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual), 第２版、コールドスプリングハー
バー(Cold Spring Harbor), 1989参照）。宿主細胞本発明の細胞（先に定義した本発明のDNA構築物または発現ベクターを含む）
は有利には、本発明の酵素変異体の組換え製造において宿主細胞として使用され
る。細胞は、便利には、宿主の染色体にDNA構築物（１つ以上のコピーで）を組
み込むことによって、変異体をコードする本発明のDNA構築物を用いて形質転換
されることができる。DNA配列が多分細胞中に安定に維持されるので、この組み
込みは一般に有利であると考えられる。宿主染色体へのDNA構築物の組み込みは
、慣用の方法に従って、例えば相同または非相同の組換えによって行うことがで
きる。あるいは、細胞は、異なるタイプの宿主細胞と共に、上記した発現ベクタ
ーを用いて形質転換されることができる。

【００８１】本発明の細胞は、より高等な生物、例えば哺乳動物または昆虫の細胞であるこ
とができるが、微生物細胞、例えば細菌もしくは菌類（酵母を含む）細胞であり
得る。適当な細菌の例としては、グラム陽性菌、たとえばバチルスサブチリス(Bac
illus subtilis)、バチルスリチェニホルミス(Bacillus licheniformis)、バ
チルスレンタス(Bacillus lentus)、バチルスブレビス(Bacillus brevis)、
バチルスステロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス
アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルスアミロリクエファシエ
ンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルスコアギュランス(Bacillus coag
ulans)、バチルスサーキュランス(Bacillus circulans)、バチルスラウタス
(Bacillus lautus)、バチルスメガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス
スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)もしくはストレプトミセスリビ
ダンス(Streptomyces lividans)もしくはストレプトミセスムリナス(Streptom
yces murinus)または、グラム陰性菌、例えば大腸菌(E. coli)である。細菌の形
質転換は、例えば、自体公知のやり方で、原形質体の形質転換によって、または
完全な細胞を用いて行うことができる。

【００８２】酵母生物体は、サッカロミセス(Saccharomyces)またはシゾサッカロミセス(Sc
hizosaccharomyces)の種、例えばサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces c
erevisiae)から、好ましく選択され得る。宿主細胞はまた、糸状菌類、例えばアスペルギルス (Aspergillus)種に属する
株、例えばアスペルギルスオリザエ (Aspergillus oryzae)もしくはアスペル
ギルスニガー (Aspergillus niger)または、フサリウム (Fusarium)の株、例
えばフサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フサリウムグラミネ
ラム(Fusarium graminearum)（完全な状態で、グリベレラゼアエ(Gribberella
zeae)と呼び、以前には、スフェリアゼアエ(Sphaeria zeae)であり、ギベレ
ラロゼウム(Gibberella roseum)およびギベレラロゼウム(Gibberella roseu
m)f.sp.セレアリス(cerealis)の別名）またはフサリウムサルフレウム(Fusari
um sulphureum)（完全な状態でギベレラプリカリス(Gibberella puricaris)と
呼び、フサリウムトリコセシオイデス(Fusarium trichothecioides)、フサリ
ウムバクトリディオイデス(Fusarium bactridioides)、フサリウムサムブシ
ウム(Fusarium sambucium)、フサリウムロゼウム(Fusarium roseum)およびフ
サリウムロゼウム(Fusarium roseum)var.グラミネアラム(graminearum)の別名
）、フサリウムセレアリス(Fusarium cerealis)（フサリウムクロックウェ
ルンセ(Fusarium crokkwellnse)の別名）またはフサリウムベネナタム(Fusari
um venenatum)の株であることができる。

【００８３】本発明の特定の実施態様においては、宿主細胞は、プロテアーゼマイナス株の
プロテアーゼ欠乏体である。これは、例えば、「alp」と呼ばれるアルカリ性プロテアーゼ遺伝子が欠損し
た、プロテアーゼ欠乏株アスペルギルスオリザエ (Aspergillus oryzae)のJaL
125であることができる。この株は、WO97/35956（ノボノルディスク(Novo Nor
disk)）に記載されている。

【００８４】糸状菌類細胞は、自体公知のやり方で、原形質体形成および原形質体の形質転
換、次いで細胞壁の再生を含むプロセスによって形質転換することができる。宿
主微生物としてのアスペルギルス (Aspergillus)の使用は、欧州特許第238,023
号（ノボノルディスク(Novo Nordisk)）に記載されており、その内容は、参照
することによって本明細書に組入れられる。本発明の酵素変異体の製造方法本発明の酵素変異体は、変異体の製造を行う条件下で宿主細胞を培養すること
ならびに、細胞および／または培養培地から変異体を回収することを含む方法に
よって製造することができる。

【００８５】細胞を培養するのに使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖させ、本発明の
酵素変異体の発現を得るのに適当な任意の慣用の培地であることができる。適当
な培地は、販売業者から入手可能であるか、または公開されている処方に従って
製造することができる（例えば、ザアメリカンタイプカルチャーコレク
ション(the American Type Culture Collection)のカタログに記載されている）
。

【００８６】宿主細胞から分泌された酵素変異体は、よく知られた手順によって、培養培地
から便利に回収することができ、そのような手順としては、遠心分離またはろ過
によって培地から細胞を分離すること、および塩、例えば硫酸アンモニウムによ
って培地のタンパク質成分を沈殿させること、次いでクロマトグラフィー法、例
えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の使
用を含む。植物における変異体の発現本発明はまた、回収可能な量でこの酵素を発現し、製造するように、本発明の
変異体をコードするDNA配列を用いて形質転換された、トランスジェニック植物
、植物の一部または植物細胞に関する。酵素は、植物または植物の一部から回収
され得る。あるいは、組換え酵素を含む植物または植物の一部をそれ自体使用す
ることができる。

【００８７】トランスジェニック植物は、双子葉植物または単子葉植物（短くは、dicotま
たはmonocot）であることができる。単子葉植物の例は、草、例えばメドウグラ
ス(meadow grass)（ブルーグラス(blue grass)、ポー(Poa)）、飼草、例えばフ
ェストゥカ(festuca)、ロリウム(lolium)、温帯性の草(temperate grass)、例え
ばアグロスティス(Agrostis)および穀物、例えば小麦、オーツ麦、ライ麦、大麦
、コメ、モロコシ類(sorghum)およびメイズ(maize)（コーン）である。

【００８８】双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物(legum)、例えばルピナス(lupin)、ジ
ャガイモ、テンサイ、エンドウ、豆(bean)および大豆ならびに、アブラナ（ブラ
ッシカセアエ(Brassicaceae)科）、例えばカリフラワー、菜種(oil seed rape)
および近縁のモデル生物であるアラビドプシスタリアナ(Arabidopsis thalian
a)である。

【００８９】植物の一部の例は、茎、カルス、葉、根、果実、種子および塊茎である。本発
明においては、特定の植物組織、例えば葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア
、液胞、ペルオキシソームおよび細胞質体がまた、植物の一部と考えられる。さ
らに、いずれの組織起源にせよ、どのような植物細胞でも、植物の一部と考えら
れる。

【００９０】そのような植物、植物の一部および植物細胞の子孫がまた、本発明の範囲内に
含まれる。本発明の変異体を発現するトランスジェニック植物または植物細胞は、当技術
分野で公知の方法に従って構成することができる。簡単には、本発明の変異体を
コードする１つ以上の発現構築物を植物宿主ゲノムに組み込むこと、および得ら
れた修飾された植物または植物細胞をトランスジェニック植物または植物細胞へ
と増殖させることによって、植物または植物細胞が構成される。

【００９１】便利には、発現構築物は、選択された植物または植物の一部において遺伝子を
発現するのに必要とされる適当な調節配列と操作可能に関連して本発明の変異体
をコードする遺伝子を含むDNA構築物である。さらには、発現構築物は、発現構
築物が組み込まれた宿主細胞を同定するのに有用な選択可能なマーカーおよび、
問題の植物へ構築物の導入のために必要なDNA配列を含み得る（後者は、使用さ
れるべきDNA導入方法に依存する）。

【００９２】調節配列、例えばプロモーターおよびターミネータ配列ならびに任意的にシグ
ナルもしくはトランジット配列の選択は、例えば酵素がいつ、どこに、かつどの
ようにして発現されるのが好ましいかに基づいて、決定される。例えば、本発明
の変異体をコードする遺伝子の発現は、構成性もしくは誘導性であることができ
、または、発達上の段階または組織特異的であることができ、遺伝子産物は、特
定の組織もしくは植物の一部、例えば種子もしくは葉に対して標的にされること
ができる。調節配列は、例えばタグ(Tague)ら、Plant, Phys., 86, 506, 1988に
より記載されている。

【００９３】構成性発現のために、35S-CaMVプロモーターを使用することができる（フラン
ク(Franck)ら、1980, Cell 21: 285-294）。器官特異的プロモーターは、例えば
貯蔵シンク(sink)組織、例えば種子、ジャガイモの塊茎および果実からのプロモ
ーター（エドワーズ(Edwards)＆コルツィ(Coruzzi), 1990. Annu. Rev. Genet.
24: 275-303）または代謝シンク(sink)組織、例えば分裂組織からのプロモータ
ー（イトウ(Ito)ら、1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878）、種子特異的プロ
モーター、例えばコメからのグルテリン、プロラミン、グロブリンまたはアルブ
ミンプロモーター（ウー(Wu)ら、Plant and Cell Physiology 第39巻、No.8, pp
.885-889 (1998)）、コンラッドU.ら、Journal of Plant Physiology 第152巻、
No.6 pp. 708-711 (1998)により記載されたビシアファバ(Vicia faba) からの
レグミン(legumin)B4および未知の種子タンパク質遺伝子からのビシアファバ(
Vicia faba)プロモーター、種子油体タンパク質(seed oil body protein)からの
プロモーター（チェン(Chen)ら、Plant and Cell Physiology 第39巻、No.9 pp.
935-941 (1998)）、ブラッシカナパス(Brassica napus)からの貯蔵タンパク
質napAプロモーターまたは、任意の他の、当技術分野で公知の、例えばWO91/147
72に記載されているような種子特異性プロモーターであり得る。さらには、プロ
モーターは、葉特異的プロモーター、例えばコメまたはトマトからのrbcsプロモ
ーター（キョウズカ(Kyozuka)ら、Plant Physiology 第102巻、No.3 pp. 991-10
00 (1993）、クロレラウィルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモ
ーター（ミトラ(Mitra), A.およびヒギンス(Higgins), DW, Plant Molecular Bi
ology 第26巻、No.1 pp. 85-93 (1994)）またはコメからのaldP遺伝子プロモー
ター（カガヤ(Kagaya)ら、Molecular and General Genetics第248巻、No.6 pp.
668-674 (1995)）、または傷誘導性プロモーター、例えばジャガイモpin2プロモ
ーター（スー(Xu)ら、Plant Molecular Biology 第22巻、No.4 pp. 573-588 (19
93)）であり得る。

【００９４】植物における酵素のより高い発現を達成するために、プロモーターエンハンサ
ー要素を使用することができる。例えば、プロモーターエンハンサー要素は、プ
ロモーターと、酵素をコードするヌクレオチド配列との間に置かれるイントロン
であり得る。例えば、スー(Xu)ら（前述）は、発現を増大するために、コメのア
クチン１遺伝子の第１のイントロンの使用を開示する。

【００９５】選択可能なマーカー遺伝子および、発現構築物の任意の他の部分を、当技術分
野で入手可能なものから選択することができる。 DNA構築物は、当技術分野で公知の慣用の技術に従って、植物ゲノムへ組み込
まれ、そのような技術としては、アグロバクテリウム(Agrobacterium)が仲介す
る形質転換、ウィルスが仲介する形質転換、ミクロ注入、粒子衝撃(particle bo
mbardment)、生物分解的(biolistic)形質転換およびエレクトロポレーションを
包含する（ガッサー(Gasser)ら、Science, 244, 1293；ポトリカス(Potrykus),
Bio/Techn. 8, 535, 1990；シマモト(Shimamoto)ら、Nature, 338, 274, 1989）
。

【００９６】目下、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)
が仲介する遺伝子転移が、トランスジェニック双子葉植物を生成するための選択
方法である（概説のためには、フーイカス(Hooykas)＆シルペルールト(Schilper
oort), 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38）。しかしながら、それを単子葉植
物を形質転換するのに使用することができる（他の形質転換法が一般にこれらの
植物のために使用されるけれど）。目下、トランスジェニック単子葉植物を生成
するための選択方法は、胚カリ(calli)または発生中の胚の粒子衝撃（形質転換D
NAでコーティングされた微細な金またはタングステン粒子）である（クリストウ
(Christou)、1992, Plant J. 2: 275-281；シマモト(Shimamoto)、1994, Curr.
Opin. Biotechnol. 5: 158-162；バジル(Vasil)ら、1992, Bio/Technology 10:
667-674）。単子葉植物の形質転換のための代替の方法は、オミルレー(Omirulle
h)S.ら、Plant Molecular Biology 第21巻、No.3 pp.415-428 (1993)により記載
されるような原形質体形質転換に基づく。

【００９７】形質転換後、当技術分野でよく知られた方法に従って、発現構築物を組み込ん
だ形質転換体が選択され、完全な植物へと再生される。材料および方法トリブチリンに対するリパーゼ活性(LU) 乳化剤としてアラビアゴムを用いてトリブチリン（グリセリントリブチレート
）を乳化することによって、リパーゼのための基質を調製する。30℃、pH7での
トリブチリンの加水分解を、pHスタット滴定実験で追跡する。１単位のリパーゼ
活性(1LU)は、標準条件下で１分当たり１μモルの酪酸を放出することができる
酵素の量に等しい。トリオレインに対するリパーゼ活性(SLU) 脂質分解活性を、基質としてオリーブ油を用いて測定することができる。

【００９８】このSLU法においては、40mMのNaClおよび5mMの塩化カルシウムを含む５mM Tr
is緩衝液中で、基質として安定化されたオリーブ油エマルジョン（シグマ(Sigma
)カタログNo.800-1）を用いて、30℃およびpH9でリパーゼ活性が測定される。2.
5mlの基質を12.5mlの緩衝液と混合し、pHを9に調整し、0.5mlの希釈したリパー
ゼ試料を添加し、そして形成されたオレイン酸の量を、pHスタットを用いた滴定
により追跡する。

【００９９】１SLUは、これらの条件下で１分当たり1モルの滴定可能なオレイン酸を遊離さ
せるリパーゼの量である。ホスホリパーゼ活性ホスホリパーゼ活性の定性または定量測定のために、以下のアッセイ法を使用
した。ホスホリパーゼ活性(PHLU) ホスホリパーゼ活性(PHLU)は、レシチンからの遊離の脂肪酸の放出として測定
される。50mMのHEPES、pH7中の50μlの4％L-アルファ-ホスファチジルコリン（
アバンティ(Avanti)からの植物レシチン）、4％Triton X-100、5mMのCaCl₂を、5
0mMのHEPES、pH7中で適当な濃度に希釈した50μlの酵素溶液に添加する。試料を
30℃にて10分間インキュベートし、遠心分離（7000rpmにて５分）の前に、反応
を95℃にて５分間停止する。ワコーケミカルズ(Wako Chemicals)社からのNEFA
Cキットを用いて、遊離の脂肪酸を測定し；25μlの反応混合物に250μlの試薬A
を添加し、37℃で10分間インキュベートする。次に、500μlの試薬Bを添加し、
試料を再び37℃で10分間インキュベートする。HP 8452Aダイオードアレイ分光光
度計を用いて、550nmでの吸収を測定する。試料は、少なくとも二重でランする
。基質および酵素の結合（予備加熱された酵素試料（95℃で10分間）＋基質）が
含まれる。脂肪酸標準として、オレイン酸を使用する。１PHLUは、これらの条件
下で１分当たり1μモルの遊離脂肪酸を放出することができる酵素の量に等しい
。ホスホリパーゼ活性(LEU) 一定のpHおよび温度下で、レシチンを加水分解し、遊離された脂肪酸の中和中
の滴定剤（0.1N NaOH）消費速度として、ホスホリパーゼ活性を測定する。

【０１００】基質は、大豆レシチン（L-α-ホスファチジル-コリン）であり、条件は、pH8.
00、40.0℃、反応時間2分間である。単位は、標準に対して定義される。ホスホリパーゼ単層アッセイ緩衝溶液（10mMのグリシン、pH9.0または10mMのNaOAc、pH5.0；1mMのCaCl₂、2
5℃）の徹底的に浄化した表面上に、ジ-デカノイルホスファチジルコリン(DDPC)
の単層をクロロホルム溶液から広げる。単層を放置（クロロホルムの蒸発）後、
表面圧を15mN/m（DDPCの平均分子面積(mean molecular area)約63オングストロ
ーム²／分子に相当する）に調整する。約60μg（マイクログラム）の酵素を含む
溶液を、単層を通して、「ゼロ-次トラフ(zero-order trough)」内の反応区画の
副相(subphase)（表面積2230mm²および反応体積56570mm³を有する注射器）に注
入する。不溶性の基質分子がより水溶性の反応生成物へと加水分解されるので、
一定の表面圧を維持するために、単層を圧迫する可動バリヤ(mobile barrier)の
速度によって、酵素活性が表される。反応生成物（カプリン酸およびMDPC）の水
溶性は、DDPCより著しく高いことが実証されているので、酵素によって１分当た
り加水分解されたDDPC分子の数が、DDPCの平均分子面積(mean molecular area)(
MMA)から見積られる。結果は、加水分解の最初の５分間にわたる平均バリヤ速度
に基づいて計算される。

【０１０１】バリヤが、２mm／分未満で動くなら、結果はホスホリパーゼ陽性であると考え
られる。プレートアッセイ１ A)精製水中の2％アガロース50mlを、５分間溶解／撹拌し、60〜63℃に冷却す
る。

【０１０２】 B) 30分間60℃にした、0.2MNaOAc、10mM CaCl₂、pH5.5の中の2%植物L-α-ホス
ファチジル-コリン95％50mlを、ウルトラソラックス(ultrathorax)を用いて15秒
間ブレンドする。等体積の2％アガロースおよび2％レシチン(AおよびB)を混合し、等体積の1％T
riton X-100をこの混合物に添加する。250μlの、精製水中のクリスタルバイオ
レット4mg/mlを、指示薬として添加する。混合物を、適当なペトリ皿に注ぎ（例
えば14cm径の皿に30ml）、酵素溶液を施用するために寒天中に適当な穴（３〜５
mm）をあける。

【０１０３】酵素試料を、OD₂₈₀=0.5に相当する濃度に希釈し、10マイクロリットルを、ア
ガロース／レシチンマトリックス中の穴に施用する。プレートを30℃にてインキ
ュベートし、プレート中の反応帯域を、約４〜５時間のインキュベーション後、
および／または約20時間のインキュベーション後に同定する。フミコララヌジ
ノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼを対照として使用し、対照より大きい清掃
帯域(clearing zone)の存在を、ホスホリパーゼ活性の正の結果として採用する
。

【０１０４】このアッセイの変形においては、Triton X-100の添加が削除される。プレートアッセイ２ 10gのアガロースを、電子レンジ中で沸騰させることによって550mlのH₂O中に
溶解させる。60〜70℃に冷却後、以下の成分を添加する： 250mlの0.4Mクエン酸塩緩衝液（pH4.5またはｐH7.1） 200mlの、2％ Triton X-100中3％レシチン（アバンティ(Avanti)からの） 2mlの2％クリスタルバイオレット 30mlの混合物を14cm径のペトリ皿に注ぐ。

【０１０５】酵素試料を施用後、プレートをインキュベートし、結果をプレートアッセイ１
についてと同様に解釈する。ジガラクトシルジグリセリド加水分解（DGDGアーゼ）活性単層アッセイ１緩衝溶液（10mMのNaOAc、pH5.5；1mMのCaCl₂、25℃；10mMのベータ-シクロデ
キストリン（シグマ(Sigma)C-4767））の徹底的に浄化した表面上に、DGDG（シ
グマ(Sigma)(D4651)）の単層をクロロホルム溶液から広げる。単層を放置（クロ
ロホルムの蒸発）後、表面圧を15mN/mに調整する。約60μg（マイクログラム）
の酵素を含む溶液を、単層を通して、「ゼロ-次トラフ(zero-order trough)」内
の反応区画の副相(subphase)（表面積2230mm²および反応体積56570mm³を有する
注射器）に注入する。（ベータ-シクロデキストリンの存在下で）不溶性の基質
分子がより水溶性の反応生成物へと加水分解されるので、一定の表面圧を維持す
るために、単層を圧迫する可動バリヤの増加する速度によって、酵素活性が表さ
れる。

【０１０６】バリヤが、１mm／分未満で動くなら、結果はDGDGアーゼ陽性であると考えられ
る。単層２緩衝溶液（約75ml、10mMのNaOAc、pH5.5；1mMのCaCl₂、25℃；10mMのベータ-
シクロデキストリン（シグマ(Sigma)C-4767））の徹底的に浄化した表面上に、D
GDG（シグマ(Sigma)(D4651)）の単層をクロロホルム溶液から広げて、表面圧約3
0mN/mにする。単層を放置（クロロホルムの蒸発）後、約30μg（マイクログラム
）の精製酵素を含む溶液を、単層を通して、表面圧を連続して測定しながら、75
mlの副相へと注入する。（ベータ-シクロデキストリンの存在下で）DGDGが水溶
性の反応生成物へと加水分解されるので、表面圧低下の増加する速度によって、
酵素活性が表される。

【０１０７】酵素添加後の表面圧の最大低下（dπ/dt）が-0.5 mN/分を超えるなら、結果は
DGDGアーゼ陽性であると考えられる。リポラーゼ(Lipolase)の多数の変異体が試
験され、DGDGアーゼ活性を有することが見出されたが、それに対して親酵素（リ
ポラーゼ(Lipolase)）のみは、非常に限られた活性しか有していなかった（dπ/
dt＞-0.5 mN/分）。酵母株 WO97/04079およびWO97/07205に記載された、サッカロミセスセレビシエ(Sac
charomyces cerevisiae)YNG318：MATa leu2-D2 ura3-52 his4-539 pep4-D1[cir+
]。酵母株の形質転換 DNA断片および開いたベクター(opened vector)を混合し、標準の方法によって
、酵母サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)YNG318へ形質転
換する。酵母形質転換のためのベクター pJSO026（S. セレビシエ(cerevisiae)発現プラスミド）は、WO97/07205および
、J.S.オッケルズ(Okkels)、(1996)「pYESベクターにおけるURA3-プロモーター
欠失は、サッカロミセスセレビシエにおける菌類リパーゼの発現レベルを増加
させる(A URA3-promoter deletion in a pYES vector increases the expressio
n level of a fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae) 」組換えDNAバイ
オテクノロジーIII：生物および工学科学の統合(Recombinant DNA Biotechnolog
y III: The Integration of Biological and Engineering Sciences),ニューヨ
ークアカデミーオブサイエンシーズ(New York Academy of Sciences)の会
誌第782巻に記載されている。それは、pYES 2.0の誘導性GAL1-プロモーターを、
構成的に発現されたサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)か
らのTPI（トリオースホスフェートイソメラーゼ）-プロモーターで置換し（アル
バート(Albert)およびカルワサキ(Karwasaki)、(1982)、J. Mol. Appl. Genet.,
1, 419-434）、かつURA3プロモーターの一部を欠失することによって、pYES 2.
0から誘導される。部位特異的変異誘発 H.ラヌジノサ(lanuginosa)脂質分解酵素の変異体の構成のために、市販のキッ
ト（カメレオン(Chameleon)二重鎖部位特異的変異誘発キット）を、製造業者の
使用説明書に従って使用することができる。

【０１０８】問題となる脂質分解酵素をコードする遺伝子が、プラスミドpHD414に挿入され
る。製造業者の使用説明書に従って、以下のプライマーの使用によって、pHD414
のアンピシリン遺伝子のScal部位が、Mlul部位に変えられる：プライマー3：AGAAATCGGGTATCCTTTCAG。問題となる脂質分解の遺伝子を含むpHD414ベクターは次に、DNAポリメラーゼ
およびオリゴ7258および7770のための鋳型として使用される。

【０１０９】 7258：5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3' （かくして、アンピシリン抵抗性遺伝子で見出され、切断のために使用されたSc
al部位をMlul部位へと変える）。プライマーno.7770を、選択プライマーとして使用した。 7770：5'p tct agc cca gaa tac tgg atc aaa tc 3'（アミノ酸配列を変える
ことなしに、H.ラヌジノサ(lanuginosa)リパーゼ遺伝子で見出されたScal部位を
変える）。

【０１１０】所望の変異（例えば、脂質分解の遺伝子のＮ-末端における、またはシステイ
ン残基の導入）が、所望の変異を含む適当なオリゴの添加によって、問題となる
脂質分解の遺伝子中へ導入される。 PCR反応が、製造業者の推奨に従って行われる。スクリーニング法酵母ライブラリーを、SC-ura寒天プレートのセルロースフィルター上に広げ、
30℃で３〜４日間インキュベートする。

【０１１１】次に、フィルターをレシチンプレートに移し、37℃で２〜６時間インキュベー
トする。活性ホスホリパーゼを含む酵母細胞は、コロニーの周りに白色清浄帯域
を発生させる。次に、陽性の変異体がさらに精製され、試験されることができる
。培地SC-ura培地酵母窒素（アミノ酸なし） 7.5g コハク酸 11.3g NaOH 6.8g カザアミノ酸（ビタミンなし） 5.6g トリプトファン 0.1g 寒天、メルク(Merck) 20g 蒸留水 1000mlにした。

【０１１２】 121℃で20分間オートクレーブに入れた。５％スレオニンの滅菌ストック溶液から４mlを、滅菌20％グルコース100mlと
一緒に900mlの体積に添加する。実施例実施例１：フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼからの主鎖お
よびフサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)ホスホリパーゼからのＣ
-末端を用いた、PCR反応による変異体の構成以下の変異体を、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼから
の主鎖のための鋳型として使用した：E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R およびSPI
RR +G91A +D96W +E99K +Q249R。親リパーゼを、Q249RのないＣ-末端において断
片を生成させるために使用した。Ｃ-末端ホスホリパーゼのための鋳型は、フミ
コララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの変異体と同じベクターでク
ローン化した、フサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)ホスホリパー
ゼであった。

【０１１３】 PCR反応１：5'プライマーとしての4244（SEQ ID NO:1）および3'プライマーと
してのH7（SEQ ID NO:6）および、上記した２つの鋳型のうちの１つ。 PCR反応２：5'プライマーとしてのFOL14（SEQ ID NO:3）および3'プライマー
としてのFOL15（SEQ ID NO:4）および鋳型としてのフミコララヌジノサ(Humic
ola lanuginosa)リパーゼ（pos 249に変異なし）。

【０１１４】 PCR反応３：5'プライマーとしてのFOL16（SEQ ID NO:5）および3'プライマー
としてのAP（SEQ ID NO:2）および鋳型としてのF.o.ホスホリパーゼ。 PCR反応４を行って、5'プライマーとしてのFOL14（SEQ ID NO:3）および3'プ
ライマーとしてのAP（SEQ ID NO:2）および鋳型としてのPCR反応２および３を用
いることによって、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ変異
体と、ホスホリパーゼからのＣ-末端との間の結合を作った。

【０１１５】 5'プライマーとしての4244（SEQ ID NO:1）および3'プライマーとしてのKBoj1
4（SEQ ID NO:7）および鋳型としてのPCR反応１および４を用いて、最終的PCRを
行った（反応２において鋳型としてフミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa
)リパーゼを用いることによって、位置249における変異を省略する可能性が生じ
た）。

【０１１６】最終のPCR断片を、制限酵素を用いて切断したpJSO026と一緒に、酵母における
インビボ(in vivo)組換えに使用した。Smal（またはBamHI）およびXbal（コー
ド領域を除去し、同時に、各末端に約75bpの重複を作って組換えの発生を可能に
するため）。この最終処理はまた、以下の実施例において使用された。プライマーFOL14（SEQ ID NO:3）およびプライマー15/16をオリゴと混合して
、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼおよびホスホリパーゼ
鋳型の両方と結合する可能性を与え、同時に両方の鋳型からのアミノ酸を異なる
位置に導入する可能性を与える。幾つかの位置について、新しいアミノ酸をまた
導入することができた。

【０１１７】プライマーFOL14（SEQ ID NO:3） H. ラヌジノサ(lanuginosa) リパーゼにおける位置205：75％R、25%S プライマーFOL15（SEQ ID NO:4）／FOL16（SEQ ID NO:5） H. ラヌジノサ(lanuginosa) リパーゼにおける位置256：50％P、50％A H. ラヌジノサ(lanuginosa) リパーゼにおける位置260：25％R、12.5％Q、12.
5％H、12.5％C、12.5％Y、12.5％W、12.5％stop。

【０１１８】得られる変異体の配列を決定し、以下の変更を有して、フミコララヌジノサ
(Humicola lanuginosa)リパーゼに対応することを見出した。括弧中の変更は、
不確実である。

【０１１９】

【表１】

【０１２０】実施例２：先端を切り取られた(truncated)配列の製造アミノ酸269、270、271、272、（273および274）後に停止して、変異体を作っ
た。以下の鋳型を用いて、以下のPCR反応を行った：E1A、G91A、D96W、E99K、P256
A、W260H、G263Q、L264A、I265T、G266D、T267A、L269N、270A、271G、272G、27
3F、(274S）。

【０１２１】反応１：5'プライマー4244（SEQ ID NO:1）および3'プライマーKBoj36（269後
に停止）反応２：5'プライマー4244（SEQ ID NO:1）および3'プライマーKBoj37（270後
に停止）反応３：5'プライマー4244（SEQ ID NO:1）および3'プライマーKBoj38（271後
に停止）反応４：5'プライマー4244（SEQ ID NO:1）および3'プライマーKBoj39（272後
に停止）得られる変異体の配列を決定し、以下の変更を有して、フミコララヌジノサ
(Humicola lanuginosa)リパーゼに対応することを見出した。

【０１２２】

【表２】

【０１２３】実施例３：ふた領域における変異の除去ホスホリパーゼ活性を失うことなく、G91AまたはE99Kを除去することができる
。得られる変異体の配列を決定し、以下の変更を有して、フミコララヌジノサ
(Humicola lanuginosa)リパーゼに対応することを見出した。

【０１２４】

【表３】

【０１２５】実施例４：ホスホリパーゼ活性を導入するための、フミコララヌジノサ(Humic
ola lanuginosa)リパーゼのＣ-末端領域におけるドーピング(doping) 位置256および位置263〜269での変異についての可能性を有する３つの異なる
ライブラリーを構築した。同時に、1、2、3または4個のアミノ酸でのＣ-末端の
伸長の可能性が含まれていた。

【０１２６】ドーピング、wt配列は下線が引かれている：

【０１２７】

【表４】

【０１２８】ライブラリーA：5'プライマーとして4244（SEQ ID NO:1）および3'プライマー
としてKBoj33および鋳型としてE1A +G91A +D96W +E99K +Q249R またはE1A +G225
Rを用いたPCR反応。このライブラリーからの変異体は伸長なしである。ライブラリーB：5'プライマーとして4244（SEQ ID NO:1）および3'プライマー
としてKBoj32（SEQ ID NO:8）および鋳型としてE1A +G91A +D96W +E99K +Q249R
またはE1A +G225Rを用いたPCR反応。このライブラリーからの変異体は、おそら
くＣ-末端伸長を含むが、伸長の前に停止コドンを含むことができる。

【０１２９】ライブラリーC：5'プライマーとして4244（SEQ ID NO:1）および3'プライマー
としてKBoj34および鋳型としてE1A +G91A +D96W +E99K +Q249R またはE1A +G225
Rを用いたPCR反応。このライブラリーからの変異体は、おそらく位置269に変異
およびＣ-末端伸長を含むが、伸長の前に停止コドンを含むことができる。以下の変異体が得られた：

【０１３０】

【表５】

【０１３１】実施例５：上記の変異体の幾つかについて、リパーゼおよびホスホリパーゼの
pH最適条件を、種々のpH値でLUおよびPHLU法を用いて決定した。結果は、pH最適
なホスホリパーゼ活性は、pH４〜６の範囲にあることを示した。リパーゼ活性に
ついての最適条件は、約ｐH6〜約pH10で変化した。 pH５および９にて、上記した単層アッセイによって、実施例５に挙げた８つの
変異体を、ホスホリパーゼ活性について分析した。結果は、すべての変異体がpH
５および９でホスホリパーゼ活性を有することを示したが、それに対して、親リ
パーゼ（フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ）は、pH５また
は９で活性を示さなかった。変異体に依存して、pH５での活性は、pH９のときよ
り高いかまたは低かった。

【０１３２】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの従来の変異体は、pH
５でホスホリパーゼ活性を有さないことがわかった：SPIRR +N94K +F95L +D96H
+N101S +F181L +D234Y +I252L +P256T +G263A +L264Q。実施例５：ホスホリパーゼ活性を有するフミコラ (Humicola)リパーゼの変異体フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)からの親リパーゼの変異体を製
造し、上記したようにしてホスホリパーゼ活性を試験した。以下の変異体は、ホ
スホリパーゼ活性を有することがわかったが、それに対して、親リパーゼは、同
じ方法によって、ホスホリパーゼ活性を有していなかった。

【０１３３】

【表６】

【０１３４】

【表７】

【０１３５】

【表８】

【０１３６】

【表９】

【０１３７】

【表１０】

【０１３８】

【表１１】

【０１３９】上記表において、(+274S)は、Ｃ-末端でのこのアミノ酸残基の存在が不確実で
あることを示す。１つのそのような変異体については、少量画分のみがこの残基
を含むことがわかった。上記変異体のいくつかは、リパーゼおよびホスホリパーゼの両方の活性を有す
ることが知られているF.オキシスポラム(oxysporum)からの従来の酵素より高い
、ホスホリパーゼ(PHLU)対リパーゼ(LU)の比を有していた。

【０１４０】上記変異体のいくつかについて、リパーゼおよびホスホリパーゼのpH最適条件
を、種々のpH値にてLUおよびPHLU法を用いて決定した。結果は、pH最適なホスホ
リパーゼ活性は、pH４〜６の範囲にあることを示した。リパーゼ活性についての
最適条件は、約ｐH6〜約pH10で変化した。 pH５および９にて、上記した単層アッセイによって、実施例５に挙げた８つの
変異体を、ホスホリパーゼ活性について分析した。結果は、すべての変異体がpH
５および９でホスホリパーゼ活性を有することを示したが、それに対して、親リ
パーゼ（フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ）は、pH５また
は９で活性を示さなかった。変異体に依存して、pH５での活性は、pH９のときよ
り高いかまたは低かった。

【０１４１】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの従来の変異体は、pH
５でホスホリパーゼ活性を有さないことがわかった：SPIRR +N94K +F95L +D96H
+N101S +F181L +D234Y +I252L +P256T +G263A +L264Q。フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)からの親リパーゼの以下の変異
体がまた、ホスホリパーゼ活性を有し得る：

【０１４２】

【表１２】

【０１４３】

【表１３】

【０１４４】実施例６：ホスホリパーゼ活性を有するリゾムコール (Rhizomucor)リパーゼの
変異体リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)からの親リパーゼの以下の２つ
の変異体を製造し、上記したようにしてホスホリパーゼ活性を試験した。変異体
は、ホスホリパーゼ活性を有することがわかったが、それに対して、親リパーゼ
は、同じ方法によって、ホスホリパーゼ活性を有していなかった。

【０１４５】 G266N G266V 実施例７：長鎖脂肪酸について増加した特異性を有するフミコラ (Humicola)リ
パーゼの変異体フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)からの親リパーゼの変異体を製
造し、異なる鎖長を有する２つのトリグリセリド基質：トリブチリン（Ｃ_4:0）
およびトリオレイン（Ｃ_18:1）に対する加水分解活性について試験した。試験は
、上記したLUおよびSLU法によって、pH９にて行った。以下の変異体が、親酵素
（フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) リパーゼ）より高い、トリオレ
イン活性対トリブチリン活性の比を有することがわかった：

【０１４６】

【表１４】

【０１４７】

【表１５】

【０１４８】

【表１６】

【０１４９】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)からの親リパーゼの以下の変異
体がまた、長鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有し得る：

【０１５０】

【表１７】

【０１５１】

【表１８】

【０１５２】実施例８：長鎖脂肪酸に対して増加した特異性を有するフサリウム (Fusarium)
リパーゼの変異体フサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)からの親リパーゼの変異体
を製造し、先の実施例におけるように試験した。以下の変異体が、親酵素より高
い、トリオレイン活性対トリブチリン活性の比を有することがわかった： Y23S Y260L フサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)からの親リパーゼの以下の
変異体がまた、長鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有し得る： R80H +S82T S82T +A129T 実施例９：長鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有するリゾムコール (Rhizomuc
or)リパーゼの変異体リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)からの親リパーゼの以下の変異
体は、長鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有し得る： Y260W Y28L Y28C +H217N 実施例10：短鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有するフミコラ (Humicola)リ
パーゼの変異体フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) からの親リパーゼの変異体を製
造し、先の実施例におけるように試験した。以下の変異体は、親酵素より高い、
トリブチリン活性対トリオレイン活性の比（より低いSLU/LU比）を有することが
わかった：

【０１５３】

【表１９】

【０１５４】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) からの親リパーゼの以下の変異
体がまた、より高いトリブチリン活性対トリオレイン活性の比を有し得る：

【０１５５】

【表２０】

【０１５６】実施例11：短鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有するフサリウム (Fusarium)
リパーゼの変異体フサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)からの親リパーゼの変異体
を製造し、先の実施例におけるように試験した。以下の変異体は、親酵素より高
い、トリブチリン活性対トリオレイン活性の比を有することがわかった： Y23W Y260D Y260R Y260C Y260N 実施例12：短鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有するリゾムコール (Rhizomuc
or)リパーゼの変異体リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei) からの親リパーゼの以下の変異
体は、短鎖脂肪酸に対する増加した特異性を有し得る： Y260C Y260G Y260V 実施例13：DGDGアーゼ活性を有するフミコラ (Humicola)リパーゼの変異体フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) からの親リパーゼの変異体を製
造し、DGDG（ジ-ガラクトシル-ジ-グリセリド）に対する加水分解活性を、上記
したようにして測定した。以下の変異体は、DGDGアーゼ活性を有することがわか
ったが、それに対して、親リパーゼは、負の結果を与えた。

【０１５７】

【表２１】

【０１５８】実施例14：増加したpH最適条件を有するフミコラ (Humicola)リパーゼの変異体フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) からの親リパーゼの変異体を製
造し、LU法により、pH７および９にてリパーゼ活性を測定した。以下の変異体は
、親リパーゼより高い、pH９での活性対pH７での活性の比を有することがわかっ
た： R84L R84W Y21I Y21V Y261I 実施例15：減少したpH最適条件を有するフミコラ (Humicola)リパーゼの変異体フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) からの親リパーゼの変異体を製
造し、LU法により、pH７および９にてリパーゼ活性を測定した。以下の変異体は
、親リパーゼより低い、pH９での活性対pH７での活性の比を有することがわかっ
た： Y261D G266D/E Y261W 実施例16：植物油の脱ゴムにおけるフミコラ (Humicola)リパーゼ変異体の使用本質的にWO98/18912（ノボノルディスク(Novo Nordisk)）の実施例６に記載
されたようにして、菜種油を、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) か
らのリパーゼの２つの変異体で処理した。

【０１５９】１つの変異体を、油1kg当たり酵素タンパク質0.6mgの酵素投与量で試験した。
種々のpHおよび温度での試験の結果は、pH5.7、35〜45℃で最適性能を示し、こ
こで、最終的P含量4ppmが達成された。45℃、pH6での別の実験は、最終的P含量4
ppmが、0.15mg/kgという低い酵素投与量で達成できたことを示した。別のフミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ変異体を用いた同
様の実験は、40℃、pH5.0〜5.5での最適性能を示した。酵素投与量は、0.3 mg/k
gであった。

【０１６０】第３のフミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ変異体を用い、4
5℃、pH5、1.8mg酵素／kg油にて菜種油を使用して、脱ゴム実験を行った。比較
のために、親リパーゼ（フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ
）を18 mg/kgで用いて、同様の実験を行った。結果は、変異体を用いて良好な脱
ゴム（＜10ppmの残留P含量）が、3.4時間で得られた。

【０１６１】親リパーゼ（フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ）は、10
倍高い酵素投与量でさえ、非常にわずかの脱ゴム効果しか有さないことがわかっ
た。実施例17：パン焼きにおけるリパーゼ変異体の使用フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)からのリパーゼの変異体を、以
下のようにして、パン焼き試験において評価した。

【０１６２】 40ppmのアスコルビン酸を用いて、ヨーロッパ純生地法(European straight do
ugh method)(ABF-SP-1201.01)に従って、メネバ(Meneba)小麦粉から生地を製造
した。以下の投与量で種々の組み合わせの添加剤を使用した：リパーゼ変異体0
、0.25、0.5または1.5mg/kg；リン脂質（レシチン）0または10g/kg；およびエン
ド-アミラーゼ0または750MANU/kg。

【０１６３】エンド-アミラーゼは、B. ステロサーモフィルス(stearothermophilus)からの
マルトゲンアミラーゼ（商品名Novamyl（商標））であった。１MANU（マルトゲ
ンアミラーゼノボ単位(Maltogenic Amylase Novo Unit）は、pH5.0、37℃
にて30分間、0.1Mクエン酸塩緩衝液1ml当たり10mgのマルトトリオース基質の濃
度で、１分当たり１μモルのマルトースを放出するのに必要とされる酵素の量と
して定義される。

【０１６４】パン焼き後、焼いたパン(loaf)を冷やし、パン体積(loaf volume)、パン片(cr
umb)の固さおよび軟らかさを、約２時間後に評価した。２重のプラスチックバッ
グ中に包んで、22℃で1、3および7日間貯蔵後に、評価を繰り返した。ステーブルミクロシステムズ(Stable Micro Systems)からのテクスチャー
アナライザー(texture analyzer)TA-XT2（探触子(probe)直径40mm）を用いて
、パン片の固さを測定した。

【０１６５】 25mm厚に切ったパン片中へ探触子を6.25mm押す（25％貫通）のに必要な力とし
て、グラムで表した軟らかさを測定した。結果は、変異体1.5mgの添加により、パン体積(loaf volume)が増加することを
示した。固さおよび弾性についての結果は、変異体が、有意に軟らかいパン片お
よび有意に良好な弾性を、０日から７日まで与えることを示す。実施例18：パン焼きにおける生地安定性のためのリパーゼ変異体の使用フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの変異体を、パン焼き
試験で評価して、生地の寝かせ(proofing)時間の延長に対するそれの耐性を評価
した。

【０１６６】 30ppmのアスコルビン酸、菌類α-アミラーゼ（10FAUのFungamyl）およびペン
トサナーゼ（100FXUのPentopan Mono）を用いて、ヨーロッパ純生地法(European
straight dough method)(347-SP-1217)に従って、ペリカン(Pelikan)小麦粉か
ら生地を製造した。0.2、0.4および0.6mg酵素タンパク質／kg小麦粉の変異体投
与量を、1000LUの親リパーゼと比較した。

【０１６７】生地をロールに作った。ロールの半分を45分間寝かせ(proof)（正常な寝かせ
時間）、他半分を70分間寝かせた（過度の寝かせ時間）。パンを焼いた後、冷却し、ロールの体積および立ち(standing)を、約２時間後
に評価した。立ち(standing)は、ロールの形状の尺度であり、10ロールの幅で割
った10ロールの高さとして定義され、これは、良好な丸みのパン塊(loaf)は高い
立ち値(standing value)を有するが、それに対して平たいロールは、低い立ち値
(standing value)を有することを意味する。

【０１６８】結果は、正常な寝かせ時間では、変異体0.4 mgおよび0.6mgの体積は、親リパ
ーゼの場合の体積より良く、ロールの立ちは、すべての投与量の変異体について
、親リパーゼの場合より良かった。ロールを過度に寝かせたときには、体積およ
び立ちの両方が、すべての投与量の変異体について、親リパーゼの場合より良か
った。実施例19：異臭発生へのリパーゼ変異体の影響異なる鎖長特異性を有するリパーゼからの異臭の発生を、全乳で評価した。発
生した酪酸／酸敗臭を、加熱後に試料の匂いを嗅ぐことによって評価した。

【０１６９】 25mlの全乳を、32℃の水浴中の100mlのブルーカップフラスコ（カップ付き）
に入れた。以下に挙げたリパーゼのそれぞれについて、0.2mg酵素タンパク質／
牛乳１リットルをフラスコに加えた。温度を45℃に上げ、15分後および105分後
に評価を行った。試験したリパーゼは、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ
およびその変異体であった。各リパーゼについて、鎖長特異性は、トリオレイン
(SLU)およびトリブチリン(LU)に対する活性の比として表される。

【０１７０】 3人が試料を評価し、以下に示した格付けに同意した。 + 検出可能な臭い ++ 明らかでかつ特徴的な酪酸および／または酸敗臭 +++ 強い酪酸および／または酸敗臭フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼより高いSLU/LU比を有
するフミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの３つの変異体は、
親リパーゼより少ない悪臭を有することがわかった。実施例20：洗濯後の布における悪臭に対するリパーゼ変異体の影響汚し綿布を、本明細書に記載した乳製品で汚した。50mgのバターを、一様な点にし
て、約30cm²の面積にわたって施用した。汚れた布を、環境条件下で24時間放置
した。洗濯工程 Terg-O-tometerにて、リパーゼを入れたおよび入れない（1250および5000LU/
リットル）市販の洗剤（5g/リットル）を使用して、汚れた布の洗濯を行った。
洗濯は、30℃で20分間100rpmにて行った。洗濯後、布を１晩放置して環境条件下
で乾燥させた。官能分析次の日、少なくとも10人の訓練した査定者からなる官能検査パネルによって、
異臭を査定した。試料を、堅く閉まったガラスびん中に保持し、悪臭の蓄積のた
めに、各評価の間少なくとも30分間あけた。布を取出し、布の悪臭を査定した。
酪酸の悪臭を、以下の等級に従って評点を付けた。対照として、リパーゼなしで
洗濯した試料を使用した。

【０１７１】０．対照より弱い臭い１．対照と同様２．対照より少し強い３．対照より明確に強い４．３より強い。

【０１７２】増加したトリオレイン／トリブチリン活性の比（増加したSLU/LU比）を有する
フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼの変異体は、親リパーゼ
（フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ）より弱いバター汚れ
からの臭いを与えることがわかった。別の洗濯実験は、変異体が、親酵素と同様
に、ラード汚れの除去に有効であることを示した。代替方法布の乳製品の汚れからの酪酸の強度はまた、器具による分析によって評価する
ことができる：１．ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによるか、または２．布からの臭いの抽出、次いでガスクロマトグラフィーによる。実施例21：バターと共に焼いたパンの匂いへのリパーゼ変異体の影響フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)からのリパーゼの６つの変異体
を製造し、3％のバターを添加して、ヨーロッパ純生地法(European straight do
ugh procedure)(347-SP-1217)によって焼いたパンにおいて評価した。0.2mgの酵
素タンパク質／kg小麦粉を、変異体のそれぞれについて使用した。

【０１７３】変異体の鎖長特異性をまた、トリオレイン／トリブチリン活性の比（上記した
SLU/LU）を測定することによって決定した。フミコララヌジノサ(Humicola la
nuginosa)からの親リパーゼおよび、フサリウムオキシスポラム(Fusarium oxy
sporum)からのホスホリパーゼ活性を有する従来のリパーゼをまた、比較のため
に試験した。

【０１７４】結果を以下にまとめる。 + 検出可能な臭い ++ 明らかでかつ特徴的な酪酸および／または酸敗臭 +++ 強い酪酸および／または酸敗臭。

【０１７５】

【表２２】

【０１７６】結果は、３以上のSLU/LU比（すなわち、長鎖脂肪酸についての高い特異性）を
有するリパーゼ変異体は、バターと一緒のレシピで焼いたパンにおいてさえ、不
快な臭いを与えないことを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】リパーゼ配列のアラインメント(alignment)を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ００３ 1/21 1/21 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号ＰＡ１９９９０１４８１ (32)優先日平成11年10月15日(1999．10．15) (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シャムカント，アナントパトカーデンマーク国，デーコー−2800 リュンビュー，クリストフェルスアレ 91 (72)発明者ボーチ，キムデンマーク国，デーコー−1808 コペンハーゲン，クレルケガーゼ 12 ２テーベー (72)発明者ビン，イェスペオデンマーク国，デーコー−2800 リュンビュー，バグスバエルトバイ 115 (72)発明者ペトリ，アンドレアスデンマーク国，デーコー−2200 コペンハーゲン，タイェンスバイ 81，３ (72)発明者グラッド，サンネシュレーデオデンマーク国，デーコー−2840 ホルテ，ビッゴバルフォズアレ 59 (72)発明者ブドルフセン，ジッテデンマーク国，デーコー−2000 フレデリクスベルウ，レイバイ３，３テーベーＦターム(参考） 4B001 AC25 EC01 4B024 AA05 AA17 BA11 CA02 DA12 HA01 4B032 DB01 DK51 4B050 CC04 DD02 HH01 LL02 LL04 4B065 AA01Y AA72X AB01 CA31 CA41 CA57 4H003 DA01 DA05 DA19 EC01 FA04 FA47

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脂質分解酵素変異体を製造する方法であって、ａ）基質および注目のエステル結合を選択し、ｂ）sn2位置を持つグリセロール部分を有するアルコール結合部位を有する親
脂質分解酵素を選択し、ｃ）該親脂質分解酵素において、該親脂質分解酵素および基質の３次元構造中
で、基質トリグリセリドのグリセロール部分のsn2位置のＣ-原子の10オングスト
ローム以内に少なくとも１つの原子を含む少なくとも１つのアミノ酸残基を選択
し、ｄ）そのそれぞれが、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換である変更を行い
、ｅ）任意的に、ｂ）以外の１つ以上の位置で、そのそれぞれが、アミノ酸残基
の挿入、欠失または置換である変更を行い、ｆ）工程ｂ〜ｄから得られる変異体を製造し、ｇ）選ばれたエステル結合に対する該変異体の活性を試験し、ｈ）選ばれたエステル結合に対する変えられた活性を有する該変異体を選択し
、そしてｉ）選ばれた該変異体を製造することを含む方法。
【請求項２】脂質分解酵素変異体を製造する方法であって、ａ）基質および注目のエステル結合を選択し、ｂ）活性Ser、活性Aspおよび活性His残基からなる触媒的三つ組を含む構造を
有する親脂質分解酵素を選択し、ｃ）該親脂質分解酵素において、以下の工程により定義されるセットEに属す
る少なくとも１つの原子を含む少なくとも１つのアミノ酸残基を選択し： i) 脂質分解酵素の構造と、触媒的三つ組および阻害剤リン原子を含むリ
ゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ構造4TGL (4TGL-inhP)とを
、２つの構造の触媒的三つ組の原子間の偏差の二乗の合計を最小にするように、
アライニングすること、 ii) 4TGL-inhPに中心を有する、半径18オングストロームの球の内側にあ
る脂質分解酵素の原子からなるセットAを規定すること、 iii) 4TGL-inhP、親脂質分解酵素の活性Ser残基のＣα原子および親脂質
分解酵素の活性Asp残基のＣα原子により規定される第１の平面を形成し、親脂
質分解酵素の活性His残基のＣα原子と、第１の平面の同じ側にある原子からな
る、セットAのサブセットとしてセットBを規定すること、 iv) 4TGL-inhP、親脂質分解酵素の活性Ser残基のＣα原子および親脂質分
解酵素の活性His残基のＣα原子により規定される第２の平面を形成し、親脂質
分解酵素の活性Asp残基のＣα原子とは、第２の平面の反対側にある原子からな
る、セットAのサブセットとしてセットCを規定すること、 v)セットBとセットCとを合わせたものに属し、かつ15以上の溶媒アクセシ
ビリティを有する原子からなるセットDを形成すること、および vi)セットDに属する原子または、セットBとセットCとを合わせたものに属
し、セットDに属する原子から3.5オングストローム未満に配置される原子を含む
構造中のアミノ酸残基からなるセットEを形成すること、ｄ）そのそれぞれが、選択されたアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である
変更を行い、ｅ）任意的に、ｄ）以外の１つ以上の位置で、そのそれぞれが、アミノ酸残基
の挿入、欠失または置換である変更を行い、ｆ）工程ｄ〜ｆから得られる変異体を製造し、ｇ）選ばれたエステル結合に対する該変異体の活性を試験し、ｈ）選ばれたエステル結合に対する変えられた活性を有する該変異体を選択し
、そしてｉ）選ばれた該変異体を製造することを含む方法。
【請求項３】脂質分解酵素変異体を製造する方法であって、ａ）基質および注目のエステル結合を選択し、ｂ）活性His残基を含む活性部位を有する親脂質分解酵素を選択し、ｃ）親脂質分解酵素のアミノ酸配列において、活性His残基のＣ-末端側で少な
くとも１つのアミノ酸残基を選択し、ｄ）そのそれぞれが、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換である変更を行い
、ｅ）任意的に、ｂ）以外の１つ以上の位置で、そのそれぞれが、アミノ酸残基
の挿入、欠失または置換である変更を行い、ｆ）工程ｂ〜ｄから得られる変異体を製造し、ｇ）選ばれたエステル結合に対する該変異体の活性を試験し、ｈ）選ばれたエステル結合に対する変えられた活性を有する該変異体を選択し
、そしてｉ）選ばれた該変異体を製造することを含む方法。
【請求項４】脂質分解酵素変異体を製造する方法であって、ａ）基質および注目のエステル結合を選択し、ｂ）親脂質分解酵素を選択し、ｃ）Ｃ-末端の10個のアミノ酸残基間で、少なくとも１つのアミノ酸残基を選
択し、ｄ）そのそれぞれが、選択されたアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である
変更を行い、ｅ）任意的に、ｃ）以外の１つ以上の位置で、そのそれぞれが、アミノ酸残基
の挿入、欠失または置換である変更を行い、ｆ）工程ｃ〜ｅから得られる変異体を製造し、ｇ）選ばれたエステル結合に対する該変異体の活性を試験し、ｈ）選ばれたエステル結合に対する変えられた活性を有する該変異体を選択し
、そしてｉ）選ばれた変異体を製造することを含む方法。
【請求項５】脂質分解酵素変異体を製造する方法であって、ａ）基質および注目のエステル結合を選択し、ｂ）ふたを有する親脂質分解酵素を選択し、ｃ）ふたにおいて、少なくとも１つのアミノ酸残基を選択し、ｄ）そのそれぞれが、選択されたアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である
変更を行い、ｅ）任意的に、ｃ）以外の１つ以上の位置で、そのそれぞれが、アミノ酸残基
の挿入、欠失または置換である変更を行い、ｆ）工程ｃ〜ｅから得られる変異体を製造し、ｇ）選ばれたエステル結合に対する該変異体の活性を試験し、ｈ）選ばれたエステル結合に対する変えられた活性を有する該変異体を選択し
、そしてｉ）選ばれた該変異体を製造することを含む方法。
【請求項６】脂質分解酵素が、真核生物、好ましくは菌類由来のものであ
り、最も好ましくはフミコラ(Humicola)科または接合菌網(Zygomycetes)科に属
する請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】脂質分解酵素変異体を製造する方法であって、ａ）基質および注目のエステル結合を選択し、ｂ）フミコラ(Humicola)科または接合菌網(Zygomycetes)科から親脂質分解酵
素を選択し、ｃ）フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼにおける20-25、56
-64、81-85および255-269の任意のアミノ酸に対応する少なくとも１つのアミノ
酸残基を選択し、ｄ）そのそれぞれが、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換である変更を行い
、ｅ）任意的に、ｃ）以外の１つ以上の位置で、そのそれぞれが、アミノ酸残基
の挿入、欠失または置換である変更を行い、ｆ）工程ｂ〜ｅから得られる変異体を製造し、ｇ）基質中の選ばれたエステル結合に対する該変異体の活性を試験し、そしてｈ）選ばれたエステル結合に対する変えられた活性を有する該変異体を選択す
ることを含む方法。
【請求項８】親脂質分解酵素が、フミコララヌジノサ(Humicola lanugi
nosa)の株DSM 4109のリパーゼである請求項７記載の方法。
【請求項９】変えられた活性が、トリグリセリドにおけるＣ₄〜Ｃ₈アシル
結合に対する活性がより低い活性であるか、または、トリグリセリドにおけるＣ ₄ 〜Ｃ₈アシル結合に対する活性とトリグリセリドにおけるＣ₁₆〜Ｃ₂₀アシル結合
に対する活性との比がより低いことである請求項１〜８のいずれか１項記載の方
法。
【請求項１０】親脂質分解酵素が、フミコラ(Humicola)科または接合菌網
(Zygomycetes)科、好ましくはフミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) の
株DSM 4109のリパーゼに属し、かつ、選択されたアミノ酸残基が、フミコララ
ヌジノサ(Humicola lanuginosa)のリパーゼにおけるY21、E56、D57、V60、G61、
D62、R81、S83、R84、L259、Y261またはG266に対応するアミノ酸を含む請求項９
記載の方法。
【請求項１１】変えられた活性が、トリグリセリドにおけるＣ₁₆〜Ｃ₂₀ア
シル結合に対する活性がより低い活性であるか、または、トリグリセリドにおけ
るＣ₁₆〜Ｃ₂₀アシル結合に対する活性とトリグリセリドにおけるＣ₄〜Ｃ₈アシル
結合に対する活性との比がより低いことである請求項１〜８のいずれか１項記載
の方法。
【請求項１２】変えられた活性が、より高いホスホリパーゼ活性である請
求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】親脂質分解酵素が、50PHLU/mgより下のホスホリパーゼ活
性および／または、0.1PHLU/LUより下のホスホリパーゼ活性対リパーゼ活性の比
を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】親脂質分解酵素が、フミコラ(Humicola)科または接合菌網
(Zygomycetes)科、好ましくはフミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) の
株DSM 4109のリパーゼに属し、かつ、選択されたアミノ酸残基が、フミコララ
ヌジノサ(Humicola lanuginosa)のリパーゼにおけるR81、R84、S85または263-26
7（例えばG266またはT267）に対応するアミノ酸を含む請求項１２または１３記
載の方法。
【請求項１５】変更が、Ｃ-末端での、好ましくは１〜５個のアミノ酸残
基を含むペプチド伸長の挿入を含み、第１残基は、好ましくはA、PまたはDであ
り、第２残基は、存在するなら、好ましくはV、GまたはRであり、第３残基は、
存在するなら、好ましくはV、GまたはRであり、第４残基は、存在するなら、好
ましくはFであり、第５残基は、存在するなら、好ましくはSである請求項１２〜
１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】変えられた活性が、ジガラクトシル-ジグリセリドに対す
るより高い加水分解活性である請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】親脂質分解酵素が、フミコラ(Humicola)科または接合菌網
(Zygomycetes)科、好ましくはフミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) の
株DSM 4109のリパーゼに属し、かつ、選択されたアミノ酸残基が、フミコララ
ヌジノサ(Humicola lanuginosa)のリパーゼにおける21、23、26、57、62、81、8
3、84、85、266、267または269に対応するアミノ酸を含む請求項１６記載の方法
。
【請求項１８】パン焼きにおいて使用するための脂質分解酵素変異体の製
造方法であって、ａ）親脂質分解酵素を選択し、ｂ）脂質分解酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である少なく
とも１つの変更を行って、脂質分解酵素変異体を得、ｃ）親脂質分解酵素と比べて、以下を有する脂質分解酵素変異体をスクリーニ
ングし： i)長鎖脂肪族アシル基へのより高い比選択性、 ii) ジガラクトシル-ジグリセリドに対するより高い活性、および iii)より高いホスホリパーゼ活性、そしてｄ）脂質分解酵素変異体を製造することを含む方法。
【請求項１９】親脂質分解酵素および変えられるべきアミノ酸が、請求項
１〜８のいずれか１項で定義したようにして選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】パン焼きにおいて使用するための脂質分解酵素変異体の製
造方法であって、ａ）脂質分解酵素をコードするDNA配列を、ランダム変異誘発に供し、ｂ）工程（ａ）で得られた、変異されたDNA配列を宿主細胞中で発現し、そし
てｃ）親脂質分解酵素と比べて、以下を有する脂質分解酵素変異体を発現する宿
主細胞をスクリーニングし： i)長鎖脂肪族アシル基へのより高い比選択性、 ii) ジガラクトシル-ジグリセリドに対するより高い活性、および iii)より高いホスホリパーゼ活性、そしてｄ）宿主細胞によって発現された脂質分解酵素を製造することを含む方法。
【請求項２１】 sn2位置を持つグリセロール部分を有するアルコール結合
部位を有する親脂質分解酵素の変異体である脂質分解酵素であって、その変異体
が、ａ）親脂質分解酵素および基質の３次元構造において、基質トリグリセリドの
グリセロール部分のsn2位置のＣ-原子の10オングストローム以内にある位置に、
アミノ酸残基の挿入、欠失または置換である変更を含み、かつｂ）基質中のエステル結合に対して変えられた活性を有する脂質分解酵素。
【請求項２２】ふたを有する親脂質分解酵素の変異体である脂質分解酵素
であって、その変異体が、ａ）ふたにおいてアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である変更を含み、か
つｂ）基質中のエステル結合に対して変えられた活性を有する脂質分解酵素。
【請求項２３】活性His残基を含む活性部位を有する親脂質分解酵素の変
異体である脂質分解酵素であって、その変異体が、ａ）活性His残基のＣ-末端側に少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入、欠失ま
たは置換である変更を含み、かつｂ）基質中のエステル結合に対して変えられた活性を有する脂質分解酵素。
【請求項２４】親脂質分解酵素の変異体である脂質分解酵素であって、そ
の変異体が、ａ）Ｃ-末端の10個のアミノ酸残基以内に少なくとも１つのアミノ酸の挿入、
欠失または置換である変更を含み、かつｂ）基質中のエステル結合に対して変えられた活性を有する脂質分解酵素。
【請求項２５】親脂質分解酵素が、真核生物、好ましくは菌類由来のもの
であり、最も好ましくは接合菌網(Zygomycetes)科に属する請求項２１〜２４の
いずれか１項記載の脂質分解酵素。
【請求項２６】親脂質分解酵素がフミコラ(Humicola)科または接合菌網(Z
ygomycetes)科、好ましくはフミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)の株DS
M 4109のリパーゼに属する請求項２５記載の脂質分解酵素。
【請求項２７】ａ）フミコラ(Humicola)科もしくは接合菌網(Zygomycetes
)科の対照脂質分解酵素と少なくとも80％相同性を有するアミノ酸配列を有する
ポリペプチドであり、ｂ）該対照脂質分解酵素と比べて、 i) フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) DSM 4109のリパーゼにお
けるA20、Y21、G23、K24、N25、V63、R81、G82、R84、A257、W260、Y261、F262
もしくはG266に対応する位置での置換、欠失もしくは挿入； ii)該リパーゼにおけるC268もしくはL269に対応するアミノ酸の置換； iii) 該リパーゼにおけるV60G、D62E、L93K、L97Q、K98E,F、E99D、P256A、
G263E,Q,R,F,N、L264A,C,P,F,G,V,I、I265L,N,F、もしくはT267A,Q,P,S,V,Eに対
応する置換； iv) 該リパーゼにおけるT267GSもしくはT267GLに対応する挿入； v) A、P、MD、CP、AG、DG、AGG、PVGF、AGRF、PRGF、AGGFもしくはAGGFSで
あるＣ-末端でのペプチド伸長； vi) 40-50個のアミノ酸の、Ｃ-末端でのペプチド伸長；または vii) Ｃ-末端での1、2、3、4、5もしくは6個のアミノ酸の先端切断；であるアミノ酸変更を含み、かつｃ）対照脂質分解酵素と比べて、基質中のエステル結合に対して変えられた活
性を有する脂質分解酵素。
【請求項２８】アミノ酸の変更が、R84K,L,W、W260H,Q,C、G266A,C,D,N,L
,I,S,T,P,V,F,W,E,K,R,YまたはL269N,I,Sに対応する請求項２７記載の脂質分解
酵素。
【請求項２９】 22、56-59、61、64、83、85、91、94、249、255または259
の任意の位置に対応する置換、欠失または挿入、好ましくはS83T、G91A、N94D、
D96S,W,F,G、Q249RまたはL259N,R,S,M,Qである、少なくとも１つのさらなるアミ
ノ酸変更をさらに含む請求項２７または２８記載の脂質分解酵素。
【請求項３０】 D62A,G,V、K98D、E99K、P256T、G263Aおよび／またはI265
T,G,Vに対応する置換をさらに含む請求項２７〜２９のいずれか１項記載の脂質
分解酵素。
【請求項３１】Ｎ-末端でのペプチド伸長を含む２７〜３０のいずれか１
項記載の脂質分解酵素。
【請求項３２】対照脂質分解酵素が、フミコララヌジノサ(Humicola la
nuginosa)からのリパーゼである２７〜３１のいずれか１項記載の脂質分解酵素
。
【請求項３３】対照脂質分解酵素が、リゾムコールミエヘイ(Rhizomuco
r miehei)からのリパーゼである２７〜３１のいずれか１項記載の脂質分解酵素
。
【請求項３４】対照脂質分解酵素が、フサリウムオキシスポラム(Fusar
ium oxysporum) からのリパーゼである２７〜３１のいずれか１項記載の脂質分
解酵素。
【請求項３５】ａ）アスペルギルスホエティダス(Aspergillus foetidu
s)からのリゾホスホリパーゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)か
らのフェルラ酸エステラーゼ、アスペルギルスツビンゲンシス(Aspergillus t
ubingensis)からのフェルラ酸エステラーゼまたはアスペルギルスオリザエ(As
pergillus oryzae)からのホスホリパーゼA1である対照酵素と少なくとも80％相
同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ｂ）該対照酵素と比べて、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)のリ
パーゼにおける20-25、56-64、81-85、91-98、255-257または259-269に対応する
位置での置換、欠失または挿入であるアミノ酸変更を含み、かつｃ）対照酵素と比べて、基質中のエステル結合に対して変えられた活性を有す
る脂質分解酵素。
【請求項３６】変更が、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)の
リパーゼにおけるY21、E56、D57、V60、G61、D62、S83、R84、G91、L93、N94、D
96、L97、K98、E99、P256、W260、Y261、G263、L264、I265、G266、T267またはL
269に対応する位置にある請求項３５記載の脂質分解酵素。
【請求項３７】変更が、好ましくは1-5個のアミノ酸による、Ｃ-末端での
伸長または先端切断である請求項３５または３６記載の脂質分解酵素。
【請求項３８】変えられた活性が、トリグリセリドにおけるＣ₄〜Ｃ₈アシ
ル結合に対する活性がより低い活性であるか、または、トリグリセリドにおける
Ｃ₄〜Ｃ₈アシル結合に対する活性とトリグリセリドにおけるＣ₁₆〜Ｃ₂₀アシル結
合に対する活性との比がより低いことである請求項２７〜３７のいずれか１項記
載の脂質分解酵素。
【請求項３９】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)のリパーゼ
におけるY21、E56、D57、V60、G61、D62、R81、S83、R84、L259、Y261またはG26
6に対応する位置でのアミノ酸変更を含む請求項３８記載の脂質分解酵素。
【請求項４０】変えられた活性が、トリグリセリドにおけるＣ₁₆〜Ｃ₂₀ア
シル結合に対する活性がより低い活性であるか、または、トリグリセリドにおけ
るＣ₁₆〜Ｃ₂₀アシル結合に対する活性とトリグリセリドにおけるＣ₄〜Ｃ₈アシル
結合に対する活性との比がより低いことである請求項２７〜３７のいずれか１項
記載の脂質分解酵素。
【請求項４１】変えられた活性が、より高いホスホリパーゼ活性である請
求項２７〜３７のいずれか１項記載の脂質分解酵素。
【請求項４２】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)のリパーゼ
におけるR81、R84、S85、G263、L264、I265、G266、T267またはL269に対応する
位置でのアミノ酸変更、好ましくはG263A,E,Q,R；L264A,C,P,Q；I265L,N,T；G26
6A,C,D,N,L,I,S,T,P,VまたはT267A,QまたはL269Nに対応する置換を含む請求項４
１記載の脂質分解酵素。
【請求項４３】本明細書で記載したｐH5での単層アッセイにおける0.1ナ
ノモル／分より大きいホスホリパーゼ活性および／または、100PHLU/mgより大き
い（好ましくは500 PHLU/mgより大きい）ホスホリパーゼ活性および／または、0
.1PHLU/LUより大きい（好ましくは0.5 PHLU/LUより大きい）ホスホリパーゼ活性
対リパーゼ活性の比を有する請求項４１または４２記載の脂質分解酵素。
【請求項４４】親脂質分解酵素が、50 PHLU/mgより下のホスホリパーゼ活
性および／または、0.1 PHLU/LUより下のホスホリパーゼ活性対リパーゼ活性の
比を有する請求項４１〜４３のいずれか１項記載の脂質分解酵素。
【請求項４５】Ｃ-末端での、好ましくは１〜５個のアミノ酸残基を含む
ペプチド伸長を含み、第１残基は、好ましくはA、PまたはDであり、第２残基は
、存在するなら、好ましくはV、GまたはRであり、第３残基は、存在するなら、
好ましくはV、GまたはRであり、第４残基は、存在するなら、好ましくはFであり
、第５残基は、存在するなら、好ましくはSである請求項４１〜４４のいずれか
１項記載の脂質分解酵素。
【請求項４６】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) の株DSM 41
09のリパーゼにおいて位置C268およびL269に対応する位置でのアミノ酸残基の欠
失を含む請求項４１〜４５のいずれか１項記載の脂質分解酵素。
【請求項４７】変えられた活性が、ジガラクトシル-ジグリセリドに対す
るより高い加水分解活性である請求項２７〜３７のいずれか１項記載の脂質分解
酵素。
【請求項４８】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼに
おけるY21、G23、N26、D57、D62、R81、S83、R84、S85、G266、T267またはL269
に対応する位置でのアミノ酸変更を含み、好ましくは２つ以上のそのような変更
を含み、最も好ましくは、ふた領域での少なくとも１つの変更をさらに含む請求
項４７記載の脂質分解酵素。
【請求項４９】負に帯電したアミノ酸残基の中性もしくは正に帯電したア
ミノ酸残基での置換または、中性アミノ酸残基の正に帯電したアミノ酸残基での
置換である、ふたにおける変更を含む請求項２７〜４８のいずれか１項記載の脂
質分解酵素。
【請求項５０】フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼに
おける位置G91、D96および／またはE99に対応する位置での、ふたにおける変更
、好ましくはG91A、D96S,W,FまたはE99Kである置換を含む請求項４９記載の脂質
分解酵素。
【請求項５１】変更E1E,D,A+ G91G,A,S,T+ N94N,D+ D96D,G,F,W+ E99E,K+
G225G,R,K+ G263Q,N+ L264L,A,V+ I265I,T,S+ G266G,A,V,S,D,E+ T267T,A,V+ L
269L,I,N,Qを含む、フミコララヌジノサ(Humicola lanuginosa) の株DSM 4109
から誘導された親リパーゼの変異体である脂質分解酵素。
【請求項５２】Ｎ-末端にペプチド伸長としてSPIRRおよび／またはＣ-末
端にペプチド伸長としてAGGFもしくはAGGFSをさらに含む請求項５１記載の脂質
分解酵素。
【請求項５３】請求項２７〜５２のいずれか１項記載の脂質分解酵素をコ
ードするDNA配列。
【請求項５４】請求項５３記載のDNA配列を含むベクター。
【請求項５５】請求項５３記載のDNA配列または請求項５４記載のベクタ
ーを含む形質転換された宿主細胞。
【請求項５６】請求項２７〜５２のいずれか１項記載の脂質分解酵素を製
造する方法であって、ａ）脂質分解酵素を発現、好ましくは分泌するように、請求項５５記載の細胞
を培養し、そしてｂ）脂質分解酵素を回収することを含む方法。
【請求項５７】生地または生地から製造される焼いた製品を製造する方法
であって、請求項２７〜５２のいずれか１項記載の脂質分解酵素を生地に添加す
ることを含み、脂質分解酵素は好ましくは、ホスホリパーゼ活性および／または
ジガラクトシルジグリセリド活性を有する方法。
【請求項５８】生地に、エンドアミラーゼおよび／またはリン脂質を添加
することをさらに含む請求項５７記載の方法。
【請求項５９】エンドアミラーゼが、バチルス(Bacillus)種からのもので
あり、好ましくはB.ステロサーモフィルス(stearothermophilus)からのマルトゲ
ンアミラーゼである請求項５７または５８記載の方法。
【請求項６０】食用油中のリン脂質含量を減らすための方法であって、大
部分のリン脂質を加水分解するように、油を請求項４１〜４６、５１または５２
のいずれか１項記載の脂質分解酵素で処理し、そして加水分解されたリン脂質を
含む水性相を油から分離することを含む方法。
【請求項６１】リン脂質を含む炭水化物起源の水性溶液またはスラリーの
ろ過性を改善する方法であって、溶液またはスラリーを請求項４１〜４６、５１
または５２のいずれか１項記載の脂質分解酵素で処理することを含み、溶液また
はスラリーが好ましくは、でん粉加水分解物、特に小麦でん粉加水分解物を含む
方法。
【請求項６２】界面活性剤および請求項２７〜５２のいずれか１項記載の
脂質分解酵素を含む洗剤組成物であって、脂質分解酵素が好ましくは、３より上
のSLU対LUの比に相当する長鎖脂肪酸に対する特異性を有する洗剤組成物。
【請求項６３】乳脂肪を含む食品のフレーバーを増加させる方法であって
、遊離の脂肪酸を放出させるように、食品を請求項２７〜５２のいずれか１項記
載の脂質分解酵素で処理することを含み、脂質分解酵素が好ましくは0.5より下
、より好ましくは0.2より下、例えば0.1より下のSLU対LUの比に相当する、短鎖
脂肪酸に対する特異性を有する方法。
【請求項６４】生地または生地から製造される焼いた製品を製造する方法
であって、ａ）少なくとも１種の脂質分解酵素を、トリグリセリド中のＣ₄〜Ｃ₈アシル結
合、トリグリセリド中のＣ₁₆〜Ｃ₂₀アシル結合、ジガラクトシル-ジグリセリド
およびリン脂質に対するその加水分解活性について試験し、ｂ）ジガラクトシル-ジグリセリドおよびリン脂質に対する加水分解活性を有
し、かつ少なくとも３のSLU/LU比に相当するＣ₁₆〜Ｃ₂₀アシル結合とＣ₄〜Ｃ₈ア
シル結合とに対する活性の比を有する脂質分解酵素を選択し、そしてｃ）選ばれた脂質分解酵素を生地に添加することを含む方法。