ES2328429T3 - Variantes de enzimas lipoliticas. - Google Patents
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Abstract
Método de preparación de una masa o un producto horneado obtenido a partir de la masa, que comprende la adición de una enzima lipolítica a la masa; dicha enzima lipolítica es una enzima lipolítica fúngica que tiene actividad hidrolitica hacia el digalactosil diglicérido y un fosfolípido, y que tiene una proporción de actividad hacia un enlace acilo C16-C20 y un enlace acilo C4-C8 que corresponde a una proporción SLU/LU de al menos 3, donde la actividad hacia el enlace acilo C 16-C 20 es determinada como SLU donde una SLU es la cantidad de lipasa que libera 1 micromol de ácido oleico titulable por minuto medido a 30ºC y pH 9 con una emulsión estabilizada de aceite de oliva como el sustrato, en un tampón Tris 5 mM que contiene 40 mM de NaCl y 5 mM de cloruro de calcio y la actividad hacia el enlace de acilo C4-C8 es determinada como LU donde una LU es la cantidad de enzima capaz de liberar 1 micromol de ácido butírico por minuto medido a 30ºC a pH 7 usando tributirina emulsionada con goma arábiga como el sustrato.
Description
Variantes de enzimas lipolíticas.
La presente invención se refiere a un método de
preparación de una masa o un producto horneado obtenido a partir de
la masa, que comprende la adición de una enzima lipolítica a la
masa.
Las enzimas lipolíticas (tales como las lipasas
y las fosfolipasas) son capaces de hidrolizar enlaces estéricos
carboxílicos en un sustrato para liberar ácidos carboxilicos. La
actividad hidrolítica en diferentes enlaces estéricos es importante
para la utilidad de la enzima lipolítica en distintas aplicaciones
industriales.
De este modo, las enzimas con una alta actividad
fosfolipasa son útiles en una amplia gama de aplicaciones tal como
el horneado (US 4.567.046), la filtración de hidrolizado de almidón
de trigo (US 5.264.367) y el tratamiento de aceite vegetal para
reducir el contenido de fosfolipidos (US 5.264.367). Para el
tratamiento del aceite vegetal, la enzima debe tener una actividad
lipasa baja, es decir, una actividad hidrolítica baja hacia los
enlaces estéricos en los triglicéridos.
WO 98/45453 indica que una enzima con una alta
actividad hidrolítica en digalactosil diglicéridos (DGDG) es útil
en el horneado.
Es sabido que se añade una lipasa a los
detergentes para ropa para ayudar en la eliminación de manchas de
grasa (p. ej. EP 258.068).
La liberación de ácidos grasos de cadena corta
como ácidos grasos libres (FFA) puede ser conveniente para el
desarrollo de sabores en productos alimenticios, p. ej. en la
maduración del queso (M. Hanson, ZFL, 41 (10),
664-666 (1990)).
La estructura tridimensional (3D) de diferentes
enzimas lipoliticas es conocida, y se sabe que diferentes
estructuras contienen una denominada "tapa" que puede estar
abierta o cerrada cubriendo el centro activo. Brady et al.,
Nature, 343, 767-770 (1990). Brzozowski A M
et al., Nature, 351, 491 (1991). Derewenda et al.,
Biochemistry, 31 (5), 1532-1541 (1992).
F. Hara et al., JAOCS, 74 (9),
1129-32 (1997) indica que algunas lipasas tienen
una actividad fosfolipasa determinada, mientras que la mayoría de
las lipasas tienen mínima o ninguna actividad en los fosfolípidos.
Por lo tanto, la actividad fosfolipasa ha sido descrita en las
lipasas de páncreas de cobaya, Fusarium oxysporum y
Staphylococcus hyicus, y se ha intentado relacionar la
actividad fosfolipasa con la estructura de la lipasa. WO 98/26057;
M.D. van Kampen et al., Chemistry and Physics of Lipids, 93
(1998), 39-45; A. Hjorth et al.,
Biochemistry 1993, 32, 4702-4707.
La técnica anterior ha descrito el efecto en la
selectividad de la longitud de cadena por sustituciones de
aminoácidos en una lipasa de Rhizopus delemar. Así, R. D.
Joerger et al., Lipids, 29 (6), 377-384
(1994) indican que las variantes F95D, F112W y V209W poseen una
preferencia alterada para los ácidos C_{4} y C_{8}. R. R. Klein
et al., JAOCS, 74 (11), 1401-1407 (1997)
muestran que la variante V206T+F95D tiene una mayor selectividad
para el ácido C_{8}. R. R. Klein et al., Lipids, 32 (2),
123-130 (1997) indican que las variantes
V209W+F112W, V94W y F95D+F214R poseen una mayor actividad
hidrolítica hacia los ácidos C_{4} y C_{8}, y sugieren que los
determinantes estructurales para la especificidad de la longitud de
cadena media pueden residir en el extremo distal de la ranura de
unión del acilo.
Los inventores han descubierto que una enzima
lipolítica que tiene actividad lipasa y fosfolipasa y actividad en
digalactosil diglicérido es particularmente eficaz para el uso en
el horneado, y diseñaron un método de selección para enzimas
lipolíticas por análisis de detección de estas actividades.
Por consiguiente, la invención proporciona un
método de preparación de una masa o un producto horneado obtenido a
partir de la masa, que comprende la adición de una enzima
lipolítica a la masa; esa enzima lipolítica es una enzima
lipolítica fúngica que tiene actividad hidrolítica hacia
digalactosil diglicérido y un fosfolípido, y que tiene un índice de
actividad hacia un enlace acilo C_{16}-C_{20} y
un enlace acilo C_{4}-C_{8} que corresponde a
una proporción SLU/LU de al menos 3, donde la actividad hacia el
enlace acilo C_{16}-C_{20} es determinado como
SLU donde una SLU es la cantidad de lipasa que libera 1 micromol de
ácido oleico titulable por minuto medido a 30ºC y pH 9 con una
emulsión estabilizada de aceite de oliva como el sustrato, en un
tampón Tris 5 mM que contiene 40 mM de NaCl y 5 mM de cloruro de
calcio y la actividad hacia el enlace acilo
C_{4}-C_{8} es determinada como la LU donde un
LU es la cantidad de enzima capaz de liberar 1 micromol de ácido
butírico por minuto medido a 30ºC y pH 7 usando tributirina
emulsionada con goma arábiga como el sustrato.
La Fig. 1 muestra un alineamiento de secuencias
de lipasa.
En comparación con la enzima lipolitica madre,
la invención tiene como objetivo alterar la actividad en al menos
un enlace estérico seleccionado en al menos un sustrato, es decir,
aumentar una actividad deseada, reducir una actividad indeseada o
cambiar la especificidad del sustrato decreciendo la proporción de
una actividad indeseada a una actividad deseada.
De este modo, una enzima con actividad
fosfolipasa aumentada puede ser útil, p. ej., en el horneado o en
la purificación del aceite vegetal. Es conveniente aumentar la
actividad hidrolítica en el digalactosil-diglicérido
(DGDG) para el uso en el horneado.
Es conveniente aumentar la actividad lipasa para
cualquier uso industrial donde se utilicen las lipasas. Para el uso
en detergentes o en el horneado, es conveniente aumentar la
actividad en los triglicéridos de cadena larga
(C_{16}-C_{20}), y es conveniente aumentar la
especificidad para ácidos grasos de cadena larga reduciendo la
proporción de la actividad en ácidos grasos de cadena corta o
cadena media (C_{4}-C_{8}) a la actividad en
ácidos grasos de cadena larga.
La enzima lipolítica que se utilizará en la
presente invención es una que puede hidrolizar enlaces estéricos.
Ese tipo de enzimas incluyen, por ejemplo, lipasas, tales como
triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3), lipoproteína lipasa (EC
3.1.1.34), monoglicérido lipasa (EC 3.1.1.23), lisofosfolipasa,
ácido ferúlico esterasa y esterasa (EC 3.1.1.1, EC 3.1.1.2). Los
números entre paréntesis son los números sistemáticos asignados por
la Comisión de Nomenclatura Enzimática de la Unión Internacional de
Bioquímica conforme al tipo de la reactividad enzimática de la
enzima.
La enzima lipolítica madre puede ser una enzima
lipolítica fúngica tal como las enzimas lipolíticas de la familia
Humicola y la familia Zygomycetes y las cutinasas
fúngicas.
Algunos ejemplos de cutinasas fúngicas son las
cutinasas de Fusarium solani pisi (S. Longhi et al.,
Journal of Molecular Biology, 268 (4), 779-799
(1997)) y Humicola insolens (US 5.827.719).
La familia Humicola de las enzimas
lipolíticas consiste en la lipasa de la cepa H. lanuginosa
DSM 4109 y las lipasas que tienen más del 50% de homología con
dicha lipasa. La lipasa de H. lanuginosa (sinónimo:
Thermomyces lanuginosus) está descrita en EP 258 068 y EP 305
216, y tiene la secuencia de aminoácidos que aparece en las
posiciones 1-269 de SEC ID Nº: 2 de US
5.869.438.
La familia Humicola también incluye las
siguientes enzimas lipolíticas: lipasa de Penicillium
camembertii
(P25234), lipasa/fosfolipasa de Fusarium oxysporum (EP 130064, WO 98/26057), lipasa de F. heterosporum (R87979), lisofosfolipasa de Aspergillus foetidus (W33009), fosfolipasa A1 de A. oryzae (JP-A 10-155493), lipasa de A. oryzae (D85895), lipasa/ácido ferúlico esterasa de A. niger (Y09330), lipasa/ácido ferúlico esterasa de A. tubingensis (Y09331), lipasa de A. tubingensis (WO 98/45453), lisofosfolipasa de A. niger (WO 98/31790), lipasa de F. solanii con un punto isoeléctrico de 6,9 y un peso molecular aparente de 30 kDa (WO 96/18729).
(P25234), lipasa/fosfolipasa de Fusarium oxysporum (EP 130064, WO 98/26057), lipasa de F. heterosporum (R87979), lisofosfolipasa de Aspergillus foetidus (W33009), fosfolipasa A1 de A. oryzae (JP-A 10-155493), lipasa de A. oryzae (D85895), lipasa/ácido ferúlico esterasa de A. niger (Y09330), lipasa/ácido ferúlico esterasa de A. tubingensis (Y09331), lipasa de A. tubingensis (WO 98/45453), lisofosfolipasa de A. niger (WO 98/31790), lipasa de F. solanii con un punto isoeléctrico de 6,9 y un peso molecular aparente de 30 kDa (WO 96/18729).
La familia Zygomycetes comprende lipasas
que tienen al menos un 50% de homología con la lipasa de
Rhizomucor miehei (P19515). Esta familia también incluye las
lipasas de Absidia reflexa, A. sporophora, A. corymbifera, A.
blakesleeana, A. griseola (todas descritas en WO 96/13578 y WO
97/27276) y Rhizopus oryzae (P21811). Los números entre
paréntesis indican la publicación o número de acceso a las bases de
datos de EMBL, GenBank, GeneSeqp o Swiss-Prot.
Es de particular interés derivar una variante
con actividad fosfolipasa de una enzima lipolítica madre con poca o
ninguna actividad fosfolipasa, p. ej. correspondiente a una
proporción de actividad fosfolipasa en relación a la actividad
lipasa inferior a 0.1 PHLU/LU o inferior a 50 PHLU/mg.
Como ya se ha expresado, la secuencia de
aminoácidos de la enzima lipolítica madre puede ser modificada en
una posición cercana a la parte de glicerol de un sustrato
triglicérido. Esta región se denominará el "centro de unión de
alcohol" de la lipasa; y está descrita en Brzozowski A M et
al., Nature, 351: 491 (1991); Uppenberg et al.,
Biochemistry, 1995, 34, 16838-16851; A. Svendsen,
Inform, 5(5), 619-623 (1994).
Para la lipasa de Rhizomucor miehei, la
extensión del centro de unión de alcohol se encuentra en el archivo
PDB "5tgl.pdb" disponible en Clasificación Estructural de las
Proteínas (SCOP) en Internet, en http://www.resb.org/pdb/, que
muestra el complejo con el inhibidor éster etílico de
n-hexilfosfato que imita el sustrato. Está descrita
en Derewenda et al. (supra), Brzozowski et al.
(supra) y Brady et al. (supra). La posición
sn2 de este modelo es el átomo CE2.
La variante normalmente contiene no más de 10
alteraciones en el centro de unión de alcohol, p. ej. 1, 2, 3, 4, 5
o 6 alteraciones.
La alteración puede estar particularmente en la
parte del centro de unión de alcohol que viene dentro de 20
posiciones (p. ej. dentro de 10 posiciones) del
C-terminal.
Como ya se ha expresado, la secuencia de
aminoácidos de la enzima lipolítica madre puede ser modificada en
una posición que está dentro de 10 \ring{A} (p. ej. dentro de 8
\ring{A}, particularmente dentro de 6 \ring{A}) del átomo C en
la posición sn2 de la porción del glicerol de un triglicérido
sustrato. Las posiciones de los siguientes aminoácidos se
encuentran dentro de 10 \ring{A} de la posición sn2 en la lipasa
de Rhizomucor miehei: 25, 28, 80-84, 88,
143-146, 175, 203, 205, 254-255,
257-259, 264-267. Las siguientes se
encuentran dentro de 8 \ring{A}: 81-83, 144,
257-258, 265-267, y las siguientes
dentro de 6 \ring{A}: 82, 144, 257, 266.
En la lipasa de Humicola lanuginosa, las
siguientes posiciones están dentro de 10 \ring{A} de la posición
sn2: 18, 21, 81-85, 89, 145-148,
172, 201, 203, 255-256, 258-260,
264-267. Las siguientes se encuentran dentro de 8
\ring{A}: 82-84, 89, 146,
258-259, 265-267, y las siguientes
dentro de 6 \ring{A}: 83, 146, 258, 266.
\vskip1.000000\baselineskip
Como ya se expresó, en un aspecto la enzima
lipolítica madre tiene una estructura que comprende una tríada
catalítica que consiste en un residuo Ser activo, Asp activo y His
activo y el aminoácido que se altera pertenece a un grupo definido
por un procedimiento determinado descrito anteriormente. La
estructura puede ser una estructura abierta o cerrada, y puede
incluir o no un sustrato o un inhibidor.
El procedimiento es realizado convenientemente
usando software tal como Insight II de MSI. Implica el alineamiento
con 4TGL, una estructura cristalina de la lipasa de Rhizomucor
miehei inhibida irreversiblemente por dietil
p-nitrofenil fosfato. El mismo se encuentra
disponible en Clasificación Estructural de las Proteínas (SCOP) en
Internet, en http://www.rcsb.org/pdb/, y está descrito en Derewenda
et al. (supra). La lipasa de Rhizomucor miehei
comprende una tríada catalítica que consiste en los residuos de
aminoácidos S144, D203 y H257.
Para la lipasa de Humicola lanuginosa, se
puede utilizar la estructura 1tib; la misma está disponible en la
Clasificación Estructural de las Proteínas (SCOP) en Internet.
Utilizando esta estructura, el grupo definido por el procedimiento
incluye las siguientes posiciones: 10-23, 26, 40,
55-64, 80-87,
116-117, 119, 145-149, 151, 168,
170, 194, 196-201, 220-222,
224-227 y 254-269.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se expresó anteriormente, una o más
alteraciones pueden ser realizadas en la secuencia de aminoácidos
entre un residuo His activo y el terminal, específicamente entre
los 12 aminoácidos en el lado C-terminal del His
activo.
La lipasa de Humicola lanuginosa tiene un
His activo en H258 y el C-terminal en L269, de modo
que esta región incluye las posiciones 259-269. La
lipasa de P. cepacia tiene un H286 activo y el
C-terminal en el residuo 297, de modo que la región
incluye los residuos 287-297.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se expresó anteriormente, una o más
alteraciones pueden ser realizadas dentro de 10 posiciones de
aminoácidos del C-terminal de la proteína madura, o
en posiciones correspondientes a tales posiciones en la lipasa de
H. lanuginosa, es decir, las posiciones
260-269 de la lipasa de H. lanuginosa. Las
posiciones correspondientes pueden ser detectadas por alineamiento
de las dos secuencias como se describe más adelante en esta
especificación.
La variante de enzima lipolítica puede ser
truncada eliminando residuos de aminoácidos correspondientes a las
primeras posiciones 1, 2, 3, 4, 5 o 6 en el
C-terminal. Una variante truncada puede tener
termostabilidad mejorada.
De forma alternativa, la variante puede llevar
una extensión peptídica en el C-terminal y/o el
N-terminal. La extensión C-terminal
puede consistir en 1-10 residuos de aminoácidos, p.
ej. A, P, AG, DG, PG, AGG, PVGF, AGRF, PRGF, AGGF o AGGFS; o puede
consistir en 40-50 residuos, p. ej., consistir en
los 48 residuos C-terminales de la lipasa de
Fusarium oxysporum
AGGFSWRRYRSAESVDKRATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYVKNNQARS. La extensión
C-terminal puede aumentar la actividad
fosfolipasa.
Más adelante se describen algunas alteraciones
en la región que se superponen con el centro de unión de
alcohol.
Una alteración específica es una sustitución en
una posición correspondiente a G266 en la lipasa de Humicola
lanuginosa, específicamente con un aminoácido de tamaño
intermedio, p. ej. A, C, D, N, L, I, S, T, P o V. Se ha descubierto
que esa sola alteración es suficiente para aumentar la actividad
fosfolipasa.
Otras alteraciones específicas son tales que
alteran la estructura terciaria, p. ej. introduciendo cadenas
laterales voluminosas o interrumpiendo los ángulos de enlace, p.
ej. introduciendo Pro. Alteraciones de este tipo pueden ser
realizadas en posiciones correspondientes a las posiciones G263.
L264. 1265. T267 o L269 en la lipasa de Humicola lanuginosa.
Algunas sustituciones específicas son G263A, E, Q, R; L264A, C, P,
Q; I265L, N, T; T267A, Q o L269N.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se expresó anteriormente, la secuencia de
aminoácidos de la enzima lipolítica presente puede ser modificada
en la región de la tapa de la enzima lipolítica madre. Esta región
está descrita en Brady et al., Nature 343,
1990, págs. 767-770 y en Brzozowski A M et
al., Nature, 351: 491 (1991). En la lipasa de H.
lanuginosa, la tapa está localizada en las posiciones
80-100, y la modificación puede ser realizada
particularmente en las posiciones 82-98, p. ej.
91-98.
La variante normalmente contiene no más de 5
alteraciones en la región de la tapa; la misma puede contener 0, 1,
2 o 3 alteraciones. Una alteración específica es una sustitución de
un aminoácido correspondiente a G91 L93, N94, D96, K98, L97 y/o E99
en la lipasa de Humicola lanuginosa con un aminoácido neutro
o cargado positivamente, p. ej. una sustitución correspondiente a
G91A,T, L93K, N94D, D96S, W, G, L97Q, K98D, F, E y/o E99K,D.
Específicamente, una variante con una alteración
en la región de la tapa también contiene una o más alteraciones
cerca de la tríada catalítica, cerca del centro de unión de
sustrato o cerca del C-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
La variante de la enzima lipolítica de la
invención comprende una o más alteraciones de un residuo de
aminoácido en cualquiera de las regiones anteriormente descritas.
Cada alteración puede ser una eliminación o una sustitución del
residuo de aminoácido, o puede ser una inserción antes o después
del residuo de aminoácido. Si el residuo de aminoácido está en el
C-terminal, la inserción puede ser una extensión
C-terminal. Una inserción normalmente consiste en
1-5 residuos de aminoácidos, p. ej.
1-2, y una extensión C-terminal
puede consistir en 1-50 o 2-10
residuos de aminoácidos.
La cantidad total de alteraciones en las
regiones mencionadas es normalmente no más de 20, p. ej. no más de
10 o no más de 5, y puede haber tan solo 1 o 2 alteraciones en las
regiones mencionadas.
Además, la variante de la enzima lipolítica de
la invención opcionalmente puede incluir otras modificaciones de la
enzima madre, normalmente no más de 10, p. ej. no más de 5
modificaciones de este tipo.
La variante generalmente tiene una homología con
la enzima lipolítica madre de al menos un 80%, p. ej. al menos un
85%, normalmente al menos un 90% o al menos un 95%.
La variante de la invención además puede
comprender una extensión peptidica en el
N-terminal, p. ej. que consista en
1-15 (particularmente 4-10)
residuos de aminoácidos, y que específicamente consista en 1, 2 o 3
aminoácidos cargados positivamente. Algunas extensiones peptídicas
del N-terminal específicas son AS, SPIRR, El RP,
EISPIRPRP, El SPPRRP y EISPIRPRP. Además, se puede utilizar
cualquier extensión peptídica descrita en WO 97/04079 y WO
97/07202.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar variantes de una enzima lipolítica
de la familia Humicola, las alteraciones de aminoácidos
pueden ser realizadas específicamente en las posiciones
correspondientes a 20-25, 56-64,
81-85 o 255-269 en la lipasa de
Humicola lanuginosa. Así, la alteración puede ser una
sustitución, eliminación o inserción en una posición
correspondiente a A20, Y21, G23, K24, N25, V63, R81, G82, R84,
A257, W260, Y261, F262 o G266 (p. ej. excluidas G23C, K24C, R81 C),
una sustitución de un aminoácido correspondiente a C268 o L269.
Algunas alteraciones específicas son
sustituciones correspondientes a la siguiente lipasa de H.
lanuginosa: Y21V/I/
L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T, V60V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T, G61V/I/UA/G/M/W/P/F/N/Q/S/T, D62E/AN, S83T,
R84K/L/W, P256A, G263E,Q,R,F, L264A,C,P,F,G,I, I265L,N,F G266D/E o T267A,Q,P,S,E, o una inserción correspondiente a T267GS o T267GL.
L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T, V60V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T, G61V/I/UA/G/M/W/P/F/N/Q/S/T, D62E/AN, S83T,
R84K/L/W, P256A, G263E,Q,R,F, L264A,C,P,F,G,I, I265L,N,F G266D/E o T267A,Q,P,S,E, o una inserción correspondiente a T267GS o T267GL.
Para alterar la actividad hacia los ácidos
grasos de cadena corta (C_{4}-C_{8}) en los
triglicéridos, se pueden realizar alteraciones a las posiciones
correspondientes a Y21, E56, D57, V60, G61, D62, R81, S83, R84,
L259, Y261 o G266, p. ej. una sustitución correspondiente a Y21V/I,
V60G, D62E/AN, S83T, R84K/L/W o G266D/E.
Para aumentar la actividad para DGDG, se pueden
realizar alteraciones a las posiciones correspondientes a Y21, G23,
N26, D57, D62, R81, S83, R84, S85, G266, T267 o L269. p. ej., se
pueden realizar dos o más de esas alteraciones, p. ej. junto con
una o más alteraciones en la región de la tapa. Para aumentar la
actividad fosfolipasa, se pueden realizar alteraciones a las
posiciones correspondientes a R81, R84, S85 o
263-267, p. ej. G266 o T267.
Para preparar variantes de una lipasa de
Pseudomonas, se pueden realizar modificaciones de
aminoácidos a las posiciones correspondientes a
12-13, 16-34, 45-52,
59-66, 68, 86-87,
107-109, 111, 143-153, 155,
157-158, 207-212, 228, 230,
242-249, 264, 279-280,
282-297, 301-302,
304-305, 307-308 en la lipasa de
P. cepacia, particularmente L17/L17, T18/A18, Y29/Y29,
L287/L286, E289/E288, 1290/1289, Q292/Q291 o L293/L292 en la lipasa
de P. cepacia/P. glumae.
Variantes específicas de la lipasa de H.
lanuginosa están descritas en los ejemplos. Las alteraciones
correspondientes pueden ser realizadas en otras enzimas lipolíticas
madres. Otras variantes pueden ser derivadas de éstas para omitir
modificaciones de aminoácidos en las posiciones 1, 106, 186, 225,
232, 237, 239 o 274. Las variantes con 274S pueden tener
opcionalmente otra extensión C-terminal de
WRRYRSAESVDKRATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYVKNN
QARS (correspondiente al C-terminal de la lipasa de F. oxysporum) de forma completa o truncada.
QARS (correspondiente al C-terminal de la lipasa de F. oxysporum) de forma completa o truncada.
La nomenclatura usada en la presente para
definir las mutaciones es básicamente la que se describe en WO
92/05249. Así, G91A indica la sustitución de G en la posición 91
por A. T267A, Q indica la sustitución de T en la posición 267 por A
o Q. El E,D,A indica que El no está cambiada o está sustituida por
D o A.
T267stop indica un codón de detención, es decir
la eliminación de T267 y todos los aminoácidos siguientes (es
decir, C268 y L269). 270P, 271V indica una extensión
C-terminal de PV (es decir, en las nuevas posiciones
270 y 271). -G266 indica la eliminación de G en la posición 266.
Los paréntesis indican que la alteración es opcional, o en ejemplos
en los cuales la alteración es incierta. SPIRR indica una extensión
N-terminal. D266 puede referirse a la posición o a
la sustitución por cualquier aminoácido (excepto D).
EISPPCGRRP o SPPCGRRP(-E) indica una sustitución
de E1 con SPPCGRRP, es decir, una adición peptídica en el
N-terminal. T267GS indica una sustitución de T267
con GS, o en otras palabras, la sustitución de T267G y una
inserción de S entre G267 y C268.
Para los fines de la presente invención, el
grado de homología puede ser determinado de manera adecuada
mediante programas informáticos conocidos en la técnica, tal como
GAP proporcionado en el paquete de programas de GCG (Manual de
Programas para el Paquete Wisconsin, versión 8, agosto de 1994,
Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,
EEUU 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of
Molecular Biology, 48, 443-45), utilizando GAP con
los siguientes ajustes para la comparación de la secuencia
polipeptídica: penalización por creación de GAP de 3.0 y
penalización por extensión de GAP de 0.1.
En la presente invención, las posiciones
correspondientes (u homólogas) en las secuencias de lipasa de
Rhizomucor miehei (rhimi), Rhizopus delemar (rhidI),
Thermomyces lanuginosa (antes; Humicola lanuginosa)
(SP400), Penicillium camembertii (PcI) y Fusarium
oxysporum (FoLnpl 1), están definidas por el alineamiento
mostrado en la Figura 1.
Para encontrar las posiciones homólogas en las
secuencias de lipasa no mostradas en el alineamiento, la secuencia
de interés es alineada a las secuencias mostradas en la Figura 1.
La nueva secuencia es alineada al alineamiento presente en la Fig.
1 usando el alineamiento de GAP a la secuencia más homóloga
encontrada por el programa GAP. GAP está incluido en el paquete de
programas GCG (Manual de Programa para el Paquete Wisconsin,
versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science
Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch,
C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-45). Los siguientes ajustes son usados para la
comparación de secuencias polipeptídicas: penalización por creación
de GAP de 3.0 y penalización por extensión de GAP de 0.1.
Como se ha descrito anteriormente, la variante
de la invención puede tener una actividad fosfolipasa mayor que la
enzima lipolítica madre. Por el método de monocapa descrito más
adelante en esta especificación, la variante puede tener una
actividad fosfolipasa de al menos 0,1 nmol/min a pH 5.
Por el método PHLU descrito más adelante en esta
especificación, la variante puede tener una actividad fosfolipasa
de al menos 100 PHLU/mg (mg de proteína enzimática pura),
particularmente al menos 500 PHLU/mg. La variante tiene una
proporción de actividad fosfolipasica respecto a la actividad
lipasa (ambas medidas con pH 7) de al menos 0,1 PHLU/LU, p. ej. al
menos 0,5, particularmente al menos 2.
\newpage
Las variantes de la invención pueden tener la
capacidad de hidrolizar fosfolipido intacto, como lo demuestra el
método PHLU. Las mismas pueden tener actividad A_{1} y/o A_{2},
de modo que pueden hidrolizar uno o ambos grupos acilos grasos en
el fosfolípido.
Muchas variantes de la lipasa de Humicola
lanuginosa tienen un pH alcalino óptimo para la actividad
lipasa y un pH ácido óptimo para la actividad fosfolipasa (p. ej.
pH 9-10 para lipasa y pH 4-6 para
fosfolipasa). Esas variantes pueden ser usadas con pH ácido (p. ej.
en desgomado de aceite, descrito más adelante), como fosfolipasas
con muy baja actividad lipasa concomitante.
No obstante, algunas variantes de la lipasa de
Humicola lanuginosa que incluyen la sustitución G266D,E
tienen pH óptimo para las actividades lipasa y fosfolipasa
alrededor de pH 5-6. Dichas variantes pueden ser
usadas con pH ácido cuando las actividades lipasa y fosfolipasa son
necesarias, p. ej. en cocción.
La termoestabilidad de la variante puede
convenientemente ser evaluada mediante la Calorimetría de Barrido
Diferencial (DSC). Según las mutaciones exactas, las variantes de
la invención generalmente poseen termoestabilidad similar o
ligeramente inferior que la enzima lipolítica madre.
La temperatura sobre el valor máximo de
desnaturalización (T_{d}) de la lipasa de Humicola
lanuginosa cuando se calienta a 90 grados/hr a pH 5 está
precisamente por encima de 70ºC (=T_{d}). La T_{d} para las
variantes de la invención es generalmente 5-10
grados inferior.
Según la especificidad de sustrato, las
variantes de la invención pueden ser usadas en el horneado.
Una variante con actividad fosfolipasa y/o
DGDGasa puede ser usada en la preparación de masa, pan y pasteles,
p. ej. para aumentar la estabilidad de la masa y las propiedades de
manipulación de la masa, o para mejorar la elasticidad del pan o
pastel. De este modo, la variante puede ser usada en un proceso
para hacer pan, e implica la adición de la variante a los
ingredientes de una masa, amasar la masa y cocinar la masa para
hacer el pan. Esto puede hacerse en analogía con US 4.567.046
(Kyowa Hakko), JP-A 60-78529 (QP
Corp.), JP-A 62-111629 (QP Corp.),
JP-A 63-258528 (QP Corp.), EP 426211
(Unilever) o WO 99/53769 (Novo Nordisk).
Resulta particularmente ventajoso usar la
variante junto con una endoamilasa
anti-endurecimiento y opcionalmente también añadir
un fosfolípido, para reducir el endurecimiento del pan y
particularmente para mejorar la blandura del pan en las primeras 24
horas después del horneado. La endoamilasa puede ser una alfa
amilasa maltogénica (p. ej. de Bacillus sp., tal como
Novamyl® de Novo Nordisk) o una alfa amilasa fúngica o bacteriana,
p. ej. de Aspergillus o Bacillus, particularmente
A. oryzae, B. licheniformis o B.
amyloliquefaciens.
En el horneado, la variante puede tener una baja
actividad en cadena corta o cadena media
(C_{4}-C_{8}), p. ej. correspondiente a una
proporción SLU/LU sobre 3. El uso de esa variante puede evitar o
suprimir el desarrollo de un sabor indeseado debido a la liberación
de ácidos grasos de cadena corta. La variante puede tener actividad
en triglicéridos y fosfolípidos al igual que DGDG.
La variante enzimática de la invención puede ser
preparada por métodos conocidos en la técnica, p. ej. según se
describe en WO 97/04079 (Novo Nordisk). A continuación se describen
métodos para la clonación de secuencias de ADN codificadoras de
enzima, seguidos de métodos para generar mutaciones en sitios
específicos dentro de la secuencia de codificación de la
enzima.
La secuencia de ADN que codifica una enzima
madre puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que
produce la enzima en cuestión, utilizando varios métodos bien
conocidos en la técnica. Primero, se debe crear una biblioteca de
ADN y/o de ADNc genómico usando ADN cromosómico o ARN mensajero del
organismo que produce la enzima que será estudiada. Luego, si la
secuencia de aminoácidos de la enzima es conocida, se deben
sintetizar sondas de oligonucleótido marcadas y se deben utilizar
para identificar clones codificadores de enzimas de una biblioteca
genómica obtenida a partir del organismo en cuestión. De forma
alternativa, una sonda de oligonucleótidos marcada con secuencias
homólogas a otro gen enzimático podría ser usada como una sonda
para identificar clones codificadores de enzimas, utilizando
condiciones de hibridación y de lavado de astringencia
inferior.
\newpage
Otro método para identificar clones
codificadores de enzimas implica insertar fragmentos de ADN
genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido,
transfomar las bacterias enzima-negativas con la
biblioteca de ADN genómico resultante, y luego cultivar en placas
las bacterias transformadas en agar con un sustrato para enzima (es
decir, maltosa), permitiendo así la identificación de clones de
expresión de la enzima.
De forma alternativa, la secuencia de ADN que
codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos
estándares establecidos, p. ej. el método de fosforamiditas
descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron
Letters 22, p. 1859-1869, o el método descrito por
Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, p.
801-805. En el método de fosforamiditas, los
oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador
automático de ADN, purificado, anillado, ligado y clonado en
vectores apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen genómico y sintético mezclado, de origen sintético y de ADNc
mezclado o de origen genómico y de ADNc mezclado, preparada ligando
fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea
apropiado, los fragmentos correspondientes a varias partes de la
secuencia de ADN entera), conforme a las técnicas estándares. La
secuencia de ADN también puede ser preparada por reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo
como se describe en US 4.683.202 o R.K. Saiki et al., (1988),
Science 239, 1988, págs. 487-491.
Una vez que se ha aislado una secuencia de ADN
codificadora de enzima, y se han identificado sitios ideales para
la mutación, las mutaciones pueden ser introducidas usando
oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen
secuencias de nucleótidos flanqueando los sitios de mutación
deseados. En un método específico, un gap monocatenario de ADN, la
secuencia codificadora de enzima, es creada en un vector que
comprende el gen enzimático. Luego, el nucleótido sintético que
lleva la mutación deseada, es anillado a una parte homóloga del ADN
monocatenario. El gap restante luego es llenado con ADN polimerasa
I (fragmento Klenow) y el constructo es ligado usando ligasa T4. Un
ejemplo específico de este método es descrito en Morinaga et
al., (1984), Biotechnology 2, p. 646-639. US
4.760.025 expone la introducción de oligonucleótidos que codifican
mutaciones múltiples mediante la realización de alteraciones
menores del casete. No obstante, una variedad de mutaciones aún
superior puede ser introducida en cualquier momen-
to por el método de Morinaga, porque una multitud de oligonucleótidos, de varias longitudes, puede ser introducida.
to por el método de Morinaga, porque una multitud de oligonucleótidos, de varias longitudes, puede ser introducida.
Otro método para introducir mutaciones en
secuencias de ADN codificadoras de enzima se describe en Nelson y
Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p.
147-151. El mismo implica la generación en 3 pasos
de un fragmento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que
contiene la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN
sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las
reacciones de la PCR. Del fragmento generado por la PCR, se debe
aislar un fragmento de ADN que lleva la mutación por seccionamiento
con endonucleasas de restricción y reinsertar en un plásmido de
expresión.
Además, Sierks. et al., (1989)
"Site-directed mutagenesis at the active site
Trp120 of Aspergillus awamori. Protein Eng., 2,
621-625. Sierks et al., (1990), "Catalytic
mechanism of fungal glucoamylase as defined by mutagenesis of
Asp176; GIu179 and GIu180 in the enzyme from Aspergillus
awamori Protein Eng. vol. 3193-198; también
describen la mutagénesis dirigida en una glucoamilasa de
Aspergillus.
Según la invención, una secuencia de ADN que
codifica la variante producida por los métodos descritos
anteriormente, o por cualquier método alternativo conocido en la
técnica, puede ser expresada, en forma de enzima, usando un vector
de expresión que normalmente incluye secuencias de control que
codifican un promotor, un operador, un centro de unión al ribosoma,
una señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen
represor o varios genes activadores.
El vector de expresión recombinante que
comprende la secuencia de ADN que codifica una variante enzimática
de la invención puede ser cualquier vector que puede ser
convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y la
elección del vector frecuentemente dependerá de la célula huésped
en la cual será introducido. El vector puede ser uno que, al ser
introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la
célula huésped y se replica junto con el o los cromosomas en que ha
sido integrado. Ejemplos de vectores de expresión adecuados
incluyen pMT838.
En el vector, la secuencia de ADN debería estar
operativamente conectada a una secuencia promotora adecuada. El
promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad
transcripcional en la célula huésped de elección y se puede obtener
a partir de genes que codifican proteínas bien homólogas o
heterólogas a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante
enzimática de la invención, especialmente en un huésped bacteriano,
son el promotor del operón lac de E. coli, los
promotores del gen de la agarasa dagA de Streptomyces
coelicolor, los promotores del gen de alfa amilasa (amyL)
de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de alfa
amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus
Stearothermophilus, los promotores de la alfa amilasa (amyQ) de
Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA
y xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en
un huésped fúngico, los ejemplos de promotores útiles son aquellos
derivados del gen que codifica TAKA amilasa de A. oryzae, el
promotor de TPI (triosa fosfato isomerasa) de S. cerevisiae
(Alber et al. (1982), J. Mol. Apl. Genet 1, p.
419-434, proteinasa aspártica de Rhizomucor
miehei, alfa amilasa neutra de A. niger, alfa amilasa
ácido estable de A. niger, glucoamilasa de A. niger,
lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A.
oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o
acetamidasa de A. nidulans.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión de la invención puede
también comprender un terminador de la transcripción adecuado y, en
eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas
a la secuencia de ADN que codifica la variante de alfa amilasa de
la invención. Las secuencias de terminación y de poliadenilación
pueden ser obtenidas de manera adecuada a partir de las mismas
fuentes que el promotor.
El vector además puede comprender una secuencia
de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped
en cuestión. Ejemplos de secuencias de este tipo son los orígenes
de replicación de los plásmidos pUC19. pACYC177, pUB110, pE194,
pAMB1 y plJ702.
El vector también puede comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa una falta en
la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o
B. licheniforrnis, o uno que confiere resistencia
antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, la canamicina, el
cloranfenicol o la tetraciclina. Además, el vector puede comprender
marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS,
argB, niaD y sC, un marcador que produce resistencia a la
higromicina, o la selección puede ser realizada por
cotransformación, p. ej. como se describe en WO 91/17243.
Los procedimientos usados para enlazar el
constructo de ADN de la invención que codifica una variante
enzimática, el promotor, el terminador y otros elementos,
respectivamente, y para insertarlo en vectores adecuados que
contengan la información necesaria para la replicación, son
conocidos por los expertos en la técnica (cf., por ejemplo,
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º
Ed., Cold Spring Harbor, 1989).
\vskip1.000000\baselineskip
La célula de la invención, que comprende un
constructo de ADN o bien un vector de expresión de la invención tal
como se define anteriormente, es ventajosamente usada como una
célula huésped en la producción recombinante de una variante
enzimática de la invención. La célula puede ser transformada con el
constructo de ADN de la invención que codifica la variante,
integrando convenientemente el constructo de ADN (en una o más
copias) en el cromosoma huésped. Esta integración generalmente es
considerada una ventaja puesto que es más probable que la secuencia
de ADN sea mantenida de forma estable en la célula. La integración
de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser
realizada según los métodos convencionales, p. ej. por
recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula
puede ser transformada con un vector de expresión como se ha
descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de
células huéspedes.
La célula de la invención puede ser una célula
de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero
puede ser una célula microbiana, p. ej. una célula bacteriana o una
fúngica (incluida la levadura).
Ejemplos de bacterias adecuadas son las
bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus
lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o
Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o
bacterias gram negativas tal como E. coli. La transformación
de las bacterias puede, por ejemplo, ser efectuada por
transformación de protoplastos o usando células competentes de
manera habitual.
El organismo de la levadura puede ser
seleccionado favorablemente de una especie de Saccharomyces
o Schizosaccharomyces, p.ej. Saccharomyces
cerevisiae.
La célula huésped también puede ser un hongo
filamentoso p. ej. una cepa de una especie de Aspergillus,
tal como Aspergillus oryzae o Aspergillus niger, o una
cepa de Fusarium, tal como una cepa de Fusarium
oxysporium, Fusarium graminearum (en el estado perfecto
denominada Gribberella zeae, previamente Sphaeria
zeae, sinónimo de Gibberella roseum y Gibberella roseum
f. sp. cerealis), o Fusarium sulphureum (en el estado
perfecto denominada Gibberella puricaris, sinónimo de
Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium
sambucium, Fusarium roseum y Fusarium roseum var. graminearum),
Fusarium cerealis (sinónimo de Fusarium crokkwellnse),
o Fusarium venenatum.
En una forma de realización específica de la
invención la célula huésped es una cepa deficiente en proteasas o
sin proteasa.
Esta puede ser por ejemplo la cepa deficiente en
proteasas JaL 125 de Aspergillus oryzae que tiene el gen de
proteasa alcalina denominado "alp" eliminado. Esta cepa está
descrita en WO 97/35956 (Novo Nordisk).
Las células de hongos filamentosos pueden ser
transformadas por un proceso que implica la formación de
protoplastos y la transformación de los protoplastos seguido de la
regeneración de la pared celular en el modo habitual. El uso de
Aspergillus como un microorganismo huésped está descrito en
EP 238 023 (Novo Nordisk NS), cuyo contenido se incluye en la
presente con fines de referencia.
La variante enzimática de la invención puede ser
producida por un método que comprende el cultivo de una célula
huésped bajo condiciones propicias para la producción de la
variante y la recuperación de la variante de las células y/o medio
de cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede
ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula
huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante
enzimática de la invención. Los medios adecuados están disponibles
de proveedores comerciales o pueden ser preparados según recetas
publicadas (p. ej. como se describe en los catálogos de la American
Type Culture Collection).
La variante enzimática segregada de las células
huéspedes pueden convenientemente ser recuperadas del medio de
cultivo por procedimientos bien conocidos, incluida la separación
de las células del medio por centrifugado o filtración, y la
precipitación de los componentes proteináceos del medio mediante
una sal tal como sulfato de amonio, seguido del uso de
procedimientos cromatográficos tal como cromatografía de intercambio
fónico, cromatografía de afinidad, o similar.
La presente invención también se refiere a una
planta transgénica, parte de una planta o célula vegetal que ha
sido transformada con una secuencia de ADN que codifica la variante
de la invención para expresar y producir esta enzima en cantidades
recuperables. La enzima puede ser recuperada de la planta o parte
de la planta. De forma alternativa, la planta o parte de la planta
que contiene la enzima recombinante puede ser usada como tal.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea o
monocotiledónea, para abreviar: una dicot o una monocot. Ejemplos
de plantas monocot son hierbas, tal como la poa de los prados
(grama azul, Poa), el forraje tal como festuca, lolium, hierba
templada, tal como Agrostis, y cereales, p. ej. trigo, avena,
centeno, cebada, arroz, sorgo y mazorca (maíz).
Ejemplos de plantas dicot son tabaco,
leguminosas, tal como altramuces, patata, remolacha azucarera,
guisante, judía y semilla de soja, y crucíferas (familia
Brassicaceae), tal como coliflor, aceite de semilla de colza y el
organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis
thaliana.
Ejemplos de partes de la planta son el tallo,
callo, hojas, raíz, frutas, semillas, y tubérculos. En el contexto
presente, también tejidos específicos de las plantas, tales como
cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas y
citoplasma son considerados una parte de la planta. Además,
cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido,
es considerada una parte de la planta.
También está incluida dentro del campo de la
invención la progenie de dichas plantas, partes de plantas y
células vegetales.
La planta transgénica o célula vegetal que
expresa la variante de la invención puede ser construida conforme a
los métodos conocidos en la técnica. En pocas palabras, la planta o
célula vegetal es construida incorporando uno o más constructos de
expresión que codifiquen la variante de la invención en el genoma
del huésped de la planta y propagando la planta o célula vegetal
resultante modificada en una planta transgénica o célula
vegetal.
Convenientemente, el constructo de expresión es
un constructo de ADN que comprende un gen que codifica la variante
de la invención en asociación operativa con secuencias reguladoras
apropiadas requeridas para la expresión del gen en la planta o
parte de la planta de elección. Además, el constructo de expresión
puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar
células huéspedes en las cuales el constructo de expresión ha sido
integrado y secuencias de ADN necesarias para la introducción del
constructo en la planta en cuestión (el último caso depende del
método de introducción de ADN que se utilizará).
La elección de las secuencias reguladoras, tales
como las secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente las
secuencias señal o de tránsito se determina, por ejemplo basándose
en el momento, el lugar y la forma en que se va a expresar la
enzima. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica la variante
de la invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser
específica del tejido, de la etapa o del desarrollo, y el producto
genético puede estar dirigido a un tejido o parte de planta
específico tal como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras
están descritas por ejemplo por Tague et al., Plant, Phys.,
86, 506, 1988.
Para la expresión constitutiva se puede utilizar
el promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980.
Cell 21: 285-294). Los promotores específicos de
órganos pueden ser por ejemplo un promotor de tejidos sumidero de
almacenamiento tal como semillas, tubérculos de patata, y frutas
(Edwards & Coruzzi, 1990. Annu. Rev. Genet. 24:
275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales
como los meristemas (Ito et al., 1994. Plant Mol. Biol. 24:
863-878), un promotor específico de semilla tal
como la glutelina, la prolamina, la globulina o el promotor de
albúmina de arroz (Wu et al., Plant and Cell Physiology vol.
39, Nº 8 pág. 885-889 (1998)), un promotor de
Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla
desconocido de Vicia faba descritos por Conrad U. et
al, Journal of Plant Physiology vol. 152, Nº 6, págs.
708-711 (1998), un promotor de una proteína del
cuerpo de aceite de semilla (Chen et al., Plant and cell
physiology vol. 39, Nº 9, págs. 935-941 (1998), el
promotor de la proteína napA de almacenamiento de Brassica
napus, o cualquier otro promotor de semilla específico conocido
en la técnica, por ejemplo como se describe en WO 91/14772. Además,
el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el
promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., Plant
Physiology vol. 102, Nº 3 págs. 991-1000 (1993), el
promotor del gen de metiltransferasa de la adenina de virus
chlorella (Mitra, A. y Higgins, DW, Plant Molecular Biology vol.
26, Nº 1, págs. 85-93 (1994), o el promotor de gen
aldP del arroz (Kagaya et al., Molecular and General
Genetics vol.248, Nº 6, págs. 668-674 (1995), o un
promotor inducible por lesiones tal como el promotor pin2 de la
patata (Xu et al, Plant Molecular Biology vol. 22, Nº 4,
págs. 573-588 (1993).
Se puede utilizar un elemento intensificador del
promotor para conseguir una expresión más alta de la enzima en la
planta. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede
ser un intrón que es colocado entre el promotor y la secuencia de
nucleótidos que codifica la enzima. Por ejemplo, Xu et al.
op cit revela el uso del primer intrón del gen de la actina 1
del arroz para realzar la expresión.
El gen de marcador seleccionable y cualquier
otra parte del constructo de expresión puede ser elegido entre los
que se encuentran disponibles en la técnica.
El constructo de ADN es incorporado en el genoma
de la planta según las técnicas convencionales conocidas en la
técnica, incluidas la transformación mediada por
Agrobacterium, la transformación mediada por virus, la micro
inyección, el bombardeo de partículas, la transformación biolística
y la electroporación (Gasser et al, Science, 244, 1293;
Potrikus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto et al, Nature,
338, 274, 1989).
Actualmente, la transformación de genes mediada
por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para
generar dicots transgénicas (para revisión Hooykas &
Schilperoort, 1992. Biol. Plant Mol. Biol. 19:
15-38), no obstante, también puede ser usado para
transformar monocotiledóneas, aunque para estas plantas
generalmente se usan otros métodos de transformación. Actualmente,
el método de elección para generar monocots transgénicas es el
bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o
tungsteno revestidas con el ADN transformante) de callos
embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992. Plant J.,
2: 275-281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin.
Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992.
Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo
para la transformación de monocots se basa en la transformación de
protoplastos según lo describe Omirulleh S, et al., Plant
Molecular biology vol. 21, Nº 3, págs. 415-428
(1993).
Después de la transformación, los transformantes
que hayan incorporado el constructo de expresión son seleccionados
y regenerados en plantas enteras según los métodos bien conocidos
en la técnica.
Un sustrato para la lipasa se prepara mediante
emulsión de tributirina (tributirato de glicerina) usando goma
arábiga como emulsionante. La hidrólisis de tributirina a 30ºC a pH
7 es seguida en un experimento de titulación
pH-stat. Una unidad de actividad lipasa (1 LU) es
igual a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 \mumol de ácido
butírico/min en las condiciones habituales.
La actividad lipolítica puede ser determinada
usando aceite de oliva como sustrato.
En este método SLU, la actividad lipasa es
medida a 30ºC y pH 9 con una emulsión estabilizada de aceite de
oliva (catálogo Sigma Nº 800-1) como el sustrato,
en un tampón Tris 5 mM con 40 mM de NaCl y 5 mM de cloruro de
calcio. 2,5 ml del sustrato es mezclado con 12,5 ml de tampón, el pH
es ajustado a 9, se añaden 0,5 ml de muestra de lipasa diluida y la
cantidad de ácido oleico formada es seguida de titulación con un
pH-stat.
Una SLU es la cantidad de lipasa que libera 1
\mumol de ácido oleico titulable por minuto bajo estas
condiciones.
Los siguientes métodos de ensayo fueron usados
para la determinación cualitativa o cuantitativa de la actividad
fosfolipasa.
La actividad fosfolipasa (PHLU) se mide como la
liberación de ácidos grasos libres de la lecitina. 50 \mul de
L-alfa-fosfatidicolina (lecitina de
planta de Avanti) 4%, Tritón X-100 4%, 5 mM de
CaCl_{2} en 50 mM de HEPES, pH 7 se añaden 50 \mul de solución
enzimática diluida a una concentración apropiada en 50 mM de HEPES,
pH 7. Las muestras son incubadas durante 10 min a 30ºC y la
reacción es detenida a 95ºC durante 5 min antes del centrifugado (5
min a 7000 rpm). Los ácidos grasos libres son determinados usando
el equipo NEFA C de Wako Chemicals GmbH; a 25 \mul de mezcla
reactiva se añaden 250 \mul de reactivo A y se incuba 10 min a
37ºC. Luego se añaden 500 \mul de reactivo B y la muestra es
incubada otra vez, 10 min a 37ºC. La absorción a 550 nm es medida
usando un espectrofotómetro de red de diodos HP 8452A. Las muestras
se analizan por duplicado como mínimo. Se incluyen ciegos de
sustrato y enzima (muestras de enzima precalentadas (10 min a 95ºC)
+ sustrato). El ácido oleico se usa como un estándar de ácido
graso. 1 PHLU es igual a la cantidad de enzima capaz de liberar 1
\mumol de ácido graso libre/min en estas condiciones.
La lecitina es hidrolizada con pH y temperatura
constantes, y la actividad fosfolipasa es determinada como el
índice de consumo de titulante (0.1N de NaOH) durante la
neutralización del ácido graso liberado.
El sustrato es lecitina de soja
(L-alfa-fosfotidil-colina)
y las condiciones son pH 8.00, 40.0ºC, tiempo de reacción 2 min. La
unidad es definida en relación a un estándar.
En una superficie íntegramente purificada de una
solución tamponada (10 mM de glicina, pH 9,0 o bien 10 mM de NaOAc,
pH 5,0; 1 mM de CaCl_{2}, 25ºC) se extiende una monocapa de
Di-decanoil-fosfatidil colina (DDPC)
de una solución de cloroformo. Después de la relajación de la
monocapa (evaporación de cloroformo) la presión de superficie es
ajustada a 15 mN/m, correspondiente a un área molecular media de
DDPC de aprox. 63 \ring{A}^{2}/molec. Una solución con
aproximadamente 60 \mug (microgramos) de enzima es inyectada a
través de la monocapa en la subfase del compartimento de la
reacción (cilindro con área de superficie 2230 mm^{2} y volumen de
reacción de 56570 mm^{3}) en la "depresión de orden cero".
La actividad enzimática es manifestada a través de la velocidad de
una barrera móvil que comprime la monocapa para mantener la presión
de la superficie constante cuando las moléculas del sustrato
insoluble son hidrolizadas en productos reactivos más solubles en
agua. Una vez que se haya verificado que la solubilidad acuosa de
los productos reactivos (ácido cáprico y MDPC) es considerablemente
superior que para DDPC el número de moléculas DDPC hidrolizadas por
minuto por la enzima se calcula a partir del área molecular media
(MMA) de DDPC. Los resultados son calculados en base a la velocidad
promedio de la barrera durante los primeros 5 minutos de la
hidrólisis.
El resultado es considerado positivo para la
fosfolipasa si la barrera se mueve a más de 2 mm/min.
A) Se derriten/agitan 50 ml de agarosa al 2% en
agua purificada durante 5 minutos y se enfrían a
60-63ºC.
B) 50 ml 2%
L-alfa-fosfatidicolina de planta 95%
en 0,2M de NaOAc, 10 mM de CaCl_{2}, pH 5.5 a 60ºC en 30 min. se
mezclan en 15 seg. con ultra torax.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclan volúmenes iguales de agarosa al 2% y
lecitina (A y B) al 2% y se añade a esta mezcla un volumen igual de
Tritón X-100 al 1%. Se añaden 250 \mul 4 mg/ml de
violeta cristal en agua purificada como indicador. La mezcla es
vertida en placas Petri apropiadas (p. ej. 30 ml en placa de 14 cm
\diameter), y se hacen hoyos apropiados en el agar
(3-5 mm) para aplicar la solución enzimática.
La muestra enzimática es diluida a una
concentración correspondiente a OD_{280} = 0,5 y se aplican 10
microlitros en los hoyos en la matriz de agarosa/lecitina. Las
placas son incubadas a 30ºC y las zonas de reacción en las placas
son identificadas después de aprox. 4-5 horas y/o
después de aprox. 20 horas de incubación. La lipasa de Humicola
lanuginosa se usa como un control, y la presencia de una zona
despejada más grande que el control es tomada como un resultado
positivo para la actividad fosfolipasa.
En una variación de este ensayo, se omite la
adición de Triton X-100.
10 g de agarosa se derriten en 550 ml de H2O
hirviendo en un horno de microondas. Tras el enfriamiento a
60-70ºC se agregan los siguientes ingredientes:
250 ml de un tampón de citrato 0,4 M (pH 4.5 o
pH 7.1)
200 ml de lecitina (de Avanti) al 3% en
Triton-X 100 al 2%
2 ml de violeta cristal al 2%
30 ml de la mezcla es vertida en placas de Petri
de 14 cm \diameter.
\vskip1.000000\baselineskip
Las placas son incubadas después de la
aplicación de las muestras enzimáticas y los resultados son
interpretados igual que para el ensayo de placa 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En una superficie íntegramente purificada de una
solución tamponada (10 mM de NaOAc, pH 5.5. 1 mM de CaCl2, 25ºC; 10
mM de beta-ciclodextrina (Sigma
C-4767)) se extiende un monoestrato de DGDG (Sigma
(D4651)) de una solución de cloroformo. Después de la relajación de
la monocapa (evaporación de cloroformo) la presión de la superficie
es ajustada a 15 mN/m. Una solución que contiene aproximadamente 60
\mug (microgramos) de enzima es inyectada a través de la monocapa
en la subfase del compartimiento de reacción (cilindro con área de
superficie de 2230 mm^{2} y volumen de reacción de 56570
mm^{3}) en la "depresión de orden cero". La actividad
enzimática es manifestada a través de velocidad aumentada de una
barrera móvil que comprime la monocapa para mantener la presión de
superficie constante mientras que las moléculas de sustrato
insoluble son hidrolizadas en productos reactivos más solubles en
agua (en presencia de beta ciclodextrina).
El resultado es considerado positivo para DGDG
si la barrera se mueve a más de 1 mm/min.
En una superficie íntegramente purificada de una
solución tamponada (aprox. 75 ml, 10 mM de NaOAc, pH 5,5; 1 mM de
CaCl2, 25ºC; 10 de mM beta-ciclodextrina (Sigma
C-4767)) se extiende una monocapa de DGDG (Sigma
(D4651)) de una solución de cloroformo a una presión de superficie
de aproximadamente 30 mN/m. Después de la relajación de la monocapa
(evaporación de cloroformo) una solución que contiene
aproximadamente 30 \mug (microgramos) de enzima purificada es
inyectada a través de la monocapa en la subfase de 75 ml mientras
se mide continuamente la presión de superficie. La actividad
enzimática se manifiesta a través del índice de reducción en la
presión de superficie cuando DGDG es hidrolizada en productos
reactivos solubles en agua (en presencia de beta ciclodextrina).
El resultado es considerado positivo para DGDG
si la caída máxima de la superficie de presión (d\pi/dt) después
de la adición de enzima excede -0,5 mN/min. Una cantidad de
variantes de lipolasa fueron evaluadas y se detectó que tienen
actividad de DGDG, mientras que la enzima madre (Lipolasa) sólo
tiene actividad muy limitada (d\pi/dt > -0,5 mN/min.).
\vskip1.000000\baselineskip
Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa
leu2-D2 ura3-52
his4-539 pep4-D1[cir+],
descrita en WO 97/04079 y WO 97/07205.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de ADN y los vectores abiertos
son mezclados y transformados en levadura Saccharomyces
cerevisiae YNG318 por métodos habituales.
\vskip1.000000\baselineskip
pJSO026 (plásmido de expresión de S.
cerevisiae) está descrito en WO 97/07205 y en J.S.Okkels,
(1996) ``Una eliminación del promotor URA3 en un vector pYES
aumenta el nivel de expresión de la lipasa fúngica en
Saccharomyces cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology III:
The Integration of Biological and Engineering Sciences, vol. 782 de
los Anales de la Academia de Ciencias de Nueva York). Se obtiene a
partir de pYES 2.0 sustituyendo el promotor de GAL1 inducible de
pYES 2.0 con el promotor de TPI (triosa fosfato isomerasa) de
Saccharomyces cerevisiae constitutivamente expresado (Albert
y Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl Genet., 1,
419-434), y eliminando una parte del promotor de
URA3.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la construcción de variantes de una enzima
lipolítica de H. lanuginosa el equipo comercial, se puede
usar el equipo Chameleon de mutagénesis dirigida al sitio
bicatenario según las instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen que codifica la enzima lipolítica en
cuestión está insertado en el plásmido pHD414. Conforme a las
instrucciones del fabricante el sitio ScaI del gen de la ampicilina
de pHD414 es cambiado a un sitio MluI usando el siguiente
cebador:
Cebador 3: AGAAATCGGGTATCCTTTCAG.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pHD414 que comprende el gen lipolítico
en cuestión luego es usado como un molde para ADN polimerasa y
oligos 7258 y 7770.
7258: 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt
cac 3'
(Cambiando así el sitio ScaI encontrado en el
gen de resistencia a la ampicilina y usado para cortar a un sitio
MluI).
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador nº 7770 fue usado como el cebador de
selección.
7770: 5'p tct agc cca gaa tac tgg atc aaa tc 3'
(cambia el sitio ScaI encontrado en el gen de lipasa de H.
lanuginosa sin cambiar la secuencia del aminoácido).
\vskip1.000000\baselineskip
La mutación deseada (p. ej. en el
N-terminal del gen lipolítico o la introducción de
un residuo de cisteína) es introducida en el gen lipolítico en
cuestión por adición de un oligo apropiado que comprenda la mutación
deseada.
Las reacciones de la PCR son realizadas según
las recomendaciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extienden las bibliotecas de levadura en
filtros de celulosa en placas de SC-ura agar y son
incubadas durante 3-4 días a 30ºC.
Los filtros luego son transferidos a las placas
de lecitina e incubados a 37ºC durante 2-6 horas.
Las células de levadura que contienen fosfolipasas activas
desarrollan zonas despejadas en blanco alrededor de las colonias.
Las variantes positivas después pueden ser purificadas y
evaluadas.
\vskip1.000000\baselineskip
- Nitrógeno de levadura (sin aminoácidos)
- 7,5 g
- Ácido succinico
- 11,3 g
- NaOH
- 6,8 g
- Casaminoácido (sin vitaminas)
- 5,6 g
- Triptófano
- 0,1 g
- Agar, Merck
- 20 g
- Agua destilada
- hasta 1000 ml
\vskip1.000000\baselineskip
Sometido a autoclave durante 20 minutos a
121ºC.
De una solución stock estéril de treonina al 5%
4 ml se añaden a un volumen de 900 ml junto con 100 ml de una
glucosa estéril al 20%.
Las siguientes variantes fueron usadas como
moldes para el esqueleto de la lipasa de Humicola
lanuginosa: E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R y SPIRR +G91A +D96W
+E99K +Q249R. La lipasa madre fue usada para generar un fragmento
en el C-terminal sin Q249R. El molde para la
fosfolipasa C-terminal fue la fosfolipasa de
Fusarium oxysporum, clonada en el mismo vector que las
variantes de lipasa de Humicola lanuginosa.
Reacción PCR 1: 4244 (Secuencia ID nº: 1) como
cebador 5' y H7 (Secuencia ID nº: 6) como cebador 3' y uno de los
dos moldes mencionados más arriba.
Reacción PCR 2: FOL14 (Secuencia ID nº: 3) como
cebador 5' y FOL15 (Secuencia ID nº: 4) como cebador 3' y lipasa de
Humicola lanuginosa como molde (ninguna mutación en pos
249).
Reacción PCR 3: FOL16 (Secuencia ID nº: 5) como
cebador 5' y AP (Secuencia ID nº: 2) como cebador 3' y fosfolipasa
F.o. como molde.
Se realizó una reacción PCR 4 para crear la
conexión entre la variante de lipasa de Humicola lanuginosa
y el C-terminal de la fosfolipasa usando FOL14
(Secuencia ID nº: 3) como cebador 5' y AP (Secuencia ID nº: 2) como
3' cebador y reacción PCR 2 y 3 como molde.
La PCR final fue realizada con 4244 (Secuencia
ID nº: 1) como cebador 5' y KBoj14 (Secuencia ID nº: 7) como
cebador 3' y reacción PCR 1 y 4 como molde (usando lipasa de
Humicola lanuginosa como molde en la reacción 2 se creó una
posibilidad de omitir la mutación en la posición 249).
El fragmento de la PCR final fue usado en una
recombinación in vivo en levadura junto con corte pJSO026
con las enzimas de restricción. SmaI (o BamHI) y XbaI (para
eliminar la región de codificación y al mismo tiempo crear un
recubrimiento de aproximadamente 75 pares de bases en cada extremo
para hacer un evento de recombinación posible). Este tratamiento
final también fue usado en los ejemplos siguientes.
El cebador FOL14 (Secuencia ID nº: 3) y el
cebador 15/16 son oligos mezclados para dar la posibilidad de
enlazar ambos con la lipasa de Humicola lanuginosa y moldes
de fosfolipasa y al mismo tiempo dar posibilidades para introducir
los aminoácidos de ambos moldes en las posiciones diferentes. Para
algunas de las posiciones se podrían introducir también nuevos
aminoácidos.
El cebador FOL14 (Secuencia ID nº: 3)
Posición 205 en la lipasa de H.
lanuginosa: 75% R, 25% S
Cebador FOL15 (Secuencia ID Nº: 4)/FOL16
(Secuencia ID nº: 5)
Posición 256 en la lipasa de H.
lanuginosa: 50% P, 50% A
Posición 260 en la lipasa de H.
lanuginosa: 25% R, 12.5% Q, 12.5% H, 12.5% C, 12.5% Y, 12.5% W,
12.5% detención.
Se determinaron las secuencias de las variantes
resultantes y se descubrió que corresponden a lipasa de Humicola
lanuginosa con las alteraciones siguientes. Las alteraciones
entre paréntesis son inciertas.
EIA, G91A, D96W, E99K, P256A, W260H, G263Q,
L264A, I265T, G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272G, 273F,
(274S)
E1A, G91A, D96W, E99K, E239C, Q249R, P256A,
G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272G273F,
(274S)
EIA, G91A, D96W, E99K, N248T, Q249R, W260Q,
G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272G, 273F,
(274S)
SPIRR, G91A, D96W, E99K, W260C, G263Q, L264A,
I265T, G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272, G273F, (274S)
SPIRR, G91A, D96W, E99K, G263Q, L264A, I265T,
G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272G, 273F, (274S)
EIA, G91A, D96W, E99K, G263Q, L264A, I265T,
G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272G, 273F, (274S)
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes fueron hechas con detención
después del aminoácido 269, 270, 271, 272, (273 y 274).
Las siguientes reacciones de la PCR fueron
hechas con el siguiente molde: EIA, G91A, D96W, E99K, P256A, W260H,
G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272G, 273F,
(274S).
\vskip1.000000\baselineskip
Reacción 1: cebador 5' 4244 (Secuencia ID nº: 1)
y cebador 3' KBoj36 (terminación después de 269)
Reacción 2: cebador 5' 4244 (Secuencia ID nº: 1)
y cebador 3' KBoj37 (terminación después de 270)
Reacción 3: cebador 5' 4244 (Secuencia ID nº: 1)
y cebador 3' KBoj38 (detención después de 271)
Reacción 4: cebador 5' 4244 (Secuencia ID nº: 1)
y cebador 3' KBoj39 (detención después de 272)
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las secuencias de las variantes
resultantes y se determinó que corresponden a lipasa de Humicola
lanuginosa con las siguientes alteraciones:
E1A, G91A, D96W, E99K, P256A, W260H, G263Q,
L264A, I265T, G266D, T267A, L269N
E1A, G91A, D96W, E99K, P256A, W260H, G263Q,
L264A, I265T, G266D, T267A, L269N, 270A
EIA, G91A, D96W, E99K, P256A, W260H, G263Q,
L264A, I265T, G266D, T267A, L269N, 270A, 271G
E1A, G91A, D96W, E99K, P256A, W260H, G263Q,
L264A, I265T, G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272G
\vskip1.000000\baselineskip
G91A o E99K puede ser eliminado sin perder la
actividad fosfolipasa. Se determinaron las secuencias de las
variantes resultantes y se determinó que corresponden a lipasa de
Humicola lanuginosa con las siguientes alteraciones:
E1A, G91A, D96W, P256A, W260H, G263Q, L264A,
I265T, G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272G, 273F, (274S)
SPIRR, D96W, E99K, G263Q, L264A, I265T, G266D,
T267A, L269N, 270A, 271G, 272G, 273F, (274S)
SPIRR, G91A, D96W, G263Q, L264A, I265T, G266D,
T267A, L269N, 270A, 271G, 272G, 273F, (274S)
E1A, G91A, D96W, P256A, W260H, G263Q, L264A,
I265T, G266D, T267A, L269N, 270A, 271G, 272G, 273F, (274S)
\vskip1.000000\baselineskip
Tres bibliotecas diferentes fueron construidas
con posibilidades de mutaciones en la posición 256 y la posición
263-269. Al mismo tiempo se incluyeron
posibilidades de extensión del C-terminal con 1, 2,
3 o 4 aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Dopaje, las secuencias de wt están
subrayadas:
256: P 94, A 3, T 3
263: G 87, E 4.8, A 3.8, R 3.6, Q 0.2, P
0.2
264: L 87, P 4.8, Q 3.8, V 3.6, A 0.2, E
0.2
265: I 85, T 5.6, L 2.2, S 1.6, N 1.5, F
1.4, R 0.4, K 0.4 A, P 0.1, G, D, C, H,Y 0.03, Q, E 0.01, stop
0.016
266: G 86, D 5.9, R 2, S 1.7, C 1.6, A
0.9, V 0.9, E 0.7, W 0.2, H,Y 0.1, I, L,T, F, P 0.02, Q, K 0.01,
stop 0.014
267: T 86, A 6.6, S 1.9, R 0.9, N 0.9,
10.9, K 0.9, M 0.9, P 0.9, P 0.9, G,V 0.14, D,E 0.07, L 0.03,
C,Q,H,F,W,Y 0.01, stop 0.01
268: C 91, S 1.9, R 1.0, G 1.0, F 0.9, Y
0.9, L 0.04, A,N,D,H,I,P,T,V 0.01, stop 2.8
269: L 92, stop 8 (KBoj 32 (SEC ID NO: 8)
y KBoj33)/ N 86, K 2.7, D 1.8, H 1.8, I 1.8, S 1.8, T 1.9, Y 1.8, R
0.1, Q,M,E 0.06, A,C,G,L,F,P,V 0.04, stop 0.06 (KBoj34)
270: stop 100 (KBoj33)/A 44, P 44, S 1.9,
T 1.8, R 1.5, L 1.5, G 1.4, V 1.4, D 0.7, Q 0.7, E 0.7, H 0.7,
N,C,I,K,M,F,W,Y 0.03, stop 0.03 (KBoj 32 (SEC ID NO: 8) y KBoj
34)
271: G 72, R 4.5, V 3.2, E 3.0, C 2.9, A 1.6, S
1.2, D 1.0, L 0.5, I,K,Y 0.15, Q,T 0.08, N,P 0.05, stop 9.2
272: G 72, R 4.5, V 3.2, E 3.0, C 2.9, A 1.6, S
1.2, D 1.0, L 0.5, I,K,Y 0.15, Q,T 0.08, N,P 0.05, stop 9.2
273: F 74, L 11, S 2.8, 12.7, V 2.7, Y 2.5, C
2.5, A,R,T 0.1, N, D, H 0.08, Q, E, K 0.01, stop 0.5
274 STOP
Biblioteca A: Reacción PCR con 4244 (SEC ID nº:
1) como cebador 5' y KBoj 33 como cebador 3' y EIA +G91A +D96W
+E99K +Q249R o E1A +G225R como molde. Las variantes de esta
biblioteca estarán sin extensión.
Biblioteca B: Reacción PCR con 4244 (SEC ID nº:
1) como cebador 5' y KBoj 32 (SEC ID nº: 8) como cebador 3' y EIA
+G91A +D96W +E99K +Q249R o E1A +G225R como molde. Las variantes de
esta biblioteca probablemente contengan una extensión
C-terminal pero pueden contener codones de
detención antes de la extensión.
Biblioteca C: Reacción PCR con 4244 (SEC ID nº:
1) como cebador 5' y KBoj 34 como cebador 3' y EIA +G91A +D96W
+E99K +Q249R o E1A +G225R como molde. Las variantes de esta
biblioteca probablemente contengan mutaciones en la posición 269 y
una extensión C-terminal pero pueden contener
codones de detención antes de la extensión.
Se obtuvieron las siguientes variantes:
Biblioteca A:
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +G266D
\vskip1.000000\baselineskip
Biblioteca B:
E1A +G91A +D96W +E99K +(R232L) +Q249R +G266S
+270A
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +G266S +270D
+271G
E1A+ G91A+ D96W+ E99K+ Q249R+ L264G+ I265G+
G266F+ T267stop
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +G266A +270P
+271G
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +L264P +I265F
+L269stop
\vskip1.000000\baselineskip
Biblioteca C:
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +G263E +G266D
+L269N +270P +271V +272G +273F
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +G263A +G266S
+L269N +270A +271G +272R +273F
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +L264P -G266 +L269I
+270P +271R +272G +273F
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +G266D +L269S +270A
+271G +272G +273F
E1A +D27G +G91A +D96W +E99K +Q249R +G266S +L269N
+270A +271G +272G +273F
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +G266D +L269N
+270A
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +L264P +L267Q
+L269N
E1A +G91A +D96W +E99K +Q249R +G263R +I265L
+L269N +270P
Ejemplo 5: Para algunas de las variantes
mencionadas, el pH óptimo para la lipasa y la fosfolipasa fue
determinado usando los métodos de LU y PHLU con distintos valores
de pH. Los resultados mostraron que la actividad fosfolipasa con pH
óptimo estaba en la gama 4-6. El valor óptimo para
la actividad lipasa varió de aproximadamente pH 6 a aproximadamente
pH 10.
Se analizaron 8 variantes catalogadas en el
ejemplo 5 en relación a la actividad fosfolipasa por el ensayo de
monocapa anteriormente descrito a pH 5 y 9. Los resultados
mostraron que todas las variantes poseen actividad fosfolipasa a pH
5 y 9, mientras que la lipasa madre (lipasa de Humicola
lanuginosa) no muestra ninguna actividad a pH 5 o 9. Según la
variante, la actividad a pH 5 fue superior o inferior que a pH
9.
Se descubrió que una variante de la técnica
anterior de lipasa de Humicola lanuginosa tiene actividad
fosfolipasica nula a pH 5: SPIRR +N94K +F95L +D96H +N 101 S +F181 L
+D234Y +I252L +P256T +G263A +L264Q.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon variantes de la lipasa madre de
Humicola lanuginosa y fueron evaluadas en relación a la
actividad fosfolipasa como se ha descrito anteriormente. Se
descubrió que las siguientes variantes tienen actividad
fosfolipasa, mientras que la madre no tenía ninguna actividad
fosfolipasa por el mismo método.
En las tabla de arriba, (+274S) indica que la
presencia de este residuo de aminoácido en el
C-terminal es incierta. Para tal variante, se
descubrió que sólo una fracción menor contenía este residuo.
Varias de las variantes mencionadas tienen una
proporción más alta de fosfolipasa (PHLU) a lipasa (LU) que una
enzima de la técnica anterior de F. oxysporum de la cual se
sabe que tiene tanto actividad lipasa como fosfolipasa.
Para algunas de las variantes mencionadas, el pH
óptimo para la lipasa y la fosfolipasa fue determinado usando los
métodos de LU y PHLU con distintos valores de pH. Los resultados
mostraron que la actividad fosfolipasa con pH óptimo estaba en la
gama 4-6. El valor óptimo para la actividad lipasa
varió de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 10.
Se analizaron 8 variantes catalogadas en el
ejemplo 5 en relación a la actividad fosfolipasa por el ensayo de
monocapa anteriormente descrito a pH 5 y 9. Los resultados
mostraron que todas las variantes poseen actividad fosfolipasa a pH
5 y 9, mientras que la lipasa madre (lipasa de Humicola
lanuginosa) no muestra ninguna actividad a pH 5 o 9. Según la
variante, la actividad a pH 5 fue superior o inferior que a pH
9.
Se descubrió que una variante de la técnica
anterior de lipasa de Humicola lanuginosa no tiene actividad
fosfolipasa a pH 5: SPIRR +N94K +F95L +D96H +N101S +F181 L +D234Y
+I252L +P256T +G263A +L264Q.
Las siguientes variantes de la lipasa madre de
Humicola lanuginosa pueden también tener actividad
fosfolipasa:
\newpage
Las dos variantes siguientes de la lipasa madre
de Rhizomucor miehei fueron preparadas y evaluadas en
relación a la actividad fosfolipasa como se ha descrito
anteriormente. Se descubrió que las variantes tienen actividad
fosfolipasa, mientras que la madre no tenía actividad fosfolipasa
por el mismo método.
G266N
G266V
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes de la lipasa madre de Humicola
lanuginosa fueron preparadas y evaluadas en relación a su
actividad hidrolítica en dos sustratos de triglicérido con
diferente longitud de cadena: tributirina (C_{4:0}) y trioleina
(C_{18:1}). Las pruebas fueron hechas a pH 9 por los métodos LU y
SLU anteriormente descritos Se descubrió que las siguientes
variantes tienen una proporción más alta de actividad de trioleina
en relación a actividad de tributirina que la enzima madre (lipasa
de Humicola lanuginosa):
Las siguientes variantes de la lipasa madre de
Humicola lanuginosa también pueden tener una especificidad
aumentada para ácidos grasos de cadena larga:
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon variantes de la lipasa madre de
Fusarium oxysporum y fueron evaluadas como en el ejemplo
precedente. Se descubrió que las siguientes variantes tienen una
proporción más alta de actividad de trioleína en relación a
actividad de tributirina que la enzima madre:
\vskip1.000000\baselineskip
Y23S
Y260L
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes variantes de la lipasa madre de
Fusarium oxysporum pueden también tener una especificidad
aumentada para ácidos grasos de cadena larga:
\vskip1.000000\baselineskip
R80H +S82T
S82T +A129T
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes variantes de la lipasa madre de
Rhizomucor miehei pueden tener una especificidad aumentada
para ácidos grasos de cadena larga:
\vskip1.000000\baselineskip
Y260W
Y28L
Y28C +H217N
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon variantes de la lipasa madre de
Humicola lanuginosa y fueron evaluadas como en el ejemplo
precedente. Se descubrió que las siguientes variantes tienen una
proporción más alta de actividad sobre tributirina a la actividad
sobre trioleína (una proporción SLU/LU inferior) que la enzima
madre:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes variantes de la lipasa madre de
Humicola lanuginosa pueden también tener una proporción más
alta de actividad sobre tributirina a la actividad sobre
trioleína:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon variantes de la lipasa madre de
Fusarium oxysporum y fueron evaluadas como en el ejemplo
precedente. Se descubrió que las siguientes variantes tienen una
proporción más alta de actividad sobre tributirina a la actividad
sobre trioleína que la enzima madre:
\vskip1.000000\baselineskip
Y23W
Y260D
Y260R
Y260C
Y260N
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes variantes de la lipasa madre de
Rhizomucor miehei pueden tener una especificidad aumentada
para ácidos grasos de cadena corta:
\vskip1.000000\baselineskip
Y260C
Y260G
Y260V
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon las variantes de la lipasa madre
de Humicola lanuginosa y se determinó la actividad
hidrolítica hacia DGDG
(di-galactosil-di-glicérido)
como se ha descrito anteriormente. Se descubrió que las siguientes
variantes tienen actividad de DGDG, mientras que la lipasa madre
dió un resultado negativo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon las variantes de la lipasa madre
de Humicola lanuginosa y se midió la actividad lipasa por el
método LU a pH 7 y 9. Se detectó que las siguientes variantes
tienen una proporción más alta de actividad a pH 9 a la actividad a
pH 7 que la lipasa madre:
\vskip1.000000\baselineskip
R84L
R84W
Y21I
Y21V
Y261I
\newpage
Se prepararon las variantes de la lipasa madre
de Humicola lanuginosa y se midió la actividad lipasa por el
método LU a pH 7 y 9. Se detectó que las siguientes variantes
tienen una proporción inferior de actividad a pH 9 a la actividad a
pH 7 que la lipasa madre:
\vskip1.000000\baselineskip
Y261D
G266D/E
Y261W
\vskip1.000000\baselineskip
Una variante de la lipasa de Humicola
lanuginosa fue evaluada en pruebas de horneado como se indica a
continuación.
Se prepararon masas a partir de harina de Meneba
según el método europeo de masa directa
(ABF-SP-1201.01) con 40 ppm de ácido
ascórbico. Se utilizaron distintas combinaciones de aditivos en las
siguientes dosificaciones: la variante de lipasa a 0; 0.,5 o 1,5
mg/kg; fosfolípido (lecitina) a 0 o 10 g/kg; y endoamilasa a 0 o
750 MANU/kg.
La endoamilasa fue amilasa maltogénica de
stearothermophilus (nombre comercial Novamyl®). Una MANU
(novo unidad de amilasa maltogénica) se define como la cantidad de
enzima requerida para liberar un \mumol de maltosa por minuto a
una concentración de 10 mg de sustrato de maltotriosa por ml de
tampón citrato 0.1 M, pH 5.0 a 37ºC durante 30 minutos.
Después del horneado, las rebanadas fueron
enfriadas, y el volumen de rebanada, solidez de miga y blandura
fueron evaluados después de aproximadamente 2 horas. La evaluación
fue repetida después de 1, 3 y 7 días de almacenamiento a 22ºC
envueltas en bolsas de plástico dobles.
Se midió la solidez de la miga usando un
analizador de textura TA-XT2 de Stable Micro
Systems (diámetro de sonda 40 mm).
Se midió la blandura en gramo como la fuerza
necesaria para comprimir una sonda de 6,25 mm en una miga de una
rebanada de pan de un grosor de 25 mm (25% penetración).
Los resultados mostraron que la adición de 1,5
mg de la variante aumentó el volumen de la rebanada. Los resultados
de la solidez y la elasticidad muestran que la variante produce
miga significativamente más blanda y elasticidad significativamente
mejor del día 0 al día 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Una variante de la lipasa de Humicola
lanuginosa fue analizada en una prueba de horneado para evaluar
su tolerancia hacia la fermentación prolongada de la masa.
Se prepararon masas a partir de harina Pelikan
según el método europeo de masa directa
(347-SP-1217) con 30 ppm de ácido
ascórbico, alfa-amilasa fúngica (10 FAU de
Fungamyl), y pentosanasa (100 FXU de Pentopan Mono). Las
dosificaciones de 0.2; 0,4 y 0,6 mg de proteína enzimática/kg de
harina de la variante fueron comparadas con 1000 LU de la lipasa
madre.
Las masas fueron convertidas en bollos. La mitad
de los bollos fueron leudados durante 45 minutos (leudado normal) y
la otra mitad durante 70 minutos (sobreleudado).
Después del horneado se enfrió el pan, y se
evaluaron el volumen y la consistencia de los bollos después de 2
horas aproximadamente. La consistencia es una medida de la forma de
los bollos y es definida como la altura de 10 bollos divididos por
la anchura de 10 bollos, lo cual significa que rebanadas bien
redondas poseen un alto valor de consistencia, mientras que los
bollos planos poseen un valor de consistencia bajo.
\newpage
Los resultados mostraron que con un tiempo de
leudado normal el volumen de 0,4 y 0,6 mg de la variante fue mejor
que el de la lipasa madre, y la consistencia de los bollos fue
mejor para la variante en todas las dosificaciones que para la
lipasa madre. Cuando los bollos fueron sobreleudados, tanto el
volumen como la consistencia fueron mejores para la variante en
todas las dosificaciones que para la lipasa madre.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó el desarrollo del mal olor de las
lipasas con diferente especificidad de longitud de cadena en leche
entera. El olor a ácido butírico/agrio desarrollado fue evaluado
oliendo las muestras después de calentarlas.
Se colocaron 25 ml de leche entera en frascos de
tapón azul de 100 ml (con tapones) en un baño maría a 32ºC. De cada
una de las lipasas catalogadas más abajo, se añadieron 0,2 mg de
proteína enzimática por litro de leche a los frascos. La
temperatura fue aumentada a 45ºC, y se realizó la evaluación
después de 15 y 105 minutos.
Las lipasas evaluadas fueron lipasa de
Humicola lanuginosa y variantes de la misma. Para cada
lipasa, la especificidad de la longitud de cadena es expresada como
la proporción de actividades en trioleína (SLU) y tributirina
(LU).
Tres personas evaluaron las muestras y
coincidieron en la clasificación mostrada más abajo
\vskip1.000000\baselineskip
- \text{+}
- Olor detectable
- \text{++}
- Olor a ácido butírico y/o agrio claro y característico
- \text{+++}
- Fuerte olor a ácido butírico y/o agrio
\vskip1.000000\baselineskip
Se descubrió que las tres variantes de lipasa de
Humicola lanuginosa que tienen una proporción SLU/LU más
alta que la lipasa de Humicola lanuginosa tienen menos mal
olor que la lipasa madre.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon seis variantes de la lipasa de
Humicola lanuginosa y fueron evaluadas en pan horneado por
el procedimiento europeo de masa directa
(347-SP-1217) con adición de 3% de
mantequilla. Se utilizaron 0,2 mg de proteína enzimática/kg de
harina para cada una de las variantes.
La especificidad de la longitud de cadena de las
variantes también fue determinada midiendo el índice de actividad
sobre trioleína/ tributirina (SLU/LU descrita arriba). La lipasa
madre de Humicola lanuginosa y una lipasa de la técnica
anterior con actividad fosfolipasa de Fusarium oxysporum
también fueron evaluadas con fines comparativos.
Los resultados están resumidos más abajo:
\vskip1.000000\baselineskip
- \text{+}
- Olor detectable
- \text{++}
- Olor a ácido butírico y/o agrio claro y característico
- \text{+++}
- Fuerte olor a ácido butírico y/o agrio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indican que las variantes de
lipasa con una proporción SLU/LU en 3 o superior (es decir. una
alta especificidad para ácidos grasos de cadena larga) no producen
ningún olor desagradable en horneado del pan incluso con
mantequilla en la receta.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<141>
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<160> 14
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
4244
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaagaatag ttcaaacaag aaga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
AP
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttgtctaa ctccttcctt ttcg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
FOL14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
FOL15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
FOL16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 23
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
H7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaatgtta ggctggttat tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
KBoj14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttttcggtt agagcggatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
KBoj32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1: A 90, C 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (59).. (60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2: G 3,A 91,T 3,C 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3: A 25, T 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 4: G 2, A 4, T 5, C 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5: G 2, A 13, T 4, C 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3: A 25, T 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 4: G 2, A 4, T 5, C 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (66)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5: G 2, A 13, T 4, C 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (68)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 6: G 91, A 3, T 3, C 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (69)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 7: G 48, A 2, T 2, C 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 8: A 92, T8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9: A 97, T 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (74)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 10: G 1,A 1, T 1,C 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (75)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 11: G 1, A 97, T 1, C 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (77)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12: G 94, A 2, T 2, C 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (78)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 13: G 1, A 1, T 91, C 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1: A 90, C 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 14: G 1, A 1, T 7, C 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (81)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 15: G 2, A 2, T 2, C 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (82)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 16: A 80, T 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (83)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 17: G 6, A 90, T 2, C 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (84)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 18: G 2, A 2, T 94, C 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (86)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 19: G 5, A 91, T 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 20: G 96, C4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (89)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 21: G 4, T 5, C 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 22: G 4, C 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (111)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 23: G 94, C 3, T 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
KBoj33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (68)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 8: A 92, T8
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (70)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9: A 97, T 3
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<223> 10: G 1, A 1, T 1, C 97
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<222> (72)
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<223> 11: G 1, A 97, T 1, C 1
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<220>
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<222> (74)
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<223> 12: G 94, A 2, T 2, C 2
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (75)
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<223> 13: G 1, A 1, T 91, C 7
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (76)
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<223> 1: A 90, C 10
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<222> (77)
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<223> 14: G 1,A 1, T7, C91
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<222> (78)
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<223> 15: G 2, A 2, T 2, C 94
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (79)
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<223> 16: A 80, T 20
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<220>
<221 > misc_característica
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<222> (80)
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<223> 17: G 6, A 90, T 2, C 2
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<220>
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<222> (81)
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<223> 18: G 2, A 2, T 94, C 2
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<220>
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<222> (83)
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<223> 19: G 5, A 91, T 4
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<222> (84)
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<223> 20: G 96, C4
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<223> 21: G 4, T 5, C 91
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<221> misc_característica
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<222> (87)
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<223> 22: G 4, C 96
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<222> (108)
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<223> 23: G 94, C 3, T 3
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 120
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
KBoj34
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_característica
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<222> (58)
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<223> 1: A 90, C 10
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (59)..(60)
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<223> 2: G 3,A 91, T 3, C 3
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (61)
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<223> 3: A 25, T 75
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (62)
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<223> 4: G 2, A 4, T 5, C 89
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<221> misc_característica
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<222> (63)
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<223> 5: G 2, A 13, T 4, C 81
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<221> misc_característica
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<222> (64)
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<223> 3: A 25, T 75
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 4: G 2, A 4, T 5, C 89
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<220>
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<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (66)
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<223> 5: G 2, A 13, T 4, C 81
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<220>
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<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (68)
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<223> 6: G 91, A 3, T 3, C 3
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<221> misc_característica
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<222> (69)
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<223> 7: G 48, A 2, T 2, C 48
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<222> (70)
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<223> 20: G 96, C4
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<220>
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<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 18: G 2, A 2, T 94, C 2
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9: A 97, T 3
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<220>
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<222> (74)
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<223> 10: G 1, A 1, T 1, C 97
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<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (75)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 11: G 1, A 97, T 1, C 1
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (77)
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<223> 12: G 94, A 2, T 2, C 2
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (78)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 13: G 1, A 1, T 91, C 7
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (79)
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<223> 1: A 90, C 10
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 14: G 1, A 1, T 7, C 91
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (81)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 15: G 2, A 2, T 2, C 94
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (82)
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<223> 16: A 80, T 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (83)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 17: G 6, A 90, T 2, C 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (84)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 18: G 2, A 2, T 94, C 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (86)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 19: G 5, A 91, T 4
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 20: G 96, C4
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (89)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 21: G 4, T 5, C 91
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 22: G 4, C 96
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (111)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 23: G 94, C 3, T 3
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip1cm20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 82
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
KBoj36
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<400> 11
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\hskip1cm21
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<211> 82
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
KBoj37
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<400> 12
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\hskip1cm22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
KBoj38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm23
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 82
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
KBoj39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm24
Claims (2)
1. Método de preparación de una masa o un
producto horneado obtenido a partir de la masa, que comprende la
adición de una enzima lipolítica a la masa; dicha enzima lipolítica
es una enzima lipolítica fúngica que tiene actividad hidrolitica
hacia el digalactosil diglicérido y un fosfolípido, y que tiene una
proporción de actividad hacia un enlace acilo
C_{16}-C_{20} y un enlace acilo
C_{4}-C_{8} que corresponde a una proporción
SLU/LU de al menos 3, donde la actividad hacia el enlace acilo
C_{16}-C_{20} es determinada como SLU donde una
SLU es la cantidad de lipasa que libera 1 micromol de ácido oleico
titulable por minuto medido a 30ºC y pH 9 con una emulsión
estabilizada de aceite de oliva como el sustrato, en un tampón Tris
5 mM que contiene 40 mM de NaCl y 5 mM de cloruro de calcio y la
actividad hacia el enlace de acilo C_{4}-C_{8}
es determinada como LU donde una LU es la cantidad de enzima capaz
de liberar 1 micromol de ácido butírico por minuto medido a 30ºC a
pH 7 usando tributirina emulsionada con goma arábiga como el
sustrato.
2. Método según la reivindicación 1, donde la
enzima lipolítica fúngica es una enzima lipolítica de la familia
Humicola.
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