CN100374556C - 脂解酶变体 - Google Patents

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Abstract

通过改变脂解酶指定区域的氨基酸序列，以便增加所需活性水平或降低不需要之活性的水平，可对脂解酶的底物特异性进行修饰。因此，本发明人开发了带有修饰型氨基酸序列的脂解酶变体，其底物特异性已改变，适于进行特殊用途。

Description

脂解酶变体
发明领域
本发明涉及通过修饰脂解酶的氨基酸序列来改变其底物特异性的方法，还涉及通过这种修饰得到的脂解酶变体。本发明还涉及脂解酶的筛选方法。
发明背景
脂解酶(如脂肪酶和磷脂酶)能水解底物中的羧酯键，从而释放羧酸。脂解酶对不同酯键的水解活性在多种工业应用中至关重要。
因此，具有高磷脂酶活性的酶具有广泛的用途，例如烘焙食品(US4,567,046)，过滤小麦淀粉水解物(US 5,264,367)和处理植物油以减少磷脂含量(US 5,264,367)。为了处理植物油，所述酶应该具有低脂肪酶活性，即对甘油三酯中的酯键的水解活性较低。
WO 98/45453指出对双半乳糖甘油二酯(DGDG)具有高水解活性的酶可用于烘焙食品。
众所周知，在洗衣用的去污剂中加入脂肪酶有助于除去油污(如EP258,068)。
为了开发食品的口味，如使奶酪变得更加鲜美，需要释放短链脂肪酸，使其成为游离的脂肪酸(FFA)(M.Hanson，ZFL，41(10)，664-666(1990))。
已知几种脂解酶的三维(3D)结构，已知几种结构含有所谓的“盖帽(lid)”，它可以是覆盖活性位点的开或关的状态，Brady等，自然343，767-770(1990)，Brzozowski A M等，自然，351，491(1991)，Derewenda等，生物化学，31(5)，1532-1541(1992)。
F.Hara等，JAOCS，74(9)，1129-32(1997)指出一些脂肪酶具有某种磷脂酶活性，而大多数脂肪酶对磷脂的活性很小或根本没有活性。已有人描述了得自豚鼠胰腺，尖孢镰孢和猪葡萄球菌的脂肪酶的磷脂酶活性，并且已有人尝试将磷脂酶活性与脂肪酶的结构联系起来WO 98/26057；M.D.van Kampen等，脂质的化学和物理学，93(1998)，39-45；A.Hjorth等，生物化学1993，32，4702-4707。
现有技术描述了德列马根霉脂肪酶中的氨基酸取代对链-长度选择性的影响。因此，R.D.Joerger等，脂质，29(6)，377-384(1994)指出变体F95D，F112W和V209W对C4和C8酸的偏好有所改变。R.R.Klein等，JAOCS，74(11)，1401-1407(1997)指出变体V206T+F95D对C8酸具有较高的选择性。R.R.Klein等，脂质，32(2)，123-130(1997)显示变体V209W+F112W，V94W和F95D+F214R对C4和C8酸具有较高的水解活性，这提示决定中等-链长特异性的结构可能存在于酰基结合沟的远侧末端。
发明简述
本发明人发现：可以对脂解酶的指定区域的氨基酸序列进行改变以修饰脂解酶的底物特异性，从而增加所需的活性水平，或者降低不需要的活性水平。因此，本发明人研制出具有经修饰的氨基酸序列的脂解酶(下文称之为脂解酶变体，或简称为变体)，所述脂解酶具有专用于特定用途的底物特异性。
因此，本发明提供了产生脂解酶变体的方法，和由此方法制备的脂解酶变体。该方法包括：
a)选择感兴趣的底物和酯键，
b)选择亲代脂解酶，
c)按下述，在亲代脂解酶活性位点附近的区域，C-末端附近或盖帽区域内选择至少一个氨基酸残基，
d)进行改变，所述改变各为插入，缺失或取代氨基酸残基，
e)任选在除c)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为插入，缺失或取代氨基酸残基，
f)制备所得变体，
g)检测该变体对所述底物酯键的活性，和
h)选择对该酯键的活性有所改变的变体。
因此，一方面，亲代脂解酶具有醇结合位点，所述位点具有含sn2位置的甘油部分，氨基酸改变发生在距碳原子10_的范围内，所述碳原子位于底物甘油三酯的甘油部分的sn2位置。
另一方面，亲代脂解酶具有含催化三联体的结构，所述三联体由活性丝氨酸，活性天冬氨酸和活性组氨酸残基组成，待改变的氨基酸位于所述催化性残基的活性组氨酸残基和C末端之间，或属于如下指定的结构组(set)E：
i)米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶结构4TGL含有催化三联体和抑制性磷原子(4TGL-inhp)，将其与所述脂解酶的结构进行对比，以使两种结构中催化三联体的原子之间的方差总和最小化，
ii)指定结构组A，它由中心位于4TGL-inhp、半径为18_的球体内的所述脂解酶原子组成，
iii)形成由4TGL-inhP、亲代脂解酶活性丝氨酸残基的Cα原子、和亲代脂解酶活性天冬氨酸残基的Cα原子所指定的第一平面，将结构组B指定为结构组A的亚结构组，组成结构组B的原子与亲代脂解酶活性组氨酸残基的Cα原子位于第一平面的同一侧，
iv)形成由4TGL-inhP、亲代脂解酶活性丝氨酸残基的Cα原子、和亲代脂解酶活性组氨酸残基的Cα原子所指定的第二平面，将结构组C指定为结构组A的亚结构组，组成结构组C的原子与亲代脂解酶活性天冬氨酸残基的Cα原子位于第二平面的相反侧，
v)形成结构组D，它由结构组B和C并集的原子组成，且溶剂可接近性为15或更高，和
vi)形成结构组E，它由含有结构组D的原子或结构组B和C并集的原子的结构中距结构组D的原子不到3.5_的氨基酸残基组成。
第三方面，所述脂解酶具有含活性组氨酸残基的活性位点，氨基酸改变发生于活性组氨酸残基和C末端之间的氨基酸序列中。
在本发明的另一方面，氨基酸改变发生于C末端的10个氨基酸残基中。
另一方面，亲代脂解酶具有盖帽，氨基酸改变发生于该盖帽中。
本发明还提供了编码所述变体的DNA序列，含有所述DNA序列的表达载体，携有所述DNA序列或所述表达载体的转化型宿主细胞，本发明还涉及产生所述变体的方法，所述方法包括培养所述转化型宿主细胞以产生变体，并从所得培养液中回收变体。另外，本发明还提供了所述变体的用途。
本发明人还发现：具有脂肪酶和磷脂酶活性以及对双半乳糖甘油二酯具有活性的脂解酶能特别有效地用于烘焙食品，他们通过检测这些活性设计出筛选脂解酶的方法。
附图简述
图1显示出脂肪酶序列的对比排列。
发明详述
改变的对底物中选定酯键的活性
与亲代脂解酶相比，本发明的目的是改变针对至少一种底物中的至少一个选定酯键的活性，即通过降低不需要的活性与需要的活性的比例来增加需要的活性，降低不需要的活性，或改变底物特异性。
因此，具有增加的磷脂酶活性的酶可用于例如烘焙食品或纯化植物油。烘焙食品时可能需要增加对双半乳糖甘油二酯(DGDG)的水解活性。
可能在使用脂肪酶的任何工业中都需要增加脂肪酶活性。为了应用于去污剂或烘焙面包类食品，需要增加对长链(C16-C20)甘油三酯的活性，并且需要通过降低对短链或中等长度链(C4-C8)脂肪酸的活性与对长链脂肪酸的活性的比例来增加对长链脂肪酸的特异性。
为了应用于食品口味的开发(例如使奶酪味道鲜美)，需要增加脂肪酶对短链或中等长度链(C4-C8)甘油三酯的活性。
为了用作纯化植物油所用的磷脂酶，需要降低针对长链(C16-C20)甘油三酯的脂肪酶活性与磷脂酶活性的比例。
亲代脂解酶
本发明所用的脂解酶是能水解酯键的酶。这种酶包括例如：脂肪酶，如三酰甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)，脂蛋白脂肪酶(EC 3.1.1.34)，甘油单酯脂肪酶(EC 3.1.1.23)，溶血磷脂酶，阿魏酸酯酶和酯酶(EC 3.1.1.1，EC 3.1.1.2)。括号中的编号是国际生物化学联会酶学委员会根据酶的酶反应性类型指定的分类号。
亲代脂解酶可以是原核生物，尤其是细菌的酶，例如可以是自假单胞菌属的酶。实例如假单胞菌属脂肪酶，如得自洋葱假单胞菌(US 5,290,694，pdb文件夹为1OIL)，荚壳假单胞菌(N Frenken等.(1992)，应用环境微生物学.583787-3791，pdb文件夹为1TAH和1QGE)，类产碱假单胞菌(EP 334462)和假单胞菌菌株SD 705(FERM BP4772)(WO 95/06720，EP721 981，WO96/27002，EP 812910)的脂肪酶。荚壳假单胞菌的脂肪酶序列与粘稠色杆菌的氨基酸序列(DE 3908131 A1)相同。其它例子是细菌的角质酶(cutinase)，如得自如门多萨假单胞菌(US 5,389,536)或恶臭假单胞菌(WO 88/09367)的假单胞菌角质酶。
或者，亲代脂解酶可以是真核生物，如真菌的脂解酶，如腐质霉科和接合菌科的脂解酶和真菌角质酶。
真菌角质酶的例子是Fusarium solani pisi(S.Longhi等，分子生物学杂志，268(4)，779-799(1997))和Humicola insolens的角质酶(US 5,827,719)。
腐质霉科的脂解酶由H.lanuginosa菌株DSM 4109的脂肪酶和与所述脂肪酶具有50％以上同源性的脂肪酶组成。H.lanuginosa(Thermomyceslanuginosus的同义词)的脂肪酶描述于EP 258 068和EP 305 216，并具有US5,869,438的SEQ ID NO：2第1-269位所示的氨基酸序列。
腐质霉科也包括下列脂解酶：沙门氏柏干酪青霉的脂肪酶(P25234)，尖孢镰孢的脂肪酶/磷脂酶(EP 130064，WO 98/26057)，异孢镰孢的脂肪酶(R87979)，臭曲霉的溶血磷脂酶(W33009)，米曲霉的磷脂酶A1(JP-A 10-155493)，米曲霉的脂肪酶(D85895)，黑曲霉的脂肪酶/阿魏酸酯酶(Y09330)，塔宾曲霉的脂肪酶/阿魏酸酯酶(Y09331)，塔宾曲霉的脂肪酶(WO98/45453)，黑曲霉的溶血磷脂酶(WO 98/31790)，茄病镰孢的脂肪酶，其等电点为6.9，表观分子量为30kDa(WO96/18729)。
接合菌科含有与米赫根毛霉脂肪酶(P19515)至少50％同源的脂肪酶。该科也包括反射犁头霉，A.sporophora，伞枝犁头霉，A.blakesleeana，A.griseola的脂肪酶(皆描述于WO 96/13578和WO 97/27276)和米根霉的脂肪酶(P21811)。括号中的号码表示EMBL，GenBank，GeneSeqp或Swiss-Prot数据库的公开号或登记号。
人们对由不具有或仅具有很低磷脂酶活性的亲代脂解酶获得具有磷脂酶活性的变体特别感兴趣，所述亲代酶的磷脂酶活性相当于磷脂酶活性与脂肪酶活性的比例小于0.1PHLU/LU或小于50PHLU/mg。
醇结合位点附近的改变
如上所述，亲代脂解酶的氨基酸序列可在靠近底物甘油三酯的甘油部分的位置修饰。该区域被称为脂肪酶的“醇结合位点”；其描述于Brzozowski AM等，自然，351：491(1991)；Uppenberg等，生物化学，1995，34，16838-16851；A.Svendsen，Inform，5(5)，619-623(1994)。
对米赫根毛霉脂肪酶而言，醇结合位点的跨度可参见PDB文件夹″5tgl.pdb″，该文件夹可得自国际互联网上的蛋白质结构分类(SCOP)，其网址为http://www.rcsb.org/pdb/，显示出带有模拟底物的抑制剂正己基膦酸乙酯的复合体。有关描述可参见Derewenda等(文献同上)，Brzozowski等(文献同上)和Brady等(文献同上)。该模型的sn2位置是原子CE2。
变体一般在醇结合位点含有不超过10个改变，例如1，2，3，4，5或6个改变。
具体可在距C末端20位之内(例如10位之内)的醇结合位点部分进行改变。
如上所述，可在距离下述碳原子10_之内(例如8_之内，特别是6_之内)的位置处修饰亲代脂解酶的氨基酸序列，所述碳原子位于底物甘油三酯之甘油部分的sn2位置。下列氨基酸位置位于距米赫根毛霉脂肪酶sn2位置10_之内：25，28，80-84，88，143-146，175，203，205，254-255，257-259，264-267。下列位于8_之内：81-83，144，257-258，265-267，下列位于6_之内：82，144，257，266。
在Humicola lanuginosa脂肪酶中，下列位置位于sn2位置的10_之内：18，21，81-85，89，145-148，172，201，203，255-256，258-260，264-267。下列位于8_之内：82-84，89，146，258-259，265-267，下列位于6_之内：83，146，258，266。
催化三联体附近的改变
如上所述，一方面，亲代脂解酶具有含催化三联体的结构，所述三联体由活性丝氨酸，活性天冬氨酸和活性组氨酸残基组成，需改变的氨基酸属于由上述特定方法指定的set。所述结构可以是开口或闭合结构，它可以包括，也可以不包括底物或抑制剂。
通过使用如MSI′s Insight II软件可以方便地实施所述步骤。它包括与4TGL进行对比，4TGL是米赫根毛霉脂肪酶被二乙基对硝基苯基磷酸酯不可逆地抑制的晶体结构。所述结构可得自国际互联网上的蛋白质结构分类(SCOP)，其网址为http://www.rcsb.org/pdb/，并描述于Derewenda等，(文献同上)。米赫根毛霉脂肪酶含有催化三联体，所述三联体由氨基酸残基S144，D203和H 257组成。
对Humicola lanuginosa脂肪酶而言，可使用结构1tib；它可得自国际互联网上的蛋白质结构分类(SCOP)。使用此结构，由所述步骤指定的set包括下列位置：10-23，26，40，55-64，80-87，116-117，119，145-149，151，168，170，194，196-201，220-222，224-227和254-269。
在活性组氨酸残基C-末端一侧的改变
如上所述，可在活性组氨酸残基和所述末端之间的氨基酸序列中进行一个或多个改变，尤其可以在活性组氨酸C末端一侧的12个氨基酸中进行改变。
Humicola lanuginosa脂肪酶在H258处有一个活性组氨酸，且其C末端位于L269处，因此，该区域包括位置259-269。洋葱假单胞菌脂肪酶具有活性H286，且其C末端位子残基297处，因此，该区域包括残基287-297。
C-末端附近的改变
如上所述，可在距成熟蛋白质C末端10个氨基酸之内的位置，或者在对应于H.lanuginosa脂肪酶中的这类位置(即H.lanuginosa脂肪酶的第260-269位)的位置处进行一个或多个改变。通过按说明书下文所述对比两个序列即可发现对应的位置。
通过缺失对应于C末端前1，2，3，4，5或6位的氨基酸残基可以截短脂解酶变体。截短的变体可具有改良的热稳定性。
或者，该变体可在C末端和/或N末端携有一个肽延伸。C末端延伸可由1至10个氨基酸残基组成，如A，P，AG，DG，PG，AGG，PVGF，AGRF，PRGF，AGGF或AGGFS；或者可由40至50个残基组成，如由尖孢镰孢脂肪酶C末端48个残基AGGFSWRRYRSAESVDKRATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYVKNNQARS组成。C末端延伸可增加磷脂酶活性。
与醇结合位点重叠的区域中的一些改变描述如下。
特别的改变是在对应于Humicola lanuginosa脂肪酶G266的位置处进行取代，特别是用中等大小的氨基酸，如A，C，D，N，L，I，S，T，P或V进行取代。只需进行这种改变就足以增加磷脂酶活性。
其它特别的改变是通过例如导入大的侧链或通过破坏键的角度，如通过导入脯氨酸来改变三级结构。可以在对应于Humicola lanuginosa脂肪酶G263，L264，I265，T267或L269的位置处进行这种改变。具体的取代有G263A，E，Q，R；L264A，C，P，Q；I265L，N，T；T267A，Q或L269N。
盖帽中的改变
如上所述，可以修饰亲代脂解酶盖帽区域的氨基酸序列。该区域描述于Brady等，自然343，1990，767-770页和Brzozowski A M等，自然，351：491(1991)。在H.lanuginosa脂肪酶中，盖帽位于第80-100位，修饰可在第82-98位，如91-98位进行。
所述变体的盖帽区域一般含有不超过5个改变；它可含有0，1，2或3个改变。特别的改变是用中性或带正电的氨基酸取代H.lanuginosa脂肪酶中对应于G91，L93，N94，D96，K98，L97和/或E99的氨基酸，例如对应于G91A，T，L93K，N94D，D96S，W，G，L97Q，，K98D，F，E和/或E99K，D的取代。
特别是，在盖帽区域具有改变的变体在催化三联体附近，底物结合位点附近或C末端附近也含有一个或多个改变。
脂解酶变体
本发明的脂解酶变体在上述任一区域含有一个或多个氨基酸残基的改变。每个改变可以是氨基酸残基的缺失或取代，或者是在该氨基酸残基之前或之后插入。如果该氨基酸残基位于C末端，插入可以是C末端延伸。插入一般由1至5(如1至2)个氨基酸残基组成，C末端延伸可由1至50个或2至10个氨基酸残基组成。
上述区域中改变的总数目一般不超过20，如不超过10或不超过5，上述区域中的改变可以少至1或2个。
另外，本发明的脂解酶变体可任选包括亲代酶中的其它修饰，一般不超过10个，如不超过5个这种修饰。
所述变体与亲代脂解酶的同源性一般至少为80％，如至少为85％，一般至少为90％或至少为95％。
本发明的变体可进一步在N末端含有肽延伸，其可由1至15个(特别是4至10个)氨基酸残基组成，并特别地含有1，2或3个带正电的氨基酸。一些特定的N末端肽延伸是AS，SPIRR，E1RP，E1SPIRPRP，E1SPPRRP和E1SPIRPRP。另外，可使用WO 97/04079和WO 97/07202中所述的任何肽延伸。
特殊的变体
为了制备腐质霉科脂解酶的变体，可以特别地在Humicola lanuginosa脂肪酶中对应于20-25，56-64，81-85或255-269的位置进行氨基酸改变。因此，改变可以是在对应于A20，Y21，G23，K24，N25，V63，R81，G82，R84，A257，W260，Y261，F262或G266的位置进行取代，缺失或插入(例如排除G23C，K24C，R81C)，和在对应于C268或L269的位置进行氨基酸取代。
一些特别的改变是在对应于Humicola lanuginosa脂肪酶中的下列位置进行取代：Y21V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T，V60V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T，G61V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T，D62E/A/V，S83T，R84K/L/W，P256A，G263E，Q，R，F，L264A，C，P，F，G，I，I265L，N，F，G266D/E或T267A，Q，P，S，E，或对应于T267GS或T267GL的插入。
为了改变针对甘油三酯短链(C4-C8)脂肪酸的活性，可在对应于Y21，E56，D57，V60，G61，D62，R81，S83，R84，L259，Y261或G266的位置进行改变，例如在对应于Y21V/I，V60G，D62E/A/V，S83T，R84K/L/W或G266D/E的位置进行取代。
为了增加对DGDG的活性，可在对应于Y21，G23，N26，D57，D62，R81，S83，R84，S85，G266，T267或L269的位置进行改变；例如可进行两个或多个这种改变，同时再在盖帽区域进行一个或多个改变。为了增加磷脂酶活性，可在对应于R81，R84，S85或263-267，如G266或T267的位置进行改变。
为了制备假单胞菌属脂肪酶的变体，可在洋葱假单胞菌脂肪酶中对应于12-13，16-34，45-52，59-66，68，86-87，107-109，111，143-153，155，157-158，207-212，228，230，242-249，264，279-280，282-297，301-302，304-305，307-308的位置进行氨基酸修饰，特别是在洋葱假单胞菌/荚壳假单胞菌脂肪酶的L17/L17，T18/A18，Y29/Y29，L287/L286，E289/E288，I290/I289，Q292/Q291或L293/L292位置进行氨基酸修饰。
实施例中公开了H.lanuginosa脂肪酶的特定变体。可在其它亲代脂解酶中进行相应的改变。通过在1，106，186，225，232，237，239或274位免除氨基酸修饰即可由这些变体得到其它变体。具有274S的变体可任选含有进一步的C末端延伸WRRYRSAESVDKRATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYVKNNQARS(对应于尖孢镰孢脂肪酶的C末端)，所述C末端延伸可以是全长或截短的形式。
氨基酸改变的命名
本文用于定义突变的命名基本如WO 92/05249所述。因此，G91A表示第91位的G被A取代。T267A，Q表示第267位的T被A或Q取代。E1E，D，A表示E1不带电，或被D或A取代。
T267stop表示终止密码子，即缺失T267及其后面的所有氨基酸(即C268和L269)。270P，271V表示PV的C末端延伸(即在新位置270和271)。-G266表示缺失266位的G。括号表示改变是任选的，或者在实施例中表示改变是不确定的。SPIRR表示N末端延伸。D266可以指位置，或者指被任何氨基酸(除D以外)取代。
E1SPPCGRRP或SPPCGRRP(-E)表示用SPPCGRRP取代E1，即在N末端添加肽。T267GS表示用GS取代T267，或换句话说，表示T267G的取代并在G267和C268之间插入S。
同源性和序列对比
为了本发明的目的，可利用本领域已知的计算机程序适当地确定同源性程度，所述程序如GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for theWisconsin Package，版本8，1994年8月，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-45)，使用具有下列设置的GAP进行多肽序列比较：GAP产生得分为3.0，GAP延伸得分为0.1。
在本发明中，通过图1所示的序列对比确定以下微生物的脂肪酶序列中的相应(或同源)位置：米赫根毛霉(rhimi)，德列马根霉(rhidl)，Thermomyceslanuginosa(前述Humicola lanuginosa)(SP400)，沙门氏柏干酪青霉(Pcl)和尖孢镰孢(FoLnp11)。
为了找到序列对比中未显示的脂肪酶序列中的同源位置，将感兴趣的序列与图1所示的序列进行对比。通过与GAP程序所发现的最同源序列进行GAP序列对比，将新序列与图1中排列的序列进行对比。GAP是GCG程序包提供的(Program Manual for the Wisconsin Package，版本8，1994年8月，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-45)，使用下列设置进行多肽序列比较：GAP产生得分为3.0，GAP延伸得分为0.1。
具有磷脂酶活性的变体
如上所述，本发明的变体可具有比亲代脂解酶更高的磷脂酶活性。通过说明书下文中所述的单层法，在pH5时，所述变体具有的磷脂酶活性至少为0.1nmol/分钟。
通过说明书下文中所述的PHLU法，所述变体具有的磷脂酶活性至少为100PHLU/mg(纯酶蛋白的mg数)，特别是至少为500PHLU/mg。所述变体的磷脂酶活性与脂肪酶活性的比例(皆在pH7时测定)至少为0.1PHLU/LU，如至少为0.5，特别是至少为2。
通过PHLU法阐明，本发明的变体能水解完整的磷脂。它们可以具有A1和/或A2活性，因此它们能水解磷脂中的一个或两个脂酰基。
最适pH
Humicola lanuginosa脂肪酶的很多变体的脂肪酶活性最适pH为碱性，磷脂酶活性最适pH为酸性(如脂肪酶为pH9-10，磷脂酶为pH4-6)。可以在酸性pH下将这种变体作为伴有较低脂肪酶活性的磷脂酶使用(如下文所述可用于使油脱胶)。
然而，Humicola lanuginosa脂肪酶的一些变体(其包括G266D，E取代)在pH约为5-6时具有最适脂肪酶和磷脂酶活性。当同时需要脂肪酶和磷脂酶活性时，如烘焙食品时，可在酸性pH下使用这种变体。
热稳定性
利用示差扫描量热术(DSC)可方便地评价所述变体的热稳定性。根据实际发生的突变，本发明的变体一般具有与亲代脂解酶类似或相对略低的热稳定性。
当于pH5以90deg/小时加热时，Humicola lanuginosa脂肪酶变性峰值的顶端温度(Td)为70℃以上(＝Td)。本发明变体的Td一般要低5至10度。
变体的用途
根据底物的特异性，本发明的变体可用于诸如改良过滤法，处理植物油，烘焙面包类食品，去污剂或制备溶血磷脂。
改良过滤法
可使用具有溶血磷脂酶活性的变体处理水溶液或糖源浆液来改良其可滤过性。此方法特别适用于含有淀粉水解物的溶液或浆液，尤其是小麦淀粉水解物，因为它难以滤过并产生云状滤过物。可以按照与EP 219,269(CPCInternational)类似的方法进行处理。
植物油处理
具有磷脂酶活性的变体可用于加工食用油以降低其中的磷脂含量中，所述加工包括用变体处理油以水解磷脂的主要部分，并将含有已水解的磷脂的水相与油分开。该加I适用于纯化任何含有磷脂的食用油，如植物油，如豆油，菜籽油和葵花子油。可以在酸性pH，如pH3-5下进行处理。选择变体，使得该变体在低pH下具有高磷脂酶活性和低脂肪酶活性(因为这两种活性的最适pH不同)较为有利。
可根据本领域已知的原理，例如与US 5,264,367(Metallgesellschaft，Rohm)；K.Dahlke & H.Buchold，INFORM，6(12)，1284-91(1995)；H.Buchold，Fat Sci.Technol.，95(8)，300-304(1993)；JP-A 2-153997(Showa Sangyo)或EP654,527(Metallgesellschaft，Rohm)类似的原理进行油处理过程。
磷脂酶的多方面用途
通过按EP 870840，JP-A 10-42884，JP-A 4-135456或JP-A 2-49593所述，用具有磷脂酶活性的变体处理磷脂，以制备相应的溶血磷脂(如溶血卵磷脂)。也可按EP 628256，EP 398666或EP 319064所述，使用该变体制备蛋黄酱。
也可按EP 567,662(Nestle)，EP 426,211(Unilever，EP 166,284(Nestle)，JP-A 57-189638(Yakult)或US 4,119,564(Unilever)所述，将具有磷脂酶活性的变体用于加工乳制品和其它食品。
如JP-A 7-177884(Kao)所述，变体可用于皮革处理。
烘焙面包类食品
具有磷脂酶和/或DGDG酶活性的变体可用于制备生面，面包和饼，以增加生面的稳定性和生面的手感，或者改善面包或饼的弹性。因此，变体可用于制备面包的方法，所述方法包括在生面的成分中加入变体，揉生面，烘焙生面，制成面包。可以按类似于US 4,567,046(Kyowa Hakko)，JP-A 60-78529(QP公司)，JP-A 62-111629(QP公司)，JP-A 63-258528(QP公司)，EP426211(Unilever)或WO 99/53769(Novo Nordisk)的方法进行此过程。
特别有利的是，将变体与抗-走味的内切淀粉酶一起使用，还可任选加入一种磷脂，以在烘焙之后的24小时内减缓面包走味，特别是改善面包的柔软度。内切淀粉酶可以是产生麦芽糖的α-淀粉酶(例如得自芽孢杆菌的种的α-淀粉酶，如Novo Nordisk的Novamyl_)或真菌或细菌的α-淀粉酶，如曲霉属或芽孢杆菌属的α-淀粉酶，尤其是米曲霉，地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶。
在烘焙时，变体可对短链或中等长度的链(C4-C8)具有低活性，例如相当于SLU/LU比例大于3。使用这种变体可避免或抑制因短链脂肪酸的释放而产生的不合乎需要的味道。所述变体对甘油三酯和磷脂以及DGDG也具有活性。
奶酪增味
如M.Hanson，ZFL，41(10)，664-666(1990))所述，对短链脂酰基具有活性的变体也可用于释放游离脂肪酸(FFA)以使食品产生味道，例如使奶酪味道鲜美。
与长链脂肪酸相比，从奶的油脂中释放出的短链脂肪酸有所增加的脂解酶变体可用于生产奶酪，例如使成熟奶酪(如切达干酪(cheddar)或巴马干酪(parmesan))增味或成熟的时间缩短。这种脂解酶变体的另一个应用是用于酶改良的奶酪(EMC)，它可用作多种食品(包括加工奶酪，调味品和快餐)的增味剂。
释放短链脂肪酸，如丁酸是产生奶酪味所必需的，而释放长链脂肪酸，如油酸可使奶酪变味。奶酪(包括EMC)中所用的脂解酶变体的SLU/LU比例应该小于0.5，例如小于0.25，最优选小于0.1。
去污剂中的应用
变体也可用作去垢的添加剂，如浓度(表示为纯酶蛋白质)为0.001-10(如0.01-1)mg/g去污剂或0.001-100(如0.01-10)mg/l洗涤液。
在去污剂中，所述变体可对长链甘油三酯(C16-C20)具有高活性以促进油污的去除。所述变体可具有磷脂酶活性。所述变体可对甘油三酯中的短链(C4-C8)脂肪酸具有低活性，例如相当于SLU/LU比例大于10。使用这种变体可避免或抑制因释放短链脂肪酸而产生的不合乎需要的臭气。
在碱性pH下同时具有脂肪酶和磷脂酶活性的变体可用于去污剂。
去污剂组合物
例如，本发明的去污剂组合物可以配制成手洗或机洗的洗衣用去污剂组合物，包括适用于预处理染色织物洗衣用添加组合物和漂洗时添加的织物柔顺剂组合物，或配制成可用于家用器具坚硬表面的一般性清洁操作的去污剂组合物。在洗衣用的去污剂中，所述变体可以有效地去除污渍，保持白净和清除污点。可按WO 97/04079，WO 97/07202，WO 97/41212，PCT/DK WO98/08939和WO 97/43375所述配制洗衣用的去污剂组合物。
本发明的去污剂组合物可以按GB 2,247,025(Unilever)或WO 99/01531(Procter&Gamble)所述，经特别配制用于手洗或机洗盘碟。在洗盘碟所用的组合物中，所述变体可以有效地去除油污/油渍，防止盘碟和洗碟机中的塑料配件被着色很深的组件染色/变色，并避免盘碟中沉淀石灰皂。
本发明的去污剂组合物可以采取任何方便的形式，例如条形，片状，粉末，颗粒，膏状或液体。液体去污剂可以含水，一般含水达70％，含有机溶剂0-30％，或者也可以不含水。
去污剂组合物含有一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非-离子型，包括半-极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或兼性离子型。表面活性剂占重量的0.1％至60％，如0.5-40％，如1-30％，通常1.5-20％。
当包括在其中时，所述去污剂通常含有约1％至约40％的阴离子去污剂，如线性烷基苯磺酸酯，α-烯烃磺酸酯，烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)，醇乙氧基硫酸酯，二级链烷磺酸盐，α-硫代脂肪酸甲酯，烷基-或链烯基琥珀酸或肥皂。
当包括在其中时，所述去污剂通常含有约0.2至约40％的非离子型表面活性剂，如脂肪醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基聚苷，烷基二甲基胺-氧化物，乙氧基化脂肪酸单乙醇-酰胺，脂肪酸单乙醇酰胺，聚羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)”)。
本发明还提供了含有本发明变体的去垢添加剂。所述去垢添加剂以及去污剂组合物可含有一种或多种其它酶，如蛋白酶，脂肪酶，角质酶，淀粉酶，糖酶，纤维素酶，果胶酶，甘露聚糖酶，阿拉伯聚糖酶，半乳聚糖酶，木聚糖酶，氧化酶，如漆酶和/或过氧化物酶。
通常，所选酶的特性应该与所选去污剂相容(即pH最适性，与其它酶和非酶组分的相容性等)，所述酶应该以有效量存在。
蛋白酶：适当的蛋白酶包括来源于动物，植物或微生物的蛋白酶。优选源自微生物的蛋白酶。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的蛋白酶。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草蛋白酶，尤其是得自芽孢杆菌的此类酶，例如枯草蛋白酶Novo，枯草蛋白酶Carlsberg，枯草蛋白酶309，枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(如源自猪或牛的胰蛋白酶)以及WO 89/06270和WO 94/25583中所述的镰孢属蛋白酶。
有用的蛋白酶的例子是描述于WO 92/19729，WO 98/20115，WO 98/20116和WO 98/34946中的变体，尤其是在一个或多个下列位置中发生了取代的变体：27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。
具体的可商购的蛋白酶包括Alcalase_，Savinase_，Primase_，Duralase_，Esperase_，和Kannase_(Novo Nordisk A/S)，Maxatase_，Maxacal_，Maxapem_，Properase_，Purafect_，Purafect OxP_，FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
纤维素酶：适当的纤维素酶包括源自细菌或真菌的纤维素酶。也包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。适当的纤维素酶包括得自芽孢杆菌属，假单胞菌属，腐质霉属，镰孢属，草根霉属，支顶孢属的纤维素酶，例如由Humicola insolens，Myceliophthora thermophila和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶，其公开于US 4,435,307，US5,648,263，US 5,691,178，US 5,776,757和WO 89/09259。
特别合适的纤维素酶是具有保护颜色的优点的碱性或中性纤维素酶。这种纤维素酶的例子是EP 0495257，EP 0531372，W O96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它例子是如WO 94/07998，EP 0531315，US 5,457,046，US 5,686,593，US 5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299所述的纤维素酶变体。
可商购的纤维素酶包括Celluzyme_，和Carezyme_(Novo Nordisk A/S)，Clazinase_，和Puradax HA_(Genencor International Inc.)，和KAC-500(B)_(kao公司)。
过氧化物酶/氧化酶：适当的过氧化物酶/氧化酶包括源自植物，细菌或真菌的酶。也包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。有用的过氧化物酶的例子包括WO 93/24618，WO 95/10602和WO 98/15257所述的得自Coprinus，如C.cinereus的过氧化物酶及其变体。
可商购的过氧化物酶包括Guardzyme_(Novo Nordisk A/S)。
通过加入含有一种或多种酶的独立的添加剂，或通过加入含有所有这些酶的混合型添加剂，可以将去污酶包含在去污剂组合物中。本发明的去垢添加剂，即独立的添加剂或混合的添加剂可配制成例如颗粒，液体，浆液等。具体的去垢添加剂制剂是颗粒，尤其是不会形成粉末的颗粒，液体，尤其是稳定化的液体，或浆液。
可以按US 4,106,991和4,661,452所述产生不会形成粉末的颗粒，并任选通过本领域已知的方法包被。蜡性包被材料的例子是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中的醇含有12至20个碳原子，而且其中有15至80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油单酯，甘油二酯和甘油三酯。适用于流体床技术的可形成薄膜的包被材料例子描述于GB 1483591。可以根据现有方法，通过加入聚醇(如丙二醇)，糖或糖醇，乳酸或硼酸来稳定液态酶制品。可根据EP 238,216中公开的方法制备被保护的酶。
去污剂可含有0-65％去污剂助剂或复合剂，如沸石，二磷酸，三磷酸，膦酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐，次氮基三乙酸，乙二胺四乙酸，二乙烯三胺五乙酸，烷基-或链烯基琥珀酸，可溶性硅酸盐或分层的硅酸盐(如Hoechst的SKS-6)。
去污剂可含有一种或多种聚合物，例如羧甲基纤维素，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯咪唑)，聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯，马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物。
去污剂可含有漂白系统，该系统含有可产生H2O2的物质，如过硼酸盐或过碳酸盐，它们可与形成过酸的漂白剂激活物混合，所述激活物如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐。或者，漂白系统可含有例如酰胺，二酰亚胺或砜型过氧酸。
可使用常规的稳定剂使本发明去污剂组合物的酶稳定化，所述稳定剂如聚醇，如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，如芳香族硼酸酯或苯基硼酸衍生物，如4-甲酰基苯基硼酸，可按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制组合物。
去污剂也可含有其它常规的去污剂成分，如织物调节剂，包括粘土，发泡剂，消泡剂，抗腐蚀剂，污物悬浮剂，抗-污物再沉积剂，染料，杀菌剂，光亮剂，水溶助长剂，晦暗抑制剂或香料。
目前，希望在去污剂组合物中能加入任何酶，尤其是本发明的变体，加入的量相当于0.01-100mg酶蛋白质/升洗涤液，如0.05-5mg酶蛋白质/升洗涤液，特别是0.1-1mg酶蛋白质/升洗涤液。
另外，可将本发明的变体掺入WO 97/07202(列入本文作为参考)中公开的去污剂制剂中。
制备酶变体的方法
可根据本领域已知的方法，如WO 97/04079(Novo Nordisk)所述的方法制备本发明的酶变体。以下描述了克隆编码酶的DNA序列的方法，接着描述了在编码酶的序列中的特定位点产生突变的方法。
克隆编码酶的DNA序列
可使用本领域众所周知的多种方法，从产生亲代酶的任何细胞或微生物中分离编码所述酶的DNA序列。首先，应使用得自生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库，所述生物体可产生目的酶。然后，如果所述酶的氨基酸序列是已知的，可合成经标记的寡核苷酸探针，使用该探针从制备自所述生物体的基因组文库中鉴定出编码酶的克隆。或者，可将含有与另一个已知酶基因同源之序列的经标记的寡核苷酸探针用作探针，通过较低严紧度的杂交和洗涤条件鉴定出编码酶的克隆。
鉴定编码酶的克隆的另一种方法包括将基因组DNA片段插入表达载体，如质粒，用所得基因组DNA文库转化酶-阴性细菌，然后将经转化的细菌铺于含有酶底物(即麦芽糖)的琼脂上，从而鉴定出表达酶的克隆。
或者，可以通过现有标准方法，如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)，四面体通讯22，1859-1869页所述的膦酰胺法或者Matthes等，(1984)，EMBOJ.3，801-805页所述的方法，合成编码所述酶的DNA序列。在膦酰胺法中，在自动化的DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火，连接并克隆至适当载体中。
最后，DNA序列可以是根据标准技术，通过连接人工合成的，基因组的或cDNA来源的片段(适当时，这些片段对应于完整DNA序列的多个部分)而制备的基因组DNA与合成性DNA的混合型DNA序列，合成性DNA与cDNA来源的DNA的混合型DNA序列，或基因组DNA与cDNA来源的DNA的混合型DNA序列。也可按US 4,683,202或R.K.Saiki等，(1988)，科学239，1988，487-491页所述，使用特异性引物，通过聚合酶链反应(PCR)制备DNA序列。
定点诱变
一旦分离出编码酶的DNA序列，并且鉴定出合乎需要的突变位点，可使用合成性寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有侧翼于所需突变位点的核苷酸序列。在特定的方法中，在携有所述酶基因的载体中产生编码酶的DNA序列的单链缺口。然后，使携有所需突变的合成核苷酸与该单链DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(klenow片段)补平残留的缺口，使用T4连接酶连接所述构建体。此方法的特例描述于Morinaga等，(1984)，生物技术2，646-639页。US 4,760,025公开了通过对DNA序列组件进行少许改变来导入编码多个突变的寡核苷酸。然而，通过Morinaga法甚至可以在任何一次导入更多的突变，因为可导入多个不同长度的寡核苷酸。
另一种将突变导入编码酶的DNA序列的方法描述于Nelson和Long，(1989)，分析生物化学180，147-151页。它包括用3步产生含有所需突变的PCR片段，所述突变是通过在PCR反应中将化学合成的DNA链用作引物之一而导入的。通过用限制性内切核酸酶裂解，从PCR-产生的片段中分离出携有突变的DNA片段，并重新插入表达质粒。
另外，Sierks等，(1989)“泡盛曲霉葡糖淀粉酶的活性位点Trp120处的定点诱变”，蛋白质工程，2，621-625；Sierks等，(1990)，“通过诱变泡盛曲霉葡糖淀粉酶的Asp176，Glu179和Glu180确定的真菌葡糖淀粉酶催化机理”，蛋白质工程，卷3，193-198也描述了曲霉属葡糖淀粉酶中的定点诱变。
酶变体的表达
根据本发明，可以使用表达载体，以酶的形式表达编码所述变体的DNA序列，所述变体是通过上述方法或通过本领域已知的任何其它方法产生的，所述表达载体一般包括编码启动子，操纵子，核糖体结合位点，翻译起始信号的控制序列，并任选包括阻抑蛋白基因或多种激活子基因。
表达载体
携有编码本发明酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是能方便地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于待导入载体的宿主细胞。载体可以是当导入宿主细胞时能整合至宿主细胞基因组，并能随整合有该载体的染色体一起复制的载体。适当表达载体的例子包括pMT838。
启动子
在载体中，DNA序列应该与适当启动子序列可操作相连。启动子可以是在所选宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，启动子可得自编码蛋白质的基因，所述蛋白质可以与宿主细胞同源或异源。
介导编码本发明酶变体的DNA序列的转录，尤其是在细菌宿主中的转录的适当启动子有：大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因的dagA启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖的淀粉酶基因(amyM)的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子，枯草芽孢杆菌xy1A和xy1B基因的启动子等。为了在真菌宿主中转录，有用的启动子有：得自编码米曲霉TAKA淀粉酶的基因的启动子，酿酒酵母TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Alber等，(1982)，J.Mol.Appl.Genet 1，p.419-434)，和米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的启动子。
表达载体
本发明的表达载体也可含有适当的转录终止子，在真核生物中，所述载体还含有聚腺苷酸化序列，该序列与编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列可操作相连。终止序列和聚腺苷酸化序列可以适当地得自与启动子相同的来源。
载体也可进一步含有能使该载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。所述序列的例子是质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。
载体也可以含有选择标记，例如产生可补偿宿主细胞缺陷的产物的基因，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者能赋予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性。另外，载体也可含有曲霉属的选择标记，如amdS，argB，niaD和sC，产生潮霉素抗性的一种标记，或可通过WO 91/17243所述的共转化完成选择。
用于分别连接编码酶变体的本发明DNA构建体，启动子，终止子和其它元件的方法，和用于将它们插入含有复制所需信息的适当载体的方法是本领域技术人员众所周知的(例见Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，1989)。
宿主细胞
含有如上所述的本发明DNA构建体，或表达载体的本发明细胞可以有利地用作重组生产本发明酶变体的宿主细胞。通过将编码所述变体的本发明DNA构建体(一个或多个拷贝)整合至宿主染色体，可以方便地转化细胞。一般认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定维持。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组将DNA构建体整合至宿主染色体。或者，可以用与不同类型的宿主细胞有关的上述表达载体转化细胞。
本发明的细胞可以是高等生物的细胞，例如哺乳动物或昆虫的细胞，但也可以是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。
适当细菌的例子是革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌或淡紫青链霉菌或鼠灰链霉菌，或者革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。可通过原生质体转化，或通过使用感受态细胞以本身已知的方法转化细菌。
酵母优选糖酵母属或裂殖糖酵母属的种，例如酿酒酵母。
宿主细胞也可以是丝状真菌，例如曲霉属的菌株，如米曲霉或黑曲霉，或镰孢属的菌株，如尖孢镰孢，禾谷镰孢(最佳状态称为玉米赤霉(Gribberellazeae)，以前被称为Sphaeria zeae，与Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis是同义词)，或硫色镰孢(确切的名称为虱状赤霉(Gibberellapuricaris)，与Fusarium trichothecioides，杆孢状镰孢，接骨木镰孢，玫瑰色镰孢和玫瑰色镰孢禾谷变种是同义词)，Fusarium cerealis(与Fusariumcrokkwellnse是同义词)，或Fusarium venenatum。
在本发明具体实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺损的蛋白酶阴性菌株。
例如，宿主细胞可以是蛋白酶缺损的米曲霉菌株JaL 125，其碱性蛋白酶基因(被称为“alp”)缺失。该菌株描述于WO 97/35956(Novo Nordisk)。
可通过形成原生质体，转化原生质体，接着以其原有方式再生细胞壁，而转化丝状真菌细胞。曲霉属作为宿主微生物的用途描述于EP 238 023(Novo Nordisk A/S)，其内容列入本文作为参考。
产生本发明酶变体的方法
本发明酶变体的产生可以是，在有利于产生所述变体的条件下培养宿主细胞，并从这些细胞和/或培养基中回收所述变体。
用于培养所述细胞的培养基可以是适于培养所述宿主细胞并表达本发明酶变体的任何常规培养基。可以商购，或者可根据公开的配方(例如描述于美国典型培养物保藏中心目录中的配方)制备适当的培养基。
可通过众所周知的方法从培养基中方便地回收宿主细胞分泌的酶变体，所述方法包括通过离心或过滤使细胞与培养基分开，利用盐(如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质组分，接着使用层析法，如离子交换层析，亲和层析等。
在植物中表达变体
本发明还涉及转基因植物，植物部分或植物细胞，它们已被编码本发明变体的DNA序列转化，从而能够以可回收的量表达和产生此酶。可从植物或植物部分中回收酶。或者，也可直接使用含有重组酶的植物或植物部分。
转基因植物可以是双子叶或单子叶植物。单子叶植物的例子是禾本科植物，如草甸草(早熟禾属(Poa))，饲料草，如羊茅属(festuca)，黑麦草属(lolium)，温带草如剪股颍属(Agrostis)，和谷类植物，如小麦，燕麦，黑麦，大麦，水稻，高粱和玉米。
双子叶植物的例子是烟草，豆科植物，如羽扇豆属植物，马铃薯，甜豆，豌豆，蚕豆和大豆，和十字花科植物(芸苔科)，如花椰菜，油菜子和密切相关的模型生物拟南芥。
植物部分的例子是茎，愈伤组织，叶，根，果实，种子和块茎。在本发明的上下文中，特定的植物组织也被认为是植物部分，如叶绿体，质外体，线粒体，液泡，过氧化物酶体和胞质。另外，任何植物细胞(无论其来源于何种组织)都被认为是植物部分。
本发明范围内还包括所述植物，植物部分和植物细胞的后代。
可根据本领域已知的方法构建表达本发明变体的转基因植物或植物细胞。简单地说，可通过下列方法构建植物或植物细胞，即将一种或多种编码本发明变体的表达构建体掺入植物宿主基因组，并将所得的经修饰植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞。
合适的表达构建体可以是DNA构建体，该构建体含有编码本发明变体的基因，所述基因与适当的调节序列可操作相连，所述调节序列是在选定植物或植物部分中表达基因所必需的。另外，所述表达构建体可含有选择标记和将该构建体导入所述植物所需的DNA序列(后者取决于所用的DNA导入法)，所述选择标记可用于鉴定整合了表达构建体的宿主细胞。
可根据例如需要在何时，何地和以何种方式表达酶来选择调节序列，例如启动子和终止序列并任选包括信号序列或转运序列。例如，编码本发明变体的基因的表达可以是组成型或诱导型表达，或者可以是发育，阶段或组织特异性表达，基因产物可以靶向特定的组织或植物部分，如种子或叶。调节序列描述于例如Tague等，植物生理学，86，506，1988。
为了进行组成型表达，可使用35S-CaMV启动子(Franck等，1980.细胞21：285-294)。器官特异性启动子可以是例如贮藏库组织(如种子，马铃薯块茎和果实)的启动子(Edwards&Coruzzi，1990.遗传学年鉴24：275-303)，或代谢库组织(如分生组织)的启动子(Ito等，1994.植物分子生物学.24：863-878)，种子特异性启动子，如水稻谷蛋白，谷醇溶蛋白，球蛋白或白蛋白的启动子(Wu等，植物和细胞生理学Vol.39，No.8pp.885-889(1998))，蚕豆豆球蛋白B4和蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(Conrad U等，植物生理学杂志Vol.152，No.6PP.708-711(1998))，种子油体蛋白的启动子(Chen等，植物和细胞生理学vol.39，No.9pp.935-941(1998))；Brassica napus贮藏蛋白napA的启动子，或本领域已知的任何其它种子特异性启动子(例见WO91/14772)。另外，启动子可以是叶特异性启动子，例如水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，植物生理学Vol.102，No.3pp.991-1000(1993))，小球藻属病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra，A和Higgins，OW，植物分子生物学Vol.26，No.1 pp.85-93(1994))，或水稻的aldP基因启动子(Kagaya等，分子和普通遗传学，Vol.248，No.6 pp.668-674(1995))，或创伤诱导型启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，植物分子生物学Vol.22，No.4 pp.573-588(1993))。
可使用启动子增强子元件在植物中获得较高的酶表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子和编码酶的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等，文献同上公开了使用水稻肌动蛋白1基因的第一个内含子增强表达。
选择标记基因和表达构建体的任何其它部分可选自本领域已知的那些。
可根据本领域已知的常规技术将DNA构建体掺入植物基因组，所述技术包括农杆菌-介导的转化，病毒-介导的转化，显微注射，微粒轰击，biolistic转化和电穿孔(Gasser等，科学，244，1293；Potrykus，Bio/Techn.8，535，1990；Shimamoto等，自然，338，274，1989)。
目前，根瘤农杆菌介导的基因转移是产生转基因双子叶植物的候选方法(有关综述见Hooykas & Schilperoort，1992.植物分子生物学.19：15-38)，然而，该方法也可用于转化单子叶植物，但单子叶植物一般使用其它的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的候选方法是微粒轰击(被转化DNA包被的显微金或钨颗粒)胚愈伤组织或发育中的胚(Christou，1992.植物杂志.2275-281；Shimamoto，1994.最新生物技术观点.5：158-162；Vasil等，1992.Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的另一种方法基于原生质体转化(Omirulleh S等，植物分子生物学Vol.21，No.3pp.415-428(1993))。
转化之后，根据本领域众所周知的方法选择掺入了表达构建体的转化子并将其再生成完整植物。
材料和方法
脂肪酶对三丁酸甘油酯的活性(LU)
通过使用阿拉伯胶作为乳化剂乳化三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)来制备脂肪酶底物。在恒pH的滴定实验中，于30℃，pH7的条件下水解三丁酸甘油酯。一个单位的脂肪酶活性(1LU)等于能在标准条件下每分钟释放1μmol丁酸的酶量。
脂肪酶对三油精甘油酯的活性(SLU)
可使用橄榄油作为底物来测定脂解活性。
在此SLU法中，于30℃，pH9的条件下，使用稳定化的橄榄油乳液(Sigma目录号800-1)作为底物，在5mM Tris缓冲液中测定脂肪酶活性，所述缓冲液含有40mM NaCl和5mM氯化钙。将2.5ml底物与12.5ml缓冲液混合，调节pH为9，加入0.5ml经稀释的脂肪酶样品，通过恒pH的滴定测定所形成的油酸的量。
一个SLU是在所述条件下每分钟释放1mol可滴定的油酸的脂肪酶量。
磷脂酶活性
使用下列检测方法定性或定量测定磷脂酶活性。
磷脂酶活性(PHLU)
磷脂酶活性(PHLU)可被测定为卵磷脂中游离脂肪酸的释放。50μl含4％L-α-磷脂酰胆碱(得自Avanti的植物卵磷脂)，4％Triton X-100，5mM CaCl2的50mM HEPES，pH7被加入到50μl用50mM HEPES，pH7稀释至适当浓度的酶溶液中。于30℃将样品保温10分钟，于95℃5分钟终止反应，然后离心(7000rpm，5分钟)。使用Wako Chemicals GmbH的NEFA C试剂盒测定游离的脂肪酸；在25μl反应混合物中加入250μl试剂A，于37℃保温10分钟。然后加入500μl试剂B，再于37℃将样品保温10分钟。使用二极管列阵分光光度计HP 8452A测定550nm的光吸收值。至少对双份样品进行实验。底物和酶盲试(预加热的酶样品(95℃，10分钟)+底物)也包括在其中。油酸被用作脂肪酸标准。1PHLU等于能在这些条件下每分钟释放1μmol游离脂肪酸的酶量。
磷脂酶活性(LEU)
在恒定的pH和温度下水解卵磷脂，磷脂酶活性被测定为滴定剂(0.1NNaOH)在中和所释放的脂肪酸的过程中的消耗速率。
底物是大豆卵磷脂(L-α-磷脂酰胆碱)，条件是pH8.00，40.0℃，反应时间为2分钟。活性单位是参照标准的相对值。
磷脂酶单层试验
在缓冲溶液(10mM Glycin，pH9.0或10mM NaOAc，pH5.0；1mM CaCl2，25℃)彻底纯化的表面，由氯仿溶液展开二-癸酰基磷脂酰胆碱(DDPC)单层。使单层松弛(蒸发氯仿)之后，将表面压力调节为15mN/m，相当于DDPC的平均分子面积约为63_2/分子。将含有约60μg酶的溶液穿过单层注射至“零级”槽反应室的面下相(表面积为2230mm2，反应体积为56570mm3的圆筒)。不溶性的底物分子被水解成更具水溶性的反应产物，使一个可移动的屏障压缩单层以维持表面压力的恒定，可用其移动速率来表示酶活性。已证实反应产物(癸酸和MDPC)的水溶性比DDPC的高很多，可以由DDPC的平均分子面积(MMA)估计所述酶每分钟水解的DDPC-分子的数目。根据水解的最初5分钟的平均屏障速率计算结果。
如果屏障以超过2mm/分钟的速率移动，可以认为结果是阳性的。
平板试验1
A)将50ml含2％琼脂糖的纯水融化/搅拌5分钟并冷却至60-63℃。
B)用ultrathorax将50ml含2％植物L-α-磷脂酰胆碱95％的0.2M NaOAc，10mM CaCl2，pH5.5(60℃，30分钟)混合15秒。
混合等量的2％琼脂糖和2％卵磷脂(A和B)，在此混合物中加入等量的1％Triton X-100。加入250μl含4mg/ml结晶紫的纯水作为指示剂。将混合物倒入适当的平皿(如倒30ml于14cm_平皿)，在琼脂中挖适当的孔(3-5mm)以盛放酶溶液。
稀释酶样品至浓度相当于OD280＝0.5，在琼脂糖/卵磷脂基质中，将10微升样品上样于孔中。于30℃保温平板，约4至5小时之后和/或保温约20小时之后，鉴定平板中的反应区。Humicola lanuginosa脂肪酶被用作对照，出现比对照大的清亮区为是磷脂酶活性的阳性结果。
在此试验的变体中，未加入Triton X-100。
平板试验2
通过在微波炉中煮沸将10g琼脂糖融化于550ml水中。冷却至60-70℃，加入下列成分：
250ml 0.4M柠檬酸盐缓冲液(pH4.5或pH7.1)
200ml含3％卵磷脂(得自Avanti)的2％Triton-X 100
2ml 2％结晶紫
将30ml该混合物倒入14cm_平皿。
上样酶样品之后保温平板，按平板试验1中所述阐明结果。
双半乳糖甘油二酯水解(DGDG酶)活性
单层试验1
在缓冲溶液(10mM NaOAc，pH5.5；1mM CaCl2，25℃；10mM β-环糊精(Sigma C-4767))彻底纯化的表面，由氯仿溶液展开DGDG(Sigma(D4651)单层。使单层松弛(蒸发氯仿)之后，将表面压力调节为15mN/m。将含有约60μg酶的溶液穿过单层注射至“零级”槽反应室的面下相(表面积为2230mm2，反应体积为56570mm3的圆筒)。不溶性底物分子被水解成更具水溶性的反应产物(在β-环糊精的存在下)，使可移动的屏障压缩单层以维持表面压力的恒定，可用其速率的增加来表示酶活性。
如果该屏障以超过1mm/分钟的速率移动，则是DGDG酶阳性的。
单层试验2
在缓冲溶液(约75ml，10mM NaOAc，pH5.5；1mM CaCl2，25℃；10mMβ-环糊精(Sigma C-4767))彻底纯化的表面，由氯仿溶液展开DGDG(Sigma(D4651)单层至表面压力约为30mN/m。使单层松弛(蒸发氯仿)之后，将含有约30μg纯化酶的溶液穿过单层注射至75ml的面下相，同时连续测定表面压力。DGDG被水解成水溶性的反应产物(在β-环糊精的存在下)，可以通过表面压力下降的速度加快来表示酶活性。
如果加入酶之后表面压力(dπ/dt)的最大下降超过-0.5mN/分钟，可以认为结果是DGDG酶阳性。检测大量Lipolase变体，发现它们具有DGDG酶活性，而亲代酶(Lipolase)仅具有很有限的活性(dπ/dt＞-0.5mN/分钟)。
酵母菌株
酿酒酵母YNG318：MATa leu2-D2ura3-52his4-539pep4-Dl[cir+]，描述于WO 97/04079和WO 97/07205。
转化酵母菌株
混合DNA片段和开环载体，并通过标准方法转化至酿酒酵母YNG318。
酵母转化的载体
pJSO026(酿酒酵母表达质粒)描述于WO 97/07205和J.S.Okkels，(1996)“pYES载体中的URA3-启动子缺失可提高酿酒酵母对真菌脂肪酶的表达水平”，重组DNA生物技术III：一体化的生物和工程科学，vol.782，纽约科学院年刊。通过用组成型表达的酿酒酵母TPI(丙糖磷酸异构酶)-启动子取代pYES2.0中的诱导型GALl-启动子(Albert和Karwasaki，(1982)，J.Mol.Appl.Genet.，1，419-434)，并缺失一部分URA3启动子，即可由pYES 2.0衍生得到pJSO026。
定点诱变
为了构建H.lanuginosa脂解酶变体，可根据厂商说明使用Chameleon双链，定点诱变试剂盒。
将编码所述脂解酶的基因插入质粒pHD414。根据厂商说明，通过使用下列引物将pHD414中氨苄青霉素基因的Scal位点替换为Mlul位点：
引物3：AGAAATCGGGTATCCTTTCAG。
然后将含有所述脂解酶基因的pHD414载体用作DNA聚合酶和寡核苷酸7258和7770的模板。
7258：5′p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3′
(由此将氨苄青霉素抗性基因中的ScaI位点变为Mlul切割位点)。
引物7770被用作选择引物。
7770：5′p tct agc cca gaa tac tgg atc aaa tc 3′(改变H.lanuginosa脂肪酶基因中的ScalI位点，而不改变其氨基酸序列)。
通过添加含有所需突变的适当寡核苷酸可将所需突变(如脂解酶基因N末端的突变或导入半胱氨酸残基)导入所述脂解酶基因。
根据厂商推荐进行PCR反应。
筛选方法
在SC-ura琼脂平板上将酵母文库铺于纤维素滤纸上，30℃保温3至4天。
然后将滤纸转移至卵磷脂平板上，37℃保温2至6小时。携有活性磷脂酶的酵母细胞会在菌落周围产生白色的清亮区。然后进一步纯化和检测这些阳性变体。
培养基
SC-ura培养基
酵母氮(不含氨基酸)          7.5g
琥珀酸                      11.3g
NaOH                        6.8g
酪蛋白氨基酸(不含维生素)    5.6g
色氨酸                      0.1g
琼脂，Merck                 20g
蒸馏水                      加至1000ml
以121C高压灭菌20分钟。
在900ml培养基中加入4ml无菌的5％苏氨酸母液和100ml无菌的20％葡萄糖。
实施例
实施例1：通过PCR反应构建具有Humicola lanuginosa脂肪酶骨架和尖孢镰孢磷脂酶的C末端的变体
将下列变体用作Humicola lanuginosa脂肪酶骨架的模板：E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R和SPIRR+G91A+D96W+E99K+Q249R。使用亲代脂肪酶产生不具有Q249R的C末端片段。C末端磷脂酶的模板是尖孢镰孢磷脂酶，它与Humicola lanuginosa脂肪酶的变体被克隆至同一载体上。
PCR反应1：4244(SEQ ID NO：1)作为5’引物，H7(SEQ ID NO：6)作为3’引物，模板为上述两个模板中的一个。
PCR反应2：FOL14(SEQ ID NO：3)作为5’引物，FOL15(SEQ ID NO：4)作为3’引物，模板为Humicola lanuginosa脂肪酶(第249位无突变)。
PCR反应3：FOL16(SEQ ID NO：5)作为5’引物，AP(SEQ ID NO：2)作为3’引物，模板为尖孢镰孢磷脂酶。
使用FOL14(SEQ ID NO：3)作为5’引物，AP(SEQ ID NO：2)作为3’引物，PCR反应2和3作为模板进行PCR反应4，以产生Humicola lanuginosa脂肪酶变体与磷脂酶的C末端之间的连接。
使用4244(SEQ ID NO：1)作为5’引物，KBoj14(SEQ ID NO：7)作为3’引物，PCR反应1和4作为模板进行最后的PCR(通过在反应2中使用Humicola lanuginosa脂肪酶为模板，使删除第249位的突变成为可能)。
将最终的PCR片段与经限制性酶SmaI(或BamHI)和XbaI切割(以除去编码区，并同时在每个末端产生约75bp的重叠从而使重组事件可以发生)的pJSO026一起用于在酵母中进行体内重组。这种最终的处理也可用于下列实施例。
引物FOL14(SEQ ID NO：3)和引物15/16是混合的寡核苷酸，它使与Humicola lanuginosa脂肪酶和磷脂酶模板的结合成为可能，同时还使在不同位置导入上述两种模板的氨基酸成为可能。对于一些位置而言，也可导入新的氨基酸。
引物FOL14(SEQ ID NO：3)
Humicola lanuginosa脂肪酶中的第205位：75％R，25％S。
引物FOL15(SEQ ID NO：4)/FOL16(SEQ ID NO：5)
Humicola lanuginosa脂肪酶中的第256位：50％P，50％A。
Humicola lanuginosa脂肪酶中的第260位：25％R，12.5％Q，12.5％H，12.5％C，12.5％Y，12.5％W，12.5％终止。
测定所得变体的序列，发现其相当于具有下列改变的Humicolalanuginosa脂肪酶，括号中的改变是不确定的。
E1A，G91A，D96W，E99K，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
E1A，G91A，D96W，E99K，E239G，Q249R，P256A，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G273F，(274S)
E1A，G91A，D96W，E99K，N248T，Q249R，W260Q，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
SPIRR，G91A，D96W，E99K，W260C，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272，G273F，(274S)
SPIRR，G91A，D96W，E99K，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
E1A，G91A，D96W，E99K，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
实施例2：产生截短的序列
制备在氨基酸269，270，271，272，(273和274)之后终止的变体。
用下列模板进行下列PCR反应：E1A，G91A，D96W，E99K，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)。
反应1：5’引物4244(SEQ ID NO：1)和3’引物KBoj36(在269之后终止)
反应2：5’引物4244(SEQ ID NO：1)和3’引物KBoj37(在270之后终止)
反应3：5’引物4244(SEQ ID NO：1)和3’引物KBoj38(在271之后终止)
反应4：5’引物4244(SEQ ID NO：1)和3’引物KBoj39(在272之后终止)
测定所得变体的序列，发现其相当于具有下列改变的Humicolalanuginosa脂肪酶。
E1A，G91A，D96W，E99K，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N
E1A，G91A，D96W，E99K，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A
E1A，G91A，D96W，E99K，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G
E1A，G91A，D96W，E99K，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G
实施例3：除去盖帽区域中的突变
可除去G91A或E99K而不会失去磷脂酶活性。测定所得变体的序列，发现其相当于具有下列改变的Humicola lanuginosa脂肪酶。
E1A，G91A，D96W，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
SPI RR，D96W，E99K，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
SPIRR，G91A，D96W，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
E1A，G91A，D96W，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
实施例4：掺入Humicola lanuginosa脂肪酶的C末端区域以导入磷脂酶活性
构建3种不同的文库，它们能在第256位和第263-269位产生突变。同时还能在C末端延伸1，2，3或4个氨基酸。
掺入见下，野生型(wt)序列有下划线：
256：P 94，A 3，T 3
263：G 87，E 4.8，A 3.8，R 3.6，Q 0.2，P 0.2
264：L 87，P 4.8，Q 3.8，V 3.6，A 0.2，E 0.2
265：I 82，T 5.6，L 2.2，S 1.6，N 1.5，F 1.4，R 0.4，K 0.4A，P 0.1，G，D，C，H，Y0.03，Q，E 0.01，stop 0.016
266：G 86，D 5.9，R 2，S 1.7，C 1.6，A 0.9，V 0.9，E 0.7，W 0.2，H，Y 0.1，I，L，T，F，P 0.02，Q，K 0.01，stop 0.014
267：T 86，A 6.6，S 1.9，R 0.9，N 0.9，I 0.9，K 0.9，M 0.9，P 0.9，P 0.9，G，V0.14，D，E 0.07，L 0.03，C，Q，H，F，W，Y 0.01，stop 0.01
268：C 91，S 1.9，R 1.0，G 1.0，F 0.9，Y 0.9，L 0.04，A，N，D，H，I，P，T，V 0.01，stop 2.8
269：L 92，stop 8(KBoj 32(SEQ ID NO：8)and KBoj33)/N 86，K 2.7，D 1.8，H 1.8，I 1.8，S 1.8，T 1.9，Y 1.8，R 0.1，Q，M，E 0.06，A，C，G，L，F，P，V 0.04，stop0.06(KBoj34)
270：stop 100(KBoj33)/A 44，P 44，S 1.9，T 1.8，R 1.5，L 1.5，G 1.4，V 1.4，D0.7，Q 0.7，E 0.7，H 0.7，N，C，I，K，M，F，W，Y 0.03，stop 0.03(KBoj 32(SEQ ID NO：8)and KBoj 34)
271：G 72，R 4.5，V 3.2，E 3.0，C 2.9，A 1.6，S 1.2，D 1.0，L 0.5，I，K，Y 0.15，Q，T 0.08，N，P 0.05，stop 9.2
272：G 72，R 4.5，V 3.2，E 3.0，C 2.9，A 1.6，S 1.2，D 1.0，L 0.5，I，K，Y 0.15，Q，T 0.08，N，P 0.05，stop 9.2
273：F 74，L 11，S 2.8，I 2.7，V 2.7，Y 2.5，C 2.5，A，R，T 0.1，N，D，H 0.08，Q，E，K 0.01，stop 0.5
274终止
文库A：用4244(SEQ ID NO：1)作为5’引物和KBoj33作为3’引物，E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R或E1A+G225R作为模板进行PCR反应，得自此文库的变体不具有延伸。
文库B：用4244(SEQ ID NO：1)作为5’引物和KBoj32(SEQ ID NO：8)作为3’引物，E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R或E1A+G225R作为模板进行PCR反应，得自此文库的变体很可能含有C末端延伸，但可在延伸之前含有终止密码子。
文库C：用4244(SEQ ID NO：1)作为5’引物和KBoj34作为3’引物，E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R或E1A+G225R作为模板进行PCR反应，得自此文库的变体很可能在第269位含有突变并含有C末端延伸，但可在延伸之前含有终止密码子。
得到了下列变体：
文库A：
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D
文库B：
E1A+G91A+D96W+E99K+(R232L)+Q249R+G266S+270A
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266S+270D+271G
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264G+I265G+G266F+T267stop
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266A+270P+271G
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264P+I265F+L269stop
文库C：
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G263E+G266D+L269N+270P+271V+272G+273F
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G263A+G266S+L269N+270A+271G+272R+273F
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264P.G266+L269I+270P+271R+272G+273F
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D+L269S+270A+271G+272G+273F
E1A+D27G+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266S+L269N+270A+271G+272G+273F
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D+L269N+270A
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264P+L267Q+L269N
E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G263R+I265L+L269N+270P
实施例5：在不同pH值下，使用LU和PHLU法测定上述一些变体的脂肪酶和磷脂酶最适pH。结果表明磷脂酶活性的最适pH范围为4-6。脂肪酶活性的最适pH为约pH6至约pH10。
在pH5和9时，通过上述单层试验分析实施例5中列出的8种变体的磷脂酶活性。结果表明所有这些变体在pH5和9时都具有磷脂酶活性，而亲代脂肪酶(Humicola lanuginosa脂肪酶)在pH5或9时未显示出活性。根据变体的不同，pH5时的活性高于或低于pH9时的活性。
当pH为5时，发现Humicola lanuginosa脂肪酶的现有技术变体不具有磷脂酶活性：SPIRR+N94K+F95L+D96H+N101S+F181L+D234Y+I252L+P256T+G263A+L264Q。
实施例5：具有磷脂酶活性的腐质霉属脂肪酶变体
按上述制备Humicola lanuginosa亲代脂肪酶的变体，并检测它们的磷脂酶活性。发现下列变体具有磷脂酶活性，而通过相同方法检测后发现，亲代不具有磷脂酶活性。
  E1A，G91A，D96W，E99K，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
  SPIRR，G91A，D96W，E99K，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
  E1A，G91A，D96W，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N，270A，271G，272G，273F，(274S)
  E1A，G91A，D96W，E99K，P256A，W260H，G263Q，L264A，I265T，G266D，T267A，L269N
  E1A，G91A，D96W，E99K，Q249R，G266S，270D，271G
  E1A，G91A，D96W，E99K，Q249R，G266D
  E1A，G91A，D96W，E99K，Q249R，G266A，270P，271G
  G266D
  E1SPPCGRRP+E99N+E239C+Q249R+G266D
  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G266D
  E1SPPCGRRP+L93K+E99K+E239C+Q249R+G266D
  E1SPPCGRRP+E99K+E239C+Q249R+G266D
  G266A
  G266W
  G266V
  G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A
  G263F+L264A+G266S+T267E
  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A
  G266S
  G266L
  G263A+G266A
  G263A+G266Y
  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G266A
  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G266S
  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G263F+L264A+G266S+T267E
  D62A+G266A
  D62A+G266S
  D96S+G266A
  D96S+G266S
  D96S+G266R
  D96S+G266W
  D96S+G266V
  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266D
  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266S
  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G263E+G266S+270A
  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+L264P+G266S
  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+P256T+G266D
  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266C+T267P+L269stop
  G263D+L264I+I265N+G266E+T267GS
  E219G+L264I+I265N+G266T+T267GL
  E1A+G91A+D96W+E99K+P256A+W260H+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  E1A+G91A+D96W+E99K+E239C+Q249R+P256A+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  E1A+G91A+D96W+E99K+N248T+Q249R+W260Q+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  SPIRR+G91A+D96W+E99K+W260C+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272+G273F(+274S)
  SPIRR+G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  E1A+G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+
  270A+271G+272G+273F(+274S)
  E1A+G91A+D96W+E99K+P256A+W260H+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  SPIRR+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  SPIRR+G91A+D96W+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  E1A+G91A+D96W+E99K+P256A+W260H+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G263E+G266D+L269N+270P+271V+272G+273F
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G263A+G266S+L269N+270A+271G+272R+273F
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264P+Δ266+L269I+270P+271R+272G+273F
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264C+I265N+G266P+T267stop
  E1A+G91A+D96W+E99K(+R232L)+Q249R+G266S+270A
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266S+270D+271G
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264F+Δ266+270A+271G+272G+273F
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264G+I265G+G266F+T267stop
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264stop
  E1A+G91A+D96W+E99K+P256A+W260H+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G
  E1A+G91A+D96W+E99K+P256A+W260H+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266A+270P+271G
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264P+I265F+L269stop
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D+L269S+270A+271G+272G+273F
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D+L269N+270A
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266S+L269N+270A+271G+272G+273F
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264P+L267Q+L269N
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G263R+I265L+L269N+270P
  E1A+D96W+E99K+P256A+W260H+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  E1A+G225R+G266D
  E1A+G225R+G263A+I265V+G266S
  E1A+G225R+G263A+T267A
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+I252M+L264Q+G266D
  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266D
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266D
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266C+L267A
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266A
E1A+D96M+G106S+G225R+G266D
  E1A+D96Q+G106S+G225R+G266S
  E1A+D96F+G225R+G266S
  E1A+D96C+G225R+G266T
  E1A+D96H+G106S+G225R+G266S
  SPIRR+D96S+G266D
  SPIRR+D96R+G106S+G266D
  SPIRR+D96I+G106S+G266S
  SPIRR+D96W+K237R+G266S
  SPIRR+G266A
  SPIRR+D96S+G106S+G225R+G266D
  SPIRR+D96Q+G 106S+G225R+G266A
  SPIRR+D96Y+G106S+G225R+G266N
  SPIRR+D96C+G 106S+G225R+G266T
  SPIRR+D96H+T186I+G225R+G266S
  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266D
  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266S
  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G263E+G266S+270A
  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+L264P+G266S
  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+P256T+G266D
  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266C+T267P+L269stop
  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266S+T267S
  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+P256T+G266S
  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+P256T+G266S+T267A
  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G266D
  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266D
  E1SPPRRP+D96S+E239C+Q249R+G266D
  L259S
  G266D
  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  G266E
  G263A+G266A
  E1SPCRPRP+E239C+Q249R+G266A
  E1SPCRPRP+E239C+Q249R+G266S
  D96S+G266A
  D96S+G266S
  D96S+G266W
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G263D+L264I+I265N+G266E+T267GS
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+L264I+I265N+G266T+T267GL
  D96F+G266A
  D96F+G266S
  E1SPPCGRRP+E99N+E239C+Q249R+G266A
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266A
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266S
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G263F+L264A+G266S+T267E
  V60G+D62A+S83T+R84K+D96W+G266D
  V60G+D62A+S83T+D96W+G266D
  V60G+D62A+S83T+D96W+G266W
  L259I
  L259N
  D96W+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A
在上表中，(+274S)表示C末端此氨基酸残基的存在是不确定的。发现这类变体仅有很少一部分含有此残基。
相对于已知具有脂肪酶和磷脂酶活性的尖孢镰孢现有技术酶而言，几种上述变体具有较高的磷脂酶(PHLU)对脂肪酶(LU)的比例。
在不同pH值下，使用LU和PHLU法测定上述一些变体的脂肪酶和磷脂酶最适pH。结果表明磷脂酶活性的最适pH范围为4-6。脂肪酶活性的最适pH为约pH6至约pH10。
在pH5和9时，通过上述单层试验分析实施例5中列出的8种变体的磷脂酶活性。结果表明所有变体在pH5和9时都具有磷脂酶活性，而亲代脂肪酶(Humicola lanuginosa脂肪酶)在pH5或9时未显示出活性。根据变体的不同，pH5时的活性高于或低于pH9时的活性。
当pH为5时，发现Humicola lanuginosa脂肪酶的现有技术变体不具有磷脂酶活性：SPIRR+N94K+F95L+D96H+N101S+F181L+D234Y+I252L+P256T+G263A+L264Q。
Humicola lanuginosa亲代脂肪酶的下列变体也具有磷脂酶活性：
  D62A+S83T+D96W+G266S
  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96L+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96N+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96A+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96E+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N
  +270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96S+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96R+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96G+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96Q+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96F+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96F+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S+
  R84W+G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  R84W+G91A+D96F+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S+
  R84W+G91A+D96F+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96F+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96W+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96F+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96W+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
实施例6：具有磷脂酶活性的根毛霉(Rhizomucor)脂肪酶变体
按上述制备米赫根毛霉亲代脂肪酶的下列两种变体，并检测其磷脂酶活性。发现这些变体具有磷脂酶活性，亲代通过相同方法检测后发现不具有磷脂酶活性。
G266N
G266V
实施例7：对长链脂肪酸具有增加的特异性的腐质霉属脂肪酶变体
制备Humicola lanuginosa亲代脂肪酶的变体，并检测其对两种具有不同链长的甘油三酯类底物：三丁酸甘油酯(C4:0)和三油精甘油酯(C18:1)的水解活性。按上述，在pH9时通过LU和SLU法进行试验。发现下列变体具有比亲代酶(Humicola lanuginosa脂肪酶)更高的三油精甘油酯活性比三丁酸甘油酯活性的比例：
  E1SPIRPRP+G91A+D96N+E99K+Q249R
  E1SPCRPRP+S83T+N94K+D96L+E239C+Q249R
  G266D
  E1SPI RPRP+D62A+E99K+Q249R
  E1SPIRPRP+D62G+E99K+Q249R
  E1SPIRPRP+D62V+E99K+Q249R
  E1SPIRPRP+R84W+E99K+Q249R
  E1SPIRPRP+R84K+E99K+Q249R
  E1SPIRPRP+K98D+E99K+Q249R
  E1SPIRPRP+E99K+Q249R+270PGLPFKRV
  E1SPPCGRRP+E99N+N101S+T231K+R232G+D234G+E239C+Q249R
  E1SPIRPRP+E99K+Q249R+270PWPARLGRL
  L93K+D96G
  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)
  E1SPCRPRP+V60G+E99N+S119G+R209P+E239C+Q249R
  G266A
  G266E
  G266V
  G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A
  G266L
  G263A+G266A
  E1SPCRPRP+E239C+Q249R+G266A
  E1SPCRPRP+E239C+Q249R+G266S
  D96S+G266A
  D96S+G266S
  D96S+G266W
  L264I+I265N+G266T+T267GL
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+L264I+I265N+G266T+T267GL
  D96F+G266A
  D96F+G266S
  E1SPPCGRRP+E99N+E239C+Q249R+G266A
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266A
  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266S
  D62A+S83T
  E1SPPCGRRP+K98D+E99N+E239C+Q249R
  T231R+N233R+270CP
  E1SPPCGRRP+E99N+E239C+Q249R+270MD
  E1SPPCGRRP+D62A+S83T+E99N+E239C+Q249R
  D62A+S83T+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R
  V60G+D62A+S83T+R84K+D96W+G266D
  L259N
  L259R
  L259M
  L259Q
  SPPCGRRP(-E)+R84W+E99N+N101S+E239C+Q249R
  R84W+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R
  Y21I
  Y21V
  SPIRPRP(-E)+R84L+E99K+Q249R
  Y21C
  SPIRPRP(-E)+D62+E99K+Q249R
  D96W+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+A270+G271+G272+F273
  +S274.
  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
Humicola lanuginosa亲代脂肪酶的下列变体对长链脂肪酸的特异性也有所增加。
  SPIRPRP(-E)+V60R+D62V+L93K+E99K+Q249R
  SPIRPRP(-E)+D62V+E99K+Q249R
  SPIRPRP(-E)+E99K+Q249R+P256D
  SPIRPRP(-E)+D62V+E99K+Q249R+P256D
  SPIRPRP(-E)+D62V+E99K+Q249R+P256S
  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96L+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96N+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96A+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96E+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96S+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96R+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96G+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96Q+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96F+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  G91A+D96F+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  R84W+G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N
  +270A+271G+272G+273F+274S
  R84W+G91A+D96F+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266S+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  R84W+G91A+D96F+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F+274S
  SPPCGRRP(-E)+V60G+D62E+S83T+R84K+E99N+N 101S+E239C+Q249R
  V60G+D62E+S83T+R84K+G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R
实施例8：对长链脂肪酸具有增加的特异性的镰孢属脂肪酶变体
按上述实施例制备尖孢镰孢亲代脂肪酶的变体，并进行检测。发现下列变体具有比亲代酶更高的三油精甘油酯活性比三丁酸甘油酯活性的比例：
Y23S
Y260L
尖孢镰孢亲代脂肪酶的下列变体对长链脂肪酸的特异性也有所增加：
R80H+S82T
S82T+A129T
实施例9：对长链脂肪酸具有增加的特异性的根毛霉脂肪酶变体
米赫根毛霉亲代脂肪酶的下列变体对长链脂肪酸的特异性也有所增加：
Y260W
Y28L
Y28C+H217N
实施例10：对短链脂肪酸具有增加的特异性的腐质霉属脂肪酶变体
按上述实施例所述制备并检测Humicola lanuginosa亲代脂肪酶的变体。发现下列变体具有比亲代酶更高的三丁酸甘油酯活性比三油精甘油酯活性的比例(较低的SLU/LU比例)：
  SPIRPRP(-E)+E99K+R195Q+R209E+Q249R
  N101R+R195Q+R209E+L259S+Y261D
  N101R+R195Q+R209E+L259S
  N101R+L259S+Y261D
  N101R+L259S
  Y261D
  L259S
  SPIRPRP(-E)+E99K+N101R+Q249R
  G263D+L264I+I265N+G266E+T267GS
  Y261I
  D234R
  Y261K
Humicola lanuginosa亲代脂肪酶的下列变体也具有较高的三丁酸甘油酯活性比三油精甘油酯活性的比例：
  N101R，R195Q，R209E，L259S，Y261D
  N101R，R195Q，R209E，L259S
  N101R，L259S，Y261D
  N101R，L259S
实施例11：对短链脂肪酸具有增加的特异性的镰孢属脂肪酶变体
按上述实施例制备尖孢镰孢亲代脂肪酶的变体，并进行检测。发现下列变体具有比亲代酶更高的三丁酸甘油酯活性比三油精甘油酯活性的比例：
Y23W
Y260D
Y260R
Y260C
Y260N
实施例12：对短链脂肪酸具有增加的特异性的根毛霉脂肪酶变体
米赫根毛霉亲代脂肪酶的下列变体对短链脂肪酸的特异性也有所增加：
Y260C
Y260G
Y260V
实施例13：具有DGDG酶活性的腐质霉属脂肪酶变体
按上述制备Humicola lanuginosa亲代脂肪酶的变体，并测定其对DGDG(双半乳糖甘油二酯)的水解活性。发现下列变体具有DGDG酶活性，而亲代脂肪酶为阴性结果。
  D96W+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A
  G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A
  D96W+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270AGGFS
  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270AGGFS
  D96F+G266S
实施例14：具有增加的最适pH的腐质霉属脂肪酶变体
制备Humicola lanuginosa亲代脂肪酶的变体，并在pH7和9时通过LU法测定脂肪酶活性。发现下列变体具有比亲代脂肪酶更高的pH9时比pH7时的活性比。
R84L
R84W
Y21I
Y21V
Y261I
实施例15：具有降低的最适pH的腐质霉属脂肪酶变体
制备Humicola lanuginosa亲代脂肪酶的变体，并在pH7和9时通过LU法测定脂肪酶活性。发现下列变体具有比亲代脂肪酶更低的pH9时比pH7时的活性比。
Y261D
G266D/E
Y261W
实施例16：腐质霉属脂肪酶变体使植物油脱胶的用途
基本上按WO98/18912(Novo Nordisk)的实施例6所述，用得自Humicolalanuginosa的两种脂肪酶变体处理油菜子。
以0.6mg酶蛋白质/kg油的酶剂量检测一种变体。多种pH和温度下的检测结果表明在pH5.7，35-45℃时具有最佳性能，此时，最终P含量达到4ppm。于45℃，pH6时进行另一实验证实：在酶剂量低至0.15mg/kg时，最终P含量可达到4ppm。
用另一种Humicola lanuginosa脂肪酶变体进行类似的实验，结果证实在40℃，pH5.0-5.5时具有最佳性能。酶剂量为0.3mg/kg。
于45℃，pH5，以1.8mg酶/kg油的剂量，使用第三种Humicola lanuginosa脂肪酶变体和油菜子进行脱胶实验。为了进行比较，以18mg/kg的剂量，用亲代脂肪酶(Humicola lanuginosa脂肪酶)进行类似的实验。结果表明用变体在3.4小时内获得了良好的脱胶效果(＜10ppm残留P含量)。
酶剂量高10倍的亲代脂肪酶(Humicola lanuginosa脂肪酶)仅具有很差的脱胶效果。
实施例17：脂肪酶变体用于烘焙面包类食品的用途
按下述在烘焙试验中评价Humicola lanuginosa脂肪酶变体。
根据欧洲直接揉面(straight dough)法(ABS-SP-1201.01)，用40ppm抗坏血酸由Meneba面粉制备生面。使用具有下列剂量的多种添加剂组合：脂肪酶变体0，0.25，0.5或1.5mg/kg；磷脂(卵磷脂)0或10g/kg；和内切淀粉酶0或750MANU/kg。
内切淀粉酶是得自嗜热脂肪芽孢杆菌的产麦芽糖淀粉酶(商品名为Novamyl_)。一个MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位)被定义为：37℃，30分钟内，底物浓度为10mg麦芽三糖/ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH5.0时，每分钟释放1μmol麦芽糖所需的酶量。
烘焙之后，冷却面包，约2小时之后评价面包体积，面包屑的牢固性和柔软度。包裹在双层塑料袋中，于22℃贮藏1，3和7天之后，重复进行评价。
使用得自Stable Micro Systems的结构分析仪TA-XT2(探针直径为40mm)测定面包屑的牢固性。
以克计的柔软度被测定为将6.25mm探针压至25mm厚面包片的面包屑中(25％穿透)所需的力。
结果证实添加1.5mg变体能增加面包体积。牢固性和弹性结果表明：从第0天至第7天，变体产生显著更软的面包屑，和显著更好的弹性。
实施例18：使用脂肪酶变体维持烘焙时的生面稳定性
在烘焙试验中评价Humicola lanuginosa脂肪酶变体对生面延伸发面的耐受性。
根据欧洲直接揉面(straight dough)法(347-SP-1217)，用30ppm抗坏血酸，真菌α-淀粉酶(10FAU Fungamyl)和戊聚糖酶(100FXU Pentopan Mono)由Pelikan面粉制备生面。将剂量为0.2，0.4和0.6mg酶蛋白质/kg面粉的变体与1000LU亲代脂肪酶进行比较。
将生面揉成面包卷。将-半面包卷发面45分钟(正常发面)，另一半发面70分钟(过度发面)。
烘焙之后，使面包冷却，约2小时之后评价面包卷的体积和站立情况。站立是对面包卷形状的测量，它被定义为10个面包卷的高度除以10个面包卷的宽度，这意味着微圆的条形面包具有高站立值，而扁平的面包卷具有低站立值。
结果证实：在正常的发面时间内，0.4和0.6mg的变体效果优于亲代脂肪酶，对所有剂量的变体而言，面包卷的站立情况好于亲代脂肪酶。当面包卷被过度发面时，对所有剂量的变体而言，面包卷的体积和站立情况都好于亲代脂肪酶。
实施例19：脂肪酶变体除臭气作用
在全脂奶中评价具有不同链长特异性的脂肪酶的除臭作用。通过在加热之后用鼻子闻味来评价所产生的丁酸/酸臭味。
将25ml全脂奶置于100ml带蓝帽的烧瓶中，将烧瓶置于32℃水浴。对下文列出的每个脂肪酶而言，在烧瓶中加入0.2mg酶蛋白质/升奶。将温度升高至45℃，15和105分钟之后进行评价。
受试的脂肪酶是Humicola lanuginosa脂肪酶及其变体。对每种脂肪酶而言，长链特异性被表示为三油精甘油酯(SLU)活性比三丁酸甘油酯(LU)活性的比例。
3个人评价样品，并同意下文所示的等级：
+       有气味
++      明显的和特征性的丁酸和/或酸臭味
+++     强烈的丁酸和/或酸臭味
发现SLU/LU比高于Humicola lanuginosa脂肪酶的3个Humicolalanuginosa脂肪酶变体产生的恶臭味少于亲代脂肪酶产生的恶臭味。
实施例20：脂肪酶变体对洗涤之后织物恶臭味的作用
弄脏：
按下述用奶制品弄脏棉织物。以均等的点在约30cm2的面积上涂抹50mg黄油。在室温下将弄脏的织物放24小时。
洗涤方法：
使用含和不含脂肪酶(1250和5000LU/l)的商购去污剂(5g/l)，在Terg-0-tometer中洗涤弄脏的织物。于30℃，以100rpm洗涤20分钟。洗涤之后，将小块布样置于室温下过夜干燥。
感觉分析：
第二天，通过至少10个经培训的评估员参加的感觉试验来评估恶臭。将样品置于密封的玻璃罐中，在每一次评估之间至少放置30分钟以积累恶臭味。取出小块布样，评估织物的恶臭味。根据下列等级对丁酸恶臭味进行评分。将未用脂肪酶洗涤的样品用作对照。
0.比对照的臭味弱
1.与对照的臭味相同
2.比对照的臭味稍强
3.比对照的臭味明显较强
4.臭味比3更强。
发现相对于亲代酶(Humicola lanuginosa脂肪酶)而言，三油精甘油酯/三丁酸甘油酯活性比例增加(SLU/LU比增加)的Humicola lanuginosa脂肪酶变体使黄油污物的气味更弱。另一洗涤实验证实：所述变体与亲代酶一样都能有效地去除油污。
其它方法
也可通过仪器分析评估织物上的奶制品油污释放的丁酸强度：
1.通过顶空气相层析，或
2.通过从织物上提取臭气，接着进行气相层析。
实施例21：脂肪酶变体对用黄油烘焙的面包臭气的作用
制备6种Humicola lanuginosa脂肪酶变体，在通过欧洲直接揉面法(347-SP-1217)烘焙的添加有3％黄油的面包中评估这些变体。对每种变体使用0.2mg酶蛋白质/kg面粉。
通过测定三油精甘油酯/三丁酸甘油酯活性比例(上述SLU/LU)来测定变体的链长特异性。也检测Humicola lanuginosa亲代脂肪酶和现有技术中已知的具有磷脂酶活性的尖孢镰孢脂肪酶以进行比较。
结果概述如下：
+       有气味
++      明显的和特征性的丁酸和/或酸臭味
+++     强烈的丁酸和/或酸臭味
  SLU/LU   级别
  本发明的变体   2.7   (+)
  3   无影响
  7   无影响
  28   无影响
  70   无影响
  亲代脂肪酶   1.2   ++
  现有技术的脂肪酶   1.1   +++
  对照(无脂肪酶)   无影响
结果表明：在制作面包时，SLU/LU比例为3或以上的脂肪酶变体(即对长链脂肪酸具有高特异性的变体)甚至在用黄油烘焙的面包中也未产生令人不愉快的臭味。
序列表
<110>Novo Nordisk A/S
<120>脂肪酶变体
<130>5559
<140>
<141>
<160>14
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：4244
<400>1
tcaagaatag ttcaaacaag aaga     24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工序列的描述：AP
<400>2
ggttgtctaa ctccttcctt ttcg     24
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：FOL14
<400>3
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<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>4
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<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：FOL16
<400>5
gatatysctg ckcayctryr ktacttc    27
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：H7
<400>6
cggaatgtta ggctggttat tgc        23
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：KBoj14
<400>7
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<210>8
<211>120
<212>DNA
<213>人工序列
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<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(62)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(63)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(64)
<223>3：A25，T75
<220>
<221>misc_特征
<222>(65)
<223>4：G2，A4，T5，C89
<220>
<221>misc_特征
<222>(66)
<223>5：G2，A13，T4，C81
<220>
<221>misc_特征
<222>(68)
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<220>
<221>misc_特征
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<221>misc_特征
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<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(77)
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(79)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(80)
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(82)
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<221>misc_特征
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<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(86)
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(89)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(90)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(111)
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<400>8
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nnnnnnsnnc nannnsnnnn nnnntnncnn gaagtaccat aggtgcgcag ngatatccgg  120
<210>9
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：KBoj33
<220>
<221>misc_特征
<222>(68)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(70)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(71)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(72)
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(75)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(76)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(77)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(78)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(79)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(80)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(81)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(83)
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(87)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(108)
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<400>9
gtaagcgtga cataactaat tacatcatgc ggccctctag agtcgaccca gccgcgccgc  60
gcactacnan nnsnnnnnnn ntnncnngaa gtaccatagg tgcgcagnga tatccgg     117
<210>10
<211>120
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：KBoj34
<220>
<221>misc_特征
<222>(58)
<223>1：A90，C10
<220>
<221>misc_特征
<222>(59)..(60)
<223>2：G3，A91，T3，C3
<220>
<221>misc_特征
<222>(61)
<223>3：A25，T75
<220>
<221>misc_特征
<222>(62)
<223>4：G2，A4，T5，C89
<220>
<221>misc_特征
<222>(63)
<223>5：G2，A13，T4，C81
<220>
<221>misc_特征
<222>(64)
<223>3：A25，T75
<220>
<221>misc_特征
<222>(65)
<223>4：G2，A4，T5，C89
<220>
<221>misc_特征
<222>(66)
<223>5：G2，A13，T4，C81
<220>
<221>misc_特征
<222>(68)
<223>6：G91，A3，T3，C3
<220>
<221>misc_特征
<222>(69)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(70)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(71)..(72)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(73)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(74)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(75)
<223>11：G1，A97，T1，C1
<220>
<221>misc_特征
<222>(77)
<223>12：G94，A2，T2，C2
<220>
<221>misc_特征
<222>(78)
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<220>
<221>misc_特征
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<221>misc_特征
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<221>misc_特征
<222>(82)
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<221>misc_特征
<222>(83)
<223>17：G6，A90，T2，C2
<220>
<221>misc_特征
<222>(84)
<223>18：G2，A2，T94，C2
<220>
<221>misc_特征
<222>(86)
<223>19：G5，A91，T4
<220>
<221>misc_特征
<222>(87)
<223>20：G96，C4
<220>
<221>misc_特征
<222>(89)
<223>21：G4，T5，C91
<220>
<221>misc_特征
<222>(90)
<223>22：G4，C96
<220>
<221>misc_特征
<222>(111)
<223>23：G94，C3，T3
<400>10
gtaagcgtga cataactaat tacatcatgc ggccctctag agtcgaccca gccgctannn  60
nnnnnnsnnn nnnnnsnnnn nnnntnncnn gaagtaccat aggtgcgcag ngatatccgg  120
<210>11
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：KBoj36
<400>11
gtaagcgtga cataactaat tacatcatgc ggccctctag agtcgaccca gccgctagtt  60
acaggcgtca gtcgcctgga ag                                           82
<210>12
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：KBoj37
<400>12
gtaagcgtga cataactaat tacatcatgc ggccctctag agtcgaccca gccgctaagc  60
gttacaggcg tcagtcgcct gg                                           82
<210>13
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：KBoj38
<400>13
gtaagcgtga cataactaat tacatcatgc ggccctctag agtcgaccca gccgctaacc 60
agcgttacag gcgtcagtcg cc                                          82
<210>14
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：KBoj39
<400>14
gtaagcgtga cataactaat tacatcatgc ggccctctag agtcgaccca gccgctagcc 60
accagcgtta caggcgtcag tc                                          82

Claims (20)

1.产生脂解酶变体的方法，所述方法包括：
a)选择具有醇结合位点的亲代脂解酶，所述位点具有含sn2位置的甘油部分，
b)在所述亲代脂解酶中选择至少一个下述氨基酸残基，其包括至少一个在该亲代脂解酶和底物的三维结构中位于底物甘油三酯之甘油部分的sn2位C原子10_之内的原子，
c)进行改变，所述改变各为所述氨基酸残基的插入、缺失或取代，
d)任选在除b)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为氨基酸残基的插入、缺失或取代，
e)制备由步骤a)-d)所得的变体，
f)检测所述变体的磷脂酶活性或双半乳糖甘油二酯酶活性，
g)选择磷脂酶活性升高或双半乳糖甘油二酯酶活性升高的变体，和
h)生产所选变体。
2.产生脂解酶变体的方法，所述方法包括：
a)从腐质霉科或接合菌科选择亲代脂解酶，
b)在所述亲代脂解酶中选择至少一个氨基酸残基，其对应于Humicolalanuginosa脂肪酶中氨基酸20-25、56-64、81-85和255-269中的任一个，
c)进行改变，所述改变各为氨基酸残基的插入、缺失或取代，
d)任选在除b)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为氨基酸残基的插入、缺失或取代，
e)制备由步骤a)-d)所得的变体，
f)检测所述变体的磷脂酶活性或双半乳糖甘油二酯酶活性，和
g)选择磷脂酶活性升高或双半乳糖甘油二酯酶活性升高的变体，和
h)生产所选变体。
3.脂解酶，其：
a)具有与参照脂解酶的氨基酸序列至少95％同源的氨基酸序列，所述参照脂解酶是Humicola lanuginosa DSM 4109脂肪酶；和
b)具有与所述参照脂解酶氨基酸序列不同的氨基酸序列，其中的差别为下列差别中的至少一种：
i)在对应于Humicola lanuginosa DSM 4109脂肪酶的位置具有氨基酸取代Y21L，V，C、R84K，W，L、W260H，Q，C、Y261D，I，K，W或G266A，C，D，N，L，S，T，P，V，F，W，E，R，Y；或
ii)在对应于Humicoa lanuginosa DSM 4109脂肪酶的位置具有氨基酸取代L269N，I，S；或
iii)在对应于Humicoa lanuginosa DSM 4109脂肪酶的位置具有氨基酸取代V60G、D62E、L93K、L97Q、K98E，F、E99D、P256A、G263E，Q，R，F，N、L264A，C，P，F，G，V，I、I265L，N，F或T267A，Q，P，S，V，E；或
iv)在对应于Humicoa lanuginosa DSM 4109脂肪酶的位置具有插入T267GS或T267GL；或
v)在C末端具有肽延伸，所述肽延伸为MD，CP，AG，DG，AGG，PVGF，AGRF，PRGF，AGGF，或AGGFS，
c)磷脂酶活性升高或双半乳糖甘油二酯酶活性升高。
4.一种DNA序列，其编码权利要求3的脂解酶。
5.一种载体，其含有编码权利要求3的脂解酶的DNA序列。
6.一种转化的宿主细胞，其携有编码权利要求3的脂解酶DNA序列或含有编码权利要求3的脂解酶DNA序列的载体。
7.产生权利要求3的脂解酶的方法，所述方法包括
a)培养权利要求6的细胞以表达所述脂解酶，和
b)回收所述脂解酶。
8.制备生面或由生面制成的烘焙食品的方法，所述方法包括在生面中加入权利要求3的脂解酶。
9.权利要求8的方法，其中所述脂解酶具有磷脂酶和双半乳糖甘油二酯酶活性。
10.去污剂组合物，其含有表面活性剂以及权利要求3的脂解酶。
11.增加含奶油食品的味道的方法，所述方法包括用权利要求3的脂解酶处理食品以释放脂肪酸。
12.产生脂解酶变体的方法，所述方法包括：
a)选择具有含催化三联体的结构的亲代脂解酶，所述三联体由活性Ser，活性Asp和活性His残基组成；
b)在亲代脂解酶中选出至少一个氨基酸残基，该残基包含至少一个属于由以下步骤指定的结构组E中的原子：
i)将所述脂解酶的结构与米赫根毛霉的含有催化三联体和称为4TGL-inhp的抑制性磷原子的脂肪酶结构4TGL进行对比，以使两种结构中催化三联体的原子之间的方差总和最小化，
ii)指定结构组A，它由中心位于4TGL-inhp、半径为18_的球体内的所述脂解酶原子组成，
iii)形成由4TGL-inhP、亲代脂解酶活性Ser残基的Cα原子、和亲代脂解酶活性Asp残基的Cα原子所指定的第一平面，将结构组B指定为结构组A的亚结构组，组成结构组B的原子与亲代脂解酶活性His残基的Cα原子位于第一平面的同一侧，
iv)形成由4TGL-inhP、亲代脂解酶活性Ser残基的Cα原子、和亲代脂解酶活性His残基的Cα原子所指定的第二平面，将结构组C指定为结构组A的亚结构组，组成结构组C的原子与亲代脂解酶活性Asp残基的Cα原子位于第二平面的相反侧，
v)形成结构组D，它由结构组B和C并集的原子组成，且溶剂可接近性为15或更高，和
vi)形成结构组E，它由含有结构组D的原子或结构组B和C并集的原子的结构中距结构组D的原子不到3.5_的氨基酸残基组成，
c)进行改变，所述改变各为所述氨基酸残基的插入、缺失或取代，
d)任选在除b)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为氨基酸残基的插入、缺失或取代，
e)制备由步骤a)-d)所得的变体，
f)检测所述变体的磷脂酶活性或双半乳糖甘油二酯酶活性，
g)选择磷脂酶活性升高或双半乳糖甘油二酯酶活性升高的变体，和
h)生产所选变体。
13.产生脂解酶变体的方法，所述方法包括：
a)选择亲代脂解酶，其具有含活性组氨酸残基的活性位点，
b)在亲代脂解酶的氨基酸序列中，选择活性组氨酸残基C末端侧的至少一个氨基酸残基，
c)进行改变，所述改变各为插入、缺失或取代所述氨基酸残基，
d)任选在除b)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为插入、缺失或取代一个氨基酸残基，
e)制备由步骤a)-d)所得的变体，
f)检测所述变体的磷脂酶活性或双半乳糖甘油二酯酶活性，
g)选择磷脂酶活性升高或双半乳糖甘油二酯酶活性升高的变体，和
h)生产所选变体。
14.产生脂解酶变体的方法，所述方法包括：
a)选择亲代脂解酶，
b)在亲代脂解酶C末端的10个氨基酸残基中选择至少一个氨基酸残基，
c)进行改变，所述改变各为插入、缺失或取代所选氨基酸残基，
d)任选在除b)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为插入、缺失或取代一个氨基酸残基，
e)制备由步骤a)-d)所得的变体，
f)检测所述变体的磷脂酶活性或双半乳糖甘油二酯酶活性，
g)选择磷脂酶活性升高或双半乳糖甘油二酯酶活性升高的变体，和
h)生产所选变体。
15.产生脂解酶变体的方法，所述方法包括：
a)选择具有盖帽的亲代脂解酶，
b)在亲代脂解酶的盖帽中选择至少一个氨基酸残基，
c)进行改变，所述改变各为插入、缺失或取代所选氨基酸残基，
d)任选在除b)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为插入、缺失或取代一个氨基酸残基，
e)制备由步骤a)-d)所得的变体，
f)检测所述变体的磷脂酶活性或双半乳糖甘油二酯酶活性，
g)选择磷脂酶活性升高或双半乳糖甘油二酯酶活性升高的变体，和
h)生产所选变体。
16.制备用于烘焙食品的脂解酶变体的方法，所述方法包括：
a)选择亲代脂解酶，
b)在该脂解酶中进行至少一个改变以得到脂解酶变体，所述改变是插入、缺失或取代一个氨基酸残基，
c)筛选与亲代脂解酶相比具有下列特性的脂解酶变体：
i)对长链脂酰基具有较高比例的选择性，和
ii)对双半乳糖甘油二酯具有较高活性，和
iii)磷脂酶活性较高，
d)制备该脂解酶变体。
17.制备用于烘焙食品的脂解酶变体的方法，所述方法包括：
a)对编码脂解酶的DNA序列进行随机诱变，
b)在宿主细胞中表达步骤a)中所得的突变DNA序列，和
c)筛选宿主细胞，其能表达与亲代脂解酶相比具有下列特性的脂解酶变体：
i)对长链脂酰基具有较高比例的选择性，和
ii)对双半乳糖甘油二酯具有较高活性，和
iii)磷脂酶活性较高，
d)制备由该宿主细胞表达的脂解酶。
18.制备生面或由生面制成的烘焙食品的方法，所述方法包括
a)检测至少一种脂解酶对甘油三酯中的C4-C8酰基键、甘油三酯中的C16-C20酰基键、双半乳糖甘油二酯和磷脂的水解活性，
b)选择对双半乳糖甘油二酯和磷脂具有水解活性，且对C16-C20酰基键和C4-C8酰基键活性之比相当于SLU/LU的比例至少为3的脂解酶，和
c)将所选脂解酶添加至所述生面。
19.脂解酶，其氨基酸序列与Humicola lanuginosa DSM 4109的脂肪酶的氨基酸序列有至少95％的同源性，并且其包含下表所示的改变组之一，
其中每个改变组具有每个横格内的所有改变：
 E1A+G91A+D96W+E99K+P256A+W260H+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266S+270D+271G  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266A+270P+271G  G266D  E1SPPCGRRP+E99N+E239C+Q249R+G266D  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G266D  E1SPPCGRRP+L93K+E99K+E239C+Q249R+G266D  E1SPPCGRRP+E99K+E239C+Q249R+G266D  G266A  G266W  G266V  G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A  G263F+L264A+G266S+T267E  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A  G266S  G266L  G263A+G266A  G263A+G266Y  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G266A  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G266S  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G263F+L264A+G266S+T267E  D62A+G266A  D62A+G266S  D96S+G266A
 D96S+G266S  D96S+G266R  D96S+G266W  D96S+G266V  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266D  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266S  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G263E+G266S+270A  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+L264P+G266S  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+P256T+G266D  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266C+T267P+L269stop  G263D+L264I+I265N+G266E+T267GS  E219G+L264I+I265N+G266T+T267GL  SPIRR+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F  SPIRR+G91A+D96W+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F  E1A+G91A+D96W+E99K+P256A+W260H+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G263E+G266D+L269N+270P+271V+272G+273F  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G263A+G266S+L269N+270A+271G+272R+273F  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264P+Δ266+L269I+270P+271R+272G+273F  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264C+I265N+G266P+T267stop  E1A+G91A+D96W+E99K(+R232L)+Q249R+G266S+270A  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266S+270D+271G  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264F+Δ266+270A+271G+272G+273F  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264G+I265G+G266F+T267stop  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264stop  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266A+270P+271G  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264P+I265F+L269stop  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D+L269S+270A+271G+272G+273F  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266D+L269N+270A  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266S+L269N+270A+271G+272G+273F  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+L264P+L267Q+L269N  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G263R+I265L+L269N+270P  E1A+G225R+G266D  E1A+G225R+G263A+I265V+G266S  E1A+G225R+G263A+T267A
 E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+I252M+L264Q+G266D  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266D  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266D  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266C+L267A  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266A  E1A+D96M+G106S+G225R+G266D  E1A+D96Q+G106S+G225R+G266S  E1A+D96F+G225R+G266S  E1A+D96C+G225R+G266T  E1A+D96H+G106S+G225R+G266S  SPIRR+D96S+G266D  SPIRR+D96R+G106S+G266D  SPIRR+D96I+G106S+G266S  SPIRR+D96W+K237R+G266S  SPIRR+G266A  SPIRR+D96S+G106S+G225R+G266D  SPIRR+D96Q+G106S+G225R+G266A  SPIRR+D96Y+G106S+G225R+G266N  SPIRR+D96C+G106S+G225R+G266T  SPIRR+D96H+T186I+G225R+G266S  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266D  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266S  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G263E+G266S+270A  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+L264P+G266S  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+P256T+G266D  E1SPPRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266C+T267P+L269stop  E1A+G91A+D96W+E99K+Q249R+G266S+T267S  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+P256T+G266S  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+P256T+G266S+T267A  E1SPPCGRRP+E239C+Q249R+G266D  E1SPPCGRRP+G91A+D96W+E239C+Q249R+G266D  E1SPPRRP+D96S+E239C+Q249R+G266D  L259S  G266D  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F  G266E
 G263A+G266A  E1SPCRPRP+E239C+Q249R+G266A  E1SPCRPRP+E239C+Q249R+G266S  D96S+G266A  D96S+G266S  D96S+G266W  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G263D+L264I+I265N+G266E+T267GS  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+L264I+I265N+G266T+T267GL  D96F+G266A  D96F+G266S  E1SPPCGRRP+E99N+E239C+Q249R+G266A  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266A  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G266S  E1SPPCGRRP+D96S+E239C+Q249R+G263F+L264A+G266S+T267E  V60G+D62A+S83T+R84K+D96W+G266D  V60G+D62A+S83T+D96W+G266D  V60G+D62A+S83T+D96W+G266W  L259I  L259N  D96W+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A  G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A  D96W+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270AGGFS  G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270AGGFS  D96F+G266S
20.脂解酶变体，其氨基酸序列与源自米赫根毛霉的亲代脂肪酶的氨基酸序列有至少95％的同源性，并且其包含下文所示的改变组之一：
G266N，
G266V。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2302043A3 (en) * 1998-11-27 2011-07-20 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
EP2295556B1 (en) 2002-01-16 2014-10-29 Novozymes A/S Lipolytic enzymes variants and methods for their production
WO2006008653A2 (en) * 2004-07-16 2006-01-26 Danisco A/S Lipolytic enzyme uses thereof in the food industry
ATE420196T1 (de) * 2005-06-13 2009-01-15 Novozymes As Enzymatische herstellung von degummierten fettsäurealkylestern
AR053634A1 (es) * 2005-06-24 2007-05-09 Novozymes As Lipasas para uso farmaceutico
EP1979475A2 (en) * 2006-01-23 2008-10-15 The Procter and Gamble Company Detergent compositions
CN110093330B (zh) * 2012-10-12 2023-11-28 丹尼斯科美国公司 包含脂解酶变体的组合物和方法
JP6787668B2 (ja) 2013-12-10 2020-11-18 天野エンザイム株式会社 改変型リパーゼ及びその用途
EP3760713A3 (en) * 2014-05-27 2021-03-31 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
CN104293744B (zh) * 2014-08-19 2017-04-12 浙江工业大学 来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用
EP4067485A3 (en) * 2014-12-05 2023-01-04 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
WO2016091870A1 (en) * 2014-12-09 2016-06-16 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
CN113862238A (zh) * 2014-12-22 2021-12-31 诺维信公司 洗涤剂组合物、脂肪酶变体以及编码其的多核苷酸
CA3051831A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Nisshin Foods Inc. Breadcrumb mix
CN108497298A (zh) * 2017-02-27 2018-09-07 诺维信公司 一种酶组合物及其应用
CN108497462A (zh) * 2017-02-27 2018-09-07 诺维信公司 一种含脂肪酶的面粉改良剂及应用
AU2018383752A1 (en) * 2017-12-13 2020-05-21 Codexis, Inc. Carboxyesterase polypeptides for amide coupling
JP2019165727A (ja) * 2018-03-22 2019-10-03 物産フードサイエンス株式会社 ドウにおけるリパーゼの新規用途
EP3902412A4 (en) * 2018-10-17 2022-08-31 Perfect Day, Inc. RECOMBINANT COMPONENTS AND COMPOSITIONS FOR USE IN FOOD
CA3163711A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Chr. Hansen A/S Lipases, compositions, methods and uses thereof
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN114455204B (zh) * 2022-01-17 2023-09-29 黑龙江省绿色食品科学研究院 一种复合降血压多肽可食性包装膜的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992005249A1 (en) * 1990-09-13 1992-04-02 Novo Nordisk A/S Lipase variants
CN1124039A (zh) * 1993-04-23 1996-06-05 诺沃挪第克公司 脂酶变异体
CN1147836A (zh) * 1994-02-22 1997-04-16 诺沃挪第克公司 制备脂解酶变异体的方法
CN1193346A (zh) * 1995-07-14 1998-09-16 诺沃挪第克公司 一种具有脂解活性的修饰酶

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US53711A (en) 1866-04-03 Improvement in the construction of pulleys
US2527785A (en) * 1948-08-21 1950-10-31 Food Technology Butter flavoring composition
GB1133533A (en) * 1965-05-13 1968-11-13 Morton Int Inc Food seasoning
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1585105A (en) 1976-04-29 1981-02-25 Unilever Ltd Emulsions
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
FR2359624A1 (fr) * 1976-07-26 1978-02-24 Euroc Development Ab Procede pour augmenter la filtrabilite et l'aptitude a la sedimentation d'une suspension de matiere biologique macromoleculaire
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
JPS57189638A (en) 1981-05-20 1982-11-22 Yakult Honsha Co Ltd Production of liquid fermented milk
JPS6030488B2 (ja) 1982-11-10 1985-07-17 協和醗酵工業株式会社 生地の改良剤およびそれを含有してなる生地
DK289083A (da) 1983-06-23 1984-12-24 Novo Industri As Lipase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
JPS6078529A (ja) 1983-10-07 1985-05-04 協和醗酵工業株式会社 生地
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
DE3423699C1 (de) 1984-06-27 1986-01-16 Maggi AG, Kempttal Saucenverbesserer in Tuben
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8525012D0 (en) 1985-10-10 1985-11-13 Cpc International Inc Carbohydrate refining process
JPS62111629A (ja) 1985-11-09 1987-05-22 キユーピー株式会社 ケ−キの製造方法
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
JPS63240755A (ja) * 1986-08-19 1988-10-06 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 強い芳香を有するバタ−フレ−バ−の製造方法
US4810414A (en) 1986-08-29 1989-03-07 Novo Industri A/S Enzymatic detergent additive
US5389536A (en) 1986-11-19 1995-02-14 Genencor, Inc. Lipase from Pseudomonas mendocina having cutinase activity
JPS63258528A (ja) 1987-04-15 1988-10-26 キユーピー株式会社 スポンジケ−キの製造方法
EP0322429B1 (en) 1987-05-29 1994-10-19 Genencor International, Inc. Cutinase cleaning composition
ATE125865T1 (de) 1987-08-28 1995-08-15 Novo Nordisk As Rekombinante humicola-lipase und verfahren zur herstellung von rekombinanten humicola-lipasen.
EP0319064B1 (en) 1987-12-03 1992-05-13 Unilever N.V. Process for the preparation of a water and oil emulsion
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
ATE129523T1 (de) 1988-01-07 1995-11-15 Novo Nordisk As Spezifische protease.
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
JP2639677B2 (ja) 1988-03-14 1997-08-13 旭化成工業株式会社 リパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ
WO1989009259A1 (en) 1988-03-24 1989-10-05 Novo-Nordisk A/S A cellulase preparation
US5648263A (en) 1988-03-24 1997-07-15 Novo Nordisk A/S Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric
EP0334462B2 (en) 1988-03-25 2002-04-24 Genencor International, Inc. Molecular cloning and expression of genes encoding lipolytic enzymes
JP2794574B2 (ja) 1988-08-11 1998-09-10 昭和産業株式会社 リゾレシチンの製造方法
JP2709736B2 (ja) 1988-08-11 1998-02-04 昭和産業株式会社 油脂の精製方法
JP2877439B2 (ja) 1989-05-17 1999-03-31 協和醗酵工業株式会社 卵の改質方法
ATE97555T1 (de) 1989-09-29 1993-12-15 Unilever Nv Getrocknetes lyso-phospholipoprotein enthaltendes nahrungsmittel.
PT97110B (pt) 1990-03-23 1998-11-30 Gist Brocades Nv Processo para catalisar reaccoes acelaraveis por enzimas, mediante adicao ao meio reaccional de sementes de plantas transgenicas e para obtencao das referidas sementes
KR100237148B1 (ko) 1990-05-09 2000-01-15 한센 핀 베네드 엔도글루칸아제 효소를 함유하는 셀룰라제 제조물
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
GB2247025A (en) 1990-08-13 1992-02-19 Unilever Plc Enzymatic dishwashing and rinsing composition
US5869438A (en) 1990-09-13 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Lipase variants
JPH0687751B2 (ja) 1990-09-26 1994-11-09 辻製油株式会社 高濃度のリゾホスファチジルコリンを含むリゾレシチンを採取する方法
EP0495258A1 (en) 1991-01-16 1992-07-22 The Procter & Gamble Company Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
CZ285148B6 (cs) 1991-04-30 1999-05-12 The Procter And Gamble Company Kapalné detergentní směsi s borito-polyolovým komplexem k inhibici proteolytického enzymu
DE69226182T2 (de) 1991-05-01 1999-01-21 Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd Stabilisierte enzyme und waschmittelzusammensetzungen
DE4115938A1 (de) 1991-05-16 1992-11-19 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches verfahren zur verminderung des gehaltes an phosphorhaltigen bestandteilen in pflanzlichen und tierischen oelen
DK0567662T3 (da) 1992-04-25 1997-08-25 Nestle Sa Fremgangsmåde til aromatisering af en mælkechokolade
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK104592D0 (da) * 1992-08-21 1992-08-21 Novo Nordisk As Fremgangsmaade
US5792641A (en) 1992-10-06 1998-08-11 Novo Nordisk A/S Cellulase variants and detergent compositions containing cellulase variants
DK52393D0 (zh) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
EP0628256B1 (fr) 1993-06-11 1997-08-13 Societe Des Produits Nestle S.A. Composition permettant de stabiliser thermiquement les protéines et produit ainsi obtenu
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
BR9407808A (pt) 1993-10-13 1997-05-06 Novo Nordisk As Variante de peroxidase com melhorada estabilidade para peróxido de hidrogenio em condições alcalinas composição de alvejamento e composição detergente
DE4339556C1 (de) 1993-11-19 1995-02-02 Metallgesellschaft Ag Verfahren zum Entschleimen von Pflanzenöl mittels Enzymen
JP3152826B2 (ja) 1993-12-22 2001-04-03 花王株式会社 酵素含有組成物の製造法
EP0749473B1 (en) 1994-03-08 2005-10-12 Novozymes A/S Novel alkaline cellulases
EP0788541B1 (en) 1994-10-06 2008-03-12 Novozymes A/S Enzyme preparation with endoglucanase activity
US5929017A (en) 1994-10-26 1999-07-27 Novonordisk A/S Enzymatic detergent composition
US5827719A (en) 1994-10-26 1998-10-27 Novo Nordisk A/S Enzyme with lipolytic activity
GB2296011B (en) 1994-12-13 1999-06-16 Solvay Novel fusarium isolate and lipases, cutinases and enzyme compositions derived therefrom
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
CN1182451A (zh) 1995-03-17 1998-05-20 诺沃挪第克公司 新的内切葡聚糖酶
US6406723B1 (en) 1997-04-09 2002-06-18 Danisco A/S Method for preparing flour doughs and products made from such doughs using glycerol oxidase and lipase
JP4068142B2 (ja) 1995-08-11 2008-03-26 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 新規の脂肪分解酵素
ATE216427T1 (de) 1995-08-11 2002-05-15 Novozymes As Verfahren zur herstellung von polypeptidabkömmlingen
EP0876489A2 (en) 1996-01-24 1998-11-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Nucleic acids encoding polypeptides having absidia lipase activity
AU725287B2 (en) * 1996-02-15 2000-10-12 Novozymes A/S Conjugation of polypeptides
WO1997035956A1 (en) 1996-03-27 1997-10-02 Novo Nordisk A/S Alkaline protease deficient filamentous fungi
DE69731195T2 (de) 1996-04-25 2006-03-09 Novozymes A/S Alkalisches, lipolytisches enzym
EP0912682A1 (en) 1996-05-15 1999-05-06 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising specific lipolytic enzyme and a specific surfactant system
JP3791058B2 (ja) 1996-07-30 2006-06-28 日本油脂株式会社 リゾレシチンの製造方法
AU3938997A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
AU3938697A (en) 1996-08-27 1998-03-19 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
AU4200797A (en) 1996-09-17 1998-04-14 Novo Nordisk A/S Cellulase variants
JPH10155493A (ja) 1996-10-04 1998-06-16 Sankyo Co Ltd アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子
AU730286B2 (en) 1996-10-08 2001-03-01 Novo Nordisk A/S Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors
CN1235636A (zh) 1996-10-31 1999-11-17 诺沃挪第克公司 新型磷脂酶,及其生产和应用
KR100561826B1 (ko) 1996-11-04 2006-03-16 노보자임스 에이/에스 섭틸라제 변종과 조성물
CA2270180C (en) 1996-11-04 2011-01-11 Novo Nordisk A/S Subtilase variants and compositions
ATE226974T1 (de) * 1996-12-09 2002-11-15 Novozymes As Verringerung von phosphorhaltigen substanzen in speiseölen mit hohem anteil an nicht- hydratisierbarem phosphor unter verwendung einer phospholipase, eine phospholipase aus fädenförmigen pilz, welche eine phospholipase a und/oder b-aktivität aufweist
DE19701348A1 (de) 1997-01-16 1998-07-23 Roehm Gmbh Protein mit Phospholipaseaktivität
WO1998034946A1 (en) 1997-02-12 1998-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a novel fas-binding protein that activates jnk and apoptosis
DE69839668D1 (de) * 1997-03-18 2008-08-14 Novozymes As Ein in-vitro-verfahren zur herstellung einer dna-bibliothek
JP3853464B2 (ja) 1997-04-08 2006-12-06 辻製油株式会社 植物性リゾレシチンの製造法
EP0994936A1 (en) 1997-07-02 2000-04-26 The Procter & Gamble Company Dishwashing compositions comprising a phospholipase and an amylase
WO1999001544A1 (en) 1997-07-04 1999-01-14 Novo Nordisk A/S FAMILY 6 ENDO-1,4-β-GLUCANASE VARIANTS AND CLEANING COMPOSIT IONS CONTAINING THEM
ATE228307T1 (de) 1998-04-20 2002-12-15 Novozymes As Herstellung von teig sowie backprodukten
EP2302043A3 (en) * 1998-11-27 2011-07-20 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
US6939702B1 (en) * 1999-03-31 2005-09-06 Novozymes A/S Lipase variant

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992005249A1 (en) * 1990-09-13 1992-04-02 Novo Nordisk A/S Lipase variants
CN1124039A (zh) * 1993-04-23 1996-06-05 诺沃挪第克公司 脂酶变异体
CN1147836A (zh) * 1994-02-22 1997-04-16 诺沃挪第克公司 制备脂解酶变异体的方法
CN1193346A (zh) * 1995-07-14 1998-09-16 诺沃挪第克公司 一种具有脂解活性的修饰酶

Also Published As

Publication number Publication date
EP2716753A1 (en) 2014-04-09
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EP2302043A2 (en) 2011-03-30
AU2007229338A1 (en) 2007-11-08
EP2113563A2 (en) 2009-11-04
JP4723087B2 (ja) 2011-07-13
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EP2290059A1 (en) 2011-03-02
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