CN1124039A - 脂酶变异体 - Google Patents

Abstract

在脂酶分子疏水优势的、加长结合袋中含有包括一活性丝氨酸的类胰蛋白酶催化三分体的脂酶发生突变，使脂接触区的非芳香族氨基酸残基被芳香族氨基酸残基所取代，此接触区包括位于含活性丝氨酸残基的脂酶结构部分内部的残基，这些残基在水解时或水解过程中参予与底物的相互作用。

Description

脂酶变异体

本发明是关于具有改良特性的新型脂酶变异体，用于所述变体表达的编码DNA构建物、能够由该DNA构建物表达变异体的宿主细胞、及通过培养所述宿主细胞制备变异体的一种方法。

重组DNA技术的出现和发展已对蛋白质化学领域产生了深刻的影响，可以设想这些技术使得根据特定要求设计肽和蛋白如酶成为可能，从而保证化合物制品具有需要的特点。

由于这些技术的实用性，构建具有需要氨基酸序列的酶已成为可能，而且对这一课题已做了大量的研究。

多种脂酶的一级结构已确定并在文献中已描述(Boel等，Lipids23，701—706(1988)，de Caro等，Biochim.Biophys.Acta671，129—138(1981)，Winkler等，Nature343，771—774(1990)。而且对更有限数目的脂酶的三级结构也已阐明(Winkler等，Nature343，771—774(1990)，Brady等，Natrue343，767—770(1990)，J.D.Schrag等，Nature 351，1991，PP.761—764)。从这些研究中发现脂酶具有某种共同的结构特点，但在另一方面，这些脂酶中也存在主要结构的变异。

WO92/05249揭示了具有改良特性的脂酶变异体，其中通过其氨基酸序列的特异修饰改变了野生型脂酶的某些特征。例如，改变野生型脂酶一称为脂接触区的静电荷和疏水性，从而提高了脂类底物进入活性位点的能力，这一改变主要通过对天然脂酶分子中的氨基酸残基的取代和缺失。

本发明现令人惊异地鉴定了更多构建具有改良特性的新型脂酶变异体的氨基酸修饰。

因此，本发明一方面涉及亲代脂酶的脂酶变异体，所述亲代脂酶在脂酶分子中疏水优势的加长结合袋中含有包括活性丝氨酸的类胰蛋白酶催化三分体，该变异体的脂接触区的非芳香氨基酸残基被芳香氨基酸残基所取代，所述脂接触区包括位于含活性丝氨酸的脂酶结构部分内部的残基，这些残基在水解时或水解过程中参予与底物的相互作用。在下面的叙述中，这一类型脂酶变异体被定义为脂酶变异体I。

本文中“类胰蛋白酶”词条用于表明亲代脂酶在活性位点含有一与胰蛋白酶相应的催化三分体，即丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺中的一种。当一些脂酶为非活性形式时，其也可含有包括活性丝氨酸的表面环状结构(这种脂酶的一个例子由Brady等，在Nature343，1990，PP.767—770中做了描述)。当脂酶被活化时，该环状结构被移去，以暴露出活性位点残基，产生一提高了表面疏水性的表面，当水解时或水解过程中，其可与脂类底物相作用。针对本发明的目的，这一表面被称为“脂类接触区”以包括位于这一表面或构成这一表面部分的氨基酸残基(或者不含有该环状结构的脂酶的相对应表面)。这些呈或不呈环形结构的氨基酸残基在水解时或在水解过程中可参与脂酶和底物的相互作用，通过接触脂类表面被活化时，脂酶从脂相中水解甘油三酯。在甘油三酯的水解过程中，形成不同量的脂肪酸和甘油单酯及甘油二酯。

Lanuginosa腐质霉(Humicola lanuginosa)脂酶的脂类接触区在本发明的申请中被详细讨论，由氨基酸残基21—25，36—38，56—62，81—98，110—116，144—147，172—174，199—213和248—269限定。这些残基是在计算机模型模拟脂酶和脂类底物相互作用的基础上被鉴定出来的。

本文中的“芳香氨基酸残基”意指酪氨酸、色氨酸和苯丙氨基，术语“非芳香氨基酸残基”意指不同于酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的氨基酸残基。

本发明进一步涉及到特定的脂酶变异体，其中WO92/05249中公开的Lanuginosa腐质霉脂酶中特定位点上的一个或多个氨基酸残基，或在其它来源脂酶的相似位点上已被其它氨基酸残基取代，Lanuginosa腐植霉脂酶的cDNA和氨基酸序列如SEQ ID No.1和2所示。这些变异体在下文中将进一步讨论。

本发明也涉及到包括编码上文所述的脂酶变异体的DNA序列的DNA构建物，含有所述DNA构建物的重组表达载体，用DNA构建物或表达载体转化的细胞，以及在有助于产生脂酶变异体的条件下培养上述细胞，然后从培养物中回收脂酶变异体生产本发明的脂酶变异体的方法。

本发明进一步涉及含有本发明脂酶变异体的去污添加剂，该脂酶任选呈无粉尘颗粒、稳定的液体或被保护酶的形式，还涉及到包括本发明脂酶变异体的去污剂组合物。

在描述本发明的脂酶变异体时，使用下列规则以易于指称：

原氨基酸：位置：取代的氨基酸

根据这一规则，例如位置96的天冬氨酸被取代为酪氨酸表示为：

Asp96Trp或D96W

多突变则被加号分开，例如：

Asp96Leu＋Leu206Val或D96L＋L206V

其代表位置96和206的突变为天冬氨酸和亮氨酸分别被亮氨酸和缬氨酸取代。脂酶变异体大多使用传统单字母氨基酸码来表示。

根据本发明，脂酶变异体I优选其中被取代的非芳香氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸残基的变异体，并优选该氨基酸位于如SEQ IDNO.2所示的成熟的Lanuginosa腐质霉脂酶的氨基酸序列的96位，或如下将详细讨论的其它来源的亲代脂酶的相似位置。

从所述Lanuginose腐质霉脂酶制得的本发明的特定脂酶变异体包括如下的一个或更多氨基酸残基取代：

E56H，P，M，W，Y，F，I，G，C，V；D96H，E，P，M，W，Y，F，I，G，C，V；L259N，D，C，Q，E，H，I，M，F，P，W，Y；L206K，R，N，D，C，Q，E，H，I，M，F，P，W，Y

当本发明的脂酶变异体含有不只一个取代时，优选两个取代，能得到特别有意义的效果。例如，下列H.Lanuginosa脂酶的变异体已被发现很有意义：D96Ｗ＋E210N；D254K＋L259I；D96L＋L206V；D96L＋L206S；D96W＋D102N；D96L＋L259I＋L206V；D56Q＋L259I＋L206V。

通过如那些上述H.Lanuginosa脂酶的相似取代而从其它来源的脂酶获得的脂酶变异体也被认为在本发明的范围内。

本文中，术语“相似取代”意指在与那些H.Lanuginosa脂酶中所确定的相似位置上进行的其它脂酶的氨基酸取代。根据该脂酶与H.Lannginosa脂酶的三维结构比较可以确定相似位置。H.Lanuginsosa脂酶的三维结构结构如WO92/05249的图1A和1B所示，被改造的亲代脂酶的三维结构可以是已知的，也可通过传统方法得出，如应用X－射线分析。被取代和插入的氨基酸残基优选属于相同类型的氨基酸(例如，疏水性，亲水性等)，但不必与H.Lanuginosa脂酶的确切氨基酸相一致。

虽然亲代脂酶可来自多种来源，如哺乳动物脂酶，例如胰、胃、肝或脂蛋白脂酶，但一般优选微生物脂酶。例如，亲代脂酶可选自酵母，如假丝酵母脂酶；细菌，如假单孢菌脂酶或真菌，如腐质霉和Rhizomucor脂酶。特别优选从一组结构同源脂酶中选择亲代脂酶。例如，亲代脂酶可以是Rhizomucor miehei脂酶，特别是EP238 023中所述的脂酶，或如上所述的H.Lanuginosa脂酶。

应注意到H.Lanuginosa脂酶和Rhizomucor miehei脂酶属于同一组脂酶，这表明两种酶的总体的三维结构是非常相似的，并且通过X－射线晶体学显示出高度同源性(H.Lanuginosa脂酶和Rh.miehei脂酶的计算机模型分别如WO92/05249的图1A和B及2A和B所示，其中两种脂酶的脂类接解区之间的相似性是十分明显的)。因此针对H.Lanuginosa脂酶的修饰类型可能对Rh.miehei脂酶也有作用。

根据本发明，应注意到上述任一氨基酸序列修饰可与本文所述的任何其它修饰或WO92/05249中提到的任一修饰相组合。

制备本发明脂酶变异体，可通过分离编码亲代脂酶的DNA序列，对所述序列适当修饰，例如定点突变以使其编码所述的变异体，并接着将修饰的DNA序列导入能表达所述变异体的适当宿主生物中。本发明的DNA构建物的DNA序列可以是按常规技术得到的cDNA、基因组DNA或合成的DNA序列或这些序列的任意组合。适用于克隆和诱变DNA序列的技术在WO92/05249中有详细描述，该文献的内容也包括在本文中作为参考。在下面的实施例中这些技术被更加具体地说明。

本发明的脂酶变异体的表达可如下进行。如WO92/04249所述，或通过本领域中已知的任何其它方法产生的突变脂酶编码序列，可利用表达载体表达为酶形式，所述载体典型地包括编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和可任意选择的抑制子基因或各种激活子基因的调控序列。为了使表达的蛋白具有分泌性，可在编码脂酶的序列前加入编码“信号序列”的核苷酸。为了在调控基因的指导下表达，将根据本发明待处理的靶基因以正确的读码框架有效地连接到调控序列。可被引入到质粒载体及支持突变脂酶基因转录的启动子序列包括但并不限于原核β－半乳糖苷酶启动子(Villa－Kamaroff，等，1978，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727－3731)和tac启动子(Beboer等，1983，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.80：21－25)。其它参考也可在“Useful Proteinsfrom recombinant bacteria”in Scientific Amer ican，1980，242：74－94中找到。

根据一种具体实施例方案，芽孢杆菌属细胞，例如地衣形芽孢杆菌，缓慢芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌用含突变DNA的表达载体转化。如果表达是在分泌性微生物如枯草芽孢杆菌中进行，信号序列可位于翻译起始信号后和目的DNA序列之前。该信号序列用以转运表达产物到细胞壁，在细胞壁分泌时它被从产物中切下。如前所述的术语“调控序列”包括存在的信号序列。

在产生本发明的脂酶变异体的优选方法中，丝状真菌被用作宿主生物。对丝状真菌宿主生物可方便地选择以前已用作宿主以产生重组蛋白的曲霉属菌株如黑色曲霉、构巢曲霉、米曲霉。应用米曲霉产生重组蛋白的深入描述见如EP238023中。

为了在曲霉属中表达脂酶变异体，在编码脂酶变异体的DNA序列之前存在一启动子，该启动子可以是在曲霉属中具有强转录活性的任一DNA序列，可从编码胞外或胞内蛋白如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶或糖酵解酶的基因中得到。

合适启动子的例子为那些从编码米曲霉高峰氏α－淀粉酶、Rhizomucor miehiei天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉中性α－淀粉酶、黑色曲霉酸稳定α－淀粉酶、黑色曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶或米曲霉磷酸丙糖异构酶基因得到的启动子。

特别当宿主生物为米曲霉时，应用于本发明方法中的优选启动子为米曲霉高峰氏淀粉酶启动子，因为它在米曲霉中表现出高转录活性。高峰氏淀粉酶启动子序列见EP238023。

适当的终止和多聚腺苷化序列可与启动子同样来源。

适用于转化真菌宿主细胞的技术描述于EP238023。

为了确保脂酶变异体从宿主细胞中分泌，编码脂酶变异体的DNA序列前可放置一信号序列，它可以是自然存在的信号序列或其功能性部分或保证蛋白从细胞中分泌的合成序列。特别是，信号序列可来自编码曲霉属菌株淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，编码Rhizomucor miehei脂酶或蛋白酶的基因，或编码腐质霉属纤维素酶、木聚糖酶或脂酶的基因。信号序列优选来自编码米曲霉高峰氏淀粉酶、黑色曲霉中性α－淀粉酶，黑色曲霉酸稳定α－淀粉酶或黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适于曲霉属细胞生长的常规培养基，转化子通常是稳定的，可没有选择压力进行培养，但是，如果发现转化子不稳定，可向细胞中导入选择标记用于筛选。

从宿主细胞分泌的成熟脂酶蛋白可通过常规的步骤从培养基中分离，这些步骤包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，使用盐如硫酸铵沉淀蛋白质组份，接着进行层析，如离子交换层析，亲和层析等。去污剂组合物

根据本发明，该脂酶变异体可典型地作为去污剂组合物的一种组份。例如，它可以非粉尘颗粒、稳定的液体或被保护酶的形式含于去污剂组合物中，非粉尘颗粒的制备如US4,106,991和4,661,452(都为NoVo Industri A/S所有)所示，并可通过本领域已知的方法进行包衣或不包衣。蜡质包衣材料的例子是具有平均摩尔分子量1000到20000的聚(氧化乙烯)产物(聚乙二醇，PEG)具有16—50个氧化乙烯单位的乙氧基化壬基酚；醇含有12—20个碳原子、并具有15至80个氧化乙烯单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；及单、二、三脂肪酸甘油酯。适于流化床技术应用的成膜包衣材料的例子见专利GB1483591。液体酶制品例如可根据已建立的方法加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定化。其它酶稳定剂在本领域中是已知的。被保护酶的制备可根据EP238,216中所示方法进行。

本发明的去污剂组合物可以是任何方便形式，如粉末、颗粒、糊状或液体。液体去污剂可以是水型，典型地含有70％水和0—30％有机溶剂或非水型。

该去污剂组合物含有一种或多种表面活性剂，其中每一种可以是阴离子的、非离子的、阳离子或两性离子的表面活性剂。该去污剂通常含有0—50％的阴离子表面活性剂如线性烷基苯磺酸盐(LAS)，α—烯属磺酸盐(AOS)，烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯盐(AS))，脂肪醇乙氧基硫酸酯盐(AEOS或AES)，仲烷基磺酸盐(SAS)，α—磺基脂肪酸甲酯，烷基或烯基丁二酸或皂。它也可含有0—40％的非离子表面活性剂如醇乙氧基化物(AEO或AE)，羧化醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基聚苷、烷基二甲基氧化胺，乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺，脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酰胺(例如WO92/06154中所述)。

该去污剂组合物另外可含有一种或多种其它酶，如淀粉酶、脂酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、或氧化酶。

该去污剂可含有1—65％的去污剂助洗剂或配位剂如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐，磷酸盐，柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)，烷基或烯基丁二酸，可溶性硅酸盐或多层式硅酸盐(如Hoechst的SKS—6)。该去污剂也可是无助洗剂的，即基本不含去污剂助洗剂。

该去污剂可含有一种或多种聚合物。例如羧甲基纤维素(CMC)，聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)，聚乙二醇(PEG)，聚(乙烯醇)(PVA)，多聚羧酸盐如多聚丙烯酸盐，马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

该去污剂可含有漂白系该，该系统包括H2O2源如过硼酸盐或过碳酸盐，其可与形成过酸的漂白激活剂如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰氧苯磺酸盐(NOBS)相结合。另外，该漂白系统可含有如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。

本发明的去污剂组合物的酶可应用常规稳定剂稳定化，如多元醇象丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳酯，并且该组合物可按如WO92/19709和WO92/19708所述方法进行配制。

该去污剂也可含有其它常规去污剂组份，如织物调理剂包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、防污再沉淀剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂或香料。

PH值(以使用浓度的水溶性测定)通常为中性或碱性，如7—11。

本发明范围内的去污剂组合物的特定形式包括：

1)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒的去污剂组合物组成为：线型烷基苯磺酸盐(以酸计算)                   7—12％醇乙氧基硫酸酯盐(例如C_12-18醇，1—2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)       1—4％醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)          5—9％碳酸钠(Na₂CO₃)            14—20％可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 2—6％沸石(NaAlSiO₄)             15—22％硫酸钠(Na₂SO₄)            0—6％柠檬酸钠/柠檬酸(C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇) 0—15％过硼酸钠(NaBO₃、H₂O)     11—18％TAED                        2—6％羧甲基纤维素                0—2％聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚0—3％物，PVP，PEG)酶                          0—5％小组分(例如抑泡剂，香料，荧光增白剂，光漂白剂)                   0—5％2)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒的去污剂组合物组成为：线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)                         6—11％醇乙氧基硫酸酯盐(例如C_12-8醇，1—2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)          1—3％醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)               5—9％碳酸钠(Na₂CO₃)                  15—21％可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)       1—4％沸石(NaAlSiO₄)                   24—34％硫酸钠(Na₂SO₄)                  4—10％柠檬酸钠/柠檬酸(C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)       0—15％羧甲基纤维素                      0—2％聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)           1—6％酶                                0—5％小组份(例如抑泡剂、香料)                0—5％3)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒的去污剂组合物组成为：线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)                        5—9％醇乙氧基化物(例如C_10-15醇，7EO)               7—14％皂如脂肪酸(例如G_16-22)                    1—3％碳酸钠(Na₂CO₃)               10—17％可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)    3—9％沸石(NaAlSiO₄)                23—33％硫酸钠(Na₂SO₄)               0—4％过硼酸钠(NaBO₃.H₂O)          8—16％TAED                           2—8％磷酸盐(例如EDTMPA)             0—1％羧甲基纤维素                   0—2％聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚体，PVP，PEG)          1—3％酶                             0—5％小组份(例如抑泡剂，香料，荧光增白剂)              0—5％4)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒的去污剂组合物，组成为：线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)                     8—12％醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)            10—25％碳酸钠(Na₂CO₃)              14—22％可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)   1—5％沸石(NaAlSiO₄)               25—35％硫酸钠(Na₂SO₄)              0—10％羧甲基纤维素                 0—2％聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚体，PVP，PEG)      1—3％酶                           0—5％小组份(例如抑泡剂、香料)     0—5％5)水溶型液体去污剂组合物，包括：线性烷基苯磺酸盐(以酸计算)                   15—21％醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)               12—18％皂如脂肪酸(例如油酸)         3—13％烯基丁二酸(C_12-14)           0—13％氨基乙醇                     8—18％柠檬酸                       2—8％磷酸盐                       0—3％聚合物(例如PVP，PEG)         0—3％硼酸盐(B₄O₇)              0—2％乙醇                         0—3％丙二醇                       8—14％酶                           0—5％小组份(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)            0—5％6)水型液体去污剂组合物，包括线性熔基苯磺酸盐(以酸计算)                  15—21％醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)            3—9％皂如脂肪酸(如油酸)沸石(NaAlSiO₄)             14—22％柠檬酸钾                    9—18％硼酸盐(B₄O₇)             0—2％羧甲基纤维素                0—2％聚合物(如PEG，PVP)          0—3％结合性聚合物如：甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物，摩尔比为25∶1；分子量0—3％3800甘油                        0—5％酶                          0—5％小组份(如：分散剂，抑泡剂，香料，荧光增白剂)                 0—5％7)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒的组合物，其组成为：醇硫酸酯盐                  5—10％乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺    3—9％皂如脂肪酸                  0—3％碳酸钠(Na₂CO₃)           5—10％可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)     1—4％沸石(NaAlSiO₄)                 20—40％硫酸钠(Na₂SO₄)                2—8％过硼酸钠(NaBO₃·H₂O)          12—18％TAED                             2—7％聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚体，PEG)              1—5％酶                              0—5％小组份(如荧光增白剂，抑泡剂，香料)                           0—5％8)配制成颗粒的去污剂组合物，其组成为：线性烷基苯基磺酸盐              8—14％乙氧基化脂肪酸单乙酰胺          5—11％皂如脂肪酸                      0—3％碳酸钠(Na₂CO₃)               4—10％可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)    1—4％沸石(NaAlSiO₄)                30—50％硫酸钠(Na₂SO₄)               3—11％柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇)       5—12％聚合物(如PVP，马来酸/丙烯酸共聚体，PEG)              1—5％酶                              0—5％小组份(如抑泡剂，香料)          0—5％9)配制成颗粒的去污剂组合物，其组成为：线性烷基苯基磺酸盐             6—12％(以酸计算)非离子表面活性剂               1—4％皂如脂肪酸                     2—6％碳酸钠(Na₂CO₃)              14—22％沸石(NaAlSiO₄)               18—32％硫酸钠(Na₂SO₄)              5—20％柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇)      3—8％过硼酸钠(NaBO₃.H₂O)         4—9％漂白活化剂(如：NOBS或TAED)     1—5％羧甲基纤维素                   0—2％聚合物(如聚羧酸盐或PEG)        1—5％酶                             0—5％小组份(如荧光增白剂，香料)     0—5％10)水型液体去污剂组合物，其组成为：线性烷基苯基磺酸盐(以酸计算)                     15—23％醇乙氧基硫酸酯(如C_12-15醇，2—3EO)           8—15％醇乙氧基化物                   3—9％(如C_12-15醇7EO或C_12-15醇，5EO)皂如脂肪酸(如月桂酸)           0—3％氨基乙醇                       1—5％柠檬酸钠                       5—10％水溶助长剂(如甲苯磺酸钠)       2—6％硼酸盐(B₄O₇)                 0—2％羧甲基纤维素                   0—1％乙醇                           1—3％丙二醇                         2—5％酶                             0—5％小组份(如聚合物，分散剂，香料，荧光增白剂)              0—5％11)水性液体去污剂组合物，其组成为：线性烷基苯基磺酸盐             20—32％(以酸计算)醇乙氧基化物(如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)               6—12％氨基乙醇                       2—6％柠檬酸                         8—14％硼酸盐(B₄O₇)                1—3％聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，结合性聚合物如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物和CMC)      0—3％甘油                           3—8％酶                             0—5％小组份(如水溶助长剂，分散剂，香料，荧光增白剂)             0—5％12)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒的去污剂组合物，其组成为：阴离子表面活性剂(线型烷基苯基磺酸盐，烷基硫酸盐，α—烯烃磺酸盐，α—磺基脂肪酸甲酯，烷磺酸盐，皂)   25—40％非离子表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)          1—10％碳酸钠(Na₂CO₃)             8—25％可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)  5—15％硫酸钠(Na₂SO₄)             0—5％沸石(NaAlSiO₄)              15—28％过硼酸钠(NaBO₃、4H₂O)      0—20％漂白活化剂(TAED或NOBS)        0—5％酶                            0—5％小组份(如香料，荧光增白剂)          0—3％13)1)—12)中所描述的去污剂配方，其中线性烷基苯基磺酸盐组份或其一部分由烷基硫酸盐(C₁₂—C₁₈)取代。

14)1)—13)中所描述的去污剂配方，其中含有稳定的或包封的过酸或作为额外的组分或作为已述漂白系统的取代物。

15)3)，7)，9)和12)中所描述的去污剂组合物中的过硼酸盐用过碳酸盐取代。

16)配制成非水型液体去污剂的去污剂组合物包括：液体非离子表面活性剂，如线性烷氧基化伯醇，助洗剂系统(如磷酸盐)，酶和碱。该去污剂也可含有阴离子表面活性剂和/或漂白系统。

本发明的脂酶变异体以便于应用于去污剂中的浓度掺入。目前预期在本发明的去污剂中，脂酯变异体以相应每升洗液0.001—100mg的酶量加入。洗碟去污剂组合物

脂酶变异体还可用作洗碟去污剂组合物的一种组份。该洗碟去污剂组合物包括表面活性剂，其可是阴离子的，非离子的、阳离子的，两性离子的或这些类型的混合物。该去污剂可含有0—90％的非离子表面活性剂如低泡沫和无泡沫的乙氧基化丙氧基化直链醇。

该去污剂组合物可含有无机和/或有机类型的去污剂助洗剂盐类。去污剂助洗剂可分为含磷和不含磷类型。去污剂通常含有1—90％的去污剂助洗剂。

含磷无机碱性去污剂助洗剂的例子包括水溶性盐类，特别是碱金属焦磷酸盐，正磷酸盐，多磷酸盐和膦酸盐。不含磷无机助洗剂的例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐及各种类型的不溶性结晶的或无定形的硅酸铝，沸石是最熟知的代表。

适宜的有机助洗剂的例子包括碱金属，铵和取代铵柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐，脂肪酸磺酸盐、羧甲氧琥珀酸盐，多聚乙酸铵，羧基化物，多羧基化物，氨基多羧基化物，多聚乙酰羧基化物和多羟基磺酸盐。

其它适宜的有机助洗剂包括已知具有助洗剂性能的较高分子量多聚物和共聚物，例如适当的聚丙烯酸，聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物及其盐类。

洗碟去污剂组合物可含有氯/溴型或氧型漂白剂。无机氯/溴型漂白剂的例子为次氯酸和次溴酸的锂、钠或钙盐及氯化磷酸三钠。有机氯/溴型漂白剂的例子为杂环的N—溴和N—氯酰亚胺，例如三氯异氰脲酸，三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸和二氯异氰脲酸及其与水溶性阳离子如钾和钠的盐。乙内酰脲化合物也适合。

氧漂白剂为优选的，例如以无机过酸盐的形式，优选与漂白剂前体一起或作为过氧酸化合物。适当的过氧漂白剂化合物的典型例子为碱金属过硼酸盐，包括四水合物和单水合物，碱金属过碳酸盐，过硅酸盐和过磷酸盐。优选的激活物为TAED和三乙酸甘油酯。

本发明的洗碟去污剂组合物可使用常规的酶稳定剂进行稳定化。如多元醇象丙二醇、糖或糖醇，乳酸、硼酸或硼酸衍生物，如硼酸芳酯。

该洗碟去污剂组合物也可含有其它酶，特别是淀粉酶、蛋白酶和/或纤维素酶。

本发明的洗碟去污剂组合物还可含有其它常规去污剂组份，如抗絮凝物、填料、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、螯合剂、抗污物再沉淀剂、抗水合剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。

总之，本发明的变异体可用于常规洗碟去污剂，例如描述于下列任何专利出版物中的任一去污剂中：EP 551670，EP 533239，WO 9303129，EP 507404，US 5141664，GB 2247025，EP 414285，GB 2234980，EP 408278，GB 2228945，GB 2228944，EP 387063， EP 385521，EP 373851，EP 364260，EP 349314，EP 331370，EP 318279，EP 318204，GB 2204319，EP 266904，US 5213706，EP 530870，CA 2006687，EP 481547，EP 337760，WO 93/14183，US 5223179，WO 93/06202，WO 93/05132，WO 92/19707，WO 92/09680，WO 92/08777， WO 92/06161，WO 92/06157，WO 92/06156，WO 91/13959，EP 399752，US 4941988，US 4908148.软化组合物

另外，本发明的脂酶变异体可用于软化组合物：

该脂酶变异体可用于织物软化剂，如J，Falbe编辑的Surtactant and Consumer Products 1987，PP295—296；TensideSurfactants Detergents，30(1993)，6，PP394—399；JADCS，Vol.61(1984)，2，PP367—376；EP517762；EP123400；WO92/19714；WO93/19147；US5,082,578；EP494769；EP544 493；EP543 562；US5,235,082；EP568 297；EP570 237中所述。

本发明的下列描述参考附图，其中

图1为通过聚合酶链反应(PCR)构建编码脂酶变异体的质粒的制备图解；

图2为通过PCR的三步诱变图解；

在下面的实施中进一步说明本发明，但无意限制所要求的本发明的范围。一般方法H.lanuginosa脂酶在米曲霉中的表达

H.Lanuginosa脂酶的克隆描述于EP305,216。该专利申请也描述了在米曲霉中脂酶的表达和鉴定。所用表达质粒被称为p960。

本申请中所用的表达质粒与p960一致，只是在紧接脂酶编码区3’附近有很小的修饰。该修饰按下面的方法进行：p960用Nrul和BamHI限制酶酶切。在这两点之间克隆质粒pBR322的BamHI/NheI片段，其中NheI片段用Klenow聚合酶补平。产生含有单一BamHI和NheI切点的质粒pAO1(见WO92/05249图5)，在这两个单一切点之间克隆p960的BamHI/XbaI片段产生pAHL(见WO92/05249图6)。脂酶基因的体外定点诱变

向脂酶基因引入突变所用方法描述于Nelson and Long，Analytical Biochemistry)180，147—151(1989)它包括以化学合成的DNA链做为PCR反应的引物，通过三步反应产生含有所需突变的PCR片段。从PCR产生的片段上，带有突变的DNA片段可通过限制酶酶切而得到，并重新插入到表达质粒中。该方法详细地描述于实施例3。在图1和2中，进一步描述了该方法。实施例1表达lanuginosa腐质霉脂酶变异体D96W质粒的构建质粒pAHL的线性化

环状质粒pAHL在下述50μl反应混合物中以内切酶SphI线性化：50mM氯化钠，10mM Tris—Hcl，pH7.9，10mM MgCl，1mM二硫苏糖醇、1μg质粒和2单位的SphI。37℃消化两个小时。反应混合物以苯酚(以pH7.5的Tris—HCl平衡)抽提，加两倍体积冰冷的96％乙醇沉淀。离心，沉淀干燥后，线状DNA以50μl水溶解并在琼脂糖凝胶上估计DNA浓度。三步PCR诱变如图2所示，三步诱变要使用四个引物：诱变引物(＝A)：5′ -ATTTATTTCTTTCAACCAGAAGTTAAGATTCCC-3′PCR Helper1(＝B)：5′ -GGTCATCCAGTCACTGAGACCCTCTACCTATTAAATCGGC-3′PCR Helper2(＝C)：5’ —CCATGGCTTTCACGGTGTCT—3’PCR Handle(＝D)：5’ —GGTCATCCAGTCACTGAGAC—3’

所有三步反应均在下述含有10mM Tris—HCl，pH8.3，50mM Kcl，1.5mM MgCl₂，0.001％明胶，0.2mM dATP，0.2mMdCTP，0.2mMdGTP，0.2mMTTP，2.5单位Taq聚合酶的缓冲液中进行。

第一步中，100pmol的引物A，100pmol的引物B和1fmol线状质粒加到一总体积为100μl的反应混合物中，进行15个反应循环，每个循环包括95℃两分钟，37℃两分钟和72℃三分钟。

PCR产物的浓度在琼脂糖凝胶上估算。然后进行第二步反应。在总体积为100μl的上述缓冲液中加0.6pmol步骤1产物和1fmol的线状质粒，95℃5分钟，37℃两分钟，72℃10分钟进行一个反应循环。

在步骤2反应混合物中加入100pmol引物C和100pmol引物D并进行20个反应循环，每个循环包括95℃两分钟，37℃两分钟和72℃三分钟。此操作包括诱变程序中的步骤3。突变的限制性片段的分离

步骤3产物用琼脂糖凝胶分离，重新溶于20μl水中。然后在总体积为50μl含有下述成份的缓冲液：100mM Nacl，50mMTris—Hcl，pH7.9，10mM Mgcl₂，1mM DTT中以限制性内切酶BamHI和BstXI各10单位消化。在37℃温育两个小时，从琼脂糖凝胶中分离到733bp的BamHI/BstXI片段。与表达载体pAHL的连接

表达载体pAHL在上述条件下以BamHI和BstXI消化，并从琼脂糖凝胶中分离大片段。将上述分离的突变片段连接到这个载体上，连接混合物用来转化大肠杆菌。通过以限制性内切酶切转化子的质粒制备物来证实片段的存在和方向。应用Sauger的双脱氧链终止法进行双链质粒的序列分析。质粒被命名为pAHLD96W，除了改变的密码子外它和pAHL是一致的。实施例2表达lanuginosa腐质霉脂酶其它变异体质粒的构建

除了用限制性内切酶XhoI和BstXI来消化PCR产物和用于再克隆突变片段D254K/L259I和L259I的载体外，下述突变体是用和实施例1中描述的相同方法构建的。用做修饰的质粒名称和引物如下。

质粒名称     引物A序列pAHLD96F       5′-ATTTATTTCTTTCAAGAAGAAGTTAAGATTCCC-3′pAHLD96V       5′-ATTTATTTCTTTCAAAACGAAGTTAAGATTCCC-3′pAHLL259I      5′-CCGAAGTACCAAATGTGAGCAGGGATATCC-3′pAHLD254K＋L259I

           5′-CCGAAGTACCAAATGTGAGCAGGGATCTTCGGAATGTTAGG-3′实施例3

米曲霉的转化(一般程序)

用米曲霉的孢子接种100ml YPD(Sherman等，酵母遗传学方法，冷泉港实验室，1981)，振荡培养24小时。菌丝体以miracloth过滤收集并用200ml 0.6M MgSO₄洗涤。菌丝体用15ml 1.2MMgSO₄，10mM NaH₂PO₄，pH5.8悬浮。悬浮液置于冰上，加入1ml含120mg批号1687的NOVOZYm234缓冲液。5分钟后加入1ml 12mg/ml的BSA，37℃轻轻振荡温育1.5—2.5小时直至显微镜下可看到溶液中大量的原生质体。

悬浮液以miracloth过滤，滤过液转移至一无菌试管，在上面加入5ml 0.6M山梨醇，100mM Tris—Hcl，pH7.0。1000g离心15分钟。在MgSO₄垫层的顶部收集原生质体。原生质体悬液中加入2倍体积的STC(1.2M山梨醇，10mM Tris—Hcl，Ph7.5，10mMCaCl₂)，混合物1000g离心5分钟。原生质体沉淀重新悬于3mlSTC并再沉淀。重复此步骤。最后原生质体重悬于0.2—1ml的STC中。100μl的原生质体悬液同含5—25μgp3SR2的10μlSTC混合(p3SR2是一个携带构巢曲霉amds基因的质粒，详见Hynes等，分子细胞生物学，第三卷第八期，1430—1439页，1983年8月)。混合物室温放置25分钟。加入0.2ml60％PEG4000(BDH29576)，10mM CaCl₂和10mM Tris—HCl，pH7.5，仔细混合(两次)，最后加入0.85ml同样的溶液，仔细混合。混合物于室温放置25分钟，2.500g离心15分钟。沉淀重新悬于2ml 1.2M山梨醇中。再一次沉淀后将原生质体涂布于含1.0M蔗糖，pH＝7.0，10mM乙酰胺做氮源和20mM CsCl抑制背景生长的基本培养基上(Cove，生物化学与生物物理年鉴，113(1966)51—56)。37℃培养4至7天后，挑出孢子悬浮于无菌水中，涂成单菌落。重复此程序，第二次再分离得到的单菌落孢子做为确定的转化子贮存。实施例4脂酶变异体D96W在米曲霉中的表达

PAHLD96W通过和实施例3中描述的含有来自构巢曲霉amds基因的p3SR2共转化转进米曲霉IFO4177中。如述制备的原生质体和等量的pAHLD96W及p3SR2混合物温育，每一种质粒约5μg。九个能利用乙酰胺做唯一氮源的转化子重分离两次。YPD上生长3天后，利用实施例5中描述的脂酶活性测定方法(本发明脂酶变异体的纯化)分析培养物上清液。选择最好的转化子做进一步研究，在一个含200ml FG4培养基(3％豆粉，3％麦芽糖糊精，1％蛋白胨，以4M NaoH调pH至7.0)的1升摇瓶中30℃培养4天。在这些条件下每毫升转化子培养物约含500个脂酶单位。

另一个脂酶变异体是按实施例3描述的一般程序基本如上所述构建的。实施例5本发明的脂酶变异体的纯化脂酶活性的分析

以阿拉伯树胶做乳化剂通过乳化三丁酸甘油酯(MERCK)制备脂酶的底物。脂酶活性是在pH7使用恒pH法分析。一个脂酶活性单位定义为每分钟释放1毫摩尔脂肪酸所需的脂酶量。

步骤1：离心发酵上清液，弃沉淀。调节上清的pH至7，逐步加入等体积的96％冷乙醇，混合物于冰浴放置30分钟，离心弃沉淀。步骤2：

离子交换层析。过滤上清液。加样于以50mM pH7的Tris—醋酸缓冲液平衡的DEAE—fast flow(phermacia TM)柱。以相同缓冲液洗柱直至280nm吸收值低于0.05OD。用5倍体积的同样缓冲液的线性盐梯度洗脱结合的酶活性组份，收集含酶活性的流份。

步骤3：疏水层析。用固体醋酸铵调整含酶活性流份的摩尔浓度至0.8M，加样于以0.8M醋酸铵预平衡的TSK胶Butyl—Toyopearl 650c柱(购自日本Tosoh公司)。以0.8M醋酸铵洗去未结合的成份，以重蒸水洗脱结合的成份。

步骤4：含脂酶活性的流份用水稀释调整其电导率至2ms，pH至7，并加样于以pH7的50mM Tris—醋酸缓冲液预平衡的高效Q琼脂糖柱(Pharmacia)。以线性盐梯度洗脱结合的酶。实施例6本发明的脂酶变异体的洗涤性能

本发明的Lanuginosa腐质霉脂酶变异体的洗涤性能是在根据同野生型Lanuginosa腐质酶脂酶比较OD280得出每升毫克蛋白计的酶量的基础上评价。

洗涤测试是在一置于恒温水浴中的150毫升烧杯中进行的。烧杯以三角磁棒搅拌。实验条件如下：方法：三次循环，每次循环间过夜干燥。洗涤液：每个烧杯100ml。布样：每个烧杯六个布样(3.5×3.5cm)织物：100％棉，试验织物型号#400污点：用苏丹红染色(每克猪油0.75毫克染料)的猪油。加热到

70℃的6μl猪油置于每个布样的中心。涂上污点后，布样于

烘箱中75℃加热30分钟。第一次洗涤前样品于室温放置过

夜。去污剂：

LAS(Nansa 1169/P，30％a.m.)     1.17g/L

AEO(Dobanol 25—7)              0.15g/L

三磷酸钠                        1.25g/L

硫酸钠                          1.00g/L

碳酸钠                          0.45g/L

硅酸钠                          0.15g/LpH        10.2脂酶浓度：每升0.075，0.188，0.375，0.75和2.5mg脂酶蛋白时间：20分钟温度：30度冲洗：以流动的自来水冲洗15分钟干燥：室温过夜(约20℃，30—50％RH)估价：第三次洗涤后，测定460nm的反射比。结果

比较了野生型Lanuginosa腐质霉脂酶和脂酶变异体的剂量反应曲线。剂量反应曲线是以测得的数值代入下述方程计算的： $\mathrm{\ΔR}=\mathrm{\Δ}{R}_{\max }\frac{C^{0.5}}{K+C^{0.5}}---\left(1\right)$ 其中△R是用反射比单位表示的效应值

C是酶浓度(mg/L)

△R_max是一个表示最大效应的常数

K是一个常数；K²表示获得最大效应一半时的酶浓度

基于野生型脂酶和每一个脂酶变异体的特征性常数△R_max和K，计算了改进因子(improvement factors)，其定义为：

   f_改进＝C_WT/C    (II)表示获得同0.25mg/L参照野生型蛋白(C_WT)相同效应所需的脂酶变异体蛋白的量。

因此计算改进因子的程序如下：

1)0.25mg/L野生型蛋白的效应△R_(野生型)由方程(I)计算；

2)同0.25mg/L野生型蛋白引起相同效应的脂酶变异体的浓度以下述方程计算

改进因子由方程(II)计算。结果如表1所示

表                      1变异体                      改进因子D96K                        4.0D96W                        2.7D96F                        1.7D254K＋L259I                1.7D96W＋D102N                 3.4L259I                       1.2从表1可看出脂酶变异体D96K，D96W，D96W＋E210N及某种程度上D96F和D254K＋L259I都有比野生型脂酶好得多的洗涤性能。这种效应提高的一个可能性解释是变异体脂接触区的电荷特性已被改变。

                     序列表(1)一般信息

(i)申请人

    (A)姓名：NOVO NORDISK A/S

    (B)街道：NOVO Alle

    (C)城市：Bagsvaerd

    (E)国家：丹麦

    (F)邮政编码：(ZIP)DK—2880

    (G)电话：＋45 44448888

    (H)传真：＋45 4449 3256

    (I)电传：37304

(ii)发明名称：脂酶变异体

(iii)序列数：2

(iv)计算机可读形式：

    (A)媒介类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC—IDOS/MS—DOS(2)SEQ ID NO：1的信息

(i)序列特征：

      (A)长度：918碱基对

      (B)类别：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑型：线状。

(ii)分子类别：cDNA

(vi)最初来源：

      (A)生物体：Lanuginosa腐质霉

      (ix)特征：

      (A)名称/关键词：CDS

      (B)位置：1..873

      (C)名称/关键词：mat—多肽

      (D)位置：67..873

     (xi)序列描述：SEQ IDNO：1ATG AGG AGC TCC CTT GTG CTG TTC TTT GTC TCT GCG TGG ACG GCC TTG    48Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu

   -20                 -15                 -10GCC AGT CCT ATT CGT CGA GAG GTC TCG CAG GAT CTG TTT AAC CAG TTC    96Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe-5                   1               5                   10AAT CTC TTT GCA CAG TAT TCT GCA GCC GCA TAC TGC GGA AAA AAC AAT    144Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn

            15                  20                  25GAT GCC CCA GCT GGT ACA AAC ATT ACG TGC ACG GGA AAT GCC TGC CCC    192Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro

        30                  35                  40GAG GTA GAG AAG GCG GAT GCA ACG TTT CTC TAC TCG TTT GAA GAC TCT    240Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser

    45                  50                  55GGA GTG GGC GAT GTC ACC GGC TTC CTT GCT CTC GAC AAC ACG AAC AAA    288Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys

60                  65                  70TTG ATC GTC CTC TCT TTC CGT GGC TCT CGT TCC ATA GAG AAC TGG ATC  336Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75                  80                  85                  90GGG AAT CTT AAC TTC GAC TTG AAA GAA ATA AAT GAC ATT TGC TCC GGC  384Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly

            95                  100                 105TGC AGG GGA CAT GAC GGC TTC ACT TCG TCC TGG AGG TCT GTA GCC GAT  432Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp

        110                 115                 120ACG TTA AGG CAG AAG GTG GAG GAT GCT GTG AGG GAG CAT CCC GAC TAT  480Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr

    125                 130                 135CGC GTG GTG TTT ACC GGA CAT ACC TTG GGT GGT GCA TTG CCA ACT CTT  528Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val

140                 145                 150GCC GGA GCA GAC CTG CGT GGA AAT GGG TAT GAT ATC GAC GTG TTT TCA  576Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser155                 160                 165                 170TAT GGC GCC CCC CGA GTC GGA AAC AGG GCT TTT GCA GAA TTC CTG ACC  624Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr

            175                 180                 185GTA CAG ACC GGC GGA ACA CTC TAC CGC ATT ACC CAC ACC AAT GAT ATT  672Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile

        190                 195                 200GTC CCT AGA CTC CCG CCG CGC GAA TTC GGT TAC AGC CAT TCT AGC CCA  720Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro

    205                 210                 215GAG TAC TGG ATC AAA TCT GGA ACC CTT GTC CCC GTC ACC CGA AAC GAT  768Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp

220                 225                 230ATC GTG AAG ATA GAA GGC ATC GAT GCC ACC GGC GGC AAT AAC CAG CCT  816Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro235                 240                 245                 250AAC ATT CCG GAT ATC CCT GCG CAC CTA TGG TAC TTC GGG TTA ATT GGG  864Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly

            255                 260                 265ACA TGT CTT TAGTGGCCGG CGCGGCTGGG TCCGACTCTA GCGAGCTCGA GATCT    918Thr Cys Leu

(2)SEQ ID NO：2的信息

    (i)序列特征

    (A)长度：291个氨基酸

    (B)类别：氨基酸

    (D)拓扑型：线状

    (ii)分子类别：蛋白质

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu

   -20                 -15                 -10Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe-5                   1               5                   10Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn

            15                  20                  25Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro

        30                  35                  40Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser

    45                  5O                  55Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys

60                  65                  70Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75                  80                  85                  90Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly

            95                  100                 105Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp

        110                 115                 120Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr

    125                 130                 135Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val

140                 145                 150Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser155                 160                 165                 170Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr

            175                 180                 185Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile

        190                195                  200Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro

    205                 210                 215Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp

220                 225                 230Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro235                 240                 245                 250Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly

            255                 260                 265Thr Cys Leu

Claims (27)

1.脂酶分子疏水优势的、加长结合袋中含有包括活性丝氨酸的类胰蛋白酶催化三分体的亲代脂酶的脂酶变异体，其中脂接触区的非芳香族氨基酸残基被芳香族氨基酸残基所取代，此接触区包括位于含活性丝氨酸残基的脂酶结构部分中的残基，这些残基在水解时或水解过程中参予与底物的相互作用。

2.根据权利要求1的脂酶变异体，其中被取代的非芳族氨基酸残基是谷氨酸或天冬氨酸残基。

3.根据权利要求1或2的脂酶变异体，其中的芳香族氨基酸残基选自包括色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸残基的组中。

4.一亲代脂酶的变异体，其中包括SEQIDNO.1所示氨基酸序列的Lanuginosa腐质霉成熟脂酶的一个或多个氨基酸残基被取代如下：

E56H，P，M，W，Y，F，I，G，C，V；

D96H，E，P，M，W，Y，F，I，G，C，V；

L259N，D，C，Q，E，H，I，M，F，P，W，Y；

L206K，R，N，D，C，Q，E，H，I，M，F，P，W，Y，

5.根据任一前述权利要求的脂酶变异体，其包含一个以上的取代，优选两个取代。

6.一亲代脂酶的变异体，其中包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的Lanuginosa腐质霉成熟脂酶的一个或多个氨基酸残基被取代如下D96W＋E210N；D254K＋L259I；D96L＋L206V；D96L＋L206S；D96W＋D102N；D96L＋L259I＋L206V；E56Q＋L259I＋L206V。

7.根据任一前述权利要求的脂酶变异体，其中的亲代脂酶是微生物脂酶。

8.根据权利要求7的脂酶变异体，其中亲代脂酶是真菌脂酶。

9.根据权利要求8的脂酶变异体，其中亲代脂酶来自腐质霉属或Rhizomucor的菌种。

10.根据权利要求9的脂酶变异体，其中亲代脂酶是Rhizomucor miehei脂酶。

11.根据权利要求9的脂酶变异体，其中亲代脂酶是Lanuginosa腐质霉脂酶。

12.根据权利要求8的脂酶变异体，其中亲代脂酶是酵母脂酶。

13.根据要求12的脂酶变异体，其中亲代脂酶来自假丝酵母属的菌种。

14.根据权利要求7的脂酶变异体，其中亲代脂酶为细菌脂酶。

15.根据权利要求14的脂酶变异体，其中亲代脂酶来自假单孢菌属的菌种。

16.含有编码权利要求1—15中任一脂酶变异体的DNA序列的DNA构建物。

17.带有权利要求16的DNA构建物的重组表达载体。

18.用权利要求16的DNA构建物或权利要求17的载体转化的细胞。

19.根据权利要求18的细胞，它是真菌细胞，例如属于曲霉属如黑色曲霉，米曲霉或构巢曲霉；酵母细胞，例如属于酵母属的菌种，如酿酒酵母或来自汉逊酵母属的甲醇酵母，如多形汉逊酵母，或毕赤氏酵母(Phichia)，如P.pastoris；或细菌细胞，例属于芽孢杆菌的菌种，如枯草芽孢杆菌，或迟缓芽孢杆菌。

20.产生权利要求1—15之任一项的脂酶变异体的方法，其中权利要示18或19的细胞在有助于脂酶变异体产生的条件下培养，随后从培养物中分离脂酶变异体。

21.含有权利要求1—15任何一项的脂酶变异体的去污剂添加剂，脂酶变异体任选呈非粉尘颗粒、稳定液态或被护酶的形式。

22.根据权利要求21的去污剂添加剂，其中每克添加剂含0.02至200mg的酶蛋白。

23.根据权利要求21或22的去污剂添加剂，它另外含有另一种酶如蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、过氧化酶、纤维素或/和一种不同于所述脂酶变异体的脂酶。

24.含有权利要求1至15任何一项的脂酶变异体的去污剂组合物。

25.根据权利要求24的去污剂组合物，它另外含有另一种酶如蛋白酶、淀粉酶、过氧化酶、纤维素酶，和/或一种不同于所述脂酶变异体的脂酶。

26.含有权利要求1至15任何一项的脂酶变异体的洗碟去污剂组合物。

27.含有权利要求1至15任何一项的脂酶变异体的软化组合物。

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