CN1458274A - 碱性纤维素酶变异体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过用另一种氨基酸取代在具有与SEQ.ID.NO：1中所示的氨基酸序列表现出至少90％同源性的氨基酸序列的纤维素酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的碱性纤维素酶变异体，所述的氨基酸残基位置为SEQ ID NO：1中的：(a)第10位，(b)第16位，(c)第22位，(d)第33位，(e)第39位，(f)第76位，(g)第109位，(h)第242位，(i)第263位，(j)第308位，(k)第462位，(l)第466位，(m)第468位，(n)第552位，(o)第564位，或(p)第608位；编码所述变异体的基因；包含所述基因的载体；包含所述载体的转化体和包含所述碱性纤维素酶变异体的洗涤剂组合物。本发明提供了能在碱性范围有效发挥作用的碱性纤维素酶，并且由于其具有高效分泌能力或具有增强的比活性可迅速大量地生产。

Description

碱性纤维素酶变异体
技术领域
本发明涉及可掺入到洗涤剂等中的纤维素酶变异体。
背景技术
此前人们认为纤维素酶是只能在中性或酸性范围内起作用，而不能在碱性洗涤剂溶液中起作用的酶。Horikoshi(参见日本专利公开No.Sho 50-28515和Horikoshi & Akiba，Alkalophilic Microorganisms，Springer，Berlin，1982)发现来自属芽孢杆菌种的(Bacillus sp.)嗜碱性微生物的碱性纤维素酶使其可应用于重垢洗涤剂。从那时起已开发由属芽孢杆菌种的(Bacillus sp.)嗜碱性微生物产生的碱性纤维素酶(参见日本专利公开No.Sho 60-23158，日本专利公开No.Rei6-030578和美国专利No.4945053)，目前已将其应用于洗涤剂中。
近来遗传工程的发展使大规模地生产洗涤剂酶成为可能，并可将其应用于碱性纤维素酶的生产。目前已克隆了大量的碱性纤维素酶基因，并确定了其核苷酸序列。而且，已引入了酶产生菌的诱变和育种技术、或所述酶编码基因的诱变技术。
然而，它们在工业规模生产上的产率未能达到令人满意的水平，因此仍然需要能高效生产的碱性纤维素酶。
因此，本发明的目的是提供能在碱性范围有效发挥作用的碱性纤维素酶，并且由于其具有高效分泌能力或具有增强的特异活性可迅速大量地生产。
发明内容
本发明人研究了一种新的碱性纤维素酶，其可在不丧失固有性能的前提下有效生产。结果发现了一种由于具有高效分泌能力或具有增强的比活性而可进行大量生产的碱性纤维素酶变异体，在所述变异体中，在与SEQ.ID.NO：1的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列中特定位置的氨基酸残基被另一氨基酸残基所取代。
本发明的一方面提供，通过用另一种氨基酸取代在具有与SEQ.ID.NO：1中所示的氨基酸序列表现出至少90％同源性的氨基酸序列的纤维素酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的碱性纤维素酶变异体，所述的氨基酸残基位置为SEQ ID NO：1中的：(a)第10位，(b)第16位，(c)第22位，(d)第33位，(e)第39位，(f)第76位，(g)第109位，(h)第242位，(i)第263位，(j)第308位，(k)第462位，(l)第466位，(m)第468位，(n)第552位，(O)第564位，或(p)第608位；以及编码该碱性纤维素酶变异体的基因。
本发明的另一方面提供包含上述基因的载体，和含有所述载体的转化体。
本发明的又一方面提供掺入了上述碱性纤维素酶变异体的洗涤剂组合物。
附图说明
图.1是与SEQ.ID.NO：1的氨基酸序列具有至少90％同源性的碱性纤维素酶的氨基酸序列的对比。
具体实施方式
本发明的碱性纤维素酶变异体是通过使一种纤维素酶(此后将该纤维素酶称为＂亲本碱性纤维素酶＂)突变获得的，该纤维素酶的氨基酸序列与SEQ.ID.NO：1表示的氨基酸序列具有至少90％的同源性，所述的突变是用另一种氨基酸残基替换在上述SEQ.ID.NO：1中所示的(a)到(p)位或其相应位置的亲本碱性纤维素酶氨基酸残基。所述的碱性纤维素酶变异体可以是野生型的变异体或人工变异体。
具有与SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列表现出至少90％同源的氨基酸序列、作为亲本碱性纤维素酶的碱性纤维素酶包含具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的碱性纤维素酶，和具有与上述序列表现出至少90％同源性的氨基酸序列的碱性纤维素酶。它们可以是野生型的碱性纤维素酶也可以是野生型的变异体。优选的，其具有经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或凝胶过滤测定的86,000±2,000的分子量，当以羧甲基纤维素作为底物时最佳的pH值为7.5到9.5；最适温度为40到50℃；除羧甲基纤维素外可顺利地降解地衣淀粉；在pH9、50℃条件下温育10min能保持足够的稳定。特别优选的是具有下述性质的纤维素酶，该纤维素酶分子量为86,000±2,000(通过SDS-PAGE或Sephacryl S200柱凝胶过滤)；最佳反应pH8.6到9.0；最适反应温度50℃；和羧甲基纤维素一样顺利地降解地衣淀粉；在50℃、pH9、存在5mM氯化钙的条件下处理10min后的剩余活性为95％或更高(估计在30℃条件下处理10min后的剩余活性为100％)。
＂具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的碱性纤维素酶＂的例子包括  Egl-237(来自芽孢杆菌种的菌株KSM-5237(FERM BP-7875)，Hakamada，et al.，Biosci Biotechnol.Biochem.，64，2281-2289，2000]。＂具有与SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列表现出至少90％同源性的氨基酸序列的碱性纤维素酶＂的例子包括，具有与SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列优选至少95％、更优选至少98％同源的氨基酸序列的碱性纤维素酶。特定的例子包括来自芽孢杆菌种的菌株1139(Egl-1139)(Fukumori，et al.，J.Gen.Microbiol.，132，2329-2335)(91.4％同源性)的碱性纤维素酶，来自芽孢杆菌种的菌株KSM-64(Egl-64)(Sumitomo，et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，56，872-877，1992)(同源性：91.9％)碱性纤维素酶和来自芽孢杆菌种的菌株KSM-N131(Egl-N131b)(日本专利申请No.2000-47237)(同源性：95.0％)。
氨基酸序列的同源性可以利用程序，如最大值匹配或搜索GENETYX-WIN同源性(Software Development Co.)来计算。
具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的亲本碱性纤维素酶的(a)到(p)位氨基酸残基是(a)第10位的亮氨酸，(b)第16位的异亮氨酸，(c)第22位的丝氨酸，(d)第33位的天冬酰胺，(e)第39位的苯丙氨酸，(f)第76位的异亮氨酸，(g)第109位的甲硫氨酸，(h)第242位的谷氨酰胺，(i)第263位的苯丙氨酸，(j)第308位的苏氨酸，(k)第462位的天冬酰胺，(l)第466位的赖氨酸，(m)第468位的缬氨酸，(n)第552位的异亮氨酸，(o)第564位的异亮氨酸，和(p)第608位的丝氨酸。
在具有与SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的亲本碱性纤维素酶中，相应于上述的SEQ.ID.NO：1(a)到(p)位的氨基酸残基优选的是：(a)第10位的亮氨酸，(e)第39位的苯丙氨酸，(f)第76位的异亮氨酸，(h)第242位的谷氨酰胺，(i)第263位的苯丙氨酸，(k)第462位的天冬酰胺，(l)第466位的赖氨酸，(m)第468位的缬氨酸和(n)第552位的异亮氨酸，其中，除上述的氨基酸残基外，具有(b)第16位的异亮氨酸和(c)第22位的丝氨酸的亲本碱性纤维素酶是更优选的，除这些氨基酸残基外具有，(d)第33位的天冬酰胺，(g)第109位的甲硫氨酸，(j)第308位的苏氨酸，(o)第564位的异亮氨酸，和(p)第608位的丝氨酸的那些是更优选的。
因此，具有与SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的亲本碱性纤维素酶优选具有上述酶学性质，和/或具有与SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列优选至少95％，更优选至少98％同源的氨基酸序列，而且具有相应于上述SEQ.ID.NO：1中(a)到(p)位的氨基酸残基。特别优选的是具有上述酶学性质，具有与SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列优选地至少95％，更优选至少98％同源的氨基酸序列，而且具有相应于上述SEQ.ID.NO：1中(a)到(p)位的氨基酸残基的纤维素酶。
当将具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的纤维素酶用作亲本碱性纤维素酶时，本发明的碱性纤维素酶变异体具有在(a)到(p)中任意位置发生取代的氨基酸序列，而将具有与SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的纤维素酶(除SEQ ID NO：1所示的碱性纤维素酶之外)用作亲本碱性纤维素酶时，位于相应于上述SEQ.ID.NO：1中(a)到(p)位的任意一个位置的氨基酸残基被另一种氨基酸残基所取代。
对于另一种氨基酸，谷氨酰胺，丙氨酸，脯氨酸或甲硫氨酸，尤其是谷氨酰胺优选位于位置(a)，天冬酰胺或精氨酸，尤其是天冬酰胺优选位于位置(b)，脯氨酸优选位于位置(c)，组氨酸优选位于位置(d)，丙氨酸，苏氨酸或酪氨酸，尤其是丙氨酸优选位于位置(e)，组氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，苏氨酸或丙氨酸，尤其是组氨酸优选位于位置(f)，异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸或缬氨酸，尤其是异亮氨酸优选位于位置(g)，丙氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸或甘氨酸，尤其是丙氨酸，苯丙氨酸或丝氨酸优选位于位置(h)，异亮氨酸，亮氨酸，脯氨酸或缬氨酸，尤其是异亮氨酸优选位于位置(i)，丙氨酸，丝氨酸，甘氨酸或缬氨酸，尤其是丙氨酸优选位于位置(j)，苏氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或精氨酸，尤其是苏氨酸优选位于位置(k)，亮氨酸，丙氨酸或丝氨酸，尤其是亮氨酸优选位于位置(l)，丙氨酸，天冬氨酸，甘氨酸或赖氨酸，尤其是丙氨酸优选位于位置(m)，甲硫氨酸优选位于位置(n)，缬氨酸，苏氨酸或亮氨酸，尤其是缬氨酸优选位于位置(O)，异亮氨酸或精氨酸，尤其是异亮氨酸优选位于位置(p)。
“在其相应位置的氨基酸残基”可利用已知的算法，例如，Lipman-Pearson方法比较氨基酸序列而鉴定，给出每一碱性纤维素酶氨基酸序列中的多个相似区的最大相似值。以此种方式(图.1)对比所述纤维素酶的氨基酸序列，无论所述氨基酸序列中存在插入或缺失都可以确定每一纤维素酶序列中同源氨基酸残基的位置。推测同源的位置存在于三维结构的同一位点，其对有关靶纤维素酶的特定功能起类似的作用。
对于另一种具有与SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的碱性纤维素酶，相应于SEQ.ID.NO：1所示的碱性纤维素酶(Egl-237)的下述位置以及这些位置上的氨基酸残基的特定例子如下所述，所述的位置是(a)第10位，(b)1第16位，(c)第22位，(d)第33位，(e)第39位，(f)第76位，(g)第109位，(h)第242位，(i)第263位，(j)第308位，(k)第462位，(l)第466位，(m)第468(n)第552位，(o)第564和(p)第608位。
                                 表1
   Egl-237     Egl-1139     Egl-64   Egl-N131b
  (a)    10Leu     10Leu     10Leu   10Leu
  (b)    16Ile     16Ile     16Ile   无与此相应的残基
  (c)    22Ser     22Ser     22Ser   无与此相应的残基
  (d)    33Asn     33Asn     33Asn   19Asn
  (e)    39Phe     39Phe     39Phe   25Phe
  (f)    76Ile     76Ile     76Ile   62Ile
  (g)    109Met     109Met     109Met   95Met
  (h)    242Gln     242Gln     242Gln   228Gln
  (i)    263Phe     263Phe     263Phe   249Phe
  (j)    308Thr     308Thr     308Thr   294Thr
  (k)    462Asn     461Asn     461Asn   448Asn
  (l)    466Lys     465Lys     465Lys   452Lys
  (m)    468Val     467Val     467Val   454Val
  (n)    552Ile     550Ile     550Ile   538Ile
  (o)    564Ile     562Ile     562Ile   550Ile
  (p)    608Ser     606Ser     606Ser   594Ser
在酶活性或酶学特性没有任何改变的前提下，这些氨基酸残基可在两个或更多个位置上同时发生取代。下面描述的是在两个或更多的位置上同时发生取代的情况下的优选的特定实例。氨基酸用三字母表示＂+＂表示在一个位置发生取代后另一位置发生另一次取代，＂/″表示此处所示的任意氨基酸均可使用。
优选的双取代的例子包括Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ile16(Asn/Arg)，Ile16(Asn/Arg)+Ser22Pro，Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ser22Pro，Asn33His+Phe39(Thr/Tyr/Ala)，Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Gln242(Ser/Ala/Phe/Val/Asp/Glu/Gly)，Ile16(Arg/Asn)+Ser22Pro，Ser22Pro+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)，Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Phe263(Ile/Leu/Pro/Val)，Leu10(Gln/Ala/Pro/Met+Thr308(Ala/Ser/Gly/Val)，Ile16(Asn/Arg)+Asn462(Thr/Leu/Phe/Arg)，Ser22Pro+Val468(Ala/Asp/Gly/Lys)，Asn33His+Ile552Met，Asn33His+Ile564(Val/Thr/Leu)，和Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Ser608(Ile/Arg)，其中Leu10Gln+Ser22Pro，Asn33His+Phe39Ala，Ser22Pro+Gln242Ala，Ser22Pro+Gln242Phe，和Ser22Pro+Gln242Ser是特别优选的。
优选的三重取代的例子包括Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ser22Pro+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)，Ile16(Asn/Arg)+Ser22Pro+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)，和Ile76(His/Met/Val/Thr/Ala)+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Lys466(Leu/Ala/Ser)，其中Leu10Gln+Ser22Pro+Gln242Ala，Ile16Asn+Ser22Pro+Gln242Ser，和Ile16Asn+Ser22Pro+Gln242Phe是特别优选的。
优选的四重取代的例子包括Lue10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ser22Pro+Ile76(His/Met/Val/Thr/Ala)+Lys466(Leu/Ala/Ser)，Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ile16(Asn/Arg)+Ile76(His/Met/Val/Thr/Ala)+Lys466(Leu/Ala/Ser)，和Ile16(Asn/Arg)+Met109(Ile/Leu/Ser/Val)+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Ile564(Val/Thr/Leu)，其中Leu10Gln+Ser22Pro+Ile76His+Lys466Leu and Leu10Gln+Ser22Pro+Gln242Ala+Lys466Leu，和Leu10Gln+Ser22Pro+Gln242Ser+Lys466Leu是特别优选的。
优选的五重取代的例子包括Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ile16(Asn/Arg)+Ser22Pro+Ile76(His/Met/Val/Thr/Ala)+Lys466(Leu/Ala/Ser)，和Ile16(Asn/Arg)+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Thr308(Ala/Ser/Gly/Val)+Ile552Met+Ser608(Ile/Arg)，其中Leu10Gln+Ile16Asn+Ile76His+Gln242ser+Lys466Leu  和Leul0Gln+Ile16Asn+Ile76His+Gln242Ala+Lys466Leu是特别优选的。
本发明的碱性蛋白酶变异体可在较上述更多的位置例如，6到16个位置同时发生取代。
除了那些通过用另一氨基酸替代上述(a)到(p)位相应的任一位置的氨基酸而获得的变异体外，本发明的碱性纤维素酶变异体还包括那些在氨基酸序列的其他位置具有一到几个氨基酸缺失，替换或添加而产生的变异体，条件是其不丧失其碱性纤维素酶活性。
本发明的碱性纤维素酶变异体可通过下述的方法获得。
明确地说，可通过对编码所克隆的亲本碱性纤维素酶(例如，具有SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列的碱性纤维素酶)的基因(SEQ.ID.NO：2)进行取代(其被称作＂突变＂)而获得，用所得的突变基因转化合适的宿主，培养所得的重组宿主，然后从培养液中收集目的酶。
可利用普通的重组DNA技术，例如，通过基因枪或PCR的方法从芽孢杆菌种的菌株KSM-S237的染色体DNA中克隆编码亲本碱性纤维素酶的基因。
有关编码亲本碱性纤维素酶的诱变，可以采用随机诱变或定点突变。更具体地说，所述的诱变可以通过，例如“定点诱变系统Mutan-Super Express Km试剂盒＂(由Takara Bio生产)进行。所述基因的任意序列均可通过重组PCR(聚合酶链式反应)方法被另一基因中与上述任意序列相应的序列所替代(PCR protocols，Academic Press，NewYork，1990)。
利用所得的突变基因生产本发明的碱性纤维素酶变异体可通过下述方式进行，即将突变基因引入能使该酶稳定的表达DNA载体，然后用所得的重组载体转化宿主细菌。
当用大肠杆菌作为宿主时，上述载体的例子包括pUC18，pBR322，和PHY300PLK(Yakult Honsha生产)，当用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作宿主时，所述载体的例子包括pUB110，pHSP64(Sumitomo，等，Biosci.Biotechnol，Biochem.，59，2172-2175，1995)和pHY300PLK。
对于宿主细菌的转化，原生质体法，感受态细胞法或电穿孔法均可使用。作为宿主细胞，革兰氏阳性细菌，如那些属于芽孢杆菌种的细菌(枯草芽孢杆菌)，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌如链霉菌(Streptomyces)，酵母如啤酒糖酵母(Saccharomyces)，真菌如曲霉菌(Aspergillus)。
用含有能同化的碳源、氮源、金属盐和维生素的培养液在合适的条件下培养上述的转化体。从培养液中分离所述的酶，再用常规的方法进行纯化，然后冷冻干燥，喷雾干燥和/或结晶使所述的酶形成理想的形式。
通过上述方式获得的本发明的碱性纤维素酶变异体在不丧失亲本碱性纤维素酶特性的前提下分泌能力得到提高，并且比活性有所提高。
此处所用的术语“分泌能力提高＂是指在类似的条件下生产亲本碱性纤维素酶和所述的碱性纤维素酶变异体(例如，在含有下述组分的培养基中(PSM培养基)于30℃下振荡培养72小时，所述组分为3％(w/v)“PolypeptonS”(Nihon Pharmaceutical生产)，0.5％鱼肉提取物(Wako Pure Chemicals生产)，0.05％酵母提取物，0.1％磷酸二氢钾，0.02％7水合硫酸镁，四环素(15μm/mL)和5％麦芽糖)，测定培养物上清液中的酶活性和蛋白含量，与亲本碱性纤维素酶相比，所述的碱性纤维素酶变异体至少表现出预测的在酶活性和蛋白含量上的提高。例如可以得出其在酶活性或蛋白含量上有至少5％，理想的是至少10％，更理想的是至少20％的提高。
因为认为亲本碱性纤维素酶与碱性纤维素酶变异体具有相同的酶活性和蛋白含量比，所以在没有发现任何比活性改变时，可测定酶活性和蛋白含量中的任一项。
因此本发明的碱性纤维素酶变异体可用作掺入多种洗涤剂组合物的酶。
尽管只要所述的纤维素酶能够表现其活性，对加入到洗涤剂组合物中的本发明的碱性纤维素酶变异体的量没有特殊地限定，但优选地在洗涤剂组合物中的量是从0.0001到5wt.％，更优选从0.00005到2.5wt.％，更优选0.01到2wt.％。当所述的碱性纤维素酶变异体以颗粒的形式使用时，在颗粒中酶的含量优选地从0.01到50wt.％，更优选的是从0.05到25wt.％，更优选的是从0.1到20wt.％。
除上述的碱性纤维素酶(颗粒)外，本发明的洗涤剂组合物优选地包含表面活性剂和助洗剂。作为表面活性剂，阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂可单独使用，也可以结合使用，但优选阴离子表面活性剂和非离子型表面活性剂。
优选的阴离子型表面活性剂包括C10-18乙醇硫酸盐，C8-20烷氧基化的乙醇硫酸盐，烷基苯磺酸盐，烷基硫酸盐，石蜡磺酸盐，α-烯烃磺酸盐，α-磺基脂肪酸盐，α-磺基脂肪酸的烷基酯盐，脂肪酸盐。在本发明中，线性的烷基苯磺酸盐具有C10-14，更优选C12-14，烷基直链是特别优选的。作为所述盐的反离子，碱金属盐和胺是优选的，其中的钠和/或钾，一乙醇胺和二乙醇胺是特别优选的。
优选的非离子型表面活性剂包括聚氧化亚烷基烷基(C8-20)醚，烷基聚葡糖苷，聚氧化亚烷基烷基(C8-20)苯基醚，聚氧化亚烷基脱水山梨醇脂肪酸(C8-22)酯，聚氧化亚烷基乙二醇脂肪酸(C8-22)酯，和聚氧化乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物。其中特别优选的非离子型表面活性剂是聚氧化亚烷基烷基醚(HLB数(通过Griffin方法计算)从10.5到15.0，优选从11.0到14.5]，通过向C10-18乙醇中添加4到20摩尔的烯化氧，如环氧乙烷或环氧丙烷而获得。
鉴于去垢性和可溶性，在洗涤剂组合物中的表面活性剂总量优选地从10到60wt.％，更优选15到50wt.％，更优选20到45wt.％。
阴离子型表面活性剂的量优选从1到60wt.％，更优选从1到50wt.％，更优选从3到40wt.％，特别是在粉状的洗涤剂组合物中。
非离子型表面活性剂的量优选从0.5到45wt.％，更优选从1到35wt.％，更优选从3到25wt.％，特别是在粉状的洗涤剂组合物中。
阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂可以单独使用，但混合使用更为优选。另外，两性表面活性剂或阳离子表面活性剂可根据使用目的结合应用。
可应用助洗剂，助洗剂本身没有去垢性，即使有也不显著，但当其加入到洗涤剂组合物中后可显著地增强洗涤剂的性能，具体说来，这种助洗剂可以改善作为洗涤剂组合物主要组分的表面活性剂的去垢性。所述的助洗剂需具有至少下述的一种作用，即多价金属阳离子清除作用，污垢分散作用和碱缓冲作用。
所述的助洗剂的例子包括水溶性无机化合物，水不溶性无机化合物和有机化合物。
水溶性无机化合物的例子包括磷酸盐(如，三聚磷酸盐，焦磷酸盐，偏磷酸盐和磷酸三钠)，硅酸盐，碳酸盐和硫酸盐。当然硫酸盐是优选的，这是因为它具有上述的三种活性。
水不溶性无机化合物的例子包括硅铝酸盐(如A型沸石，B型沸石，X型沸石，和无定形的硅铝酸盐)，和晶状的硅酸盐。当然颗粒大小为3μ或更小的A型沸石(更优选1μm或更小)是优选的。
有机化合物的例子包括羧酸盐(如氨基羧酸盐，羟基氨基羧酸盐，羟基羧酸盐，环羧酸盐，顺丁烯二酸衍生物，和草酸盐)，和有机羧酸(盐)聚合物(如丙烯酸聚合物或共聚物，聚羧酸盐聚合物或共聚物，乙醛酸聚合物，和其多糖和盐)。当然有机羧酸(盐)的聚合物是优选的。
上述助洗剂中的盐中，优选的反离子是碱金属盐和胺，其中钠或钾，一乙醇胺和二乙醇胺是特别优选的。
尽管上述的助洗剂可以单独使用也可以结合使用，使用水溶性无机化合物是优选的，水溶性无机化合物和有机化合物相结合是更优选的，水溶性无机化合物，有机化合物和水不溶性无机化合物结合使用是更优选的。
鉴于洗涤剂的性能，所述助洗剂在所述洗涤剂组合物中的总量优选地从20到80wt.％，更优选从30到70wt.％，更优选从35到60wt.％。
在洗涤剂组合物中，作为助洗剂的水溶性无机化合物的含量，特别是在粉末状的洗涤剂组合物中，优选的范围是从10到50wt.％，更优选从15到45wt.％，更优选从20到40wt.％。
作为助洗剂的水不溶性无机化合物的含量，特别是在粉末状的洗涤剂组合物中，优选的范围是从5到50wt.％，更优选从10到45wt.％，更优选从15到40wt.％。
作为助洗剂的有机化合物的含量，特别是在粉末状的洗涤剂组合物中，优选的范围是从0.1到20wt.％，更优选从0.3to 15wt.％，更优选从0.5到10wt.％。
在本发明的洗涤剂组合物中，可掺入添加剂如漂白剂(过碳酸盐，过硼酸盐，漂白活化剂等)，抗再沉淀剂(羧甲基纤维素等)，软化剂(二烷基型季铵盐，粘土矿等)，还原剂(亚硫酸盐等)，荧光增白剂(联苯型，氨基二苯乙烯型等)，泡沫控制剂(硅氧烷等)和香料。
在本发明的洗涤剂组合物中，还可以加入除本发明的碱性纤维素酶之外的多种酶。所述酶的例子包括，水解酶，氧化酶，还原酶，转移酶，裂解酶，异构酶，连接酶和合成酶。其中，本发明之外的纤维素酶，蛋白酶，角蛋白酶，酯酶，cutinases，淀粉酶，脂肪酶，支链淀粉酶，果胶酶，甘露聚糖酶，葡糖苷酶，葡聚糖酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，漆酶，是优选的。其中蛋白酶，纤维素酶，淀粉酶和脂酶是特别优选的。
本发明的洗涤剂组合物可利用通过上述方法获得的本发明的碱性纤维素酶变异体，结合上述的洗涤剂组分通过常规方法制备。洗涤剂的形式可根据使用的目的进行选择。其可以，例如，液体，粉末，颗粒，糊剂或固体形式提供。
如此获得的本发明的洗涤剂组合物可用于洗衣店粉状洗涤剂，洗衣店液体洗涤剂，自动洗盘剂或棉纤维修饰洗涤剂。
实施例
实施例1：碱性纤维素酶基因变异体的制备
首先，在使所述碱性纤维素酶产量提高的情况下，为了获得碱性纤维素酶变异体，在碱性纤维素酶基因区域通过Error-Prone PCR方法进行了随机诱变，由此构建了变异体文库。从所获得的变异体中筛选能有效地改善碱性纤维素酶产量的变异体。通过核苷酸测序确定突变位点后，利用合适的引物在突变位点进行随机诱变或定点诱变来构建多重突变的变异体。将来自芽孢杆菌种的菌株KSM-S237的碱性纤维素酶基因引入质粒pHY300PLK中作为模板DNA。
所用的随机诱变混合引物是Ile16X(引物1，SEQ.ID.NO：3，X表示另一种氨基酸)，Phe39X(引物2，SEQ.ID.NO：4)，Ile76X(引物3，SEQ.ID.NO：5)，Met109X(引物4，SEQ.ID.NO：6)，Phe263X(引物5，SHQ.ID.NO：7)，Thr308X(引物6，SEQ.ID No：8)，Asn462X(引物7，SEQ.ID.NO：9)，Lys466X(引物8，SEQ.ID.NO：10)，Val468X(引物9，SEQ.ID.NO：11)，Ile552X(引物10，SEQ.ID.NO.12)，Ile564X(引物11，SEQ.ID.NO：13)和Ser608X(引物12，SEQ.ID.NO：14)。
用于引入定点突变的引物是，Leu10Gln(引物13，SEQ.ID.NO：15)，Ser22Pro(引物14，SEQ.ID.NO：16)，Asn33His(引物15，SEQ.ID.NO：17)，Phe39Ala(引物16 SEQ.ID.NO：18)，Met109Ile(引物17，SEQ.ID.NO：19)，Gln242Ser(引物18，SEQ.ID NO：20)，Gln242Ala(引物19，SEQ.ID.NO：21)，Gln242Phe(引物20，SEQ.ID.NO：22)，Gln242Val(引物21，SHQ.ID NO：23)，Gln242Asp(引物22，SEQ.ID.NO：24)或Gln242Glu(引物22，SEQ.ID.NO：24)，Gln242Gly(引物23，SEQ.ID NO：25)，Gln242Ile(引物20，SEQ.ID.NO：22)，Gln242Thr(引物24，SEQ.ID.NO：26)，Gln242Leu(引物25，SEQ.ID NO：27)，Gln242Met(引物26，SEQ.ID.NO：28)，Gln242Tyr(引物27，SEQ.ID.NO：29)，Phe263Ile(引物28，SHQ.ID NO：30)，Thr308Ala(引物29，SHQ.ID.NO：31)和Ile552Met(引物30，SEQ.ID.NO：32)。
具体地，将0.5μL(10ng)模板DNA质粒，20μL(1μM)引入突变的引物，20μL(1μM)反义引物，10μL×10PCR缓冲溶液，8μL10mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合物，0.5μL(2.5单位)of＂Pyrobest DNA聚合酶＂(Takara生产)和39.5μL去离子水进行混合后，用＂Gene Amp PCR系统9700＂(Amesham-Pharmacia生产)进行PCR。所述的反应条件是94℃2min，接下来在94℃1min进行30个循环，56℃1min，72℃30sec，最后72℃1min。将所得的PCR产物经＂GFX PCR DNA和Gel Band纯化试剂盒＂(Amesham-Pharmacia)纯化后，向所述溶液中加入5.5μL×10磷酸化缓冲液和1μL(10单位)多核苷酸激酶，在37℃下温育1小时(50μL)。将25μL磷酸化的PCR产物与2μL(20ng)模板质粒，10μL×10PCR缓冲液，8μL10mM dNTP混合物，1μL(5单位)的＂Pyrobest DNA聚合酶＂和54μL去离子水相混合，进行PCR。反应条件是94℃2min，接下来在94℃1min进行30个循环，60℃1min，72℃6min，最后在72℃下12min。
将所得的PCR纯化(43.5μL)。然后加入5.5μL×10磷酸化缓冲液和1μL(10单位)多核苷酸激酶，在37℃下磷酸化1小时。乙醇沉淀所得的混合物。收集所得的DNA溶液(10μL)用连接试剂盒ver.2(Takara生产)在16℃下连接18小时，然后再用乙醇沉淀，由此收集DNA混合物。
实施例2
用5μL由实施例1中获得的DNA混合物，将所述的DNA引入枯草芽孢杆菌菌株ISW1214，参见Chang和Cohen(Mol.Gen.Gent.，168，111-115，1979)，由此获得相应的转化体。具体说来，将枯草芽孢杆菌菌株ISW1214在50mL LB培养基中于37℃下振荡培养2小时(在600nm下的吸光值：0.4)，室温下离心分离(7000rpm 15min)收集细胞，悬浮于5mL SMMP[0.5M蔗糖，20mM马来酸二钠，20mM 6水氯化酶，35％(w/v)＂抗生素培养基3＂(Difco)]。向所得的悬浮液中加入500μL溶于SMMP溶液的溶菌酶溶液(30mg/mL)，将所得的溶液在37℃下温育1小时。然后在室温下离心分离(2800rpm，15min)收集原生质体，将其悬浮于5mL SMMP中制成原生质体溶液。向0.5mL原生质体溶液中加入10μL质粒溶液和1.5mL 40％(w/v)聚乙二醇(PEG8，000，Sigma)。缓慢地搅拌所得的混合物。在室温下放置2min后，将所得的混合物与5mL SMMP溶液混合。在室温下离心(2800rpm15min分离)，收集原生质体，再次悬浮于1mL SMMP溶液中。将所得的原生质体悬浮液在37℃振荡90min(120rpm)，然后涂布到含四环素(15μg/mL，Sigma)的DM3再生琼脂培养基中[0.8％(w/v)琼脂(WakoPure Chemicals生产)，0.5％6水合琥珀酸二钠，0.5％＂CasaminoAcids Technical＂(Difco生产)，0.5％酵母抽提物，0.35％磷酸二氢钾，0.15％磷酸氢二钾，0.5％葡萄糖，0.4％6水合氯化镁，0.01％牛血清白蛋白(Sigma生产)，0.5％羧甲基纤维素，0.005％台盼蓝(Merck生产)和氨基酸混合物(亮氨酸和甲硫氨酸，各10μg/mL)]在30℃下温育72小时以得到转化体。在DM3再生琼脂培养板上形成的带有晕圈的转化体于30℃下在含有四环素(15μg/mL)的聚胨培养基中振荡培养15小时。收集细胞，提取质粒并通过＂Micro Prep质粒纯化试剂盒＂(Amesham-Pharmacia生产)纯化。
实施例3：核苷酸序列的确定
用＂377DNA测序仪＂(Applied Biosystems生产)确定由实施例2获得的质粒中插入的所述纤维素酶基因的核苷酸序列。
实施例4：纤维素酶变异体产量的评估
在含有3％(W/v)＂Polypepton S＂(Nihon Pharmaceutical生产)，0.5％鱼肉抽提物(Wako Pure Chemicals)，0.05％酵母抽提物，0.1％磷酸二氢钾，0.02％7水合硫酸镁，四环素(15μl/mL)和5％麦芽糖的培养基(PSM培养基)中于37℃条件下培养72小时。
分析每一纤维素酶变异体培养物上清液中的活性。假定单位体积培养物中的重组的野生型纤维素酶的产量为100％，下述碱性纤维素酶变异体的产量分别为：Leu10Gln是120％，Ile16Asn 139％，28Ser22Pro140％，Asn33His 105％，Phe39Ala 113％，Ile76His 112％，Met109Leu112％，Gln242Ser 125％，Phe263Ile 137％，Thr308Ala 102％，Asn462Thr116％，Lys466Leu 110％，Val468Ala 122％，Ile552Met 132％，Ile564Val113％，和Ser608Ile 110％。所述双突变体的产量为Leu10Gln+Ser22Pro是117％，Asn33His+Phe39Ala 118％，Ser22Pro+Gln242Ala207％，Ser22Pro+Gln242Phe 196％，Ser22Pro+Gln242Val187％，Ser22Pro+Gln242Ser 175％，Ser22Pro+Gln242Ile174％，Ser22Pro+Gln242Gly 160％，Ser22Pro+ Gln242Glu158％，Ser22Pro+Gln242Asp 145％，Ser22Pro+Gln242Thr134％，Ser22Pro+Gln242Leu 128％，Ser22Pro+Gln242Met125％，Ser22Pro+Gln242Tyr是115％。三重变异体Leu10Gln+Ser22Pro+Gln242Ser的产量为162％，Ile16Asn+Ser22Pro+Gln242Ser为107％。四重变异体Leu10Gln+Ser22Pro+Ile76His+Lys466Leu的产量为113％，四重变异体Leu10Gln+Ile16Asn+Ile76His+Gln242Ser+Lys466Leu的产量为163％，从而表现出产量上的提高。
对结果的分析表明在大多数变异体中产量的提高是由于分泌的蛋白的量的提高。在242位发生取代的变异体表现出对作为底物的羧甲基纤维素酶(CMC)比活性提高。具体说来，假定野生型酶的比活性为100％，Gln242Ala的比活性为147％，Gln242Val 150％，Gln242Ser125％，Gln242Phe 128％，Gln242Asp 107％，Gln242Glu 106％，Gln242Gly105％，从而表现出相对比活性的提高。而且，在0.1M磷酸盐缓冲液(pH8)中也表现出比活性提高。例如，Gln242Ala的比活性是150％，Gln242Ser 110％，Gln242Val 123％，Gln242Phe 110％，Gln242Asp108％，Gln242Glu 114％，从而表现出相对比活性的提高。通过＂蛋白分析试剂盒＂(Bio-Rad生产)以牛血清白蛋白作为标准蛋白测定了上述蛋白的含量。
<纤维素酶试验(3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法)>
向由0.2mL 0.5M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0)，0.4mL2.5％(w/v)羧甲基纤维素(A01MC：Nippon Paper Industries)，和0.3mL去离子水组成的反应混合物中加入0.1mL经适当稀释的酶溶液。在所得混合物于40℃温育20min后，向其中加入1mL二硝基水杨酸试剂(0.5％二硝基水杨酸，30％罗谢尔盐，1.6％氢氧化钠)沸水浴5min使还原糖显色。在冰水中淬灭后加入4mL去离子水，测定在535nm下的吸光值以确定还原糖的产量。以类似的方式进行空白实验，只是在沸水浴中温育即将开始前加入酶溶液。将在上述反应条件下1min内产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖的蛋白量作为1个酶活性单位(1U)。
实施例5
制备具有下述组分的由A-1颗粒，C-1颗粒和日本专利公开号No.2002-265999中描述的香料组成的粉末洗涤剂，加入1350000U/kg本发明的碱性纤维素酶变异体后，评估含有所述酶的洗涤剂的去垢性。
            表2
    (组分)       (wt.％)
    A-1颗粒       99
    C-1颗粒       0.5
    香料       0.5
    总量       100
<去垢性的测定方法>
(人工染污的织物)
应用在日本专利公开号No.2002-265999中所描述的用于去垢性评估的人工染污的织物。
(洗涤条件，洗涤方法和评估方法)
在硬水(CaCl2：55.42mg/L，MgCl2.6H2O：43.51mg/L)中于30℃溶解洗涤剂，制备1L 0.00667wt.％含水洗涤剂溶液。30℃条件下，将5片人工染污的织物浸没到所述含水洗涤剂溶液中1小时，然后用Terg-O-Tometer以100rpm搅拌，30℃下10min。用活水漂洗每片织物后烫平，以备进行反射比的测定。污染前、人工污染的织物清洗前后，织物在550nm下的反射比通过自动比色计(ShimadzuCorporation生产)测定。依照下述方程，基于5片织物清洗比率的平均值确定清洗比(washing ratio)(％)，评估去垢性。
清洗比(％)＝
清洗后污染织物的反射比-清洗前污染织物的反射比×100
污染前织物的反射比-清洗前污染织物的反射比
(评估结果)
结果，含有本发明的碱性纤维素酶变异体的洗涤剂表现的清洗比为71％，与不含纤维素酶的洗涤剂测得的64％的清洗比相比，相当于提高了7％。
工业实用性
应用本发明的碱性纤维素酶变异体后，与常规的情况相比在培养液中可获得较高活性，这使得大量的碱性纤维素酶可用于包括洗涤剂在内的工业用途。为产生预定量的酶，培养次数可以减少，从而使培养过程所需的能量、培养基组分的量、培养过程中形成的二氧化碳的量和排放的水的量均可下降。
                          序列表<110>花王株式会社<120>碱性纤维素酶变异体<130>P<150>JP P2002-089531<151>2002-03-27<150>JP P2003-013840<151>2003-01-22<160>31<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>824<212>PRT<213>芽孢杆菌种(Bacillus sp.)KSM-S237<400>1Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile1               5                  10                  15Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly
         20                  25                  30Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
     35                  40                  45Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
 50                  55                  60Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly65                  70                  75                  80Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
             85                  90                  95Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu
        100                 105                 110Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile
    115                 120                 125Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
130                 135                 140Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp145                 150                 155                 160Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu
            165                 170                 175Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
        180                 185                 190Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
    195                 200                 205Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys
210                 215                 220Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp225                 230                 235                 240Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
            245                 250                 255Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
        260                 265                 270Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
    275                 280                 285Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
290                 295                 300Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp305                 310                 315                 320Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
            325                 330                 335Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
        340                 345                 350Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro
    355                 360                 365Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
370                 375                 380Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys385                 390                 395                 400Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
            405                 410                 415Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn
        420                 425                 430Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val
    435                 440                 445Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp
450                 455                 460Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val465                 470                 475                 480Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser
            485                 490                 495Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala
        500                 505                 510Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr
    515                 520                 525Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Ash Ile Ala Phe His Glu
530                 535                 540Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala545                 550                 555                 560Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
            565                 570                 575Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser
        580                 585                 590Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser
    595                 600                 605Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala
610                 615                 620Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp625                 630                 635                 640Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
            645                 650                 655Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
        660                 665                 670Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
    675                 680                 685Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
690                 695                 700Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys705                 710                 715                 720Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
            725                 730                 735Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
        740                 745                 750Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
    755                 760                 765Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
770                 775                 780Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys785                 790                 795                 800Glu Ala ValLys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
           805                 810                 815ValLys Asn Glu Ala Lys Lys Lys
       820<210>2<211>2475<212>DNA<213>芽孢杆菌种(Bacillus sp.)KSM-S237<220><221>CDS<222>(1)..(2475)<400>2atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att ctt att   48Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile1               5                  10                  15tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg gca gct ctt gca gca gaa gga   96Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly
         20                  25                  30aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac aat gtt   144Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
     35                  40                  45aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc gat gga   192Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
 50                  55                  60caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta cgt gga   240Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly65                   70                  75                  80atg agt aca cac gga tta cag tgg ttt cct gag atc ttg aat gat aac   288Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
             85                  90                  95gca tac aaa gct ctt tct aac gat tgg gat tcc aat atg att cgt ctt   336Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu
        100                 105                 110gct atg tat gta ggt gaa aat ggg tac gct aca aac cct gag tta atc   384Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile
    115                 120                 125aaa caa aga gtg att gat gga att gag tta gcg att gaa aat gac atg   432Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
130                 135                 140tat gtt att gtt gac tgg cat gtt cat gcg cca ggt gat cct aga gat   480Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp145                 150                 155                 160cct gtt tat gca ggt gct aaa gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta   528Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu
            165                 170                 175tac cct aat aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag ccg agt   576Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
        180                 185                 190agt aat aat aat ggt gga gca ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg   624Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
    195                 200                 205aaa gcg gta aaa gaa tat gct gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa   672Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys
210                 215                 220agc ggt aat gca gat gac aac att atc att gtt ggt agt cca aac tgg   720Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp225                 230                 235                 240agt cag cgt ccg gac tta gca gct gat aat cca att gat gat cac cat   768Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
            245                 250                 255aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct tca act   816Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
        260                 265                 270gaa agc tat ccg tct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac gta atg   864Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
    275                 280                 285agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca   912Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
290                 295                 300gag tgg gga acg agt caa gct agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat   960Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp305                 310                 315                 320gaa gca gat gta tgg att gaa ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg   1008Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
            325                 330                 335gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca   1056Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
        340                 345                 350cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca acc aat ctt gac cca ggt cca   1104Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro
    355                 360                 365gat cat gtg tgg gca cca gaa gaa tta agt ctt tct gga gaa tat gta   1152Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
370                 375                 380cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt aca aaa   1200Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys385                 390                 395                 400tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa gga ttt   1248Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
            405                 410                 415gga gtg aat tcg gat tct cca aat aaa gaa ctt att gca gtt gat aat   1296Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn
        420                 425                 430gaa aac aac act ttg aaa gtt tcg gga tta gat gta agt aac gat gtt   1344Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val
    435                 440                 445tca gat ggc aac ttc tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc aac ggt tgg   1392Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp
450                 455                 460gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gag aag ctt aca atg gat gtt   1440Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val465                 470                 475                 480att gtt gat gaa cca acg acg gta gct att gcg gcg att cca caa agt   1488Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr ValAla Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser
            485                490                 495agt aaa agt gga tgg gca aat cca gag cgt gct gtt cga gtg aac gcg   1536Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala ValArg Val Asn Ala
        500                 505                510gaa gat ttt gtc cag caa acg gac ggt aag tat aaa gct gga tta aca   1584Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr
    515                 520                 525att aca gga gaa gat gct cct aac cta aaa aat atc gct ttt cat gaa   1632Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu
530                 535                 540gaa gat aac aat atg aac aac atc att ctg ttc gtg gga act gat gca   1680Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala545                 550                 555                 560gct gac gtt att tac tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt   1728Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
            565                 570                 575gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct   1776Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser
        580                 585                 590gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct   1824Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser
    595                 600                 605ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg   1872Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala
610                 615                 620tta tca tgg gaa ttt gga tat cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg   1920Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp625                 630                 635                 640gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt   1968Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
            645                 650                 655gag aat gat tat gta gct ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca   2016Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
        660                 665                 670aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac   2064Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
    675                 680                 685ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa   2112Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
690                 695                 700tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa   2160Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys705                 710                 715                 720att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt   2208Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
            725                 730                 735aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga   2256Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
        740                 745                 750gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg   2304Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
    755                 760                 765gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg cca cct gtc gat   2352Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
770                 775                 780gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa   2400Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys785                 790                 795                 800gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca   2448Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
            805                 810                 815gtc aaa aat gag gct aag aaa aaa taa                               2475Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys
        820                 825<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>3cttccattct tnnkttagtt ttacttctat c 31<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>4acactcgtga agacaatnnk aaacatttat taggtaat 38<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>5atcaacatgg agaaaaannk caattacgtg gaatgagt 38<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>6acgattggga ttccaatnnk attcgtcttg ctatgtat 38<210>7<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>7caatgtatac tgttcacnnk tacactggtt cacatgct 38<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>8ttgcaacaga gtggggannk agtcaagcta gtggagac 38<210>9<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>9atgctcgtct ttctgccnnk ggttggggaa aaagtgtt 38<210>10<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>10ctgccaacgg ttggggannk agtgttgata ttttaggt 38<210>11<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>11acggttgggg aaaaagtnnk gatattttag gtgctgag 38<210>12<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>12ataacaatat gaacaacnnk attctgttcg tgggaact 38<210>13<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>13ctgatgcagc tgacgttnnk tacttagata acattaaa 38<210>14<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>14gggactgggc tggagagnnk ggtgtgaaaa cagcttta 38<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>15gaaaacaaag cagcagattt cttccattc 29<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>16gttttacttc tacctttatt tccggcag 28<210>17<21>22<212>DNA<213>人工序列<400>17cttcacgagt gtgtccttct gc 22<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>18cctaataaat gtttagcatt gtcttcacga gtg 33<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>19ggattccaat atcattcgtc ttgctatg 28<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>20agtccggacg cgaactccag tttggac 27<210>21<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>21aagtccggac gcgcactcca gtttggacta c 31<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>22agtccggacg aadactccag tttggac 27<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>23agtccggacg cacactccag tttggac 27<210>24<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>24aagtccggac gmtcactcca gtttggacta c 31<210>25<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>25agtccggacg cccactccag tttggac 27<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>26agtccggacg cgtactccag tttggac 27<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>27agtccggacg aagactccag tttggac 27<210>28<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>28aagtccggac gcatactcca gtttggacta c 31<210>29<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>29agtccggacg atwactccag tttggac 27<210>30<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>30gtgaaccagt gtagatgtga acagtatac 29<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>31cagagtgggg agcgagtcaa gctag 25<210>32<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>32tatgaacaac atgattctgt tcgtgg 26

Claims (7)

1.通过用另一种氨基酸取代在具有与SEQ.ID.NO：1中所示的氨基酸序列表现出至少90％同源性的氨基酸序列的纤维素酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的碱性纤维素酶变异体，所述的氨基酸残基位置为SEQ ID NO：1中的：(a)第10位，(b)第16位，(c)第22位，(d)第33位，(e)第39位，(f)第76位，(g)第109位，(h)第242位，(i)第263位，(j)第308位，(k)第462位，(l)第466位，(m)第468位，(n)第552位，(O)第564位，或(p)第608位。
2.如权利要求1所述的碱性纤维素酶变异体，其中所述的另一种氨基酸残基选自下述的氨基酸：
(a)第10位：谷氨酰胺，丙氨酸，脯氨酸或甲硫氨酸，
(b)第16位：天冬酰胺或精氨酸
(c)第22位：脯氨酸
(d)第33位：组氨酸
(e)第39位：丙氨酸，苏氨酸或酪氨酸，
(f)第76位：组氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，苏氨酸或丙氨酸，
(g)第109位：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸或缬氨酸，
(h)第242位：丙氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸或甘氨酸，
(i)第263位：异亮氨酸，亮氨酸，脯氨酸或缬氨酸
(j)第308位：丙氨酸，丝氨酸，甘氨酸或缬氨酸
(k)第462位：苏氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，精氨酸，
(l)第466位：亮氨酸，丙氨酸或丝氨酸
(m)第468位：丙氨酸，天冬氨酸，甘氨酸或赖氨酸，
(n)第552位：甲硫氨酸，
(o)第564位：缬氨酸，苏氨酸或亮氨酸，以及
(p)第608位：异亮氨酸或精氨酸。
3.编码如权利要求1或2所述的碱性纤维素酶变异体的基因。
4.包含权利要求3的基因的重组载体。
5.包含权利要求4的重组载体的转化体。
6.如权利要求5所述的转化体，其中以微生物作为宿主。
7.包含权利要求1或2所述的碱性纤维素酶变异体的洗涤剂组合物。
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