JP2002017367A - 酵素の改良方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、酵素の特性を改良する方法を提供す
ることを目的とする。 【解決手段】本発明の方法は、酵素タンパク質中のアミ
ノ酸置換の効果における曖昧な相加性に基づき、変異、
選択を繰り返して特性を改良することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素の特性の改良
方法、及び当該方法によって得られた酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】触媒活性を有するタンパク質を総称して
酵素という。酵素に一般に共通する性質の一つとして基
質の種類を厳密に識別する「基質特異性」がある。

【０００３】１）高い基質特異性が要求される場合 酵素を産業的に利用する方法の一つとして、一般に酵素
反応の高い特異性を利用し分析素子を組み立て種々の物
質が混在する試料から特定の物質のみを定量することが
行われている。例えば、生体成分の測定のためにヒトの
体液（血液、血漿、血清、尿など）を試料とし酵素反応
にもどつき生体成分を測定することが、臨床診断ならび
に臨床検査薬分野で広く応用されている。このような酵
素を用いた生体成分の測定は、疾病の進行度合いを推定
し治療効果を確認するためにも、あるいは予防医学的に
疫学的なリスク因子を生体成分の中から同定するために
も重要である。よって、測定には正確さ及び精度管理が
特に要求される。

【０００４】また、酵素反応を利用して産業的に有用な
物質を製造することも可能である。例えば酵素Ｅを用い
て出発物質Ａから生成物Ｂを得る工程を、単純化して以
下の化１のように表す。

【０００５】

【化１】 しかしながら、通常の酵素反応は上記の矢印で表したご
とく可逆的な反応様式をとる場合が多い。すなわち、酵
素Ｅは出発物質Ａに反応して生成物Ｂの生成を促進する
という機能を有する一方、基質濃度、ｐＨ、温度等の反
応条件によって、生成物Ｂの方に反応して出発物質Ａの
生成を促進する場合がある。産業的に安価に生成物Ｂを
得るには、Ａ→Ｂ方向の不可逆的な反応様式に酵素Ｅの
反応特異性を改変させる必要が生じる。

【０００６】上述したような、酵素反応の高い特異性を
利用して種々の物質が混在する試料から特定の物質のみ
を定量する場合、酵素反応を利用して産業的に有用な物
質を製する場合などには、化学反応そのもの若しくは化
学構造論的に厳密な反応及び基質特異性を有すること、
すなわち高い基質特異性を有することが期待される。こ
のような場合の例ａ）−ｃ）を以下に記載する。

【０００７】ａ）血清トランスアミナーゼの場合：臨床
診断では、血清トランスアミナーゼ（ＡＬＴ：アラニン
アミノトランスフェラーゼやＡＳＴ：アスパラギン酸ア
ミノトランスフェラーゼ）活性を測定することが、肝疾
患の臨床検査として汎用されている。しかしながら、生
体成分中のＬＤ（乳酸デヒドロゲナーゼ）やＭＤ（リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ）に起因する測定試薬基質に対す
る副反応が試薬ブランクとして測定され、測定値の正確
さや精度管理上で問題となることが指摘されている（臨
床化学２０００年第２９巻補冊２号９９ａ―１１５
ａ）。

【０００８】ｂ）コレステロールデヒドロゲナーゼの場
合：コレステロールデヒドロゲナーゼを用いて血清コレ
ステロールを定量する場合、生成物のコレステ４エン３
オンによる生成物阻害のために測定感度が低下する現象
が知られている。

【０００９】そのため、コレステロールデヒドロゲナー
ゼによる酵素反応時に生成したコレステ４エン３オンを
ヒドラジン化合物により同時に酵素との親和性を有しな
いかたちに変換する工夫がなされている（Ｋａｙａｍｏ
ｒｉ Ｙら“Ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒ
ｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓａｙｉｎｇ ｔｏ
ｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｓｅｒｕｍ
ｗｉｔｈ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇ
ｅｎａｓｅ．” Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ． １９９９ Ｄ
ｅｃ；４５（１２）：２１５８−６３）。しかしなが
ら、ジアゾ化合物は取扱いの上で人体への危害をあたえ
る可能性があり、問題となる。例えば、ヒドラジン一水
和物は、和光純薬工業試薬カタログ２０００年版より毒
性および腐食性を有する劇物ＩＩＩ類ならびに危険物４
−３−ＩＩＩ類の化合物と記載されている。

【００１０】ｃ）ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラ
ーゼの場合：ｐ−ヒドロキシ安息香酸ならびにその誘導
体を用いた血清コリンエステラーゼ活性の測定には、補
酵素及びｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ｐ
ＨＢＨ）と組み合せた方法が用いられる（詳しくは、臨
床検査法提要 金原出版 平成１０年第３１版 ページ
６３２−３３に記載）。実施例でも記述するようにＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来ｐＨ
ＢＨの反応様式には２つの反応が存在することが知られ
ている。

【００１１】

【化２】（ｉ） ｐ−ヒドロキシ安息香酸＋Ｏ₂＋ＮＡ
ＤＰＨ→ プロトカテキン酸 ＋Ｈ₂Ｏ ＋ ＮＡＤＰ⁺ （ｉｉ） Ｏ₂＋ＮＡＤＰＨ → Ｈ₂Ｏ ＋ ＮＡＤＰ
⁺ 特に（ｉｉ）の反応は、（ｉ）の反応による生成物のプ
ロトカテキン酸が、ｐＨＢＨに対して活性化因子的に作
用し（ｉｉ）の副反応を促進させる（丸尾文治、田宮信
雄監修 ページ１７９ 酵素ハンドブック１９８２年
朝倉書店発行）。そこで、ｐ−ヒドロキシ安息香酸の濃
度とＮＡＤＰ⁺生成量とを化学量論的に一致させること
が、上記の血清コリンエステラーゼを測定に重要とな
る。現在では、その解決策としてｐＨＢＨの（ｉ）の反
応により生成するプロトカテキン酸を分解するために、
さらにプロトカテキン酸オキシゲナーゼ（ＰＣＯ）を添
加している。しかしながら、ＰＣＯの添加は臨床検査薬
としてのコスト面や検査試薬の溶液安定性の面で問題と
なる。

【００１２】２）広範な基質との反応性が要求される場
合 １）に対し、例えば産業的に生み出された産物などを酵
素反応を利用して浄化する場合、当該酵素が一群の対象
物質すべてと反応することが望まれる。このような酵素
は近年「環境浄化酵素」として着目されている。

【００１３】前記環境浄化酵素として、例えば洗剤など
に利用されるリパーゼやプロテアーゼを例にあげると、
リパーゼの場合は脂肪酸エステルの炭素鎖数や不飽和度
に依存しない酵素、プロテアーゼの場合はペプチド鎖の
アミノ酸残基数に依存せず任意のアミノ酸残基のところ
で加水分解する酵素が望まれる。これら場合は、酵素が
広範な物質と反応すること、即ち、酵素の基質特異性が
低いことが重要となる。

【００１４】しかしながら、上述した１）高い基質性が
要求される場合、２）広範な基質との反応性が要求され
る場合のいずれも、酵素反応活性のみならず、コスト
面、安全性等の種々の点で十分に満足のゆく結果は得ら
れていなかった。また、各酵素反応について、さらに別
の酵素を加えるというように、所期の結果を得るための
工夫が個別になされていた。しかしながら、所期の基質
特異性を有する酵素を効率よく得るための一般的な方
法、即ち、任意の野生型の酵素について基質特異性を改
良する方法は、その必要性にもかかわらず本発明前には
開発されていなかった。

【００１５】さらに、基質特異性のみならず、酵素活性
の強弱、（熱、溶液、ｐＨ、有機溶剤を含む化学変性剤
等に対する）酵素の安定性、（作用、ｐＨ、温度等に対
する）反応の平衡、比活性の改良、反応特異性などのそ
の他の酵素の特性についても所期の特性を有する酵素を
効率よく得るための一般的な方法、即ち、任意の野生型
の酵素について特性を改良する方法は、本発明前には開
発されていなかった。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、酵素の特性
を改良するための方法を提供することを目的とする。本
発明の方法は、酵素タンパク質中のアミノ酸置換の効果
における曖昧な相加性に基づき、変異、選択を繰り返し
て特性を改良することを含む、ことを特徴とする。

【００１７】本発明は、さらに、前記方法によって得ら
れた改良酵素を提供することを目的とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題を
解決するために鋭意研究に努めた結果、任意の酵素につ
いて特性を改良するための方法を想到した。以下、特性
の一例として、基質特異性について本発明を説明する。

【００１９】具体的には、本発明の方法は酵素タンパク
質中のアミノ酸置換の効果における曖昧な相加性に基づ
き、変異、選択を繰り返して基質特異性を改良すること
を含む、ことを特徴とする。即ち、タンパク質は下記の
２０種類のアミノ酸残基から構成される。 任意の酵素のアミノ酸配列において、野生型の配列のア
ミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより基
質特異性が変化する。本発明の方法では、配列中の複数
の箇所のアミノ酸残基を同時に置換するのではなく、１
箇所のアミノ酸残基づつ選択、変異を繰り返してアミノ
酸置換多重変異体における基質特異性の変化を調べ、好
ましいものを選択してゆく。

【００２０】本明細書において「基質特異性を改良す
る」とは、野生型よりも基質特異性を高める場合、低め
る場合のいずれの場合をも含む。酵素の基質反応特異性
の改良を目的とする場合、例えば、１）化学反応そのも
のもしくは化学構造論的に厳密な反応および基質特異性
を有するように野生型酵素を改変する場合、あるいは
２）野生型酵素では反応できなかった基質アナログにま
で反応し、産業的に広範に使用できように野生型酵素を
改変する場合、等が該当する。１）の場合は反応特異性
および／または基質特異性を高めるに該当し、２）の場
合は反応特異性および／または基質特異性を低下させ、
反応範囲を広めることに該当する。

【００２１】本明細書における「酵素タンパク質中のア
ミノ酸置換の効果における曖昧な相加性」とは、酵素タ
ンパク質の配列中、１箇所のアミノ酸残基づつ変異を加
えていった場合における、基質特異性の変化を意味す
る。

【００２２】「曖昧な相加性」とは、標的アミノ酸残基
の置換変異体一次データベースより前述のごとく基質特
異性の改変に効果のある残基を少なくとも３箇所選択
し、さらに多重置換の組み合わせにおいてアミノ酸置換
の効果を高める場合、１次データベースで各アミノ酸残
基に対してもっとも効果の現れたもの同士を組み合わせ
ても最良のものが得られるとは限らず、少なくとも２の
選択幅をもたせ１箇所のアミノ酸残基づつ段階的にアミ
ノ酸置換により改変効果を図ることをいう。従って、最
終的に獲得される多重置換変異体の多くは一次データベ
ース上で最も効果のあったもの同士の組み合わせになる
場合は少なく、一次データベース上でアミノ酸置換効果
が認められた上位（例えば、３つ）同士の組み合わせか
ら最適なものを選別することとなる。一次データベース
上で効果の現れた置換体同士を組み合わせることにより
最大の効果を発揮させる面は、相加性を期待する方法論
の範疇に属する。しかしながら、本方法の特徴は、効果
のあった異なる置換体同士を同時に掛け合わせて優れた
効能を期待するのとは異なり、候補集団同士の組み合わ
せにより変異・選択を繰り返し、その中から予期せぬも
のまでデータベース化していくものである。集団同士の
組み合わせの概念を、本明細書中「曖昧な相加性」と定
義する。

【００２３】限定されるわけではないが、好ましくは本
発明の方法は、以下の工程ｉ）−ｉｖ）を含む。 ｉ） 酵素タンパク質中の任意の３又はそれ以上の箇所
のアミノ酸残基について各アミノ酸残基を他のアミノ酸
残基に変異させた、一群の変異体を作成してその基質特
異性を測定し、変異アミノ酸残基と基質特異性の関係に
関するデータベースを作成し； ｉｉ） 前記ｉ）の変異体を作成した３又はそれ以上の
箇所のアミノ酸残基のうち任意の２箇所のアミノ酸残基
の各々について、ｉ）のデータベースより基質特異性に
関与する少なくとも２つの変異体を選択し； ｉｉｉ） 前記２箇所のアミノ酸残基を同時に、前記各
々選択した基質特異性に関与する少なくとも２つのアミ
ノ酸残基に変異させた、一群の２重変異体を作成してそ
の基質特異性を測定し、前記２重変異体と基質特異性の
関係に関するデータベースを作成し； ｉｖ） 前記ｉｉｉ）のデータベースより２重変異体に
ついて基質特異性に関与する少なくとも２つの２重変異
体を選択し、さらに、ｉ）のデータベースよ り、ｉｉ）で考慮しなかった箇所のうち１箇所のアミノ
酸残基について基質特異性に関与する少なくとも２つの
変異体を選択し；そして ｖ） ｉｖ）で選択された少なくとも２つの２重変異体
において、さらに、前記別の１箇所のアミノ酸残基につ
いてｉｖ）で選択された少なくとも２つのアミノ酸残基
に変異させた、一群の３重変異体を作成してその基質特
異性を測定し、前記３重変異体と基質特異性の関係に関
するデータベースを作成して基質特異性が改良された３
重変異体を選択する ｖｉ） 所望により、前記ｖ）のデータベースより３重
変異体について基質特異性に関与する少なくとも２つの
３重変異体を選択し、さらに、ｉ）のデータベースよ
り、ｉｉ）およびｖｉ）で考慮しなかった箇所のうち１
箇所のアミノ酸残基について基質特異性に関与する少な
くとも２つの変異体を選択し、上記ｉｖ）−ｖ）の工程
を繰り返す。

【００２４】以下、各工程について非限定的に説明す
る。ｉ）の工程においては、まず、酵素タンパク質中の
任意の３又はそれ以上の箇所のアミノ酸残基について、
アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変異させた一群の変
異体を作成する。

【００２５】着目する任意の３又はそれ以上の箇所は、
特に限定されない。酵素タンパク質の全てのアミノ酸残
基について、野生型と異なるアミノ酸残基に変異させた
変異体を作成してもよい。また、例えば、システイン残
基及びメチオニン残基を含む含琉アミノ酸残基、又はシ
ステイン残基のみ、というように特定のアミノ酸残基に
着目してもよい。あるいは、特定の領域、例えば基質結
合に関与する領域が既知であれば基質結合領域等、に着
目し、当該領域についての一群の変異体を作成してもよ
い。

【００２６】着目する任意の３又はそれ以上の箇所のア
ミノ酸残基について、それぞれ、野生型のアミノ酸残基
以外のアミノ酸に置換した変異体を作成する。上述した
ように、一般にタンパク質を構成するアミノ酸残基は２
０種類存在する。よって、アミノ酸置換変異体は各箇所
について最大１９種類作成することができる。しかしな
がら、全ての種類の変異体を作成する必要はない。例え
ば、システイン残基に着目した場合、システイン以外の
１９種類のアミノ酸置換した１９種類の変異体を作成可
能である。また、含硫アミノ酸残基（システイン残基及
びメチオニン残基）に着目した場合、これらを含硫アミ
ノ酸以外の他のアミノ酸残基に置換した最大１８種類の
変異体を作成してもよい。

【００２７】酵素タンパク質の特定の部位でのアミノ酸
置換は、当業者に既知の任意の方法を使用して行うこと
が可能である。例えば、合成ＤＮＡを用いた部位特異的
変異法を用いることができる。部位特異的変異法として
は、ＺｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈらの方法（Ｚｏｌｌｅ
ｒ，Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏ
ｌ．１００，ｐ．４６８）及びその改良方法、本明細書
の実施例で用いたＰＣＲを利用した方法などの他、多く
の方法が公知である。本発明においては、目的の箇所で
のアミノ酸置換できる変異方法であれば、どのような方
法でも適用可能である。

【００２８】作成された一群の変異体について、基質特
異性を測定する。基質特異性の測定は、対象の酵素タン
パク質に応じて当業者は任意に選択可能である。酵素の
有する基質特異性を測定する場合、通常基質の化学構造
と類似する化合物（アナログ）との間での交差反応性の
程度を、例えば、デヒドロゲナーゼの場合は補酵素の酸
化還元反応の程度として分光光学的に求めることができ
る。上述の臨床検査薬のような生体液を試料としてその
中に含まれる特定の生体試料を測定する場合、一般に試
料液のかわりに生理食塩水や精製水を対照試料として測
定する。このような対照試料について生じる試薬ブラン
ク反応を、測定に用いた各酵素のブランク反応という。
ブランク反応では、通常の酵素学的な測定方法では検出
できないような副反応まで問題となる場合がある。その
ような場合には、所定の測定試薬組成ならびに所定の測
定条件下での本反応とブランク反応の程度を比例化し、
実質的な基質特異性を判定してもよい。

【００２９】限定されるわけではないが、後述する実施
例では、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ｐ
ＨＢＨ）の基質特異性の改良を行った。実施例では、ｐ
ＨＢＨの主反応の生成物であり、かつ副反応の基質とも
なるプロトカテキン酸に対する交差反応性を指標に調べ
た。交差反応性の相対活性（％）が低い、即ちプロカテ
キン酸に対する交差反応性が低いほど、ｐＨＢＨ酵素の
ｐ−ヒドロキシ安息香酸に対する基質特異性が高いと判
断した。

【００３０】一群の変異体について基質特異性を測定す
ることにより、着目した任意の３又はそれ以上の箇所に
ついて、各箇所毎に、変異アミノ酸残基と基質特異性の
関係に関するデーターベースを作成する。

【００３１】工程ｉｉ）において、前記工程ｉ）の変異
体を作成した３又はそれ以上の箇所のアミノ酸残基のう
ち任意の２箇所のアミノ酸残基の各々について、ｉ）の
データベースより基質特異性に関与する少なくとも２つ
の変異体を選択する。

【００３２】本工程において、変異体を選択する箇所
は、工程ｉ）でデータベースを作成した箇所のうち任意
の２箇所を選択可能である。即ち、例えば、工程ｉ）に
おいてａ、ｂ、ｃ及びｄの４箇所のアミノ酸残基につい
て各々データベースを作成した場合、工程ｉｉ）で着目
する２箇所はａ、ｂ、ｃおよびｄのうち例えばａとｃ、
ｂとｃなどの任意の２箇所を選択可能である。

【００３３】上記任意の２箇所について、工程ｉ）のデ
ータベースより基質特異性に関与する少なくとも２つの
変異体を選択する。「基質特異性に関与する」とは、変
異により酵素の基質特異性高められた場合、又は低下し
た場合のいずれの場合をも含む。当業者は目的により所
望の少なくとも２つの変異体を選択する。即ち、酵素の
基質特異性を高めることを目的とする場合、データベー
スより各箇所について、一般に基質特異性の高い方より
少なくとも２つの変異体を選択する。但し、例えば、生
化学的要因により特定の変異体を選択できない場合など
は、その変異体を選択せずに、次に基質特異性の高い変
異体を順に選択してもよい。逆に、酵素の基質特異性を
低めることを目的とする場合、データベースより各箇所
について、一般に基質特異性の低い方より少なくとも２
つの変異体を選択する。

【００３４】選択する変異体の数は２つ以上であればよ
く、特に限定されない。好ましくは２−４であり、より
好ましくは３である。以降の各工程において変異体を選
択する場合も、選択する変異体の数は同様である。

【００３５】工程ｉｉｉ）において、工程ｉｉ）で選択
した２箇所について同時に、各々選択した基質特異性に
関与する少なく２つのアミノ酸残基に変異させた、一群
の２重変異体を作成する。例えば、工程ｉｉ）におい
て、ａおよびｃの箇所を選択した場合、ａ及びｃの２箇
所に変異を施した２重変異体を作成する。２重変異体の
作成は、例えば工程ｉ）に関して上述した公知の部位特
異的変異法により作成可能である。次いで、２重変異体
について工程ｉ）と同様に基質特異性を測定し、前記２
重変異体と基質特異性の関係に関するデータベースを作
成する。

【００３６】工程ｉｖ）において、工程ｉｉｉ）のデー
タベースより２重変異体について基質特異性に関与する
少なくとも２つの２重変異体を選択する。工程ｉｉ）の
場合と同様に、当業者は目的により所望の少なくとも２
つの２重変異体を選択する。即ち、酵素の基質特異性を
高めることを目的とする場合、工程ｉｉｉ）のデータベ
ースより基質特異性の高い方より少なくとも２つの２重
変異体を選択する。逆に、酵素の基質特異性を低めるこ
とを目的とする場合、一般に基質特異性の低い方より少
なくとも２つの２重変異体を選択する。

【００３７】一方、さらに、ｉ）のデータベースより、
工程ｉｉ）で考慮しなかった箇所のうち１箇所のアミノ
酸残基について基質特異性に関与する少なくとも２つの
変異体を選択する。例えば、ｉｉｉ）の工程でａ／ｃ
２重変異体を作成した場合、本工程ではｂ又はｄについ
て２つの変異体を選択する。前記さらなる１箇所のアミ
ノ酸残基の好ましい２つの変異体の選択は、工程ｉｉ）
と同様に行う。

【００３８】ｖ）の工程において、工程ｉｖ）で選択さ
れた少なくとも２つの２重変異体において、さらに、前
記別の１箇所のアミノ酸残基についてｉｖ）で選択され
た少なくとも２つのアミノ酸残基に変異させた、一群の
３重変異体を作成する。ｉｉｉ）の工程でａ／ｃ ２重
変異体を作成した場合、これにさらにｂ（又はｄ）の位
置に工程ｉｖ）で選択された好ましい少なくとも２つの
変異を施し、一群の３重変異体を作成する。

【００３９】得られた３重変異体について前述と同様に
基質特異性を測定し、基質特異性との関係に関するデー
タベースを作成する。このデータベースより所期の基質
特性を有する好ましい３重変異体を選択することが可能
である。

【００４０】ｖｉ）の工程において、さらに所望によ
り、工程ｉｉ）−ｉｖ）で考慮しなかっら箇所のうち１
箇所のアミノ酸残基について、工程ｉ）のデータベース
より基質特異性に関与する少なくとも２つの変異体を選
択し、工程ｖ）の３重変異体に相加的に変異を施して、
４重変異体を作成してもよい。さらに、同様にｉｉ）−
ｉｖ）のアミノ酸の選択・置換の工程を繰り返して、所
期の多重変異体を作成してもよい。

【００４１】本発明は、このように１箇所のアミノ酸残
基づつ選択、変異を繰り返してアミノ酸置換多重変異体
における基質特異性の変化を調べ、好ましいものを選択
してゆく。本発明は、酵素の基質特異性を改良するため
に、１箇所のアミノ酸残基づつ選択、変異を行うという
技術的思想を利用した工程を含めば足り、多重変異体作
成の全ての工程において、１箇所のアミノ酸残基づつ選
択、変異を行わなくてもよい。よって、例えば、ｉ）−
ｖ）の工程によって３重変異体を作成し、さらに、別の
２箇所のアミノ酸残基に同時に変異を施して５重変異体
を作成したような場合も、３重変異体の作成の過程で本
発明の思想を利用するものであり、本発明の範囲に含ま
れる。

【００４２】本発明において酵素の種類は特に限定され
ず、基質特異性の改良を目的とする任意の酵素を適用可
能である。非限定的に、例えば、酵素の基質特異性を高
めることを目的とする場合は乳酸デヒドロゲナーゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナ
ーゼ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼなどに
適用可能である。酵素の基質特異性を低めることを目的
とする場合、例えば、洗剤などに使用されるリパーゼ、
プロテアーゼ、ペプチダーゼなどに適用可能である。

【００４３】酵素の基質特異性を高めることを目的とし
て、本発明の方法により酵素の改良を行った場合、他の
基質に対する交差反応性を好ましくは約４％以下まで低
下させることができる。

【００４４】以上、酵素の「特性」の一例として基質特
異性について本発明を説明した。本発明は「基質特異
性」に限定されず、酵素の任意の種々の「特性」につい
て改良を行い、所期の特性を有する酵素を得ることを可
能にする。本発明の方法によって改良しうる「特性」の
例としては、酵素活性の強弱、（熱、溶液、ｐＨ、有機
溶剤を含む化学変性剤等に対する）酵素の安定性、（作
用、ｐＨ、温度等に対する）反応の平衡、比活性の改
良、反応特異性などが含まれる。

【００４５】

【発明の効果】本発明では、１箇所のアミノ酸残基づつ
変異を加えていった場合における、基質特異性の変化に
基づいて、好ましい多重変異体の選択、さらに別の箇所
のアミノ酸残基の変異、の工程を繰り返すことにより酵
素の特性を改良する。これにより、一度に複数箇所の変
異を同時に生じさせ、全ての組み合わせの変異体につい
て特性を検討するよりも、検討する多重変異体の数が少
なくてすむ、という効果が得られる。

【００４６】本発明の効果をより理解しやすくするため
に、システイン残基ｎ個を含む野生型酵素においてシス
テイン残基を変異させて基質特異性を高める場合を例に
して説明する。

【００４７】各システイン残基のアミノ酸配列上の位置
をＡｉ（ｉ＝１ないしｎ）とする。各システイン残基を
他のアミノ酸残基に変換させると、各箇所のシステイン
残基について最大１９種類、合計１９×ｎ個の変異体が
作成される。各変異体の基質特異性について測定しデー
タバンクを作成する（工程ｉ）） Ａ₁及びＡ₂についてデータバンクより基質特異性の高い
変異体を各々３つ、例えばＡ₁Ｘ、Ａ₁Ｙ、Ａ₁Ｚ（Ｘ，
Ｙ，Ｚはシステイン以外のアミノ酸残基）、Ａ₂Ｘ、Ａ₂
Ｙ、Ａ₂Ｚ（Ｘ，Ｙ，Ｚはシステイン以外のアミノ酸残
基）選択する（工程ｉｉ）） Ａ₁およびＡ₂について２重変異体を作成して基質特異性
を測定する。２重変異体について合計９個のデータを得
る（Ａ₁ＸＡ₂Ｘ、Ａ₁ＹＡ₂Ｘ、Ａ₁ＺＡ₂Ｘ、Ａ ₁ＸＡ
₂Ｙ、Ａ₁ＹＡ₂Ｙ、Ａ₁ＺＡ₂Ｙ、Ａ₁ＸＡ₂Ｚ、Ａ₁ＹＡ₂
Ｚ、Ａ₁ＺＡ₂Ｚ）（工程ｉｉｉ）） ２重変異体の９個のデータより、基質特異性の高い３つ
の２重変異体を選択する（例えば、Ａ₁ＸＡ₂Ｘ、Ａ₁Ｙ
Ａ₂Ｘ、Ａ₁ＺＡ₂Ｘ）。さらに、Ａ₃について基質特異性
の高い３つの変異体を選択する（例えば、Ａ₃Ｘ、Ａ
₃Ｙ、Ａ₃Ｚ）（工程ｉｖ）。

【００４８】Ａ₁、Ａ₂およびＡ₃について３重変異体を
作成して基質特異性を測定する。３重変異体について合
計９個のデータを得る（Ａ₁ＸＡ₂ＸＡ₃Ｘ、Ａ₁ＹＡ₂Ｘ
Ａ₃Ｘ、Ａ₁ＺＡ₂ＸＡ₃Ｘ、Ａ₁ＸＡ₂ＸＡ₃Ｙ、Ａ₁ＹＡ₂
ＸＡ₃Ｙ、Ａ₁ＺＡ₂ＸＡ₃Ｙ、Ａ ₁ＸＡ₂ＸＡ₃Ｚ、Ａ₁ＹＡ
₂ＸＡ₃Ｚ、Ａ₁ＺＡ₂ＸＡ₃Ｚ）（工程ｖ）。

【００４９】Ａ₃について基質特異性の高い３つの変異
体を選択し、前記３重変異体のうち基質特異性の高い３
つの変異体にさらに変異を施す。上記工程をＡ_nについ
てまで繰り返す（工程ｉｖ））。

【００５０】本発明の改良方法を用い、上述の例におい
て基質特異性の高い酵素を得る場合、工程ｉｉ）ないし
工程ｉｖ）において変異を繰り返しにより最終的に合計
３（多重変異体からの選択）×３（新たな変異の選択）
×（ｉ−１）個の変異体を作成して基質特異性を測定す
ることになる。これに対し、従来の方法により、全ての
システイン残基に同時に変異を施す場合、１９のｉ乗個
の組み合わせが可能であり、これらの変異体を全て作成
しなかればならない。仮に、各システイン残基毎に基質
特異性の高い変異体を３つ選択したとしても、同時に変
異を施すと３のｉ乗個の変異体の作成が必要となる。仮
にシステイン残基の箇所が５箇所の場合、本発明の場
合、３×３×（５−１）＝３６個の変異体の検討で足り
る。これに対し、従来の方法では同時に変異を施す従来
法では３の５乗個、即ち２４３個の変異体の検討が必要
となる。

【００５１】以上、ｎ個のシステイン残基について３個
ずつ変異体を選択する場合を例として、本発明の効果を
説明した。このように本発明は、検討する変異体の数を
減らし効率よく酵素の特性を改良することを可能とす
る。本発明の効果は、検討すべきアミノ酸残基の数を多
いほどより大きくなる。以下、実施例によって本発明を
具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限
定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に
基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることがで
き、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。

【００５２】

【実施例】ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼの
基質特異性を改良した変異体の作成について実施例を記
載する。

【００５３】実施例１ システインを含まないＰｏｂＡ
遺伝子の構築並びにアミノ酸変異酵素の作製 （ｉ）システインを含まないＰｏｂＡ遺伝子の構築 Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＩＦ
Ｏ１４１６０）由来のｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキ
シラーゼ（ｐＨＢＨ）をコードする遺伝子（ＰｏｂＡ遺
伝子）を鋳型に用いたＰＣＲ法により、野生型のＰｏｂ
Ａ遺伝子配列上に存在するＣｙｓ残基をその他のアミノ
酸に置換した変異酵素遺伝子ライブラリーを構築した。

【００５４】野生型ＰｏｂＡ遺伝子の塩基配列ならびに
当該遺伝子を挿入したプラスミドについては、末森明夫
らの１９９９年生物工学会要旨集に詳述されている。野
生型ＰｏｂＡ遺伝子の塩基配列及びコードされるアミノ
酸配列を、本明細書中において後述する配列表の配列番
号１及び２に各々記載する。ｐＨＢＨタンパク質のＮ末
端メチオニンは、配列番号１の塩基番号２５−２７によ
ってコードされる。変異酵素遺伝子ライブラリーを構築
するために、ｐＨＢＨタンパク質の１５２番目、１５８
番目、２１１番目及び３３２番目のＣｙｓ残基を、それ
ぞれ他のアミノ酸残基に置換するようにＰＣＲ反応を行
った。ＰＣＲ核酸増幅用プライマーとして、各場合にお
いてそれぞれ４種類のプライマーを使用した。より具体
的な操作手順として、Ｃｙｓ１５２置換ライブラリー作
製を例に、図１に示す。

【００５５】先ず、ＳＤ−Ｎ１プライマー（配列番号
３）とプライマー２（配列番号４）を含むＰＣＲ反応溶
液と、プライマー１（配列番号５）とＣ２プライマー
（配列番号６）を含むＰＣＲ反応溶液の２種類の反応溶
液を準備し、各々独立してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ
反応により前者から配列断片Ａ、後者からが配列断片Ｂ
が得られる。反応は、変性（９５℃、０．５分）、アニ
ーリング（５５℃、０．５分）、伸長（７２℃、１．５
分）からなるサイクルを３０サイクル繰り返した。ＰＣ
Ｒ反応の結果、ＰＣＲ産物ＡとＰＣＲ産物Ｂを得た。

【００５６】３０サイクル反応後、両者の反応溶液を混
合し、さらに５サイクル（アニーリング、変性及び伸長
は上記と同じ条件）のＰＣＲをおこなった。その結果、
産物Ａと産物Ｂ間で重複する３６ｂｐの配列の上で相補
的に重なり合う産物Ａと産物Ｂの部分２本鎖産物を作製
した。さらにＳＤ−Ｎ１プライマーとＣ２プライマーを
過剰に添加し、３０サイクル（アニーリング、変性及び
伸長は上記と同じ条件）のＰＣＲ伸長反応をおこなうこ
とで、Ｃｙｓ１５２番目のみを任意のアミノ酸に置換し
た配列のみを有する改変ＰｏｂＡ全長遺伝子が増副産物
として得られた。

【００５７】上記の１５２番目のＣｙｓ変異に用いた４
種類のプライマーの塩基配列を以下に記載する。配列
中、ｎはａ、ｔ、ｇ、ｃを、ｋはｇあるいはｔを、ｍは
ａあるいはｃを示す。以下、本明細書中の塩基配列にお
いて同様とする。

【００５８】

【化３】（ａ）ＳＤ−Ｎ１プライマー ５’−agg gga tcc aaa gga gga gga act tcc atg aaa
acg cta aaa acc caagtc gcc−３’（配列番号３） （ｂ）プライマー１ ５’−aca gcc cgc gat gta gtc mnn ctc cag gcg aaa
agc ttc−３’（配列番号５） （ｃ）プライマー２ ５’−gaa gct ttt cgc ctg gag nnk gac tac tac gcg
ggc tgt−３’（配列番号４） （ｄ）Ｃ２プライマー ５’−taa gga tcc cgt tac tcg ata gct tcg taa gga
agc ccg acg taa ttttct tgc −３’（配列番号６） 上記配列（ａ）〜（ｄ）のうち、１５２番目のＣｙｓ以
外のアミノ酸置換の場合でも、（ａ）ＳＤ−Ｎ１プライ
マーと（ｄ）Ｃ２プライマーは共通に使用し、プライマ
ー１とプライマー２は各Ｃｙｓ残基の置換に固有のもの
とした。１５８番目、Ｃｙｓ２１１番目、Ｃｙｓ３３２
番目のＣｙｓ置換に用いたプライマー１及びプライマー
２の配列を以下に示す。

【００５９】

【化４】１５８番目のＣｙｓ変異の場合 （ｂ）プライマー１ ５’−tgc gac tac atc gcg ggc nnk gat ggt ttt cac
ggt gtg−３’（配列番号７） （ｃ）プライマー２ ５’−cac acc gtg aaa acc atc mnn gcc cgc gat gta
gtc gca−３’（配列番号８）２１１番目のＣｙｓ変異の場合 （ｂ）プライマー１ ５’−gcg cgt ggc ttt gcc ctg nnk agc atg cgc tcg
ccg acc−３’（配列番号９） （ｃ）プライマー２ ５’−ggt cgg cga gcg cat gct mnn cag ggc aaa gcc
acg cgc−３’（配列番号１０） ３３２番目のＣｙｓ変異の場合 （ｂ）プライマー１ ５’−gaa cag tac tca gcg atc nnk ttg cgc cgc gta
tgg aaa−３’（配列番号１１） （ｃ）プライマー２ ５’−ttt cca tac gcg gcg caa mnn gat cgc tga gta
ctg ttc−３’（配列番号１２） （ｉｉ）アミノ酸変異酵素の作製 （ｉ）により、ＰｏｂＡ遺伝子においてｐＨＢＨタンパ
ク質の１５２番目、１５８番目、２１１番目及び３３２
番目のＣｙｓ残基をコードする部分をそれぞれ他のアミ
ノ酸残基をコードするように置換させたＰＣＲ反応物
（４種類）を得た。以降、これらの４種類のＰＣＲ反応
物を混合して変異体のライブラリーの作成に使用した。

【００６０】ＰＣＲ反応物を制限酵素ＢａｍＨ１で処理
し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ−）（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社製）のＢａｍＨ１部位に挿入連結し、組
換え発現ベクターを作成した。当該組換えベクターを用
いて大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造製）
を形質転換し、Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ培地寒天プレート
上で青白反転したコロニーをピックアップした。次い
で、ｐＨＢＨの基質であるｐ−ヒドロキシ安息香酸なら
びにＩＰＴＧ（イソプロピルβ−チオガラクトピラノシ
ド）含むＬＢ寒天培地を分注した４８穴タイタープレ−
トに、上記Ｘ−ｇａｌ培地で白色を示したコロニーを１
コロニー／ウェルの割合で移植した。ｐＨＢＨ酵素活性
にて褐色に培地が変化したウェルを３７℃インキュベー
ターで２日間静置後観察し、変異酵素遺伝子を有する大
腸菌形質転換体をライブラリー化した。各Ｃｙｓ残基置
換体としておよそ５００個の変異酵素コロニーを調べ、
Ｃｙｓ残基が改変された置換アミノ酸を同定した。大腸
菌形質転換体で組換え変異酵素を発現させるために用い
たＰｏｂＡ発現プラスミドの操作手順を図２に示した。

【００６１】実施例２ システイン残基のアミノ酸置換
酵素ライブラリーの構築 実施例１で得られた大腸菌形質転換体よりプラスミドを
抽出し、変異酵素のアミノ酸置換の様相を塩基配列より
決定した。その結果、１５２番目、１５８番目、２１１
番目又は３３２番目のＣｙｓ残基が置換された変異体
が、各々１３種類、９種類、１１種類及び１１種類が獲
得できた。

【００６２】得られた一群のアミノ酸置換体について、
Ｃｙｓ残基が他のアミノ酸に置換された場合の基質特異
性の変化を調べた。結果を以下の表１−４に示す。表１
−４においてアミノ酸置換体は、Ｃｙｓ残基が他のアミ
ノ酸に置換されたかたちの一文字略記で示す。なお、表
中の棒線部分はアミノ酸置換を行った時に活性を有する
変異酵素が取得できなかったことを意味する。基質特異
性は、各種変異酵素の粗酵素液をサンプルとし、プロト
カテキン酸に対する交差反応性を指標に調べた。交差反
応性の相対活性（％）は、次式より算出した。

【００６３】

【化５】 以下の表において、相対活性（％）が低い、即ちプロカ
テキン酸に対する交差反応性が低いほど、ｐＨＢＨ酵素
のｐ−ヒドロキシ安息香酸に対する基質特異性が高いと
判断される。本実施例では、基質特異性が高いものを好
ましいものとして選択した。

【００６４】

【表１】

【００６５】

【表２】

【００６６】

【表３】

【００６７】

【表４】 実施例３ Ｃ１５２置換とＣ１５８置換との組み合わせ
による２重変異酵素ライブラリーの構築と相対活性
（％） 実施例１の表１より、Ｃ１５２の相対活性の低いアミノ
酸残基変異体として、Ｃ１５２がＡ、Ｔ、Ｖ又はＬに各
々置換された４種類の変異体を選択した。同様に、表２
より、Ｃ１５８の相対活性の低いアミノ酸残基変異体と
して、Ｃ１５８がＩ又はＰに各々置換された２種類の変
異体を選択した。

【００６８】次いで、Ｃ１５２とＣ１５８の２箇所のア
ミノ酸残基を同時に、前記各々選択したアミノ酸残基に
変異させた計８種類の２重変異体酵素を作成した。２重
変異体は、実施例１で記載した塩基置換を含む核酸増幅
用プライマーを用いたＰＣＲによる変異導入の工程を繰
り返すことによって行われた。

【００６９】得られた２重変異体について実施例１と同
様に相対活性（％）を測定した。結果を以下の表５に示
す。

【００７０】

【表５】 表５ Ｃ１５２／Ｃ１５８ ２重置換体の相対活性（％） Ｃ１５２ Ｌ Ｖ Ｔ Ａ Ｃ１５８ Ｐ ４．４ ４．８ ４．７ ４．９ Ｉ ４．９ ４．５ ４．７ ５．０ 実施例４ Ｃ１５２／Ｃ１５８ ２重置換とＣ３３２置
換との組み合わせによ る３重変異酵素ライブラリーの構
築と相対活性（％） 実施例３の表５より、Ｃ１５２／Ｃ１５８ ２重変異体
のうち相対活性の低い２重変異体として、Ｃ１５２／Ｃ
１５８がＶＩ、ＬＰ又はＴＰに各々置換された３種類の
２重変異体を選択した。一方、実施例１の表４より、Ｃ
３３２の相対活性の低いアミノ酸残基変異体として、Ｃ
３３２がＡ又はＴに各々置換された２種類の変異体を選
択した。

【００７１】次いで、上記選択された３種類のＣ１５２
／Ｃ１５８ ２重変異体において、さらに、Ｃ３３２を
上記選択した２種のアミノ酸残基に変異させた計６種類
の３重変異体酵素を作成した。３重変異体は、実施例１
で記載した塩基置換を含む核酸増幅用プライマーを用い
たＰＣＲによる変異導入の工程を繰り返すことによって
行われた。

【００７２】得られた３重変異体について実施例１と同
様に相対活性（％）を測定した。結果を以下の表６に示
す。

【００７３】

【表６】 表６ Ｃ１５２／Ｃ１５８／Ｃ３３２ ３重置換体の相対活性（％） Ｃ１５２／Ｃ１５８ ＶＩ ＬＰ ＴＰ Ｃ３３２ Ａ ４．２ ４．５ ４．９ Ｔ ４．８ ４．３ ５．０ 実施例５ Ｃ１５２／Ｃ１５８２／Ｃ３３２の３重置換
とＣ２１１置換との組み合わせによる４重変異酵素ライ
ブラリーの構築と相対活性（％） 実施例４の表６より、Ｃ１５２／Ｃ１５８／Ｃ３３２
３重変異体のうち相対活性の低い３重変異体として、Ｃ
１５２／Ｃ１５８Ｃ／Ｃ３３２がＶＩＡ、ＬＰＴ又はＬ
ＰＡに各々置換された３種類の３重変異体を選択した。
一方、実施例１の表３より、Ｃ２１１の相対活性の低い
アミノ酸残基変異体として、Ｃ２１１が各々Ｆ、Ｉ又は
Ｔに置換された３種類の変異体を選択した。

【００７４】次いで、上記選択された３種類のＣ１５２
／Ｃ１５８／Ｃ３３２ ３重変異体において、さらに、
Ｃ２１１を上記選択した３種のアミノ酸残基に変異させ
た計９種類の４重変異体酵素を作成した。４重変異体
は、実施例１で記載した塩基置換を含む核酸増幅用プラ
イマーを用いたＰＣＲによる変異導入の工程を繰り返す
ことによって行われた。

【００７５】得られた４重変異体について実施例１と同
様に相対活性（％）を測定した。結果を以下の表７に示
す。

【００７６】

【表７】 表７ Ｃ１５２／Ｃ１５８／Ｃ２１１／Ｃ３３２ ４重置換体の相対活性（％ ） Ｃ１５２／Ｃ１５８／Ｃ３２２ ＶＩＡ ＬＰＴ ＬＰＡ Ｆ ４．０ ４．３ ４．３ Ｃ２１１ Ｉ ３．９ ３．９ ４．０ Ｔ ４．１ ４．３ ４．１ 実施例２−５に例示したように、本発明の酵素の改良方
法は、酵素タンパク質中のアミノ酸置換の効果における
曖昧な相加性に基づき、変異、選択を繰り返して基質特
異性を改良していく方法である。実施例２−５の結果よ
りシステインを含まないアミノ酸置換変異酵素の効果を
置換相加性の面から表８にまとめた。

【００７７】

【表８】表８相対活性（％） 野生型 （ＣＣＣＣ） ４．９ １重置換（ＬＣＣＣ） ４．３ ２重置換（ＬＰＣＣ） ４．４ ３重置換（ＬＰＣＴ） ４．３４重置換（ＬＰＩＴ） ３．９ 表８に示されたように、２重置換、３重置換、４重置換
と好ましい置換変異を加えることにより、相対活性が低
下、即ち基質特異性が向上した。実施例６ ４重アミノ酸置換変異ｐＨＢＨの性質 本実施例では、実施例５で得られた４重変異酵素Ｃ１５
２Ｌ／Ｃ１５８Ｐ／Ｃ２１１Ｉ／Ｃ３３２Ｔの理化学的
な性質を調べた。先ず、大腸菌形質転換体からの粗酵素
液を出発材料としてクロマトグラフィ精製をおこない、
基質特異性については、プロトカテキン酸に対する相対
活性を確認した。さらに、その他の理化学的性質につい
ても明らかとした。結果を野生型と比較したものを以下
の表９に示す。

【００７８】

【表９】 ｐＨＢＨ 野生型 C152L／C158P／C211I／C332T プロトカテキン酸 ４．９％ ３．９％ に対する相対活性 作用温度 ２０〜４０℃まで ２０℃〜４５℃まで 熱安定性 ５０℃で８０％失活 失活せず （１５分間処理） 表９に示されたように、ｐＨＢＨのＣ１５２Ｌ／Ｃ１５
８Ｐ／Ｃ２１１Ｉ／Ｃ３３２Ｔ ４重変異体は、野生型
（ＣＣＣＣ）と比較して相対活性が４．９％から３．９
％に有意に減少した。その他の理化学的性質は、作用温
度は野生型とほぼ同様であり、熱安定性は野生型よりも
向上しており５０℃で１５分処理を行っても失活しなか
った。

【００７９】

【配列表】 <110> Oriental Yeast Co., Ltd. Secretary of Agency of Industrial Science and Technology <120> A method for modifying an enzyme <130> 001501 <160> 12 <210> 1 <211> 1224 <212> DNA <213> Peudomonas fluorescencs <220> <221> CDS <222> (25)(1215) <400> 1 aggggatcca aaggaggaac ttccatgaaa acgctaaaaa cccaagtcgc cattattggc 60 gccggtccct ccggattgct gctcggccag ttactgcaca acgcgggtat ccagaccctg 120 attctagagc gccagagcgc cgactacgtg caaggccgca tccgtgccgg ggtgctggag 180 caaggcatgg tcgacctgct gcgcgaagcg ggcgtcagcc gacgcatgga cgccgagggc 240 cttgtgcatg acggtttcga attggcactc aatggcgaac tcacccacat cgacctcaag 300 gcgctcaccg gcggccagtc ggtgatgatc tacggccaga ccgaagtcac ccgtgacttg 360 atggccgccc gcgaagcggc gggtggcatc actctatatg aaacgcagaa cgtgcagcct 420 catggtcaca aaactgatcg accctggctg accttcgagc accagggtga agcttttcgc 480 ctggagtgcg actacatcgc gggctgtgat ggttttcacg gtgtggcgcg gcagtcgatt 540 ccggcgcagt cgttgaaggt cttcgagcgc gtctatccct tcggttggctg ggcgtcctc 600 gccgacacac cgccggtgca tgacgaactg gtgtacgcca aacatgcgcgt ggctttgcc 660 ctgtgcagca tgcgctcgcc gacccgcagc cgctattacc tgcaagtgccg gttgaagaa 720 gcgctggatg aatggtcgga tcagcgcttc tgggatgagc tgaaaacccgt ttgcccagt 780 gcactggcgg cccaactggt caccgggcca tccatcgaga agagcatcgc gccgctgcgc 840 agctttgtgg tcgagccgat gcaatacggg cgcctgttcc tgctggggga cgccgcgcat 900 atcgtgccgc ccaccggggc caagggcttg aacctggcgg ccagcgacgt gagtacgctg 960 tttcggatct tgctcaaggt ctatcgcgag gggcgggtgg acctgctgga acagtactca 1020 gcgatctgct tgcgccgcgt atggaaagcc gaacggtttt cctggtggat gacttcgatg 1080 ttgcaccagt ttccggaggc cgacgggttc agccagcgca ttgccgagag cgagcttgcg 1140 tatttcatca gctccgaggc gggccgcaaa accatcgcag aaaattacgt cgggcttcct 1200 tacgaagcta tcgagtaagg atcc 1224 <210> 2 <211> 397 <212> PRT <213> Peudomonas fluorescencs <400> 2 Met Lys Thr Leu Lys Thr Gln Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ser 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Gly Gln Leu Leu His Asn Ala Gly Ile Gln Thr Leu 20 25 30 Ile Leu Glu Arg Gln Ser Ala Asp Tyr Val Gln Gly Arg Ile Arg Ala 35 40 45 Gly Val Leu Glu Gln Gly Met Val Asp Leu Leu Arg Glu Ala Gly Val 50 55 60 Ser Arg Arg Met Asp Ala Glu Gly Leu Val His Asp Gly Phe Glu Leu 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Glu Leu Thr His Ile Asp Leu Lys Ala Leu Thr Gly 85 90 95 Gly Gln Ser Val Met Ile Tyr Gly Gln Thr Glu Val Thr Arg Asp Leu 100 105 110 Met Ala Ala Arg Glu Ala Ala Gly Gly Ile Thr Leu Tyr Glu Thr Gln 115 120 125 Asn Val Gln Pro His Gly His Lys Thr Asp Arg Pro Trp Leu Thr Phe 130 135 140 Glu His Gln Gly Glu Ala Phe Arg Leu Glu Cys Asp Tyr Ile Ala Gly 145 150 155 160 Cys Asp Gly Phe His Gly Val Ala Arg Gln Ser Ile Pro Ala Gln Ser 165 170 175 Leu Lys Val Phe Glu Arg Val Tyr Pro Phe Gly Trp Leu Gly Val Leu 180 185 190 Ala Asp Thr Pro Pro Val His Asp Glu Leu Val Tyr Ala Lys His Ala 195 200 205 Arg Gly Phe Ala Leu Cys Ser Met Arg Ser Pro Thr Arg Ser Arg Tyr 210 215 220 Tyr Leu Gln Val Pro Val Glu Glu Ala Leu Asp Glu Trp Ser Asp Gln 225 230 235 240 Arg Phe Trp Asp Glu Leu Lys Thr Arg Leu Pro Ser Ala Leu Ala Ala 245 250 255 Gln Leu Val Thr Gly Pro Ser Ile Glu Lys Ser Ile Ala Pro Leu Arg 260 265 270 Ser Phe Val Val Glu Pro Met Gln Tyr Gly Arg Leu Phe Leu Leu Gly 275 280 285 Asp Ala Ala His Ile Val Pro Pro Thr Gly Ala Lys Gly Leu Asn Leu 290 295 300 Ala Ala Ser Asp Val Ser Thr Leu Phe Arg Ile Leu Leu Lys Val Tyr 305 310 315 320 Arg Glu Gly Arg Val Asp Leu Leu Glu Gln Tyr Ser Ala Ile Cys Leu 325 330 335 Arg Arg Val Trp Lys Ala Glu Arg Phe Ser Trp Trp Met Thr Ser Met 340 345 350 Leu His Gln Phe Pro Glu Ala Asp Gly Phe Ser Gln Arg Ile Ala Glu 355 360 365 Ser Glu Leu Ala Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Ala Gly Arg Lys Thr Ile 370 375 380 Ala Glu Asn Tyr Val Gly Leu Pro Tyr Glu Ala Ile Glu 385 390 397 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 3 aggggatcca aaggaggagg aacttccatg aaaacgctaa aaacccaagt cgcc 54 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 4 gaagcttttc gcctggagnn kgactactac gcgggctgt 39 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 5 acagcccgcg atgtagtcmn nctccaggcg aaaagcttc 39 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 6 taaggatccc gttactcgat agcttcgtaa ggaagcccga cgtaattttc ttgc 54 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 7 tgcgactaca tcgcgggcnn kgatggtttt cacggtgtg 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 8 cacaccgtga aaaccatcmn ngcccgcgat gtagtcgca 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 9 gcgcgtggct ttgccctgnn kagcatgcgc tcgccgacc 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 10 ggtcggcgag cgcatgctmn ncagggcaaa gccacgcgc 39 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 11 gaacagtact cagcgatcnn kttgcgccgc gtatggaaa 39 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Primer for PCR <400> 12 tttccatacg cggcgcaamn ngatcgctga gtactgttc 39

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｃｙｓ１５２置換ライブラリー作製の
模式図を示す。

【図２】図２は、ｐｏｂＡ発現ベクターの構築の模式図
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:39） (72)発明者 末森 明夫 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 中村 淳雄 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号 オリ エンタル酵母工業株式会社内 (72)発明者 松川 寛和 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号 オリ エンタル酵母工業株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA11 BA08 CA02 CA20 DA06 GA11 HA01 HA20 4B050 CC04 DD02 GG01 HH02 LL03 LL04 4H003 DA01 EC01 EC02 FA03 FA16

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素の特性を改良する方法であって、酵素
   タンパク質中のアミノ酸置換の効果における曖昧な相加
   性に基づき、変異、選択を繰り返して特性を改良するこ
   とを含む、前記方法。
2. 【請求項２】以下の工程、 ｉ） 酵素タンパク質中の任意の３又はそれ以上の箇所
   のアミノ酸残基について各アミノ酸残基を他のアミノ酸
   残基に変異させた、一群の変異体を作成してその特性を
   測定し、変異アミノ酸残基と特性の関係に関するデータ
   ベースを作成し； ｉｉ） 前記ｉ）の変異体を作成した３又はそれ以上の
   箇所のアミノ酸残基のうち任意の２箇所のアミノ酸残基
   の各々について、ｉ）のデータベースより特性に関与す
   る少なくとも２つの変異体を選択し； ｉｉｉ） 前記２箇所のアミノ酸残基を同時に、前記各
   々選択した特性に関与する少なくとも２つのアミノ酸残
   基に変異させた、一群の２重変異体を作成してその特性
   を測定し、前記２重変異体と特性の関係に関するデータ
   ベースを作成し； ｉｖ） 前記ｉｉｉ）のデータベースより２重変異体に
   ついて特性に関与する少なくとも２つの２重変異体を選
   択し、さらに、ｉ）のデータベースより、ｉｉ）で考慮
   しなかった箇所のうち１箇所のアミノ酸残基について特
   性に関与する少なくとも２つの変異体を選択し；そして ｖ） ｉｖ）で選択された少なくとも２つの２重変異体
   において、さらに、前記別の１箇所のアミノ酸残基につ
   いてｉｖ）で選択された少なくとも２つのアミノ酸残基
   に変異させた、一群の３重変異体を作成してその特性を
   測定し、前記３重変異体と特性の関係に関するデータベ
   ースを作成して特性が改良された３重変異体を選択する ｖｉ） 所望により、前記ｖ）のデータベースより３重
   変異体について特性に関与する少なくとも２つの３重変
   異体を選択し、さらに、ｉ）のデータベースより、ｉ
   ｉ）およびｖｉ）で考慮しなかった箇所のうち１箇所の
   アミノ酸残基について特性に関与する少なくとも２つの
   変異体を選択し、上記ｉｖ）−ｖ）の工程を繰り返すこ
   とを含む、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】前記選択される変異体の数が２ないし４で
   ある、請求項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】前記工程ｉ）の３又はそれ以上の箇所のア
   ミノ酸残基がシステイン残基である、請求項１ないし３
   のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】酵素の基質特異性を改良するための、請求
   項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】前記特性の改良された酵素の他の基質に対
   する交差反応性が４％以下である、請求項５のいずれか
   １項に記載の方法。
7. 【請求項７】特性の改良された酵素が、ｐ−ヒドロキシ
   安息香酸水酸化酵素の変異体である、請求項１ないし６
   のいずれか１項に記載の方法。
8. 【請求項８】特性の改良された酵素が、［Ｃ１５２Ｌ／
   Ｃ１５８Ｐ／Ｃ２１１Ｉ／Ｃ３３２Ｔ］ｐ−ヒドロキシ
   安息香酸水酸化酵素変異体である、請求項７に記載の方
   法。
9. 【請求項９】１ないし８のいずれか１項に記載の方法に
   より特性の改良された酵素。