KR102169528B1 - 열민감성이 향상된 돌연변이 udg - Google Patents

열민감성이 향상된 돌연변이 udg Download PDF

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Abstract

본원은 야생형대비 열민감성이 증가된 돌연변이 UDG를 개시한다. 본원에 따른 돌연변이 UDG는 높은 열민감성으로 PCR 반응의 저해 효과가 없어 PCR/qPCR PreMIX의 개발은 물론, 특히 낮은 melting 및 amplification step 이 필요한 실험에 보다 적합한 UDG 적용 PCR 진단 키트 개발을 가능하게 한다.

Description

열민감성이 향상된 돌연변이 UDG {Mutant Uracil DNA Glycosylase with increased thermal sensitivity}
본 발명은 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 및 그 용도와 관련된 것이다.
PCR(Polymerase Chain Reaction)은 특정 핵산을 증폭하는 방법으로 생물학, 생화학 및 의학분야에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이다(Yamamoto, Y. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002, 9 (3), 508-514).
하지만 PCR은 매우 민감하고 신속한 분자 진단 검사법이지만 검출하고자 하는 대상과 PCR에 의해 증폭된 산물이 DNA로 서로 동일하기 때문에 위양성 문제가 발생할 가능성이 높다. 특히, 이전 반응에서 증폭된 PCR 산물이나 검체의 처리 과정 중에 발생된 캐리오버 오염(carry-over contamination)에 의해 위양성 증폭이 일어날 수 있다. 실제로 PCR 진단검사를 실시하는 진단 실험실의 경우 동일한 프라이머를 사용하는 PCR 증폭 실험을 수천에서 수만 회 반복해서 진행하기 때문에, 이전 반응에서 증폭된 PCR 산물이 에러로졸 등의 형태로 공기 중을 떠돌다가 다음번 반응 튜브에 혼입되어 위양성 증폭을 일으킨다는 예는 다양하게 보고되어 오고 있다.
이러한 PCR 증폭 산물의 캐리오버 오염은 일단 발생하면 증폭 산물의 양이 천문학적으로 증가하기 때문에(초기 DNA 대비 약 1013 배) 일반적인 세척(cleaning) 방법으로는 오염을 제거하기 어려운 문제점이 있다. 캐리오버 오염은 감염병이나 유전질환을 진단함에 있어서 감염되지 않은 사람을 환자로 오진하여 중대한 문제를 일으킬 수 있다. 이전에 다른 환자를 진단할 때 증폭된 DNA가 감염되지 않은 새로운 사람의 샘플을 검사할 때 섞여 들어가 정상인을 환자로 판정하게 할 수 있으며, 결과적으로 잘못된 처방과 치료로 이어질 수 있다.
이러한 캐리오버 오염을 해결하기 위해 현재 가장 널리 사용되는 방법은 Uracil DNA Glycosylase를 이용한 방법이다. UDG 처리법에서는 먼저, PCR 반응액에 dTTP/dUTP의 혼합물을 첨가하여 PCR을 수행함으로써 T와 U가 혼합된 증폭산물을 만들어낸다. 이후 반응부터는 PCR 반응을 수행할 때 UDG 효소를 PCR 반응액에 첨가하여 37~50℃, 5~30분의 선행 반응을 포함시켜 PCR 진단을 수행한다. 이러한 과정을 통해 Carryover contamination이 발생할 경우 오염된 DNA는 dU를 포함하게 되며, 이들은 UDG에 의해 U base가 제거된다. UDG가 처리되어 베이스가 없어진 DNA는 불안정하기 때문에 PCR 과정 중에 열에 의해 짧은 단편으로 잘려지게 되고, 따라서 이들은 더 이상 주형 DNA로 사용되지 못한다.
UDG 처리법은 필요한 시약(UDG 효소, dUTP)을 PCR 반응액에 포함된 채로 사용할 수 있으며 일반적인 PCR 프로그램에 한 step만 추가해주면 되기 때문에 단일 반응/단일 과정으로 캐리오버 오염을 손쉽게 방지할 수 있다는 장점이 있다.
그러나 현재 널리 사용되는 UDG 효소는 대부분 대장균에서 유래하여 열적 안정성이 높으며, 심지어 PCR 과정이 종료된 이후에도 활성이 살아있는 경우가 종종 있다. 이 때문에 증폭 산물을 즉시 아가로스젤로 분석하지 않으면 증폭 산물 자체가 분해되는 현상이 발생하는 문제점이 있다.
나아가 복잡한 Multiplex Realtime PCR의 경우 TaqMan 프로브 서열 설계의 한계 때문에 비교적 낮은 온도(약 50℃)에서 어닐링(annealing) 반응을 수행해야 하는 경우가 있다. 이때 대장균 유래 UDG 효소의 경우 해당 온도에서 활성을 보유하고 있으므로 적절하게 증폭된 산물조차 분해하여 전체적인 PCR의 민감도를 저해시키는 (Ct value의 delay) 문제가 발생한다. 이는 PCR 진단 키트의 성능을 하락시키는 원인으로 작용한다.
비교적 낮은 온도에서 최적 활성을 보이는 저온성 미생물 유래 UDG이 예로 해양 미생물 BMTU 3346 균주에서 유래한 marine UDG가 있다(Jaeger, S, Molecular cloning, sequency, and expression of the heat-labile uracil-DNA glycosylase from a marine psychrophilic bacterium, strain BMTU3346. Extremophiles. 2000, 4(2):115-122). 그러나 이는 원래 균주가 아닌 대장균에서 재조합 형태로 발현시키기 때문에 E. coli UDG에 비해 발현율 및 용해도가 낮아 단위 효소 당 정제 비용이 높고 정제 과정이 상대적으로 복잡한 단점이 있다.
따라서 열민감성이 높아 PCR 등과 같은 반응 과정 중에 열에 의해 쉽게 불활성화 되며, 한번 불활성화가 되고 나면 재활성화가 되지 않은 UDG의 개발이 필요하다.
열민감성이 높아 PCR 과정 중에 열에 의해 쉽게 불활성화 되며, 한번 불활성화가 되고 나면 재활성화가 잘 일어나지 않는 새로운 열민감성 돌연변이 UDG를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 서열번호 1의 서열로 표시되는 대장균 유래의 야생형 UDG(Uracil DNA Glycosylase) 단백질에 E4A, W7A, E13A, Q16A, Y19A, D43X, F48A, F50A, E52A, H67A, K57A, Q71A, H73A, P87A, L96A, E112A, L121A, H134A, E142A, F144A, R156A, F161A, L162A, W164A, H180A, L183A, H202A, G214E, G214W, G214R, W220A, 및 L224A로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환이 도입된, 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질을 제공하며, 상기 각 숫자는 아미노산 잔기의 위치를 나타내고, 알파벳은 아미노산 잔기를 나타내며 야생형 잔기는 왼쪽에, 치환된 잔기는 오른쪽에 나타내고, 상기 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다.
일 구현예에서 본원에 따른 돌연변이 UDG는 43번 위치에 치환을 포함하며, 상기 치환은 A, C, G, H, I, K, P, R, V 또는 W 아미노산 잔기 중 어느 하나이다.
일 구현예에서 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질은 D43A, D43C, D43H, D43R, D43V, D43W 또는 K57A 중 하나 이상을 포함하며, 다른 구현예에서 상기 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질은 E157A 또는 E215A 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현에에서 본원에 따른 돌연변이 단백질은 치환을 조합으로 포함하며, 이는 D43A/K57A, D43A/E157A, D43A/E215A, D43A/K57A/E157A, D43A/E157A/E215A, 또는 D43A/K57A/E157A/E215A로부터 선택되는 두 개 이상의 치환을 조합으로 포함한다.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 돌연변이 UDG 단백질을 포함하는 RT, PCR 또는 RT-PCR 반응에서 반응물 중의 핵산 오염 제거용 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 돌연변이 UDG 단백질, PCR 중합효소 및 PCR 반응에 필요한 완충액을 포함하는, PCR 프리믹스 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 돌연변이 UDG 단백질, RT(Reverse Transcription) 효소 및 RT 반응에 필요한 완충액을 포함하는, RT 프리믹스 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 돌연변이 UDG 단백질, RT 효소, PCR 중합효소 및 RT-PCR 반응에 필요한 완충액을 포함하는, RT-PCR 프리믹스 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 돌연변이 UDG 단백질을 핵산을 포함하는 반응물 중에서 약 5 내지 55℃에서 반응시키는 단계를 포함하는, 분석 대상 샘플에서 핵산 오염 제거 방법을 제공한다.
일 구현예에서 상기 반응물은 RT, PCR 또는 RT-PCR 반응에 사용된다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 돌연변이 UDG 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함한는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 포함한다.
본원에 따른 돌연변이 UDG는 야생형 또는 기존의 시판중인 UDG와 비교해서 높은 열민감성을 가져 뒤이은 PCR 반응에서 효과적으로 불활성화된다. 따라서 PCR 반응을 저해하지 않기 때문에, RT(Reverse Transcription, 역전사), PCR(Polymerase Chain Reaction), RT-PCR 또는 정량 PCR(qPCR)의 프리믹스(PreMIX)의 개발은 물론, 특히 낮은 온도의 멜팅 및 증폭 단계가 필요한 실험에 보다 적합한 UDG 적용 PCR 진단 키트 개발을 가능하게 한다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따라 열민감성 아미노산 잔기를 선별하기 위해 분자동역학으로부터 구한 상호작용 에너지 네트워크 그래프이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 돌연변이를 갖는 UDG 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균에서 각 목적 단백질이 발현되는 것을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3은 본원의 일구현예 따라 제조된 돌연변이를 갖는 UDG 단백질의 열민감도를 테스트하기 위해 사용한 인비트로 UDG 활성 어세이의 원리를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 도 3의 원리에 따른 분석물을 Denaturing PAGE 분석을 통해 확인한 결과로 잘려진 단일 가닥만을 특이적으로 분석 가능하다.
도 5는 본원의 일구현예 따라 제조된 돌연변이를 갖는 UDG 단백질의 열민감도를 도 3 및 도 4의 방법에 따라 측정한 결과이다.
도 6은 도 5에서 선별된 D43A, K57A, E157A 및 E215A 돌연변이 UDG의 열민감도를 도 3 및 도 4의 방법에 따라 측정한 결과이다. D43A과 K57A 클론에서 야생형보다 약 3~5배 이상 활성을 더 많이 잃어버리고(0.2 ng 기준). E157A와 E215A의 경우에도 야생형에 비해 열에 의한 활성저하가 약 30% 정도 더 큰 것으로 나타났다.
도 7은 D43A 돌연변이의 열민감도를 방사성 동위원소를 이용하여 측정한 결과이다. 야생형의 경우 약 50%의 활성이 감소하는데 15분 가까이 소요되었으나, D43A 클론의 경우 최초 2분 열처리에 의해 70% 이상 활성이 감소되고 5분부터는 90% 이상 활성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 돌연변이 UDG의 열민감도가 야생형에 비에 월등히 높음을 확인할 수 있었다.
도 8은 야생형과 D43A 돌연변이 UDG의 melting temperature의 차이를 측정하기 위해 J-815 CD spectrometer(Jasco, Japan)를 이용하여 circular dichroism(CD) 분석을 실시한 결과로 WT의 Tm은 약 44℃, D43A 돌연변이의 Tm은 약 39℃로 측정되었다. 이 결과는 D43A 돌연변이가 야생형보다 효소의 3차원적 구조 안정성이 낮다는 것을 의미하며, 따라서 돌연변이의 높은 열민감성을 뒷받침하는 결과이다.
도 9는 돌연변이와 야생형 UDG의 다양한 생화학적 특성들을 다양한 버퍼 조건에서 측정한 결과로, pH를 6.6에서 9까지 달리하여 UDG의 활성 변화를 측정한 결과 D43A 돌연변이와 야생형에서 모두 효소 활성에 큰 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.
도 10은 돌연변이와 야생형 UDG Salt 농도에 따른 활성 영향도를 평가하기 위해 NaCl 농도를 20에서 250 mM 까지 달리하여 활성을 측정한 결과로, 야생형과 돌연변이 UDG 모두 낮은 salt 농도에서 높은 활성을 보였으며 salt 농도가 높아질수록 활성이 저해되는 것으로 나타났다. 특히 200 mM 이상에서는 20 mM 에서의 UDG 활성의 20% 정도만을 나타내는 것으로 나타났으며 이러한 염에 의한 활성 저해 효과는 야생형과 돌연변이 모두 유사한 것으로 확인되었다.
도 11은 돌연변이와 야생형 UDG의 이가 금속이온의 농도에 따른 효소의 활성 변화를 측정하였다. 이를 위해 MgCl2, CaCl2, ZnCl2, CoCl2, MnCl2를 0.01에서 1 mM 까지 다양한 농도로 사용하였다. 실험 결과 야생형과 돌연변이 UDG 모두 이가 금속이온의 농도가 증가할수록 활성이 거의 저해되는 것으로 나타났으나, 돌연변이와 야생형 UDG 간의 divalent metal ion 농도에 따른 활성 저해도의 차이는 거의 없는 것으로 나타났다.
도 12는 돌연변이와 야생형 UDG의 ZnCl2와 CoCl2의 농도에 따른 효소의 활성 변화를 측정한 결과이다. ZnCl2와 CoCl2의 경우에는 각각 0.05 mM 과 0.2 mM 에서 95% 이상 효소의 활성이 억제되는 것으로 나타났다.
도 13은 야생형과 돌연변이 UDG의 최적 반응온도를 확인하기 위해 5~95℃까지 5℃ 간격으로 효소의 활성을 측정하였다. 실험 결과 야생형과 돌연변이 모두 45℃에서 최적 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나 열민감성이 높은 것으로 확인된 D43A 돌연변이의 경우 35℃에서의 활성이 55℃ 활성의 약 3배 정도로 측정되어(야생형의 경우 거의 동일) 전반적인 최적 활성 온도가 야생형에 비해 낮은쪽으로 편향되어 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 D43A 돌연변이의 열민감성이 야생형에 비해 높기 때문에 나타난 것이라고 판단된다.
도 14는 Realtime PCR에서 돌연변이와 야생형 UDG에 의한 PCR 효율 저해 효과를 분석한 결과이다. 야생형 UDG를 사용한 경우 반응에 첨가한 UDG 양에 비례하여 Ct(Cycle threshold) 값이 증가하였고, 이는 UDG 반응 과정 이후의 전변성 단계에서 야생형 UDG가 완전히 불활성화되지 않아 이후의 PCR 증폭 단계에서 증폭된 산물을 분해하고 있음을 의미한다. 그러나 본원의 돌연변이 UDG는 야생형에 비해 높은 열민감성을 나타냈으며 특히 D43A와 K57A 돌연변이의 경우 PCR 과정 중에 존재하는 95℃ 반응 조건에서 빠르게 불활성화되어 첨가한 UDG의 양에 따른 Ct 값의 변화가 거의 없음을 확인할 수 있었다.
도 15는 본원의 일 구현예에 따라 제조된, D43 위치가 C, G, K, H, I, P, R, V, W 아미노산으로 치환된 돌연변이 UDG를 발현, 정제한 결과이다. 상기 돌연변이에 대한 In vitro UDG activity assay 결과는 도 15 및 도 16에 기재되어 있다.
도 16은 도 15에서 제조된 돌연변이 UDG의 열민감도를 In vitro UDG activity assay로 분석한 결과이다. D43 위치를 각각 H, R, V, W 로 변경시켰을 때 야생형대비 각각 53, 52, 32, 65배 열민감도가 증가하는 것으로 나타났으며, D43A 의 경우 기존 실험 결과와 유사하게 열민감도가 약 8배 증가하였으며, 나머지 C, G, K, I, P 돌연변이도 정도의 차이는 있었으나 야생형 대비 약 3~15배 정도 열민감도가 증가하는 것으로 나타났다.
도 17은 도 16의 결과를 야생형과 비교하여 열민감도 증가 배수로 나타낸 것이다.
도 18은 D43A, E157A, E215A, L162A, L183A, K57A 및 K171A 번째 잔기로부터 선택되는 두 개이상의 돌연변이를 포함하는 UDG의 열민감도를 측정한 결과이다. D43A/K57A, D43A/E157A, D43A/E215A, D43A/K57A/E157A, D43A/E157A/E215A, D43A/K57A/E157A/E215A 돌연변이에서 모두 야생형보다 2배 이상 증가된 열민감성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 D43A를 포함하지 않는 조합 돌연변이의 경우 열민감성 증대 효과가 1.5배 이내인 것으로 나타났다 이러한 결과는 D43 위치의 돌연변이가 E. coli UDG의 열적안정성 결정에 중요함을 나타낸다.
도 19는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 E4, W7, Y19, F48, E52, H67, Q71, H73, F77, R80, P87, L96, E112, L121, F144, F161, G214 위치를 알라닌, 글루탐산, 알지닌 또는 트립토판으로 변화시킨 총 19종의 돌연변이 UDG의 열민감도 측정결과이다. W7A, E52A, G214W 돌연변이 효소의 경우 야생형 대비 각각 6.9배, 14.2배, 9.3배 열민감도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 외에 Y19A, F48A, Q71A, H73A, E112A, F144A, F161A, G214R 돌연변이들의 경우에도 열민감성이 약 2배 이상 증가하는 것으로 나타났다.
도 20은 본원에 따른 D43A D43C, D43H, D43R, D43V, D43W UDG와 야생형 UDG의 열민감도 및 불활성화 후 재활성화 여부를 측정한 결과이다. 야생형 UDG의 경우 55℃ 열처리 이후에도 22%의 활성을 보유하는 것으로 확인되었으나, 본원에 따른 UDG는 45℃에서 90% 이상 불활성화되는 것을 확인할 수 있었다. 나아가 야생형 UDG의 경우 65℃와 75℃에서 완전히 불활성화 되었으나 85℃와 95℃ 열처리 이후에는 일부 활성이 남아있는 것(재활성화)을 확인할 수 있었으나, 본원에 따른 UDG는 이러한 현상이 나타나지 않았다. 이는 본원의 UDG가 높은 열민감성으로 인해 가장 효과적으로 불활성화되고 재활성화되지 않아 RT는 물론 PCR 반응에 사용시 PCR을 저해하지 않아 그 효율을 가장 효과적으로 높일 수 있음을 나타낸다.
본원은 대장균 UDG(Uracil DNA glycosylases)의 특정 잔기에 돌연변이를 도입하여 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질의 개발에 근거한 것이다.
PCR과 같은 증폭 반응에서는 실제 주형이 아닌, 이미 한번 증폭된 산물이 검체에 오염되어 증폭되는 경우가 빈번하게 발생하고, 이로 인해 위양성(false positive)이 초래된다. 이를 방지하기 위해, 통상적으로, 증폭된 DNA는 dUTP를 포함하도록 하고, 새로운 증폭반응에서 증폭된 DNA의 오염물은 반응 초기에 UDG에 의해 제거되고, 그 뒤 UDG는 불활성화되나, 열민감도가 낮을 경우 불활성되지 않고 남아 PCR의 증폭 효율을 감소시키는 문제가 있다.
본원에서는 대장균 유래 UDG의 특정 잔기에 치환 돌연변이를 도입한 결과, 야생형과 비교하여 열민감도가 향상되어 상대적으로 낮은 온도에 수행되는 뒤이은 PCR 반응에서도 불활성되기 때문에, PCR의 증폭 효율을 감소시키는 기존의 문제를 해결하였다.
이에 한 양태에서 본원은 서열번호 1의 서열로 표시되는 대장균 유래의 야생형 UDG 단백질에 E4A, W7A, E13A, Q16A, Y19A, D43X, F48A, F50A, E52A, H67A, K57A, Q71A, H73A, P87A, L96A, E112A, L121A, H134A, E142A, F144A, R156A, F161A, L162A, W164A, H180A, L183A, H202A, G214E, G214W, G214R, W220A, 및 L224A로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환이 도입된, 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질에 관한 것이다.
본원에서 아미노산 잔기는 당업계에 공지된 알파벳 단문자로 나타내며, 야생형 잔기는 잔기 위치를 나타내는 숫자 왼쪽에, 치환된 잔기는 오른쪽에 나타내고, 상기 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다. 알파벳 단문자는 다음의 아미노산을 나타낸다: A, 알라닌 Alanine; R, 알지닌 Arginine; N, 아스파라진 Asparagine; D, 아스파르트산 Aspartic acid; C, 사이토신 Cysteine; E, 글루탐산 Glutamic acid; Q, 글루타민 Glutamine; G, 글라이신 Glycine; H, 히스티딘 Histidine; I, 아이소루이신 Isoleucine; L, 루이신 Leucine; K, 라이신 Lysine; M, 메티오닌 Methionine; F, 페닐알라닌 Phenylalanine; P, 프롤린 Proline; S, 세린 Serine; T, 쓰레오닌 Threonine; W, 트립토한 Tryptophan; Y, 타이로신 Tyrosine; V, 발린 Valine; X, 임의의 아미노산.
본원에서 사용된 용어 “유라실 DNA 글리코실라제(Uracil DNA glycosylases, UDG)”는 DNA 합성 중에 dUTP가 편입되어 들어가는 경우, 염기 유라실과 당인 데옥시라이보스간의 글라이코스(glycosidic) 결합을 절단하는 효소를 일컫는 것으로, UDG는 자유 dUTP, 자유 데옥시유리딘, 또는 RNA에는 작용하지 않는다.
일 구현예에서 본원에 따른 돌연변이 UDG 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 기준으로 43번째 위치에 아미노산 치환을 포함하는 것이다. 이를 위해 E. coli UDG와 구조적 유사성이 높은 다양한 효소들을 다중서열정렬 및 상용 웹서버를 이용한 안정성 분석을 통해 D43 위치에 돌연변이를 유발하였을 때 가장 열안정성을 감소시킬 것으로 계산된 8종의 아미노산 잔기를 선별하였다. 본원에서는 야생형 아스파르트산 잔기(D)를 A, C, G, K, H, I, P, R, V 또는 W 중 어느 하나로 치환한 경우 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질을 수득하였으며, 상기 다양한 잔기는 수 개의 화학적 성질로 그룹핑 될 수 있는 20개 아미노산 잔기를 대표할 수 있는 것으로, 이에 43번째 잔기에서 야생형인 D를 제외한 임의의 아미노산으로 치환된 돌연변이 UDG를 포함한다.
다른 구현예에서 본원에 따른 돌연변이 UDG 펩타이드는 57번째 위치에 아미노산 치환을 포함하는 것이다. 일 구현예에서 야생형 57번째 위치에는 라이신(K) 잔기는 알라닌 또는 이와 크기적 화학적 측면에서 유사한 글라이신(G)로 치환된 것이다.
본원에서 구축된 돌연변이 UDG의 아미노산 서열에 해당하는 서열번호는 다음 표와 같다.
[표 1]
Figure 112019080297538-pat00001
다른 구현예에서 본원에 따른 돌연변이 UDG는 두 개 이상의 돌연변이를 조합으로 포함한다.
일 구현예에서 두 개 이상의 돌연변이를 조합으로 포함하는 경우, 43번 위치에서의 돌연변이를 포함하고, 이에 추가하여 K57A, E157A 또는 E215A를 조합으로 포함한다.
일 구현예에서는 D43A/K57A, D43A/E157A, D43A/E215A, D43A/K57A/E157A, D43A/E157A/E215A, 또는 D43A/K57A/E157A/E215A나 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 돌연변이 UDG 펩타이드는 위와 같은 서열로 한정되는 것이 아니며, 이의 생물학적 균등물(biological equivalents)를 포함하는 것이다. 생물학적 균등물이란, 본원에 개시된 아미노산 서열에 추가적인 변형을 가하였으나, 본원에 따른 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것으로, 이러한 변형은, 예를 들어 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하는 것이다.
일 구현예에서는 본원에 따른 돌연변이 UDG 펩타이드에 보존적 아미노산 치환이 일어난 것을 포함한다. 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이란 특정 폴리펩타이드가 갖는 활성을 실질적으로 영향을 미치거나 감소시키지 않는 치환을 의미하는 것이다.
보존적 아미노산 치환은 당업계에 알려진 것으로 예를 들면 Blosum (BLOcks SUbstitution Matrix) 기반한 표 2에 기재된 바와 같으며, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds); 및 Henikoff, S.; Henikoff, J.G. (1992). "Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks". PNAS 89 (22): 10915-10919. doi:10.1073/pnas.89.22.10915; WO2009012175 A1 등에 기재된 것을 참조할 수 있다.
[표 2]
Figure 112019080297538-pat00002
나아가 상술한 바와 같은 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 후술 하는 바와 같이 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본원에 개시된 것과 실질적 동일성을 갖는 것도 포함된다. 실질적 동일성은 본원에 개시된 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본원에 따른 돌연변이 UDG는 RT, PCR 또는 RT-PCR 반응 전에 사용되어, 특히 핵산의 캐리오버 오염을 제거한다.
본원에서 사용된 용어 RT(Reverse Transcription, 역전사)는 mRNA로부터 상보성 DNA(cDNA)를 합성하는 반응이다. 이를 위해 역전사 효소(Reverse Transcriptase)가 사용되며, 반응 조건은 일반적으로 약 42~60℃에서 약 30분간 수행된다. 역전사 효소는 시중에서 구매할 수 있다. 역전사 반응에서 합성된 cDNA는 PCR 반응의 주형(template)으로 사용되기 때문에 RT 반응에서 오염을 제거하는 것이 중요하며, 또한 뒤이은 PCR 반응을 방해하지 않는 것이 또한 중요하다. 특히 하나의 시험관에서 수행되는 원스텝 RT-PCR에서 유리하게 작용할 수 있다. RT-PCR에서 본원에 따른 UDG와 RT-PCR 반응물을 15~55℃에서 약 10분 동안 반응한 후 약 42~60℃에서 약 30분간 RT 반응을 수행하고, 이후 연결해서 92~95℃에서 ~0.5분(변성 denaturation), 50~65℃에서 ~1분(어닐링 annealing), 70~74℃에서 ~1분/kb를 1 사이클로 해서 25~40 사이클 수행할 수 있다. 기존의 UDG의 경우는 UDG와 RT의 반응 온도가 겹치기 때문에 RT-PCR에 사용하지 못했는데, 본원에 따른 UDG는 RT 반응의 온도에서(예를 들어 42℃)에서 상당부분 불활성화 되어 RT-PCR에 사용 가능할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 PCR(Polymerase Chain Reaction)은 특정 핵산을 증폭하는 방법으로 생물학, 생화학 및 의학분야에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이다(Yamamoto, Y. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002, 9 (3), 508-514). PCR은 변성, 프라이머 결합 및 신장으로 구성되는 세 가지 단계를 한 사이클로 해서 여러 사이클로 반복되며, 각 단계는 이에 적합한 온도에서 수행된다. PCR에 가장 널리 사용되는 효소는 Thermus aquaticus 유래의 Taq DNA 중합효소이며, 높은 온도에서 열안정으로 인해 효율적이고 안정적인 PCR을 가능하게 한다. 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다.
이에 다른 측면에서 본원은 본원에 따른 돌연변이 UDG 단백질을 포함하는 RT, RT-PCR 또는 PCR 반응에서 반응물의 핵산 오염 제거용 키트 또는 조성물에 관한 것이다.
또는 다른 측면에서 본원은 본원에 따른 돌연변이 UDG 단백질을 포함하는 RT, RT-PCR 또는 PCR 반응용 키트 또는 조성물에 관한 것이다.
본원에 따른 조성물은 프리믹스의 형태로 제공될 수 있다. 프리믹스는 RT(Reverse Transcription, 역전사), PCR(Polymerase Chain Reaction), RT-PCR 또는 정량 PCR(qPCR) 등에 본원에 따른 UDG 또는 이를 포함하는 조성물이 사용되는 경우, 상기 각 반응에 필요한 각각의 구성요소들이 제조단계에서 이미 혼합되어 농축된 형태로 사용자에게 공급되는 시약으로 이러한 프리믹스를 이용할 경우 사용자는, 예를 들면 PCR의 경우 프리믹스는 본원에 따른 UDG에 추가하여 PCR 반응에 필요한 내열성 중합효소, dNTP 및 완충용액(버퍼)를 포함하고 사용자는 주형 DNA, 프라이머 및 정제수만 추가로 첨가하여 사용할 수 있다. PCR 프라믹스는 본원에 따른 UDG, Taq 중합효소, dNTP, Mg2+ 또는 Mn2+와 같은 2가 양이온, 염, 완충액, 보존제 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 성분 중에서 염의 예로는 KCl, NaCl, Ammonium sulfate, 완충액의 예로는 Tris-HCl, Sodium-/Potasium phosphate, 보존제의 예로는 Glycerol, 첨가제의 예로는 DMSO를 들 수 있으나 특별히 이들로 제한되는 것은 아니다. 구체적 사용 목적이나 용도에 따라 본원에 따른 조성물은 또 다른 활성을 가지는 효소와 함께 섞일 수 있으며 예를 들어, Pfu DNA polymerase, dUTPase, Pyrophosphatase, Reverse Transcriptase, DNase/RNase Inhibitor와 함께 사용될 수 있으며,이 경우 해당 효소의 활성을 나타내기 위해 필요한 조성물이 추가로 사용될 수 있거나, 변경될 수 있다.
또 다른 측면에서 본원은 본원에 따른 UDG 단백질을 이용한 RT(Reverse Transcription, 역전사), PCR(Polymerase Chain Reaction), RT-PCR 또는 정량 PCR(qPCR)의 반응에서 핵산 오염 제거 방법 또는 PCR 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 UDG는 야생형보다 최적 반응 온도 및 불활성화 온도가 약 5 내지 10℃ 정도 낮아 적절한 양의 효소를 사용할 경우 일반적으로 42~50℃에서 수행하는 RT 반응과 결합된 One-step RT-PCR/RT-qPCR에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한 낮은 멜팅 및 증폭이 하나의 단계로 수행되는 PCR 반응에 유리하게 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 본원에 따른 UDG를 이용한 핵산 오염 제거 반응은 15℃ 내지 55℃, 또는 35 내지 45℃, 특히 40℃에서 수행될 수 있다.
본원에 따른 돌연변이 UDG는 RT 반응에서 불활성화 될 수 있다. RT 반응은 일반적으로 42℃에서 진행하고 경우에 따라 60℃까지 에서도 수행된다. 특히 일 구현예에서 D43A, D43C, D43H, D43R, D43V, D43W는 45℃에서 활성이 100% 감소하였기 때문에(도 20) 42℃에서 진행되는 RT 반응 이전에 불활성화가 시작되므로 RT 반응을 저해하지 않아 RT-PCR에 적용 시 특히 유리할 수 있다.
본원에 따른 돌연변이 UDG는 PCR에 사용되는 온도에서 불활성화 된다. PCR은 변성/프라이머 결합(annealing)/신장의 각 단계에 특정 온도가 필요한데, 특히 다수 개 세트의 프라이머를 이용하는 Multiplex Realtime PCR 의 경우 TaqMan 프로브 서열 설계의 한계 때문에 비교적 낮은 온도(약 50℃ 이하)에서 어닐링(annealing) 반응을 수행해야 하는 경우가 있다. 이때 대장균 유래 UDG 효소의 경우 해당 온도에서 활성을 보이고, 열처리(최초 변성 온도) 이후에도 활성을 나타내기 때문에, PCR의 증폭 효율을 현저하게 낮춘다. 본원에 따른 UDG는 본원 도 14에 기재된 것과 같이, 특히 약 50℃ 이하의 어닐링 반응이 수행되는 PCR에 유용하게 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 UDG를 사용하는 PCR 방법은 약 50℃ 이하, 예를 들면 약 45℃ 내지 약 50℃에서 수행되는 어닐링 반응을 포함하는 PCR 반응에 사용될 수 있다. 또한 어닐링과 DNA 합성이 하나의 단계로 진행되는 투스텝 PCR에도 유용할 수 있다.
일 구현예에서 PCR에서 PCR 반응 시작 전에 사용되어 반응물의 핵산 오염을 제거한다. 예를 들면 약 15~55℃에서 약 10분 동안 본원에 따른 UDG로 처리하여 반응물의 오염을 제거하고, 이어 약 92~95℃에서 약 0.5분(denaturation) 처리로 UDG를 완전히 불활성화시키며, 주형을 변성하고, 약 50~65℃에서 약 1분(annealing), 약 70~74℃에서 약 1분/kb를 1 사이클로 해서 25~40 사이클을 수행한다.
다른 구현예에서 원스텝 RT-PCR에 사용되며, 약 15~55℃에서 약 10분 동안 UDG로 처리하여 반응물의 핵산 오염을 제거하고, 이어 약 42~60℃에서 약 30분간 RT 반응을 수행할 수 있으며, 이러한 RT 온도에서 본원에 따른 UDG는 상당부분 불활성화되어 원스텝 RT-PCR에 효과적으로 사용가능한다. 이후 연결해서 약 92~95℃에서 약 0.5분(denaturation), 약 50~65℃에서 약 1분(annealing), 약 70~74℃에서 약 1분/kb를 1 사이클로 해서 25~40 사이클 수행하다.
또 다른 구현예에서는 RT 또는 RT-PCR 반응에서 UDG 반응 단계가 생략된다. 예를 들면 상온에서 상기 반응을 위한 프리믹스를 준비하는 동안 상온에서 UDG 반응이 일어 날 수 있고, 본원에 따른 UDG는 뒤이은 반응에서 효과적으로 불활성된다.
다른 측면에서 본원은 또한 상술한 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 서열은 단백질 서열이 결정되는 경우 공지된, 20개의 아미노산을 코딩하는 코돈서열로부터 용이하게 결정될 수 있는 것이다. 하나의 아미노산을 코딩하는 복수개의 코돈이 존재하는 경우, 생물 종에 따라 선호적으로 사용되는 코돈의 종류도 알려진 것으로, 본원에서는 대장균에서 선호되는 코돈을 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 도출할 수 있다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드는 다양한 목적 예를 들면 생산을 위해 적절한 벡터에 도입되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절서열, 예를 들면 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열에 작동 가능하게 연결되어 사용될 수 있다. 이러한 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드가 도입될 수 있는 벡터 또는 플라스미드는 숙주에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되는 것은 아니며, 구체적 목적에 맞추어 공지된 임의의 벡터가 사용될 수 있으며, 천연, 또는 재조합 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 벡터, 예컨대 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pET-21a, pET-32a 벡터 등을 사용할 수 있다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 적당한 숙주 내로 도입되어 사용될 수 있으며, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 세포는 특히 원핵세포를 포함한다. 예를 들면, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포를 포함한다.
본원에 따른 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현을 위해 다양한 형태로 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(Expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또 다른 측면에서 본원은 또한 상기 재조합 세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 상기 배양된 세포 또는 배양물로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 본원에 따른 돌연변이 UDG 단백질의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 세포를 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160시간 동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.
본 발명에서, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 폴리펩타이드를 수집할 수 있다.
본 발명은 달리 언급이 없는 한 분자생물학, DNA 재조합기술의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 다음의 책 및 문헌을 참조할 수 있다. 분자생물학 및 생화학에 관한 일반적인 방법에 관해서는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds.,John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press)등을 참조할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. UDG 구조 분석을 통한 열민감성 아미노산 잔기 선별
XRD 실험으로 밝혀진 E. coli 유래 UDG 단백질의 3차원 구조를(PDB code: 2EUG) 슈퍼컴퓨팅을 이용하여 분자동역학 시뮬레이션을 수행하였다(분자 동역학 시뮬레이션은 이미 주어진 force field를 거리에 대해 미분하여 단백질을 구성하는 모든 원자들 사이의 힘을 구하고, 뉴턴의 법칙을 이용하여 분자의 운동을 기술하는 시뮬레이션이다. (F=ma=-dU/dx)). AMBER force-field를 이용하여 주어진 온도에서 단백질의 구조들의 집합을 분자동역학 시뮬레이션으로 구하고, 이로부터 단백질을 구성하는 아미노산 잔기들 사이의 모든 상호작용 에너지, 즉 에너지 네트워크를 계산하였다.
도 1은 시뮬레이션으로부터 추출된 아미노산 잔기들 간의 에너지 네트워크를 나타내고, 이에 대하여 Laplacian network clustering 분석을 수행하여 에너지 네트워크의 허브를 구하여 아래와 같이 구조 안정성에 중요한 아미노산 리스트를 선별하였다: E13, Q16, D43, F50, K57, I60, E97, N107, H134, E142, R156, E157, L162, W164, K171, Q178, R179, H180, L183, H202, E215, W220, L224. Laplacian network clustereing은 주어진 네트워크에서 i,j가 연결이 되어 있으면 weight를 부여하고 그렇지 않으면 0의 값을 갖는 인접행렬(Aij, Adjacency Matrix)과, 행렬의 대각 성분 i,i가 노드 i와 연결된 weight의 합이며 나머지 비대각성분은 모두 0인 Degree Matrix(Dij)를 구한다. 그리고 라플라시안 행렬 Lij=Dij-Aij로 정의한다. 그리고 라플라시안 행렬의 성질을 이용하여 clustering을 하고 허브를 구한다 (Lij를 대각화하여 nonzero lowest eigenvalue에 해당하는 eigenvector의 값이 같은 성분들이 그룹을 나타내고, a few largest eigenvalue에 해당하는 eigenvector에서 값이 큰 성분들이 hub로 정의한다.).
실시예 2. 열민감성 유발 후보 돌연변이 UDG 클로닝 및 단백질 발현
실시예 1에서 선별된 잔기가 각각 알라닌으로 치환된 UDG 유전자를 다음과 같이 제조하였다. 이를 위해 야생형 E. coli UDG 유전자(서열번호 2)에 EZchange™ Site-directed Mutagenesis Kit (Enzynomics) 및 표 3의 프라이머를 사용자의 지시대로 사용하여 선별된 잔기에 인위적으로 점 돌연변이를 도입하였다. 정확한 돌연변이가 도입되었는지 서열분석으로 확인하였다(제노텍 또는 바이오닉스).
[표 3] 본원에 따른 돌연변이 UDG 구축 및 분석에 사용된 프라이머 세트
Figure 112019080297538-pat00003
Figure 112019080297538-pat00004
Figure 112019080297538-pat00005
Figure 112019080297538-pat00006
이어 상기와 같이 제조된 24종의 돌연변이 UDG 단백질을 다음과 같이 발현하였다. 상기 24종의 열민감성 UDG 후보 유전자를 포함하는 발현 벡터를 각각BL21(DE3)RIL 균주에 칼슘 클로라이드 히트쇽 형질전환을 하였다. 이어 상기 형질전환된 단일 대장균 콜로니를 37℃에서 OD600=0.5~1이 되도록 배양한 후 1 mM IPTG 를 첨가하여 4시간 동안 배양하여 단백질을 발현시켰다. 이어 원심분리를 통해 세포 펠렛을 확보하고 소니케이션을 통해 세포를 파쇄한 뒤 다시 한 번 원심 분리하여 가용성 분획과 불용성 분획을 SDS-PAGE 방법으로 분석하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 야생형을 포함하여 총 25종의 시료에서 목적 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 3. 후보 돌연변이 UDG의 열민감도 측정
이어 실시예 2에서 발현된 UDG 단백질 24종 중에서 열민감도가 증가된 돌연변이가 있는지 확인하기 위해 In vitro UDG activity assay를 수행하였다. 해당 실험은 5‘ 끝부분에 FAM 형광 물질이 표지되어 있고 가운데에 dU를 하나 포함하고 있는 완전히 상보적인 이중가닥 DNA를 기질로 사용하는 실험방법이다(도 3 및 도 4 참조).
이를 위해 총 20 ul의 반응액에 10X USE Reaction buffer (EZ™ USE Enzyme, Enzynomics), Endonuclease VIII (Enzynomics) 100 ng, 이중가닥 형광 dU 기질 20 pmol을 혼합하여 준비하였다. 여기에 95℃에서 5~15분간 열처리 또는 열처리를 하지 않은 야생형 및 돌연변이 UDG를 넣어주고 37℃에서 15분간 반응시키면 UDG에 의해 dU의 uracil 염기가 잘려나가 abasic site가 형성된다. 다음으로, 과량의 Endonuclease VIII에 의해 abasic site가 절단되어 첨가한 UDG의 활성에 비례하여 이중가닥 DNA의 한쪽 가닥이 잘려지게 된다(도 3). 해당 반응액을 Denaturing PAGE 분석을 통해 확인하면 잘려진 단일 가닥만을 특이적으로 분석 가능하다(도 4).
상기와 같은 In vitro UDG activity assay 방법으로 불용성 단백질을 생산하는 돌연변이 클론을 제외한 23종의 후보 돌연변이 UDG와 야생형 UDG에 대한 열민감도 테스트를 수행하였다. 분석에는 발현된 가용성 분획을 정제과정 없이 정량만 하여 사용하였다.
열민감성 증가율은 다음과 같은 수식으로 계산하였다;
[열처리 이후 50% 기질을 절단하기 위해 필요한 효소의 양] / [열처리 이전 50% 기질을 절단하기 위해 필요한 효소의 양].
결과는 도 5에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 D43A와 K57A 돌연변이가 각각 야생형 대비 50% 이상의 열민감성이 증가하였으며 H134A, E142A, W164A, H180A, L183A, H202A, L224A도 야생형 대비 10% 이상 열민감성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 각 돌연변의 UDG 의 특이적 활성도는 W164A 클론을 제외하면 야생형 대비 50% 이내로 측정되어 PCR 실험 적용에 적합한 것으로 확인되었다(Data not shown).
실시예 4. 돌연변이 UDG 정제 및 열민감도 측정
(1) 정제
In vitro UDG activity assay 방법을 통한 열민감성 평가 실험을 바탕으로 향후 추가 개발 및 평가를 위해 50% 이상의 열민감성 증가가 확인된 D43A와 K57A, 그리고 야생형과 유사한 열민감성을 가진 것으로 평가된 E157A와 E215A 및 야생형 UDG 총 5종의 단백질에 대한 정제 작업을 수행하였다. 약 50 mg의 발현된 UDG가 포함된 soluble extract를 1 ml의 Ni-NTA resin (Qiagen)와 혼합하여 4℃ 저온조건에서 3시간 동안 overhead rotation 하여 UDG와 Ni-NTA resin의 binding을 유도하였다. 이후 gravity column (Bio-rad)으로 혼합액을 옮긴 후, 20 column volume의 W1 buffer (CB2000 + 5 mM IDZ), 20 column buffer의 W2 (D.W), 10 column volume의 W3 (2M NaCl + 40% Ethylene glycol), 10 column volume의 W4 buffer (CB300 + 20 mM IDZ)으로 순차적으로 washing 하였다. 최종적으로 60 mM IDZ가 포함된 W4 buffer와 250 mM IDZ가 포함된 Elution buffer를 사용하여 단백질을 elution 하였다.
이를 통해 야생형 UDG와 돌연변이 UDG 4종이 포함된 총 5종의 UDG 효소를 정제하였다. 야생형 UDG의 경우 최고 1.37 mg/ml (137,000 unit/ml), D43A의 경우 최고 1.51 mg/ml (151,000 unit/ml), K57A의 경우 최고 2.32 mg/ml (232,000 unit/ml), E157A의 경우 최고 1.67 mg/ml (167,000 unit/ml), E215A의 경우 최고 1.63 mg/ml (163,000 unit/ml)의 농도를 확보하였다. 확보된 UDG의 평균 순도는 SDS-PAGE 실험 결과 약 90~95% 범위임을 확인할 수 있었다.
(2) In vitro UDG 활성 분석을 이용한 열민감도 측정
후보 돌연변이 UDG 의 열민감성을 보다 정확하게 측정하기 위해 정제된 돌연변이 UDG를 사용하여 In vitro UDG activity assay를 수행하였다. 도 3 및 도 4와 동일한 방법으로 실험을 진행하였으며 첨가된 UDG의 양은 0.2, 1, 2, 5 ng 순으로 증가시켜 사용하였다. 결과는 도 6에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 열처리 이전에는 야생형과 돌연변이 UDG에 상관없이 모두 0.2 ng과 1 ng 사이에서 사용된 기질을 98% 이상 절단하는 것을 확인하였다. 그러나 95℃에서 15분간 열처리 과정을 먼저 진행한 경우에는 D43A과 K57A 클론에서 야생형보다 약 3~5배 이상 활성을 더 많이 잃어버리는 것을 확인할 수 있었다 (0.2 ng 기준). E157A와 E215A의 경우에도 야생형에 비해 열에 의한 활성저하가 약 30% 정도 더 큰 것으로 관찰되었다 (0.2 ng 기준).
(3) 방사성 동위원소를 이용한 열민감도 측정
돌연변이 UDG의 열민감성 증가도를 보다 직접적으로 확인하기 위해 방사성 동위원소를 활용한 활성 측정 실험을 수행하였다. 이를 위해 가장 먼저, 방사성 동위원소로 표지된 기질을 준비하였다. 기질 준비를 위해 쓰인 DNA의 서열은 다음과 같다. 기질 1: 5’-GGA ACA ATT CUG CGG CTT TAG-3‘ (서열번호 160), 기질 2: 5’-CTA AAG CCG CAG AAT TGT TCC-3‘ (서열번호 161). 먼저 기질 1 올리고뉴클레오티드를 20 pmol을 8.25 pmol의 [γ-32P] ATP와 polynucleotide kinase (Enzynomics)를 이용하여 표지하였다. EDTA를 넣어 반응을 중단시킨 후 기질 2 올리고뉴클레이티드를 20 pmol 만큼 더 첨가하였다. 해당 반응액을 최종 1X Annealing buffer [125 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5)] 조건으로 혼합하여 PCR machine을 이용하여 두 단일가닥 DNA를 이중가닥 DNA로 혼성화시켰다. 최종적으로 10% SDS-PAGE 및 gel purification을 통해 순수하게 분리하였다.
이렇게 준비한 기질을 이용하여 야생형과 돌연변이 UDG의 열처리 이전과 이후의 활성을 평가하였다. 먼저 200 fmol/ul로 준비된 정제된 야생형 및 D43A 돌연변이 효소를 95℃에서 0, 2, 5, 10, 20분 동안 열처리하였다. 이후 이들 각각 1 ul 씩 사용하여 총 20 ul의 반응액에서 (20 mM Tris-HCl (pH 7.8), 0.1 mM DTT, 1 mM EDTA) 15 fmol의 기질과 반응시켰다. 반응은 25℃에서 10분간 진행되었으며, 그 후 동일한 부피의 2X stop solution을 첨가하여 반응을 중단하였다. 반응물들을 끓는 물에서 20분간 처리한 후 3M HCl을 2 ul 첨가하여 염 농도를 중화하였다. 마지막으로 반응물 8 ul를 15% denaturing gel에 1X TBE를 넣고 35W에서 30분간 전기영동하여 분리하였다. 최종 전기영동산물을 85℃에서 2.5시간 동안 3MM (Whatman) 종이 위에 진공으로 말린 후 Phosphoimager 및 X-ray 필름을 이용하여 분석하였다.
결과는 도 7에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 야생형의 경우 약 50%의 활성이 감소하는데 15분 가까이 소요되었으나, D43A 클론의 경우 최초 2분 열처리에 의해 70% 이상 활성이 감소되고 5분부터는 90% 이상 활성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 돌연변이 UDG의 열민감도가 야생형에 비해 월등히 높음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 돌연변이 UDG의 야생형과 비교한 Tm 분석
실시예 4에서 정제된 단백질을 이용하여 야생형과 D43A 돌연변이 UDG의 melting temperature를 분석하였다. 이를 위해 J-815 CD spectrometer (Jasco, Japan)를 제조자의 방법대로 이용하여 circular dichroism (CD) 분석을 실시하였다. 25℃에서 95℃까지 온도를 증가시키면서 2℃ 단위로 222 nm의 ellipticity를 측정하였다. 결과는 도 8에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 WT의 Tm은 약 44℃, D43A 돌연변이의 Tm은 약 39℃로 측정되어 돌연변이 UDG의 Tm이 약 5℃ 정도 낮은 것으로 확인되었다. 이 결과는 D43A 돌연변이가 야생형보다 효소의 3차원적 구조 안정성이 낮다는 것을 의미하며, 따라서 돌연변이의 높은 열민감성을 뒷받침하는 결과이다.
실시예 6. 돌연변이 UDG의 야생형과 비교한 pH, salt, divalent cation에 의한 활성 차이 분석
실시예 4에서 정제된 단백질을 이용하여 야생형과 D43A 돌연변이 UDG의 다양한 생화학적 특성들을 여러 가지 버퍼 조건에서 측정하였다. 먼저 pH를 6.6 에서 9까지 달리하여 UDG의 활성 변화를 측정한 결과 D43A 돌연변이와 야생형에서 모두 효소 활성에 큰 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다(도 9 참조).
Salt 농도에 따른 활성 영향도를 평가하기 위해 NaCl 농도를 20에서 250 mM 까지 달리하여 활성을 측정하였다. 야생형과 돌연변이 UDG 모두 낮은 salt 농도에서 높은 활성을 보였으며 salt 농도가 높아질수록 활성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 200 mM 이상에서는 20 mM에서의 UDG 활성의 20% 정도만을 나타내는 것으로 나타났으며 이러한 염에 의한 활성 저해 효과는 야생형과 돌연변이 모두 유사한 것으로 확인되었다(도 10 참조).
마지막으로 divalent metal ion 의 농도에 따른 효소의 활성 변화를 측정하였다. divalent metal ion은 MgCl2, CaCl2, ZnCl2, CoCl2, MnCl2를 0.01에서 1 mM 까지 다양한 농도로 사용하였다. 실험 결과 야생형과 돌연변이 UDG 모두 divalent metal ion의 농도가 증가할수록 활성이 거의 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 11 및 도 12 참조). 특히 ZnCl2와 CoCl2의 경우에는 각각 0.05 mM과 0.2 mM에서 95% 이상 효소의 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 12). 그러나 돌연변이와 야생형 UDG 간의 divalent metal ion 농도에 따른 활성 저해도의 차이는 거의 없는 것으로 확인되었다.
실시예 7. 돌연변이 UDG의 최적 반응온도 분석
실시예 4에서 정제된 단백질을 이용하여 야생형과 D43A 돌연변이 UDG의 최적 반응온도를 분석하였다. 이를 위해 5~95℃까지 5℃ 간격으로 효소의 활성을 측정하였다. 결과는 도 13에 기재되어 있다. 실험 결과 야생형과 돌연변이 모두 45℃에서 최적 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나 열민감성이 높은 것으로 확인된 D43A 돌연변이의 경우 35℃에서의 활성이 55℃ 활성의 약 3배 정도로 측정되어 (야생형의 경우 거의 동일) 전반적인 최적 활성 온도가 야생형에 비해 낮은쪽으로 편향되어 있음을 알 수 있었다(도 13). 이러한 결과는 D43A 돌연변이의 열민감성이 야생형에 비해 높기 때문에 나타난 것이라고 판단된다.
실시예 8. 돌연변이 UDG의 Realtime PCR에서 UDG 에 의한 저해 효과 감소 실험
가장 널리 쓰이는 대장균 유래 UDG의 경우 Realtime PCR에 적용하였을 때 PCR 과정중에 완전히 불활성화되지 않아 PCR 증폭산물을 일부 분해함으로써 Realtime PCR의 효율을 감소시키는 부작용이 있는 것으로 관찰되고 있다.
본원에서 개발된 열민감성 UDG 돌연변이들의 경우 PCR 과정중에 빠르게 불활성화되어 이러한 부작용이 없을 것으로 예측하였다. 이를 실험적으로 검증하기 위해 아래와 같은 실험을 수행하였다. 인간 cDNA 10 ng을 주형으로 하여 GAPDH 유전자를 표적 DNA로 증폭하기 위해 Forward (5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3’)(서열번호 157), Reverse (5’-TTGACGGTGCCATGGAATTTG-3’)(서열번호 158) 프라이머와 형광 TaqMan 프로브(5‘ FAM-CCTGGTCACCAGGGCTGCTTTTAA-TAMRA 3’)(서열번호 159)를 사용하였다(제노텍, 대한민국). 유전자 증폭을 위해 표준 PCR 완충액(10 mM Tris-HCl/pH 8.3, 1.5 MgCl2, 50 mM KCl, 0.2 mM dNTP)에 야생형 Taq 폴리머라제 1 unit (50 ng/unit)과 야생형 또는 돌연변이 UDG를 0, 1, 2, 5, 10 ng를 혼합하여 사용하였다. PCR 반응은 실시간 PCR 장비(CFX96, Bio-Rad)를 사용하였으며 50℃에서 4분 UDG 반응 단계, 95℃에서 15분 전변성 단계를 거친 후 95℃에서 10초, 50℃에서 40초, 60℃에서 20초를 1 사이클로 하여 총 50 사이클을 수행하였다. 상대적 형광값은 매 사이클의 50℃, 40초 반응 후에 측정하여 나타내었다.
결과는 도 14에 기재되어 있다. 이에 나타난 것과 같이 야생형 UDG를 사용한 경우 반응에 첨가한 UDG 양에 비례하여 Ct (Cycle threshold) 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 UDG 반응 과정 이후의 전변성 단계에서 야생형 UDG가 완전히 불활성화되지 않아 이후의 PCR 증폭 단계에서 증폭된 산물을 분해하고 있음을 의미한다. 그러나 D43A와 K57A 돌연변이의 경우 PCR 과정 중에 존재하는 95℃ 반응 조건에서 빠르게 불활성화되어 첨가한 UDG의 양에 따른 Ct 값의 변화가 거의 없음을 확인할 수 있었다. 정도의 차이는 존재하였지만 E157A와 E215A 돌연변이의 경우에도 야생형보다 낮은 Ct 값 증가를 나타냄을 확인할 수 있었으며 이는 해당 돌연변이들이 야생형 UDG 에 비해 높은 열민감성을 나타냄을 의미한다.
실시예 9. 43번째 잔기에서 알라닌이외 다양한 아미노산으로의 돌연변이 제조 및 열민감성 분석
보다 열민감성이 증가한 돌연변이를 찾기위해 선별된 잔기들을 다양한 아미노산으로 변화시켜는 실험을 수행하였다. 이를 위해 E. coli UDG와 구조적 유사성이 높은 다양한 효소들을 분자동역학 시뮬레이션을 이용한 자유에너지 계산, 다중서열정렬 및 상용 웹서버를 이용한 안정성 분석을 통해 D43 위치에 돌연변이를 유발하였을 때 가장 열안정성을 감소시킬 것으로 계산된 8종의 아미노산 잔기를 선별하였다. 이들은 각각 C, G, K, H, I, P, R, V, W 였으며 실시예 2, 3과 동일하게 Site-directed mutagenesis 후 단백질 발현 및 정제를 통해 돌연변이 UDG 8종을 확보하였다. 이에 사용된 프라이머 세트는 표 3에 개시되어 있다.
이들 돌연변이 UDG를 발현한 결과는 도 15에 기재되어 있다.
이들을 이용하여 In vitro UDG activity assay를 수행한 결과를 도 16, 17에 나타내었다. 실험 결과 D43 위치를 각각 H, R, V, W로 변경시켰을 때 야생형대비 각각 53, 52, 32, 65배 열민감도가 증가하는 것을 알 수 있었다. D43A의 경우 기존 실험 결과와 유사하게 열민감도가 약 8배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 나머지 C, G, K, I, P 돌연변이도 정도의 차이는 있었으나 야생형 대비 약 3~15배 정도 열민감도가 증가하는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 결과를 통해 예측된 D43 위치에 A가 아닌 다른 아미노산을 도입하여도 야생형 대비 열민감성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 특히 H, R, V, W 돌연변의 경우 A 보다 4~8배 증가된 열민감성을 나타내었다.
실시예 10. 조합돌연변이 제조 및 열민감성 분석
다음으로 앞에서 확인된 돌연변이들을 서로 조합하였을 때 열민감성이 추가로 증대되는지 확인하기 위해 조합 돌연변이를 제작하였다. 1차로 선별된 아미노산 잔기들을 조합하여 single, double, triple, quadruple 돌연변이를 제작하였고 새로운 후보 돌연변이들을 추가하여 총 17종의 돌연변이 UDG에 대해 In vitro UDG activity assay를 수행하였다. 결과는 도 18에 기재되어 있으며, 실험 결과 D43A와 조합된 D43A/K57A, D43A/E157A, D43A/E215A, D43A/K57A/E157A, D43A/E157A/E215A, D43A/K57A/E157A/E215A 돌연변이에서 모두 야생형보다 2배 이상 증가된 열민감성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 D43A를 포함하지 않는 조합 돌연변이의 경우 열민감성 증대 효과가 1.5배 이내임을 확인하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, D43 위치의 돌연변이가 E. coli UDG의 열적 안정성 유지에 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었다.
실시예 11. 다양한 돌연변이 UDG 제조 및 열민감도 분석
보다 다양한 열민감성 UDG를 선별하기 위해 E4, W7, Y19, F48, E52, H67, Q71, H73, F77, R80, P87, L96, E112, L121, F144, F161, G214 위치를 alanine, glutamic acid, arginine 또는 tryptophan으로 변화시킨 돌연변이 UDG를 제작하였다. 선택된 잔기들은 이전 실험과 유사하게 구조를 바탕으로 free energy 계산에 의해 예측되었다.
결과는 도 19에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 정제된 총 19종의 돌연변이 UDG의 열민감성을 기존에 확인된 D43A 돌연변이와 비교/측정한 결과 W7A, E52A, G214W 돌연변이 효소의 경우 야생형 대비 각각 6.9배, 14.2배, 9.3배 열민감도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 외에 Y19A, F48A, Q71A, H73A, E112A, F144A, F161A, G214R 돌연변이들의 경우에도 열민감성이 약 2배 이상 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
실시예 12. 본원의 돌연변이 UDG와 야생형 UDG의 불활성화 온도 및 재활성화 여부 분석
본원에 따른 돌연변이 UDG 중에서 D43A, D43C, D43H, D43R, D43V, D43W 를 대상으로 비교 실험을 수행하였다.
야생형 UDG 및 본원의 UDG는 사전 실험을 수행하여 동등한 양의 기질을 자르는 농도를 결정한 후, 35℃에서 95℃까지 10℃ 간격으로 온도를 다르게 하여 5분간 열처리 한 후 35℃, 15분 반응을 통해 UDG의 활성을 측정하였다.
결과는 도 20에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 55℃ 이상에서는 야생형 UDG를 제외한 모든 UDG가 불활성화 되는 것을 확인하였다. 야생형 UDG의 경우 55℃ 열처리 이후 22%의 활성을 보유하는 것으로 확인되었으나, 반면 본원의 D43A, D43C, D43H, D43R, D43V, D43W의 경우 해당 온도에서 완전히 불활성화되는 것을 확인할 수 있어, 열민감성이 높음을 확인할 수 있었다.
이에 더해서 D43A는 45℃에서부터, D43R과 D43V는 35℃에서부터 불활성화가 시작되는 것을 확인할 수 있어, 열민감성이 상당히 높음을 확인할 수 있었다. 이는 또한 42℃에서 진행되는 RT(Reverse Transcription, 역전사) 반응 이전에 불활성화가 시작되므로 RT 반응을 저해하지 않는 것을 나타낸다.
추가하여 야생형 UDG의 경우 65℃와 75℃에서 완전히 불활성화 되었으나 85℃와 95℃ 열처리 이후에는 일부 활성이 남아있는 것(재활성화)을 확인할 수 있었으나, 본원에 따른 UDG는 이러한 현상이 나타나지 않았다.
이는 본원의 D43A, D43C, D43H, D43R, D43V, D43W가 높은 열민감성으로 인해 효과적으로 불활성화되고 재활성화되지 않아 PCR 반응에 사용시 PCR을 저해하지 않아 그 효율을 가장 효과적으로 높일 수 있음을 나타낸다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
<110> Enzynomics Co. Ltd. Daegu Gyeongbuk Institute of Science & Technology <120> Mutant Uracil DNA Glycosylase with increased thermal sensitivity <130> DP201901003P <160> 161 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 229 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(229) <223> Wild-type UDG <400> 1 Met Ala Asn Glu Leu Thr Trp His Asp Val Leu Ala Glu Glu Lys Gln 1 5 10 15 Gln Pro Tyr Phe Leu Asn Thr Leu Gln Thr Val Ala Ser Glu Arg Gln 20 25 30 Ser Gly Val Thr Ile Tyr Pro Pro Gln Lys Asp Val Phe Asn Ala Phe 35 40 45 Arg Phe Thr Glu Leu Gly Asp Val Lys Val Val Ile Leu Gly Gln Asp 50 55 60 Pro Tyr His Gly Pro Gly Gln Ala His Gly Leu Ala Phe Ser Val Arg 65 70 75 80 Pro Gly Ile Ala Ile Pro Pro Ser Leu Leu Asn Met Tyr Lys Glu Leu 85 90 95 Glu Asn Thr Ile Pro Gly Phe Thr Arg Pro Asn His Gly Tyr Leu Glu 100 105 110 Ser Trp Ala Arg Gln Gly Val Leu Leu Leu Asn Thr Val Leu Thr Val 115 120 125 Arg Ala Gly Gln Ala His Ser His Ala Ser Leu Gly Trp Glu Thr Phe 130 135 140 Thr Asp Lys Val Ile Ser Leu Ile Asn 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG Q71A Forward <400> 97 gcggcgcatg gtctggcatt ttccgttcg 29 <210> 98 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG Q71A Reverse <400> 98 tcccggtccg tgataaggat cctggccgag aatc 34 <210> 99 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG H73A Forward <400> 99 gctggtctgg cattttccgt tcgtcccg 28 <210> 100 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG H73A Reverse <400> 100 cgcctgtccc ggtccgtgat aaggatcctg 30 <210> 101 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG F77A Forward <400> 101 gcttccgttc gtcccggcat tgccattcc 29 <210> 102 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG F77A Reverse <400> 102 tgccagacca tgcgcctgtc ccggtcc 27 <210> 103 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG R80A Forward <400> 103 gctcccggca ttgccattcc tccgtc 26 <210> 104 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG 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29 <210> 119 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG E142A Forward <400> 119 gcaaccttca ccgataaagt gatcagcctg attaac 36 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG E142A Reverse <400> 120 ccagccgagg ctggcgtggg 20 <210> 121 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG F144A Forward <400> 121 gccaccgata aagtgatcag cctgattaac cagcatc 37 <210> 122 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG F144A Reverse <400> 122 ggtttcccag ccgaggctgg cgtgg 25 <210> 123 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG R156A Forward <400> 123 gccgaaggcg tggtgttttt gttgtgg 27 <210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG R156A Reverse <400> 124 atgctggtta atcaggctga tcactttatc 30 <210> 125 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG E157A Forward <400> 125 gcaggcgtgg tgtttttgtt gtggggat 28 <210> 126 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG E157A Reverse <400> 126 gcgatgctgg ttaatcaggc tgatcacttt 30 <210> 127 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG F161A Forward <400> 127 gctttgttgt ggggatcgca tgcgcaaaag 30 <210> 128 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG F161A Reverse <400> 128 caccacgcct tcgcgatgct ggttaatcag 30 <210> 129 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG L162A Forward <400> 129 gcgttgtggg gatcgcatgc gcaaa 25 <210> 130 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG L162A Reverse <400> 130 aaacaccacg ccttcgcgat gctggt 26 <210> 131 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG W164A Forward <400> 131 gcgggatcgc atgcgcaaaa gaaagg 26 <210> 132 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG W164A Reverse <400> 132 caacaaaaac accacgcctt cgcga 25 <210> 133 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG K171A Forward <400> 133 gcaggggcga ttatagataa gcaacgccat c 31 <210> 134 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG K171A Reverse <400> 134 cttttgcgca tgcgatcccc acaac 25 <210> 135 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG Q178A Forward <400> 135 gcacgccatc atgtactgaa agcaccg 27 <210> 136 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG Q178A Reverse <400> 136 cttatctata atcgcccctt tcttttgcgc 30 <210> 137 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG R179A Forward <400> 137 gcccatcatg tactgaaagc accgcatcc 29 <210> 138 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG R179A Reverse <400> 138 ttgcttatct ataatcgccc ctttcttttg c 31 <210> 139 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG H180A Forward <400> 139 gctcatgtac tgaaagcacc gcatccg 27 <210> 140 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG H180A Reverse <400> 140 gcgttgctta tctataatcg cccctttc 28 <210> 141 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG L183A Forward <400> 141 gcgaaagcac cgcatccgtc gccgcttt 28 <210> 142 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG L183A Reverse <400> 142 tacatgatgg cgttgcttat ctataatcgc ccctttc 37 <210> 143 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG H202A Forward <400> 143 gcttttgtgc tggcaaatca gtggctg 27 <210> 144 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG H202A Reverse <400> 144 gttgcagcca aagaatccac gatgc 25 <210> 145 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG G214E Forward <400> 145 gaggagacgc cgattgactg gatgccagta ttaccg 36 <210> 146 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG G214E Reverse <400> 146 acgttgttcc agccactgat ttgccagcac aaaatg 36 <210> 147 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG G214R Forward <400> 147 cgcgagacgc cgattgactg gatgccag 28 <210> 148 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG G214R Reverse <400> 148 acgttgttcc agccactgat ttgccagcac aaaatg 36 <210> 149 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG G214W Forward <400> 149 tgggagacgc cgattgactg gatgccagta ttacc 35 <210> 150 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG G214W Reverse <400> 150 acgttgttcc agccactgat ttgccagcac aaaatg 36 <210> 151 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG E215A Forward <400> 151 gcgacgccga ttgactggat gccagtat 28 <210> 152 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG E215A Reverse <400> 152 gccacgttgt tccagccact gatttg 26 <210> 153 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG W220A Forward <400> 153 gcgatgccag tattaccggc agagagtgag 30 <210> 154 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG W220A Reverse <400> 154 gtcaatcggc gtctcgccac gt 22 <210> 155 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG L224A Forward <400> 155 gcaccggcag agagtgagta aatggctaac g 31 <210> 156 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG L224A Reverse <400> 156 tactggcatc cagtcaatcg gcgtc 25 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG GAPDH Forward <400> 157 acggatttgg tcgtattggg c 21 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG GAPDH Reverse <400> 158 ttgacggtgc catggaattt g 21 <210> 159 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG GAPDH Probe <400> 159 cctggtcacc agggctgctt ttaa 24 <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG D43X Substrate 1 <400> 160 ggaacaattc ugcggcttta g 21 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant UDG D43X Substrate 2 <400> 161 ctaaagccgc agaattgttc c 21

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 서열로 표시되는 대장균 유래의 야생형 UDG(Uracil DNA Glycosylase) 단백질에 E4A, W7A, E13A, Q16A, Y19A, D43X, F48A, E52A, H67A, K57A, Q71A, H73A, P87A, L96A, E112A, L121A, H134A, E142A, F144A, R156A, F161A, L162A, W164A, H180A, L183A, H202A, G214E, G214W, G214R, 및 L224A로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환이 도입된, 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질로,
    상기 각 숫자는 아미노산 잔기의 위치를 나타내고, 알파벳은 아미노산 잔기를 나타내며 야생형 잔기는 왼쪽에, 치환된 잔기는 오른쪽에 나타내고, 상기 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타내는 것인, 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 D43X에서 X는 A, C, G, K, H, I P, R, V 또는 W 아미노산 잔기 중 어느 하나인, 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질은 D43A, D43C, D43H, D43R, D43V, D43W 또는 K57A 중 하나 이상을 포함하는 것인, 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질은 E157A 또는 E215A 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것인, 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 돌연변이 단백질은 두 개 이상의 치환을 조합으로 포함하는 D43A/K57A, D43A/E157A, D43A/E215A, D43A/K57A/E157A, D43A/E157A/E215A, 또는 D43A/K57A/E157A/E215A 로부터 선택되는 것인, 야생형 대비 열민감성이 향상된 돌연변이 UDG 단백질.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 UDG 단백질을 포함하는 RT, PCR 또는 RT-PCR 반응에서 반응물 중의 핵산 오염 제거용 키트.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 UDG 단백질, PCR 중합효소 및 PCR 반응에 필요한 완충액을 포함하는, PCR 프리믹스 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 UDG 단백질, RT (Reverse Transcription) 효소 및 RT 반응에 필요한 완충액을 포함하는, RT 프리믹스 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 UDG 단백질, RT 효소, PCR 중합효소 및 RT-PCR 반응에 필요한 완충액을 포함하는, RT-PCR 프리믹스 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 UDG 단백질을 핵산을 포함하는 반응물 중에서 5 내지 55℃에서 반응시키는 단계를 포함하는, 분석 대상 샘플에서 핵산 오염 제거 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 반응물은 RT, PCR 또는 RT-PCR 반응에 사용되는 것인, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 UDG 단백질을 코딩하는 핵산.
  13. 제 12 항에 따른 돌연변이 UDG 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
  14. 제 13 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵세포.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701716A (zh) * 2016-10-08 2017-05-24 辽宁耳康基因技术有限公司 一种热不稳定的ung酶及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701716A (zh) * 2016-10-08 2017-05-24 辽宁耳康基因技术有限公司 一种热不稳定的ung酶及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문1: ASSEFA, N. G. 등 *
논문2: SOBEK, H. 등 *
논문3: DUNCAN, B. K. 등 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117417919A (zh) * 2023-10-13 2024-01-19 江苏省海洋资源开发研究院(连云港) 一种热敏感尿嘧啶dna糖苷酶及其应用

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