JP2001054387A - 改良されたｒｎａポリメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】熱安定性が高く、しかもより高い温度域で反応
することができるＲＮＡポリメラーゼを提供する。 【解決手段】ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク
質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸
を付加、欠失、挿入もしくは置換により変異させたタン
パク質であって、改変前の該タンパク質に比して熱安定
性もしくは高温域での比活性が向上したことを特徴とす
る改変型ＲＮＡポリメラーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＲＮＡポリメラー
ゼ活性を有するタンパク質を遺伝子工学的手法により改
変することにより得られる、熱安定性あるいは高温度域
での比活性が改変前の野生型ＲＮＡポリメラーゼに比し
て向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼ、該ＲＮＡポリメ
ラーゼをコ−ドする遺伝子および該遺伝子を使用する該
ＲＮＡポリメラーゼの製造方法及びその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、ＲＮＡポリメラーゼは遺伝子
の転写発現に関するキー酵素として多くの研究がなさ
れ、様々な機能、性質が知られてきている。なかでもＴ
７、Ｔ３、Ｋ１１及びＳＰ６といったバクテリオファー
ジ由来のＲＮＡポリメラーゼについては、大腸菌や高等
生物のＲＮＡポリメラーゼとは異なり、単一のポリペプ
チド鎖のみで活性を発現することから、転写メカニズム
を解析するための格好の材料とされている。また、プロ
モーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを鋳型に、ＮＴＰを基
質として、プロモーター下流の鋳型ＤＮＡに相補的な一
本鎖ＲＮＡを合成するという性質及びその際のプロモー
ター配列に対する認識が非常に厳密であるという性質か
ら、これらファージ由来のＲＮＡポリメラーゼは、イン
・ヴィトロ（in vitro）でＲＮＡを合成するための酵素
としても汎用されている。これにより合成されたＲＮＡ
は、多くの分子生物学的手法、例えばノーザンハイブリ
ダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション時に用
いるＲＮＡプローブ(リボプローブ）として、あるいは
細胞もしくは無細胞タンパク合成（翻訳）系に加えて、
翻訳される鋳型ＲＮＡとして利用されている。

【０００３】さらに近年になって、ＲＮＡポリメラーゼ
の持つ、一定温度下にて鋳型ＤＮＡから多くのＲＮＡコ
ピーを作り出す特性すなわち転写活性を利用して、例え
ば、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic acid sequene-based ampli
fication method）、ＴＭＡ法（Transcription mediate
d amplification method）と呼ばれる転写に基づく核酸
増幅方法や転写に基づいたシークエンス方法といった、
より複雑な系の方法が開発されている。

【０００４】ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法などの転写に基づ
く核酸増幅方法は、ＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素
さらに必要によりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分の
みを分解するＲＮａｓｅＨを共存させ、これらの反応を
カップリングさせることにより、微量のＲＮＡを増幅、
あるいは特定のＲＮＡの有無を検出する方法である。こ
の方法は、ＤＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅反
応、いわゆるＰＣＲ法とは異なり、温度サイクルをかけ
ることなく一定温度にて、従って特別な機器を用いるこ
となく、短時間に目的核酸を増幅することが可能であ
り、これらの特徴から臨床診断用として広く用いられる
ことが期待されている。

【０００５】一方、転写に基づくシークエンス方法(国
際公開ＷＯ９６／１４４３４号公報)は、従来のいわゆ
るサンガー法あるいはダイデオキシ法と呼ばれるシーク
エンス方法において、ＤＮＡポリメラーゼ、２’−デオ
キシリボヌクレオシド−５’−トリフォスフェイト
（２’−ｄＮＴＰｓ）及び２’、３’−ジデオキシリボ
ヌクレオシド−５’−トリフォスフェイト（２’、３’
−ｄｄＮＴＰｓ）の代わりにＲＮＡポリメラーゼ、リボ
ヌクレオシド５’−トリフォスフェイト（ｒＮＴＰｓ）
及び３’−デオキシリボヌクレオシド−５’−トリフォ
スフェイト（３’−ｄＮＴＰｓ）を用いてシークエンス
を行う方法である。従来のＤＮＡポリメラーゼを用いる
シークエンス方法では、ＰＣＲ反応で得られた生成物
（ＤＮＡ断片）をシークエンス反応に供する場合は、そ
の反応溶液中に存在する取り込まれなかったプライマー
及び２’ｄＮＴＰｓを除去することが必要であった。し
かしながら、このＲＮＡポリメラーゼを用いた転写に基
づくシークエンス反応では、上述のプライマー及び２’
−ｄＮＴＰｓは反応の基質とはなり得ないため、ＰＣＲ
生成物を直接シークエンス反応の鋳型として用いること
ができる。こうした理由から、この転写に基づくシーク
エンス法は、ＰＣＲ反応からシークエンス反応までの工
程を自動化できる可能性を持つ画期的な方法として期待
されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うにＲＮＡポリメラーゼが使用される反応系が複雑化
し、かつ用途が広がるなかで、ＲＮＡポリメラーゼの熱
安定性が低いこと及び／又は高温度域で反応することが
できないことが問題となっていた。

【０００７】ＮＡＳＢＡ反応の場合では、反応温度を上
げることによりターゲットに対する特異性ひいては検出
感度の向上に繋がることが期待されるが、ＲＮＡポリメ
ラーゼが失活してしまうために不可能であった。また診
断に用いるキットの一構成物としての酵素の熱安定性の
向上は、輸送を容易にし、結果の再現性を向上させる意
味からも重要である。

【０００８】一方、転写に基づくシークエンス反応にお
いてもＲＮＡポリメラーゼの熱安定性が低いために、Ｐ
ＣＲ生成物をシークエンス決定する際には、ＰＣＲ反応
後にＲＮＡポリメラーゼを追加することが必要となり、
自動機器を用いる場合における試薬の長期保存の観点か
ら、自動化する際の大きな障壁となりうることが考えら
れる。

【０００９】以上のようなことから、従来のものよりも
熱安定性が高く、しかもより高い温度域で反応できるＲ
ＮＡポリメラーゼが待ち望まれていた。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するためにＴ７ＲＮＡポリメラーゼにおいて熱安
定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼを構築するこ
とを目的として鋭意検討した結果、野生型ＲＮＡポリメ
ラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を遺伝子工学的手法
により改変することで熱安定性を向上させることができ
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち本発明は、以下のような構成から
なる。 （１）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を構
成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付
加、欠失、挿入もしくは置換により変異させたタンパク
質であって、改変前の該タンパク質に比して熱安定性も
しくは高温域での比活性が向上したことを特徴とする改
変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （２）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質が、
Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージおよびＫ１１ファージより
なる群から選択されるファージ由来のタンパク質である
（１）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （３）配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列の
少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入もしくは
置換により変異させてなる（１）の改変型ＲＮＡポリメ
ラーゼ。 （４）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、４３０番目のアミノ酸残基セリン、８４９番目のア
ミノ酸残基フェニルアラニンおよび８８０番目のアミノ
酸残基フェニルアラニンよりなる群から選ばれた少なく
とも１箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミ
ノ酸配列を有する（１）〜（３）のいずれかの改変型Ｒ
ＮＡポリメラーゼ。 （５）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、少なくとも４３０番目のアミノ酸残基セリンがプロ
リンに置換されたアミノ酸配列を有する（４）の改変型
ＲＮＡポリメラーゼ。 （６）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、少なくとも８４９番目のアミノ酸残基フェニルアラ
ニンがイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を有する
（４）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （７）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、少なくとも８８０番目のアミノ酸残基フェニルアラ
ニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有する
（４）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （８）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、少なくとも４３０番目のアミノ酸残基セリン、８４
９番目のアミノ酸残基フェニルアラニン、８８０番目の
アミノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、イ
ソロイシン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有す
る（４）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （９）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、４３０番目のアミノ酸残基セリン、８４９番目のア
ミノ酸残基フェニルアラニン、８８０番目のアミノ酸残
基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、イソロイシ
ン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（４）
の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （１０）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンもしく
は８８１番目のアミノ酸残基フェニルアラニンのうちの
少なくとも１箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され
たアミノ酸配列を有する（１）または（２）の改変型Ｒ
ＮＡポリメラーゼ。 （１１）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、少なくとも８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラ
ニンがイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を有する
（１０）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （１２）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、少なくとも８８１番目のアミノ酸残基フェニルアラ
ニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１
０）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （１３）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、少なくとも８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラ
ニンがイソロイシンに置換され、かつ８８１番目のアミ
ノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されたアミ
ノ酸配列を有する（１０）の改変型ＲＮＡポリメラー
ゼ。 （１４）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであっ
て、８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがイソ
ロイシンに置換され、かつ８８１番目のアミノ酸残基フ
ェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を
有する（１０）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （１５）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであ
って、４５３番目のアミノ酸残基セリン、８７２番目の
アミノ酸残基フェニルアラニンおよび９０３番目のアミ
ノ酸残基フェニルアラニンよりなる群から選ばれた少な
くとも１箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたア
ミノ酸配列を有する（１）または（２）の改変型ＲＮＡ
ポリメラーゼ。 （１６）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであ
って、少なくとも４５３番目のアミノ酸残基セリンがプ
ロリンに置換されたアミノ酸配列を有する（１５）の改
変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （１７）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであ
って、少なくとも８７２番目のアミノ酸残基フェニルア
ラニンがイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を有す
る（１５）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （１８）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであ
って、少なくとも９０３番目のアミノ酸残基フェニルア
ラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有する
（１５）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （１９）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであ
って、少なくとも４５３番目のアミノ酸残基セリン、８
７２番目のアミノ酸残基フェニルアラニン、９０３番目
のアミノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、
イソロイシン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有
する（１５）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （２０）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであ
って、４５３番目のアミノ酸残基セリン、８７２番目の
アミノ酸残基フェニルアラニン、９０３番目のアミノ酸
残基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、イソロイシ
ン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１
５）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。 （２１）（１）〜（２０）のいずれかの改変型ＲＮＡポ
リメラーゼの少なくとも一部をコードする塩基配列を含
有することを特徴とするＤＮＡフラグメント。 （２２）（２１）のＤＮＡをベクタ−に挿入したことを
特徴とするＤＮＡ組換えベクタ−。 （２３）（２２）のＤＮＡ組換え発現ベクタ−を用いて
形質転換されたことを特徴とする組換え宿主細胞。 （２４）宿主細胞が大腸菌（Escherichia coli）である
（２３）の組換え宿主細胞。 （２５）（２３）または（２４）の組換え宿主細胞を培
養しＲＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする改
変型ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。 （２６）（１）〜（２０）のいずれかの改変型ＲＮＡポ
リメラーゼを用いて恒温核酸増幅反応によりＲＮＡを増
幅せしめることを特徴とするＲＮＡを合成する方法。 （２７）（１）〜（１８）のいずれかの改変型ＲＮＡポ
リメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用試薬キッ
ト。

【００１２】尚、アミノ酸残基については、以下、慣例
により使用されている一文字表記法を用いて説明する。
本発明において改変されるアミノ酸のみを記述すると、
セリン(Ｓ)、プロリン(Ｐ、フェニルアラニン(Ｆ)、チ
ロシン(Ｙ)、イソロイシン(Ｉ)である。また、例えば、
Ｓ４３０Ｐの表記は、４３０番目のアミノ酸残基ＳをＰ
に置換させたことあるいは置換させた変異体（変異型酵
素）を意味し、さらにＳ４３０Ｐ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８
０Ｙは、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９ＩおよびＦ８８０Ｙの３
種類の置換を含む三重変異体（三重変異型酵素）を意味
する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明において、「野生型ＲＮＡ
ポリメラーゼ」とは、天然に存在する全てのＲＮＡポリ
メラーゼを意味する。さらに、「野生型ＲＮＡポリメラ
ーゼ」は、対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼの能力と
比較して、熱安定性を向上させることを目的とする改変
以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失を、さらに有す
るものであることもできる。即ち、野生型ＲＮＡポリメ
ラーゼを人為的に上記以外の目的で改変したＲＮＡポリ
メラーゼも、上記「野生型ＲＮＡポリメラーゼ」に含ま
れる。但し、そのようなアミノ酸の置換、挿入または欠
失は、ＲＮＡポリメラーゼとしての活性を維持する範囲
で、行われたものであることが適当である。さらに「野
生型ＲＮＡポリメラーゼ」としては、例えば、Ｔ７ファ
ージ、Ｔ３ファージ、Ｋ１１ファージに由来するＲＮＡ
ポリメラーゼを挙げることができる。但し、これらのＲ
ＮＡポリメラーゼに限定されるものではない。

【００１４】本発明のＲＮＡポリメラーゼは、対応する
野生型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸
が改変された熱安定性もしくは高温域での比活性の向上
したＲＮＡポリメラーゼである。ここで、「熱安定性」
とは、例えば、０℃から１００℃の温度下で、ある特定
の時間インキュベーションした場合に、インキュベーシ
ョン後の酵素が熱により失活せずに活性が残存している
こと、あるいは残存している酵素活性のインキュベーシ
ョン前に対する割合をいうものである。また、「高温域
での比活性」とは、例えば、３７℃から１００℃の温度
下で酵素活性を測定した場合における単位タンパク質重
量当たりの酵素活性をいうものである。

【００１５】本発明において、アミノ酸残基の変異は公
知の方法により実施することができる。具体的には、例
えば、付加によるタンパク質の機能を改変する方法とし
ては、Nature Biotechnology第１７巻、第５８〜６１頁
（１９９９年）に記載されている。また、欠失による方
法としては、Biochem.Biophys.Res.Commun. 第２４８
巻、第２号、第３７２〜３７７頁、挿入による方法とし
ては、FEBS Lett.第４４２巻、第２４１〜２４５頁（１
９９９年）、置換による方法としては、NucleicAcids R
eserch 第２６巻、第２号、第６８１〜６８３頁（１９
９８年）にそれぞれ記載されている。

【００１６】本発明者らは、まず、野生型Ｔ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子を挿入した発現プラスミドpKKT7RNA
Pを構築し、次に、この発現プラスミドpKKT7RNAPを基に
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの変異体を作製した。即ち、４
３０番目のアミノ酸残基ＳをＰに置換させた変異体Ｓ４
３０Ｐを、また、同様に８９１番目のアミノ酸残基Ｆを
Ｉに置換させた変異体Ｆ８４９Ｉを、さらに同様に８８
０番目のアミノ酸残基ＦをＹに置換させた変異体Ｆ８８
０Ｙを作製した。次にこれらの変異型酵素を精製し、そ
の熱安定性について調べた。

【００１７】本明細書における、野生型Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼのアミノ酸配列は、遺伝子配列データベースで
あるGeneBankより、accession No. M38308で登録されて
いるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子配列を若干訂正した
配列表・配列番号１及び配列番号２を基礎としている。
配列番号１及び配列番号２に示す配列の上段は塩基配
列、下段はその配列に対応するアミノ酸配列である。右
端の数字は、塩基配列の場合、開始コドンＡＴＧのＡを
１として全長２６５２塩基よりなることを示し、またア
ミノ酸の番号は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの最初のＭ
(メチオニン)を１として全長８８３アミノ酸残基からな
っていることを示す。従って、本発明における野生型Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列及び各アミノ酸に
付された番号は、この配列番号１及び配列番号２に示さ
れる配列及び番号のことである。

【００１８】さらに、上述のように、上記野生型Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼは、本発明で目的とする改変以外のア
ミノ酸の置換、挿入または欠失をさらに有するものであ
ってもよい。従って、本発明の目的に基づいて変異を導
入すべき野生型ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ＲＮ
Ａポリメラーゼに別の変異を導入したものである場合、
特にそのような変異が、アミノ酸の挿入または欠失であ
る場合、それに応じて上記アミノ酸番号は変動し、図１
及び図２に示す番号とは異なったとしても、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼ活性を維持している限り、そのようなに挿
入または欠失を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼも本発明
の目的とする変異を導入する野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼの範疇に含まれる。

【００１９】また、本明細書におけるＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼ以外のＲＮＡポリメラーゼについてのアミノ酸配
列及び各アミノ酸に付された番号は、図１及び図２に示
されている配列及び番号である。さらに、本発明で目的
とする改変以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失を、
さらに有するものであることもできる。従って、これら
のアミノ酸配列及びその番号に付いても、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼの場合と同様であり、アミノ酸の挿入または
欠失による変異がある場合、それに応じて上記アミノ酸
番号は変動するが、そのような一部に変異を有する野生
型のＲＮＡポリメラーゼも本発明において本発明の目的
とする変異を導入する野生型ＲＮＡポリメラーゼの範疇
に含まれる。

【００２０】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む発現
ベクターは、Ｔ７ファージゲノミックＤＮＡ（シグマ
製）を鋳型にして、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の
開始コドン領域に特異的なプライマーと終始コドン領域
に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施し、この増
幅産物を制限酵素にて消化した後、発現ベクターpKK223
-3（ファルマシア製）に導入することにより構築した。
この発現ベクターを用いて、大腸菌ＪＭ１０９に形質転
換することにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質を大
量に発現させることができる。

【００２１】発現ベクターpKKT7RNAPを持つ大腸菌エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）から精製したＴ７
ＲＮＡポリメラーゼは、in vitroでＴ７プロモーター
を含んだＤＮＡ存在下で充分なＲＮＡ合成活性を有して
いた。この発現プラスミドpKKT7RNAPをベースにして変
異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとして、上述のＳ４３０
Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｆ８８０Ｙ及びそれらの置換を複数含
んだ多重変異体を構築した。これらの変異型Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼを大腸菌組換え宿主より精製し、各変異型
酵素の熱安定性を野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較
した。結果を表１に示す。表１に示すように、これらの
変異型酵素では、熱安定性の一つの指標である活性半減
期が野生型酵素に比べて大幅に向上していた。

【００２２】ここで上記３種のファージ、即ち、Ｔ７、
Ｔ３及びＫ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼにお
いては、それらのアミノ酸配列は互いに極めて高いホモ
ロジーを有していることが知られている。図１及び図２
に、これら３種類のファージ由来ＲＮＡポリメラーゼの
アミノ酸配列を比較して示す。このように、Ｔ７、Ｔ
３、Ｋ１１由来のＲＮＡポリメラーゼは互いに極めて類
似しており、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにおいて得られた
結果を、アミノ酸配列の類似する他のＲＮＡポリメラー
ゼに適用することは比較的容易にできると考えられる。
即ち、図１及び図２から、Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポ
リメラーゼの４３０、８４９及び８８０番目のアミノ酸
残基に対応するアミノ酸残基は、Ｔ３ファージ由来のＲ
ＮＡポリメラーゼではそれぞれ４３１、８５０及び８８
１番目のアミノ酸残基であり、またＫ１１ファージ由来
のＲＮＡポリメラーゼではそれぞれ４５３、８７２及び
９０３番目のアミノ酸残基であり、従って、Ｔ３ ＲＮ
ＡポリメラーゼにおけるＦ８５０Ｉ及びＦ８８１Ｙ変異
体、さらにＫ１１ ＲＮＡポリメラーゼにおけるＳ４５
３Ｐ、Ｆ８７２Ｉ及びＦ９０３Ｙ変異体も、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼにおける変異体と同様に野生型に比べてよ
り高い熱安定性を有していることは容易に類推できる。

【００２３】本発明は、上記改変型ＲＮＡポリメラーゼ
を製造する方法であって、ＲＮＡポリメラーゼをコード
する核酸分子を用意し、次いでその塩基配列内の1つま
たはそれ以上の部位における塩基を変異させるように該
核酸分子を改変し、次いで変異させた核酸分子により発
現される改変されたＲＮＡポリメラーゼを回収すること
を含む方法を包含する。ＲＮＡポリメラーゼをコードす
る核酸分子の調製、核酸分子への突然変異の導入、改変
されたＲＮＡポリメラーゼの精製はいずれも、公知の手
法を用いて行うことが出来る。

【００２４】即ち、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、
野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をベースとして適
当な塩基を改変して変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を作製し、続いてこの遺伝子をベクターに導入し、発
現ベクターを構築する。次に、この発現ベクターを用い
て、宿主細胞を形質転換することにより変異型Ｔ７ＲＮ
Ａポリメラーゼ蛋白質を大量に発現させることができ
る。

【００２５】本発明における核酸分子への変異の導入
は、当業者がなし得る方法であればいかなる方法でもよ
いが、例えばサイトディレクテッドミュータジェネシス
法がある。

【００２６】本発明において使用するベクターは、ＲＮ
Ａポリメラーゼのクローニング及び発現を可能とするも
のであればいかなるものでもよく、例えばファージ及び
プラスミドが挙げられる。プラスミドとしては、ｐＵＣ
１１８，ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ、ｐＬＥＤ−Ｍ１、ｐ７３、ｐＧＷ７などが挙げ
られる。ファージとしては、例えばλｇｔ１１、λＺＡ
ＰIIなどが挙げられる。

【００２７】本発明において使用する宿主細胞として
は、大腸菌、酵母、バチルス（Bacillus）属細菌などが
挙げられる。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コ
リＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕ
ｅ、ＰＲ１、ＢＬ２１などが挙げられる。本発明におい
ては、上記の熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラ
ーゼをコードする遺伝子を上記ベクターに挿入して組換
え発現ベクターとし、さらにこの組換え発現ベクターに
て宿主細胞を形質転換する。

【００２８】本発明の製造方法においては、上記組換え
宿主細胞を培養して、熱安定性の向上した改変型ＲＮＡ
ポリメラーゼを発現させる。組換え宿主細胞の培養に使
用する培地ならびに条件は常法に従う。具体例として
は、熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を、例
えばＴＢ培地にて培養する。

【００２９】上記培養により得られた改変型ＲＮＡポリ
メラーゼの精製法としては、（ａ）組換え宿主を集めた
後、破砕して細胞抽出物を調製し、（ｂ）宿主細胞由来
の不純タンパク質を除去する工程を含む。組換え宿主細
胞より産出された熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリ
メラーゼは、宿主菌体を培地で培養後、培養液から遠心
分離等にて分離、回収する。該菌体を緩衝液に再懸濁し
た後、超音波処理、ダイノミル・フレンチプレンス等に
より菌体を破砕する。次いでカラムクロマトグラフィー
を実施し、熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラー
ゼを回収する。カラムクロマトグラフィーは、陽イオン
交換体、例えば、フォスフォセルロース、あるいは陰イ
オン交換体、例えば、ＤＥＡＥセファロース、あるいは
アフィニティー吸着体ヘパリンセファロースなどが好ま
しい。

【００３０】本発明における改変型ＲＮＡポリメラーゼ
は、例えば恒温核酸増幅反応により特定のＲＮＡを増幅
せしめるのに特に有用である。ここで、恒温核酸増幅反
応とは、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法（Self-sus
tained sequence replication method）、ＴＡＳ法（Tr
anscription based amplification system method）な
どが挙げられる。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、以下の実施例において、Ｔ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼ活性の測定は以下のように行なった。すなわち、
活性測定用緩衝液（４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ
８．０)、２０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオス
レイトール、０．５ｍＭ ｒＮＴＰ、Ｔ７ゲノムＤＮＡ
（シグマＤ４９３１）、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、
[³Ｈ]rＵＴＰ（３７０ｋＢｑ／μｌ））中で、酵素を３
７℃，１０分間反応させたのち、合成されたＲＮＡを酸
不溶性沈殿として回収し、シンチレーションカウンター
にて取り込まれた³Ｈ量を測定した。酵素活性の１単位
(Ｕ)は、この条件下で６０分間に１ナノモルのｒＮＴＰ
を酸不溶性沈殿画分に取り込ませる酵素量とした。

【００３２】実施例１ 野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子のクローニングと発現プラスミドの構築 野生型ＲＮＡポリメラーゼの発現プラスミドは以下のよ
うにして構築した。すなわち、Ｔ７ファージゲノミック
ＤＮＡ（シグマ製）を鋳型にして、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子の開始コドン領域に特異的なプライマー(T7E
coATG : 5'-CGC GAA TTC ATG AAC ACG ATT AAC ATC GCT
-3’)、及び終始コドン領域に特異的なプライマー(T7T
erPstI: 5'-TTT CTG CAG TGG CGT TAC GCG AAC GCG AAG
-3’)を用いてＰＣＲを実施し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼをコードする遺伝子を増幅した。次に、この増幅産
物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにて消化した後、発
現プラスミドpKK223-3（ファルマシア製）の同制限酵素
サイトに導入しＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現プラス
ミドを作製した。これをpKKT7RNAPと名付けた。なお、
得られたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列に
関しては、発現プラスミド中の得られた遺伝子をシーク
エンス決定することにより、ＰＣＲにより増幅した際の
意図しない塩基置換が入っていないことを確認した。

【００３３】実施例２ 改変型Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子の作製 改変型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、上記実施例
１で得られた野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に
点変異を導入することにより行った。点変異の導入はク
イックチェインジミュータジェネシスキット（ストラタ
ジーン社製）および点変異導入用オリゴヌクレオチドを
用いて、説明書の指示に従い行った。Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８
４９Ｉ及びＦ８８０Ｙのための点変異の導入は、変異導
入用のプライマーを変えること以外は基本的に同じ条件
にて実施できる。以下に一例として、Ｔ７ ＲＮＡポリ
メラーゼ遺伝子の１２８８番目の塩基であるＴをＣに置
換した（その結果、４３０番目のアミノ酸残基ＳがＰに
置換される）変異型遺伝子Ｓ４３０Ｐを作製した際の条
件を示す。

【００３４】pKKT7RNAP５ｎｇ、変異導入用プライマー
（5'-GTT TAC GCT GTG CCA ATG TTCAAC CCG CAA-3'及び
5'-TTG CGG GTT GAA CAT TGG CAC AGC GTA AAC-3')各
１２５ｎｇ、上記キット添付の反応用緩衝液５μｌ、１
０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリ
メラーゼ２．５Ｕを含む５０μｌの溶液を、９５℃で３
０秒間インキュベートした後、９５℃、３０秒／５５
℃、１分／６８℃、１２分の温度サイクルを１２サイク
ル実施した。温度サイクル終了後、反応液に制限酵素Ｄ
ｐｎＩ １０Ｕを添加し、３７℃で１時間インキュベー
トした。次にこの反応液１μｌをエシェリヒア・コリＪ
Ｍ１０９株コンピテントセル１００μｌに加え、３０分
間氷冷した後、４２℃で３０秒間インキュベートし、９
００μｌのＳＯＣ培地を加え３７℃で１時間インキュベ
ートした。これに５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
ＬＢ寒天培地上にスプレッドし、３７℃で一晩インキュ
ベートした。得られたコロニーをＬＢ培地２．５ｍｌに
て一晩培養した後、定法に従いプラスミドを抽出した。
最後に、これらのプラスミドの当該領域のシークエンス
を行い、１２８８番目のＴがＣに置換されているクロー
ンを取得し、pKKT7S430Pと名付けた。

【００３５】また、同様の方法で、変異導入用プライマ
ーとして5'-TTC TAC GAC CAG ATC GCT GAC CAG TTG CAC
-3'及び 5'-GTG CAA CTG GTC AGC GAT CTG GTC GTA GAA
-3'を用いることにより２５４５番目のＴをＡに置換し
た（結果として、８４９番目のＦがＩに置換される）遺
伝子を含む発現プラスミド（pKKT7F849I）、5'-TCT TAG
AGT CGG ACT ACG CGT TCG CGT AAC-3'及び 5'-GTT ACG
CGA ACG CGT AGT CCGACT CTA AGA-3'を用いることによ
り２６３９番目のＴをＡに置換した（結果として、８８
０番目のＦがＹに置換される）遺伝子を含む発現プラス
ミド（pKKT7F880Y）を作製した。さらに、これらの３種
類の変異を複数含む変異型遺伝子に関しては、変異を含
む領域を制限酵素にて切り出し、他の変異を含む発現プ
ラスミドの同領域と入れ替えることにより作製した。

【００３６】実施例３ 形質転換体の作製 実施例１及び実施例２で得られたプラスミド１ｎｇをＪ
Ｍ１０９コンピテントセル１００μｌに加え、３０分間
氷冷した後、４２℃で３０秒間インキュベートし、９０
０μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間インキュベ
ートした。これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
ＬＢ寒天培地上にて３７℃で一晩インキュベートし、形
質転換体を得た。

【００３７】実施例４ 野生型及び各種改変型Ｔ７ＲＮ
Ａポリメラーゼの精製 野生型及び各種改変型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは基本的
に同じ方法にて精製、調製することができる。実施例３
で得られた各形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＴＢ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で一晩
インキュベートした。得られた菌体を１２，０００回転
／分で５分間遠心することにより回収した。菌体約１０
ｇをバッファー１（２０ｍＭトリス−塩酸(ｐＨ８．
０),１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール, ５
％グリセロール）２０ｍｌに懸濁し、これを超音波破砕
機で破砕した後、１２０００回転／分で２０分間遠心す
ることにより沈殿を分離した。得られた上清に０．６％
ポリエチレンイミン溶液を０．４ｍｌ添加し、３０分間
攪拌した。これを１２０００回転／分で１０分間遠心す
ることにより沈殿を分離し、上清を回収した。この液に
硫酸アンモニウムを４．５６ｇ加え、３０分間攪拌した
後、これを１２０００回転／分で１０分間遠心すること
により沈殿を分離し回収した。得られた沈殿をバッファ
ー２（２０ｍＭトリス−塩酸(ｐＨ８．０),１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、２０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５％グリセロール）５ｍｌに溶解し、１００ｍｌの
バッファー２に対して透析した。次に、これをＤＥＡＥ
セファロースカラム（５ｍｌ)にチャージし、１０ｍｌ
のバッファー２で洗浄後、ＮａＣｌの０〜５００ｍＭの
グラジエントにより溶出した。得られたフラクションの
うち、ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む画分をプールし、
１００ｍｌのバッファー２に対して透析した。次に、こ
れをフォスフォセルロースカラム（５ｍｌ)にチャージ
し、１５ｍｌのバッファー２で洗浄後、バッファー２を
ベースとしてＮａＣｌ濃度の１００〜４００ｍＭのグラ
ジェントにより溶出した。得られたフラクションのう
ち、ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む画分を回収した。以
上の操作で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりほぼ単一なバンド
を示す１０ｍｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼタンパク質を
得た。

【００３８】実施例５ 野生型及び各変異体の活性半減
期の測定 熱安定性の指標の一つである活性半減期（ある温度でイ
ンキュベートした際に活性が半減するまでの時間）の測
定は以下のようにして実施した。すなわち ４０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)、２０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、５ｍＭジチオスレイトール、７０ｍＭ ＫＣｌ、
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡからなる緩衝液中、酵素を４
８℃にてインキュベートし、一定の時間間隔ごとにサン
プリングを行い、各サンプリング時点での残存活性を測
定した。野生型および各種改変型Ｔ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼを４８℃でインキュベートした際の残存活性を経時
的に測定した結果を図３に示す。また、図３から導き出
される野生型及び各変異型酵素の活性半減期を表１に示
す。

【００３９】表１の数値は、４８℃で酵素をインキュベ
ートした場合に、酵素活性が半減するまでの時間（mi
n）を示しており、数値が大きいほどその酵素の熱安定
性が高いことを示している。図３及び表１から、各変異
型酵素はいずれも野生型酵素に比してより高い熱安定性
を有していることがわかる。また今回作製した変異型酵
素の中では、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ及びＦ８８０Ｙの
３箇所の変異を全て含む三重変異型酵素（Ｓ４３０Ｐ＋
Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８０Ｙ）が最も熱安定性に優れてい
る。

【００４０】

【表１】

【００４１】実施例６ 野生型及び各変異型酵素のin v
itro転写反応 野生型及び各変異型酵素のin vitro転写反応は以下のよ
うに実施した。即ち、野生型及び各変異型酵素各５０Ｕ
を、４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)、２０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、０．
４ｍＭｒＮＴＰ、０．１％ＢＳＡ、０．５μｇ ｐＵＣ
Ｔ７−１からなる転写反応バッファー５０μｌに加え、
３７、４５、４８、５１℃の各温度にて１時間反応させ
た。ここでｐＵＣＴ７−１は、Ｔ７プロモーターの下流
に約１．５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントが連結されたプ
ラスミドＤＮＡであり、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによ
り転写されると約１．５ＫｂｐのＲＮＡが合成されるも
のである。１時間の反応の後、反応液のうちの３μｌを
０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、合成されたＲ
ＮＡの有無、量を測定した。その０．７％アガロースゲ
ル電気泳動の結果を図４に示す。なお各レーンに付され
ているナンバーは上記表１における各変異体のナンバー
に相当する。図４より、変異型酵素、特にＮｏ．８の三
重変異体（Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８０Ｙ）は、
より高い反応温度でも合成された転写産物（ＲＮＡ）の
バンドを確認でき、野生型に比してより高い温度下でも
活性を有していることが確認できる。

【００４２】実施例７ 野生型及び三重変異型酵素の各
温度での比活性測定 各温度での比活性の測定は以下のようにして実施した。
すなわち、野生型及び改変型酵素を、予め以下の温度に
保った活性測定緩衝液（４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
(ｐＨ８．０)、２０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチ
オスレイトール、０．５ｍＭ ｒＮＴＰ、Ｔ７ファージ
ゲノムＤＮＡ（シグマＤ４９３１）、５０ｕｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、[³Ｈ]rＵＴＰ（３７０ｋＢｑ／ｕｌ）に加え、
３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６
５℃にて１０分間反応させ、各温度における活性を測定
した。また、各酵素のタンパク質濃度は、プロテインア
ッセイキット（バイオラッド社製）を用いて、キット付
属のイムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）を標準タンパク
質として用いて測定した。比活性（ＳＡ)は、単位タン
パク質重量当たりの酵素活性のことであり、活性量を酵
素タンパク量で割ることにより算出できる。野生型およ
び三重変異型酵素（Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８０
Ｙ）の各温度での比活性を測定した結果を図５に示す。
図５より、改変型酵素は、野生型酵素に比べて各温度全
般にわたって高い比活性を有しており、特に高温域での
比活性に優れており、とりわけ５０℃での比活性は野生
型の約１２倍もの値を有していることが判る。

【００４３】

【発明の効果】上述したように、本発明により提供され
る改変型ＲＮＡポリメラーゼは、野生型に比べて熱安定
性及び特に高温度域での比活性が向上しており、従来の
野生型ＲＮＡポリメラーゼでは使用できなかった高温度
下における反応に用いることができる。

【００４４】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：８８３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源：バクテリオファージＴ７（Bacteriophage T7) 配列 Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu 20 25 30 Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu 35 40 45 Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val 50 55 60 Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys 65 70 75 80 Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg 85 90 95 Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu 100 105 110 Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser 115 120 125 Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala 130 135 140 Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys 145 150 155 160 His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His 165 170 175 Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser 180 185 190 Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp 195 200 205 Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr 210 215 220 Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp 225 230 235 240 Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr 245 250 255 Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val 260 265 270 Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala 275 280 285 Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala 290 295 300 Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile 305 310 315 320 Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala 325 330 335 Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile 340 345 350 Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp 355 360 365 Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val 370 375 380 Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe 385 390 395 400 Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe 405 410 415 Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe 420 425 430 Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys 435 440 445 Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly 450 455 460 Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys 465 470 475 480 Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro 485 490 495 Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu 500 505 510 Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr 515 520 525 Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln 530 535 540 His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn 545 550 555 560 Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys 565 570 575 Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn 580 585 590 Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys 595 600 605 Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly 610 615 620 Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly 625 630 635 640 Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln 645 650 655 Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln 660 665 670 Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr 675 680 685 Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys 690 695 700 Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg 705 710 715 720 Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp 725 730 735 Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu 740 745 750 Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu 755 760 765 Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His 770 775 780 Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu 785 790 795 800 Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr 805 810 815 Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met 820 825 830 Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln 835 840 845 Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu 850 855 860 Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe 865 870 875 880 Ala Phe Ala

【００４５】 配列番号：２ 配列の長さ：２６５２ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：バクテリオファージ Ｔ７（Bacteriophage T7) 配列 ATG AAC ACG ATT AAC ATC GCT AAG AAC GAC TTC TCT GAC ATC GAA CTG 48 Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu 1 5 10 15 GCT GCT ATC CCG TTC AAC ACT CTG GCT GAC CAT TAC GGT GAG CGT TTA 96 Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu 20 25 30 GCT CGC GAA CAG TTG GCC CTT GAG CAT GAG TCT TAC GAG ATG GGT GAA 144 Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu 35 40 45 GCA CGC TTC CGC AAG ATG TTT GAG CGT CAA CTT AAA GCT GGT GAG GTT 192 Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val 50 55 60 GCG GAT AAC GCT GCC GCC AAG CCT CTC ATC ACT ACC CTA CTC CCT AAG 240 Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys 65 70 75 80 ATG ATT GCA CGC ATC AAC GAC TGG TTT GAG GAA GTG AAA GCT AAG CGC 288 Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg 85 90 95 GGC AAG CGC CCG ACA GCC TTC CAG TTC CTG CAA GAA ATC AAG CCG GAA 336 Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu 100 105 110 GCC GTA GCG TAC ATC ACC ATT AAG ACC ACT CTG GCT TGC CTA ACC AGT 384 Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser 115 120 125 GCT GAC AAT ACA ACC GTT CAG GCT GTA GCA AGC GCA ATC GGT CGG GCC 432 Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala 130 135 140 ATT GAG GAC GAG GCT CGC TTC GGT CGT ATC CGT GAC CTT GAA GCT AAG 480 Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys 145 150 155 160 CAC TTC AAG AAA AAC GTT GAG GAA CAA CTC AAC AAG CGC GTA GGG CAC 528 His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His 165 170 175 GTC TAC AAG AAA GCA TTT ATG CAA GTT GTC GAG GCT GAC ATG CTC TCT 576 Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser 180 185 190 AAG GGT CTA CTC GGT GGC GAG GCG TGG TCT TCG TGG CAT AAG GAA GAC 624 Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp 195 200 205 TCT ATT CAT GTA GGA GTA CGC TGC ATC GAG ATG CTC ATT GAG TCA ACC 672 Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr 210 215 220 GGA ATG GTT AGC TTA CAC CGC CAA AAT GCT GGC GTA GTA GGT CAA GAC 720 Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp 225 230 235 240 TCT GAG ACT ATC GAA CTC GCA CCT GAA TAC GCT GAG GCT ATC GCA ACC 768 Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr 245 250 255 CGT GCA GGT GCG CTG GCT GGC ATC TCT CCG ATG TTC CAA CCT TGC GTA 816 Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val 260 265 270 GTT CCT CCT AAG CCG TGG ACT GGC ATT ACT GGT GGT GGC TAT TGG GCT 864 Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala 275 280 285 AAC GGT CGT CGT CCT CTG GCG CTG GTG CGT ACT CAC AGT AAG AAA GCA 912 Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala 290 295 300 CTG ATG CGC TAC GAA GAC GTT TAC ATG CCT GAG GTG TAC AAA GCG ATT 960 Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile 305 310 315 320 AAC ATT GCG CAA AAC ACC GCA TGG AAA ATC AAC AAG AAA GTC CTA GCG 1008 Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala 325 330 335 GTC GCC AAC GTA ATC ACC AAG TGG AAG CAT TGT CCG GTC GAG GAC ATC 1056 Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile 340 345 350 CCT GCG ATT GAG CGT GAA GAA CTC CCG ATG AAA CCG GAA GAC ATC GAC 1104 Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp 355 360 365 ATG AAT CCT GAG GCT CTC ACC GCG TGG AAA CGT GCT GCC GCT GCT GTG 1152 Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val 370 375 380 TAC CGC AAG GAC AAG GCT CGC AAG TCT CGC CGT ATC AGC CTT GAG TTC 1200 Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe 385 390 395 400 ATG CTT GAG CAA GCC AAT AAG TTT GCT AAC CAT AAG GCC ATC TGG TTC 1248 Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe 405 410 415 CCT TAC AAC ATG GAC TGG CGC GGT CGT GTT TAC GCC GTG TCA ATG TTC 1296 Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe 420 425 430 AAC CCG CAA GGT AAC GAT ATG ACC AAA GGA CTG CTT ACG CTG GCG AAA 1344 Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys 435 440 445 GGT AAA CCA ATC GGT AAG GAA GGT TAC TAC TGG CTG AAA ATC CAC GGT 1392 Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly 450 455 460 GCA AAC TGT GCG GGT GTC GAT AAG GTT CCG TTC CCT GAG CGC ATC AAG 1440 Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys 465 470 475 480 TTC ATT GAG GAA AAC CAC GAG AAC ATC ATG GCT TGC GCT AAG TCT CCA 1488 Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro 485 490 495 CTG GAG AAC ACT TGG TGG GCT GAG CAA GAT TCT CCG TTC TGC TTC CTT 1536 Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu 500 505 510 GCG TTC TGC TTT GAG TAC GCT GGG GTA CAG CAC CAC GGC CTG AGC TAT 1584 Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr 515 520 525 AAC TGC TCC CTT CCG CTG GCG TTT GAC GGG TCT TGC TCT GGC ATC CAG 1632 Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln 530 535 540 CAC TTC TCC GCG ATG CTC CGA GAT GAG GTA GGT GGT CGC GCG GTT AAC 1680 His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn 545 550 555 560 TTG CTT CCT AGT GAG ACC GTT CAG GAC ATC TAC GGG ATT GTT GCT AAG 1728 Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys 565 570 575 AAA GTC AAC GAG ATT CTA CAA GCA GAC GCA ATC AAT GGG ACC GAT AAC 1776 Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn 580 585 590 GAA GTA GTT ACC GTG ACC GAT GAG AAC ACT GGT GAA ATC TCT GAG AAA 1824 Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys 595 600 605 GTC AAG CTG GGC ACT AAG GCA CTG GCT GGT CAA TGG CTG GCT TAC GGT 1872 Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly 610 615 620 GTT ACT CGC AGT GTG ACT AAG CGT TCA GTC ATG ACG CTG GCT TAC GGG 1920 Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly 625 630 635 640 TCC AAA GAG TTC GGC TTC CGT CAA CAA GTG CTG GAA GAT ACC ATT CAG 1968 Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln 645 650 655 CCA GCT ATT GAT TCC GGC AAG GGT CTG ATG TTC ACT CAG CCG AAT CAG 2016 Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln 660 665 670 GCT GCT GGA TAC ATG GCT AAG CTG ATT TGG GAA TCT GTG AGC GTG ACG 2064 Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr 675 680 685 GTG GTA GCT GCG GTT GAA GCA ATG AAC TGG CTT AAG TCT GCT GCT AAG 2112 Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys 690 695 700 CTG CTG GCT GCT GAG GTC AAA GAT AAG AAG ACT GGA GAG ATT CTT CGC 2160 Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg 705 710 715 720 AAG CGT TGC GCT GTG CAT TGG GTA ACT CCT GAT GGT TTC CCT GTG TGG 2208 Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp 725 730 735 CAG GAA TAC AAG AAG CCT ATT CAG ACG CGC TTG AAC CTG ATG TTC CTC 2256 Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu 740 745 750 GGT CAG TTC CGC TTA CAG CCT ACC ATT AAC ACC AAC AAA GAT AGC GAG 2304 Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu 755 760 765 ATT GAT GCA CAC AAA CAG GAG TCT GGT ATC GCT CCT AAC TTT GTA CAC 2352 Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His 770 775 780 AGC CAA GAC GGT AGC CAC CTT CGT AAG ACT GTA GTG TGG GCA CAC GAG 2400 Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu 785 790 795 800 AAG TAC GGA ATC GAA TCT TTT GCA CTG ATT CAC GAC TCC TTC GGT ACC 2448 Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr 805 810 815 ATT CCG GCT GAC GCT GCG AAC CTG TTC AAA GCA GTG CGC GAA ACT ATG 2496 Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met 820 825 830 GTT GAC ACA TAT GAG TCT TGT GAT GTA CTG GCT GAT TTC TAC GAC CAG 2544 Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln 835 840 845 TTC GCT GAC CAG TTG CAC GAG TCT CAA TTG GAC AAA ATG CCA GCA CTT 2592 Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu 850 855 860 CCG GCT AAA GGT AAC TTG AAC CTC CGT GAC ATC TTA GAG TCG GAC TTC 2640 Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe 865 870 875 880 GCG TTC GCG TAA 2652 Ala Phe Ala

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｋ１１ファージ、Ｔ３ファージ及びＴ７ファー
ジ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比較した
図である（前半部）。各段の最下行のアスタリスク
（＊）は、３種類のファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ
に共通しているアミノ酸であることを示している。

【図２】Ｋ１１ファージ、Ｔ３ファージ及びＴ７ファー
ジ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比較した
図である（後半部）。各段の最下行のアスタリスク
（＊）は、３種類のファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ
に共通しているアミノ酸であることを示している。

【図３】野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素及び各変
異型酵素の熱安定性を比較した図である。野生型及び各
変異型酵素を４８℃にてインキュベートし、経時的にサ
ンプリングして残存活性を測定したものである。

【図４】野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素及び各変
異型酵素のin vitro転写活性を反応温度を３７、４５、
４８及び５１℃の条件で測定したものである。Ｔ７プロ
モーターを含むプラスミドに野生型及び各変異型酵素を
加え、各温度にて1時間反応させた後、合成（転写）さ
れたＲＮＡを０．７％アガロースゲル電気泳動により調
べたものである。

【図５】野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素と変異型
酵素（Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８０Ｙ）の３７〜
６５℃での比活性を比較した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 CA04 DA06 EA04 GA11 HA09 4B050 CC03 CC04 DD01 FF04E FF05E FF09E LL01 LL03 LL05 4B065 AA26X AA98Y AC10 BA02 CA29 CA60

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパ
   ク質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ
   酸を付加、欠失、挿入もしくは置換により変異させたタ
   ンパク質であって、改変前の該タンパク質に比して熱安
   定性もしくは高温域での比活性が向上したことを特徴と
   する改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
2. 【請求項２】 ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパ
   ク質が、Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージおよびＫ１１ファ
   ージよりなる群から選択されるファージ由来のタンパク
   質である請求項１記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
3. 【請求項３】 配列表・配列番号１に記載されるアミノ
   酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入
   もしくは置換により変異させてなる請求項１記載の改変
   型ＲＮＡポリメラーゼ。
4. 【請求項４】 Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ
   であって、４３０番目のアミノ酸残基セリン、８４９番
   目のアミノ酸残基フェニルアラニンおよび８８０番目の
   アミノ酸残基フェニルアラニンよりなる群から選ばれた
   少なくとも１箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され
   たアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれかに記載
   の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
5. 【請求項５】 Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ
   であって、少なくとも４３０番目のアミノ酸残基セリン
   がプロリンに置換されたアミノ酸配列を有する請求項４
   記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
6. 【請求項６】 Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ
   であって、少なくとも８４９番目のアミノ酸残基フェニ
   ルアラニンがイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を
   有する請求項４記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
7. 【請求項７】 Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ
   であって、少なくとも８８０番目のアミノ酸残基フェニ
   ルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有す
   る請求項４記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
8. 【請求項８】 Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ
   であって、少なくとも４３０番目のアミノ酸残基セリ
   ン、８４９番目のアミノ酸残基フェニルアラニン、８８
   ０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプロ
   リン、イソロイシン、チロシンに置換されたアミノ酸配
   列を有する請求項４記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
9. 【請求項９】 Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ
   であって、４３０番目のアミノ酸残基セリン、８４９番
   目のアミノ酸残基フェニルアラニン、８８０番目のアミ
   ノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、イソロ
   イシン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有する請
   求項４記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
10. 【請求項１０】 Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラー
    ゼであって、８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラニ
    ンもしくは８８１番目のアミノ酸残基フェニルアラニン
    のうちの少なくとも１箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に
    置換されたアミノ酸配列を有する請求項１または２に記
    載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
11. 【請求項１１】 Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラー
    ゼであって、少なくとも８５０番目のアミノ酸残基フェ
    ニルアラニンがイソロイシンに置換されたアミノ酸配列
    を有する請求項１０記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
12. 【請求項１２】 Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラー
    ゼであって、少なくとも８８１番目のアミノ酸残基フェ
    ニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有
    する請求項１０記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
13. 【請求項１３】 Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラー
    ゼであって、少なくとも８５０番目のアミノ酸残基フェ
    ニルアラニンがイソロイシンに置換され、かつ８８１番
    目のアミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換さ
    れたアミノ酸配列を有する請求項１０記載の改変型ＲＮ
    Ａポリメラーゼ。
14. 【請求項１４】 Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラー
    ゼであって、８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラニ
    ンがイソロイシンに置換され、かつ８８１番目のアミノ
    酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ
    酸配列を有する請求項１０記載の改変型ＲＮＡポリメラ
    ーゼ。
15. 【請求項１５】 Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラ
    ーゼであって、４５３番目のアミノ酸残基セリン、８７
    ２番目のアミノ酸残基フェニルアラニンおよび９０３番
    目のアミノ酸残基フェニルアラニンよりなる群から選ば
    れた少なくとも１箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に置換
    されたアミノ酸配列を有する請求項１または２に記載の
    改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
16. 【請求項１６】 Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラ
    ーゼであって、少なくとも４５３番目のアミノ酸残基セ
    リンがプロリンに置換されたアミノ酸配列を有する請求
    項１５記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
17. 【請求項１７】 Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラ
    ーゼであって、少なくとも８７２番目のアミノ酸残基フ
    ェニルアラニンがイソロイシンに置換されたアミノ酸配
    列を有する請求項１５記載の改変型ＲＮＡポリメラー
    ゼ。
18. 【請求項１８】 Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラ
    ーゼであって、少なくとも９０３番目のアミノ酸残基フ
    ェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を
    有する請求項１５記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
19. 【請求項１９】 Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラ
    ーゼであって、少なくとも４５３番目のアミノ酸残基セ
    リン、８７２番目のアミノ酸残基フェニルアラニン、９
    ０３番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプ
    ロリン、イソロイシン、チロシンに置換されたアミノ酸
    配列を有する請求項１５記載の改変型ＲＮＡポリメラー
    ゼ。
20. 【請求項２０】 Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラ
    ーゼであって、４５３番目のアミノ酸残基セリン、８７
    ２番目のアミノ酸残基フェニルアラニン、９０３番目の
    アミノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、イ
    ソロイシン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有す
    る請求項１５記載の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
21. 【請求項２１】 請求項１〜２０のいずれかに記載の改
    変型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも一部をコードする
    塩基配列を含有することを特徴とするＤＮＡフラグメン
    ト。
22. 【請求項２２】 請求項２１記載のＤＮＡをベクタ−に
    挿入したことを特徴とするＤＮＡ組換えベクタ−。
23. 【請求項２３】 請求項２２記載のＤＮＡ組換え発現ベ
    クタ−を用いて形質転換されたことを特徴とする組換え
    宿主細胞。
24. 【請求項２４】 宿主細胞が大腸菌（Escherichia col
    i）である請求項２３記載の組換え宿主細胞。
25. 【請求項２５】 請求項２３または２４に記載の組換え
    宿主細胞を培養しＲＮＡポリメラーゼを採取することを
    特徴とする改変型ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
26. 【請求項２６】 請求項１〜２０のいずれかに記載の改
    変型ＲＮＡポリメラーゼを用いて恒温核酸増幅反応によ
    りＲＮＡを増幅せしめることを特徴とするＲＮＡを合成
    する方法。
27. 【請求項２７】 請求項１〜１８のいずれかに記載の改
    変型ＲＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増
    幅用試薬キット。