CN1252258C - 具有改进的卵污渍洗涤性能的新枯草杆菌酶 - Google Patents

Abstract

具有改进的卵污渍洗涤性能的新枯草杆菌酶。这些枯草杆菌酶在用于诸如清洁或洗涤剂组合物，如洗衣组合物和洗盘组合物，包括自动洗盘组合物中时，表现出优良的或改进的卵污渍洗涤性能。

Description

具有改进的卵污渍洗涤性能的新枯草杆菌酶

技术领域

本发明涉及具有改进的卵污渍洗涤性能的新枯草杆菌酶(subtilase)。这些枯草杆菌酶的作用是在用于诸如清洁或洗涤剂组合物，如洗衣组合物和洗盘组合物，包括自动洗盘组合物时，表现出优良的或改进的洗涤性能。

本发明还涉及编码该枯草杆菌酶的分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、包含此核酸构建体的宿主细胞，以及生产和使用本发明的枯草杆菌酶的方法。而且，本发明涉及包含本发明枯草杆菌酶的清洁和洗涤剂组合物，以及这些酶在洗涤剂组合物中的用途和用于除去卵污渍。

发明背景

在洗涤剂工业，酶已在洗涤配方中使用了30年以上。用于这些配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶和其它酶或它们的混合物。商业上最为重要的酶是蛋白酶。

数量不断增长的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白工程化变体，如DURAZYM^(Novo Nordisk A/S)、RELASE^(NovoNordisk A/S)、MAXAPEM^(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT^(Gene-ncor International，Inc.)。

而且，现有技术中描述了大量的蛋白酶变体，如在以下文献中所述：EP 130756(GENENTECH)(对应于US再颁专利号34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO 87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell和Fersht(1985)自然(Nature)318：375-376；Thomas，Russell和Fersht(1987)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)193：803-813；Russel和Fersht自然328：496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(Amgen)；WO 95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER&GAMBLE COMPANY)；WO 95/30010(PROCTER&GAMBLECOMPANY)；WO 95/29979(PROCTER&GAMBLE COMPANY)；US 5.543.302(SOLVAY S.A.)；EP 251446(GENENCOR)；WO89/06279(NOVO NORDISK A/S)；WO 91/00345(NOVO NORDISKA/S)；EP 525610Al(SOLVAY)；和WO 94/02618(GIST-BROCADESN.V.)。

但是，尽管现有文献中已描述了大量有用的蛋白酶和蛋白酶变体，对于大量的工业应用，仍需要新的改进的蛋白酶或蛋白酶变体。

具体而言，由于卵清中存在的物质抑制许多种丝氨酸蛋白酶，因而提出从衣物或硬表面除去卵污渍的问题。

因此，本发明的目的在于提供改进的枯草杆菌酶，它适于从衣物和/或硬表面除去卵污渍。

发明概述

因此，在第一方面，本发明涉及一种具有改进的卵污渍洗涤性能的枯草杆菌酶，所述的枯草杆菌酶选自

a)与SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少88％同一性的枯草杆菌酶；

b)由在低严格条件下与以下序列杂交的多核苷酸编码的枯草杆菌酶：

i)SEQ ID NO：1中第1-807位核苷酸所示的多核苷酸的互补链，或

ii)包含至少100个核苷酸的(i)的子序列；和

c)由克隆到存在于大肠杆菌(Escherichia coli)MT173 DSM 13306中的质粒片段上的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶，或者与所述的枯草杆菌酶具有至少88％同一性的变体。

在第二方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本发明枯草杆菌酶的核酸序列。

在第三方面，本发明涉及一种编码枯草杆菌酶的分离的多核苷酸，其选自：

a)与SEQ ID NO：1中第1-807位核苷酸所示的核酸序列具有至少88％同一性的多核苷酸；

b)由在低严格条件下与以下序列杂交的多核苷酸编码的枯草杆菌酶：

i)SEQ ID NO：1中第1-807位核苷酸所示的多核苷酸的互补链，或

ii)包含至少100个核苷酸的(i)的子序列；和

c)克隆到存在于大肠杆菌MT173 DSM 13306中的质粒片段上的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者与所述的核酸序列具有至少88％同一性的变体。

在第四方面，本发明涉及一种包含本发明核酸序列的核酸构建体，所述核酸构建体可操作地与一种或多种能够指导枯草杆菌酶在适宜的宿主内表达的调控序列相连接。

在第五方面，本发明涉及一种包含本发明核酸构建体、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。

在第六方面，本发明涉及一种包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。

在第七方面，本发明涉及一种产生本发明枯草杆菌酶的方法，所述方法包括：

(a)在有助于产生枯草杆菌酶的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和

(b)回收枯草杆菌酶。

在第八方面，本发明涉及一种清洁或洗涤剂组合物，优选为洗衣或洗盘组合物，所述组合物包含本发明的枯草杆菌酶。

本发明进一步的方面涉及本发明的枯草杆菌酶在清洁或洗涤剂组合物中的用途；本发明的枯草杆菌酶或组合物用于除去卵污渍的用途；一种用于清洁或洗涤的方法，包括从硬表面或衣物上除去卵污渍的方法，所述方法包括使硬表面或衣物与本发明的组合物接触。

关于序列对比和编号参见图1，该图表示在枯草杆菌蛋白酶BPN′(a)(BASBPN)和本发明的新枯草杆菌酶(b)之间的序列对比。

本专利申请中的这些序列对比用作对残基进行编号的参照。

定义

在更详细地讨论本发明之前，首先定义以下的术语和惯用语。

氨基酸命名法

A＝Ala＝丙氨酸

V＝Val＝缬氨酸

L＝Leu＝亮氨酸

I＝Ile＝异亮氨酸

P＝Pro＝脯氨酸

F＝Phe＝苯丙氨酸

W＝Trp＝色氨酸

M＝Met＝甲硫氨酸

G＝Gly＝甘氨酸

S＝Ser＝丝氨酸

T＝Thr＝苏氨酸

C＝Cys＝半胱氨酸

Y＝Tyr＝酪氨酸

N＝Asn＝天冬酰胺

Q＝Gln＝谷氨酰胺

D＝Asp＝天冬氨酸

E＝Glu＝谷氨酸

K＝Lys＝赖氨酸

R＝Arg＝精氨酸

H＝His＝组氨酸

X＝Xaa＝任意氨基酸

核酸命名法

A＝腺嘌呤

G＝鸟嘌呤

C＝胞嘧啶

T＝胸腺嘧啶(仅在DNA中)

U＝尿嘧啶(仅在RNA中)

变体命名的命名法和惯用语

在描述本发明生产或期待的多种枯草杆菌酶变体中，采用以下的命名法和惯用语以易于参照：

首先通过将分离的或亲本酶与枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)的对比来定义参考框。

可以由GCG程序包9.1版的GAP程序获得序列对比，用于对枯草杆菌酶进行编号，使用了以下参数：间隔创建罚分＝8，间隔扩展罚分＝8，且所有的其它参数保持为它们的默认值。

另一种方法是使用已知的枯草杆菌酶之间的对比，如在WO91/00345中所示的序列对比。在大部分情况下，差异并不重要。

枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)和本发明的新枯草杆菌酶之间的对比如图1所示。

因此，将定义许多与BASBPN相关的缺失和插入。在图1中，本发明的新枯草杆菌酶与BASBPN相比，在36、58、158、162、163和164位有6处缺失。这些缺失在图1中由星号(*)表示。

一般采用以下的三个成分来表示对亲本酶所进行的多种修饰：

原始氨基酸  位置  替换的氨基酸

因此，符号G195E意指195位的甘氨酸被谷氨酸替换。

在原始氨基酸残基可以是任意氨基酸残基的情况下，有时可以用简略表达方式仅表示位置和替换的氨基酸：

位置  替换的氨基酸

这种符号尤其与同源枯草杆菌酶的修饰相关(见下文)。

类似地，当替换氨基酸残基的种类不重要时：

原始氨基酸  位置

当原始氨基酸和替换氨基酸均可以包含任意氨基酸时，则只指出位置，如：170。

当原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸时，所选择的氨基酸表示在括号内：

原始氨基酸  位置{ 替换的氨基酸₁，…，替换的氨基酸_n }

对于特定的变体，使用特定的三个或一个字母代码，包括代码Xaa和X用来表示任何氨基酸残基。

替换：

用谷氨酸替换195位的甘氨酸表示为：

                        Gly195Glu或G195E

或者用任意氨基酸残基酸替换195位的甘氨酸表示为：

                        Gly195Xaa或G195X

或

                        Gly195或G195

因此用丝氨酸替换170位的任意氨基酸残基表示为：

                        Xaa170Ser或X170S

或

                        170Ser或170S

这种符号尤其与同源枯草杆菌酶的修饰相关(见下文)。因此170Ser意指包含BASBPN中的Lys170Ser修饰和本发明枯草杆菌酶的Arg170Ser的修饰(参见图1)。

对于其中的原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸的修饰而言，由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸替换170位的精氨酸表示为

Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G，A，S，T}

以表示变体

R170G、R170A、R170S和R170T。

缺失：

195位甘氨酸的缺失表示为：

                Gly195^*或G195^*

相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示为

                Gly195^*+Leu196^*或G195^*+L196^*

插入：

额外的氨基酸残基的插入，如在G195后插入赖氨酸表示为：

                Gly195GlyLys或G195GK；

或者，当插入一个以上的氨基酸残基，如在G195后插入Lys和Ala时，这种插入表示为：

                Gly195GlyLysAla或G195GKA

在这些情况下，通过将小写字母加到插入氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置号来对插入氨基酸残基进行编号。在以上的实施例中，序列194-196因此为：

                194 195 196

BLSAVI          A-G-L

                    194 195 195a 195b 196

变体                A-G-K-A-L

当插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基时，显然是在命名中出现了简并。如果例如在以上的实施例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则将它表示为G195GG。对从

            194 195 196

BLSAVI      A-G-L

            194 195 195a 196

至变体      A-G-G-L

            194 194a 195 196

的同一现行变化还可以表示为A194AG。

这些例子对本领域技术人员来说是显而易见的，且表示法G195GG和这种类型插入的相应表示法因此是指包含此类等同的简并表示法。

填补间隔：

当与用于编号的枯草杆菌蛋白酶BPN′序列进行比较，在参照的酶中存在缺失时，则对于在36位天冬氨酸的插入而言，这种位置处的插入表示为：

            ^*36Asp或^*36D

多重修饰：

用加号分隔含多重修饰的变体，如：

         Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E

代表在170和195位分别用酪氨酸和谷氨酸替换精氨酸和甘氨酸的修饰。

因此，Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示以下变体：

Tyr167Gly+Arg170Gly，          Tyr167Gly+Arg170Ala，

Tyr167Gly+Arg170Ser，          Tyr167Gly+Arg170Thr，

Tyr167Ala+Arg170Gly，          Tyr167Ala+Arg170Ala，

Tyr167Ala+Arg170Ser，          Tyr167Ala+Arg170Thr，

Tyr167Ser+Arg170Gly，          Tyr167Ser+Arg170Ala，

Tyr167Ser+Arg170Ser，          Tyr167Ser+Arg170Thr，

Tyr167Thr+Arg170Gly，          Tyr167Thr+Arg170Ala，

Tyr167Thr+Arg170Ser            和Tyr167Thr+Arg170Thr。

这种命名法与针对替换、取代、插入或缺失具有特定共同性质的氨基酸残基，如带正电荷(K、R、H)、带负电荷(D、E)的残基的修饰，或用一种小氨基酸替换另一种小氨基酸的诸如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}的保守氨基酸的修饰特别相关。进一步的详细描述参见“发明详述”部分。

蛋白酶

分解蛋白质底物中的酰胺键的酶归类为蛋白酶，或(可互换的)肽酶(见Walsh，1979，酶反应机理(Enzymatic Reaction Mechanisms).W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。

氨基酸位置/残基的编号

如果没有另外指出，本文所用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN′(BASBPN)序列的氨基酸编号。对BPN′序列的详细描述，参见图1或Siezen等人，蛋白质工程(Protein Engng.)4(1991)719-737。

丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是一种催化肽键水解的酶，其中在活性部位存在必需的丝氨酸残基(White，Handler和Smith，1973“生物化学原理(Principles of Biochemistry)，”第五版，McGraw-Hill Book公司，NY，第271-272页)。

细菌丝氨酸蛋白酶的分子量在20,000-45,000道尔顿的范围内。它们被二异丙基氟磷酸抑制。它们水解简单末端脂类，且其活性与真核生物糜蛋白酶(也是一种丝氨酸蛋白酶)相似。一个更为狭义的术语：包括在一个亚组的碱性蛋白酶反映某些丝氨酸蛋白酶的高pH最佳值，为pH9.0-11.0(综述参见Priest(1977)细菌学评论(Bacteriological Rev.)41：711-753)。

枯草杆菌酶

Siezen等人提出丝氨酸蛋白酶的一个亚组，其暂称为枯草杆菌酶(subtilase)，见蛋白质工程，4(1991)719-737和Siezen等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523。它们是通过对170多个先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定了大量的枯草杆菌酶，并已测定了一些枯草杆菌酶的氨基酸序列。对此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述参见Siezen等人(1997)。

枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或″真″枯草杆菌蛋白酶，包含“标准的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(BLSCAR)(ALCALASE^，NOVO NORDISK A/S)和枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。

Siezen等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I-S2或强碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶并包括：枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL^，Gist-BrocadesNV)、枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI)(SAVINASE^，NOVO NORDISKA/S)、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE^，NOVO NORDISKA/S)和碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。

亲本枯草杆菌酶

术语“亲本枯草杆菌酶”描述一种根据Siezen等人(1991和1997)定义的枯草杆菌酶。关于进一步的细节，参见上述对“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从天然来源分离的枯草杆菌酶，其中，在保持枯草杆菌酶特性的情况下经过进一步修饰。而且，亲本枯草杆菌酶还可以是通过如以下文献所述的DNA改组技术制备的枯草杆菌酶：J.E.Ness等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，17，893-896(1999)。

术语“亲本枯草杆菌酶”可另外称为“野生型枯草杆菌酶”。

枯草杆菌酶的修饰

本文所用的术语“修饰”定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及对编码枯草杆菌酶的DNA所进行的遗传操作。修饰可以是氨基酸侧链的取代、目标氨基酸处的替换、缺失和/或插入。

枯草杆菌酶变体

在本发明的上下文中，术语枯草杆菌酶变体或突变的枯草杆菌酶指由表达突变基因的生物体产生的枯草杆菌酶，该突变基因来源于含原始或亲本基因并产生相应亲本酶的亲本微生物，所述亲本基因已发生突变以产生突变基因，这种突变基因在适宜的宿主中表达时产生所述的突变枯草杆菌酶。类似地，所述突变基因还可以来自由DNA改组技术产生的亲本基因。

同源枯草杆菌酶序列

在本上下文中，两种氨基酸序列之间的同源性用参数“同一性”描述。

为了确定两种枯草杆菌酶之间的同一性程度，可以使用相同的设置应用(下文)GCG程序包9.1版的GAP方法。此方法的计算结果除了氨基酸序列对比外，还有两个序列之间的“同一性百分率”的计算结果。

根据此说明，本领域技术人员常规地鉴定适宜的同源性枯草杆菌酶和相应的同源的活性部位环区，它们可以根据本发明进行修饰。

分离的多核苷酸

本文所用的术语“分离的多核苷酸”指一种经分离纯化以适合应用于遗传工程化的蛋白质产生系统的形式的多核苷酸。这些分离的分子可以从其自然环境中分离，是包括cDNA和基因组克隆以及来自DNA改组实验或定点自体生殖(site-directed autogenesis)实验的多核苷酸。本发明的分离的多核苷酸不含其它通常与之相关的基因，但可包括5′和3′未翻译区如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域技术人员来说是显而易见的(例如，参见Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。术语“分离的核酸序列”或称为“分离的DNA序列”、“克隆的核酸序列”或“克隆的DNA序列”。

分离的蛋白质

术语“分离的”在应用于蛋白质时指此蛋白质已从其自然环境中分离出。

在优选的形式中，分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(参见以下))。

通过SDS-PAGE测定分离的蛋白质的纯度大于10％，优选大于20％，更优选大于30％。还优选提供通过SDS-PAGE测定纯度大于40％，大于60％，大于80％，更优选大于95％，并最优选大于99％的高度纯化形式的蛋白质。

术语“分离的蛋白质”可另称为“纯化的蛋白质”。

同源杂质

术语“同源杂质”意指任何来源于最初获得本发明枯草杆菌酶的同源细胞的杂质(如除了本发明枯草杆菌酶之外的另一多肽)。

自……获得

本文所用与特定的微生物源相关的术语“自……获得”意指该多核苷酸和/或枯草杆菌酶是由特定来源或由细胞产生，其中所述的特定来源或细胞中已插入来自于其中的基因。

底物

本文所用的与蛋白酶的底物相关的术语“底物”应以其最广义的形式解释为包括含有至少一种易于被枯草杆菌蛋白酶水解的肽键的化合物。

产物

本文所用的与来自蛋白酶酶促反应的产物有关的术语“产物”在本发明的上下文中应解释为包括涉及蛋白酶枯草杆菌酶的水解反应的产物。产物可以是在随后的水解反应中的底物。

洗涤性能

在本发明上下文中，术语“洗涤性能”用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于目标上的卵污渍至清洁的能力。还参见本文实施例2中的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”。

性能因子

用下式定义术语“性能因子”：

P＝R_{枯草杆菌酶}-R_洒维奈斯

其中，P为性能因子，R_{枯草杆菌酶}为如在“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中所述采用枯草杆菌酶处理之后的试验材料的反射能力(reflectance)，而R_洒维奈斯为如在“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中所述采用Savinase^处理之后的试验材料的反射能力，进一步的详情参见本文实施例2中的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”。

附图简述

图1表示采用上述的GAP法进行枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列(a)和本发明新枯草杆菌酶的氨基酸之间的序列对比。

发明详述

在本发明的第一个令人感兴趣的方面，具有改进的卵污渍洗涤性能的枯草杆菌酶是一种分离的与SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列(即成熟的枯草杆菌酶)具有至少88％同一性的枯草杆菌酶。在本发明的一个令人感兴趣的实施方案中，所述的枯草杆菌酶与SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性(下文称为“同源枯草杆菌酶”)。在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，分离的枯草杆菌酶由SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列组成。

可以采用用于蛋白质和DNA对比的完全Smith-Waterman对比法进行序列对比和同一性分值计算。默认记分矩阵方法BLOSUM50和同一性矩阵方法分别用于蛋白质和DNA的序列对比。在一个间隔中的第一个残基的罚分对于蛋白质而言为-12，对DNA而言为-16，而对一个间隔中的其它残基的罚分对蛋白质而言为-2，对DNA而言为-4。对比来自Fasta软件包v20u6版本(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“改进的生物序列分析工具(Improved Tools for Biological sequenceAnalysis)”，PNAS 85：2444-2448，以及W.R.Pearson(1990)“用FASTP和FASTA的快速和灵敏序列比较(Rapid and Sensitive sequenceComparison with FASTP and FASTA)”酶学方法(Methods inEnzymology)183：63-98)。

通过进行此类序列对比，发现具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的枯草杆菌酶和多种已知的枯草杆菌酶的氨基酸序列之间的下列同一性(以百分率表示)：

	BLSAVI	BLAP	BASBPN	BLSCAR	SEQ ID NO：2
						BLSAVIBLAP1)BASBPNBLSCARSEQ ID NO：2	10098.160.460.986.6	10060.761.387.4	10069.559.3	10055.8	100

¹⁾BLAP(迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)碱性蛋白酶)已在US5,352,604中描述。

在本发明的另一令人感兴趣的实施方案中，分离的枯草杆菌酶由以下多核苷酸编码，此多核苷酸在低严格条件下，优选在中等严格条件下，更优选在高度严格条件下与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1中第1-807位核苷酸所示的多核苷酸的互补链，或(ii)至少含100个核苷酸的(i)的子序列(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，分子克隆，实验室手册，第二版(Molecular Cloning A Laboratory Manual，2dedition)，冷泉港，纽约。

如SEQ ID NO：1中第1-807位核苷酸所示的多核苷酸的互补链的片断或子序列可为至少100个核苷酸，或优选地至少200个核苷酸。而且，此子序列应该编码具有蛋白水解活性的枯草杆菌酶片断。此枯草杆菌酶也可以是具有蛋白水解活性的枯草杆菌酶的等位基因变体或片断。

根据本领域已知的方法，可以将SEQ ID NO：1的多核苷酸或其子序列或片断，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片断用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的菌株的、编码具有蛋白水解活性的枯草杆菌酶。具体来说，这种探针可以根据标准的Southern印迹法，用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可以显著地短于整个序列，但应该至少为15，优选至少25，更优选至少35个核苷酸长。也可以使用较长的探针。DNA和RNA探针均可使用。一般对探针进行标记以检测相应的基因(如采用³²P、³H、³⁵S、生物素或亲和素)。此类探针包含在本发明中。

因此，可以从制备自其它此类生物体的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述的探针杂交并编码本发明枯草杆菌酶的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳法，或本领域技术人员已知的其它分离技术分离来自其它此类生物体的基因组DNA或其它DNA。可以将来自这些文库的DNA或分离的DNA转移或者固定到硝酸纤维素或其它适宜的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其子序列同源的克隆或DNA，将此载体材料用于Southern印迹法。为本发明目的，杂交表明多核苷酸在低至高严格条件下与相应于SEQ ID NO：1中所示的核酸序列、其互补链或其子序列的标记的核酸探针杂交。采用X射线薄膜检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

对于长度至少为100个核苷酸的长探针，低至高严格条件定义为：根据标准的Southern印迹法，在42℃下于5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA，以及含用于低严格条件的25％甲酰胺、含用于中等严格条件的35％甲酰胺或含用于高严格条件的50％甲酰胺中进行预杂交和杂交。

对于长度至少为100个核苷酸的长探针，最终用2×SSC，0.2％SDS优选至少在50℃下(低严格条件)，更优选至少在55℃下(中等严格条件)，进一步更优选至少在65℃下(高严格条件)将载体材料各洗三次，每次15分钟。

对于长度在大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，严格条件定义为：根据标准Southern印迹法，在以下条件下进行预杂交、杂交和洗涤后杂交：在采用Bolton和McCarthy(1962，美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)48：1390)计算法计算的Tm之下5℃-10℃，0.9M NaCl，于0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠，1mM一碱价磷酸钠，0.1mM ATP和每毫升0.2mg酵母RNA。

对于长度在大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短核苷酸，在添加了0.1％SDS的6×SCC中洗涤15分钟，洗涤一次；并使用6×SSC，在计算的T_m之下5℃-10℃洗涤两次，每次15分钟。

现有技术中已知所谓用类似的氨基酸残基对某氨基酸残基的保守取代预期仅产生酶特征的小变化。

下列表I列出了保守氨基酸替换的组

表I

保守氨基酸替换

共性                                    氨基酸

碱性(带正电荷)                          K＝赖氨酸

                                        H＝组氨酸

酸性(带负电荷)                          E＝谷氨酸

                                        D＝天冬氨酸

极性                                    Q＝谷氨酰胺

                                        N＝天冬酰胺

疏水                                    L＝亮氨酸

                                        I＝异亮氨酸

                                        V＝缬氨酸

                                        M＝甲硫氨酸

芳族                                    F＝苯丙氨酸

                                        W＝色氨酸

                                        Y＝酪氨酸

小                                      G＝甘氨酸

                                        A＝丙氨酸

                                        S＝丝氨酸

                                T＝苏氨酸

因此，在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的枯草杆菌酶组合有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失和/或插入。

特别地，考虑与现有技术中已知的其它修饰的结合以提供改进的酶活性。

现有技术描述了大量具有不同的改进性质的枯草杆菌酶变体，这些大量的枯草杆菌酶变体在本文的“发明背景”部分提及(参见上文)。

因此，对SEQ ID NO：2的氨基酸序列在下列一个或多个位置处进行的修饰认为尤其适用(按BASBPN编号)：27、36、56、76、87、97、101、104、120、123、167、170、222、224、235和274。

具体来说，认为本发明的枯草杆菌酶的以下变体适于组合(按BASBPN编号)：K27R、^*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、R101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167、R170、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。

而且，认为在活性部位(b)环区域插入至少一个附加氨基酸残基，相当于从95位至103位(BASBPN编号)插入至少一个附加氨基酸残基，将赋予本发明的枯草杆菌酶附加的洗涤性能。具体而言，优选在以下位置至少插入一个附加氨基酸残基，如插入一个附加氨基酸残基：98位和99位之间，以及99位和100位之间。

而且，还认为与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的枯草杆菌酶具有免疫化学同一性或部分免疫化学同一性的分离的枯草杆菌酶，优选为纯化的形式，也包含在本发明的范围之内。采用已知的Ouchterlony双向免疫扩散法，通过免疫交叉反应鉴定试验测定免疫化学性质。具体而言，根据以下文献所述的方法，通过免疫兔(或其它啮齿动物)制备含有具有免疫活性或与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的枯草杆菌酶的表位结合的多克隆抗体抗血清：Harboe和Ingild，见N.H.Axelsen，J.Roll和B.Weeks编辑，定量免疫电泳手册(A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis)，Blackwell Scientific Publication，1973，第23章；或Johnstone和Thorpe，实用免疫化学(Immunochemistry inPractice)，Blackwell Science Publication，1982(更具体地，第27-31页)。具有免疫化学同一性的枯草杆菌酶是在采用特定免疫化学技术时，以相同的方式如全部沉淀物融化、相同的沉淀物形态和/或相同的电泳迁移率与抗血清反应的枯草杆菌酶。Axelsen、Bock和Kroll在N.H.Axelsen，J.Roll和B.Weeks编辑，定量免疫电泳手册，Blackwell，ScientificPublications，1973，第10章中描述了关于免疫化学同一性的进一步解释。具有部分免疫化学同一性的枯草杆菌酶是在采用特定免疫化学技术时，以部分相同的方式如部分沉淀物融化、部分相同的沉淀物形态和/或部分相同的电泳迁移率与抗血清反应的的枯草杆菌酶。在N.H.Axelsen，J.Roll和B.Weeks编辑，定量免疫电泳手册，BlackwellScientific Publication，1973，第11章中描述了部分免疫化学同一性。

抗体还可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以根据以下的方法制备和使用：E.Harlow和D.Lane编辑，1988，抗体，实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约。

本发明人已分离出编码具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的枯草杆菌酶的基因，并将其插入到大肠杆菌MT173。根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，2000年2月10日将包含该基因的大肠杆菌MT173菌株保存在德意志微生物保藏中心DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig，德国，其保藏号为DSM13306。

在本发明的令人感兴趣的实施方案中，枯草杆菌酶与由克隆到存在于保藏号为DSM 13306的大肠杆菌MT173中质粒片断上的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

如上述，本发明的枯草杆菌酶表现出优越的卵污渍洗涤性能。因此，为了使本领域技术人员-在其研发工作早期-能够选择有效的和优选的用于此目的的枯草杆菌酶，本发明人提供了一种适宜的预试验，此试验易于由本领域技术人员完成以初步评价所讨论的枯草杆菌酶的性能。

因此，本文的实施例2中所公开的试验“标准的洗涤剂洗涤性能试验”可用于评价所选择的枯草杆菌酶的功效。换句话说，在将一种枯草杆菌酶掺入标准的洗涤剂组合物中时，可与参照体系比较(此时为Savinase^)，用“标准的洗涤剂洗涤性能试验”评价该枯草杆菌酶除去标准纺织物上的卵污渍的能力。利用这种试验，可以初步研究所选择的枯草杆菌酶除去卵污渍的适用性，其基本原理是如果所选择的枯草杆菌酶在试验中没有表现出相对于Savinase^的明显改进，则一般不需要进行进一步的试验。

因此，具体用于本文所述目的枯草杆菌酶是这样的一种枯草杆菌酶：如在“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中所述，当它在包含以下成分的标准洗涤剂中试验时，与在相同条件下试验的Savinase^相比表现出改进的卵污渍洗涤性能，标准的洗涤剂组合物包含：

      6.2％       LAS(Nansa 80S)

      2％         C₁₆-C₁₈脂肪酸的钠盐

      4％         非离子表面活性剂(Plurafax LF404)

      22％        沸石P

      10.5％      Na₂CO₃

      4％         Na₂Si₂O₅

      2％         羧甲基纤维素(CMC)

      6.8％       丙烯酸盐液体CP5 40％

      20％        过硼酸钠(经验式NaBO₂.H₂O₂)

      0.2％       EDTA

      21％        Na₂SO₄

                  水(平衡量)

可以通过采用在本文的实施例2中定义的所谓“性能因子”将洗涤性能的改进进行定量。

在本发明的一个非常令人感兴趣的实施方案中，本发明的枯草杆菌酶在“洗涤性能试验”测试时，其性能因子至少为1，如至少为1.5，例如至少为2，优选至少为2.5，如至少为3，例如至少为3.5，特别是至少为4，如至少为4.5，例如至少为5。

明显地，优选本发明的枯草杆菌酶在所述的最低水平上，更优选在所述的中等水平上，最优选在所述的最高水平上符合上述标准。

本发明的枯草杆菌酶可以通过标准技术构建，用于人为地产生多样性，如通过不同枯草杆菌酶基因的DNA改组技术(参见WO 95/22625和J.E.Ness等人，自然生物技术，17，893-896(1999))。

明显地，本发明的枯草杆菌酶还可以从天然来源中分离，即本发明的枯草杆菌酶可以是例如细菌枯草杆菌酶，例如革兰氏阳性细菌枯草杆菌酶或革兰氏阴性细菌枯草杆菌酶，其中革兰氏阳性细菌枯草杆菌酶例芽孢杆菌属多肽，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结牙孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)枯草杆菌酶；或者链霉菌属枯草杆菌酶，如变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)枯草杆菌酶；其中所述革兰氏阴性细菌枯草杆菌酶，如大肠杆菌或假单胞菌(假单胞菌sp)枯草杆菌酶。

本发明的枯草杆菌酶也可为真菌多肽，更优选酵母枯草杆菌酶如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia枯草杆菌酶；或者更优选的丝状真菌枯草杆菌酶如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filobasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、链孢霉属(Neurospora)拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉菌属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)枯草杆菌酶。

在一个令人感兴趣的实施方案中，枯草杆菌酶为卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasii、可鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)枯草杆菌酶。

在另一个有用的实施方案中，枯草杆菌酶为棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporium)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichodermakoningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichoderma viride)枯草杆菌酶。

可以理解，对于上述的种，本发明包含理想和不理想状态和其它分类学等同物，如变形物，而不管它们已知的种名。本领域技术人员将易于认识到适当等同物的同一性。

这些种的菌株对公众来说是易于在一些培养物保藏中心得到的，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究服务专利培养物保藏所，北方地区研究中心(NRRL)。

而且，可以采用上述的探针从包含自自然界(如土壤、混合肥料、水等)分离的微生物的其它来源中鉴定并获得此类枯草杆菌酶。用于从天然栖所分离微生物的技术在本领域中是已知的。这样类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库可获得所述的多核苷酸。一旦用探针检测到编码枯草杆菌酶的多核苷酸，可以采用本领域技术人员已知的技术分离并克隆该序列(例如，参见Sambrook等人，1989，上文)。

用于克隆本发明的枯草杆菌酶)以及向基因(如枯草杆菌酶基因)中导入插入物的多种方法在现有技术中是已知的，参见在“发明背景”部分引用的参考文献。

一般来说，可以采用用于克隆基因和向该基因引入插入物(随机和/或定点)的标准方法以获得本发明的枯草杆菌酶。为了进一步描述适宜的技术，参照本文的实施例(见下文)和(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等人(编辑)“分子生物学最新方法”(“Current protocols in Molecular Biology”)，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)“用于芽孢杆菌的分子生物学方法”(“Molecular Biological Methods forBacillus”)，John Wiley和Sons，1990)；和WO 96/34946。

而且，本发明的枯草杆菌酶可以通过标准技术构建，用于人为地产生多样性，如通过不同枯草杆菌酶基因的DNA改组技术(参见WO95/22625；Stemmer WPC，自然370：389-91(1994))。例如将编码Savinase^的基因与实际上已鉴定的一种或多种部分枯草杆菌酶序列进行DNA改组，在随后筛选改进的洗涤性能后，提供本发明的枯草杆菌酶。

多核苷酸

本发明还涉及一种编码本发明枯草杆菌酶的分离的多核苷酸。

在一个令人感兴趣的实施方案中，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的第1-807位核苷酸所示的多核苷酸具有至少88％的同一性。优选地，此多核苷酸与SEQ ID NO：1的第1-807位核苷酸所示的多核苷酸具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO：1的第1-807位核苷酸所示的多核苷酸、其能够编码本发明枯草杆菌酶的等位基因变体或其片断。显然，此多核苷酸可由SEQ ID NO：1的第1-807位核苷酸所示的多核苷酸组成。

本发明还包括编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，它由于遗传密码简并性而不同于SEQ ID NO：1。本发明还涉及编码具有蛋白水解活性的SEQ ID NO：2片断的SEQ ID NO：1的子序列。

SEQ ID NO：1的子序列为包含在SEQ ID NO：1的第1-807位核苷酸内、已去除了5’和/或3’的一个或多个核苷酸的多核苷酸。

本发明还涉及编码本发明枯草杆菌酶的分离的多核苷酸，所述多核苷酸在低严格条件下，优选在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的第1-807位核苷酸所示的多核苷酸的互补链，或(ii)至少含100个核苷酸的(i)的子序列。本发明还涉及(i)和(ii)的互补链。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在现有技术中是已知的，它包括从基因组DNA中分离，由cDNA制备，或它们的组合。可以从这些基因组DNA克隆本发明的多核苷酸，例如通过使用已知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆的DNA片断。例如，参见Innis等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR：A Guide to Methods and Application)，Academic Press，纽约。可以使用其它的核酸扩增方法如连接酶链反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

分离的多核苷酸可以例如通过遗传工程中所用的标准克隆方法获得，以便将该核苷酸从其天然位置重新定位到可使其复制的不同位点处。克隆方法可包括切除和分离含编码枯草杆菌酶的多核苷酸的所需核酸片断，将此片断插入到载体分子，并将此重组载体整合到宿主细胞，在宿主细胞中复制出该多核苷酸的多个拷贝或克隆。此多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成来源、合成来源或它们的任一组合。

为本发明的目的，两个多核苷酸之间的同一性程度如上述测定。

编码本发明的枯草杆菌酶的多核苷酸的修饰对于合成与该枯草杆菌酶基本类似的枯草杆菌酶是必须的。术语“基本上类似的”枯草杆菌酶指非天然存在的枯草杆菌酶的形式。这些枯草杆菌酶在某些设计方式上可与从其天然来源分离得到的枯草杆菌酶不同，如在特定的活性、热稳定性、pH最佳值等方面存在的不同变体。可以在作为SEQ ID NO：1的多肽编码部分而存在的多核苷酸的基础上构建变体序列，如其子序列和/或通过以下方法构建：引入核苷酸取代，其不产生由该核酸序列编码的另一种枯草杆菌酶的氨基酸序列，但对应于欲用于生产这种酶的宿主生物体的密码子使用；或者引入核苷酸取代，其可产生不同的氨基酸序列。核苷酸取代的一般性描述，参见Ford等人，1991，蛋白质的表达和纯化(Protein Expression and Purification)2：95-107。

对于本领域技术人员来说，显然这种取代可以在所述分子的关键功能区之外进行并仍产生活性枯草杆菌酶。对本发明的分离的多核苷酸编码的多肽的活性至关重要的氨基酸残基，优选其不发生取代，可以根据本领域中已知的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如，参见Cunningham和Wells，1989，科学(Science)244：1081-1085)。在后一技术中，在此分子的每一个带正电荷的残基处引入突变，并试验所得突变分子的蛋白水解活性，以鉴定此分子活性的关键氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也可以通过三维结构分析测定，这种三维结构是由诸如核磁共振分析、结晶学或光亲合标记技术而测定的(例如，参见de Vos等人，1992，科学255：306-312；Smith等人，1992，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的核酸核建体，所述核酸可操作地与一种或多种能够指导多肽在适宜的宿主细胞内表达的调控序列相连接。

可以多种方式操作编码本发明枯草杆菌酶的分离多核苷酸以提供枯草杆菌酶的表达。在插入载体之前对多核苷酸操作的适当性和必需性取决于表达载体。采用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术在现有技术中是已知的。

所述调控序列包括所有表达本发明枯草杆菌酶所必需或有利的组分。每一种调控序列对于编码枯草杆菌酶的多核苷酸来说可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于先导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，所述调控序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。可以为此调控序列提供用于引入特定限制性位点的接头，促进此调控序列与编码枯草杆菌酶的多核苷酸编码区连接。

所述调控序列可以是适宜的启动子序列，为被宿主细胞识别用于表达核酸序列的多核苷酸。所述的启动子序列含介导枯草杆菌酶表达的转录调控序列。所述的启动子可以是在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的任何多核苷酸，包括突变体、截短和杂合启动子，并可以由与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内枯草杆菌酶的基因获得。

用于指导本发明核酸构建体的转录，尤其是在细菌宿主细胞中转录的适宜的启动子的实例为得自以下的启动子：大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院院报75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院报80：21-25)。其它的启动子如在以下文献中所述：“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”，科学美国人(Scientific American)，1980，242：74-94；和Sambrook等人，1989，见上文。

用于指导在丝状真菌宿主细胞中本发明的核酸构建体的转录的适宜的启动子的实例为得自以下的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、Rhiomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhiomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)，以及Na₂-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)和它们的突变体、截短和杂合启动子。

在酵母宿主中，有用启动子得自以下来源的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它酵母宿主细胞的有用启动子如Romanos等人，1992，酵母(Yeast 8：423-488所述。

所述调控序列还可以是一种适宜的转录终止子序列，为由宿主细胞识别用于终止转录的序列。终止子序列可操作地连接到编码枯草杆菌酶的多核苷酸的3’末端。任何在所选择的宿主细胞中发挥功能的终止子可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子得自以下来源的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

优选的酵母宿主细胞终止子得自以下来源的基因：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的酵母宿主细胞的终止子。

所述调控序列还可以是适宜的先导序列，为对宿主细胞翻译重要的mRNA非翻译区。所述先导序列可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的5’末端。任何在所选择的宿主细胞内发挥功能的先导序列可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的先导序列得自以下来源的基因：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

适宜的酵母宿主细胞先导序列得自以下来源的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

所述调控序列还可以是聚腺苷酸化序列，该序列可操作地连接到多核苷酸的3’末端且在转录时被宿主细胞识别为一种将聚腺苷残基加至被转录的mRNA的信号的序列。任何在所选择的宿主细胞中发挥功能的聚腺苷酸化序列可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列得自以下来源的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列如由Guo和Sherman，1995，分子细胞生物学(Molecular Cellular Biology)15：5983-5990所描述。

所述的调控序列还可以是信号肽编码区，其编码连接到枯草杆菌酶的氨基末端的氨基酸序列并指导所编码的枯草杆菌酶进入细胞分泌途径。所述多核苷酸的编码序列的5’端本身可以包含一个天然连接在具有编码所分泌的枯草杆菌酶的编码区节段的翻译读框上的信号肽编码区。可选择地，所述编码序列的5’端可以包含此编码序列的外源信号肽编码区。当所述的编码序列并不天然包含一个信号肽编码区时，可能需要外源信号肽编码区。可选择地，所述的天然信号肽编码区可用外源信号肽编码区简单替换以促进枯草杆菌酶的分泌。但任何可指导所表达的枯草杆菌酶进入所选择的宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区均可用于本发明。

细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自以下来源的基因的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。其它的信号肽如在以下文献中所述：Simonen和Palva，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57：109-137。

丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自以下基因的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶。

酵母宿主细胞的有用信号肽得自以下来源的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的信号肽编码区。

所述调控序列还可以是编码位于枯草杆菌酶氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得的多肽已知是一种酶原或前多肽(或在某些情况下为酶原)。前多肽一般没有活性，并可以通过催化切割或自身催化切割来自前多肽的前肽而转化为成熟的活性多肽。所述的前肽编码区可以得自以下来源的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)。

当在枯草杆菌酶的氨基末端存在信号肽和前肽区两者时，所述的前肽区与枯草杆菌酶的氨基末端相邻，所述的信号肽区与所述前肽区的氨基末端相邻。

加入对与宿主细胞生长相关的多肽的表达进行调节的调控序列也是有利的。那些调控系统的实例是其对化学或物理刺激物(包括存在的调节化合物)的应答可以使得基因的表达被开启或关闭的系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可以用作调控序列。调控序列的其它实例为允许基因扩增的调控序列。在真核系统中，它们包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸可操作地与调控序列连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的核酸构建体、启动子和转录与翻译终止信号的重组表达载体。

包含编码本发明酶的核酸构建体的重组表达载体可以是任何可方便地进行重组DNA操作的载体。

载体的选择一般取决于它将被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，这种载体的复制独立于染色体的复制，如质粒。可选择地，所述载体可以是在导入宿主细胞后，被部分或全部整合入宿主细胞基因组，并与将其整合进去的染色体一起复制。

所述载体优选为这样的表达载体，其中，编码本发明的酶的DNA序列可操作地与其它的DNA转录所需的节段相连接。一般来说，所述表达载体来自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。术语“可操作地连接”指将所述诸节段以使其按它们的预期目的发挥功能的方式排列，如转录是在启动子中引发并通过编码此酶的DNA序列而前行。

所述的启动子可以是任何在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的DNA序列，并可以得自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质编码基因。

用于细菌宿主细胞的适宜的启动子的实例包括以下基因的启动子：嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或噬菌体λ-P_R或P_L启动子或大肠杆菌 lac、 trp或 tac启动子。

如果需要，编码本发明酶的DNA序列还可以可操作地连接到适宜的终止子上。

本发明的重组载体还可包含能够使所述载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。

所述载体还可以包含可选择的标记，例如其产物弥补宿主细胞缺陷的基因，或编码如对抗生素像卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等的抗性，或对重金属或除草剂的抗性的基因。

为了指导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也公知为先导序列、前原序列或前序列)。可以将分泌信号序列以正确读框连接到编码酶的DNA序列。分泌信号序列一般位于编码此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信号序列可以是通常与该酶相关的或来自编码另一种分泌蛋白质的基因。

用于分别连接编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列，或通过适宜的PCR扩增方案组配这些序列和将它们插入至含有复制或整合所需信息的适宜的载体的方法对本领域技术人员来说是已知的(参见例如，Sambrook等人，在所引述的文章中)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。

导入到宿主细胞中的编码本发明的酶的DNA序列可以与所讨论的宿主同源或异源。如果与所述宿主细胞同源，即由该宿主细胞天然产生，编码本发明的酶的DNA序列一般可操作地与非天然环境中存在的另一启动子序列相连接，或者在可应用的情况下与另一分泌信号序列和/或终止子序列相连接。所用术语″同源″指包括编码天然存在于所讨论的宿主生物体中的酶的DNA序列。所用术语“异源的”是指包括在所述宿主细胞中本身不表达的酶的DNA序列。因此所述的DNA序列可以来源于另一生物体或者是合成的序列。

导入本发明的DNA构建体或重组载体的宿主细胞包括任何能够产生本发明的酶的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞，包括植物。

通过培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌菌株，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，特别是迟缓芽孢杆菌，或链霉菌菌株，如变铅青链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。

所述细菌的转化可以通过已知的方式用原生质体转化、电穿孔、接合或使用感受态细胞进行(参见Sambrook等人，见上)。

当在细菌如大肠杆菌中表达所述的酶时，该酶一般以非溶解性颗粒驻留于细胞质中(已知称作包涵体)，或由细菌分泌序列引导到周质间隙。在前一种情况下，将细胞裂解，回收所述颗粒，变性，其后通过稀释变性试剂使酶重新折叠。后一种情况下，该酶通过以下操作回收：如超声或渗透压休克破坏细胞，使所述的周质间隙的内容物释放，再回收该酶。

当在革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达该酶时，该酶可以驻留于细胞质中，或由细菌分泌序列引导到胞外培养基中。在后一种情况下，该酶可按下述方法从培养基中回收。

在本发明的另一实施方案中，所述的真菌宿主细胞是酵母细胞。此处所用到的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子酵母和属于半知菌亚门(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于将来酵母分类有可能发生变化，为本发明的目的，酵母应当按照如酵母的生物学和活性(Biology andActivities of Yeast)(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所描述的进行定义。

在一优选的实施方案中，所述的酵母宿主细胞是假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、啤酒酵母(酵母属)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或Yarrowia的细胞。

在另一最优选的实施方案中，所述的酵母宿主细胞是卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、可鲁弗酵母、诺地酵母或卵形糖酵母细胞。

在另一最优选的实施方案中，所述的酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一最优选的实施方案中，所述的酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一优选的实施方案中，所述的真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有的真菌门(Eumycota)亚门和卵菌门(Oomycota)亚门的丝状形式(如Hawksworth等人，1995中所定义的，见上)。所述的丝状真菌是以包含几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖的菌丝体壁为特征。

营养生长是通过菌丝延长进行的，而碳代谢是需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体出芽进行的，碳代谢可以是发酵的。

在另一更优选的实施方式中，所述的丝状真菌宿主细胞是但不限于顶孢霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、链孢霉属、青霉属、草根霉菌属、Tolypocladium或木霉属类的细胞。

在另一最优选的实施方式中，所述的丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉细胞。在另一最优选的实施方式中，所述的丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum细胞。在一最优选的实施方式中所述的丝状真菌亲本细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。

在另一最优选的实施方式中，所述的丝状真菌宿主细胞是Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉、Trichodermaharzianum、康宁木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

真菌细胞可通过一种下述方法转化，所述方法包括用目前已知的方式形成原生质体、转化该原生质体并再生细胞壁。适合用于转化曲霉属宿主细胞的方法已在下述文献中描述：EP 238 023和Yelton等人，1984，美国国家科学院院报81：1470-1474。转化镰孢霉属的方法已在下述文献中描述：Malardier等人，1989，基因(Gene)78：147-156和WO 96/00787。酵母转化可以用在下述文献中描述的方法进行：Becker和Guarente，见Abelson，J.N.和Simon，M.I.编辑，酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法，194卷，182-187页，Academic Press，Inc.，纽约；Ito等人，1983，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)153：163；和Hinnen等人，1978，美国国家科学院院报75：1920。

生产本发明的枯草杆菌酶的方法

本发明进一步涉及生产本发明的枯草杆菌酶的方法，该方法包括：

a)在有益于所述枯草杆菌酶生产的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和

b)回收所述的枯草杆菌酶。

当含编码所述酶的DNA序列的表达载体转化入异源宿主细胞中时即可使本发明的该酶异源重组产生。

由此可以生产以不含同源杂质为特征的的高度纯化的枯草杆菌酶组合物。

本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明的酶的同源细胞的任何杂质(例如除本发明的酶之外的其他多肽)。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于所讨论的宿主细胞生长的常规培养基。所表达的枯草杆菌酶可方便地分泌到培养基中，然后可以通过已知的方法回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，再利用盐如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质组分，接下来进行层析，如离子交换层析、亲和层析等。

本发明的枯草杆菌酶的用途

本发明的枯草杆菌酶可以有多种工业用途，尤其是在洗涤剂工业中。因此本发明还涉及包含本发明的酶的清洁或洗涤剂组合物，优选包含本发明的酶的洗衣或洗盘组合物。

含本发明所述枯草杆菌酶的洗涤剂组合物：

一般来说，清洁和洗涤剂组合物已在本领域中有所描述，对合适的清洁和洗涤剂组合物的进一步描述可以参见WO 96/34946；WO97/07202；WO 95/30011。

而此处所述的实例表明本发明的枯草杆菌酶对卵污渍所表现出的优越的洗涤性能。

洗涤剂组合物

本发明的酶可以添加到清洁或洗涤剂组合物中而成为其中的组分。

例如，本发明的洗涤剂组合物可以制成用于手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括适用于预处理污染织物的洗涤添加剂组合物和漂洗添加的纤维软化剂组合物，或制成用于清洁普通家具硬表面的洗涤剂组合物，或被制成用于手洗或机洗的洗盘操作。

在一特定的方面，本发明提供一种包含本发明的枯草杆菌酶的洗涤添加剂。所述的洗涤添加剂和洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它的酶如另一种蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶、例如漆酶，和/或过氧化物酶。

一般来说，所选择的酶的性能应当与所选择的洗涤剂相适应(即pH-最适宜，与其它酶或非酶组分具相容性等)，且所述的酶应以有效剂量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括来自动物、植物、微生物的蛋白酶。

来源于微生物的蛋白酶是优选的。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。所述的蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述的)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO 89/06270和WO94/25583中所公开的镰孢霉属的蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729，WO 98/20115，WO98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在一个或多个下述位置发生替换的变体：27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。

优选的可商购的蛋白酶包括Alcalase^TM，Savinase^TM，Primase^TM，Duralase^TM，Esperase^TM和Kannase^TM(Novo Nordisk A/S)，Maxatase^TM，Maxacal^TM，Maxapem^TM，Properase^TM，Purafect^TM，Purafect OxP^TM，FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括那些来源于细菌或真菌的脂肪酶。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括如EP258 068和EP 305 216中所公开的来自腐质霉属(Thermomyces与之同物异名)，例如来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶或如WO96/13580中所公开的来自H.Insolens的脂肪酶，假单胞菌脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.Alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.Pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.Cepacia)(EP 331376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.Fluorescens)，假单胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)，芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993)，生物化学与生物物理学学报(Biochemica etBiophysica Acta)，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)。

其它的实例为如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 407 225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所公开的脂肪酶变体。

优选的可商购的脂肪酶包括Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(NovoNordisk A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些来源于细菌或真菌的淀粉酶。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如来源于芽孢杆菌的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌的特定菌株，详细内容参见GB 1,296,839。

有用的淀粉酶的实例是如WO 94/02597，WO 94/18314，WO96/23873和WO 97/43424中所描述的变体，尤其是那些在一个或多个下列位置发生替换的变体：15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM，Termamyl^TM，Fungamyl^TM和BAN^TM(Novo Nordisk A/S)，Rapidase^TM和Purastar^TM(来自GenencorInternational Inc.)。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括来源于细菌或真菌的纤维素酶。也包括其经化学修饰或蛋白工程突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、草根霉属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如可由在US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US5,776,757和WO 89/09259中公开的Humicola insolens、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的所述真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶是具有颜色保护优势的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例为如EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中所公开的纤维素酶。其它的实例为如那些在WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所公开的纤维素酶变体。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(Novo NordiskA/S)，Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些来源于植物、细菌或真菌的过氧化物酶/氧化酶。也包括化学修饰或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括如WO 93/24618，WO 95/10602和WO 98/15257所述的来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus))和其变体的过氧化物酶。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novo Nordisk A/S)。

所述的洗涤剂酶可以通过添加含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，也就是独立添加剂或组合添加剂可以制成例如颗粒状、液体、浆状等等。优选的洗涤剂添加剂形式为颗粒状(特别是非粉末化颗粒)、液体(特别是稳定的液体)或浆。

非粉末化颗粒可依照例如US 4,106,991和4,661,452所述进行生产并可任选地用已知的方法包被。蜡状包被材料的实例是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中，醇含12到20个碳原子且其中存在15到80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中给出了适合于通过流化床技术应用的成膜包被材料的实例。液体酶制剂可以依照现成的方法通过例如添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以稳定。受保护的酶可依照EP 238,216中所公开的方法进行制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如棒状、片状、粉末、颗粒、粘团或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或不含水的。

所述的洗涤剂组合物一般包含一种或多种表面活性剂，它们可以是非离子表面活性剂，包括半极性的和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。所述的表面活性剂一般占到0.1％到60％的重量。当包含在所述洗涤剂中时，通常包含约1％到约40％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸酯、α-烯属磺酸酯、硫酸烷基酯(硫酸脂肪醇酯)、乙氧基硫酸醇酯、仲链烷磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或皂。

当包含在所述洗涤剂中时，通常含有约0.2％到约40％的非离子表面活性剂例如乙氧基化脂肪醇、乙氧基化壬基酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

所述的洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂增洁剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层叠式硅酸盐(例如购自Hoechst的SKS-6)。

所述的洗涤剂还可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。

所述的洗涤剂还可以含有可能包含H₂O₂来源的漂白体系，如可以与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐结合的过硼酸盐或过碳酸盐。可选择地，所述的漂白体系可以包含例如酰胺、二酰亚胺或砜类的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物中的酶可以通过诸如以下的常规稳定剂稳定：多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，且所述的组合物也可制备为如WO 92/19709和WO 92/19708中所述的组合物。

所述的洗涤剂还可以包含其它的常规洗涤剂成分例如纤维调节剂包括黏土、增泡剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增白剂、助溶剂、失泽抑制剂或香料。

目前认为在所述洗涤剂组合物中任何酶，特别是本发明的酶可以以相当于每升洗涤液中具有0.01-100mg酶蛋白质，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白质，特别优选每升洗涤液中具有0.1-1mg酶蛋白质的量加入。

本发明的酶可以添加到如WO 97/07202所公开的洗涤剂配方中，该文献引入本文作为参考。

通过下述的实例对本发明进行较详细说明，这些实例不作为对本发明请求保护范围的任何限制。

在洗涤剂组合物中，简写成分的意义如下：

LAS：        直链C₁₂烷基苯磺酸钠

TAS：        牛油烷基硫酸钠

XYAS：       C_1x-C_1y烷基硫酸钠

SS：         式2-丁基辛酸的仲皂化表面活性剂

25EY：       与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C₁₂-C₁₅的

             直链伯醇

45EY：       与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C₁₄-C₁₅

             的直链伯醇

XYEZS：      每摩尔与平均Z摩尔的环氧乙烷缩合的C_1x-C_1y烷基

             硫酸钠

非离子：     平均乙氧基化程度3.8而平均丙氧基化程度为4.5

             的C₁₃-C₁₅混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，由

             BASF GmbH售出，商品名为Plurafax LF404

CFAA：       C₁₂-C₁₄烷基N-甲基葡糖酰胺

TFAA：       C₁₆-C₁₈烷基N-甲基葡糖酰胺

硅酸盐：     无定型硅酸钠(SiO₂∶Na₂O比率＝2.0)

NaSKS-6：    分子式为δ-Na₂Si₂O₅的晶状多层硅酸盐

碳酸盐：     无水碳酸钠

磷酸盐：    三磷酸钠

MA/AA：     1∶4马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约为80,000

聚丙烯酸酯：平均分子量为8,000的聚丙烯酸酯均聚物，由BASF

            GmbH销售，商品名为PA30

沸石A：     基本颗粒大小在1-10微米范围内的分子式为

            Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂·27H₂O的水合硅铝酸钠

柠檬酸盐：  二水合三柠檬酸钠

Citric：    柠檬酸

过硼酸盐：  无水过硼酸钠一水合物漂白剂，经验式为

            NaBO₂·H₂O₂

PB4：       无水过硼酸钠四水合物

过碳酸盐：  经验式为2Na₂CO₃·3H₂O₂的无水过碳酸钠漂白剂

TAED：      四乙酰基乙二胺

CMC：       羧甲基纤维素钠

DETPMP：    二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto出售，

            商品名为Dequest 2060

PVP：       聚乙烯吡咯烷酮聚合物

EDDS：      钠盐形式的乙二胺-N，N′-二琥珀酸[S，S]异构体

抑泡剂：    25％固体石蜡，熔点温度50℃，17％疏水硅石，

            58％石蜡油

粒状抑泡剂：12％硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％粒状淀粉

硫酸盐：    无水硫酸钠

HMWPEO：    高分子量聚环氧乙烷

TAE 25：    乙氧基化牛油醇(25)

洗涤剂实例I

本发明的粒状纤维清洁组合物可依照下述制备：

直链C12烷基苯磺酸钠

6.5

硫酸钠沸石A次氮基三乙酸钠酶PVPTAED硼酸过硼酸盐苯酚磺酸盐次要组分

15.026.05.00.10.53.04.018.00.1补充至100％

洗涤剂实例II

本发明的致密颗粒纤维清洁组合物(密度800g/l)可依照下述制备：

45AS25E3S25E525E3TFAA沸石ANaSKS-6柠檬酸碳酸盐MA/AACMC酶TAED过碳酸盐EDDS

8.02.03.03.02.517.012.03.07.05.00.40.16.022.00.3

粒状抑泡剂水/次要组分

3.5补充至100％

洗涤剂实例III

本发明的对洗涤彩色织物特别有用的粒状织物清洁组合物可依照下述制备：

LASTASTFAA45AS45E725E3S68E1125E5柠檬酸盐碳酸盐柠檬酸沸石ANa-SKS-6MA/AADETPMP酶硅酸盐硫酸盐PVP聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物过硼酸盐

10.72.4-3.14.0-1.8-15.0-2.532.1-5.00.20.102.55.20.5-1.0

--4.010.0-3.0-8.07.010.03.025.09.05.00.80.05-3.0-0.2-

苯酚磺酸盐	0.2	-
			水/次要组分	补充至100％

洗涤剂实例IV

本发明的具有“洗涤过程中的软化处理”能力的粒状织物清洁组合物可依照下述制备：

45ASLAS68AS45E725E3椰油-烷基-二甲基羟基乙基氯化铵柠檬酸盐Na-SKS-6沸石AMA/AADETPMP过硼酸盐过碳酸盐TAED绿土黏土HMWPEO酶硅酸盐碳酸盐粒状抑泡剂CMC

-7.61.34.0-1.45.0-15.04.00.415.0-5.010.0-0.103.010.01.00.2

10.0---5.01.03.011.015.04.00.4-15.05.010.00.10.055.010.04.00.1

水/次要组分

补充至100％

洗涤剂实例V

本发明的强力液体织物清洁组合物可依照下述制备：

酸式LAS柠檬酸酸式25AS酸式25AE2S25AE7CFAADETPMP脂肪酸油酸乙醇丙二醇酶椰油-烷基二甲基羟基乙基氯化铵绿土黏土PVP	-5.08.03.08.051.08-4.02.00.10--2.0	25.02.0----1.0-1.06.06.00.053.05.0-
			水/次要组分	补充至100％

粉末自动洗盘组合物I

非离子表面活性剂	0.4-2.5％
		硅酸钠	0-20％
二硅酸钠	3-20％
		三磷酸钠	20-40％
碳酸钠	0-20％

过硼酸钠	2-9％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	1-4％
硫酸钠	5-33％
		酶	0.0001-0.1％

粉末自动洗盘组合物II

非离子表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)	1-2％
		二硅酸钠	2-30％
碳酸钠	10-50％
		磷酸钠	0-5％
柠檬酸三钠二水合物	9-30％
		乙酸次氮基三钠(NTA)	0-20％
过硼酸钠一水合物	5-10％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	1-2％
聚丙烯酸盐聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物)	6-25％
		酶	0.0001-0.1％
香料	0.1-0.5％
		水	5-10

粉末自动洗盘组合物III

非离子表面活性剂	0.5-2.0％
		二硅酸钠	25-40％
柠檬酸钠	30-55％
		碳酸钠	0-29％
碳酸氢钠	0-20％

一水合过硼酸钠	0-15％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-6％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
		黏土	1-3％
聚氨基酸	0-20％
		聚丙烯酸钠	0-8％
酶	0.0001-0.1％

粉末自动洗盘组合物IV

非离子表面活性剂	1-2％
		沸石MAP	15-42％
二硅酸钠	30-34％
		柠檬酸钠	0-12％
碳酸钠	0-20％
		过硼酸钠一水合物	7-15％
四乙酰基乙二胺(TAED)	0-3％
		多聚物	0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
		有机磷酸脂	0-4％
黏土	1-2％
		酶	0.0001-0.1％
硫酸钠	平衡

粉末自动洗盘组合物V

非离子表面活性剂

1-7％

二硅酸钠	18-30％
		柠檬酸三钠	10-24％
碳酸钠	12-20％
		单过硫酸盐(2KHSO5·KHSO4·K2SO4)	15-21％
漂白稳定剂	0.1-2％
		马来酸/丙烯酸共聚物	0-6％
二亚乙基三胺五乙酸五钠盐	0-2.5％
		酶	0.0001-0.1％
硫酸钠，水	平衡

粉末和液体的具洗涤表面活性剂系统的洗盘组合物VI

非离子表面活性剂	0-1.5％
		十八烷基二甲基胺N-氧化物二水合物	0-5％
十八烷基二甲基胺N-氧化物二水合物和十六烷基二甲基胺N-氧化物二水合物的80∶20wt.C18/C16掺混物	0-4％
		无水十八烷基双(羟乙基)N-氧化物和无水十六烷基双(羟乙基)胺N-氧化物的70∶30wt.C18/C16掺混物	0-5％
平均乙氧基化程度为3的C13-C15烷基乙氧基硫酸酯	0-10％
		平均乙氧基化程度为3的C12-C15烷基乙氧基硫酸酯	0-5％
平均乙氧基化程度为12的C13-C15乙氧基化的醇	0-5％
		平均乙氧基化程度为9的C12-C15乙氧基化醇混合物	0-6.5％
平均乙氧基化程度为30的C13-C15乙氧基化醇	0-4％

混合物
		二硅酸钠	0-33％
三磷酸钠	0-46％
		柠檬酸钠	0-28％
柠檬酸	0-29％
		碳酸钠	0-20％
过硼酸钠一水合物	0-11.5％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-7.5％
		硫酸钠	0-12.5％
酶	0.0001-0.1％

非水的液态自动洗盘组合物VII

液体非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
		碱金属硅酸盐	3.0-15.0％
碱金属磷酸盐	20.0-40.0％
		选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液体载体	25.0-45.0％
稳定剂(例如磷酸和C16-C18链烷醇的不完全酯)	0.5-7.0％
		泡沫抑制剂(例如硅氧烷)	0-1.5％
酶	0.0001-0.1％

非水的液态洗盘组合物VIII

液体非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
		硅酸钠	3.0-15.0％
碱金属碳酸盐	7.0-20.0％

柠檬酸钠	0.0-1.5％
		稳定系统(例如细粒硅氧烷和低分子量二烷基聚乙二醇醚的混合物)	0.5-7.0％
低分子量聚丙烯酸酯聚合物	5.0-15.0％
		黏土凝胶增稠剂(例如斑脱土)	0.0-10.0％
羟丙基纤维素聚合物	0.0-0.6％
		酶	0.0001-0.1％
选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物和乙二醇醚的液体载体	平衡量

触变性液体自动洗盘组合物IX

C12-C14脂肪酸	0-0.5％
		嵌段共聚物表面活性剂	1.5-15.0％
柠檬酸钠	0-12％
		三磷酸钠	0-15％
碳酸钠	0-8％
		三硬脂酸铝	0-0.1％
枯烯磺酸钠	0-1.7％
		聚丙烯酸盐增稠剂	1.32-2.5％
聚丙烯酸钠	2.4-6.0％
		硼酸	0-4.0％
甲酸钠	0-0.45％
		甲酸钙	0-0.2％
正癸基二苯基氧化物二磺酸钠	0-4.0％
		一乙醇胺(MEA)	0-1.86％
氢氧化钠(50％)	1.9-9.3％
		1，2-丙二醇	0-9.4％

酶	0.0001-0.1％
		抑泡剂、染料、香料、水	平衡量

液体自动洗盘组合物X

脂肪醇乙氧基化物	0-20％
		脂肪酸酯磺酸酯	0-30％
十二烷基硫酸钠	0-20％
		烷基多苷	0-21％
油酸	0-10％
		二硅酸钠一水合物	18-33％
柠檬酸钠二水合物	18-33％
		硬脂酸钠	0-2.5％
过硼酸钠一水合物	0-13％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-8％
马来酸/丙烯酸共聚物	4-8％
		酶	0.0001-0.1％

含被保护的漂白颗粒的液体自动洗盘组合物XI

硅酸钠	5-10％
		焦磷酸四钾	15-25％
三磷酸钠	0-2％
		碳酸钾	4-8％
被保护的漂白颗粒，如氯	5-10％
		聚合增稠剂	0.7-1.5％
氢氧化钾	0-2％

酶	0.0001-0.1％
		水	平衡

XII：如I、II、III、IV、VI和X所述的自动洗盘组合物，其中，由过碳酸盐替代过硼酸盐。

XIII：如I-VI所述的自动洗盘组合物，其还含有锰催化剂。所述的锰催化剂可以是例如，在“用于低温漂白的高效锰催化剂”(“Efficientmanganese catalysts for low-temperature bleaching”)，自然，(1994)，369，637-639中所述的化合物中的一种。

材料和方法

蛋白水解活性

在本发明的上下文中蛋白水解活性是用Kilo NOVO蛋白酶单位(KNPU)表示的。所述的活性相对于酶标准品(SAVINASE^)而确定，所述的测定是基于在标准条件下蛋白水解酶对二甲基酪蛋白(DMC)溶液的消化进行的，所述的标准条件为50℃，pH 8.3，反应时间9分钟，测定时间3分钟。需要时可向Novo Nordisk A/S，Denmark索取AF 220/1文件夹，该文件夹包含在此作为参考。

GU是甘氨酸单位，定义为蛋白水解酶活性，在标准条件下，N-乙酰基酪蛋白作为底物在40℃温育15分钟，产生相当于1mmole甘氨酸的NH₂-基团量。

也可以用PNA试验根据与在美国油脂化学家学会会志(Journal ofAmerican Oil Chemists Society)，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，L.A.，(1988)中描述的底物琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-对硝基苯酚反应测定酶活性。

实施例1-本发明的枯草杆菌酶的构建和表达

具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶定位于载体pJRoC112，其与质粒pKH400(已在WO98/41623中有描述)非常相似。上述质粒在编码成熟的枯草杆菌蛋白酶的区域外是相同的，即这些质粒中的复制起点，表现氯霉素抗性的cat基因，引导枯草杆菌蛋白酶转录启始的启动子和来自Savinase^的前/原区域都是一致的。仅编码成熟枯草杆菌蛋白酶基因部分存在区别。

这一质粒可在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制。在枯草芽孢杆菌中由该质粒表达本发明的枯草杆菌蛋白酶。该蛋白酶的发酵和纯化如下所述。

PKH400是通过向pJS3(如J.Schidt等人，见：蛋白质和肽通讯(Protein and Peptide Letters)，3，39-44(1996)中所述的含编码枯草杆菌酶309(savinase^)的合成基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体)的第1841和3730位引入两个BamHI位点而构建的。

成熟的基因已亚克隆到质粒pzero-2(Invitrogen，Groningen，TheNetherlands)中。将含有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的枯草杆菌酶全长成熟区域的约1240bp PmeI-BamHI片段连接到载体pZero-2上，用限制性内切酶BamHI-EcoRV消化。将连接混合物转化感受态的大肠杆菌细胞。通过PCR分析转化子以证明是否存在插入片段，并对编码成熟枯草杆菌蛋白酶的这一片段部分进行测序。所得质粒命名为pTVB364，于2000年2月10目保藏于DSMZ，保藏号为DSM 13306。

发酵

发酵生产枯草杆菌酶是按下述进行的：30℃下在旋转振荡台(300转/分钟)上用含100ml BPX培养基的500ml挡板式锥形瓶发酵5天。

因此，为了获得例如2升肉汤需用20个锥形瓶同时发酵。

培养基：

    BPX培养基成分(每升)

    马铃薯淀粉                100g

    磨碎的大麦                50g

    大豆粉                    20g

    Na₂HPO₄×12H₂O        9g

    普朗尼克(Pluronic)        0.1g

    酪蛋白酸钠                10g

培养基中的淀粉是用α-淀粉酶液化的，该培养基在120℃下加热45分钟灭菌。灭菌后向培养基中添加NaHCO₃至0.1M，将pH调节到9。

纯化

这一过程涉及纯化在芽孢杆菌宿主细胞中产生的本发明的枯草杆菌酶的2升发酵液。

在1升的烧杯内将约1.6升发酵肉汤于5000转/分钟离35分钟。用10％的醋酸调节上清液，使其pH值为6.5，并用Seitz Supra S100过滤盘过滤。

用配备有Amicon S1Y10 UF滤筒的Amicon CH2A UF装置将滤出液浓缩至约400ml。在用杆菌肽亲和柱于pH 7条件下吸附前，先将UF浓缩物离心并于室温下过滤。所述枯草杆菌酶于室温下用在含0.01M二甲基戊二酸，0.1M硼酸和0.002M氯化钙、已调节pH为7的缓冲液中的25％异丙醇和1M氯化钠从杆菌肽柱洗脱。

由杆菌肽纯化步骤中所得的具有蛋白酶活性的级分合并应用于用含0.01M二甲基戊二酸，0.2M硼酸和0.002M氯化钙调pH至6.5的缓冲液平衡的750ml Sephadex G25柱(直径5cm)。

由Sephadex G25所得的具有蛋白水解活性的级分合并应用于用含0.01M二甲基戊二酸，0.2M硼酸和0.002M氯化钙调节pH至6.5的缓冲液平衡的150ml CM Sepharose CL 6B阳离子交换柱(直径5cm)。

所述蛋白酶用在2升相同缓冲液中的0-0.1M线性梯度氯化钠洗脱。

最后的纯化步骤中，将由CM Sepharose柱获得的含有蛋白酶的级分合并并在装有GR81PP膜(出自Danish Sugar Factories Inc.)的Amicon超滤池中浓缩。

应用上述构建和发酵技术以及分离步骤，即可生产并分离出所述的具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的新枯草杆菌酶。

实施例2-“标准的洗涤剂洗涤性能试验”

为评估枯草杆菌酶在标准洗涤剂组合物中的洗涤性能，用下述的实验条件进行了标准洗涤实验：

    洗涤剂：                    标准洗涤剂

    洗涤剂剂量                  4.0g/l

    pH                          10.1

    洗涤时间                    20分钟

    温度：                      30℃

    水硬度：                    15°dH

    酶浓度：                    10nm(在洗涤剂溶液中)

    测试系统：                  10ml烧杯和搅拌棒

    织物/体积：                 5件织物(2.5cm)/50ml洗涤剂溶液

    测试材料：                  WFK10N(卵污渍)

所述的标准洗涤剂的组分如下：

6.2％     LAS(Nansa 80S)

2％       C₁₆-C₁₈脂肪酸钠盐

4％       非离子表面活性剂(Plurafax LF404)

22％      沸石P

10.5％    Na₂CO₃

4％       Na₂Si₂O₅

2％      羧甲基纤维素(CMC)

6.8％    丙烯酸盐液体CP540％

20％     过硼酸钠(经验式NaBO₂·H₂O₂)

0.2％    EDTA

21％     Na₂SO₄

         水(平衡量)

通过向测试系统中添加HCl或NaOH将洗涤剂溶液的pH调节到10.1。通过添加CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺∶Mg²⁺＝4∶1)将水硬度调节到15°dH。洗涤后将织物用自来水冲洗并于空气中干燥。

对试验材料反射能力(R_{枯草杆菌酶})的测定是用Macbeth ColorEye 7000photometer(Macbeth，Division of Kollmorgen InstrumentsCorporation，德国)在460nm下进行的。测定方法依制造商的建议进行。

为确定空白值，进行了不添加酶的类似洗涤实验。接下来如上述进行反射能力(R_空白)的测定。

然后如上所述进行参考实验，其中测定了Savinase^的洗涤性能。接下来，如上所述测定了反射能力(R_savinase)。

所述的洗涤性能是用根据下述公式定义的性能因子(P)进行评估的：

      P＝(R_{枯草杆菌酶}-R_空白)-(R_savinase-R_空白)

       ＝R_{枯草杆菌酶}-R_savinase

应用上述实验方法获得了下述结果：

酶	R(460nm)	P
			空白(没有酶)	40.5	-
Savinase	40.7	-
			SEQ ID NO：2	46.5	5.8

可见，与Savinase^相比，本发明的枯草杆菌酶对卵污渍表现出改善的洗涤性能。

实施例3-本发明的枯草杆菌酶在自动清洁剂(ADW)中的性能

本发明的枯草杆菌酶在自动清洁剂(ADW)中的性能是通过在可商购的家用洗盘组合物(Somat Turbo，购自Henkel Waschmittel GmbH)中进行试验的。所用的污物是蛋/牛奶，用其包被钢盘。而且还加入了包含各种食品的压载污物。

洗涤剂：    Somat Turbo

洗涤剂剂量  4.0g/l

pH          10.7(如实)

水硬度：    3°dH(机器离子交换器)

温度：      55℃

酶浓度：    20nM和40nM，根据机器中洗涤水的总体积

试验方法：  如下所述的在钢盘上的蛋/牛奶污物

机器：      Cylinda Compact

洗涤程序：  程序4，不进行预冲洗

材料

220ml全脂牛奶

15个蛋，中等大小

钢盘，直径18cm

Somat Turbo盘洗涤组合物在微波炉中在85℃下加热5分钟以使组合物中的酶失活。

污染钢盘

将220ml全脂牛奶与15个生卵在Braun UK 20 kitchen machine中混合2分钟，过滤后，将不锈钢盘浸没于上述混合物中使其污染。

将上述盘向上放置于室温下干燥过夜。干燥后的盘在120℃下加热45分钟以使其表面的蛋白质变性。

ADW实验

在每一实验中，10个污物盘在没有经过Cylinda Compact machine预洗的情况下洗涤(程序4)。除所述的污物盘外，所述的机器用10个瓷盘、4个玻璃杯、4个茶杯和16套刀叉添满。

而且，向机器中添加50g的压载泥浆。

所述泥浆的组成如下：马铃薯淀粉(5.43％)，小麦粉(4.38％)，菜油(4.32％)，人造黄油(4.32％)，猪油(4.32％)，奶酪(8.76％)，全脂牛奶(8.76％)，蛋(8.76％)，番茄酱(3.00％)，烤肉酱(2.19％)，芥末(4.00％)，苯甲酸(0.73％)，水(3mM Ca²⁺+Mg²⁺)(36.71％)。

测定和计算

所述的光反射值(R-值)是用Minolta Chroma Meter(型号：CR-300)在盘中的六个不同的位点测定的。对干净盘(R_clean)、加热后的污物盘(R_soiled)和清洗后的盘(R_after wash)进行测定。

依照下述公式计算去除的蛋白膜(％RPF)：

％RPF＝100％×(R_after wash-R_soiled)/(R_clean-R_soiled)

用上述试验方法获得了下述结果(±显示标准偏差)：

酶	％RPF(20nM)	％RPF(40nm)
			Savinase	3.9±1.6	3.0±1.0
SEQ ID NO：2	42.4±16.5	78.7±2.1

显而易见，本发明的酶与Savinase^相比具有优越的性能。

生物材料的保藏

下述生物材料根据布达佩斯条约的规定保藏在德意志微生物保藏中心Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig，德国，并获得了下述保藏号：

保藏物	保藏号	保藏日期
			大肠杆菌 MT173	DSM 13306	2000年2月10日

上述保藏物由Novo Nordisk A/S制备，此后转让于NovozymesA/S。

                        序列表

<110>诺和酶股份有限公司

<120>PH004

<130>6137

<150>DK PA 2000 00405

<151>2000-03-14

<160>2

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>807

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(807)

<400>1

gcg caa tcg gta cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc cca gct gcc    48

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1               5                   10                  15

cat aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat       96

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

            20                  25                   30

aca ggg ata tcc act cat cca gat cta aat att cgt ggt ggc gca agc      144

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

        35                  40                  45

ttt gta cca ggg gaa ccg tcg act caa gat ggg aac ggg cac ggg acg      192

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

    50                  55                  60

cac gtt gca gga aca gtg gca gct ctt aat aac tca atc ggt gtg att      240

His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile

65                  70                  75                  80

ggt gtg gcg cca agt gct gat cta tac gct gta aaa gta ctt gga gca      288

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

                85                  90                  95

aat ggt aga gga agc gtt agt gga att gct caa ggt cta gag tgg gct      336

Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

            100                 105                 110

gca gcg aat aac atg cat att gct aac atg agt ctc ggt agt gat gca      384

Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala

        115                 120                 125

cct agt act aca ctt gag cgt gca gtc aac tac gcg aca agc cag ggt      432

Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly

    130                 135                 140

gta cta gtt att gca gcg act ggt aac aac ggt tcc ggt tca gta ggc      480

Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly

145                 150                 155                 160

tat cct gct cgt tat gcc aac gca atg gct gta gga gcg act gac caa      528

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

                165                 170                 175

aac aac aga cgt gca aac ttt tct cag tac ggt aca gga att gac atc      576

Asn Asn Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile

            180                 185                 190

gta gca cct ggc gtt gac att gaa agc acc tac cca ggc agc tct tat      624

Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Glu Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Ser Tyr

        195                 200                 205

gac agc cta agt ggc aca tca atg gct act cca cat gtc gcc ggc gtc      672

Asp Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val

    210                 215                 220

gcc gca cta gtt aaa caa aag aac cca tct tgg tct aat gta caa att      720

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225                 230                 235                 240

cga aat cat cta aag aat acg gca act agt tta gga agc acg aac ttg      768

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

                245                 250                 255

tat gga agc gga ctt gtt aac gca gaa gcg gca acg cgt                  807

Tyr Gly Ser Gly Leu Val ASn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

            260                 265

<210>2

<211>269

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1               5                   10                  15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

            20                  25                  30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

        35                  40                  45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

    50                  55                  60

His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile

65                  70                  75                  80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

                85                  90                  95

Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

            100                 105                 110

Ala Ala Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala

        115                 120                 125

Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Gln Gly

    130                 135                 140

Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Ser Val Gly

145                 150                 155                 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

                165                 170                 175

Asn Asn Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile

            180                 185                 190

Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Glu Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Ser Tyr

        195                 200                 205

Asp Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val

    210                 215                 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225                 230                 235                 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

                245                 250                 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

            260                 265

Claims (34)

1.一种枯草杆菌酶，其选自：

a)氨基酸序列与SEQ ID NO：2的第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的枯草杆菌酶；

b)由克隆到存在于大肠杆菌MT173DSM 13306中的质粒片段上的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分所编码的枯草杆菌酶，或者与所述的枯草杆菌酶具有至少95％同一性的变体，并且其中，

当在包含以下成分的标准洗涤剂组合物中试验时，

6.2％LAS

2％C₁₆-C₁₈脂肪酸的钠盐

4％非离子表面活性剂

22％沸石P

10.5％Na₂CO₃

4％Na₂Si₂O₅

2％羧甲基纤维素

6.8％丙烯酸盐液体CP540％

20％过硼酸钠，经验式NaBO₂·H₂O₂

0.2％EDTA

21％Na₂SO₄

水，平衡量所述枯草杆菌酶与相同条件下试验的枯草杆菌蛋白酶309相比表现出改进的卵污渍洗涤性能。

2.根据权利要求1所述的枯草杆菌酶，其中性能因子至少为1。

3.根据权利要求2所述的枯草杆菌酶，其中性能因子至少为2。

4.根据权利要求3所述的枯草杆菌酶，其中性能因子至少为3。

5.根据权利要求4所述的枯草杆菌酶，其中性能因子至少为4。

6.根据权利要求5所述的枯草杆菌酶，其中性能因子至少为5。

7.根据权利要求1所述的枯草杆菌酶，所述枯草杆菌酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

8.根据权利要求7所述的枯草杆菌酶，所述枯草杆菌酶由SEQ IDNO：2的第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求1所述的枯草杆菌酶，所述枯草杆菌酶具有的氨基酸序列与克隆至存在于大肠杆菌MT173DSM13306中的质粒片断上的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分所编码的枯草杆菌酶具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

10.根据权利要求9所述的枯草杆菌酶，所述枯草杆菌酶由克隆至存在于大肠杆菌MT173DSM13306中的质粒片断上的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分所编码的枯草杆菌酶组成。

11.根据前述任一项权利要求所述的枯草杆菌酶，所述枯草杆菌酶是具有SEQ ID NO：2的第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列的枯草杆菌酶的变体，其在至少一个如下位点中包含一个或多个氨基酸残基的替代、缺失和/或插入：按BASBPN编号，位点27、36、56、76、87、97、101、104、120、123、167、170、222、224、235和274。

12.根据权利要求11所述的枯草杆菌酶，其中根据BASBPN编号，所述修饰选自K27R、^*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、R101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167X、R170X、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。

13.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1-12中任意一项所定义的枯草杆菌酶的多核苷酸。

14.一种编码枯草杆菌酶的分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自

a)与SEQ ID NO：1的第1-807位核苷酸所示的多核苷酸具有至少95％同一性的多核苷酸；和

b)克隆到存在于大肠杆菌MT173DSM13306中的质粒上的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者与所述的核酸序列具有至少95％同一性的变体。

15.根据权利要求14所述的多核苷酸，所述多核苷酸具有的核酸序列与SEQ ID NO：1的第1-807位核苷酸所示的多核苷酸具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

16.根据权利要求14所述的多核苷酸，所述多核苷酸具有的核酸序列与克隆到存在于大肠杆菌MT173DSM13306中的质粒上的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

17.一种核酸构建体，其包含可操作地与一种或多种能够指导枯草杆菌酶在适宜的宿主内表达的调控序列相连接的如权利要求13-16中任意一项所述的核酸序列。

18.一种重组表达载体，其包含权利要求17的核酸构建体、启动子以及转录和翻译终止信号。

19.一种重组宿主细胞，其包含权利要求17的核酸构建体。

20.根据权利要求19所述的宿主细胞，所述宿主细胞为细菌。

21.根据权利要求20所述的宿主细胞，所述宿主细胞为芽孢杆菌。

22.根据权利要求21所述的宿主细胞，所述宿主细胞为迟缓芽孢杆菌。

23.根据权利要求19所述的宿主细胞，所述宿主细胞为真菌或酵母。

24.根据权利要求23所述的宿主细胞，所述宿主细胞为丝状真菌。

25.根据权利要求23所述的宿主细胞，所述宿主细胞为曲霉。

26.一种生产权利要求1-12中任意一项所述的枯草杆菌酶的方法，所述方法包括：

(a)在有助于生产枯草杆菌酶的条件下培养如权利要求19-25中任意一项所定义的重组宿主细胞；和

(b)回收枯草杆菌酶。

27.一种清洁或洗涤剂组合物，所述组合物包含权利要求1-12中任意一项所述的枯草杆菌酶。

28.根据权利要求27所述的清洁或洗涤剂组合物，其为洗衣或洗盘组合物。

29.根据权利要求27或28所述的组合物，所述组合物还包含纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、其它蛋白酶、淀粉酶或它们的混合物。

30.如权利要求1-12中任意一项所述的枯草杆菌酶在清洁或洗涤剂组合物中的应用。

31.如权利要求1-12中任意一项所述的枯草杆菌酶用于除去卵污渍的用途。

32.如权利要求27-29中任意一项所述的清洁或洗涤剂组合物用于除去卵污渍的用途。

33.一种清洁或洗涤硬表面或衣物的方法，所述方法包括使硬表面或衣物与权利要求27-29中任意一项所述的组合物接触。

34.一种除去硬表面或衣物的卵污渍的方法，所述方法包括使含卵污渍的硬表面或含卵污渍的衣物与权利要求27-29中任意一项所述的组合物接触。