HUT71315A - Modified cutinases, dna, vector and host - Google Patents

Description

Jelen találmány a lipolitikus enzimek tárgykörére vonatkozik. Közelebbről, a találmány tárgya rekombináns DNStechnlkákkal módosított lipolitikus enzimek, ezek előállítási eljárásai, valamint alkalmazásuk, különösen enzimatikus detergens készítményekben.

A lipolitikus enzimek a triglicerideket szabad zsírsavakká és digliceridekké, monogliceridekké, és esetenként glikollá hidrolizálni képes enzimek. Komplexebb felépítésű észtereket is képesek hasítani, mint például a növények kutin rétegét, illetve a bőrön lévő faggyút. A lipolitikus enzimeket az iparban különböző enzimatikus eljárásokhoz alkalmazzák, mint például trigliceridek inter- és transz-észteresítéséhez és észeterek szintéziséhez. Az enzimeket detergens készítményekben is alkalmazzák, azzal a céllal, hogy Javítsák a detergens zsíreltávolító tulajdonságait.

A legszélesebb körben alkalmazott lipolitikus enzimek a lipázok (EC. 3.1.1.3). Például, az EP-A-258 068 és EP-A-305 216 számú európai szabadalmi bejelentésben (mindkettő Novo Nordisk) gomba lipázok rDNS technikákkal más mikroorganizmus gazdákban történő előállítását írják le, különösen a Thermomyces lanuginosus/ Humicola lanuginosa-'ból származó lipázét. Az EP-A-331 376 számú európai szabadalmi bejelentésben (Amano) lipázokat, rDNS technikákkal való előállításukat, valamint alkalmazásukat írják le, köztük a Pseudomonas cepacia-XiOl. származó lipáz egy aminosavszekvenc iáját.

Rekombináns DNS technikával előállított

I

Lipázok további példáit a WO-A-89/09263 és EP-A-218 272 számú szabadalmi bejelentésben (mindkettő Gist-Brocades) írják le. A lipázokkal és módosításaikkal foglalkozó publikációk nagy száma ellenére eddig csak a Hwnicola lanuginosa-'ból származó lipázt alkalmazták széleskörűen (Lipolase™ márkanéven), mint detergens termékek adalékát.

A lipázok fő jellemzője, hogy határfelületi aktiválást mutatnak.

Ez azt Jelenti, hogy az enzimaktivitás sokkal nagyobb határfelületeket vagy micellákat képező szubsztráton, mint a teljesen oldott szubsztráton. A határfelületi aktiválás a lipolitikus aktivitás olyan esetekben tapasztalható hirtelen fokozódásában nyilvánul meg, amikor a szubsztrát-koncentrációt a szubsztrát kritikus micella koncentrációja (CMC) fölé emeljük, és határfelületek alakulnak ki. Ez a jelenség kísérletesen az enzimaktivitás szubsztrát-koncentráció függvényében készített görbe megszakadásaként figyelhető meg.

lipázok esetében a határfelületi aktiválást a lipázmolekula protein struktúráj ának konformációváltozásaként értelmezik.

Szabad, kötetlen állapotban a helikális fedél (lid) betakarja a katalitikus kötőhelyet, a lipid szubsztráthoz való kötődés hatására azonban a fedél elmozdul, és a katalitikus hely szabaddá válik. A helikális fedélről úgy tartják, hogy szintén kölcsönhatásba lép a lipid felületével, lehetővé téve ezáltal, hogy az enzim a határfelületen kötött állapotban maradjon.

• · · ·

A WO-A-92/O5249 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Novo Nordisk) genetikailag módosított lipázokat írnak le, különösen a Humicola lanuginosa-böl származó lipázt, melyet a lipid érintkezési zónáján módosítottak. A bejelentésben a lipid érintkezési zónát úgy definiálják, mint az a felület, melyet aktív formában a helikális fedél borít be. A módosítások a lipid érintkezési zóna egy vagy több aminosavgyökének delécióját vagy szubsztitúcióját foglalják magukban, melyekkel fokozható a lipid érintkezési zóna elektrosztatikus töltése és/vagy csökkenthető annak hidrofóbitása. Ez a lipid érintkezési zóna egy vagy több negatív töltésű aminosav-gyökének deléciójával, vagy ezen gyökök semleges vagy pozitívabb töltésű aminosavakkal történő helyettesítésével, és/vagy a lipid érintkezési zónában egy vagy több semleges aminosav-gyök pozitív töltésű aminosavakkal való helyettesítésével, és/vagy a lipid érintkezési zónában egy vagy több hidrofil aminosav-gyök deléciójával vagy ezen gyökök hidrofób aminosavakkal történő helyettesítésével valósítható meg.

A kutinázok a viasz észter enzimek (EC 3.1.1.50) alosztályát képviselik, melyek képesek a kutin (észteresedett hosszú láncú zsírsavak és zsíralkoholok hálózata) lebontására. A kutin a növényekben a levelek és hajtások védőbevonataként található. A kutinázok ezenfelül lipolitikus aktivitással is rendelkeznek, vagyis képesek a trigliceridek hidrolízisére, s e tulajdonságuk alapján speciális lipázokként is besorolhatók. A kutinázok azonban — a lipázokkal • · ♦ ·

ellentétben —

···· · · *· - 5 - nem mutatnak semmiféle Jelentős határfelületi

aktiválást.

A kutlnázok számos forrásból, úgymint növényekből (pl.

pollenből), baktériumokból és gombákból nyerhetők. Zsírbontó

tulajdonságaik	miatt a kutinázokat enzimatikus detergens
készítmények	alkotóelemeiként Javasolták alkalmazásra.
Például, a	W0-A-88/09367 számú nemzetközi szabadalmi
bejelentésben	(Genencor) hatékony tisztító készítmények
létrehozásához	egy felületaktív anyag és egy lényegében

tiszta bakterilális kutináz enzim kombinációját Javasolták. Pseudomonas putida (ATCC 53552) Gram-negatív baktériumból nyert kutinázt tartalmazó detergens készítményt bocsátottak közre. A későbbi EP-A-476 915 számú európai szabadalmi

bejelentésben	(Clorox) azonban azt írják, hogy ugyanaz az
enzim (melyet	lipázként említenek) hagyományos módszerek
alkalmazásával	kevésbé hatékony a szövetek olajos

szennyeződéseinek eltávolításában, mint az egyéb lipázok.

Az utóbbi időben meghatározták egy Fusarium solani pisi-bői származó kutináz háromdimenziós szerkezetét (Martinez és

mtsi. Natúré,

356. 615-618, 1992). Azt találták, hogy ez a

kutináz nem rendelkezik a katalitikus kötőhelyeket beborító helikális fedéllel. Ehelyett, ügy tűnik, a szerin gyökből

álló aktív	hely hozzáférhető az oldószer számára. E
felfedezések	a lipazoknál a határfelületi aktiválás

mechanizmusáról alkotott Jelenlegi elképzelést látszanak megerősíteni.

« • · · ·

A Fusariwn solani és szekvenálták pisi-bői származó kutináz gént klónozták (Ettinger és mtsi, Biochemistry, 26.

7883-7892,

1987).

A WO-A-90/09446 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Plánt

Génétics Systems) e gén klónozását és termelését írják le E. coli-ban. A kutináz vizes és nemv1ze b közegben, a kutináz és a szubsztrát közötti határfelület hiányában hatásosan képes katalizálni az és Jelenlétében egyaránt észterek hidrolízisét és szintézisét. Általános stabilitásuk alapján felvetették, hogy ezek a kutinázok alkalmazhatók lénnének tisztítószerek (mint pl. mosodai detergensek) és egyéb speciális zsíroldó készítmények (mint pl. kozmetikai készítmények és samponok) előállításában. Nem írták le sem az enzim gazdaságosan kivitelezhető előállítási eljárását, sem a kutinázt tartalmazó specifikus enzimatikus detergens készítményt.

A fő jellemvonás, vagyis a határfelületi aktiválás hiánya miatt e találmány tárgyaként a kutinázokat, mint lényegében semmilyen határfelületi aktiválást nem mutató lipolitikus enzimeket jelöljük ki.

A kutinázok ezáltal különböznek a klasszikus lipázoktól, abban az értelemben, hogy nem rendelkeznek a katalitikus kötőhelyet betakaró helikális fedéllel.

Amint fentebb említettük, csak a Htunicola lanuginosa-tól származó lipázt alkalmazzák széleskörűen (Lipolase™ márkanéven), mint detergens termékek adalékát. A Lipola8e™-t leíró cikkben (Chemistry and Industry, 183-186.

• · · · ···· • · · · · · • · · · · · · • ········· · ·

old.. 1990) Henrik Malmos megjegyzi: ismert, hogy általában a lipázok aktivitása a mosás során alacsony, és ez alól a Lipolase sem kivétel. A szárítás során, amikor a szövet víztartalma csökken, az enzim visszanyeri aktivitását, és a zsíros szennyeződések hídrólizálódnak. A következő mosási ciklus során a hidrolizált anyag eltávozik a szövetből. Ez magyarázatot ad arra is, hogy a lipázok hatása miért alacsony az első mosási ciklus után, s miért lényegesen nagyobb a következő ciklust követően. Ilyenformán, továbbra is szükség van olyan lipolitikus enzimekre, amelyek jelentős aktivitást mutatnak a mosási művelet közben.

Azt találtuk, hogy a kutinázok, különösen a Fu sár iuin solani

pisi-bői	származó, mosás közbeni aktivitást mutatnak,
azonban	továbbra is szükség van tökéletesített mosás
közbeni	lipolitikus aktivitással rendelkező kutinázokra.
valamint	az ilyen enzimek előállítási eljárására.

A találmány tárgya olyan kutináz változatok, amelyekben az aminosav-szekvenciát úgy módosítottuk, hogy az anionos felületaktív anyagokkal való kompatibilitás javuljon. Azt találtuk, hogy anionban gazdag detergens készítményekben az eukarióta kutinázok, különösen a Fusarium solani pisi-bői, a Colletotrichum capsici-ből, a Colletotrichum gloesporiodesből és a Magnaporthe grisea-'ből származó kutinázok lipolitikus aktivitása az anionos felületaktív anyagok enzimhez való kötődésének csökkentésével tökéletesíthető.

• ·

A találmány targya egy eredeti kutináz olyan változata, melyet úgy módosítottunk, hogy az anionos felületaktív anyagokkal való kompatibilitás Javuljon; ez a tökéletesítés elsősorban az anionos felületaktív anyagok enzimekhez való kötődésének csökkentésével valósítható meg.

A találmány kutináz enzimek változataira vonatkozik. Amint fentebb említettük, a kutinázok számos forrásból, úgymint növényekből (pl. pollenből), baktériumokból vagy gombákból nyerhetők. A találmányban a rekombináns DNS-technikákkal végzett módosításhoz eredeti kutinázként vagy kiindulási anyagként eukarióta kutinázokat alkalmazunk. Az eukarióta kutinázo*k szintén különféle forrásokból, úgymint növényekből (pl. pollenből) és gombákból nyerhetők.

Az (eukarióta) gomba kutinázok csoportja két családból áll, melyek különböző, levél-, illetve hajtás-specifitással rendelkeznek.

savas vagy

A levél-specifikus kutinázok működéséhez a semleges pH, míg a hajtás-specifikus kutinázok működéséhez lúgos pH optimális. A lúgos pH-optimummal rendelkező kutinázok lúgos összetételű detergens készítményekben (mint pl. nagyteljesítményű mosóporokban vagy folyadékokban) jobban alkalmazhatók. A savas vagy semleges pH-optimummal rendelkező kutinázok inkább a kisebb teljesítményű termékek vagy öblítószerek esetében alkalmasak, de alkalmazhatók ipari tisztítószerekben is.

Az I. táblázatban négy különböző, hajtás-specifikus kutinázt mutatunk be, pH-optimumaikkal együtt.

I. TÁBLÁZAT

Hajtás-specifikus kutinázok	pH-optimum
Fusarium solani pisi	9
Fusarium roseum culmorum	10
Rhizoctonia solani	8,5
Alternaria brassicicola (PNB-áz I)	9

A találmányban különösen előnyben részesítettek a vad típusú Fusarium solani pisi-bői származtatható kutinázok (Ettinger,

W.F., Thukral, S.K. és Kolattukudy, P.E.: Structure of outinasé gene, cDNS, and the dérived amino acid sequence from phytopathogenic fungi, Biochemistry, 26. 7883-7892, 1987). Bizonyos detergens készítményekben alkalmazva ez a kutináz szabályos mosás közbeni hatásokat mutat.

A találmányban a rekombináns DNS-technikákkal végzett módosításhoz kiindulási kutinázként szintén alkalmasak azok a kutinázok, amelyek a Fusarium solani pusi-ből származó kutinázzal nagy aminosav homológiával rendelkeznek. Ezek példái a Col letotrichum capsici-\>ő\, a Colletot.richum gloesporiodes-ból és a Magnaporthe grisea-ból származó kutinázok. A 11. ábrán e kutinázok részleges amlnosavszekvenciáit mutatjuk be, s látható a köztük mutatkozó

I ···· nagyfokú homológia.

A Fusarium solani piai kutináz tökéletesítésének alternatív módja génjének módosítását foglalja magában. Más eukariota szervezetek kutinázát kódoló genetikai információ Fusarium solani pisi, Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloesporlodes és Magnaporthe grisea (pro)kutinázt kódoló cDNS-éből származó 5'- és 3'-DNS próbák, valamint más lipolitikus enzimekben konzervált szekvenciákat felismerő próbák alkalmazásával izolálható. Ezek a próbák, szükség esetén, a kutinázt termelő eukarióta sejtek messenger RNS-

éből származó	cDNS-ek polimeráz láncreakció (PCR) (ld. pl.
WO-A-92/05249)	alkalmazásával végzett sokszorosításához
alkalmazhatók.	Miután az így kapott, kutinázokat kódoló

géneket standard eljárások szerint E. coii-ban klónozzuk és expresszáljuk, a kutinázokat megfelelő körülmények között zsíros szennyeződéseket eltávolító képességükre teszteljük.

Ezzel a módszerrel a fentebb említett kutinázok számos természetes előfordulású változatát nyerhetjük, melyek Javított mosás közbeni teljesítménnyel rendelkeznek. Sőt, a természetes előfordulású kutinázok szekvenciái kiváló alapot nyújtanak a Fusarium solani pisi kutináz további protein-technológiai kezeléséhez.

A mosás közbeni lipolitikus enzimek aktivitását meghatározó faktorokról született új elképzelések, és a Fusarium solani pisi kutináz háromdimenziós (3D) szerkezetének (Martinez és mtsi, Natúré, 356. 615-618, 1992)

1.1

alapos vizsgálata alapján számos lehetőséget találtunk, melyekkel e kutináz (és általában a kutinázok) anionos felületaktív anyagokkal való kompatibilitása rekombináns DNS-technikák alkalmazásával tökéletesíthető.

A Fusarium solani pisi kutináz ismert háromdimenziós szerkezetéből kiindulva a Colletotrichum gloesporoides háromdimenziós szerkezetét elméleti alapú összehasonlító modellező technikák alkalmazásával kaptuk, melyeket a SYBYL molekuláris modellező software csomag COMPOSER moduljával (TRIPOS associates, Inc., St. Louis, Missouri) valósítottunk meg. A Colletotrichum gloesporoides így kapott modelljét a BIOSYM molekuláris modellező software csomag (BIOSYM, San Diego, CA) alkalmazásával megvalósított energia minimalizálási (EM) és molekuláris dinamikai (MD) technikák alkalmazásával finomítottuk. A modell EM és MD finomítása során tapasztalati megközelítést alkalmaztunk. A modellt egyúttal a potenciális energia-függvény és az ismert szerkezeti feltételek energiaszintjeihez igazítottuk. A modell minőségét olyan ismérvek alapján értékeltük, mint a hidrogénkötések száma és minősége, a másodlagos szerkezeti elemeket illetően a hidrogénkötések mintázata, a peptid egységek orientációja, a főláncok lapszögeinek értéke, az aromás csoportok érintkezési szöge és a rések mérete. A modellt a fentieken kívül a nem megfelelően fedett töltésekre, a túlzottan szabad hidrofób gyökökre, és az energetikailag nem kedvező elhelyezkedésű diszulfid hidakra

···· · · · ·

Is ellenőriztük. Az idevaló oldallánc-rotamereket a Ponder &

Richards rotamer könyvtárból választottuk ki (Ponder és mtsi, J. Mól. Bioi., 193. 775-791, 1987). E könyvtárból egy adott oldallánc-rotamer végső kiválasztása a fentebb említett feltételek értékelésén alapul. Az oldallánc atomok megfelelő helyzetbe rendezéséhez MS technikát alkalmaztunk.

A Magnaporthe grisea-t>óY származó kutináz háromdimenziós

szerkezetének	megismeréséhez	hasonló	módszereket
alkalmaztunk.

Találmányunkban	leírjuk,	hogy	a kutinázok	az anionos
felületaktív	anyagokkal	való	kölcsönhatás	csökkentése

éredekében anélkül módosíthatók, hogy a módosított kutináz mosás közbeni aktivitása megváltozna.

Ez számos módon megvalósítható. Az egyik lehetőség szerint, az anionos felületaktív anyagok enzimhez való kötődése az anionos felületaktív anyag és az enzim közötti elektrosztatikus kölcsönhatás mérséklésével, például, az enzim egy anionos felületaktív anyag apoláros végéhez kötődni képes hidrofób részének közelében elhelyezkedő egy vagy több pozitív töltésű arginin-gyökének lizin-gyökökkel végzett helyettesítésével csökkenthető. Az anionos felületaktív anyag és az enzim közötti elektrosztatikus kölcsönhatás oly módon is mérsékelhető, hogy az arginin-gyök pozitív töltését az arginintól 6 A távolságon belül negatív töltés, például glutaminsav-gyök bevitelével leárnyékoljuk. Más lehetőség szerint, az anionos felületaktív anyag és az

enzim közötti elektrosztatikus kölcsönhatás oly módon is mérsékelhető, hogy az enzim egy anionos felületaktív anyag apoláros végéhez kötődni képes hidrofób részének közelében elhelyezkedő egy vagy több pozitív töltésű arginin-gyökét töltés nélküli aminosav-gyökökkel helyettesítjük. Az anionos felületaktív anyag és az enzim közötti elektrosztatikus kölcsönhatás oly módon is mérsékelhető, hogy az enzim egy anionos felületaktív anyag apoláris végéhez kötődni képes hidrofób részének közelében elhelyezkedő egy vagy több pozitív töltésű arginin-gyökét negatív töltésű aminosav gyökökkel helyettesítjük.

Az anionos felületaktív anyag és az enzim kötődése csökkentésének másik megközelítési módja szerint az enzim egy anionos felületaktív anyag apoláros végéhez kötődni képes hidrofób részének közelében elhelyezkedő egy vagy több aminosav-gyököt kevésbé hidrofób aminosav-gyökökkel helyettesítjük. Ilyen kevésbé hidrofób aminosav-gyökként előnyösen glicint, szerint, alanint aszparaginsavat vagy treonint alkalmazunk.

A találmány szerint előállított kutináz változatok — anionos felületaktív anyagokkal való fokozott kompatibilitásuknak köszönhetően — anionos felületaktív anyagokban gazdag detergens vagy tisztítószer készítmények alkotórészeként alkalmazva az enzimaktivitás terén előnyöket biztosítanak. A találmány leírásában az anionos felületaktív anyagokban gazdag kifejezés azt Jelenti, hogy · · ········ • ·····*··· * · a detergens vagy tisztítószer készítmény 5 %-nál, általában %-nál, előnyösen 20 %-nál több anionos felületaktív anyagot tartalmazó felületaktív rendszerből áll.

Azt találtuk, hogy a találmány szerinti kutináz változatok egy mosási folyamat fő ciklusa során tökéletesített mosás közbeni teljesítménnyel rendelkeznek. A mosási folyamat fő ciklusa során tökéletesített mosás közbeni teljesítményen azt értjük, hogy az enzimet tartalmazó detergens készítmény egy európai típusú automata mosógépben, átlagos mosási feltételek (koncentráció, vízkeménység, hőmérséklet) mellett egyszeri mosással képes eltávolítani egy szennyezett szövet olajos szennyeződéseinek jelentős hányadát. Tudni kell, hogy a hagyományos, kereskedelemben beszerezhető Lipolase™ (Novo Nordisk) lipolitikus enzim az olajos szennyeződésekre nem gyakorol jelentős mosás közbeni hatást.

Egy enzim olajos szennyeződésre gyakorolt mosás közbeni hatását az alábbi vizsgálattal értékelhetjük. 10 %-nál kevesebb pamutot tartalmazó új poliészter szöveteket enzimmentes detergens készítménnyel (mint az alább megadott) előmosunk, majd alaposan kiöblítünk. Ezeket a tiszta szöveteket ezután olívaolajjal vagy más alkalmas, hidrolizálható olajjal szennyezzük. Valamennyi vizsgálati szövetet, melyek tömege átlagosan 1 g, 100 ml-es poliszitrén palackban 30 ml mosóoldatban áztatjuk. A mosóoldat az alábbi detergens készítményt 1 g/liter koncentrációban tartalmazza.

A palackokat 30 percig vízzel töltött Miele TMT mosógépben,

normál 30 ’C-os főmosás programmal, keverjük. A kutináz változatot 3 LU/ml koncentrációban adjuk a mosóoldathoz. A kontroll nem tartalmaz enzimet. A mosópor összetétele (m/m %-ban):

LAS	6,9
Szappan	2,0
Nemionos felületaktív anyag	10,0
Zeolit	27,0
Nátrium-karbonát	10,2
Nátrium-szulfát	13,0

Mosás után a szöveteket hideg vízzel alaposan kiöblítjük, centrifugában hideg levegővel szárítjuk, majd meghatározzuk a visszamaradt zsír mennyiségét. Ez többféle módon végezhető. A hagyományos eljárás szerint a tesztszövetet Soxhlet extraháló készülékben petroléterrel extraháljuk, az oldószert ledesztilláljuk. és a szöveten a kezdeti zsírmennyiség hányadaként (méréssel) meghatározzuk a maradék zsíros anyag százalékos mennyiségét.

Egy második, érzékenyebb eljárás szerint a tesztszövetek beszennyezéséhez brómozott olívaolajat alkalmazunk (Richards, S., Morris, M.A. és Arklay, T.H., Textilé Research Journal, 105-107, 196Θ). Ezután valamennyi tesztszövetet 100 ml-es polisztirén palackban 30 ml mosóoldatban inkubáljuk. A palackokat vízzel töltött mosógépben normál 30 °C-os főmosás programmal keverjük. A főmosás után a tesztszöveteket hideg vízben 5 másodperc • · · alatt óvatosan kiöblítjük. Közvetlenül az öblítés után az anyagokat hideg levegővel szárítjuk. Szárítás után a maradék zsír mennyisége a szövet brómtartalmának röntgensugárzásos fluoreszcencia spektrometriával végzett mérésével határozható meg. Az eltávolított zsír mennyisége a tesztszöveten kezdetben Jelenlevő mennyiség százalékaként határozható meg, az alábbiak szerint:

brómme - brómmu %-os szennyeződés eltávolítás = --------------- x 100 brórnm· ahol a brómme a tesztszöveten a bróm mosás előtt Jelenlevő százalékos mennyiségét, a brómmu pedig a mosás után jelenlevő mennyiségét jelenti.

Az enzimatikus aktivitás értékelésének további módja a visszaverődési együttható 460 nm-nél, standard eljárásokkal végzett mérése.

A találmány leírásában a módosított, mutált vagy mutáns enzim vagy enzim változat olyan enzimet jelent, amelyet mutáns gént expresszáló mutáns organizmus termel. A mutáns gén (amely nemcsak néma mutációkat tartalmazó gén) olyan gént jelent, amely közvetlenül vagy közvetve a megfelelő kiindulási enzim szekvenciájából származó, s attól egy vagy több helyen eltérő aminosav-szekvenciával rendelkező enzimet kódol. Az eredeti enzim a megfelelő, változtatás nélküli gén géntermékét jelenti. Egy gén néma mutációja a gén polinukleotid-szekvenciájában keletkezett változás vagy különbség, amely (a genetikai kód degeneráltságának köszönhetően) a gén által kódolt enzim aminosavszekvenciájában nem okoz változást.

A mutáns vagy mutált mikroorganizmus az enzimet kódoló génjét illetően mutációnak alávetett szülői mikroorganizmust vagy annak leszármazottját Jelenti. Az organizmus ilyen mutációja (a) a szülői mikroorganizmus eredetileg Jelenlévő, megfelelő génjének (szülői gén) mutációjával vagy (b) egy másik forrásból közvetlenül vagy közvetve nyert megfelelő gén szóban forgó mikroorganizmusba történő átvitelével (bevitelével) hajtható végre, miáltal mutáns mikroorganizmust kapunk. A gazda mikroorganizmus olyan organizmus, amely egy mutáns vagy átvitt génnel rendelkezik.

A gazda mikroorganizmus általában egyaránt származhat ugyanazon vagy különböző törzsből vagy fajból, mint a szülői mikroorganizmus.

A találmány tárgya a szabadalmi bejelentésben

Fusarium solani pisi

WO-A-90/09446 számú nemzetközi (Plánt Genetics Systems) leírt kutináz mutáns alakjai, és

Colletotrichvun capsici,

Colletotrichum gloesporoides és

Magnaporthe grisea kvtinázainak mutáns alakjai. Ezek kutináz változatok rekombináns DNS-technikával kapott vagy előállított gént tartalmazó, rekombináns DNS-technikával módosított mikroorganizmusokkal termeltethetek.

A megfelelő aminosav-gyökök azonosítása után a kérdéses aminosavakat másik aminosav-gyökke1 helyettesítjük, mint például a Fusarium solani pisi kutináz R17E mutációja esetében.

A szakember számára nyilvánvaló, hogy az ilyen módosítások befolyásolják a kutináz szerkezetét. Természetesen azokat a módosítások részesítjük előnyben, amelyek az aktív hely körüli elektrosztatikus töltést nem befolyásolják túlságosan. Megállapítottuk az enzim konformációjának elkerülhetetlen torzulása és a fokozott enzimaktivitás közötti egyensúly szintjét, miáltal nagy valószínűséggel válik lehetővé a sikeres kutináz változatok tervezése és előállítása. A II. táblázatban és a leírásban másutt a peptid- szekvenciákban az aminosavakat és aminosav-gyököket az alábbi egy- vagy hárombetűs rövidítésekkel jelöljük.

II. TÁBLÁZAT

A	—	Alá	—	alanin	V		Val	-	valin
L	-	Leu	-	leucin	I	-	He	-	izoleucin
P	-	Pro	-	prolin	F	-	Phe	-	fenilalanin
W	-	Trp	-	triptofán	M	-	Met	=	metionin
G	-	Gly	-	glicin	S	-	Ser	=	szerin
T	-	Thr	-	treonin	C	-	Cys	-	cisztein
Y	-	Tyr	-	t.irozin	N	-	Asn	-	aszparagin
Q	-	Gin	-	glutamin	D	-	Asp	-	aszparaginsav
E	-	Glu	-	glutaminsav	K	-	Lys	-	lizin
R	-	Arg	-	arginin	H	-	His	-	hisztidin

• 44 · • · 4 · • ···· · • * ·· ·

A találmányban egy protein aminosav-szekvenciájában Jelenlevő mutáció, és így maga a mutáns protein az alábbi rövidített módon a mutáció elhelyezkedésével és természetével írható le: a mutációval megváltoztatott eredeti aminosav-gyök megnevezésével; a mutáció helyével (szekvencia szám); és az eredeti aminosav helyére bevitt aminosav-gyök megnevezésével. Ha a szekvenciában egy aminosavas inszerció van Jelen, elhelyezkedését a szabályos szekvencia vagy a vonatkoztatási szekvencia inszerció helye előtti utolsó tagjának számához kapcsolt egy vagy több index betűvel jelöljük.

Például, a 17. helyen lévő arginin glutaminnal végzett helyettesítésével Jellemezhető mutánst

Argl7Glu vagy R17E

Jelöléssel azonosítjuk. Egy további aminosav-gyök. mint pl.

a prolin arginin utáni (feltételezett) inszercióját

Argl7ArgPro vagy R17RP, vagy más módon *17aP Jelöléssel (melyben az inszertált gyököt 17a-val jelöljük) azonosíthatjuk.

Az arginin ugyanezen helyen lévő (feltételezett) azonosíthatjuk.

vagy egy hiányzó delécióját Argl7* vagy R17* Jelzéssel

A csillag a megadott helyen egy deléciót aminosav-gyököt Jelent, attól függően, hogy az adott aminosav tényleges deléció folytán, vagy csupán az adott helyen aminosav-gyökkel rendelkező másik szekvenciával vagy vonatkoztatási szekvenciával való összehasonlítás eredményeként hiányzik.

A többszörös mutációkat + Jelekkel választjuk el; pl.

• 4

RÍ7E+S54I+A128F szubsztitúcióval létrehozott három mutációt hordozó mutáns proteint jelent, melyben a mutációk a feltüntetett helyeken találhatók. Az alábbi táblázatban megadott mutációk kívánság szerint kombinálhatok.

A III. táblázatban a találmány szerinti kutináz változatok néhány hasznos példáját mutatjuk be, melyek a Fusarimn solani pisi-bői és a Magnaporthe grisea kutinázán alapulnak.

III. TÁBLÁZAT

Fusarium solani pisi kutináz változatok:

R17L, R17K, R17E, L51A, L51S, R78L, T80D, R88E, R96N, R96Q, R156L, A195S, R196A, R196K, R196E;

Magnaporthe grisea kutináz változatok:

A80D, A88E, R156L.

A találmány további tárgya eljárás a találmány szerinti kutináz változatok előállítására. A természetben előforduló, kutinázokat termelő mikroorganizmusok rendszerint növénypatogének, s a módosított kutináz gének gazdasejteiként való működéshez nem túl alkalmasak. Következésképpen, a módosított (pro)kutinázokat kódoló géneket rDNS vektorokba foglaltuk, melyek bevihetők a rekombináns DNS-technológiához előnyben részesített gazda mikroorganizmusokba. E célra a WO-A-90/09446 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leirt rDNS vektorral lényegében megegyező rDNS vektorok

alkalmazhatók .

A természetben előforduló, kutinázokat termelő mikroorganizmusok fermentációs folyamatokhoz nem igazán alkalmasak. A fermentációs eljárás hozamának javítása érdedében egy javított kutinázt kódoló gént olyan mikroorganizmusba kell átvinni, amely olcsó táptalajon gyorsan növekszik, s nagy mennyiségű kutináz szintézisére és kiválasztására képes. Ilyen alkalmas, rDNS-sel módosított találmány szerinti gazda mikroorganizmusok a baktériumok, többek között a Bacillus, Corynebacterium, Staphylocoocus és Streptomyces fajok, vagy az alacsonyabb rendű eukarióták, mint a Saccharomyces cerevisiae és rokon fajai, a KI uyveromyces marxianus és rokon fajai, a Hansenula polymorpha és rokon fajai, valamint az Aspergillus nemzetségbe tartozó fajok. Az előnyben részesített gazda mikroorganizmusok az alacsonyabb rendű eukarióták, mivel ezek a mikroorganizmusok a fermentációs folyamat során nagyon hatékonyan termelik és szekretálják az enzimeket, s képesek a kutináz molekula glikozilálására. A glikozilálás növelheti a kutináz detergens rendszerekben mutatott stabilitását.

A találmány további tárgya genetikai anyag, amely a módosított eukarióta kutináz gének (pl. a Fusarium solani pisi-ból származó gén) klónozó rDNS vektorokba történő beviteléből származik, valamint ezen genetikai anyag új gazdasejtek transzformálásában és a kutináz változatok • · · · ········ • · · · · • ·♦ ·* ···· · · · ···* · · ·· · génjeinek uj gazdasejtekben történő expresszálásában való alkalmazása.

A találmány további tárgya rDNS-technikával előállított vagy módosított, kutináz változatokat kódoló polinukleotidok, ilyen polinukleotidokat tartalmazó rDNS vektorok, valamint ilyen polinukleotidokat és/vagy ilyen rDNS vektorokat tartalmazó, rDNS-technikával módosított mikroorganizmusok. A találmány további tárgya a módosított eukarióta kutinázokat kódoló, megfelelő polinukleotidok, mint például egy érett kutináz változatot kódoló bázisszekvenciával rendelkező polinukleotid, melyben az utolsó transziáit kodont egy stop kodon követi, s amely tetszés szerint az érett kutináz változatot kódoló nukleotid-szekvenciáktól közvetlenül upstream irányban elhelyezkedő, a kutináz pre-pro- és proszekvenciáját kódoló nukleotid-szekvenciákkal rendelkezik.

Ilyen polinukleotidban az eredeti organizmusból származó, kutinázt kódoló nukleotid-szekvencia úgy módosítható, hogy legalább egy kodon, de előnyösen annyi kodon, amennyi csak lehetséges, néma mutáció tárgyát képezze, hogy a korábbiakkal egyenértékű aminosavakat kódoló, az új gazda által előnyben részesített kodonok alakuljanak ki, miáltal a bevitt gének számára az új gazda sejtjein belül javított stabilitású messenger-RNS-t biztosítunk.

A pro- vagy érett kutinázokat kódoló nukleotidszekvenciáktól upstream irányban olyan szekvencia • ···* ♦··· · · ♦ •»·· · · ·· ·

- 23 helyezhetünk. amely a kiválasztott gazdának megfelelő jelző vagy szekréciós szekvenciát kódol. Ilyenformán, a találmány egyik megvalósítási módja rDNS vektorra vonatkozik, melybe kutináz változatot vagy annak prekurzorát kódoló nukleotidszekvenciát inszertáltunk.

A nukleotid-szekvencia származhat például:

(a) természetesen előforduló nukleotid-szekvenciából (pl. amely a Fusarium solani pisi által termelt pre-pro- vagy pro-kutináz eredeti aminosav-szekvenciáját kódolja);

(b) kémiai úton szintetizált nukleotid szekvenciákból, melyek az új gazda által előnyben részesített kodonokból állnak, és amelyek az új gazdában stabil messenger-RNS-t eredményeznek, s szintén az eredeti aminosav-szekvenciát kódolják;

(c) az (a) vagy (b) pontban említett nukleotid-szekvenciák valamelyikéből származó, génsebészeti úton előállított nukleotid-szekvenciákból. melyek más aminosav-szekvenciájú, de detergens rendszerekben kiváló stabilitással és/vagy aktivitással rendelkező Fusarium solani pisi kutinázt kódolnak.

összefoglalásul; egy kutináz gént alkotó nukleotidszekvencia expresszióját irányítani képes rDNS vektorok az előnyben részesített gazdák valamelyikében előnyösen az alábbi komponensekből állnak:

a) Érett kutinázt, prekutinázt vagy megfelelő prekutinázt kódoló kétszálú (ds; double-stranded) DNS, amelyben a ···« «··· • ···* ···· · · · • 4 · · · · ·· ·

- 24 pre-szekvencia legalább egy részét egy (a kiválasztott gazdasejt számára előnyős) szekréciós Jeltől közvetlenül downetream irányban eltávolítottuk. Olyan esetekben, amikor a gén transzlálódó része nem az ATG kodonnal kezdődik, a szekvencia elejére ATG kodont kell helyezni. A gén transzlálódó részének minden esetben megfelelő stop kodonnal kell végződnie.

b) A kutinázt kódoló kétszálú DNS [(a) komponens] +” szálától upstream irányban elhelyezkedő, a kiválasztott gazda számára megfelelő expressziós regulon.

c) A kutinázt kódoló kétszálú DNS [(a) komponens] + szálától downstream irányban elhelyezkedő, a kiválasztott gazda számára megfelelő terminátor szekvencia;

dl) A kétszálú DNS kiválasztott gazda genomjába való integrációját elősegítő nukleotid-szekvenciák.

d2) A kiválasztott gazda számára megfelelő replikációs kezdőhely.

el) Tetszés szerint (auxotróf) szelekciós marker; az auxotróf marker az auxotróf marker kódoló régiójából és egy hibás promoterből állhat;

e2) Tetszés szerint a kiválasztott gazdában a kutináz prekurzor alakjának érésében és/vagy szekréciójában szerepet játszó proteineket kódoló kétszálú DNS szekvencia.

Egy ilyen rDNS vektor a korábban meghatározott polinukleotidtól upstream és/vagy downstream irányban további, a kutináz funkcionális expresszióját elősegítő szekvenciákat is hordozhat. Az auxotróf marker az auxotróf

marker kódoló régiójából és egy hibás promoterből állhat.

A találmány egy másik megvalósítási módja a fentebb leírt kutinázok egyikének fermentációs előállítására vonatkozik. A fermentáció lehet normális, adagonkénti (batch) fermentáció, fed-batch fermentáció vagy folyamatos fermentáció. Az alkalmazni kívánt eljárás kiválasztása a gazdatörzstől és a fermentációs folyamat előnyben részesített későbbi lépéseitől függ (melyek önmagukban ismertek). Ilyenformán, a találmány további tárgya eljárás egy, a találmányban meghatározott kutináz változat előállítására, melynek során egy rDNS-technikával módosított mikroorganizmust (amely legalább egy, a kutináz aminosav-szekvenciáját befolyásoló mutációt hordozó, rDNS technikával előállított gént tartalmaz, ami a kútináznak a megfelelő kiindulási enzimhez képest Javított aktivitást biztosít·) fermentatív körülmények között tenyésztünk; a mikroorganizmus által termelt kutináz fermentléből történő elválasztásával, vagy a mikroorganizmus sejtek fermentléből történő elkülönítésével, s az elkülönített sejtek feltárásával a kutináz változatból készítményt állítunk elő, oly módon, hogy a kutináz változatot fizikai vagy kémiai bekoncentráló vagy tisztító módszerekkel az említett fermentléből vagy az említett sejtekből bekoncentráljuk vagy részlegesen tisztítjuk. A körülményeket előnyösen úgy választjuk meg, hogy a mikroorganizmus a kutináz változatot a fermentlébe szekretálja. s szűréssel vagy az enzimet a sejtek eltávolítása után centrifugalással a fermentléből nyerhessük ···· ·»··

ki. A kutináz változat ezután tetszés szerint kívánt mértékben koncentrálható vagy tisztítható. Ezek a fermentációs folyamatok — a mikroorganizmus speciális természetétől eltekintve — ismert fermentációs technikák alapján, és általánosan használt fermentációs és utókezelési berendezésben végezhetők.

A találmány további tárgya eljárás kutináz változat termelésére képes, módosított mikroorganizmus előállítására rDNS technikákkal, melynek során a mikroorganizmusba bevitt, kutináz változatot kódoló gént 5' végén a gazdaszervezetben Jelző vagy szekréciós szekvenciaként működő (módosított) pre-szekvenciát kódoló génfragmenshez fuzionáljuk.

Egy másik szempontból a találmány tárgya rDNS-technikával módosított, kutináz változatot kódoló gént tartalmazó mikroorganizmusok, melyek képesek az említett gén által kódolt kutináz változat termelésére. Az rDNS-technikával módosított mikroorganzimusban a természetes kutinázt kódoló gént (ha eredetileg Jelen van) előnyösen eltávolítjuk, pl. egy másik szerkezeti génnel helyettesítve.

Egy másik	szempontból a találmány további tárgya a találmány
szerinti	kutináz változatokat tartalmazó enzimatikus
detergens	készítmények. Az ilyen készítmények a kutináz
változat	és más, detergens rendszerekben általánosan
használt	összetevők keverékéből állnak, beleértve a
detergens	készítmények adalékanyagait, és a kész detergens

- 27 »· ·· • · 'V * • *·«···· ·«» 4· *«·· ···· és tisztitó készítményeket. pl. az ismert és például az EP-A-258 068 számú európai szabadalmi bejelentésben leírt fajtákat.

Az ilyen detergens készítmények többi komponense valamennyi ismert fajta lehet, mint például a GB-A-1 372 034 (Unilever), US-A-3 950 277, US-A-4 011 169, EP-A-179 533 (Procter &

Gamble), EP-A-205 208 és EP-A-206 390 (Unilever), JP-A63-078000 (1988) számú szabadalmi bejelentésekben, és a

29056 számú Research Disclosure-ben (1988 Június) (melyek mindegyikét, a bennük felsorolt leírásokkal együtt, hivatkozásul említjük) leírtak.

A találmány szerinti kutináz változatokat bármely alkalmas alakban hozzáadhatjuk a detergens készítményhez, például szemcsés készítmény, oldat vagy sűrű enzim-szuszpenzió formájában, vagy vivőanyaggal együtt (pl. a EP-A-258 068 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak, és a Novo Nordisk Savinase™ és Lipolase™ termékei).

A kutináz változat készítményhez adott mennyisége széles határok között változtatható, pl. a detergens készítmény tömegére vonatkoztatva 10 LU/g és 20000 LU/g között, előnyösen 50 LU/g és 2000 LU/g között. A találmány leírásában az LU (lipáz egység) meghatározása megegyezik az EP-A-258 068 számú európai szabadalmi bejelentésben (Novo

Nordisk) leírtakkal.

*> · · * »

Egyéb enzimek, mint a proteázok, amilázok és cellulázok esetében, melyek szintén Jelen lehetnek a készítményben megfelelő tényezők módosításával hasonló megfontolások alkalmazhatók.

Előnyösek lehetnek az olyan készítmények, melyekben a kutinázzal együtt proteáz is

Jelen van.

Proteázokként

10-es pl értéknél kisebbel rendelkezők alkalmasak.

Az EP-A-271

154 számú európai szabadalmi bejelentésben (Unilever) számos ilyen proteázt írnak le. A kutináz változatokkal együtt alkalmazható proteázok közé tartozik (bizonyos körülmények között) például a BPN' típusú szubtilizin vagy a irodalomban leírt több szubtilizin típus, melyek közül néhányat már Javasoltak detergens készítményekben való alkalmazásra; ilyenek például az EPA-130 756 vagy EP-A-251 446 (mindkettő Genentech); US-A-4 760 025 (Genencor): EP-A-214 435 (Henkel); WO-A-87/04661 (Amgen); W0-A-87/05050 (Genex) számú szabadalmi bejelentésekben, illetve Thomas és mtsi (Natúré, 316, 375-376 (1986/5), és J. Mól. Bioi., 1H3, 803-813 (1987)); és Russel és mtsi (Natúré, 32Q, 496-500, (1987)) által leírt mutáns proteázok.

A találmányt a továbbiakban a példák segítségével mutatjuk be. A nukleinsavak manipulálásához és vizsgálatához alkalmazott valamennyi eljárást lényegében Sambrook, J., Fritsch, E.F. és Maniatis, T., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Prees, Cold Spring Harbor, New York, 1989, ISBN 0-87969-309-6) leírása szerint végeztük, kivéve, ahol ezt ·· · «WV* • 9 9 · ·· » » « · · · * ♦ ··· ···· · ·* ···· · · ·· * pisi kutináz gén ο1igonukleot idők

- 29 másképpen jeleztük.

Az ábrák rövid leírása

Az 1/A ábrán a szintetikus Fusarium solani

1- es kazettájának, és az azt alkotó nukleotid-szekvenciája látható. Az közötti átmeneteket a kazetta szekvenciájában jelöljük. A kisbetűk a nyitott leolvasási kereten kívüli nukleotidokat jelzik.

Az 1/B ábrán a szintetikus Fusarium solani pisi kutináz gén

2- es kazettájának, ée az azt alkotó oligonukleotidok nukleotid-szekvenciája látható. Az oligonukleotidok közötti átmeneteket a kazetta szekvenciájában Jelöljük.

Az 1/C ábrán a szintetikus Fusarium solani pisi kutináz gén

3- as kazettájának, és az azt alkotó oligonukleotidok nukleotid-szekvenciája látható. Az oligonukleotidok közötti átmeneteket a kazetta szekvenciájában jelöljük. A kisbetűk a nyitott leolvasási kereten kívüli nukleotidokat jelzik.

Az 1/D ábrán a szintetikus Fusarium solani pisi pre-prokutinázt kódoló szintetikus kutináz gén nukleotidszekvenciája látható. Az ábrán feltüntettük a kutináz pre-, pro- és érett szekvenciáját, valamint a klónozáshoz használt helyeket és az oligonukleotidok közötti átmeneteket. A kisbetűk a nyitott leolvasási kereten kívüli nukleotidokat eb·· ··*· jelzik .

A 2. ébrén a Fnsariiun solani pisi pro-kutinázt kódoló szekvenciát E. coli phoA pre-szekvencia származékot kódoló szekvenciához kötő szintetikus DNS-fragmens nukleotidszekvenciája látható. Az ábrán feltüntettük a riboszóma kötési helyet (RBS) és a klónozáshoz használt restrikciós enzim felismerési helyeket. A kódolt phoA Jelző-szekvencia aminosav-szekvenciáját és a kutináz gén egy részét egybetüs rövidítéssel jelöljük.

A 3. ábrán a 8-as kazetta (az invertáz pre-szekvencia és az érett Fusariiun solani pisi kutináz kódoló szekvenciáinak fúziós pontjait kódoló Sacl-Bcll fragmens) nukleotidszekvenciája látható.

A 4. ábrán a pUR2741 plazmid, a pUR2740 plazmidból egy 0,2 kb-os Sall-Nrul fragmens deléciójával nyert E. coli - S. cerevisiae shuttle (ingázó) vektor látható, amely a pBR322 plazmid egy részéből, a 2j.an plazmidból származó élesztősejt replikációs kezdőhelyből, élesztő leu2D génből, és a gal7 promoter szabályozása alatt álló, növényi alfagalaktozidázzal fuzionált, élesztő invertáz Jelzőszekvenciát kódoló régióból áll.

Az 5. ábrán a PÜR7219 plazmid, egy E. coll - S. cerevisiae shuttle vektor látható amely a pBR322 plazmid egy részéből, a 2 jm plazmidból származó élesztősejt replikációs «*·« ·»·· • V te · · &

• · · · · · · • ···· ·»·· · · · ···· » · ·♦ 9 kezelőhelyből, élesztő leu2D génből. és a gal7 promoter szabályozása alatt álló, az érett Fusarium solani pisi kutinázt kódoló régióval fuzionált élesztő invertáz Jelzőszekvenciát kódoló régióból áll.

A 6. ábrán

a pUR2740 plazmid, egy E. coli - S. cerevisiae

shuttle vektor látható, amely a pBR322 plazmid egy

részéből, a 2	μαι plazmidból származó élesztősejt replikációs
kezdőhelyből,	, élesztő leu2D génből, és a gal7 promoter
szabályozása	alatt álló, növényi alfa-galaktozidázzal

fuzionált, élesztő invertáz Jelző-szekvenciát kódoló régióból áll.

A 7. ábrán	az exlA pre-szekvencia és az érett Fusarium
solani pisi	kutináz kódoló szekvenciáinak különböző típusú
kapcsolatait	tartalmazó 5-ös, 6-os és 7-es kazetta

nukleotid-szekvenciája látható.

A 8. ábrán a pAW14B plazmid látható, melyet az Aspergillus niger var. awamori genom DNS-ének 5,3 kb-os Sáli fragmensének a pUC19 Sáli helyére történő inszerciójával kaptunk.

A 9.

ábrán a pUR7280 plazmid látható, melyet a pAW14B plazmidban az exlA nyitott leovasási keretet tartalmazó

BspHI-AflII fragmens Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló szekvenciát tartalmazó BspHI-AflII fragmenssel való helyettesítésével kaptunk. A pUR7280 plazmid igy a Fusarium solani pisi pre-pro-kutináz gént az Aspergillus niger var.

awamori promoter és terminátor szabályozása alatt tartalmazza.

A 10. ábrán a pUR7281 plazmid látható, melyet úgy kaptunk, hogy a pUR7280 plazmidba A. nidulans amdS és Aspergillus niger var. awamori pyrG szelekciós markert vittünk be.

A 11. ábrán a Fusarium solani pisl-ből, Colletotrichum capsici-ből,

Colletotrichum gloesporoides-böl és Magnaporthe grisea-tól származó kutinázok részleges aminosavszekvenciái láthatók, melyeken feltüntettük az aminosavgyökök háromdimenziós szerkezetben való elhelyezkedését.

A 12. ábrán a Fusarium solani pisi kutináz és a kutináz változatok

LAS alapú detergens készítménnyel való kompatibilitását mutatjuk be.

A 13. ábrán a Fusarium solani pisi kutináz és a kutináz változatok

LAS alapú detergens készítménnyel való kompatibilitását mutatjuk be.

A 14. ábrán a

Fusarium solani pisi kutináz és a kutináz változatok sok nemionos felületaktív anyagot tartalmazó detergens készítménnyel való kompatibilitását mutatjuk be.

A 15. ábrán a Fusarium solani pisi kutináz és a kutináz változatok SDS-sel való kompatibilitását mutatjuk be.

A 16. ábrán a Fusarium solani pisi kutináz és az R17E kutináz változat mosás közbeni hatását mutatjuk be.

1. példa

Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló szintetikus gén készítése

Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló szintetikus gént lényegében az EP-A-407 225 számú európai szabadalmi bejelentésben (Unilever) leírtak szerint készítettünk. A Fusarium solani pisi gének közölt nukleotid-szekvenciái alapján (Soliday és mtsi, 1984, és W0-A-90/09446 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés (Plánt Genetic Systems)) teljes egészében szintetikus DNS fragmenst terveztünk, amely Fusarium solani pisi pre-pro-kutináz polipeptidet kódoló régiót tartalmaz. Az eredeti Fusarium solani pisi gén nukleotid-szekvenciájához képest ez a szintetikus kutináz gén több nukleotidot érintő változásokat foglal magában, melyeknél a génen belül megfelelő helyekre restrikciós enzim felismerési helyeket építettünk, anélkül, hogy befolyásolnánk a kódolt aminosav-szekvenciát. A teljes szintetikus kutináz gén nukleotid-szekvenciáját a 1/D ábrán mutatjuk be.

A szintetikus kutináz gén létrehozásához szintetikus DNS oligonukleotidokból kiindulva három külön kazettát illesztettünk össze. Valamennyi szintetikus DNS kazetta az elején EcoRI helyet, a végén HindlII helyet tartalmaz. Az

oligonukleotidokat Applied Biosystems 380A típusú DNS-szintetizátor alkalmazásával szintetizáltuk, és poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítottuk. Az egyes kazetták összeállításához az alábbiakban vázolt eljárást követtük. Az adott kazettát alkotó oligonukleotidők ekvimoláris mennyiségét (50 pmól) összekevertük, 5' végükön foszforiláltuk, és standard módszerek szerint annuáltuk és ligáltuk. A kétszálú DNS molekulák képződött elegyét EcoRIgyel és HindlII-mal emésztettük, agaróz gélelektroforézissel méret szerint frakcionáltuk, s a gélről elektro-elúcióval választottuk le. A kapott szintetikus DNS kazettát a pUC9 2,7 kb-os EcoRI-HindlII fragmenséhez ligáltuk, és Escherichia coli-ha transzformáltuk. A szintetikus kazetták szekvenciájának igazolása érdekében számos klón EcoRIHindlII inszertjét mindkét irányban teljes egészében megszekvenáltuk. Ezen eljárás alkalmazásával az 1-es kazettát tartalmazó PÜR7207 plazmidot (1/A ábra), a 2-es kazettát tartalmazó PÜR7208 plazmidot (1/B ábra) és a 3-as kazettát tartalmazó pUR7209 plazmidot (1/C ábra) alakítottuk ki. A szintetikus kutináz gént végül a pUR7207 2,9 kb-os EcoRI-Apal fragmense, a pUR7208 0.2 kb-os Apal-Nhel fragmense és a pUR7209 0,3 kb-os Nhel-HindlII fragmense egyesítésével állítottuk össze, miáltal a pUR7210 plazmidot kaptuk, amely a Fusarium solani pisi teljes pre-prokutinázát kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmaz (1/D ábra).

• · ·

2. ábra

A Fusarium solani piai (pro)kutlnáz expresszálása Escherichia coli-ban

A szintetikus kutináz génnel az E. coli számára expressziós vektort készítettünk, amely funkcionálisan hasonló a WO-A90/09446 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Plánt Genetic Systems) leírt vektorhoz. Olyan konstrukciót terveztünk, amelyben a Fusarium solani pisi pro-kutinázt kódoló szintetikus gén részt megfelelő E. coli expressziós jelek előzik meg, azaz (i) egy indukálható promoter; (ii) egy riboszóma kötési hely; és (iii) egy jelző-szekvencia, amely transzlációs kezdő kodont, és a pro-kutináz citoplazma membránon keresztüli transzportjához szükséges információt biztosít.

Az E. coli phoA jelző-szekvenciája származékának a szintetikus kutináz gén pro-szekvenciájával való fúziójához szintetikus linkért (ld. 2. ábra) terveztünk. A jelző peptid hasításának és a pro-kutináz szekréciójának elősegítéséhez a phoA jelző-szekvencia három C-terminális aminosav-gyökét (Thr-Lys-Ala) Ala-Asn-Ala aminosavakkal helyettesítettük, a kutináz pro-szekvenciájának N-terminális aminosav-gyökét (leu 1, ld. 1/D ábra) pedig alaninra cseréltük. Ez a konstrukció biztosítja a kutináz számára, hogy a periplazmatikus térbe szekretálódjon (ld. WO-A-90/09446 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés. Plánt Genetic Systems).

• * · · ····

- 36 Hogy ilyen konstrukciót kapjunk, a kutináz pre-szekvenciát, és a pro-szekvencia egy részét tartalmazó 69 kb-os EcoRISpel fragmenst eltávolítóttűk a PÜR7210 plazmidból, és a szintetikus DNS linker szekvenciával (EcoRI-Spel fragmens) helyettesítettük, ami az E. coli phoA pre-szekvencia származékot és a kutináz pro-szekvencia megváltoztatott Nterminális aminosav-gyökét (2. ábra) eredményezte. A kapott plazmidot pUR7250-nek neveztük el, és riboszómakötő helyet és a phoA jelző-szekvenciához fuzionált pro-kutináz-kódoló régiót tartalmazó 0,7 kb-os BamHI-HindlII fragmens izolálásához alkalmaztuk. Ezt a fragmenst a pMMB67EH plazmid (Fürste, J.P., Pansegrau, W., Frank, R., Blöcker, H., Scholz, P., Bagdasarian, M. és Lanka, E.: Molecular cloning of the plasmid RP4 prímásé region in a multi-host-range tacP expression vector, Gene, 119-131, 1986). 8,9 kb-os BamHI-HindlII fragmenséhez ligáltuk, miáltal a pUR7220 plazmidot kaptuk. Ebben a plazmidban a pro-kutinázt kódoló gén a phoA jelző-szekvencia módosított változatához fuzionálva található. és az indukálható tac-promoter szabályozása alatt áll.

A pUR7220 plazmidot tartalmazó WK6 E. coli törzset 0,5 liter IXTB tápközeget (0,017 M KH₂PO<; 0,017 M KsHP0₄; 12 g/1 Bacto-tryptone, 24 g/1 Bacto-élesztő kivonat, 0,4 V/V % glicerin) (Tartof és Hobbs, Gene, 67. 169-182, 1988) tartalmazó kétliteres rázólombikokban növesztettük. A tenyészeteket 100 ^g/ml ampicillin jelenlétében élénk rázás mellett (150 percenkénti fordulat) egy éjszakán keresztül

25-30 ’C-on addig növesztettük, mig az 0D 610 nm-nél el nem érte a 10-12-es értéket. A tenyészethez ezután 10 pM végkoncentrációban IPTG-t (izopropil-ö-D-tio-galaktopiranozid) adtunk, és az inkubálást további 12-16 órán keresztül folytattuk. Amikor a tenyészetekből vett minták analízisével a termelődött lipolitikus aktivitás további Jelentős növekedését nem tapasztaltuk, a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és az eredeti tenyészeti térfogatban 20 % szacharózt tartalmazó pufferben 0 ’C-on reszuszpendáltuk. A sejteket centrifugálással újra összegyűjtöttük, és az eredeti tenyészet térfogatával megegyező térfogatú Jéghideg vízben reszuszpendáltuk, ami a sejtek ozmotikus lízisét okozta. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk, majd a sejtmentes kivonatot ecetsavval pH = 4,8-ra savanyítottuk, egy éjszakára 4 ’C-on állni hagytuk, s a képződött csapadékot eltávolítottuk. Ebben a stádiumban a sejtmentes kivonat ultrafiltrálásával és fagyasztva szárításával 75 %-osnál tisztább, endogén lipázoktól lényegében mentes kutináz készítményt kaptunk. Más módon, a kutináz homogén állapot eléréséig (azaz 95 %-osnál nagyobb tisztaságúvá) is tisztítható, melynek során a savanyított sejtmentes kivonatot SP-sephadex oszlopra töltjük, az enzimet pH = 8.0 pufferrel eluáljuk. a koncentrált lúgos oldatot megfelelő térfogatú DEAE-cellulóz oszlopon (Whatman DE-52) engedjük át, és a DEAE oszlopon átfolyt frakciót közvetlenül Q-Sepharose HP (Paharmacia) oszlopra visszük. Sóoldat gradienssel végzett eluálással homogén kutináz készítményt kaptunk, melynek jellemző összes hozama 75 %-nál Jobb volt.

3. példa

Fúsarium solani pisi kutináz változatokat kódoló gének előállítása

A fusarium solani pisi pre-pro-kutináz 1. példában leírt szintetikus génjének alkalmazásával különböző géneket állítottunk melyek a kódolt aminosav-szekvenciában változtatásokat tartalmaztak. A gének kialakításához lényegében az 1.

példában a teljes szintetikus kutináz gént alkotó három kazetta előállításához leírt eljárásokat követtük. Például, az 1-es kazetta új változatát az 1. példában leírtakkal megegyező oligonukleotidok (a mutációval megváltoztatni kívánt helynek megfelelő kódoló tripletet lefedő két olignukleotid kivételével) alkalmazásával állítottuk össze. Az említett két oligonukleotid helyett olyan két új oligonukleotidot alkalmaztunk, melyek tartalmazzák a mutáns szekvenciát, de másképpen azonosak a helyettesített eredeti oligonukleotidokkal.

3/A példa

A CUTI1C IG és CUTI1I IG (ld. 1/A ábra) helyett egy CUTI1C IG változatot (amely AGA helyett GAG-t tartalmaz), illetve egy CUTI1I IG változatot (amely TCT helyett CTC-t tartalmaz) magában foglaló 1-es kazetta változat alkalmazásával az R17E Fusarium solani pisi kutinázt kódoló gént állítottunk elő.

«· · ···♦

- 39 Az új ,1-es kazettát lényegében az 1. példában leírtak szerint klónoztuk és szekvenáltuk, és a PÜR7210 plazmid megfelelő fragmensét az R17E mutációt tartalmazó, körülbelül 120 bp-os EcoRI/NruI DNS-fragmenssel helyettesítettük, miáltal a pUR7240 plazmidot (R17E) kaptuk. Az e plazmidból származó 0,6 kb-os Spel-HindlII fragmenst a pUR7220 plazmid megfelelő fragmensének helyettesítésére használtuk, miáltal a pUR7222 (R17E) E. coli expressziós plazmidot kaptuk, amelyet a WK6 E. coli törzsbe transzformáltunk. A transzformánsokat a 2. példában leírt módon növesztettük, s a pro-kutináz enzim változatot lényegében a 2. példában leírtak szerint nyertük ki és tisztítottuk. A 17. arginin lizinnel vagy leucinnal hasonlóan helyettesíthető.

3/B példa

A CUTI3F MH és CUTI3M MH helyett (ld. 3/A ábra) egy CUTI3F

MH változatot (amely CGG helyett GAG-t tartalmaz), illetve egy CUTI3M MH változatot (amely CCG helyett CTC-t tartalmaz) magában foglaló

3-as kazetta változat alkalmazásával

R196E

Fu sár iiun solani pisi kutináz változatot kódoló gént állítottunk elő.

Az ú,i

3-as kazettát lényegében példában leírtak szerint klónoztuk és szekvenáltuk. és a

PUR7210 plazmid megfelelő fragmensét az R196E mutációt tartalmazó, körülbelül 120 bp-os EcoRI/NruI DNS-fragmenssel helyettesítettük, miáltal a pUR7241 plazmidot (R196E) kaptuk. Az e plazmidból származó 0,6 kb-os Spel-HindlII fragmenst a pUR7220 plazmid megfelelő fragmensének

helyettesítésére használtuk, miáltal a pUR7222 (R17E) E. coli expressziós plazmidot kaptuk, melyet a WK6 E. coli törzsbe transzformáltunk. A transzformánsokat a 2. példában leírt módon növesztettük, s a pro-kutináz enzim változatot lényegében a 2. példában leírtak szerint nyertük ki és tisztítottuk. Ugyanezen eljárással a 196. arginint lizinnel helyettesítettük (R196K), melynek során a CUTI3F MH és a CUTI3M MH helyett egy CUTI3F MH változatot (amely CGG helyett AAG-t tartalmaz), illetve egy CUTI3M MH változatot (amely CGG helyett CTT-t tartalmaz) alkalmaztunk. Hasonlóan, a 196. arginint leucinnal helyettesítettük (R196L), melynek során a CUTI3F MH és a CUTI3M MH helyett egy CUTI3F MH változatot (amely CGG helyett CTT-t tartalmaz), illetve egy CUTI3M MH változatot (amely CCG helyett AAG-t tartalmaz) alkalmaztunk. A 196. arginin alaninnal végzett helyettesítéséhez szintén ezt a módszert alkalmaztuk.

3/C példa

A CUTUF IG és CUTI1L IG (ld. 1/A ábra) helyett egy CUTI1F

IG változatot (amely CTC helyett GCT-t tartalmaz), illetve egy CUTUL IG változatot (amely GAG helyett AGC-t tartalmaz) magában foglaló

1-es kazetta változat alkalmazásával L51A

Fusarium solani pisi kutináz változatot kódoló gént állítottunk elő.

Az új

1-es kazettát lényegében az 1.

példában leírtak szerint klónoztuk és szekvenáltuk, és a pUR7210 plazmid megfelelő fragmensét az L51A mutációt tartalmazó, körülbelül 12 kb-os EcoRI/NruI DNS fragmenssel helyettesítettük, miáltal

Az e plazmidból származó a PÜR724.2 (L51A) plazmidot kaptuk.

0.6 kb-os Spel-HindlII fragmenst a

PÜR7220 megfelelő fragmenséntek helyettesítéséhez használtuk, miáltal a PÜR7245 (L51A)

E. coli expressziós plazmidot kaptuk, amelyet a WK6

E. coli törzsbe transzformáltunk. A transzformánsokat a 2. példában leírt módon növesztettük, pro-kutináz enzim változatot lényegében a 2. példában leírtak szerint nyertük ki és tisztítottuk. Hasonlóan, az 51.

leucin szerinnel is

3/D példa

A 3/A és 3/B példa szerint előállított kazetták alkalmazásával két módosítást tartalmazó kutináz változat állítható elő. A

3/A példában a pUR7240 (R17E) plazmid, a

3/B példában pedig az R196E mutációt tartalmazó Eagl/HindlII

DNS-fragmens kialakítását írtuk le. A pUR7240 (R17E)

Apai/HindiII

DNS-fragmensét a pUR7241 Apai/HindiII DNSfragmensével helyettesítettük, miáltal

PÜR7243 (R17E+R196E) plazmidot kaptuk. Az plazmidból származó 0,6 kb-os

Spel-HindlII fragmenst a pUR7220 megfelelő fragmenséntek helyettesítéséhez használtuk, miáltal a pUR7226 (R17E+R196E) E. coli expressziós plazmidot kaptuk, amelyet a WK6 E. coli törzsbe transzformáltunk. A transzformánsokat a 2. példában leírt módon növesztettük, s a pro-kutináz enzim változatot lényegében a 2. példában leírtak szerint nyertük ki és tisztítottuk.

3/E példa

A 3/A és 3/B példa szerint előállított kazetták alkalmazásával két módosítást tartalmazó kutináz változat állítható elő.

3/A példában a pUR7240 (R17E) plazmid, a

3/C példában az

L51A mutációt tartalmazó DNS-fragmens kialakítását írtuk le. A pUR7240 megfelelő fragmensét a

PÜR7242 plazmid BclI/Apal fragmensével helyettesítettük, miáltal a pUR7246 (R17E+L51A) E. coli expressziós plazmidot kaptuk, amelyet a WK6 E. coli törzsbe transzformáltunk. A transzformánsokat a 2. példában leírt módon növesztettük, s a pro-kutináz enzim változatot lényegében a 2. példában leírtak szerint nyertük ki és tisztítottuk.

4. példa

A FuBárium eolani pisi kutináz expresszáláea

Saccharomyces cerevisiae-ben

A szintetikus Fusarium solari pisi kutináz gén Saccharomyces cerevi siae-ben való expresszálásához olyan expressziós vektort készítettünk melyben az érett kutinázt kódoló szintetikus gén előtt a

S. cerevisiae invertáz pre-szekvenciá.ja (Taussig, R.

és Carlsson, M.: Nucleotide sequence of the yeast SUC2 gene fór invertase, Nucleic Acids

Rés., 11. 1943-1954, 1983) és az erős, indukálható gal7 promoter (Nogi, Y. és Fukasawa,

T.. Nucleotide sequence of the transcriptional initiation region of the yeast GAL7 gene,

Nucleic Acids Rés., 11. 8555-8568, 1983) áll. Ilyen ···· ···· fúzióhoz a szintetikus kutináz gént úgy készítettük, hogy egy adapter fragmenst szintetizáltunk, melyben az invertáz pre-szekvenciát kódoló szekvenciát az érett kutináz N terminálisát kódoló szekvenc iához fúzionáltuk. Ezt a fragmenst lényegében az

1.

példában leírt módon EcoRIHindlII kazettaként (8-as kazetta, ld. 3. ábra) pUC9 plazmidba illesztettük, miáltal a pUR7217 plazmidot kaptuk.

A pUR7210 és pUR7217 plazmidokat JM110 E. coli törzsbe (mely nem rendelkezik dam metiláz aktivitással) transzformáltuk, és a pUR7217 2,8 kb-os BclI-HindlII fragmensét a pUR7210 0,6 kb-os BclI-HindlII fragmensével ligáltuk, miáltal a pUR7218 plazmidot kaptuk, melyben az érett kutináz polipeptidet kódoló nukleotid-szekvencia a S. cerevisiae invertáz preszekvenciát kódoló régió egy részével fúzionálva van jelen.

A pUR2741 expressziós vektort (4. ábra) pUR2740-ből (Verbakel, J.A.M.V., Heterologous gene expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Ph.D. disszertáció, Rijke Universiteit Utrecht, Hollandia, 1991) (6. ábra) származtattuk, oly módon, hogy izoláltuk a PÜR2740 8,9 kb-os Nrul-Slal fragmensét, Sáli túlnyúló végét Klenowpolimerázzal feltöltöttük, és a fragmenst gyűrűvé zártuk. A PÜR2741 7,3 kb-os SacI-HindlII fragmensét a PÜR7218 0,7 kbos SacI-HindlII fragmenséhez ligáltuk, miáltal a pUR7219 plazmidot kaptuk (ld. 5. ábra). A S. cerevisiae polll terminátor tetszés szerint a kutináz gén mögé helyezhető a HindlII helyen, melyről kiderült, hogy a kutináz gén hatékony expresszálásához nem feltétlenül szükséges. A PÜR7219 E. coli - S. cerevisiae shuttle” plazmid a 2p «· ♦ · ···· ···;

• · · · * · «·«·· · _Λ* ···· ···· · · * »··· · · ♦· · plazmidot tartalmazó S. cerevisiae törzsekben (dr* törzsek) való replikádéhoz egy replikációs kezdőhelyet. a S. cerevisiae Leu2 gén (S. cerevisiae leu^- törzsekben nagy kópiaszámú trasznformánsok szelekcióját lehetővé tevő) promoterhiányos változatát, és a Fusarium solani pisi kutináz érett részét kódoló szintetikus gént az erős, indukálható S. cerevisiae gal7 promoter szabályozása alatt a S. cerevisiae invertáz pre-szekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazza.

Az SU50 S. cerevisiae törzset (a, cir°, leu2, his4, canl), amely azonos az YT6-2-1L törzzsel (Erhart, E. és Hollenberg, C.P. , Curing of Saccharomyces cerevisiae 2-μιη DNA by transformation, Curr. Génét., 3, 83-89, 1981), élesztősejtek standard elektoroporációs eljárásának alkalmazásával a 2μ S. cerevisiae plazmid és a pUR7219 plazmid ekvimoláris mennyiségével együttesen transzformáltuk. A transzformánsokat leucin prototrófiára szelektáltuk, és számos transzformánsból teljes DNS-t izoláltunk. Valamennyi transzformáns esetében úgy tűnt, hogy a 2μ és pUR7219 plazmidot egyaránt tartalmazzák, példát szolgáltatva arra, hogy a leu2 gén pUR7219 plazmidban lévő promoter-hiányos változata (amennyiben nagy kópiaszámban van Jelen) a 2u élesztő piamid Jelenlétének köszönhetően csak funkcionálisan egészítheti ki a leu2-hiányos törzseket. A transzformánsok egyikét komplett táptalajon több, mint 40 generáción keresztül tenyésztettük, majd szelektív szilárd táptalajon replika-technikával lenyomatokat készítettünk, miáltal az

SU51 S. oerevtsiae törzset (a. cir*, Ieu2, his4, canl) kaptuk.

A pUR7219 plazmidot tartalmazó SU51 S. cerevisiae törzset 0,2 liter MM tápközeget (6,7 g/1 aminosavak nélküli élesztő nitrogén bázis, 20 mg/1 hisztidin, 20 g/1 glükóz) tartalmazó 1 literes rázólomblkokban növesztettük.

A tenyészeteket 30 ^eC-on, egy éjszakán keresztül élénk rázás (150 percenkénti fordulat) mellett addig növesztettük, míg 610 nm-nél az OD el nem érte a 2-4 értéket. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és 2 literes rázólombikban 1 liter YPGAL tápközegben (10 g/1 élesztő kivonat, 20 g/1 bacto pepton, 50 g/1 galaktóz) reszuszpendáltuk, s az inkubálást további 12-16 óráig folytattuk. Szabályos időközönként mintákat vettünk a tenyészetből, s a sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk. A felülúszót szubsztrátként olívaolaj alkalmazásával titrimetriás módszerrel kutináz aktivitásra teszteltük. Valamennyi minta esetében 5,0 ml lipáz szubsztrát (a lipáz számára szubsztrátként olívaolajat tartalmaz, Sigma) és 25,0 ml puffér (5 mM

Tris-HCl, pH

9,0, 40 mM NaCl, 20 mM CaClz) kevert elegyéhez 100-200 ul szűrletet adtunk. A vizsgálatot °C-on végeztük, és a zsírsavak felszabadulását (0,05 M

NaOH oldattal a pH-t 9,0-re állítva) Mettler DL25 titráló berendezésben automatizált titrálással mértük. A titrálószer idő függvényében mért mennyiségével görbét készítettünk. A mintában jelenlevő lipáz aktivitás nagyságát a görbe maximális meredekségéből számítottuk ki. Egy enzimaktivitási egység úgy definiálható, mint az enzim azon mennyisége, amely a fentebb meghatározott körülmények között az olívaolajból egy perc alatt 1 μηόΐ zsírsavat szabadít fel. Az ilyen meghatározások a szakemberek számára ismertek.

Amikor a kutináz-aktivitás termelődése tovább már nem fokozódott, a sejteket centrifugálással eltávolitottuk, majd a sejtmentes kivonatot ecetsavval pH = 4,8-ra állítottuk, és a kutinázt az 1. példában leírt módon nyertük ki.

5. példa

Fusarium solani pisi kutináz változatok expresszáláea

S. cerevisiae-ben

A pUR7241 (R196E) plazmid 0,5 kb-os Apal-HindlII fragmensét a pUR7218 plazmid hasonló fragmensének helyettesítéséhez használtuk, miáltal a pUR7229 (R196E) plazmidot kaptuk, melyben a mutációt tartalmazó gént működőképesen kapcsoltuk a S. cerevislae jelző-szekvenciához. A pUR7241 7,0 kb-os SacI-HindlII fragmensét a pUR7229 (R196E) 0,7 kb-os SaclHindlII fragmenséhez ligáltuk, miáltal a pUR7235 (R196E) plazmidot kaptuk, amelyet az SU51 S. cerevisiae törzs transzformálásához használtunk. A kapott transzformánsokat a 4. példában leírtak szerint inkubáltuk, és a tenyésztő közegből a termelődött enzim változatot a 4. és 1. példában leírtak szerint nyertük ki.

6. példa

Fusarium solani pisi kutináz expresszálása

Aspergi11ue-okban

A szintetikus Fusarium solani pisi kutináz gén Aspergi11us niger var. awatnori-ban történő expresszálásához olyan expressziós vektort készítettünk, melyben a Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló szintetikus gént az A. niger var. awamori erős, indukálható exlA promoterének [Maat, J., Róza, M. , Verbakel, J. Stam, J., Santos de Silva,

M.J., Bőssé, M. , Eggmond, M.R. , Hagemans, M.L.D., v. Gorcom, R.F.M., Hessing, J.G.M., v.d. Hondel, C.A.M.J.J. és v. Rotterdam, C. : Xylanes and their application in bakery (Xylans and Xylanases, Progress in Biotechnology, szerk.: Visser, J. Beldman, G. , Kusters-van Someren, M.A. és Voragen, A.G.J., 7. kötet, Elsevier Science Publishers,

Amsterdam, 1992, ISBN 0-444-89477-2); de Graaf, L.H., van den Broek, H.C., van Ooijen, A.J.J. és Visser, J.: Structure and regulation of an Aspergillus xylanase gene (Xylans and Xylanases, Progress in Biotechnology, szerk.: Visser, J. Beldman, G., Kueters-van Someren, M.A. és Voragen, A.G.J.,

7. kötet, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1992, ISBN 0-444-89477-2)] szabályozása alá helyeztük.

A PÜR7280 pre-pro-kutináz expressziós plazmidot a pAW14B plazmidból kiindulva állítottuk elő, melyet a JM109 E. coli törzsben 1990. május 31-én CBS 237.90 deponálási számon a Centraalbureau voor Schimmelcultures-nél (Baarn, Hollandia) helyeztünk letétbe, s amely 2,5 kb-os 5' szegélyező szekvencáival és 2,0 kb-os 3' szegélyező szekvenciával együtt egy kb. 5,3 kb-os Sáli fragmenst tartalmaz, melyen a 0,7 kb-os endoxllanáz II (exlA) gén helyezkedik el (8. ábra). A pAW14B plazmidban az exlA kódoló régiót a pre-pro-kutinázt kódoló régióval helyettesítettük. Az exlA gén első kodonját (ATG) tartalmazó BspHI helyet (5'-TCATGA-3') és az exlA gén stop kodonját (TAA) tartalmazó AflII helyet (5'-CTTAAG-3') felhasználtuk a pUR7280 plazmid előállításához.

A plazmid Összeállítását az alábbiak szerint végeztük. A pAW14B plazmidot (7,9 kb) BspHI-gyel részlegesen emésztettük, s a linearizált plazmidot (7,9 kb) agaróz gélről izoláltuk. Az izolált 7,9 kb-os fragmenst ezután a más BspHI helyeknél linearizált plazmidok eltávolítása érdekében BsmI-gyel hasítottuk, amely a számunkra érdekes BspHI helytől downstream irányban néhány nukleotid távolságra hasít. A fragmenseket agaróz gélen választottuk el, és izoláltuk a 7,9 kb-os BspHI-BsmI fragmenst. Ezt AflII-vel részlegesen emésztettük, s a kapott 7,2 kb-os BspHI-AflII fragmenst izoláltuk.

A PÜR7210 0,7 kb-os BspHI-AflII fragmensét, amely a Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló nyitott leolvasási keret egészét tartalmazza, a pAW14B plazmid 7,2 kb-os BspHI-AflII fragmensével ligáltuk, miáltal a p(JR7280 plazmidot kaptuk. Az előállított vektort (pUR7280) ezután hagyományos együttes • « · · ···* ·.»♦· · transzformálási technikák alkalmazásával penészgombákba (pl. Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, stb.) transzformálhatjuk, s a pre-pro-kutináz gén az endoxilanázll promoter indukálásával expresszálható. Az előállított rDNS vektorba hagyományos szelekciós markereket (pl. amdS vagy pyrG, higromicin, stb. ) is építhetünk, s a penészgombákat a kívánt protein expresszálása érdekében a kapott rDNS vektorral transzformálhatjuk. Az amdS és pyrG szelekciós markerek expressziós vektorba történő bevitelével például a pUR7281-et kapjuk (10. ábra). E célból NotI helyet hozunk létre, oly módon, hogy a pre-pro-kutináz gén ATG kodonjától upstream irányban 1,2 kb távolságban elhelyezkedő EcoRI helyet szintetikus oligonukleotid (5'-AATTGCGGCCGC-3') felhasználásával NotI hellyé alakítjuk, miáltal a pUR7282 plazmidot kapjuk. A teljes A. nidulans amdS gént és A. niger var.

awamori pyrG gént saját promotereikkel és terminátoraikkal szegélyező NotI együtt tartalmazó megfelelő DNS fragmenst helyekkel láttuk el, és a pUR7282 plazmid

NotI helyére vittük be, miáltal a pUR7281 plazmidot kaptuk (10. ábra).

A szintetikus Fusarium solani pisi kutináz gén Aspergillus niger var. awamori-b>an más módon történő expresszálásához olyan expressziós vektort készítettünk, melyben az érett kutinázt kódoló szintetikus gén előtt nem a saját pre-proszekvenciája, hanem az A. niger var. awamori exlA preszekvenciája helyezkedik el.

·« · « · · ··*· »Λ·*

- 50 • · · f ·»·· • · · · · • · ·· ·

Az ilyen fúziókhoz előállításához számos melyekben az exlA alkalmas szintetikus kutináz gén adaptor fragmenst szintetizáltunk, pre-szekvenciát kódoló szekvenciát különböző módokon kapcsoltuk az érett kutináz N-terminállsát kódoló szekvenciához. Az 5-ös kazettában az összekapcsolást úgy végeztük, hogy az exlA pre-szekvenciát a kutináz pro-szekvenciájához fuzionáltuk. A 6-os kazettában az exlA pre-szekvenciát az érett kutináz N-terminális gyökéhez fuzionáltuk. A 7-es kazetta azonos a 6-ossal, de ebben a kódolt érett kutináz polipeptid N-terminális gyökét az eredeti glicinről szerinre cseréltük, hogy a jelző-peptid hasításának követelményeihez jobban igazodjon. Az 5-ös, 6-os és 7-es kazettát, lényegében az 1. példában leírtak szerint, szintetikus oligonukleotidokból állítottuk össze (ld. 7.

ábra). Az 5-ös kazettát a pUR7210 plazmid 0,1 kb-os

EcoRI-Spel fragmensének helyettesítéséhez használtuk, miáltal a pUR7287 plazmidot kaptuk. A 6-os és 7-es kazettát a PUR7210

0,1 kb-os

EcoRI-BclI fragmensének helyettesítéséhez használtuk, miáltal a pUR7287, illetve a pUR7288 plazmidot kaptuk.

A PÜR7287,

PÜR7288 és pUR7289 plazmidok esetében a 0,7 kb-os BspHI-AflII fragmenst a

PAW14B 7,2 kb-os BspHI-AflII fragmensével ligáltuk, miáltal a pUR7290, pUR7291, illetve pUR7292 plazmidot kaptuk.

A kialakított rDNS vektorokat ezután hagyományos együttes transzformálási technikákkal penészgombákba (Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori) transzformáltuk, és a pre-(pro)-kutináz gént az endoxilanázll promoter

- 51 9 9··· ··»· · · • b · « « ♦ ·· indukálásával expresszáltuk. Az előállított rDNS vektorokba hagyományos szelekciós markerekkel (pl. amdS vagy pyrG, higromicin, stb. ) is építhetünk, s a penészgombákat a kívánt protein expresszálása érdekében a kapott rDNS vektorral transzformálhatjuk, amint azt ebben a példában a pUR7280 esetében bemutattuk (ld. fentebb).

Az érett Fusarium solani pisi kutinázt kódoló régiót a megfelelő pro-szekvenciával vagy a kutináz jelzőszekvenciával vagy az exlA jelző-szekvenciával együtt (vagy ezek nélkül) az Aspergillus niger var.

awamori exlA promoter és terminátor szabályozása alatt tartalmazó pUR7280,

PÜR7281, pUR7290, PÜR7291 vagy

PÜR7292 expressziós vektorokkal transzformált Aspergillus törzseket az alábbi körülmények között növesztettük. Több, 400 ml szintetikus tápközeget (pH

6,5) tartalmazó 1 literes rázólombikot

10E6/ml végkoncentrációban spórákkal oltottunk. A tápközeg az alábbi összetételű volt (AW tápközeg):

szacharóz g/1

NaNOs

6,0 g/1

KC1

0,52 g/1

KH2PO4

1,52 g/1

MgS0₄-7HzO

0,49 g/1 élesztő-kivonat

1,0 g/1

ZnS0₄·7HsO mg/1

H3BO3 mg/1

MnCÍ2-4H₂0 mg/1

FeS0₄-7H₂0 mg/1 «· · » « · * · · • ·· · « • · · · · • e ··· «

CaC12-6H20	1,7 mg/1
CuS04-5Hs0	1,6 mg/1
NaH2Mo04·2HZO	1,5 mg/1
NazEDTA	50 mg/1

Az lnkubálást ’C-on 24 órán keresztül

200 percenkénti fordulattal Mk rázó inkubáló készülékben végeztük. A növesztés után sejteket szűréssel (0,45 jan-es filteren) szacharóz és élesztő-kivonat nélküli AW tápközegben (sóoldat) kétszer mostuk, 50 ml sóoldatban reszuszpendáltuk, és 50 ml sóoldatot tartalmazó 300 ml-es rázólombikokba tettük, melyekhez 10 g/1 végkoncentrác ióban xilózt adtunk (indukáló közeg). A fenti körülmények között az lnkubálást egy éjszakán keresztül végeztük. A kapott tenyészeteket biomassza eltávolítása érdekében miracloth-on szűrtük, és a kutinázt lényegében a 2. példában leírt módon nyertük ki.

7. példa

Fusarium solanl pisi kutináz változatok expresszálása Aspergi11us-okban

Lényegében a 6. példában leírt eljárást követve, de a gomba expressziós vektor előállításához a pUR7210 plazmid helyett pUR7240 (R17E) vagy pUR7241 (R196E) plazmidot alkalmazva

Aspergillus niger var. awamori-ban az említett mutációkat tartalmazó Fusariwn solani pisi kutináz változatokat termeltünk.

- 53 ·» · ♦ *······· • · · · ·’ * · · · · ·.·* • ···· ·»·· » *· ···· » · ·· ·

Θ. példa

A Fusarium solani pisi kutináz génnel rokon gének azonosítása és izolálása

Különböző gombákból a Fusarium solani pisi kutinázzal különböző fokú homológiát mutató kutinázokat kódoló géneket izoláltunk. A gombatenyészeteket 0,25 % glükózzal kiegészített Hankin, L. és Kolattukudy, P.E. (J. Gén. Microbiol., ül, 457-463, 1968) által leírt 200 ml tápközeget tartalmazó 500 ml rázólomblkokban Mk X típusú rázó inkubátor készülékben (100 percenkénti fordulattal) 4 napon keresztül 28 ’C-on inkubáltuk. Ennyi idő elteltével a glükóz elhasználódott, s a kutináz-termelést lényegében Ettinger és mtsi. (Biochemistry, 26. 7883-7892, 1987) által leírt módon kutin hidrolizátum hozzáadásával indukáltuk. A tenyészetből szabályos időközönként mintákat vettünk, s azokat standard módszerekkel (ld. 4. példa) lipolitikus aktivitás jelenlétére vizsgáltuk. A lipolitikus aktivitás rendszerint az indukálást követően kb. két nappal mutatható ki, s ekkor a sejteket standard módszerekkel végzett szűréssel összegyűjtöttük. A micéliumokat mostuk, folyékony nitrogénben fagyasztottuk, s standard módszerekkel liofilizáltuk. A guanidinium-tíocianát eljárással teljes celluláris RNS készítményeket izoláltunk, melyeket lényegében Sambrook, J., Fritsch, E.F. és Maniatis, T. által leírt módon (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, ISNB 0-87969-309-6) cézium-kloridos ···« «··« ·* ···· ···· » *· ; ···· · · ·· *

- 54 sűrűség-gradiens centrifugálással tisztítottuk. PoliA(+) mRNS frakciókat poliAT traktus mRNS izoláló kit (Promega) alkalmazásával izoláltunk. A poliA(+) mRNS frakciókat a kutinázzal rokon gének expressziójának igazolása érdekében — próbaként a Fusarium solani pisi kutináz gén egy cDNS fragmensének alkalmazásával — standard technikák szerint Northern hibridizációs analízisben alkalmaztuk. A próbával hibridizálni képes anyagot tartalmazó mRNS készítményeket a forgalmazó útmutatásai szerint ZAP cDNS szintetizáló kit (Stratagene, La Jolla) alkalmazásával cDNS szintetizálásához használtuk, miáltal olyan cDNS fragmenseket kaptunk, amelyek a poli-A régiót szegélyező Xhol ragadós véggel, a molekula másik végén pedig EcoRI adaptorral rendelkeztek. A kapott cDNS fragmenseket lambda ZAPII vektorokban (Stratagene, La Jolla) szensz irányban, irányított klónozással expressziós könyvtárak létrehozásához alkalmaztuk, melyek lehetővé teszik a β-galaktozidáz fúziós proteinek expresszióját (Huse, W.D. és Hansen, C., Strategies, 1, 1-3, (1988). Ezeket a könyvtárakat Fusarium solani pisi kutináz ellen termelt antiszérum alkalmazásával screeneltük.

Más módon, a szintetizált cDNS frakciókat kutináz-specifikus primerek (ld. 2. táblázat) alkalmazásával PCR-screening módszerrel vizsgáltuk. A primerek több gomba kutináz gén aminosav-szekvenciájának összehasonlításából származnak (Ettinger, W.F., Thukral, S.K. és Kolattukudy, P.E.: Structure of cutinasé gene, cDNS, and the derived amino acid sequence from phytopathogenic fungi, Biochemistry, • · · · ·

- 55 7883-7892, 1987).

PCR reakció kötülményeit minden egyes primer készlethez külön állítottuk be, s kontrolként

Fusari um solani pisi kutinázból származó cDNS-t alkalmaztunk.

Azon cDNS készítmények esetében, melyekkel a Fusarium solani pisi kutinázból származó cDNS-sel azonos körülmények között előállított PCR fragmens hosszához hasonló (vagy nagyobb) specifikus PCR fragmenst tudtunk előállítani, a kapott PCR fragmenst gélelektroforézissel tisztítottuk, és leválasztottuk a gélről.

Egy másik megközelítés szerint specifikus kutináz primereket használva közvetlenül néhány gombatörzs genom-DNS-éhez szintén PCR screening technikát alkalmaztunk, melynek során pozitív kontrollként Fusarium solani pisi genom DNS-t használtunk. Azon gomba genom-DNS készítmények esetében, melyekkel a Fusarium solani pisi kutinázból származó cDNSsel azonos körülmények között előállított PCR fragmens hosszához hasonló (vagy nagyobb) specifikus PCR fragmenst tudtunk előállítani, a kapott PCR fragmenst gélelektroforézissel tisztítottuk, és leválasztottuk a gélről.

Az expressziós könyvtár módszerrel vagy (akár cDNS, akár genom-DNS alkalmazásával) a pozitívnak értékelt törzsek, esetében nagy molekulatömegű törzseket lényegében Ettinger

PCR screening módszerrel valamint számos egyéb törzs genom-DNS-t izoláltunk. A és mtsi. (1987, ld. fentebb) által leírt módon növesztettük, a genom-DNS-t pedig de • · · · · · · • ···»····· · · ··· · · ·· ·

Graaf, L.H. , H.W.J. van den Broek és J. Visser által leírt módon (Isolation and expression of the Aspergillus nidulans pyruvate kinase gene, Curr. Génét., 13, 315-321, 1988). izoláltuk. A genom-DNS-t különböző restrikciós enzimekkel emésztettük, és próbaként az analóg cDNS inszert (expressziós könyvtár módszer) vagy a PCR fragmens (PCR screening módszer) vagy a Fusarium solani pisi kutináz gén (más törzsek esetében) alkalmazásával Southern hibridizációval vizsgáltuk. A kutináz génekről fizikai térképet készítettünk. A genom-DNS egy megfelelően emésztett mintáját gélelektroforézissel méret szerint frakcionáltuk, a megfelelő méretű fragmenseket leválasztottuk a gélről, és PÜC19 plazmidba szubklónoztuk. E genom könyvtárakat a megfelelő cDNS inszerttel (expressziós könyvtár módszer) vagy a PCR fragmenssel (PCR screening módszer) screeneltük, miáltal a kutináz gének genom kópiáit tartalmazó kiónokat kaptunk. E géneket mindkét irányban megszekvenáltuk. Az intronokat a megfelelő cDNS szekvenálásával vagy más kutináz szekvenciákkal történő összehasonlítással (Ettinger és mtsi, 1987, ld. fentebb) azonosítottuk. Az érett kutináz polipeptid N-terminális végét szintén ilyen összehasonlításból származtattuk. Standard PCR technikák alkalmazásával az intronokat eltávolítottuk, közvetlenül a nyitott leolvasási keret mellé downstream irányban HindiII helyet vittünk be, s a Saccharomyces cerevisiae invertáz gén pre-szekvencját kódoló szekvenciáját (amely előtt egy SacI hely található, vö. a 8-as kazettával, 3. ábra) az érett kutináz N-terminálisát kódoló szekvenciához fuzionáltuk. A kapott, a kutináz géneket a Saccharomyces cerevisiae invertáz pre-szekvenciát kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazó SacI-HindlII fragmenseket a pUR7241 7,3 kb-os SacI-HindlII fragmenséhez ligáltuk (ld. 4. ábra), s az SU31 S. cerevisiae törzsbe transzformáltuk. A gomba kutinázokat lényegében a 4. példában leírtak szerint expresszáltuk és nyertük ki a tenyésztő közegből.

9. példa

Az R17E, R196E és R17E+R196E Fusarium solani piai kutináz változatok különböző anionos felületaktív anyagokkal való kompat ib i1itása

A Fusarium solani pisi kutináz és az R17E, R196E és

R17E+R196E Fusarium solani pisi kutináz változatok különböző anionos felületaktív anyagokkal való kompatibilitását az alábbiak szerint teszteltük. Különböző detergens készítményekben enzimoldatokat készítettünk. Az oldatokat 40 °C-on inkubáltuk, és szabályos időközönként mintákat vettünk, majd az enzimaktivitást a 4. példában leírt vizsgálattal meghatároztuk. Az alábbi (A, B, C) detergens készítményeket alkalmaztuk.

···· ····

- 58 V

A készítmény

Vegyület m/m %

Na - lineáris alkil-benzol-szulfonát11,7

Nemionos felületaktív anyag 7E05,8

Nemionos felületaktív anyag 3E03,2

Zeolit38,8

Sokolan CP74,8

Nátrium CMC0,8

Nátrium-karbonát13,9

Nátrium-perborát8,0

TAED5,4

Nátrium-szilikát2,5

B készítmény

Vegyületm/m %

Nátrium primer alkil-szulfát6,5

Nemionos felületaktív anyag 7E06,5

Nemionos felületaktív anyag 3E08,3

Szappan2,3

Zeolit38,0

Nátrium-karbonát15,9

Nátrium-perborát8,0

TAED5,4

Nátrium-szilikát2,5

C készítmény

Vegyület m/m %

Na - lineáris alkil-benzil-szulfonát

6,9

Nemionos felületaktív anyag

10,0

Szappan

2,0

Zeolit

27,0

Nátrium-karbonát

10,2

Az A, B és C készítményekkel kapott eredményeket a 12., 13., illetve 14. ábrán mutatjuk be. Az eredményekből az következik, hogy (különösen a sok anionos felületaktív anyagot tartalmazó A'· készítményben) a kutináz változatok stabilabbak, mint a vad típusú Fusarium solani pisi kutináz.

10. példa

Az R196K és R196L Fusarium solani pisi kutináz változatok nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) való kompatibilitása

A Fusarium solani pisi kutináz és az R196K és R196L Fusarium solani pisi kutináz változatok nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) való kompatibilitását a következők szerint teszteltük.

Az enzimekből 0,4 mM SDS-ben és 10 mM Tris-ben 0 ’FH vízkeménységnél oldatokat készítettünk, melyeket 40 °C-on inkubáltunk, és szabályos időközönként mintákat vettünk. A visszamaradt enzimaktivitást a 4. példában leírt vizsgálat ·· · · ···· ···· • · · · · · ······· • ········· · · ···· · · ·· ·

- 60 szerint határoztuk meg. Az eredményeket a 15. ábrán mutatjuk be. Látható, hogy a nátrium-dodecil-szulfát anionos felületaktív anyag mellett mindkét kutináz változat stabilabb, mint a vad típusú Fusarium solani pisi kutináz.

11. példa

Az R17E Fusarium solani pisi kutináz változat mosás közbeni aktivitásának meghatározása

A poliészterből és pamutból készült tesztszöveteket tiszta olívaolajjal szennyeztük be, majd valamennyi tesztszövetet 100 ml-es polisztirén palackban 30 ml mosóoldatban inkubáltuk. A palackokat 40 ’C-os normál főmosás program alkalmazásával vízzel töltött Miele TMT mosógépben kevertük.

A mosóoldat a 9. példában leírt A és B mosóporból literenként 2 grammot tartalmazott (vízkeménység = 27 °FH).

Az eredményeket a 16. ábrán mutatjuk be. A különféle mosási körülmények között az R17E kutináz változat mosás közbeni aktivitásának fokozódása a vad típusú Fusarium solani pisi kutinázéhoz képest nyilvánvaló. Az összehasonlítás érdekében ugyanezen kísérleteket Lipolase™-zal is elvégeztük. Valamennyi esetben az R17E kutináz változat volt a hatásosabb.

Claims (26)

1. Kutináz változat, amely egy kiindulási kutináz változata, s amelyben az aminosav-szekvenciát úgy módosítottuk, hogy az anionos felületaktív anyagokkal való kompatibilitás fokozódjon.

igénypont szerinti kutináz változat, amely esetében az kopatibilitást anionos felületaktív anyagokkal való az anionos felületaktív anyagok enzimhez történő kötődésének csökkentésével fokoztuk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti kutináz változat, amely esetében az anionos felületaktív anyag enzimhez való kötődését az anionos felületaktív anyag és az enzim közötti elektrosztatikus kölcsönhatás mérséklésével csökkentjük.

4. Az 1-3. igénypotok bármelyike szerinti kutináz változat, amely esetében az anionos felületaktív anyag és az enzim közötti elektrosztatikus kölcsönhatást úgy mérsékeljük, hogy az enzim anionos felületaktív anyag apoláris végéhez kötődni képes hidrofób részéhez közel elhelyezkedő egy vagy több pozitív töltésű arginin gyököt lizin gyökökkel helyettesítjük.

5. Az 1-3. igénypotok bármelyike szerinti kutináz változat, amely esetében az anionos felületaktív anyag és az enzim közötti elektrosztatikus kölcsönhatást úgy mérsékeljük. hogy az enzim anionos felületaktív anyag apoláris végéhez kötődni képes hidrofób részéhez közel elhelyezkedő egy vagy több pozitív töltésű arginin gyököt töltés nélküli aminosav-gyökökkel helyettesítjük.

6. Az 1-3. igénypotok bármelyike szerinti kutináz változat, amely esetében az anionos felületaktív anyag és az enzim közötti elektrosztatikus kölcsönhatást úgy mérsékeljük, hogy az enzim anionos felületaktív anyag apoláris végéhez kötődni képes hidrofób részéhez közel elhelyezkedő egy vagy több pozitív töltésű arginin gyököt negatív töltésű aminosav-gyökökkel helyettesítjük.

7. Az 1-3. igénypotok bármelyike szerinti kutináz változat, amely esetében az anionos felületaktív anyag és az enzim egymáshoz való kötődését az enzim anionos felületaktív anyag apoláris végéhez kötődni képes hidrofób részéhez közel elhelyezkedő egy vagy több aminosav-gyök kevésbé hidrofób aminosav-gyökökkel végzett helyettesítésével csökkentjük.

8. A 7. igénypont szerinti kutináz változat, amelyben kevésbé hidrofób aminosav-gyökként glicint, szerint, alanínt, aszparaginsavat vagy treonint alkalmazunk.

9. Az 1-8. igényponok bármelyike szerinti kutináz változat, melyet eukarióta kiindulási kutinázból alakítottunk ki.

···· ····

10. Az 1-9. Igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, melyet olyan kiindulási kutinázból alakítottunk ki, amely a Fusarium solani pisi-bői származó kutináz ellen termelt antitestekkel immunológiailag kereszt-reaktív.

11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, amely nagymértékű homológiát mutat a Fusarium solani pisi-bői, Colletotrichum capsici-ből, Colletotrichum gloesporoides-ből és Magnaporthe grisiea-ből származó kutinázt kódoló 5' és/vagy 3' végével és/vagy a kutinázok konzervált szekvenciáival.

12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, amelyben a módosított gyökök a Fusarium solani pisi kutináz aminosav-szekvenciájának egy vagy több alábbi helyén: 17., 51., 78., 80., 88., 96., 156., 195. és 196., vagy egy másik kutináz szekvenciájának megfelelő helyein helyezkednek el.

13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, amelyben a módosított gyökök a Fusarium solani pisi kutináz 51. és 195. aminosava körül, vagy egy másik kutináz megfelelő aminosavai körül elhelyezkedő hidrofób szakaszban helyezkednek el.

14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, amely a Magnaporthe grisiea kutináz egy változata, s az A80D, A88E és R156L mutációkból egyet vagy többet ···· ··«· tartalmaz.

15. Eljárás az 1-14. igényponyok bármelyike szerinti kutináz változat előállítására, azzal jellemezve, hogy a kutináz változatot kódoló, rDNS-technikával előállított gént tartalmazó, rDNS-technikával módosított mikroorganizmust fermentatív körülmények között tenyésztjük, a mikroorganizmus által termelt kutináz fermentléből történő elválasztásával, vagy a mikroorganizmus sejtek fermentléből történő elkülönítésével, s az elkülönített sejtek feltárásával a kutináz változatból készítményt állítunk elő, oly módon, hogy a kutináz változatot fizikai vagy kémiai bekoncentráló vagy tisztító módszerekkel az említett fermentléből vagy az említett sejtekből bekoncentráljuk vagy részlegesen tisztítjuk.

16. rDNS-technikával módosított mikroorganizmus, azzal Jellemezve, hogy az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változatot kódoló rDNS vektorral transzformáltuk, miáltal képes expresszálni az említett kutináz változatot.

17. A 16. igénypont szerinti, rDNS-technikaval módosított mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy olyan, kutináz változatot kódoló gént hordoz, említett mikroorganizmusba, gazdaszervezetben jelző- vagy funkcionáló (módosított) melyet úgy juttatunk az hogy 5' végét a szekréciós-szekvenciaként pre-szekvenciát kódoló génfragmenshez fúziónáljuk.

···* ···« • · ··

18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti, rDNS-technikával módosított mikroorganizmus, azzal Jellemezve, hogy az említett gazdaszervezet eukarióta, például a Saccharomyces, Kluyveromyces vagy a Hansenula nemzetségbe tartozó élesztő, vagy az Aspergillus nemzetségbe tartozó gomba.

19. A 16-18. igénypontok bármelyike szerinti, rDNS-

technikával módosított mikroorganizmus, amely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változatot kódoló rekombináns DNS vektort hordoz, azzal Jellemezve, hogy az

említett mikroorganizmus auxotróf mutáns, melyet egyik szülői sejtjében az auxotróf markert kódoló gén génátrendezésével hoztunk létre.

20. Polinukleotid, amely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti érett kutináz változatot kódoló bázis-szekvenciával vagy funkcionális megfelelőjével vagy mutánsával rendelkezik, s amelyben az utolsó transziáit kodont egy stop kodon követi, s az érett enzimet kódoló nukleotidszekvenciától közvetlenül upstream irányban tetszés szerint a kutináz pre-szekvenciáját kódoló nukleotid-szekvenciával rendelkezik.

21. Polinukleotid, amely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti érett kutináz változatot kódoló bázis-szekvenciával rendelkezik, s amelyben az utolsó transziáit kodont egy stop kodon követi, s az érett enzimet kódoló nukleotidszekvenciától közvetlenül upstream irányban tetszés szerint ···· ···*· • · « · · · ··«·'· · · • ·····«··· « · ·«·· · · ·· ·

- 66 a megfelelő pre-szekvencia legalább egy részét, és/vagy a kiválasztott gazdaszervezet számára megfelelő Jelző- vagy szekréciós-szekvenciát kódoló nukleotid-szekvenciával rendelkezik.

22. Polinukleotid, amely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti érett kutináz változatot kódoló bázis-szekvenciával vagy funkcionális megfelelőjével vagy mutánsával rendelkezik, s amelyben az eredeti organizmusból származó, kutináz változatot kódoló nukleotid-szekvenciát úgy módosítottuk, hogy legalább egy, de előnyösen annyi kodon, amennyi lehetséges, néma mutáció tárgyát képezze, hogy az eredetiekkel egyenértékű aminosavakat kódoló, és a 17-20. igénypontok valamelyike szerinti új gazdaszervezet számára előnyös kodonok alakuljanak ki, miáltal az említett gazdaszervezetek sejtjeiben a bevitt, fokozott stabilitású gének számára alkalmas messenger-RNS-t áll rendelkezésre.

23. A 20-22. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid, melyben a pro- vagy az érett kutináz változatot kódoló nukleotid-szekvenciától upstream irányban a 16-19. igénypontok bármelyike szerinti gazdaszervezet számára megfelelő Jelző- vagy szekréciós Jelet kódoló nukleotid-szekvencia helyezkedik el.

24. Rekombináns vektor, amely képes egy kutináz változatot kódoló nukleotid-szekvencia expressziójának irányítására, s amely az alábbi komponensekből áll:

• · · · · 4· » *44* 14«· « «4

44·· · » ···

a) érett kutináz változatot, prekutinázt vagy megfelelő prekutinázt kódoló kétszálú (ds; double-stranded) DNS, amelyben a i pre-szekvencia legalább egy részét egy, a kiválasztott gazdasejt számára előnyös szekréciós Jeltől közvetlenül downstream irányban eltávolítóttűk, azzal a feltétellel, hogy amennyiben a gén transzlálódó része nem az

ATG kodonnal kezdődik, a szekvencia elejére ATG kodont kell helyezni, továbbá, hogy a gén transzlálódó részének minden esetben megfelelő stop kodonnal végződik, vagy ilyen kodont kell hozzáadni;

b) a kutináz változatot kódoló kétszálú DNS [(a) komponens] + szálától upstream irányban elhelyezkedő, a kiválasztott gazda számára megfelelő expressziós regulon;

c) a kutinázt kódoló kétszálú DNS [(a) komponens] +“ szálától downstream irányban elhelyezkedő, a kiválasztott gazda számára megfelelő terminátor szekvencia;

dl) a kétszálú DNS kiválasztott gazda genomjába való integrációját elősegítő nukleotid-szekvenciák; vagy d2) a kiválasztott gazda számára megfelelő replikációs kezdőhely;

el) tetszés szerint (auxotróf) szelekciós marker;

e2) tetszés szerint, a kiválasztott gazdában a kutináz prekurzor alakjának érésében és/vagy szekréciójában szerepet Játszó proteineket kódoló kétszálú DNS szekvencia.

25. A 24. igénypont szerinti rekombináns DNS vektor, amely a korábban meghatározott polinukleotidtól upstream és/vagy downstream irányban a kutináz hatékony ν· · · “··· ·«·· • · « » · · • · · · · « · • ···· ···· · · · ···· · * ·· · expressziódát elősegítő további szekvenciákat tartalmaz.

26. A 24. vagy 25. igénypont szerinti rekombináns DNS vektor, amely egy auxotróf markert kódoló régióból és egy hibás promoter régióból álló auxotróf markert hordoz.

27. Enzimatikus detergens hogy az 1-14. igénypontok változatot tartalmaz.