HUT71325A - Modified cutinases, dna, vector and host - Google Patents

Description

KIVONAT

A találmány tárgya tökéletesített lipolitikus aktivitással rendelkező kutináz változatok, melyek aminosav-szekvenciáját úgy módosították, hogy az enzim felületi hidrofóbitása fokozódjon. A találmányban elsősorban a Fusarium solani pisi kutináz változatait írják le.

81698-2227-GI

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY • ·

Képviselő:

DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

MÓDOSÍTOTT KUTIZÁNOK, DNS, VEKTOR ÉS GAZDASZERVEZET

UNILEVERN.V., Rotterdam, Hollandia

Feltalálók:

EGMOND Maarten Róbert, Utrecht

VAN DÉR HIJDEN Hendrikus Theodorus W.M., Capelle a/d Ijssel

MUSTERS Wouter, Maasluis

PETERS Hans, Rotterdam

VERRIPS Comelis Theodorus, Maassluis

DE VLIEG Jákob, Maassluis HOLLANDIA

A bejelentés napja: 1993. 12. 09.

Elsőbbsége: 1992.12.18. (92204025.8) NL

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP93/03550

A nemzetközi közzététel száma: WO94/14963

81698-2227D-GI/gcs

•’Ι e1 e r ι tálá1mány lipolitikus enzimek tárgykörére vonatkozik. Közelebbről, a találmány tárgya rekombináns DNStechnikákkal módosított lipolitikus enzimek, ezek előállítási eljárásai, valamint alkalmazásuk, különösen enzimatikus detergens készítményekben.

A lipolitikus enzimek a triglicerideket szabad zsírsavakká és digliceridekké, monogliceridekké, és esetenként glikollá hidrolizálni képes enzimek. Komplexebb felépítésű észtereket is képesek hasítani, mint például a növények kútin rétegét, illetve a bőrön lévő faggyút. A lipolitikus enzimeket az iparban különböző enzimatikus eljárásokhoz alkalmazzák, mint például trigliceridek inter- és transz-észteresítéséhez és észeterek szintéziséhez. Az enzimeket detergens készítményekben is alkalmazzák, azzal a céllal, hogy javítsák a detergens zsireltávolító tulajdonságait.

A legszélesebb körben alkalmazott lipolitikus enzimek a lipázok (EC. 3.1.1.3). Például, az EP-A-258 068 és EP-A-305 216 számú európai szabadalmi bejelentésben (mindkettő Novo Nordisk) gomba lipázok rDNS technikákkal más mikroorganizmus gazdákban történő előállítását írják le, különösen a Ther-momyces lanuginosus/Hwnicola lanuginosa-b>ól származó lipázét. Az EP-A-331 376 számú európai szabadalmi bejelentésben (Amano) lipázokat. rDNS technikákkal való előállításukat, valamint alkalmazásukat írják le, köztük a Pseudomonas cepacia-ból származó lipáz egy aminosavszekvenciáját. Rekombináns DNS technikával előállított lipázok további példáit a WO-A-89/09263 és EP-A-218 272 számú szabadalmi bejelentésben (mindkettő Gist-Brocades) írják le. A lipázokkal és módosításaikkal foglalkozó publikációk nagy száma ellenére eddig csak a Humicola lanuginosa-dól származó lipázt alkalmazták széleskörűen (Lipolase™ márkanéven), mint detergens termékek adalékát.

A lipázok fő jellemzője, hogy határfelületi aktiválást

mutatnak. Ez	azt jelenti, hogy az enzimaktivitás sokkal
nagyobb a	határfelületeket vagy micellákat képező
szubsztráton,	mint a teljesen oldott szubsztráton. A
határfelületi	aktiválás a lipolitikus aktivitás olyan

esetekben tapasztalható hirtelen fokozódásában nyilvánul meg, amikor a szubsztrát-koncentrációt a szubsztrát kritikus micella koncentrációja (CMC) fölé emeljük, és határfelületek alakulnak ki. Ez a jelenség kísérletesen az enzimaktivitás szubsztrát-koncentráció függvényében készített görbe megszakadásaként figyelhető meg.

lipázok esetében a határfelületi aktiválást a lipázmolekula protein struktúráj ának konformációváltozásaként értelmezik.

Szabad, kötetlen állapotban a helikális fedél (lid) betakarja a katalitikus kötőhelyet, a lipid szubsztráthoz való kötődés hatására azonban a fedél elmozdul, és a katalitikus hely szabaddá válik. A helikális fedélről úgy tartják, hogy szintén kölcsönhatásba lép a lipid felületével, lehetővé téve ezáltal, hogy az enzim a határfelületen kötött állapotban maradjon.

« · · «·« ·

A W0-A-92/05249 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Novo Nordisk) genetikailag módosított lipázokat írnak le, különösen a Humicola lanuginosa-ból származó lipázt, melyet a lipid érintkezési zónáján módosítottak. A bejelentésben a lipid érintkezési zónát úgy definiálják, mint az a felület, melyet aktív formában a helikális fedél borít be. A módosítások a lipid érintkezési zóna egy vagy több aminosavgyökének delécióját vagy szubsztitúcióját foglalják magukban, melyekkel fokozható a lipid érintkezési zóna elektrosztatikus töltése és/vagy csökkenthető annak hidrofóbitása. Ez a lipid érintkezési zóna egy vagy több negatív töltésű aminosav-gyökének deléciójával, vagy ezen gyökök semleges vagy pozitívabb töltésű aminosavakkal történő helyettesítésével, és/vagy a lipid érintkezési zónában egy vagy több semleges aminosav-gyök pozitív töltésű aminosavakkal való helyettesítésével, és/vagy a lipid érintkezési zónában egy vagy több hidrofil aminosav-gyök deléciójával vagy ezen gyökök hidrofób aminosavakkal történő helyettesítésével valósítható meg.

A kutinázok a viasz észter enzimek (EC 3.1.1.50) alosztályát képviselik, melyek képesek a kutin (észteresedett hosszú láncú zsírsavak és zsíralkoholok hálózata) lebontására. A kutin a növényekben a levelek és hajtások védőbevonataként található. A kutinázok ezenfelül lipolitikus aktivitással is rendelkeznek, vagyis képesek a trigliceridek hidrolízisére, s e tulajdonságuk alapján speciális lipázokként is besorolhatók. A kutinázok azonban — a lipázokkal • · ···· ·· · · ·· • · ···· · ♦ • · · · · · · ellentétben — nem mutatnak semmiféle jelentős határfelületi aktiválást.

A kutinázok számos forrásból, úgymint növényekből (pl. pollenből), baktériumokból és gombákból nyerhetők. Zsírbontó tulajdonságaik miatt a kutinázokat enzimatikus detergens

készítmények	alkotóelemeiként javasolták alkalmazásra.
Például, a	W0-A-88/09367 számú nemzetközi szabadalmi

bejelentésben (Genencor) hatékony tisztító készítmények létrehozásához egy felületaktív anyag és egy lényegében tiszta bakterilális kutináz enzim kombinációját javasolták. Pseudomonas putida (ATCC 53552) Gram-negatív baktériumból nyert kutinázt tartalmazó detergens készítményt bocsátottak közre. A későbbi EP-A-476 915 számú európai szabadalmi bejelentésben (Clorox) azonban azt írják, hogy ugyanaz az enzim (melyet lipázként említenek) hagyományos módszerek alkalmazásával kevésbé hatékony a szövetek olajos szennyeződéseinek eltávolításában, mint az egyéb lipázok.

Az utóbbi időben meghatározták egy Fusarium solani pisi-bői származó kutináz háromdimenziós szerkezetét (Martinez és mtsi. Natúré, 356. 615-618, 1992). Azt találták, hogy ez a kutináz nem rendelkezik a katalitikus kötőhelyeket beborító helikális fedéllel. Ehelyett, úgy tűnik, a szerin gyökből álló aktív hely hozzáférhető az oldószer számára. E felfedezések a lipázoknál a határfelületi aktiválás mechanizmusáról alkotott Jelenlegi elképzelést látszanak megerősíteni.

• · · · • · • · ··

A Pusar-i um solani és szekvenálták pisi-böl származó kutináz gént klónozták (Ettinger és mtsi, Biochemistry, 2t>,

7883-7892,

1987).

A WO-A-90/09446 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Plánt

Génétics Systems) e gén klónozását és termelését írják le E. coli-ban. A kutináz vizes és nemvizes közegben, a kutináz és a szubsztrát közötti határfelület hiányában hatásosan képes katalizálni az és jelenlétében egyaránt észterek hidrolízisét és szintézisét. Általános stabilitásuk alapján felvetették, hogy ezek a kutinázok alkalmazhatók lénnének tisztítószerek (mint pl. mosodai detergensek) és egyéb speciális zsíroldó készítmények (mint pl. kozmetikai készítmények és samponok) előállításában. Nem írták le sem az enzim gazdaságosan kivitelezhető előállítási eljárását, sem a kutinázt tartalmazó specifikus enzimatikus detergens készítményt.

A fő jellemvonás, vagyis a határfelületi aktiválás hiánya miatt e találmány tárgyaként a kutinázokat, mint lényegében semmilyen határfelületi aktiválást nem mutató lipolitikus enzimeket jelöljük ki.

klasszikus lipázoktól,

A kutinázok ezáltal különböznek a abban az értelemben, hogy nem rendelkeznek a katalitikus kötőhelyet betakaró helikális fedéllel.

Amint fentebb említettük, csak a Humicola lanuginosa-ból származó lipázt alkalmazzák széleskörűen (Lipolase™ márkanéven), mint detergens termékek adalékát. A Lipolase™-t leíró cikkben (Chemistry and Industry, 183-186.

• · ···· ·· · · ·· old.. 1990) Henrik Malmos megjegyzi: ismert, hogy általában a lipázok aktivitása a mosás során alacsony, és ez alól a Lipolase sem kivétel. A szárítás során, amikor a szövet víztartalma csökken, az enzim visszanyeri aktivitását, és a zsíros szennyeződések hidrolizálódnak. A következő mosási ciklus során a hidrolizált anyag eltávozik a szövetből. Ez magyarázatot ad arra is, hogy a lipázok hatása miért alacsony az első mosási ciklus után, s miért lényegesen nagyobb a következő ciklust követően. Ilyenformán, továbbra is szükség van olyan lipolitikus enzimekre, amelyek jelentős aktivitást mutatnak a mosási művelet közben.

Azt találtuk, hogy a kutinázok, különösen a Fusarium solani

pisi-bői	származó, mosás közbeni aktivitást mutatnak,
azonban	továbbra is szükség van tökéletesített mosás
közbeni	lipolitikus aktivitással rendelkező kutinázokra,

valamint az ilyen enzimek előállítási eljárására.

A találmány tárgya olyan kutinázok, melyeket teljesítményük, elsősorban mosás közbeni lipolitikus aktivitásuk javítása érdekében módosítottunk.

Meglepő módon azt találtuk. hogy az eukarióta kutináz enzimek, közelebbről a Fusarium solani pisi-bői, a Colletotrichum capsici-ből, a Colletotrichum gloesporiodesből és a Magnaporthe grisea-ból származó kutinázok, az aminosav szekvencia oly módon történő módosításával tökéletesíthetők, miáltal az enzim felületi hidrofóbitása • « · · · ♦ · ··«· «· ««·· «· ···· növekszi k.

A találmány tárgya egy eredeti kutináz enzim olyan változata, melyet úgy módosítottunk, hogy az enzim felületi hidrofóbitása fokozódjon. Az enzim felületi hidrofóbitását előnyösen úgy fokozzuk, hogy növelt lipid érintkezési zónát hozzunk létre.

A találmány kutináz enzimek változataira vonatkozik. Amint fentebb említettük, a kutinázok számos forrásból, úgymint, növényekből (pl. pollenből), baktériumokból vagy gombákból nyerhetők. A találmányban a rekombináns DNS-technikákkal végzett módosításhoz eredeti kutinázként vagy kiindulási anyagként eukarióta kutinázokat alkalmazunk. Az eukarióta kutinázok szintén különféle forrásokból, úgymint növényekből (pl. pollenből) és gombákból nyerhetők.

Az (eukarióta) gomba kutinázok csoportja két családból áll, melyek különböző, levél-, illetve hajtás-specifitással rendelkeznek. A levél-specifikus kutinázok működéséhez a savas vagy semleges pH, míg a hajtás-specifikus kutinázok működéséhez lúgos pH optimális. A lúgos pH-optimummal rendelkező kutinázok lúgos összetételű detergens készítményekben (mint pl. nagyteljesítményű mosóporokban vagy folyadékokban) jobban alkalmazhatók. A savas vagy semleges pH-optimummal rendelkező kutinázok inkább a kisebb teljesítményű termékek vagy alkalmasak, de alkalmazhatók ipari tisztítószerekben is.

Az 1. táblázatban négy különböző, hajtás-specifikus kutinázt mutatunk be, pH-optimumaikkal együtt.

I. TÁBLÁZAT

Hajtás-specifikus kutinázok	pH-optimum
Fusarium solani pisi	9
Fusarium roseum culmorum	10
Rhizoctonia solani	8,5
Alternaria brassicicola (PNB-áz I)	9

A találmányban különösen előnyben részesítettek a vad típusú Fusarium solani pisi-tői származtatható kutinázok (Ettinger, W.F., Thukral, S.K. és Kolattukudy, P.E.: Structure of cutinasé gene, cDNS, and the derived amino acid sequence from phytopathogenic fungi, Biochemistry, 25, 7883-7892, 1987). Bizonyos detergens készítményekben alkalmazva ez a kutináz szabályos mosás közbeni hatásokat mutat.

A találmányban a rekombináns DNS-technikákkal végzett módosításhoz kiindulási kutinázként szintén alkalmasak azok a kutinázok, amelyek a Fusarium solani pisi-tői származó kutinázzal nagy aminosav homológiával rendelkeznek. Ezek példái a Colletotrichum capsici-bői, a Colletotrichum gloesporiodes-től és a Magnaporthe grisea-től származó kutinázok. A 12. ábrán e kutinázok részleges aminosav

- 1.U szekvenciáit mutatjuk be. s látható a köztük mutatkozó nagyfokú homológia.

A Fusarium solani pisi kutináz tökéletesítésének alternatív módja génjének módosítását foglalja magában. Más eukariota szervezetek kutinázát kódoló genetikai információ Fusarium solani pisi, Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloesporiodes és Magnaport.he grisea (pro)kutinázt kódoló cDNS-éből származó 5'- és 3'-DNS próbák, valamint más lipolitikus enzimekben konzervált szekvenciákat felismerő próbák alkalmazásával izolálható. Ezek a próbák, szükség esetén, a kutinázt termelő eukarióta sejtek messenger RNS-

éből származó	cDNS-ek polimeráz láncreakció (PCR) (ld. pl.
W0-A-92/05249)	alkalmazásával végzett sokszorosításához
alkalmazhatók.	Miután az így kapott, kutinázokat kódoló

géneket standard eljárások szerint E. coli-ban klónozzuk és

expresszáljuk,

a kutinázokat megfelelő körülmények között

zsíros szennyeződéseket eltávolító képességükre teszteljük.

Ezzel a módszerrel a fentebb említett kutinázok számos természetes előfordulású változatát nyerhetjük, melyek Javított mosás közbeni teljesítménnyel rendelkeznek. Sőt, a természetes előfordulású kutinázok szekvenciái kiváló alapot nyújtanak a Fusarium solani pisi kutináz további protein-technológiai kezeléséhez.

mosás közbeni lipolitikus enzimek aktivitását meghatározó faktorokról született új elképzelések, és a

Fusarium solani pisi kutináz háromdimenziós (3D)

WWW· szerkezetének alapos vizsgálata alapjan számos lehetőséget találtunk, melyekkel e kutinázok (és általában a kutinázok) teljesítménye rekombináns DNS-technikák segítségével fokozható.

Mivel a kutinázok alapvetően különböznek a lipázoktól (mint a Lipolase™), a kutináz és a szubsztrát (lipid határfelület) közötti kölcsönhatás alapelve különbözik a fedél kinyílását és a szubsztráthoz kötődni képes hidrofób terület szabaddá válását magában foglaló elvtől (Brzozowski és mtsi, Natúré, 351, 494-494, 1991).

A találmányban leírjuk, hogy a kutinázok a szubsztráttal való interakció fokozásához anélkül módosíthatók, hogy a módosított kutináz felületén a kutináz molekulák aggregációját eredményező nagyságú hidrofób terület alakulna ki . A hidrofób felület hidrofób aminosavak (mint az alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, triptofán, tirozin és metionin, illetve kisebb mértékben a glutaminsav, glutamin és hisztidin, feltéve, hogy ez utóbbiak hidrofób oldalláncai nincsenek beépülve a kutináz hidrofób magjába) bevitelével növelhető. A metionint normális esetben nem tartjuk hidrofób aminosavnak; bizonyos helyzetekben beépülve azonban hatékonyan hozzájárulhat a kutináz molekula fokozott felületi hidrofóbitásához.

Néhány esetben előnyös volt a hidrofób aminosavak mellé töltéssel rendelkező aminosavakat is beépíteni, hogy · · ··· ♦ · · * » u··· ·« ·»·· ·» «*·

- 12 elkerüljük az enzim aggregalódását. Meglepő módon, azt találtuk, hogy a pozitív töltésű aminosavak (mint a lizin és arginin) a kutináz molekula bizonyos helyein beépülve szintén fokozhatják a hidrofób felület nagyságát. Ez a kutináz molekula azon helyeire korlátozódik, ahol a lizin és az arginin metiléncsoportja nem tud a molekula belsejébe épülni. A lizin és arginin alkalmazásának előnye az, hogy az amino- és ímidocsoportok fokozzák annak valószínűségét, hogy a metiléncsoportok szabadon álljanak, s ezáltal képesek legyenek kölcsönhatásba lépni a lipid fázissal.

A lizint és	arginint normális esetben nem tartják hidrofób
aminosavnak,	azonban e gyökök oldalláncai (a metilén-
csoportokban)	sok hidrofób atomot tartalmaznak, melyek
kölcsöhatásba	léphetnek a lipid fázissal. A lizin-gyök

hidrofób részének mérete valójában hasonló a valin-gyökéhez.

Ha a pozitív töltés bevitele negatívan befolyásolja a kutináz egyéb belső tulajdonságait, ez kiegyenlítő hatású negatív töltés bevitelével, vagy a kutináz molekula azon részében (vagy annak közelében), amely kölcsönhatásba lép a lipid fázissal, pozitív töltés elvételével kompenzálható.

A Fusariwn solani pisi kutináz aktív helye körüli felület hidrofóbitásának vizsgálata azt mutatja, hogy a hidrofóbitás nem optimális. Ennek tökéletesítéséhez e terület bizonyos aminosavait. terjedelmesebb hidrofób gyökökkel kell helyettesíteni.

• · • ·

- 13 A lipolitikus enzimek szerkezete és működése közötti összefüggés Jobb megértése érdekében behatóan tanulmányoztuk számos ilyen enzim háromdimenziós (3D) szerkezetét. Olyan struktúrák esetében, melyeket korábban nem írtak le, a szerkezetet molekuláris modellezéssel származtattuk.

A Rhizomucor miehei lipáz háromdimenziós szerkezetét röntgen-krisztallográfiával határozták meg (Brady és rntsi. Natúré, 343. 767-770, 1990; Brzozowski és mtsi, Natúré, 351, 491-494, 1991; Derewenda és mtsi, Biochemistry, 31, 1532-1541, 1992). A 144-es szerinnél található aktív hely, amely Ser-His-Asp proteáz-szerű katalitikus triádhoz tartozik, egy rövid helikális fedél (85-91. gyök) alatt helyezkedik el. Azt a szerkezetet, melyben a szerin aktív hely beépített formában helyezkedik el, az alábbiakban az enzim zárt konformációjaként említjük. Ogy tartjuk, hogy az olaj-víz határfelületnél bekövetkező adszorpció a helikális fedél elmozdulásával kapcsolatos. Az elmozdulás eredményeként a szerin aktív hely szabaddá válik, és az aktív hely körüli hidrofób terület növekszik. Ögy véljük, hogy a nyitott konformáció az olaj-víz határfelületen adszorbeált aktivált enzimnek felel meg.

A Rhizomucor miehei gomba lipáz zárt konformációjának alfa szénatom koordinátáit Brookhaven-ben a Protein Data Bank-nál helyeztük letétbe. A Rhizomucor miehei lipáz teljes protein koordinátáinak (vázgerinc és oldalláncok) kialakításához bonyolult számítási módszereket alkalmaztunk. A Rhizomucor

L4 miehei lipaz nyers kiindulási modelljét S. Wodak és mtsi által leirt számítási módszerek (Protein Engineering, 2,

335-345, 1989) alkalmazásával készítettük. E módszert a

SYBYL molekuláris modellező software csomag (TRIPOS

Associates,

Inc. ,

St.

Louis, Missouri) segítségével valósítjuk meg. A modellt később a BIOSYM molekuláris modellező software csomag (BIOSYM, San

Diego, CA) alkalmazásával megvalósított energia minimalizálási (EM) és molekuláris dinamikai (MD) technikák alkalmazásával finomítottuk. A modell EM és MD finomítása során tapasztalati megközelítést alkalmaztunk. A modellt egyúttal a potenciális energia-függvény és az ismert szerkezeti feltételek energiaszintjeihez igazítottuk. A modell minőségét olyan ismérvek alapján értékeltük, mint a hidrogénkötések száma és minősége, a másodlagos szerkezeti elemeket illetően a hidrogénkötések mintázata, a peptid egységek orientációja, a főláncok lapszögeinek értéke, az aromás csoportok érintkezési szöge és a rések mérete. A modellt a fentieken kívül a nem megfelelően fedett töltésekre, a túlzottan szabad hidrofób gyökökre, és az energetikailag nem kedvező elhelyezkedésű diszulfid hidakra is ellenőriztük. Az idevaló oldallánc-rotamereket a Ponder &

Richards rotamer könyvtárból választottuk ki (Ponder és mtsi, J. Mól. Bioi., 193. 775-791, 1987). E könyvtárból egy adott oldallánc-rotamer végső kiválasztása a fentebb említett feltételek értékelésén alapul. Az oldallánc atomok megfelelő helyzetbe rendezéséhez MS technikát alkalmaztunk. A modell szerkezetét alaposan vizsgáltuk, hogy megfelel-e az ismert szerkezeti Jellemzőknek, s a szerkezeti tulajdonságok optimálissá tételéhez EM és MD számításokat alkalmaztunk, miáltal lehetővé vált a Rhizomucor miehei lipáz megbízható, teljes atommodelljének kialakítása. Rhizomucor miehei lipáz nyitott konformációját MD számítógépes szimulálással kaptuk, melynek során a lipáz aktív helyére egy Cio-trigliceridet kapcsoltunk. A nyitott szerkezet leírt konformációs Jellemzőivel (Derewenda és mtsi, Biochemistry,

31. 1532-1541, 1992) végzett alapos összehasonlítás azt mutatta, hogy a nyitott konformáció fenti módon kapott számítógépes modellje lényegében azonos.

A Rhizomucor miehei gomba lipáz ismert háromdimenziós szerkezetéből kiindulva a Humicola langinosa lipáz nyitott és zárt háromdimenziós szerkezetét elméleti alapú összehasonlító modellező technikákkal kaptuk, melyeket a

SYBYL molekuláris modellező software csomag COMPOSER moduljával (TRIPOS associates.

Inc., St. Louis, Missouri) valósítottunk meg.

A Humicola langinosa lipáz így kapott modelljét a fentebb említett számítási módszerekkel finomítottuk.

A lipáz molekula azon részét, amely szerepet játszik a szubsztrát enzimen való adszorpciójában, a Rhizomucor miehei gomba lipáz és a Humicola langinosa lipáz háromdimenziós szerkezetének összehasonlításával azonosítottuk.

A Fusarium solani pisi kutináz ismert háromdimenziós • · « · * · · szerkezetéből kiindulva a Col 1etotrichum gloesporoides háromdimenziós szerkezetét elméleti alapú összehasonlító modellező technikák alkalmazásával kaptuk, melyeket a SYBYL molekuláris modellező software csomag COMPOSER moduljával (TRIPOS associates, Inc., St. Louis. Missouri) valósítottunk meg. A Colletotrichum gloesporoides így kapott modelljét a fentebb említett számítási módszerekkel finomítottuk.

A II. táblázatban felsorolt lipolitikus enzimek háromdimenziós szerkezetéből váratlan módon arra a megfigyelésre jutottunk, hogy meghatározható egy bizonyos vektor, amely a Fusarium solani pisi kutináz 116-120. gyökei alfa szénatomjaihoz a legkisebb négyzet illeszkedést mutatja. Ez a vektor lényegében merőleges arra a felületre, melyen a szubsztráttal való interakció lejátszódik.

Az alábbi II. táblázatból látható. hogy különböző forrásokból származó több lipolitikus enzim primer szekvenciáját összehasonlítva a Fusarium solani pisi kutináz 116-120. aminosav-gyökei nagyfokú funkcionális homológiával rendelkező területen helyezkednek el. Az egymás alá rendezett összehasonlítás (allignment) a lipolitikus enzimek esetében a Gly-(His/Tyr)-Ser-X-Gly konszenzus szekvenciához igazítva végezhető.

II. TÁBLÁZAT

Humicola langinosa lipáz

Mucor miehei lipáz humán hasnyálmirigy lipáz

Fusarium 3.p. kutináz

C. gloesporoides kutináz

YRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGY YKVAVIGHSLGGATALLCALGLYQREE SNVHVIGHSLGAHAAGEAGRRTNGTIG ATLIAGGYSQGAALAAASIEDLDSAIR AAIVSGGYSQGTAVMAGSISGLSTTIK

A fentiek értelmében a kutináz molekula azon részének meghatározásához, melyben a tökéletesített mosás közbeni aktivitással rendelkező kutináz kialakítása érdekében aminosav módosítást végezhetünk, a Fusarium solani pisi kutináz 116-120. aminosav-gyökeinél az említett vektort alkalmaztuk. Az alábbi III. táblázatban a II. táblázatban bemutatott lipolitikus enzimek szomszédos aminosavai láthatók.

III. TÁBLÁZAT szál szál helix akt.hely

H. lanuglnosa	lip.	138-141	142	Ser*146	147-159	his258
Mucor miehei	lip.	136-139	(ill.:	140-Ser*144)	145-157	his257
humán hasny.	lip.	144-147	(ill.:	148-Ser*152)	153-165	his263
F.s. pisi kutináz	112-115	(ill.:	116-Ser*120)	121-133	hisl88
C. gloesp. kutináz	112-115	(ill.:	116-Ser*120)	121-133	hisl88

ill.

illeszkedés; Ser* = szerin aktív hely • ·

A találmány egyik tárgya tökéletesített mosás közbeni lipolitikus aktivitással rendelkező módosított kutináz enzim, amelyben az aminosav-szekvenciát úgy módosítjuk, hogy az enzim felületének hidrofóbitása növekedjen. Az enzim lipid érintkezési zónával szomszédos felületén a hidrofóbitást előnyösen úgy növeljük, hogy megnövekedett lipid érintkezési zónát alakítsunk ki.

A kutináz felületi hidrofóbitása úgy fokozható, hogy egy vagy több aminosav-gyököt alaninnal, valinnal, leucinnal, izoleucinnal, prolinnal, fenilalaninnal, triptofánnal, tirozinnal, metioninnal, glutaminsawal, glutaminnal vagy hisztidinnel helyettesítünk. A helyettesítést előnyösen valinnal, leucinnal, izoleucinnal, fenilalainnal, triptofánnal vagy metioninnal végezzük.

Előnyösnek találtuk az aminosav-szekvenciát úgy módosítani, hogy egy vagy több lizin vagy arginin gyök bevitelével (a felületi hidrofóbitás fokozódása mellett) egy vagy több pozitív töltés is beépüljön.

A módosított gyökök előnyösen a molekula azon részében helyezkednek el, amelyet a Fusarium solani pisi kutináz 116-120. aminosav-gyökeinek alfa szénatomjaihoz (vagy egy másik kutináz megfelelő alfa szénatomjaihoz) a legkisebb négyzet illeszkedést mutató vektor, és az erre a vektorra merőleges, a 117. gyök alfa szénatomját (vagy egy másik kutináz megfelelő alfa szénatomját) tartalmazó sik határoz • ·

-tömeg.

Amint fentebb említettük, a Fusariwn solani písf-ből származó kutináz háromdimenziós szerkezetét korábban leírták. E kutináz esetében világos, hogy mely módosítások eredményezik a találmány tárgyát képező módosításokat. Abban az esetben, ha egy adott kutináz háromdimenziós szerkezete még nem ismert, az aminosav-szekvencia ismert szekvenciával való összehasonlításával (allignment) (ld. 12. ábra) (melyet a lipolitikus enzimek esetében a Gly-(His/Tyr)-Ser-X-Gly konszenzus szekvenciához igazítva végzünk) lehetővé válik a találmány tárgyába tartozó módosítások megvalósítása. Ennek során előnyösen molekuláris modellező technikákat is alkalmazunk.

A találmány szerint előállított kutináz változatok detergens vagy tisztító készítmények alkotórészeként alkalmazva az enzimaktivitás terén előnyöket biztosítanak. Azt találtuk, hogy egy mosási folyamat fő ciklusa során tökéletesített mosás ' közbeni teljesítménnyel rendelkeznek. A mosási folyamat fő ciklusa során tökéletesített mosás közbeni teljesítményen azt értjük, hogy az enzimet tartalmazó detergens készítmény egy európai típusú automata mosógépben, átlagos mosási feltételek (koncentráció, vízkeménység, hőmérséklet) mellett egyszeri mosással képes eltávolítani egy szennyezett szövet olajos szennyeződéseinek jelentőe hányadát. Tudni kell, hogy a hagyományos, kereskedelemben beszerezhető Lipolase™ (Novo Nordisk) lipolitikus enzim az

olajos szennyeződésekre nem gyakorol jelentős mosás közbeni hatást.

Egy enzim olajos szennyeződésre gyakorolt mosás közbeni hatását az alábbi vizsgálattal értékelhetjük. 10 %-nál kevesebb pamutot tartalmazó új poliészter szöveteket enzimmentes detergens készítménnyel (mint az alább megadott) előmosunk, majd alaposan kiöblítünk. Ezeket a tiszta szöveteket ezután olívaolajjal vagy más alkalmas, hidrolizálható olajjal szennyezzük. Valamennyi vizsgálati szövetet, melyek tömege átlagosan 1 g, 100 ml-es poliszitrén palackban 30 ml mósóoldatban áztatjuk. A mosóoldat az alábbi detergens készítményt 1 g/liter koncentrációban tartalmazza. A palackokat 30 percig vízzel töltött Miele TMT mosógépben, normál 30 °C-os főmosás programmal keverjük. A kutináz változatot 3 LU/ml koncentrációban adjuk a mosóoldathoz. A kontroll nem tartalmaz enzimet. A mosópor összetétele (m/m %-ban):

Etoxilált alkohol, nemionos felületaktív anyag9,5

Nátrium-szulfát38,6

Nátrium-karbonát40,4

Nátrium-szilikát (Na20:Si20 = 2,4)7,3

Víz4,2

Nem ionos felületaktív anyagként 12-15 szénatomos, etoxilált alkoholt (10.5-13 EO) alkalmaztunk, de a nem ionos, etoxilált alkohol minősége széles határok között változtatható.

·· ···· · · · · • ♦ ···· « · ·.:· .·

- 21 Mosás után a szöveteket hideg vízzel alaposan kiöblítjük, centrifugában hideg levegővel szárítjuk, majd meghatározzuk a visszamaradt zsír mennyiségét. Ez többféle módon végezhető. A hagyományos eljárás szerint a tesztszövetet Soxhlet extraháló készülékben petroléterrel extraháljuk, az oldószert ledesztilláljuk, és a szöveten a kezdeti zsírmennyiség hányadaként (méréssel) meghatározzuk a maradék zsíros anyag százalékos mennyiségét.

Egy második, érzékenyebb eljárás szerint a tesztszövetek beszennyezéséhez brómozott olívaolajat alkalmazunk (Richards, S., Morris, M.A. és Arklay, T.H., Textilé Research Journal, SS, 105-107, 1968). Ezután valamennyi tesztszövetet 100 ml-es polisztirén palackban 30 ml mosóoldatban inkubáljuk. A palackokat vízzel töltött mosógépben normál 30 °C-os főmosás programmal keverjük. A főmosás után a tesztszöveteket hideg vízben 5 másodperc alatt óvatosan kiöblítjük. Közvetlenül az öblítés után az anyagokat hideg levegővel szárítjuk. Szárítás után a maradék zsír mennyisége a szövet brómtartalmának röntgensugárzásos fluoreszcencia spektrometriával végzett mérésével határozható meg. Az eltávolított zsír mennyisége a tesztszöveten kezdetben jelenlevő mennyiség százalékaként határozható meg, az alábbiak szerint:

brómme - brómmu %-os szennyeződés eltávolítás - --------------- x 100 brómm.

• · ahol a brómme a tesztszöveten a bróm mosás előtt jelenlevő százalékos mennyiségét, a brómmu pedig a mosás után jelenlevő mennyiségét jelenti.

Az enzimatikus aktivitás értékelésének további módja a visszaverődési együttható 460 nm-nél, standard eljárásokkal végzett mérése.

A találmány leírásában a módosított, mutált vagy mutáns enzim vagy enzim változat olyan enzimet jelent, amelyet mutáns gént expresszáló mutáns organizmus termel. A mutáns gén (amely nemcsak néma mutációkat tartalmazó gén) olyan gént jelent, amely közvetlenül vagy közvetve a megfelelő kiindulási enzim szekvenciájából származó, s attól egy vagy több helyen eltérő aminosav-szekvenciával rendelkező enzimet kódol. Az eredeti enzim a megfelelő, változtatás nélküli gén géntermékét jelenti. Egy gén néma mutációja a gén polinukleotid-szekvenciájában keletkezett változás vagy különbség, amely (a genetikai kód degeneráltságának köszönhetően) a gén által kódolt enzim aminosavszekvenc iájában nem okoz változást.

A mutáns vagy mutált mikroorganizmus az enzimet kódoló génjét illetően mutációnak alávetett szülői mikroorganizmust vagy annak leszármazottját jelenti. Az organizmus ilyen mutációja (a) a szülői mikroorganizmus eredetileg jelenlévő, megfelelő génjének (szülői gén) mutációjával vagy (b) egy másik forrásból közvetlenül vagy közvetve nyert megfelelő • · gén szóban forgó mikroorganizmusba történő átvitelével (bevitelével) hajtható végre, miáltal mutáns mikroorganizmust kapunk. A gazda mikroorganizmus olyan organizmus, amely egy mutáns vagy átvitt génnel rendelkezik. A gazda mikroorganizmus általában egyaránt származhat ugyanazon vagy különböző törzsből vagy fajból, mint a szülői mikroorganizmus.

A találmány tárgya a szabadalmi bejelentésben

Fusarium solani pisi

W0-A-90/09446 számú nemzetközi (Plánt Genetics Systems) leírt kutináz mutáns alakjai, és

Colletotrichum capsici,

Colletotrichum gloesporoides és

Magnaporthe grisea kutinázainak mutáns alakjai. Ezek kutináz változatok rekombináns DNS-technikával kapott vagy előállított gént tartalmazó, rekombináns DNS-technikával módosított mikroorganizmusokkal termeltethetők.

Azon aminosav-gyökök azonosítása után, amelyek a molekula azon részében helyezkednek el, amelyet a Fusarium solani pisi kutináz 116-120. aminosav-gyökeinek alfa szénatomjaihoz (vagy egy másik kutináz megfelelő alfa szénatomjaihoz) a legkisebb négyzet illeszkedést mutató vektor, és az erre a vektorra merőleges, a 117. gyök alfa szénatomját (vagy egy másik kutináz megfelelő alfa szénatomját) tartalmazó sík határoz meg, a megfelelő aminosavak egy vagy több azonosított helyre történő bevitelével megkísérelhetjük módosítani az aminosav-szekvenciát (ld. pl. az N172K mutáns szekvenciája a Fusarium solani pisi kutinázéhoz vagy • 4 ·· ···· 4 4 • · · · · · .· ♦*·.·;

- 24 homológjáéhoz képest).

A szakember számára nyilvánvaló, hogy az ilyen módosítások befolyásolják a kutináz szerkezetét. Természetesen azokat a módosítások részesítjük előnyben, amelyek az aktív hely körüli elektrosztatikus töltést nem befolyásolják túlságosan. Megállapítottuk az enzim konformációjának elkerülhetetlen torzulása és a fokozott enzimaktivitás közötti egyensúly szintjét, miáltal nagy valószínűséggel válik lehetővé a sikeres kutináz változatok tervezése és előállítása.

A IV. táblázatban és a leírásban másutt a peptidszekvenciákban az aminosavakat és aminosav-gyököket az alábbi egy- vagy hárombetűs rövidítésekkel Jelöljük.

IV. TÁBLÁZAT

A	—	Alá	—	alanin	V	=	Val	ZZ	valin
L	-	Leu	-	leucin	I	=	He	-	izoleucin
P	-	Pro	-	prolin	F	-	Phe	-	fenilalanin
W	-	Trp		triptofán	M	-	Met	-	metionin
G	-	Gly	-	glicin	S		Ser	zz	szerin
T	=	Thr	-	treonin	C		Cys	zz	cisztein
Y	-	Tyr	-	tirozin	N	-	Asn	zz	aszparagin
Q	-	Gin	-	glutamin	D	-	Asp	zz	aszparaginsav
E	-	Glu	=	glutaminsav	K	=	Lys	-	lizin
R		Arg	—	arginin	H	-	His	zz	hisztidin

• · * ·

- 25 A találmányban egy protein aminosav-szekvenciájában jelenlevő mutáció, és így maga a mutáns protein az alábbi rövidített módon a mutáció elhelyezkedésével és természetével írható le: a mutációval megváltoztatott eredeti aminosav-gyök megnevezésével; a mutáció helyével (szekvencia szám); és az eredeti aminosav helyére bevitt aminosav-gyök megnevezésével. Ha a szekvenciában egy aminosavas inszerció van jelen, elhelyezkedését a szabályos szekvencia vagy a vonatkoztatási szekvencia inszerció helye előtti utolsó tagjának számához kapcsolt egy vagy több index betűvel Jelöljük.

Például, a 172. helyen lévő aszparagin lizinnel végzett helyettesítésével jellemezhető mutánst Asnl72Lys vagy N172K jelöléssel azonosítjuk. Egy további aminosav-gyök, mint pl. a prolin aszparagin utáni (feltételezett) inszercióját Asnl72AsnPro vagy N172NP. vagy más módon *172aP jelöléssel (melyben az in6zertált gyököt 172a-val jelöljük) azonosíthatjuk. Az aszparagin ugyanezen helyen lévő (feltételezett) delécióját Asnl72* vagy N172* Jelzéssel azonosíthatjuk. A csillag a megadott helyen egy deléciót vagy egy hiányzó aminosav-gyököt jelent, attól függően, hogy az adott aminosav tényleges deléció folytán, vagy csupán az adott helyen aminosav-gyökkel rendelkező másik szekvenciával vagy vonatkoztatási szekvenciával való összehasonlítás eredményeként hiányzik.

A többszörös mutációkat + Jelekkel választjuk el; pl.

N172K+S54I+A128F szubsztitúcióval létrehozott három mutációt hordozó mutáns proteint jelent. melyben a mutációk a feltüntetett helyeken találhatók. Az alábbi táblázatban megadott mutációk kívánság szerint kombinálhatok.

Az V. táblázatban a találmány szerinti kutináz változatok néhány hasznos példáját mutatjuk be, melyek a Fusarium solani pisi kutinázán alapulnak.

V. TÁBLÁZAT

Fusarium solani pisi kutináz változatok

T19V, G41A, T45K, T45P, *I49a, S54I, N58R, G75R, A76P, G82A.

D83S, A85F, A85V, S92R, A93V, L99K, G100R, A127L, A128F,

N172K, T173I, T179F, I183F, V184I, A185L, L189F, A190L,

D 194R, G197V, E201K

A találmány szerinti előnyben részesített változatok a Fusarium solani pisi kutináz A85F, N172K és E201K változatai, valamint az egyéb kutinázok megfelelő változatai. Egy ilyen megfelelő változatra példa a Colletotrichum gloesporoides kutinázából származó Aspl72Lys vagy D172K változat.

A találmány további tárgya eljárás a találmány szerinti kutináz változatok előállítására. A természetben előforduló, kutinázokat termelő mikroorganizmusok rendszerint növény• «

- 27 patogének. s a módosított kutináz gének gazdasejteiként való működéshez nem túl alkalmasak. Következésképpen, a módosított (pro)kutinázokat kódoló géneket rDNS vektorokba foglaltuk, melyek bevihetők a rekombináns DNS-technológiához előnyben részesített gazda mikroorganizmusokba. E célra a WO-A-90/09446 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt rDNS vektorral lényegében megegyező rDNS vektorok alkalmazhatók.

A természetben előforduló, kutinázokat termelő mikroorganizmusok fermentációs folyamatokhoz nem igazán alkalmasak. A fermentációs eljárás hozamának javítása érdekében egy javított kutinázt kódoló gént olyan mikroorganizmusba kell átvinni, amely olcsó táptalajon gyorsan növekszik, s nagy mennyiségű kutináz szintézisére és kiválasztására képes. Ilyen alkalmas, rDNS-sel módosított találmány szerinti gazda mikroorganizmusok a baktériumok, többek között a Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus és Streptomyces fajok, vagy az alacsonyabb rendű eukarióták, mint a Saccharomyces cerevisiae és rokon fajai, a KI uyveromyces marxianus és rokon fajai, a Hansenula polymorpha és rokon fajai, valamint az Aspergillus nemzetségbe tartozó fajok. Az előnyben részesített gazda mikroorganizmusok az alacsonyabb rendű eukarióták, mivel ezek a mikroorganizmusok a fermentációs folyamat során nagyon hatékonyan termelik és szekretálják az enzimeket, s képesek a kutináz molekula glikozilálására. A glikozílálás növelheti a kutináz detergens rendszerekben mutatott stabilitását.

A találmány további tárgya genetikai anyag, amely a módosított eukarióta kutináz gének (pl. a Fusarium solani písí-ből származó gén) klónozó rDNS vektorokba történő beviteléből származik, valamint ezen genetikai anyag új gazdasejtek transzformálásában és a kutináz változatok génjeinek új gazdasejtekben történő expresszálásában való alkalmazása.

A találmány további tárgya rDNS-technikával előállított vagy módosított, kutináz változatokat kódoló polinukleotidok, ilyen polinukleotidokat tartalmazó rDNS vektorok, valamint ilyen polinukleotidokat és/vagy ilyen rDNS vektorokat tartalmazó, rDNS-technikával módosított mikroorganizmusok. A találmány további tárgya a módosított eukarióta kutinázokat kódoló, megfelelő polinukleotidok, mint például egy érett kutináz változatot kódoló bázisszekvenciával rendelkező polinukleotid, melyben az utolsó transziáit kodont egy stop kodon követi, s amely tetszés szerint az érett kutináz változatot kódoló nukleotid-szekvenciáktól közvetlenül upstream irányban elhelyezkedő, a kutináz pre-pro- és proszekvenciáját kódoló nukleotid-szekvenciákkal rendelkezik.

Ilyen polinukleotidban az eredeti organizmusból származó, kutinázt kódoló nukleotid-szekvencia úgy módosítható, hogy legalább egy kodon, de előnyösen annyi kodon, amennyi csak lehetséges, néma mutáció tárgyát képezze, hogy a

::9 korábbiakkal egyenértékű aminosavakat kódoló, az új gazda által előnyben részesített kodonok alakuljanak ki, miáltal a bevitt gének számára az új gazda sejtjein belül Javított stabilitású messenger-RNS-t biztosítunk.

A pro- vagy érett kutinázokat kódoló nukleotidszekvenciáktól upstream irányban olyan szekvencia helyezhetünk, amely a kiválasztott gazdának megfelelő jelző vagy szekréciós szekvenciát kódol. Ilyenformán, a találmány egyik megvalósítási módja rDNS vektorra vonatkozik, melybe kutináz változatot vagy annak prekurzorát kódoló nukleotidszekvenciát inszertáltunk.

A nukleotid-szekvencia származhat például:

(a) természetesen előforduló nukleotid-szekvenciából (pl. amely a Fusarium solani pisi által termelt pre-pro- vagy pro-kutináz eredeti aminosav-szekvenciáját kódolja);

(b) kémiai úton szintetizált nukleotid szekvenciákból, melyek az új gazda által előnyben részesített kodonokból állnak, és amelyek az új gazdában stabil messenger-RNS-t eredményeznek. s szintén az eredeti aminosav-szekvenciát kódolj ák;

(c) az (a) vagy (b) pontban említett nukleotid-szekvenciák valamelyikéből származó, génsebészeti úton előállított nukleotid-szekvenciákból, melyek más aminosav-szekvenciájú, de detergens rendszerekben kiváló stabilitással és/vagy aktivitással rendelkező Fusarium solani pisi kutinázt kódolnak.

• * • ·

- 30 összefoglalasu.1; egy kutináz gént alkotó nukleotidszekvencia expresszióját irányítani képes rDNS vektorok az előnyben részesített gazdák valamelyikében előnyösen az alábbi komponensekből állnak:

a) Érett kutinázt, prekutinázt vagy megfelelő prekutinázt kódoló kétszálú (ds; double-stranded) DNS, amelyben a preszekvencia legalább egy részét egy (a kiválasztott gazdasejt számára előnyös) szekréciós jeltől közvetlenül downstream irányban eltávolitottuk. Olyan esetekben, amikor a gén transzlálódó része nem az ATG kodonnal kezdődik, a szekvencia elejére ATG kodont kell helyezni. A gén transzlálódó részének minden esetben megfelelő stop kodonnal kell végződnie.

b) A kutinázt kódoló kétszálú DNS [(a) komponens] + szálától upstream irányban elhelyezkedő, a kiválasztott gazda számára megfelelő expressziós regulon.

c) A kutinázt kódoló kétszálú DNS [(a) komponens] + szálától downstream irányban elhelyezkedő, a kiválasztott gazda számára megfelelő terminátor szekvencia;

dl) A kétszálú DNS kiválasztott gazda genomjába való integrációját elősegítő nukleotid-szekvenciák.

d2) A kiválasztott gazda számára megfelelő replikációs kezdőhely.

el) Tetszés szerint (auxotróf) szelekciós marker; az auxotróf marker az auxotróf marker kódoló régiójából és egy hibás promoterből állhat;

e2) Tetszés szerint a kiválasztott gazdában a kutináz prekurzor alakjának érésében és/vagy szekréciójában szerepet •· »··« ·« ·· β, • · · · · · · • · · ··· · ···* * * · ··

- 31 .játszó proteineket kódoló kétszálú DNS szekvencia.

Egy ilyen rDNS vektor a korábban meghatározott polinukleotidtól upstream és/vagy downstream irányban további, a kutináz funkcionális expresszióját elősegítő szekvenciákat is hordozhat. Az auxotróf marker az auxotróf marker kódoló régiójából és egy hibás promoterből állhat.

A találmány egy másik megvalósítási módja a fentebb leírt kutinázok egyikének fermentációs előállítására vonatkozik. A fermentáció lehet normális, adagonkénti (batch) fermentáció, fed-batch fermentáció vagy folyamatos fermentáció. Az alkalmazni kívánt eljárás kiválasztása a gazdatörzstől és a fermentációs folyamat előnyben részesített későbbi lépéseitől függ (melyek önmagukban ismertek). Ilyenformán, a találmány további tárgya eljárás egy, a találmányban meghatározott kutináz változat előállítására, melynek során egy rDNS-technikával módosított mikroorganizmust (amely legalább egy, a kutináz aminosav-szekvenciáját befolyásoló mutációt hordozó, rDNS technikával előállított gént tartalmaz, ami a kutináznak a megfelelő kiindulási enzimhez képest javított aktivitást biztosít) fermentativ körülmények között tenyésztünk; a mikroorganizmus által termelt kutináz fermentléből történő elválasztásával, vagy a mikroorganizmus sejtek fermentléből történő elkülönítésével, s az elkülönített sejtek feltárásával a kutináz változatból készítményt állítunk elő, oly módon, hogy a kutináz változatot fizikai vagy kémiai bekoncentráló vagy tisztító • ♦··

- 32 módszerekkel az említett fermentléből vagy az említett sejtekből bekoncentráljuk vagy részlegesen tisztítjuk. A körülményeket előnyösen úgy választjuk meg, hogy a mikroorganizmus a kutináz változatot a fermentlébe szekretálja, az enzimet a sejtek eltávolítása után szűréssel vagy centrifugalássál a fermentléből nyerhessük ki.

A kutináz változat ezután tetszés szerint kívánt mértékben koncentrálható vagy tisztítható. Ezek a fermentációs folyamatok — a mikroorganizmus speciális természetétől eltekintve — ismert fermentációs technikák alapján, és általánosan használt fermentációs és utókezelési berendezésben végezhetők.

A találmány további tárgya eljárás kutináz változat termelésére képes, módosított mikroorganizmus előállítására rDNS technikákkal, melynek során a mikroorganizmusba bevitt, kutináz változatot kódoló gént 5' végén a gazdaszervezetben jelző vagy szekréciós szekvenciaként működő (módosított) pre-szekvenciát kódoló génfragmenshez fúzionáljuk.

Egy másik szempontból a találmány tárgya rDNS-technikával módosított, kutináz változatot kódoló gént tartalmazó mikroorganizmusok, melyek képesek az említett gén által kódolt kutináz változat termelésére. Az rDNS-technikával módosított mikroorganzimusban a természetes kutinázt kódoló gént (ha eredetileg jelen van) előnyösen eltávolítjuk, pl. egy másik szerkezeti génnel helyettesítve.

Egy másik szerinti detergens változat »«« · • · · · · · • · ··· · • · · · · ·» ··«· ·· ···« szempontból a találmány további tárgya a találmány kutináz változatokat tartalmazó enzimatikus készítmények. Az ilyen készítmények a kutináz és más, detergens rendszerekben általánosan használt detergens összetevők keverékéből állnak, beleértve a készítmények adalékanyagait, és a kész detergens és tisztitó készítményeket, pl.

az ismert és például az

ΕΡ-Α-25Θ 068 számú európai szabadalmi bejelentésben leírt fajtákat. A készítmények 5-60 m/m %, előnyösen 20-50 m/m % detergens alapanyagot, és 0,1-50 m/m % aktív anyagot tartalmazhatnak, mely utóbbi 0-95 m/m %-ban egy vagy több anionos felületaktív anyagból, és 5-100 m/m %-ban egy vagy több nemionos felületaktív anyagból áll.

Az ilyen detergens készítmények többi komponense valamennyi ismert fajta lehet, mint például a GB-A-1 372 034 (Unilever), US-A-3 950 277, US-A-4 011 169, EP-A-179 533 (Procter &

Gamble), EP-A-205 208 és EP-A-206 390 (Unilever), JP-A63-078000 (1988) számú szabadalmi bejelentésekben, és a

29056 számú Research Disclosure-ben (1988 június) (melyek mindegyikét, a bennük felsorolt leírásokkal együtt, hivatkozásul említjük) leírtak.

A találmány szerinti kutináz változatokat bármely alkalmas alakban hozzáadhatjuk a detergens készítményhez, például szemcsés készítmény, oldat vagy sűrű enzim-szuszpenzió formájában, vagy vivőanyaggal együtt (pl. a EP-A-258 068 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak, és a Novo

Nordisk Savinase™ és Lipolase.™ termékei).

A kutináz változat készítményhez adott mennyisége széles határok között változtatható, pl. a detergens készítmény tömegére vonatkoztatva 10 LU/g és 20000 LU/g között, előnyösen 50 LU/g és 2000 LU/g között. A találmány leírásában az LU (lipáz egység) meghatározása megegyezik az EP-A-258 068 számú európai szabadalmi bejelentésben (Novo

Nordisk) leírtakkal.

Egyéb enzimek esetében (melyek szintén Jelen lehetnek a készítményben) — a megfelelő tényezők módosításával — hasonló megfontolások alkalmazhatók (ld. pl. EP-A-407 225 számú európai szabadalmi bejelentés).

Előnyösek lehetnek az olyan készítmények, melyekben a kutinázzal együtt proteáz is jelen van. Proteázokként 10-es pl értéknél kisebbel rendelkezők alkalmasak. Az EP-A-271 154 számú európai szabadalmi bejelentésben (Unilever) számos ilyen proteázt írnak le. A kutináz változatokkal együtt alkalmazható proteázok közé tartozik (bizonyos körülmények között) például a BPN' típusú szubtilizin vagy a irodalomban leírt több szubtilizin típus, melyek közül néhányat már Javasoltak detergens készítményekben való alkalmazásra; ilyenek például az EP-A-130 756 vagy EP-A-251 446 (mindkettő Genentech) ; US-A-4 760 025 (Genencor); EP-A-214 435 (Henkel); W0-A-87/04661 (Amgen); W0-A-87/05050 (Genex) számú szabadalmi bejelentésekben, illetve Thomas és mtsi (Natúré, ·· * 4 · · ·· ·· ·« • · · · · 4 · , .*·

313.. 375-376 (1986/5), és J. Mól. Bioi., 133, 803-813 (1987))-, és Russel és mtsl (Natúré, 323, 496-500, (1987)) által leírt mutáns proteázok.

A találmányt a továbbiakban a példák segítségével mutatjuk be. A nukleinsavak manipulálásához és vizsgálatához alkalmazott valamennyi eljárást lényegében Sambrook, J., Fritsch, E.F. és Maniatis, T., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, ISBN 0-87969-309-6) leírása szerint végeztük, kivéve, ahol ezt másképpen Jeleztük.

Az ábrák rövid leírása

Az 1/A ábrán a szintetikus Fusarium solani pisi kutináz gén

1- es kazettájának, és az azt alkotó oligonukleotidok nukleotid-szekvenciája látható. Az oligonukleotidok közötti átmeneteket a kazetta szekvenciájában jelöljük. A kisbetűk a nyitott leolvasási kereten kívüli nukleotidokat jelzik.

Az 1/B ábrán a szintetikus Fusarium solani pisi kutináz gén

2- es kazettájának, és az azt alkotó oligonukleotidok nukleotid-szekvenciája látható. Az oligonukleotidok közötti átmeneteket a kazetta szekvenciájában jelöljük.

Az 1/C ábrán a szintetikus Fusarium solani pisi kutináz gén

3-as kazettajanak, é3 az azt alkotó oligonukleotidők nukleotid-szekvenciája látható. Az oligonukleotidők közötti átmeneteket a kazetta szekvenciájában jelöljük. A kisbetűk a nyitott leolvasási kereten kívüli nukleotidokat jelzik.

Az 1/D ábrán a szintetikus Fusarium solani pisi pre-prokutinázt kódoló szintetikus kutináz gén nukleotidszekvenciája látható. Az ábrán feltüntettük a kutináz pre-, pro- és érett szekvenciáját, valamint a klónozáshoz használt helyeket és az oligonukleotidők közötti átmeneteket. A kisbetűk a nyitott leolvasási kereten kívüli nukleotidokat jelzik.

A 2. ábrán a Fusarium solani pisi pro-kutinázt kódoló szekvenciát E. coli pYioK pre-szekvencia származékot kódoló szekvenciához kötő szintetikus DNS-fragmens nukleotidszekvenciája látható. Az ábrán feltüntettük a riboszóma kötési helyet (RBS) és a klónozáshoz használt restrikciós enzim felismerési helyeket. A kódolt phoA jelző-szekvencia aminosav-szekvenciáját és a kutináz gén egy részét egybetüs rövidítéssel jelöljük.

A 3. ábrán a 8-as kazetta (az invertáz pre-szekvencia és az érett Fusarium solani pisi kutináz kódoló szekvenciáinak fúziós pontjait kódoló Sacl-Bcll fragmens) nukleotidszekvenciája látható.

A 4. ábrán a pUR2741 plazmid, a pUR2740 plazmidból egy 0,2 ·

- 37 ··· kb-os Sall-Nrul fragmens deléciójával nyert E. coli - S. cerevisiae shuttle (ingázó) vektor látható, amely a pBR322 plazmid egy részéből, a 2^«n plazmidból származó élesztősejt replikációs kezdöhelyből, élesztő leu2D génből, és a gal7 promoter szabályozása alatt álló, növényi alfagalaktozidázzal fuzionált, élesztő invertáz jelzőszekvenciát kódoló régióból áll.

Az 5. ábrán a pUR7219 plazmid, egy E. coli - S. cerevisiae shuttle vektor látható amely a pBR322 plazmid egy részéből, a 2 pm plazmidból származó élesztősejt replikációs kezdőhelyből, élesztő leu2D génből, és a gal7 promoter szabályozása alatt álló, az érett Fusarium solani pisi kutinázt kódoló régióval fuzionált élesztő invertáz jelzőszekvenciát kódoló régióból áll.

A 6. ábrán a pUR2740 plazmid, egy E. coli - S. cerevisiae shuttle vektor látható, amely a pBR322 plazmid egy részéből, a 2 pm plazmidból származó élesztősejt replikációs kezdőhelyből, élesztő leu2D génből, és a gal7 promoter szabályozása alatt álló, növényi alfa-galaktozidázzal fuzionált, élesztő invertáz jelző-szekvenciát kódoló régióból áll.

A 7. ábrán az exlA pre-szekvencia és az érett Fusarium solani pisi kapcsolatait kutináz kódoló szekvenciáinak különböző típusú tartalmazó 5-ös, 6-os és 7-es kazetta nukleotid-szekvenciája látható.

- 38 A 8. ábrán a pAW14B plazmid látható, melyet az Aspergillus niger var. awamori genom DNS-ének 5,3 kb-os Sáli fragmensének a pUC19 Sáli helyére történő inszerciójavai kaptunk.

A 9.

ábrán a pUR7280 plazmid látható, melyet a pAW14B plazmidban az exlA nyitott leovasási keretet tartalmazó

BspHI-AflII fragmens Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló szekvenciát tartalmazó BspHI-AflII fragmenssel való helyettesitésével kaptunk. A pUR7280 plazmid így a Fusarium solani pisi pre-pro-kutináz gént az Aspergillus niger var. awamori promoter és terminátor szabályozása alatt tartalmazza.

A 10. ábrán a PÜR7281 plazmid látható, melyet úgy kaptunk, hogy a PÜR7280 plazmidba A. nidulans amdS és Aspergillus niger var. awamori pyrG szelekciós markert vittünk be.

A 11. ábrán a Fusarium solani pisi kutináz molekula vázlatos ábrázolása látható.

A 12. ábrán a Fusarium solani pisi-bői, Colletotrichum capsíci-től, Colletotrichum gloesporoides-hől és Magnaporthe grisea-'ból származó kutinázok részleges aminosavszekvenciája látható, melyeken feltüntettük a gyökök háromdimenziós szerkezetben megfigyelhető elhelyezkedését.

A 13. ábrán a Fusarium solani pisi kutináz és az N172K ···· «· • «

- 39 kutináz változat mosás közbeni aktivitását mutatjuk be.

A 14. ábrán a Fusarium solani pisi kutináz és az E2O1K kutináz változat mosás közbeni aktivitását mutatjuk be.

A 15. ábrán a Fusarium solani pisi kutináz és az A85F kutináz változat mosás közbeni aktivitását mutatjuk be.

1. példa

Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló szintetikus gén készítése

Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló szintetikus gént lényegében az EP-A-407 225 számú európai szabadalmi bejelentésben (Unilever) leírtak szerint készítettünk. A Fusarium solani pisi gének közölt nukleotid-szekvenciái alapján (Soliday és mtsi, 1984, és W0-A-90/09446 számú szabadalmi bejelentés (Plánt Genetic Systems)) teljes egészében szintetikus DNS fragmenst terveztünk, amely Fusarium solani pisi pre-pro-kutináz polipeptidet kódoló régiót tartalmaz. Az eredeti Fusarium solani pisi gén nukleotid-szekvenciájához képest ez a szintetikus kutináz gén több nukleotidőt érintő változásokat foglal magában, melyeknél a génen belül megfelelő helyekre restrikciós enzim felismerési helyeket építettünk, anélkül, hogy befolyásolnánk a kódolt aminosav-szekvenciát. A teljes szintetikus kutináz gén nukleotid-szekvenciáját a 1/D ábrán mutatjuk be.

·· ···· »·

- 40 A szintetikus kutináz gén létrehozásához szintetikus DNS oligonukleotidőkből kiindulva három külön kazettát illesztettünk össze. Valamennyi szintetikus DNS kazetta az elején EcoRI helyet, a végén HindlII helyet tartalmaz. Az oligonukleotidokat Applied Biosystems 380A típusú DNS-szintetizát.or alkalmazásával szintetizáltuk, és poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítottuk. Az egyes kazetták összeállításához az alábbiakban vázolt eljárást követtük. Az adott kazettát alkotó oligonukleotidők ekvimoláris mennyiségét (50 pmól) összekevertük, 5' végükön foszforiláltuk, és standard módszerek szerint annuáltuk és ligáltuk. A kétszálú DNS molekulák képződött elegyét EcoRIgyel és HindlII-mal emésztettük, agaróz gélelektroforézissel méret szerint frakcionáltuk, s a gélről elektro-elúcióval választottuk izoláltuk. A kapott szintetikus DNS kazettát a pUC9 2,7 kb-os EcoRI-HindlII fragmenséhez ligáltuk, és Escherichia coli-ba transzformáltuk. A szintetikus kazetták szekvenciájának igazolása érdekében számos klón EcoRIHindlII inszertjét mindkét irányban teljes egészében megszekvenáltuk. Ezen eljárás alkalmazásával az 1-es kazettát tartalmazó p(JR7207 plazmidot (1/A ábra), a 2-es kazettát tartalmazó pUR7208 plazmidot (1/B ábra) és a 3-as kazettát tartalmazó pUR7209 plazmidot (1/C ábra) alakítottuk ki. A szintetikus kutináz gént végül a pUR7207 2,9 kb-os EcoRI-Apal fragmense, a pUR7208 0,2 kb-os Apal-Nhel fragmense és a pUR7209 0,3 kb-os Nhel-HindlII fragmense egyesítésével állítottuk össze, miáltal a pUR7210 plazmidot kaptuk, amely a Fusarium solani pisi teljes pre-pro···* ·· «· > · ··· · • · · · · · ·· ··♦· *· ·*·♦ kutinázát kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmaz (1/D ábra).

2. ábra

A Fusarium solani pisi (pro)kutlnáz expresszálása

Escherichia coli-ban

A szintetikus kutináz génnel az E. coli számára expressziós vektort készítettünk, amely funkcionálisan hasonló a WO-A90/09446 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Plánt Genetic Systems) leírt vektorhoz. Olyan konstrukciót terveztünk, amelyben a Fusarium solani pisi pro-kutinázt kódoló szintetikus gén részt megfelelő E. coli expressziós jelek előzik meg, azaz (i) egy indukálható promoter; (ii) egy riboszóma kötési hely; és (iii) egy jelző-szekvencia, amely transzlációs kezdő kodont, és a pro-kutináz citoplazma membránon keresztüli transzportjához szükséges információt biztosít.

Az E. coli phoA jelző-szekvenciája származékának a szintetikus kutináz gén pro-szekvenciájával való fúziójához szintetikus linkért (ld. 2. ábra) terveztünk. A jelző peptid hasításának és a pro-kutináz szekréciójának elősegítéséhez a phoA jelző-szekvencia három C-terminális aminosav-gyökét (Thr-Lys-Ala) Ala-Asn-Ala aminosavakkal helyettesítettük, a kutináz pro-szekvenciájának N-terminális aminosav-gyökét (leu 1, ld. 1/D ábra) pedig alaninra cseréltük. Ez a konstrukció biztosítja kutináz számára, hogy a ··♦· ·· • · · · Σ - Λ ···· ·» ···.

- 42 periplazmat ikus térbe szekretálódjon (ld. WO-A-90/09446 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, Plánt Génétic Systems).

Hogy ilyen konstrukciót kapjunk, a kutináz pre-szekvenciát, és a pro-szekvencia egy részét tartalmazó 69 kb-os EcoRISpel fragmenst eltávolítottuk a pUR7210 plazmidból, és a szintetikus DNS linker szekvenciával (EcoRI-Spel fragmens) helyettesítettük, ami az E. coli phoA pre-szekvencia származékot és a kutináz pro-szekvencia megváltoztatott Nterminális aminosav-gyökét (2. ábra) eredményezte. A kapott plazmidot pUR7250-nek neveztük el, és riboszómakötő helyet és a phoA jelző-szekvenciához fúzionált pro-kutináz-kódoló régiót tartalmazó 0,7 kb-os BamHI-HindiII fragmens izolálásához alkalmaztuk. Ezt a fragmenst a pMMB67EH plazmid (Fürste, J.P., Pansegrau, W., Frank, R. , Blöcker, H., Scholz, P., Bagdasarian, M. és Lanka, E.: Molecular cloning of the plasmid RP4 prímásé region in a multi-host-range tacP expression vector, Gene, 119-131, 1986). 8,9 kb-os BamHI-HindlII fragmenséhez ligáitűk, miáltal a PÜR7220 plazmidot kaptuk. Ebben a plazmidban a pro-kutinázt kódoló gén a phoA jelző-szekvencia módosított változatához fúzionálva található, és az indukálható tac-proinoter szabályozása alatt áll.

A pUR7220 plazmidot tartalmazó WK6 E. coli törzset 0,5 liter IXTB tápközeget (0,017 M KH₂P0₄; 0,017 Μ K2HPO4; 12 g/1 Bacto-tryptone. 24 g/1 Bacto-élesztő kivonat, 0.4 V/V % glicerin) (Tartót és Hőbbe, Gene, 67., 169-182, 1988) tartalmazó kétliteres rázólombikokban növesztettük. A tenyészeteket 100 pg/ml ampicillin jelenlétében élénk rázás mellett (150 percenkénti fordulat) egy éjszakán keresztül 25-30 °C-on addig növesztettük, míg az 0D 610 nm-nél el nem érte a 10-12-es értéket. A tenyészethez ezután 10 j.ü végkoncentrációban IPTG-t (izopropil-6-D-tio-galaktopiranozid) adtunk, és az inkubálást további 12-16 órán keresztül folytattuk. Amikor a tenyészetekből vett minták analízisével a termelődött lipolitikus aktivitás további Jelentős növekedését nem tapasztaltuk, a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és az eredeti tenyészeti térfogatban 20 % szacharózt tartalmazó pufferben 0 “C-on reszuszpendáltuk. A sejteket centrifugálással újra összegyűjtöttük, és az eredeti tenyészet térfogatával megegyező térfogatú jéghideg vízben reszuszpendáltuk, ami a sejtek ozmotikus lizisét okozta. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk, majd a sejtmentes kivonatot ecetsavval pH = 4.8-ra savanyítottuk, egy éjszakára 4 °C-on állni hagytuk, s a képződött csapadékot eltávolítottuk. Ebben a stádiumban a sejtmentes kivonat ultrafiltrálásával és fagyasztva szárításával 75 %-osnál tisztább, endogén lipázoktól lényegében mentes kutináz készítményt kaptunk. Más módon, a kutináz homogén állapot eléréséig (azaz 95 %-osnál nagyobb tisztaságúvá) is tisztítható, melynek során a savanyított sejtmentes kivonatot SP-sephadex oszlopra töltjük, az enzimet pH = 8.0 pufferrel eluáljuk, a koncentrált lúgos oldatot megfelelő térfogatú DEAE-cellulóz • ·

- 44 oszlopon (Whatman DE-52) engedjük át, és a DEAE oszlopon átfolyt frakciót közvetlenül Ü-Sepharose HP (Paharmacia) oszlopra visszük. Sóoldat gradienssel végzett eluálással homogén kutináz készítményt kaptunk, melynek jellemző összes hozama 75 %-nál jobb volt.

3. péIda

Fusarium solani pisi kutináz változatokat kódoló gének előállítása

A Fusarium solani pisi pre-pro-kutináz 1. példában leírt szintetikus génjének alkalmazásával különböző géneket állítottunk melyek a kódolt aminosav-szekvenciában változtatásokat tartalmaztak. A gének kialakításához lényegében az 1.

példában a teljes szintetikus kutináz gént alkotó három kazetta előállításához leírt eljárásokat követtük. Például, a Fusarium solani pisi kutináz N172K változatát kódoló gént úgy készítettük, hogy a 3-as kazetta egy új változatát állítottuk össze, melynek során az 1.

péIdában leírtakkal megegyező oligonukleotidokat alkalmaztunk, a mutációval megváltoztatni kívánt (vagyis az Asn 172) helyen a kódoló tripletet lefedő két oligonukleotid kivételével. Az eredeti oligonukleotidok helyett új szintetikus oligonukleotidokat alkalmaztunk, melyek a mutáns szekvenciát tartalmazzák, de máskülönben azonosak az eredetiekkel. Részletesebben; a CUTI3D MH és CUTI3K MH helyett egy CUTI3D MH változatot (mely AAT helyett AAG-t tartalmaz), illetve egy CUTI3K MH változatot (mely ATT helyett CTT-t tartalmaz) alkalmazásával új, N172K mutációt tartalmazó 3-as kazettát állítottunk össze (ld. 1/C ábra). Az új 3-as kazettát lényegében az 1. példában leírtak szerint klónoztuk és szekvenáltuk, és a mutációt tartalmazó 0,3 kb-os Nhel-HindlII DNS fragmenssel a p(JR7210 plazmidban a megfelelő fragmenst helyettesítettük, miáltal a pUR7257 (N172K) plazmidot kaptuk. Az e plazmidból származó 0,6 kb-os Spel-HindlII fragmenst a pUR7220 megfelelő fragmensének helyettesítéséhez használtuk, miáltal a pUR7224 E. coli expressziós plazmidot kaptuk. Ezt az E. coli expressziós plazmidot a WK6 E. coli törzsbe transzformáltuk. A transzformánsokat a 2. példában leírtak szerint növesztettük, s a pro-kutináz enzim változatot lényegében a 2. példában leírt módon nyertük ki és tisztítottuk.

Az E201K Fusarium solani pisi kutináz változatot kódoló gént hasonló módon, a CUTI3F MH és CUTI3M MH helyett egy CUTI3F MH változatot (mely GAG helyett AAG-t tartalmaz), illetve egy CUTI3M MH változatot (mely CTC helyett CTT-t tartalmaz) magában foglaló új 3-as kazetta változat (ld. 1/C ábra) összeállításával hoztuk létre.

Az A85F Fusarium solani pisi kutináz változatot kódoló gént hasonló módon, a CUTI2C MH és CUTI2I MH helyett egy CUTI2C MH változatot (mely GCT helyett TTC-t tartalmaz), illetve egy CUTI2I MH változatot (mely AGC helyett GAA-t tartalmaz) magában foglaló új 2-es kazetta változat (ld. 1/B ábra) összeállításával hoztuk létre.

4. példa

A Fusariwn solani pisi kutináz expresszálása

Saccharomyces cerevisiae-ben

A szintetikus Fusariiun cerevisiae-ben való solani pisi kutináz gén Saccharomyces expresszálásához olyan expressziós vektort készítettünk, melyben az érett kutinázt kódoló szintetikus gén előtt a

S.

cerevisiae invertáz pre-szekvenciája (Taussig, R.

és Carlsson, M.: Nucleotide sequence of the yeast SUC2 gene fór invertase, Nucleic Acids

1943-1954, 1983) és az erős, indukálható gal7 promoter (Nogi, Y. és Fukasawa,

T., Nucleotide sequence of the transcriptional initiation region of the yeast GAL7 gene,

Nucleic Acids Rés., 11, 8555-8568, 1983) áll. Ilyen fúzióhoz a szintetikus kutináz gént úgy készítettük, hogy egy adaptor fragmenst szintetizáltunk, melyben az invertáz pre-szekvenciát kódoló szekvenciát az érett kutináz Nterminálisát kódoló szekvenciához fúzionáltuk. Ezt a fragmenst lényegében az 1. példában leírt módon EcoRIHindlII kazettaként (8-as kazetta.

ld. 3. ábra) pUC9 plazmidba

A PUR7210 illesztettük, miáltal a PÜR7217 plazmidot kaptuk.

és pUR7217 plazmidokat JM110 E. coli törzsbe (mely nem rendelkezik dam metiláz aktivitással) transzformáltuk, és a pUR7217 2,8 kb-os BclI-HindlII fragmensét a PÜR7210 0,6 kb-os BclI-HindlII fragmensével ligáltuk, miáltal a pUR7218 plazmidot kaptuk, melyben az érett kutináz polipeptidet kódoló nukleotid-szekvencia a S. cerevisiae invertáz preszekvenciát kódoló régió egy részével fuzionálva van Jelen.

A pUR2741 expressziós vektort (4. ábra) pUR2740-ből

(.Verbakel, J.A.M.V., Heterologous gene expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Ph.D. disszertáció, Rijks Universiteit Utrecht., Hollandia, 1991) (6. ábra) származtattuk, oly módon, hogy izoláltuk a pUR2740 8,9 kb-os Nrul-Slal fragmensét, Sáli túlnyúló végét Klenowpolimerázzal feltöltöttük, és a fragmenst gyűrűvé zártuk. A PÜR2741 7,3 kb-os SacI-HindlII fragmensét a pUR7218 0,7 kbos SacI-HindlII fragmenséhez ligáltuk, miáltal a pUR7219 plazmidot kaptuk (ld. 5. ábra). A S. cerevisiae polll terminátor tetszés szerint a kutináz gén mögé helyezhető a HindlII helyen, melyről kiderült, hogy a kutináz gén hatékony expresszálásához nem feltétlenül szükséges. A PÜR7219 E. coli - S. cerevisiae shuttle plazmid a 2μ plazmidot tartalmazó S. cerevisiae törzsekben (cir^4- törzsek) való replikációhoz egy replikációs kezdőhelyet, a S. cerevisiae Leu2 gén (S. cerevisiae leu~ törzsekben nagy kópiaszámú trasznformánsok szelekcióját lehetővé tevő) proinoterhiányos változatát. és a Fusarium solani pisi kutináz érett részét kódoló szintetikus gént az erős, indukálható S. cerevisiae gal7 promoter szabályozása alatt a

S. cerevisiae invertáz pre-szekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazza.

Az SU50 S. cerevisiae törzset (a, cir°, leu2, his4, canl), amely azonos az YT6-2-1L törzzsel (Erhart, E. és Hollenberg, C.P., Curing of Saccharomyces cerevisiae 2-/.an DNA by transformation, Curr. Génét., 3, 83-89, 1981), élesztősejtek »♦ ···· ·· ·· ·· • · · · · · · standard elektoroporaciós eljárásának alkalmazásával a 2u 5. cerevisiae plazmid és a pUR7219 plazmid ekvlmoláris mennyiségével együttesen transzformáltuk. A transzformánsokat leucin prototrófiára szelektáltuk, és számos transzformánsból teljes DNS-t izoláltunk. Valamennyi transzformáns esetében úgy tűnt, hogy a 2μ és pUR7219 plazmidot egyaránt tartalmazzák, példát szolgáltatva arra, hogy a leu2 gén pUR7219 plazmidban lévő promoter-hiányos változata (amennyiben nagy kópiaszámban van jelen) a 2μ élesztő piamid jelenlétének köszönhetően csak funkcionálisan egészítheti ki a leu2-hiányos törzseket. A transzformánsok egyikét komplett táptalajon több, mint 40 generáción keresztül tenyésztettük, majd szelektív szilárd táptalajon replika-technikával lenyomatokat készítettünk, miáltal az SU51 S. cerevisiae törzset (a, cir*, leu2, his4, canl) kaptuk.

A pUR7219 plazmidot tartalmazó SU51 S. cerevisiae törzset 0,2 liter MM tápközeget (6,7 g/1 aminosavak nélküli élesztő nitrogén bázis, 20 mg/1 hisztidin, 20 g/1 glükóz) tartalmazó 1 literes rázólombikokban növesztettük.

A tenyészeteket 30 ’C-on, egy éjszakán keresztül élénk rázás (150 percenkénti fordulat) mellett addig növesztettük, míg 610 nm-nél az 0D el nem érte a 2-4 értéket. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és 2 literes rázólombikban 1 liter YPGAL tápközegben (10 g/1 élesztő kivonat, 20 g/1 bacto pepton, 50 g/1 galaktóz) reszuszpendáltuk, s az * · · · · · · • · · · ·»·..

inkubálást további

12-16 óráig folytattuk. Szabályos időközönként mintákat vettünk a tenyészetből, s a sejttörmeléket centrifügálással eltávolítottuk. A felülúszót szubsztrétként olívaolaj alkalmazásával titrimetriás módszerrel kutináz aktivitásra teszteltük. Valamennyi minta esetében 5,0 ml lipáz szubsztrát (a lipáz számára szubsztrátként olívaolajat tartalmaz, Sigma) és 25,0 ml puffér (5 mM

Tris-HCl, pH

9,0, 40 mM NaCl, 20 mM CaClz) kevert elegyéhez 100-200 pl szűrletet adtunk. A vizsgálatot °C-on végeztük, és a zsírsavak felszabadulását (0,05 M

NaOH oldattal a pH-t 9,0-re állítva) Mettler DL25 titráló berendezésben automatizált titrálással mértük. A titrálószer idő függvényében mért mennyiségével görbét készítettünk. A mintában Jelenlevő lipáz aktivitás nagyságát a görbe maximális meredekségéből számítottuk ki. Egy enzimaktivitási egység úgy definiálható, mint az enzim azon mennyisége, amely a fentebb meghatározott körülmények között az olívaolajból egy perc alatt 1 pmól zsírsavat szabadít fel. Az ilyen meghatározások a szakemberek ezámára ismertek.

Amikor a kútináz-aktivitás termelődése tovább már nem fokozódott, a sejteket centrifugálással eltávolítottuk, majd a sejtmentes kivonatot ecetsavval pH - 4,8-ra állítottuk, és a kutinázt az 1. példában leírt módon nyertük ki.

• · ·

5. példa

Fusarium solani pisi kutináz változatok expresszálása

S. cerevisiae-ben

A Fusarium solani pisi kutináz N172K változatát S. cerevisiae-ben az alábbi módon expresszáltuk. A p(JR7257 (N172K) plazmid 0,5 kb-os Apal-HindlII fragmensével a PÜR7218 plazmid analóg framgensét helyettesítettük, miáltal a pUR7228 (N172K) plazmidot kaptuk, melyben a mutációt tartalmazó gén működőképesen kapcsolódik a S. cerevlsiae jelző-3zekvenciát kódoló szekvenciához. A pUR2741 7,0 kb-os SacI-HindlII fragmensét a pUR7228 (N172K) 0,7 kb-os SacI-HindlII fragmenséhez ligáltuk, miáltal a pUR7234 (N172K) plazmidot kaptuk. Ezt a plazmidot az SU51 S. cerevisiae törzsbe transzformáltuk. A keletkezett transzformánsokat a 4. példában leírtak szerint inkubáltuk, és a termelődött enzim változatot a 4. és 1. példában leírt módon a tenyészeti közegből nyertük ki.

A Fusarium solani pisi kutináz E201K változatát S. cerevisiae-ben a fentivel azonos módon termeltük, melynek során az E201K kutináz változatot kódoló Fusarium solani pisi kutináz gén változatot (amit a 3. példában írtunk le) alkalmaztuk.

A Fusarium solani pisi kutináz A85F változatát S. cerevisiae-ben a fentivel azonos módon termeltük, melynek 3orán az A85F kutináz változatot kódoló Fusarium solani pisi kutináz gén változatot (amit a 3. példában írtunk le) alkalmaztuk.

6. példa

Fusariuin solani pisi kutináz expresszálása

Aspergi 11us-okban

A szintetikus Fusarium solani pisi kutináz gén Aspergillus niger var. awamori-tan történő expresszálásához olyan expressziós vektort készítettünk, melyben a Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló szintetikus gént az A. niger var. awamori erős, indukálható exlA promoterének [Maat, J., Róza, M., Verbakel, J. Stam, J., Santos de Silva, M.J., Bőssé, M. , Eggmond, M.R., Hagemans, M.L.D., v. Gorcom, R.F.M., Hessing, v.d. Hondel, C.A.M.J.J. és v.

Rotterdam, C.: Xylanes and their application in bakery (Xylans and Xylanases, Progress in Biotechnology, szerk.: Visser, J. Beldman, G., Kusters-van Someren, M.A. és Voragen, A.G.J., 7. kötet, Elsevier Science Publishers,

Amsterdam. 1992, ISBN 0-444-89477-2); de Graaf, L.H., van den Broek, H.C., van Ooijen, A.J.J. és Visser, J.: Structure and regulation of an Aspergillus xylanase gene (Xylans and Xylanases, Progress ín Biotechnology, szerk.: Visser, J. Beldman, G., Kusters-van Someren, M.A. és Voragen, A.G.J.,

7. kötet, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1992, ISBN 0-444-89477-2)] szabályozása alá helyeztük.

A pUR7280 pre-pro-kutináz expressziós plazmidot a pAW14B plazinidból kiindulva állítottuk elő, melyet a JM109 E. coli törzsben 1990. május 31-én CBS 237.90 deponálási számon a Centraalbureau voor Schimmelcultures-nél (Baarn, Hollandia) helyeztünk letétbe, s amely 2,5 kb-os 5' szegélyező szekvencáival és 2.0 kb-os 3' szegélyező szekvenciával együtt egy kb. 5,3 kb-os Sáli fraginenst tartalmaz, melyen a 0,7 kb-os endoxilanáz II (exlA) gén helyezkedik el (8. ábra). A pAW14B plazmidban az exlA kódoló régiót a pre-pro-kutinázt kódoló régióval helyettesítettük. Az exlA gén első kodonját (ATG) tartalmazó BspHI helyet (5-TCATGA-3') és az exlA gén stop kodonját (TAA) tartalmazó AflII helyet (5'-CTTAAG-3') felhasználtuk a pUR7280 plazmid előállításához.

A plazmid összeállítását az alábbiak szerint végeztük. A pAW14B plazmidot (7,9 kb) BspHI-gyel részlegesen emésztettük, s a lineáriséit plazmidot (7,9 kb) agaróz gélről izoláltuk. Az izolált 7,9 kb-os fragmenst ezután a más BspHI helyeknél linearizált plazmidok eltávolítása érdekében BsmI-gyel hasítottuk, amely a számunkra érdekes BspHI helytől downstream irányban néhány nukleotid távolságra hasit. A fragmenseket agaróz gélen választottuk el, és izoláltuk a 7,9 kb-os BspHI-BsmI fragmenst. Ezt AflII-vel részlegesen emésztettük, s a kapott 7,2 kb-os BspHI-AflII fragmenst izoláltuk.

A pUR7210 0,7 kb-os BspHI-AflII fragmensét, amely a Fusarium solani pisi pre-pro-kutinázt kódoló nyitott leolvasási keret • · egészét tartalmazza, a pAW14B plazmid 7,2 kb-os BspHI-AflII fragmensével ligáltuk, miáltal a p(JR7280 plazmidot kaptuk. Az előállított vektort (p(JR7280) ezután hagyományos együttes transzformálási technikák alkalmazásával penészgombákba (pl. Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, stb.) transzformálhatjuk, s a pre-pro-kutináz gén az endoxilanázlI proinoter indukálásával expresszálható. Az előállított rDNS vektorba hagyományos szelekciós markereket (pl. amdS vagy pyrG. higromicin, stb.) is építhetünk, s a penészgombákat a kívánt protein expresszálása érdekében a kapott rDNS vektorral transzformálhatjuk. Az amdS és pyrG szelekciós markerek expressziós vektorba történő bevitelével például a p(JR7281-et kapjuk (10. ábra). E célból NotI helyet hozunk létre, oly módon, hogy a pre-pro-kutináz gén ATG kodonjától upstream irányban 1,2 kb távolságban elhelyezkedő EcoRI helyet szintetikus oligonukleotid (5'-AATTGCGGCCGC-3) felhasználásával NotI hellyé alakítjuk, miáltal a PÜR7282 plazmidot kapjuk. A teljes A. nidulans amdS gént és A. niger var.

awamori pyrG gént saját promotereikkel és terminátoraikkal szegélyező NotI együtt tartalmazó megfelelő DNS fragmenst helyekkel láttuk el, és a PÜR7282 plazmid

NotI helyére vittük be, miáltal a pUR7281 plazmidot kaptuk (10. ábra).

A szintetikus Fusarium solani pisi kutináz gén Aspergillus niger var. awamori-ban más módon történő expresszálásához olyan expressziós vektort készítettünk, melyben az érett kutinázt kódoló szintetikus gén előtt nem a saját pre-pro« • · · szekvenciája, hanem az /1. niger var. awamoz'i exlA pre szekvenciája helyezkedik el.

Az ilyen fúziókhoz előállításához számos melyekben az exlA alkalmas szintetikus kutináz gén adaptor fragmenst szintetizáltunk, pre-szekvenciát kódoló szekvenciát különböző módokon kapcsoltuk az érett kutináz N-terminálisát kódoló szekvenciához. Az 5-ös kazettában az összekapcsolást úgy végeztük, hogy az exlA pre-szekvenciát a kutináz pro-szekvenciájához fuzionáltuk. A 6-os kazettában az exlA pre-szekvenciát az érett kutináz N-terminális gyökéhez fuzionáltuk. A 7-es kazetta azonos a 6-ossal, de ebben a kódolt érett kutináz polipeptid N-terminális gyökét az eredeti glicinről szerinre cseréltük, hogy a jelző-peptid hasításának követelményeihez jobban igazodjon. Az 5-ös, 6-os és 7-es kazettát, lényegében az 1. példában leírtak szerint, szintetikus oligonukleotidőkből állítottuk össze (ld. 7.

ábra). Az

5-ös kazettát a PÜR7210 plazmid 0,1 kb-os

EcoRI-Spel fragmensének helyettesítéséhez használtuk, miáltal a pUR7287 plazmidot kaptuk. A 6-os és

7-es kazettát

PÜR7210

0,1 kb-os

EcoRI-BclI fragmensének helyettesítéséhez használtuk, miáltal a PÜR7287, illetve a pUR7288 plazmidot kaptuk. A

PÜR7287, pUR7288 és pUR7289 plazmidok esetében a 0,7 kb-os BspHI-AflII fragmenst a

PAW14B 7,2 kb-os BspHI-AflII fragmensével ligáltuk, miáltal a PÜR7290, PÜR7291, illetve PÜR7292 plazmidot kaptuk.

A kialakított rDNS vektorokat ezután hagyományos együttes • · · ··· · • · · transzformálás! technikákkal penészgombákba (Aspergillus niger. Aspergillus niger var. awamori) transzformáltuk, és a pre-(pro)-kutináz gént az endoxilanázlI proinoter indukálásával expresszáltuk. Az előállított rDNS vektorokba hagyományos szelekciós markerekkel (pl. amdS vagy pyrG, higromicin, stb.) is építhetünk, s a penészgombákat a kívánt protein expresszálása érdekében a kapott rDNS vektorral transzformálhatjuk, amint azt ebben a példában a pUR7280 esetében bemutattuk (ld. fentebb).

Az érett Fusarium solani pisi kutinázt kódoló régiót a megfelelő pro-szekvenciával vagy a kutináz jelzőszekvenciával vagy az exlA jelző-szekvenciával együtt (vagy ezek nélkül) az Aspergillus niger var. awamori exlA promoter és terminátor szabályozása alatt tartalmazó pUR7280, pUR7281, pUR7290, pUR7291 vagy pUR7292 expressziós vektorokkal transzformált Aspergillus törzseket az alábbi körülmények között növesztettük. Több, 400 ml szintetikus tápközeget (pH - 6,5) tartalmazó 1 literes rázólombikot 10E6/ml végkoncentrációban spórákkal oltottunk. A tápközeg az alábbi összetételű volt (AW tápközeg):

szacharóz	10 g/1
NaNOs	6,0 g/1
KC1	0,52 g/1
KH2PO4	1,52 g/1
MgSO4-7H2O	0,49 g/1
élesztő-kivonat	1,0 g/1
ZnS04-7H20	22 tng/1

• ♦ ·

HsBOa	11 mg/J
MnCl2-4H20	5 mg/1
FeS04-7H20	5 mg/1
CaCl2-6H20	1,7 mg/1
CuS04-5H20	1,6 mg/1
NaH2Mo042H20	1,5 ing/l
Na2EDTA	50 mg/1

Az inkubálást °C-on 24 órán keresztül 200 percenkénti fordulattal Mk rázó inkubáló készülékben végeztük. A növesztés után sejteket szűréssel (0,45 ;m-es filteren) összegyűjtöttük, szacharóz és élesztő-kivonat nélküli AW tápközegben (sóoldat) kétszer mostuk, 50 ml sóoldatban reszuszpendáltuk, és 50 ml sóoldatot tartalmazó 300 ml-es rázólombikokba tettük, melyekhez 10 g/1 végkoncentrációban xilózt adtunk (indukáló közeg). A fenti körülmények között az inkubálást egy éjszakán keresztül végeztük. A kapott tenyészeteket biomassza eltávolítása érdekében miracloth-on szűrtük, és a kutinázt lényegében a 2. példában leírt módon nyertük ki.

7. példa

Fusarium solani pisi kutináz változatok expresszálása

Aspergi11us-okban

Lényegében a 6. példában leírt eljárást követve, de a gomba expressziós vektor előállításához a PÜR7210 plazmid helyett PÜR7257 (N172K) plazmidot alkalmazva Aspergillus niger var.

• · i · aivamorl-ban N172K mutációt tartalmazó Fusarium solani pisi kutináz változatot termeltünk.

Θ. példa

A Fusarium solani pisi kutináz génnel rokon gének azonosítása és izolálása

Különböző gombákból a Fusarium solani pisi kutinázzal különböző fokú homológiát mutató kutinázokat kódoló géneket izoláltunk. A gombatenyészeteket 0,25 % glükózzal kiegészített Hankin, L. és Kolattukudy, P.E. (J. Gén. Microbiol., 31, 457-463, 1968) által leírt 200 ml tápközeget tartalmazó 500 ml rázólombikokban Mk X típusú rázó inkubátor készülékben (100 percenkénti fordulattal) 4 napon keresztül 28 °C-on inkubáltuk. Ennyi idő elteltével a glükóz elhasználódott, s a kútináz-termelést lényegében Ettinger és mtsi. (Biochemistry, 23, 7883-7892, 1987) által leírt módon kutin hidrolizátum hozzáadásával indukáltuk. A tenyészetből szabályos időközönként mintákat vettünk, s azokat standard módszerekkel (ld. 4. példa) lipolitikus aktivitás jelenlétére vizsgáltuk. A lipolitikus aktivitás rendszerint az indukálást követően kb. két nappal mutatható ki, s ekkor a sejteket. standard módszerekkel végzett szűréssel összegyűjtöttük. A micéliumokat mostuk, folyékony nitrogénben fagyasztottuk, s standard módszerekkel liofilizáltuk. A guanidinium-tiocianát eljárással teljes celluláris RNS készítményeket izoláltunk, melyeket lényegében Sambrook, J., Fritsch, E.F. és Maniatis, T.

·

- 58 áltál le irt módon (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1989, ISNB 0-87969-309-6) cézium-kloridős sűrűség-gradiens centrifugálással tisztítottuk. PoliA(+) mRNS frakciókat poliAT traktus mRNS izoláló kit (Promega) alkalmazásával izoláltunk. A poliA(+) mRNS frakciókat a kutinázzal rokon gének expressziójának igazolása érdekében — próbaként a Fusarium solani pisi kutináz gén egy cDNS fragmensének alkalmazásával — standard technikák szerint Northern hibridizációs analízisben alkalmaztuk. A próbával hibridizálni képes anyagot tartalmazó mRNS készítményeket a forgalmazó útmutatásai szerint ZAP cDNS szintetizáló kit (Stratagene, La Jolla) alkalmazásával cDNS szintetizálásához használtuk, miáltal olyan cDNS fragmenseket kaptunk, amelyek a poli-A régiót szegélyező Xhol ragadós véggel, a molekula másik végén pedig EcoRI adaptorral rendelkeztek. A kapott cDNS fragmenseket lainbda ZAPII vektorokban (Stratagene, La Jolla) szensz irányban, irányított klónozással expressziós könyvtárak létrehozásához alkalmaztuk, melyek lehetővé teszik a O-galaktozidáz fúziós proteinek expresszióját (Huse, W.D. és Hansen, C., Strategies, 1, 1-3, (1988). Ezeket a könyvtárakat Fusarium solani pisi kutináz ellen termelt antiszérum alkalmazásával screeneltük.

Más módon, a szintetizált cDNS frakciókat kutináz-specifikus primerek (ld. 2. táblázat) alkalmazásával PCR-screening módszerrel vizsgáltuk. A primerek több gomba kutináz gén aminosav-szekvenciájának összehasonlításából származnak (Ettinger. W.F.. Thukral, S.K. és Kolattukudy. P.E.:

Structure of cutinase gene. cDNS, and the derived amino acid sequence from phytopathogenic fungi, Biochemistry,

7883-7892, 1987).

A PCR reakció kötülményeit minden egyes primer készlethez külön állítottuk be, s kontrolként

Fusarium solani pisi kutinázból származó cDNS-t alkalmaztunk. Azon cDNS készítmények esetében, melyekkel a Fusariiun solani pisi kutinázból származó cDNS-sel azonos körülmények között előállított PCR fragmens hosszához hasonló (vagy nagyobb) specifikus PCR fragmenst tudtunk előállítani, a kapott PCR fragmenst gélelektroforézissel tisztítottuk, és leválasztottuk a gélről.

Egy másik megközelítés szerint specifikus kutináz primereket használva közvetlenül néhány gombatörzs genom-DNS-éhez szintén PCR screening technikát alkalmaztunk, melynek során pozitív kontrollként Fusariiun solani pisi genom DNS-t használtunk. Azon gomba genom-DNS készítmények esetében, melyekkel a Fusariiun solani pisi kutinázból származó cDNSsel azonos körülmények között előállított PCR fragmens hosszához hasonló (vagy nagyobb) specifikus PCR fragmenst tudtunk előállítani, a kapott PCR fragmenst gélelektroforézissel tisztítottuk, és leválasztottuk a gélről,

Az expressziós könyvtár módszerrel vagy (akár cDNS. akár genom-DNS alkalmazásával)

PCR screening módszerrel pozitívnak értékelt törzsek. valamint számos egyéb törzs ·· ···>« ··

esetében nagy rno lekulatömegü genom-DNS-t izoláltunk. A törzseket lényegében Ettinger és mtsi. (1987, ld. fentebb) által leirt módon növesztettük, a genom-DNS-t pedig de Graaf, L.H., H.W.J. van den Broek és J. Visser által leírt módon (Isolation and expression of the Aspergillus nidulans pyruvate kinase gene, Curr. Génét., ±3, 315-321, 1988). izoláltuk. A genom-DNS-t különböző restrikciós enzimekkel emésztettük, és próbaként az analóg cDNS inszert (expressziós könyvtár módszer) vagy a PCR fragmens (PCR screening módszer) vagy a Fusarium solani pisi kutináz gén (inás törzsek esetében) alkalmazásával Southern hibridizációval vizsgáltuk. A kutináz génekről fizikai térképet készítettünk. A genom-DNS egy megfelelően emésztett mintáját gélelektroforézissel méret szerint frakcionáltuk, a megfelelő méretű fragmenseket leválasztottuk a gélről, és pUC19 plazmidba szubklónoztuk. E genom könyvtárakat a megfelelő cDNS inszerttel (expressziós könyvtár módszer) vagy a PCR fragmenssel (PCR screening módszer) screeneltük, miáltal a kutináz gének genom kópiáit tartalmazó kiónokat kaptunk. E géneket mindkét irányban megszekvenáltuk. Az intronokat a megfelelő cDNS szekvenálásával vagy más kutináz szekvenciákkal történő összehasonlítással (Ettinger és mtsi, 1987, ld. fentebb) azonosítottuk. Az érett kutináz polipeptid N-terminális végét szintén ilyen összehasonlításból származtattuk. Standard PCR technikák alkalmazásával az intronokat eltávolítottuk, közvetlenül a nyitott leolvasási keret mellé downstream irányban HindlII helyet vittünk be, s a Saccharomyces cerevisiae invertáz gén

pre-szekvenciát kódoló szekvenciáját (amely előtt egy SacI hely található, vő. a 8-as kazettával, 3. ábra) az érett kutináz N-terininálisát kódoló szekvenciához fuzionáltuk. A kapott, a kutináz géneket a Saccharomyces cerevisiae invertáz pre-szekvenciát kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazó SacI-HindlII fragmenseket a pUR7241 7,3 kb-os SacI-HindlII fragmenséhez ligáltuk (ld. 4. ábra), s az SU31 S. cerevisiae törzsbe transzformáltuk. A gomba kutinázokat lényegében a 4. példában leírtak szerint expresszáltuk és nyertük ki a tenyésztő közegből.

9. példa

Az N172K Fusarium solani pisi kutináz változat “mosás közbeni” aktivitása

Az N172K kutináz változat zsíreltávolító hatását a vad típusú Fusarium solani pisi kutinázéval hasonlítottuk össze. A teszt során a zsíreltávolító hatás kimutatásához brómozott olívaolajjal szennyezett szövetet használtunk. A tesztszöveten a zsír mennyiségét fentebb leírt módon, a szöveten lévő bróm röntgensugaras fluoreszcencia spektrométriával kimutatott mennyiségének mérésével határoztuk meg.

A vad típusú Fusarium solani pisi kutináz (WT) és az N172K változat szennyezés eltávolító enzimatikus hatását több kísérleti körülmény között 3LU/ml dózisnál határoztuk meg.

VI. TÁBLÁZAT %-os szennyeződés %-os szennyeződés T Detergens Vízeltávolítás (WT) eltávolítás N172K (°C) készítmény kem.(FH)

4,9	10,1	40	A	(1	g/1)	6
1,6	6,7	40	B	(2	g/1)	6
20,2	24,6	40	C	(2	g/1)	27
13,2	13,4	40	B	(1	g/1)	27
30,8	40,6	30	C	(2	g/1)	27
17,4	22,4	30	B	(2	g/1)	27

Az A, B és C detergens készítmények összetétele az alábbi volt (m/m %)

A készítmény

Vegyület m/m %

Nemionos felületaktív

Cis-isalkohol 10.5-13EO	9,5
Nátrium-szülfát	38,6
Nátrium-karbonát	40,4
Nátrium-szilikát (NazO:SÍ2O - 2,4)	7,3
Víz	4,2

• · ·»·4 ·· ···· • · w * V · ·· <> V 4 ····

- 63 B készítmény

Vegyület	m/m %
DOBS	6,4
Szappan	1,7
Synperonic A7	3,0
Zeolit	43
Sokolan CP7	9,9
vízüveg	1,2
Nátrium CMC	0,77
Nátrium-karbonát	10,16
NaOH	2,6
Víz	100 %-ra

’C készítmény

Vegyület	m/m %
Kókusz primer alkil-szulfát	5,2
Nemionos felületaktív Ci2-i5alkohol	7 E0 5,2
Nemionos felületaktív Ciz-isalkohol	3 E0 6,6
Nátrium-szilikát	0.45
Zeolit 4A	32,00
Nátrium-karbonát	11,52
Keményített faggyú szappan	2,00

A mosás közbeni, olajos szennyeződést eltávolító hatás fokozódása a vad típusú Fusarium solani pisi kutinázéhoz viszonyítva különböző mosási feltételek között nyilvánvaló.

A 13. ábrán a 2 g/1 koncentrációjú C detergens készítmény alkalmazásával különböző enzimkoncentrációkkal 30 °C-on 27 °FH vízkeménység mellett 30 percig végzett mosással kapott mosás közbeni teljesítményt mutatjuk be.

Az összehasonlítás érdekében ugyanezeket a kísérleteket Lipolase™ alkalmazásával is elvégeztük. Valamennyi körülmény között az N172K változat volt a hatásosabb.

12. példa

Az E201K Fusarium solani pisi kutináz változat mosás közbeni aktivitása

Az E201K kutináz változat zsíreltávolító hatását 2 g/1 koncentrációjú C detergens készítmény (ld. 11. példa) alkalmazásával 30 °C-on 27 °FH vízkeménység mellett 30 percig végzett mosással a vad típusú Fusarium solani pisi kutinázéval hasonlítottuk össze. A teszt során a zsíreltávolító hatás kimutatásához brómozott olívaolajjal szennyezett szövetet használtunk. A tesztszöveten a zsír mennyiségét fentebb leírt módon, a szöveten lévő bróm röntgensugaras fluoreszcencia spektrometriával kimutatott mennyiségének mérésével határoztuk meg.

• ·

- 65 Az eredményeket a 14. ábrán mutatjuk be. A mosás közbeni olajos szennyeződést eltávolító hatás fokozódása a vad típusú Fusarium solani pisi kutinázéhoz viszonyítva nyilvánvaló. Az összehasonlítás érdekében ugyanezt a kísérletet Lipolase™ alkalmazásával is elvégeztük. Azt találtuk, hogy az E201K kutináz változat egyértelműen hatásosabb volt.

13. példa

Az A85F Fusarium solani pisi kutináz változat mosás közbeni aktivitása

Az E201K kutináz változat zsíreltávolító hatását 2 g/1 koncentrációjú C detergens készítmény (ld. 11. példa) alkalmazásával 30 °C-on 27 ’FH vízkeménység mellett 30 percig végzett mosással a vad típusú Fusarium solani pisi kutinázéval hasonlítottuk össze. A teszt során a zsíreltávolító hatás kimutatásához brómozott olívaolajjal szennyezett szövetet használtunk. A tesztszöveten a zsír mennyiségét fentebb leírt módon, a szöveten lévő bróm röntgensugaras fluoreszcencia spektrometriával kimutatott mennyiségének mérésével határoztuk meg.

Az eredményeket a 15. ábrán mutatjuk be. A mosás közbeni, olajos szennyeződést eltávolító hatás fokozódása a vad típusú Fusarium solani pisi kutinázéhoz viszonyítva nyilvánvaló. Az összehasonlítás érdekében ugyanezt a kísérletet Lipolase™ alkalmazásával is elvégeztük. Azt

találtuk, hatásosabb hogy az A85F kutináz változat egyértelműen volt.

Claims (25)

1. - 67 Szabadalmi igénypontok

   1. Kutináz változat., amely egy kiindulási kutináz változata, s amelyben az aminosav-szekvenciát úgy módosítottuk, hogy az enzim felületi hidrofóbitása fokozódjon.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti kutináz változat, melyben az enzim lipid érintkezési zónával szomszédos felületének hidrofóbitását oly módon változtattuk meg, hogy megnövekedett lipid érintkezési zóna alakuljon ki.

   3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti kutináz változat, melyben a hidrofóbitást egy vagy több aminosav valinnal, leucinnal, izoleucinnal, fenilalaninnal, triptofánnal vagy metioninnal végzett helyettesítésével fokoztuk. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kutináz

   változat, melyben az aminosav szekvenciát úgy változtattuk meg, hogy a felületi hidrofóbitás fokozása mellett egy vagy több pozitív töltés is beépüljön.
3. 5. A 4. igénypont szerinti kutináz változat, melyben a pozitív töltést egy vagy több lizin vagy arginin gyök

   bevitelével építettük be. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat., melyben a helyettesített aminosav-gyök kis

   • β ·

   - 68 oldallanccőil rendelkezik, s az említett aminosav-gyököt előnyösen az alanin, szerin és glicin közül közül választjuk ki.
4. 7. Az 1-6. igényponok bármelyike szerinti kutináz változat, melyet eukarióta kiindulási kutinázból alakítottunk ki.
5. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, melyet olyan kiindulási kutinázból alakítottunk ki, amely a Fusarium solani pisi-bői származó kutináz ellen termelt antitestekkel immunológiailag kereszt-reaktív.
6. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, melyet kiindulási kutinázként a Fusarium solani pisi-bői származó kutinázból alakítottunk ki.
7. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, melyben a módosított gyökök a molekula azon részében helyezkednek el, amelyet a Fusarium solani pisi kutináz 116-120. aminosav-gyökeinek alfa szénatomjaihoz vagy egy másik kutináz megfelelő alfa szénatomjaihoz a legkisebb négyzet illeszkedést mutató vektor, és az erre a vektorra merőleges, a 117. gyök alfa szénatomját vagy egy másik kutináz megfelelő alfa szénatomját tartalmazó sík határoz meg.
8. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, melyben a módosított gyökök a molekula azon részében helyezkednek el, amely a Fusarium solani pisi kutináz 116-120. aminosav-gyökeinek alfa szénatomjaihoz a legkisebb négyzet illeszkedést mutató vektorra merőleges, a 117. gyök alfa szénatomjától 15 Á távolságra lévő első sík, és az említett első síkkal párhuzamos, a 117. gyök alfa szénatomját tartalmazó második sík között helyezkedik el.
9. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, melyben a módosított gyökök a Fusarium solani pisi kutináz aminosav-szekvenciájának egy vagy több alábbi helyén: 17., 18., 19., 40., 42-46., 50., 53., 54., 58., 74.,

   75., 78., 80-88., 91., 92., 93., 95., 96., 97., 99., 100.,

   119., 150-156., 158., 160.. 168., 169., 170., 172., 173.,

   174., 176., 179., 180-190., 192., 193., 194., 196., 197.,

   198., 201., vagy egy másik kutináz szekvenciájának megfelelő helyein helyezkednek el.
10. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, melyben a módosított gyökök a Fusarium solani pisi kutináz aminosav-szekvenciájának egy vagy több alábbi helyén: 19., 41., 45., 49., 54., 58., 75., 76., 82., 85.,

    92., 93., 100., 127., 128., 172., 173., 179., 183., 184.,

    185., 189., 190., 194., 197., 201., vagy egy másik kutináz szekvenciájának megfelelő helyein helyezkednek el.
11. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, melyben a T19V, G41A, T45K, T45P, *I49a, S54I, • · · · · · ·· ·· ·· * · · · · · « • · · · · · · ·· · · · · · ·

    - 70 N58R, G75R, Α76Ρ. G82A. D83S, A85F. A85V. S92R, A93V, L99K.

    G100R, A127L, A128F. N172K, T173I, T179F, I183F, V184I,

    A185L, L189F, A190L. D194R, G197V, E201K módosításokat a Fusarium solani pisi kutináz aminosav-szekvenciájában vagy vagy egy másik kutináz szekvenciájának megfelelő helyein végeztük.
12. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változat, melyben az

    A85F, N172K, E201K módosításokat a

    Fii sári um solani pisi kutináz aminosav-szekvenciájában vagy vagy egy másik kutináz szekvenciájának megfelelő helyein végeztük.
13. 16.

    Eljárás az 1-15. igényponyok bármelyike szerinti kutináz változat előállítására, azzal jellemezve, hogy a kutináz változatot kódoló. rDNS-technikával előállított gént tartalmazó rDNS-technikával módosított mikroorganizmust fermentatív körülmények között tenyésztjük, mikroorganizmus által termelt kutináz fermentléből történő elválasztásával, vagy a mikroorganizmus sejtek fermentléből történő elkülönítésével, s az elkülönített sejtek feltárásával a kutináz változatból készítményt állítunk elő, oly módon, hogy a kutináz változatot fizikai vagy kémiai bekoncentráló vagy tisztító módszerekkel az említett fermentléből vagy az említett sejtekből bekoncentráljuk vagy részlegesen tisztítjuk.
14. 17. rDNS-technikával módosított mikroorganizmus, azzal

    F jellemezve, hogy az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változatot kódoló rDNS vektorral transzformáltuk, miáltal képes expresszálni az említett kutináz változatot.
15. 18.

    A 17. igénypont szerinti rDNS-technikával módosított mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy olyan, kutináz változatot kódoló gént hordoz, melyet úgy Juttatunk az említett mikroorganizmusba, hogy

    5' végét gazdaszervezetben Jelző- vagy szekréciós-szekvenciaként funkcionáló (módosított) pre-szekvenciát kódoló génfragmenshez fuzionáltuk.
16. 19. A 17.

    vagy 18. igénypont szerinti, rDNS-technikával módosított mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy az említett gazdaszervezet eukarióta, például a Saccharomyces,

    KI uyveromyces vagy a Hansenula nemzetségbe tartozó élesztő, vagy az Aspergillus nemzetségbe tartozó gomba.
17. 20. A

    17-19.

    igénypontok bármelyike szerinti, rDNStechnikával módosított mikroorganizmus, amely az 1-15.

    igénypontok bármelyike szerinti kutináz változatot kódoló rekombináns

    DNS vektort hordoz, azzal Jellemezve, hogy az említett mikroorganizmus auxotróf mutáns, melyet egyik szülői sejtjében az auxotrófia markert kódoló gén génátrendezésével hoztunk létre.
18. 21. Polinukleotid. amely az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti érett kutináz változatot kódoló bázis-szekvenciával • ·

    - 72 vagy tünkéionalis megfelelőjével vagy mutánsával rendelkezik, s amelyben az utolsó transziáit kodont egy stop kodon követi, s az érett enzimet kódoló nukleotidszekvenciától közvetlenül upstream irányban tetszés szerint a kutináz pre-szekvenciáját kódoló nukleotid-szekvenciával rendelkezik.
19. 22. Polinukleotid, amely az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti érett kutináz változatot kódoló bázis-szekvenciával rendelkezik, s amelyben az utolsó transziáit kodont egy stop kodon követi, s az érett enzimet kódoló nukleotidszekvenciától közvetlenül upstream irányban tetszés szerint a megfelelő pre-szekvencia legalább egy részét, és/vagy a kiválasztott gazdaszervezet számára megfelelő jelző- vagy szekréciós-szekvenciát kódoló nukleotid-szekvenciával rendelkezik.
20. 23. Polinukleotid, amely az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti érett kutináz változatot kódoló bázis-szekvenciával vagy funkcionális megfelelőjével vagy mutánsával rendelkezik, s amelyben az eredeti organizmusból származó, kutináz változatot kódoló nukleotid-szekvenciát úgy módosítottuk, hogy legalább egy, de előnyösen annyi kodon, amennyi lehetséges, néma mutáció tárgyát képezze, hogy az eredetiekkel egyenértékű aminosavakat kódoló, és a 17-20. igénypontok valamelyike szerinti új gazdaszervezet számára előnyös kodonok alakuljanak ki, miáltal az említett gazdaszervezetek sejtjeiben a bevitt, fokozott stabilitású • ·

    - 73 V * gének szamara alkalmas messenger-RNS-t áll rendelkezésre.
21. 24. A 21-23. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid, melyben a pro- vagy az érett kutináz változatot kódoló nukleotid-szekvenciától upstream irányban a 17-20. igénypontok bármelyike szerinti gazdaszervezet számára megfelelő jelző- vagy szekréciós jelet kódoló nukleotid-szekvencia helyezkedik el.
22. 25. Rekombináns vektor, amely képes egy kutináz változatot kódoló nukleotid-szekvencia expressziójának irányítására, s amely az alábbi komponensekből áll:

    a) érett kutináz változatot, prekutinázt vagy megfelelő

    prekutinázt kódoló kétszálú (ds; double-stranded) DNS, amelyben a pre-szekvencia legalább egy részét egy, a kiválasztott gazdasejt számára előnyös szekréciós jeltől

    közvetlenül downstream irányban eltávolítottuk, azzal a feltétellel, hogy amennyiben a gén transzlálódó része nem az

    ATG kodonnal kezdődik, a szekvencia elejére ATG kodont kell helyezni, továbbá, hogy a gén transzlálódó részének minden esetben megfelelő stop kodonnal végződik, vagy ilyen kodont kell hozzáadni;

    b) a kutináz változatot kódoló kétszálú DNS [(a) komponens] ”+ szálától upstream irányban elhelyezkedő, a kiválasztott gazda számára megfelelő expressziós regulon;

    c) a kutinázt kódoló kétszálú DNS [(a) komponens] + szálától downstream irányban elhelyezkedő, a kiválasztott gazda számára megfelelő terminátor szekvencia;

    • · » · · • ··» • * · 9 9 dl) a kétszalú DNS kiválasztott gazda genomjába való integrációját elősegítő nukleotid-szekvenciák; vagy d2) a kiválasztott gazda számára megfelelő replikációs kezdőhely;

    el) tetszés szerint (auxotróf) szelekciós marker;

    e2) tetszés szerint, a kiválasztott gazdában a kutináz prekurzor alakjának érésében és/vagy szekréciójában szerepet játszó proteineket kódoló kétszálú DNS szekvencia.
23. 26. A 25. igénypont szerinti rekombináns DNS vektor, amely a korábban meghatározott polinukleotidtól upstream és/vagy downstream irányban a kutináz hatékony expresszióját elősegítő további szekvenciákat tartalmaz.
24. 27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti rekombináns DNS vektor, amely egy auxotróf markert kódoló régióból és egy hibás promoter régióból álló auxotróf markert hordoz.
25. 28. Enzimatikus detergens készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti kutináz változatot tartalmaz.

    A meghatalmazott: