CN1127012A - 具有乙酰酯酶活性的酶 - Google Patents

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Abstract

具有乙酰酯酶活性的酶，该酶包括氨基酸序列IxFGDxYYT，其中x代表任何氨基酸残基。该酶对乙酰化的木聚糖和乙酰化的甘露聚糖表现有活性，并可用于修饰或降解含植物材料。

Description

具有乙酰酯酶活性的酶
发明的所属领域
本发明涉及具有乙酰酯酶活性的酶，生产该酶的方法，以及含有一种或多种所说酶的酶制剂。
发明的背景
各种生物学植物材料中，(主要在木聚糖、甘露聚糖和果胶聚合物中)，许多多糖均可以乙酰化形式存在〔1〕。乙酰基团的生物学意义尚不完全明了。已经知道，乙酰基团常常可防止多糖被水解酶降解。因此，为了实现部分或完全地酶促破坏乙酰化的多糖，使这些多糖去乙酰化是必要的〔2—4〕。
因此，有人预料〔2，3〕乙酰酯酶对于食品工业，主要在水果和蔬菜加工中如果汁生产、造酒或果胶提取中是一种重要的酶，其中可以利用它们的修饰乙酰化多糖成为易降解形式的能力。
已知许多真菌都含有能够使乙酰化的多糖去乙酰化的酶，这些酶通常被称为乙酰酯酶。已纯化了某些真菌乙酰酯酶〔5—9〕。然而，由于缺少充分鉴定特性的均一底物，以及检测乙酚释放的方法困难且耗时而阻碍了对这些酶的研究。迄今尚没有描述这些酶的工业应用。
WO92/19728描述了从真菌菌种棘孢曲霉(Aspergillumaculeatus)中分离的半乳糖醛酸—鼠李聚糖(rhamnogalacturonan)乙酰酯酶。该酶对果胶发状区域中的乙酰化半乳糖醛酸残基是特异的。EP507369描述了编码分离自黑曲霉(Aspergillusniger)之乙酰木聚糖酯酶的DNA序列。
为了许多目的，期望提供基本上没有其他成分的乙酰酯酶。以这种方式，有可能产生适于特殊目的的酶制剂，这些制剂可含有单一乙酰酯酶或其随意组合，并可含有或不含其他多糖降群酶。为此目的，方便的办法是使用重组DNA技术制取单一成分的乙酰酯酶。
发明的概要
现令人惊奇地发现，除上述半乳糖醛酸鼠李聚糖乙酰酯酶外，真菌菌种棘孢曲霉还产生许多具有有用酶促活性的新的乙酰酯酶。尽管这些酶只是以很低的量(占总的酶产生量的0.1％以下)产生的，但本发明人已成功地纯化并从性质上鉴定了这些新的酶。
因此，本发明涉及具有乙酰酯酶活性的新的酶，特别是涉及单一成分的乙酰酯酶。
更具体地说，本发明的第一个方面涉及具有乙酰酯酶活性的酶，该酶包含序列表SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列，其中X代表任何一种氨基酸残基。
本文所使用的术语“具有乙酰酯酶活性”是指一组酶，其成员具有能够按下文材料和方法部分中给出的程序裂解乙酰酯酶底物—对位硝基苯酚乙酸酯(PNP—乙酸酯)这一共有特征。再者，在某些情况下它们也可能作用于其他乙酰化非糖底物。这些酶统称为乙酰酯酶。可以理解到，本文公开的各种乙酰酯酶的天然底物在不同的乙酰化多糖，例如乙酰化甘露聚糖、乙酰化木聚糖、乙酰化半乳糖醛酸—鼠李聚糖及乙酰化果胶间可能有所变化。
在进行导致本发明的研究工作中，令人惊奇地发现，由棘孢曲霉中分离的不同的乙酰酯酶包含SEQ ID NO.1中所示的部分氨基酸序列。该序列的存在可能是乙酰酯酶，特别是由棘孢曲霉或其他相关生物产生的乙酰酯酶的特征。如上所述，X可以是任何氨基酸残基，其在本文中可被理解为包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰按、天冬氨酸、半脘氨酸、容氨酰胺、容氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、卤氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
第二个方面，本发明涉及具有乙酰酯酶活性的酶，该酶是对乙酰化木聚糖及乙酰化甘露聚糖有活性的。据本发明人所知，以前尚没有公开过对这两种底物都有活性的酶。因此，已知乙酰酯酶是很特异的，因为它们只使一种类型的乙酰化碳水化合物去乙酰化。根据本发明的这一个方面的乙酰酯酶的优点是，它可用于一种以上类型的底物。
本文使用的术语“对乙酰化的木聚糖的活性”和“对乙酰化的甘露聚糖的活性”，意思是指该酶能够分别水解见于乙酰基团与木聚糖之间和乙酰基团与甘露聚糖之间的酯键。
本发明的再一个方面涉及具有乙酰酯酶活性的酶，该酶与对抗衍生于棘孢曲霉，CBS101.43纯化的乙酰酯酶的抗体发生免疫学反应并具有约44或35DKa的分子量。
本文限定的是分子量约44KDa或35KDa的棘孢曲霉乙酰酯酶。如众所周知，测得的给定酶的分子量的确切数值取决于其检测中使用的方法。因此，即使所使用的分子量检测法只稍有不同，和/或由产生不同的人进行分子量检测时，都可能出现所测得的真实数值的变化。因此，应在这一基础上估计本文给出的酶的分子量，并最好解释为一个接近所述真实数值的范围，而不是其准确数值。如果用本领域已知的其他适当的方法(如质谱法、凝胶过滤或沉淀法)而不是实际用于本发明的方法检测酶的分子量(详见下文材料和方法部分所述)，则可望得到与本申请实际给出者有所不同的分子量。
本文中使用的术语“衍生于”不仅是指由CBS101.43菌株产生的乙酰酯酶，而且还包括由分离自CBS101.43菌株的DNA序列编码的和在用所说的DNA序列转化的宿主生物体中产生的乙酰酯酶。
本发明的再一个方面涉及具有乙酰酯酶活性的酶，该酶是由包含SEQ IDNO.4中所示之DNA序列的DNA序列编码的。
应明确的是，由包含SEQ ID NO.4中所示DNA序列之类似物的DNA序列编码的酶也被看作是本发明范围之内的。本文中使用的术语“类似物”被理解为包括编码具有乙酰酯酶活性之酶的任何DNA序列，并且其与SEQ ID NO.4中所示的DNA序列至少70％同源，包括SEQ ID NO.4中所示DNA序列的部分序列。类似DNA序列可以是在下述条件下编码乙酰酯酶之DNA相同的探针杂文的DNA序列：于大约40℃在5×SSC中预浸渍并在5×SSC、5XDenharat氏溶液、50mM磷酸钠(pH6、8)，以及50mg变性的超声处理的小牛胸腺DNA的溶液中预杂交1小时，然后在添加有50μCi32P—dCTP标记之探针的相同溶液中，于大约40℃下杂交18小时，再于2×SSC、0.2％SDS中于40℃洗三次共30分钟。类似DNA序列与SEQ ID NO.4中所示的序列至少80％，如至少90％同源，且最好与所说的序列至少95％同源。
可以从例如另一种生物体中分离或基于SEQ ID NO.1—3中所示的氨基酸序列制备类似DNA序列，例如可以导入并不产生另一个乙酰酯酶的氨基酸序列，但相当于在其中导入3DNA物建体之宿主生物体的密码于用法的核苷酸取代，或者导入将产生不同的氨基酸序列并因此有可能产生不同的蛋白质结构后者会产生与天然酶有不同性质的乙酰酯酶突变体的核苷酸取代。可能的修饰的其他例子是在序列中插入一个或多个核苷酸，在序列的每个末端加入一个或多个核苷酸，或者在序列的任一末端或在序列内删除一个或多个核苷酸。
本发明的再一个方面涉及用于降解植物细胞壁成分的酶制剂，所说的制剂富含具有如上所述的乙酰酯酶活性的酶，还涉及酶或酶制剂的各种应用。
发明的详细描述
根据一个实施方案，包含SEQ ID NO.1中所示共有氨基酸序列的本发明的酶是包含SEQ ID NO.2中所示N末端氨基酸序列的酶。该酶在下文中被称为乙酰酯酶I。
本文中术语“N末端氨基酸序列”在其常规含义上应被理解为成熟(被分泌或经过加工的)酶的N末端氨基酸序列，即在信号序列或前序列已被切掉后所保留的N末端序列。
本发明的乙酰酯酶I较好是由包含SEQ ID NO.4中所示DNA序列的DNA序列或所说DNA序列的类似物编码的，所说的类似物与所说的DNA序列至少有80％，较好至少有90％同源。
乙酰酯酶I较好有大约44KDa的分子量，pI范围为4.5—5.1，和/或最适pH范围为大约6.0—9.0，例如在本文所述条件下测得最适pH范围约为7.0—7.5。
已发现本发明的乙酰酯酶I，当用下文材料和方法部分中所述的检测法检测时，基本上对乙酰化木聚糖、乙酰化甘露聚糖和/或乙酰化半乳糖醛酸—鼠李聚糖没有活性。此外，已发现乙酰酯酶I是没有脂肪酶活性的。
本发明的另一种酶是包含SEQIDNO.3中所示N末端氨基酸序列的酶，其中可以是任何氨基酸残基。在下文中该酶被称为乙酰酯酶II。
已发现本发明的乙酰酯酶II是对乙酰化木聚糖或乙酰化甘露糖有活性的，而对乙酰化串乳糖醛酸—鼠李聚糖则基本上没有活性。事实上，据信本发明的乙酰酯酶II是首次公开的对乙酰化木聚糖和乙酰化甘露聚糖都有活性的酶。
目前，本发明的乙酰酯酶II较好是如上所示氨基酸序列中的X为苏氨酸残基的酶。
本发明的乙酰酯酶II较好有范围为4～5，如大约4.5的pI，和/或大约35KDa的分子量。
应明确的是，上文鉴定的酶的同系物应看作是本发明的范围内的。术语“同系物”是指N末端氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基分别不同于SEQ ID NO.2或3中所示序列的有乙酰酯酶活性，而基本上不损伤酶之特征性乙酰酯酶活性的酶。例如，同系物可以是经适当地修饰编码该氨基酸序列的DNA序列，如果导致向序列的N和C末端之一或两者加入一个或多个氨基酸残基、在氨基酸序列的一个或多个不同位点取代一个或多个氨基酸残基、在氨基酸序列的一个或多个位点的一个或两个末端删除一个或多个氨基酸残基，或在氨基酸序列的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸残基的适当修饰而制备本发明乙酰酯酶I或II的天然存在的或遗传工程改造的变异体。
优选的是同源性酶的N末端氨基酸序列为至少70％同源，如分别与SEQ IDNO.2或3中所示之N末端氨基酸序列至少80％、90％或95％同源。
借助本发明，有可能提供高度纯化形式的乙酰酯酶，即，用本文材料与方法部分中所述的SDS凝胶电泳法测定其纯度大于80％，且最好大于90％或95％。
虽然可从包括植物和动物在内的任何来源得到具有乙酰酯酶活性的本发明的酶，但目前优选的是微生物来源的酶。
本文中，术语“微生物来源”意欲包括细菌和真菌(如丝状真菌或酵母)。术语“可得到的”意欲包括可从上述任何来源回收的酶，或者可由分离自上述来源的DNA或基于这些来源的DNA制备的DNA序列编码并表达的酶。
特别是，本发明的确可以得自真菌更具体地说是曲霉属特别是棘孢曲霉或黑曲霉菌株木霉(Trichoderma)的菌株，特别是T.harzianum，T.reesie，或镰孢霉属(Fusarium)的菌株，特别是尖镰孢(F.oxysporum)，可得自酵母属的菌株，特别是酿酒酵母。
作为一个例子可用本领域已知的纯化方法，包括超滤、柱层析、凝胶过滤等，以及这些方法的适当组合，从任何适当的生物体如棘孢曲霉的培养物中回收有乙酰酯酶活性的本发明的酶。继后可以检测从这些方法制得的含蛋白质部分的乙酰酯酶活性。下文实施例1中给出了整个纯化方案的更详细的描述。
虽然可用上述方法生产本发明的酶，但目前优选的是利用适于这一目的的重组DNA技术。因此，本发明的酶最好经过表达从编码该酶的DNA序列而产生的，所说的DNA序列则是从上述适当生物体的DNA或基因组文库分离的。适当的生物体的优选例子是棘孢曲霉CBS101.43，公众可从Centeraalbureall voorSchimmelcultures，Delft，NL得到该菌株。
例如可经筛选适当生物体如棘孢曲霉的cDNA文库，并选择与基于所说酶之氨基酸序列而制备的DNA探针杂交的克隆，以分离编码该酶的DNA序列(如上述序列)。杂交可在本领域已知的条件下，例如上述与类似DNA相关联的条件下完成。
另外，也可以经筛选上述任何生物体，特别是棘孢曲霉之菌株的cDNA或基因组文库，并按上述方法分离表达乙酰酯酶活性的克隆，以分离DNA序列。然而，当在其本身表达乙酰酯酶活性的细胞中制备cDNA或基因组文库时，该后一种方法可能受到限制，并因此而产生假阳性筛选结果。特别是，当使用PNP—乙酸酯作为底物时，如期望由真核细胞表达乙酰酯酶活性，则会出现假阳性结果。
然后可用标准程序从克隆中分离以上述任一方法选择的适当的DNA序列。
继而可将DNA序列插入重组表达载体中。所用载体可以是常规用于重组DNA操作的任何一种载体，对载体的选择常常取决于它将要导入的宿主细胞。因此，载体可以是一种自动复制载体，即作为染色体外整体存在的载体，其复制是不依赖于染色体复制的，如质粒。另外，载体也可以是当被导入宿主细胞内时，可整合到宿主细胞基因组中，并与它已整合进的宿主细胞的染色体一起复制的载体。
在载体中，应将编码乙酰酯酶的DNA序列可操作地连接到适当后动子和终止子序列上。后动子可以是在选择的宿细胞中显示有转录活性，并且可以衍生于编码同源或异源于宿主细胞之蛋白质的基因的任何DNA序列。用于连接乙酰酯酶之DNA序列、后动子和终止子的方法，以及将它们插入适当载体中的方法是本领域技术人员熟知的(例如参见Sambrook et al，1989)。
用编码本发明的酶的DNA序列转化的宿主细胞较好是真核细胞，特别是如酵母或丝状真菌细胞等真菌细胞。具体地说，细胞可属于曲霉属的菌种，最好是米曲霉(A oryzae)或黑曲霉(A.niger)。可以用涉及原生质体形成的原生质体转化的方法转化真菌细胞，然后以已知的方式再生细胞壁。EP238023(Novo NordiskA/S)中描述了作为宿主微生物的曲霉菌的使用，该文献的内容列入本文作为参考。宿主细胞还可以是酵母细胞，如酵母属的菌株，特别是酿酒酵母。
在另一个方面，本发明涉及生产本发明的酶的方法，其中在允许产生该酶的条件下培养用编码该酶的DNA序列转化的适当的宿主细胞，并从培养物中回收所产生的酶。
用于碚养被转化的宿主细胞的培养基可以是适于生长所说的宿主细胞的任何常规培养基。所表达的乙酰酯酶可方便地分泌到培养基中并可用已知的方法从中回收之，这些方法包括经离心或过滤从培养基中分离细胞、借助盐如硫酸铵沉淀培养基的蛋白质成分，然后进行层析如离子交换层析，亲和层析等。
除了用于制备本发明的乙酰酯酶外，还可用编码此乙酰酯酶的DNA序列失活或破坏编码乙酰酯酶的基因。因此，为了某些应用，存在于所使用的多糖底物上的乙酰基因可能是重要的，而不经乙酰酯酶的作用除去之。在某些将使和树胶作为底物的应用中即可能是这种情况。因此，乙酰酯酶对这些底物的作用可能是不期望有的。
因此预期可以使用编码本发明的乙酰酯酶的DNA序列(如SEQ ID NO.4所示的DNA序列)或其部分来避免为这些应用所使用的多糖降解酶制剂中乙酰酯酶活性的存在，其中底物上乙酰基因的存在是合乎要求的。更具体地说，预期可以使用编码本发明的乙酰酯酶的DNA序列，以破坏将或失活将用作基本上没有或只包含小量乙酰酯酶的多糖降解生产菌的生物体中存在并有活性的乙酰酯酶基因。
可经制备乙酰酯酶基因的反义序列并按照已知的反义技术使用该反义序列失活所研究的乙酰酯酶基因，以方便地完成失活作用。因而，可以产生能够生产只有小量(或基本上没有)不需要之乙酰酯酶活性的多糖降解酶的新的产生酶的生物体，如微生物。
再一个方面，本发明涉及用于降解或修饰植物细胞壁成分的酶制剂，所说的制剂富含有上述乙酰酯酶活性的酶。
已富集了本发明的酶的酶制剂例如可以是包含多种酶促活性的酶制剂。特别是该酶制剂包含多种植物细胞壁降解酶，如Pulpzyme、Gamanase、Pectinexr、Pectinex Ultre SPr、Celluclaet或Celluzyme(所有这些酶制剂都得自Novo Hordisk A/S)。
本文中，术语“富含”意指已增加了酶制剂的乙酰酯酶活性，如富集因子至少为1.1，而这种增加一般是由于加入按上述方法制备的本发明的酶。
另外，富含有乙酰酯酶活性之酶的酶制剂可以是包含本发明的酶作为主要酶促成分的酶制剂，即单成分酶制剂。
可以按照本领域已知的方法，并可以液体或干燥制剂的形式制备酶制剂。例如，酶制剂可以是颗粒或微颗粒形式的。可以按照本领域已知的方法稳定将包含于制剂中的酶。
除了本发明的乙酰酯酶外，本发明的酶制剂可含有一种或多种其他植物细胞壁降解酶，例如有纤维素水解、木聚糖水解、甘露聚糖水解或果胶水解活性的酶，如2—阿拉伯糖苯酶、木聚糖酶、2—萄聚糖苯酶、β—木糖苷酶、甘露聚糖酶、β—甘露糖苷酶、2—半乳糖苷酶、阿拉伯聚糖酶、半乳糖醛酸鼠李聚糖酶、半乳聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶溶解酶、果胶酸盐溶解酶、萄聚糖酶、2—半乳糖醛酸苷酶或果胶甲基酯酶。
可借助属于曲霉属的微生物，较好是黑风霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉、或木霉属的微生物产生其他的酶。
较好使用根据本发明的酶制剂作为降解或修饰植物细胞壁材料，以及来源于植物细胞壁之含木聚糖或苷露聚糖材料的试剂。
下面给出的是优选使用的本发明的酶制剂。可基于本领域已知的方法来确定本发明酶制剂的剂量及使用该制剂的其他条件。
已知许多多糖都是乙酰化的，如硬木、软木或谷物中的乙酰化木聚糖、软水中的乙酰化半乳甘露聚糖和半乳萄甘露聚糖、糖甜菜中的乙酰化果胶、双子叶植物的乙酰化半乳糖醛酸—鼠李聚糖和乙酰化葡聚糖，以及乙酰化树胶如梧桐树胶(得自苹婆树)和黄原胶(细菌树胶)。
因此，使用本发明的乙酰酯酶与没有其他木聚糖水解酶(特别是β—木糖苷酶)或者有有限的其他木聚糖水解酶活性的木聚糖酶结合，以将木聚糖降解为聚寡糖是十分有利的。这样的寡糖可用作填充剂。
经完全或部分地除去木聚糖的侧支链将有利于由本发明的乙酰酯酶连同含木聚糖酶的酶制剂降解木聚糖。可用温和的酸处理或用2—阿拉伯糖苷酶除去阿拉伯糖侧链基因，并可用2—萄糖醛酸苷酶除去萄糖醛酸侧链。
经乙酰酯酶和木聚糖酶，或乙酰酯酶、木聚糖酶及上述侧链水解酶的联合作用释放的寡聚体可进一步经β—木糖苷酶的作用被降解或游离的木糖(及其他单糖)。所释放的木糖可被转化成其他化合物如呋喃硐香味剂。
可使用本发明的乙酰酯酶并合用没有其他甘露聚糖水解酶或只有有限的其他甘露聚糖水解酶活性的甘露聚糖酶，降解甘露聚糖(包括半乳甘露聚糖、萄甘露聚糖及半乳萄甘露聚糖)以生产寡糖。寡糖可用作填充剂。
经全部或部分除去甘露聚糖侧支链，可有利于用本发明的乙酰酯酶和含甘露聚糖的酶制剂降解甘露聚糖。例如，甘露聚糖的半乳糖侧支链可经β—半乳糖苷酶的作用而除去。
可使用β—甘露糖苷酶(及用于葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的β—葡糖苷酶)进一步降解经乙酰酯酶和甘露聚糖酶，或如上所述合用乙酰酯酶、甘露聚糖酶及2—半乳糖苷酶处理所释放的寡聚体，以产生游离甘露糖。
可将本发明的乙酰酯酶与木聚糖水解酶合用，用于改良动物饲料，并可发挥其体外(经改良饲料成分)或体内作用。乙酰酯酶特别适于加到含有较高量乙酰化木聚糖的动物饲料组合物，例如含牧草、容物或玉米叶的饲料中。
本发明的乙酰酯酶可与木聚糖和/或甘露聚糖酶合用，用于造纸或纸浆工业，例如用发改善木素纤维素纸浆的漂白性能或滤水性能。
用本发明的乙酰酯酶并合用其他酶处理植物材料，以改善不同类型的加工，有利于纯化或提取不同的成分如碳水化合物，改善饲养质量、降低水结合能力、改善废水处理厂中的降解性、改善牧草和玉米向青贮饲料的转化率、或者水解各种植物细胞壁衍生的材料或废物材料，如造低废物材料，或农业残留物如麦秸、玉米棒、整个玉米植物株、果仁壳、杂草、植物外壳、豆荚、废弃容物、糖甜菜浆等。
可使用本发明的乙酰酯酶制剂使碳水化合物去乙酰化，以改变其性质。如碳水化合物的流变性、稳定能力或疏水性。例子是对木聚糖和甘露聚糖的去乙酰化作用。用于上述目的的碳水化合物乙酰酯酶制剂较好是基本上没有可使所说的碳水化合物解聚活性的。
此外，在有低水活度的系统中，可用本发明的乙酰酯酶酯化如乙酰化(通过酯合成或转酯化作用)木聚糖和甘露聚糖等碳水化合物。由此形成的乙酰化的碳水化合物可比天然存在的碳水化合物有更大的乙酰化程度，并将具有增加了疏水性等新的性质，并进而改善了乳化和/或稳定含脂肪乳液的能力。
可在食口工业中使用本发明的酶制剂降解植物细胞壁多糖。其中主要是用在水果和蔬菜加工如果汁生产或果酒酿造中，并且可用于造纸和纸浆工业中。此外，该酶制剂可用于修饰或降解例如用于食品中的树胶。这些树胶的例子是梧桐树胶(得自苹婆树)、阿拉伯树胶、特别是刺槐豆树胶(角豆树)、瓜耳树胶及黄原胶(细菌胶)。
下列附图进一步说明本发明，其中
图1是用于分离本发明的酶的纯化方法的流程图；
图2是从上述棘孢曲霉上清液中分离的纯化的乙酰酯酶的银染色SDS—PAGE凝胶。在12％TSDS—PAGE凝胶上分离并按材料和方法部所述银染色蛋白质。泳道1：分子量标记(磷酸化酶β：94KDa，βSA：67KDa，卵清蛋白：43KDa，磷酸酐酶：39KDa，STI：20.1KDa)。泳道2：10μg棘孢曲霉上清液。泳道3：20μg集合物I。泳道4：20μg从阴离子交换层析纯化得到的副部分。泳道5：0.8μg集合物1.1。泳道6：0.07μg集合物I.II。泳道7：1.2μg纯化的半乳糖醛酸—鼠李聚糖乙酰酯酶(WO92/19728)；
图3图解显示按下文材料和方法部分所述测得的从集合物I.I回收的乙酰酯酶的最适pH；
图4显示对PNP乙酸酯、乙酰化甘露聚糖及乙酰化木聚糖测得的从集合物I.Ⅱ中回收的乙酰酯酶的最适pH。
图5显示用等电聚焦法测得的本发明酶的等电点。泳道1：标记物淀粉萄糖苷酶(pI3.5)、以及胰蛋白酶抑制剂(pI4.55)、牛清碳酸酐酶(pI5，85)、人碳酸酐酶(pI6.55)的等电点。泳道2：10μg棘孢曲霉培养物上清液。泳道3：1μg集合物I.I。泳道4：1μg集合物I.II。
下列实施例进一步详细描述本发明，这些实施例不以任何方式限制本发明权利要求的范围。
材料和方法
供体生物体和发酵：使棘孢曲霉，菌株CBS101.43在40m3通气的连续搅拌的以酵罐内生长于含有12％(W/W)大豆饼和1.5％磷酸钾pH低于5.0的培养基中。发酵期间使用pH保持在大约4.2，并在发酵期间连续加入马铃薯淀粉。过滤所得培养物上清液离心并在20KDaUF滤器中浓缩得到约150mg/ml蛋白质。
PNP—乙酰酯酶活性：在500μl的1.6mMPNP—乙酸酯(Sigma，ST.Louis，USA)、20mM柠酸酸盐(pH5.5)中保温纯化酶的样品，并在加入100μlIMTris(pH7.0)后检测活性OD450定量所释放之PNP的量，以检测活性。1单位定义为于40℃释放1μmolePNP/分钟的活性。
乙酰酯酶检测法(Boehringer Mannheim检测法)：
按照制造商提供的使用手册完成检测。
将乙酰化的多糖底物溶解在试剂级水中得到1％溶液/悬浮液，以制得将用于检测的底物溶液。
将65μl底物溶液加到30μl的0.3M有适当pH的缓冲液(即用于集合物I.I和I.II乙酰酯酶的Tris缓冲液pH6.5)中。最后加入5μl酶溶液(以及加入5μl水作为空白对照)。
在振荡台上将样品于37℃保温1小时，然后加热至95℃约15分钟，以失活酶。
用Boehringer Manheim检测法检测10μl该溶液的乙酯酯含量。
乙酰化的底物：
乙酰化半乳糖醛酯—鼠李聚糖(经修饰的发状区域)
该底物得自用果胶酶制剂(Pectinex AR，Novo—Nordisk)部分果胶水解的Golden Delicious苹果，然后对其进行离心香味反率取(aromawtripping)及在MW60,000Da截留BX3聚砜膜(PatersonCandy Ltd.)上进行引超滤。将保留物对水透析并冻干。将代表1.7％苹果固体和大约4％糖的MHR部分乙酰化。
乙酰化的甘露聚糖
该底物由Jiirgen Puls(Hamburg，FRG)提供。它是按照常规方法用亚氯酸盐使锯木去木质化，然后用DMSO提取半纤维素后从Norwegian Bruce(Picia abes)中分离的。在DEAE琼脂糖凝胶柱上经阴离子交换层析分离所提取的多糖，并收集含甘露聚糖的部分。
乙酰化的木聚糖
按照参考文献6(Kormelink ＆Vorageh)中所述方法经蒸汽提取桦木产生水溶性多糖，得到作为其不可透析部分的乙酰化木聚糖。其中含有70.6％总糖和10.6％乙酰基(基于干燥物质)。
按照改进的Laemli方法〔16〕，在Mini—LeaK4电泳。按照厂商提供的说明书用Multiphor电泳单元在属性电解质PAG平板(pH3.5～9.5)(Pharmacia，Sweden)上进行等电聚胶。基本上按文献〔11〕中所述方法进行银染色或考马斯兰染色。
pI的测定：按照厂商提供的说明书在pharmacia两性电解质PAG平板(pH3.5～9.5)上电泳检测等遇点。电泳后按下述方法对凝胶进行银染色。
蛋白质检测法：使用BioRad蛋白质检测法。
最适pH的检测：
用PNP—乙酸酯
将纯化的酶(2～5μg)与2mMPNP—乙酸酯在有不同pH的50mM柠檬酸盐—磷酸盐缓冲液中保温。保温25分钟后，在0.2MTris(pH7.0)中检测OD405nm以定量PNP释放。对照样品含有PNP—乙酸酯的缓冲液，但不含酶，从含酶样品中减去在这些样品中测得的吸光率。
用乙酰化多糖
为了检测酶对乙酰化多糖的活性，将样品与1％底物溶液在0.1M有不同pH的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中保温，保温30分钟用Boehriger Nannheim检测法检测所释放的乙酸酯。保温没有酶的对照样品，并从含酶样品测得的数值中减去对照样品数值。
氨基酸序列测定：按上述方法在SDS—PAGE中对纯化的酶进行电泳分离并使用标准方法电转印到PVDF膜(Immobillon，Milipore，USA)上。按照制造厂商的说明书在AppliedBiosystms473A测序仪上对电转印之蛋白质的N末端氨基酸进行序列测定。
MRNA制备：从按上述方法生长的CBS101.43中分离的RNA；其中所说的菌株经培养3—5天后收获菌缘体，直接在液氮中冷冻并保存于-80℃。
在大肠杆菌中构建棘孢曲霉cDNA文库：基本上按WO92/19728中所述方法进行，该文献的内容掺入本文作为参考。更具体地说，使用Boel等人(EMBO J，3：1097—1102，1984)和Chirgwin等人(Biochemistry(Wash)，18：5294—5299，1979)所述方法，从匀浆化的棘孢曲霉菌缘体中提取总RNA。在Oligo(dT)纤维素柱中按Aviv和Leder(PNAS，USA69：1408—1412，1972)所述方法经两次亲和层析循环得到含poly(A)的RNA。使用Invitrogen的cDNA合成药盒，按厂商所述方法合成cDNA。
棘孢曲霉乙酰酯酶特异性cDNA重组体的鉴定：使用基于已确定的乙酰酯酶的氨基酸序列而制备的合成的寡脱氧核苷酸；或使用免疫学筛选方法进行鉴定。这些方法已在WO92/19728中详述。
曲霉属表达载体的构建：可将按上述方法制得的DNA序列插入WO92/19728中所述的表达载体pHD414中完成这一构建。可按照已知方法在大肠杆菌中扩增所得表达质粒，然后按照下述一般方法转化到米曲霉或黑曲霉中。
米曲霉或黑曲霉的转化(一般方法)：
用米曲霉或黑曲霉的孢子接种100mlYPD(Sherman et al，Metgods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，1981)，并于37℃振荡约2天。通过纤细滤布过滤以收获菌丝体并用200ml 0.6M Mg洗。将菌丝体悬浮在15ml 1.2M MgSO4，10mMNaH2PO4(pH＝5.8)中。在冰上冷却悬液并加入1ml含有120mg NovozymR234(批号1687)的缓冲液中。5分钟后加入1ml12mg/mlBSA(Sigma type H25)并在37℃和轻轻搅拌下持续保温1.5～2.5小时，直到在显微镜下观察到样品中的大量原生质体。
通过纤细滤布过滤悬浮液，将滤液转移到无菌管中并在其上覆盖5ml 0.6M山梨醇，100mM Tris—HCI(pH7.0)。100g离心15分钟并从MgSO4垫层的顶部收集原生质体。向原生质体悬液中加入2体积STC(1.2M山梨醇、10mM Tris—HCI，pH7.5，10mMCaCl2)并将混合物以1000g离心5分钟。将原生物体沉淀物重新悬浮在3mlSTC中并再次离心沉降之。重复这一处理过程。最后将原生质体重新悬浮在0.2—1mlSTC中。
将100μl原生质体悬液与5—25mg适当的DNA在10μSTC中混合。将原生质体与p3SR2(携带构巢曲霉amds基因的质粒)混合。将混合物于室温下放置25分钟。加入0.2ml 60％PEC 4000(BDH29576)、10mM CaCl2和10mM Tris—HCI(pH7.5)并小心混合之(两次)，最后加入0.85ml同样溶液并小心混合之。将混合物于室温放置25分钟，以2500g离心15分钟并将沉淀物重新悬浮在2ml 1.2mM山梨醇中。再一次沉降后将原生质体散布在适当的平板上。将原生质体散布在含有1.0M蔗糖(pH7.0)、10mM乙酰胺(作为氮源)及20mMCsCl的基本平板(Cove Biochem，Biophys.Acta 113 51—56(1966))上，以抑制本底生长。37℃保温2—7天后挑取孢子并散布单个菌落的孢子。重复该程序并在第二次再分离后储存单个菌落的孢子作为限定的转化体。
免疫学交叉反应性：可以使用纯化的乙酰酯酶制备用于检测免疫学交叉反应性的抗体。更具体地说，可按照N.Axelsen等人(A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，BlackwellSeieutific Publications，1973，Chapter23)或A.Johnstone和R.Thorpe(Immunochencistry in Practice，Blackwell ScientificPublicationw，1982，具体参见PP.27—31)所述的方法产生抗本发明的酶的抗血清。例如可经盐沉淀((NH4)2SO4)，然后透析并进行离子交换层析(例如使用DEAE—Sephadex柱)从抗血清中制得纯化的免疫球蛋白。可用Outcherlony双扩散分析法(O.Ouchterlony，Handbook of Exparimental Immunology(D.M.Weir，Ed)，Blackwell Scientific Publications，1967，PP.655—706)、交叉免疫电泳法(N.Axelsen et al，文献同上，chapter3and4)，或火箭免疫电泳法(N.Axelsen et al，chapter2)对该蛋白质进行免疫化学性质鉴定。
实施例1
纯化
按图1中所示程序纯化乙酰酯酶。
初步纯化
在带有10KDa滤膜的200ml Amicon池中超滤100ml按上述方法制得的棘孢曲霉上清液。用调到终体积50ml的20mM TrispH7.8将保留物稀释10倍，并以4ml/分钟的流速加样到于20mM Tris(pH7.0)中的250mlDEAE柱(50mm内径)上。用0.1至0.4MNacl的线性梯度径200分钟洗脱结合的蛋白质，收集10ml洗脱部分并检测PNP—乙酰酯酶活性。洗脱一个如图1中所表明的PNP—乙酰酯酶活性的峰(集合物I)。
向集合物I中加入硫酸铵(AMS)至终浓度2M，并将所得混合物以2ml/分钟的流速加样到在50mM tris(pH6.5)；2MAMS中的60ml苯基琼脂糖柱(26mm内径)上。用降低AMS浓度的步骤梯度(第步骤降低0.5MAMS)洗脱结合的蛋白质，并将DEAE集合物分离成两个不同的活性峰(集合物I.I和集合物I.II)。
在加于0.25M乙酸铵(pH5.5)中的500mlSuperdex 6.75柱(26mm内径)上，以1ml/分钟的流速经凝胶过滤纯化从苯基琼脂糖(Phenyl Sepharose)柱上得到的集合物。收集10ml部分并使用上述方法检测PNP—乙酰酯酶活性。
最终纯化合部分纯化之乙酰酯酶的部分
集合物I.I(乙酰酯酶I)：
将该活性集合物超滤到10mM磷酸钠(pH6.8)中，并以1ml/分钟的恒定流速加于8mlBiorad HTP羟基磷灰石柱(10mm内径)上。在30分钟内用线性渐增到0.5M的磷酸盐浓度洗脱结合的蛋白质。收集每管5ml，并检测PNP—乙酰酯酶活性和蛋白质含量(使用SDS—PAGE和蛋白质检测法)。如用上述SDS—PAGE法测得的，纯化的酶具有44KDa的分子量。纯化的酶没有显示出对乙酰化的木聚糖、甘露聚糖或半乳糖醛酸—鼠李聚糖的任何活性。
集合物I.II(乙酰酯酶II)
凝胶过滤后，得到对乙酰化甘露聚糖和木聚糖都有活性的部分。将该部分超滤到10mM磷酸钠(pH6.8)中并以1ml/分钟的恒定流速加到8mlBiopad HTP羟基磷灰石柱(10mm内径)上。在30分钟内用线性渐增到0.5M浓度的磷酸盐洗脱结合的蛋白质。收集5ml一管并检测PNP—乙酰—酯酶活性及蛋白质含量(SDS—PAGE和蛋白质检测法)。回收两个部分中的活性，两者均含有42KDa蛋白质和35KDa蛋白质。推测42KDa蛋白质是PCT/DK93/00445中所述的多聚半乳糖醛酸酶I将最后洗脱的部分超滤到25mM Tris(pH8.0)中并以1ml/分钟的流速加于1mlmono—P柱上。在60分钟期间内以220至0.5M Nacl的渐增的线性Nacl梯度洗脱结合的蛋白质。第管收集2ml并检测PNP—乙酰酯酶活性和蛋白质含量(SDS—PAGE和蛋白质检测法)。有活性的部分含有对乙酰化甘露和木聚糖均有活性的一种35KDa蛋白质。
在下表中，列出了上述纯化程序中得到的棘孢曲霉乙酰酯酶的纯度系数和活性。显示出了从纯化过程中选择的部分，以及最终纯化的酶部分。PNP—乙酰酯酶活性的回收率为0.8％。用上文给出的方法检测乙酰酯酶活性。
     部分  蛋白质含量       活性(μmol/分钟)          比活性   纯化系数
    A.a.上清液’     10g     6320.00U         O.632U/mg     1.0
集合物I     950mg     2148.00U         2.26U/mg     3.6
集合物I.I后s-200     21mg     345.00U         16.87U/mg     26.7
集合物I.II后s-200     192mg     475.20U         2.47U/mg     3.9
集合物I.I     200μg     3.49U         17.46U/mg     27.6
集合物I.II     200μg     20.00U         100.00U/mg     158.2
’=棘孢曲霉 上清液
实施例2
本发明的纯化的乙酰酯酶的特征鉴定
使用上文材料和方法部分中所述程序确定按实施例1中所述方法制得的纯化的乙酰酯酶的最适pH。
当使用PNP—乙酸酯作为底物进行检测时，发现从集合物I.I分离的(并具有44KDa表现分子量)的乙酰酯酶的最适pH为7.0—7.5。发现该酶在从pH5.0到pH9.0的条件下均是有活性的。pH曲线示于图3中。
使用PNP—乙酸酯作为底物，发现从集合物I.II中分离的乙酰酯酶有6.0的小的最适pH和7—8的大的最适pH。但这种在碱性pH时的高活性可能是因为在中性pH以上底物的不稳定性而人为造成的。使用乙酰化甘露聚糖和木聚糖作为底物时，测得一个宽的最适pH，且峰值在6.0。pH曲线示于图4中。
使用上文材料和方法部分所述程序测定两种酶的等电点。结果示于图5中。
使用上文材料和方法部分中所述步骤测定两种酶的N末端氨基酸序列。
实施例3
经聚合酶链反应产生cDNA探针
为了得到用于棘孢曲霉之乙酰酯酶的cDNA探针，经在多义位置掺入脱氧肌苷而合成相应于纯化的乙酰酯酶I之NH2末端序列中某一区域的简并寡核苷酸(引物AE1.1/P3；p3r—5′—TTYGAYTGGGAYWSIAC—3′)。使用有同向(引物#22，5′—CTGTAATACGACTCACTA—3′)和反向(引物#172，5′—GGGCGTGAATGTAAGCGTGAC—3′)pYES2.0引物配对的引物，利用聚合酶链反应技术(Ohara et ai，1989)从含有7000个克隆的扩增的cDNA文库集合物扩增靶乙酰酯酶cDNA。使用DNA热循环和2.5单位Tag聚合酶(Perkin—Elmer，Cetus)，在含有550pmol有意义引物(AE1.1/P3)和各100pmol反义引物(见上文)，1Mg模板DNA(Qiagen纯化的质粒DNA)和各200μMdNTP的100μlPCR缓冲液(10mM Tris—HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％，Perkin—Elmer，Cetus)中进行PCR反应。使用在94℃变性1分钟、55℃退火2分钟，和72℃延伸3分钟的循环方式进行30次PCR循环。
在1％琼脂糖凝胶上电泳分析10μl等分的扩增产物，用一个引物对(AE1.1/P3；PYES反向引物#172)揭示出1.5Kb和1.0Kb产物。从凝胶上切下感兴趣的DNA片段，使用D—0405型不封口透析管(Sigma)经电洗脱(Sambrook et al，1989)回收，然后用苯酚提取并于-20℃下用乙醇沉淀12小时。在含有各50μmdNTP和3单位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的20μl缓冲液(20mMKAC，1mMDTT)中，于370℃将PCR产物处理10分钟以将其末端填平。于70℃保温5分钟以终止反应，在冰上冷却5分钟并稀释在50μl激酶缓冲液(70mM Tris—HCI，pH7.6，10mMMgCL2，5mMDTT)中，然后用T4多核等酸激酶(10V，New England Bioabs)和1mMATPpH7.0(Pharmacia)于37℃磷酸化30分钟，用苯酚提取，乙醇沉淀，并于16℃处理12小时连接到Smai切割的，去磷酸化pUC18载体上(每次连接50ng，Pharmacia)。
使用5μl连接混合物转化大肠杆菌DH52成为氨苄青霉素抗性菌株(Hanahan，1985)，经分离质粒极微制剂DNA(Sambrooket al.1989)并用ECORI/HindIII酶切质粒亚克隆，然后用通用的pUC引物测定来自一个亚克隆(pAE8.1.1)的1.5Kb插入段之末端的序列(Sanger et ai，1977)分析10个克隆。对pCIAEI亚克隆的核苷酸序列分析揭示出一个独特的开放读码，其除了引物编码的氨基酸外，还含有与纯化的乙酰酯酶I的可利用的NH2末端序列并存的附加残基。
编码棘孢曲霉之乙酰酯酶的全长cDNA的分离和特性鉴定
为了分离乙酰酯酶的全长度cDNA克隆，将cDNA文库集合物#22的集落铺敷在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板(24×24cm平板，Nunc)上，并复制到用尼龙滤膜(Hybond—N，Amersham)包被动的LB＋amp一平板上。按上述随机引导对纯化的1.5Kb乙酰酯酶PCR片段进行32P标记，并用作以集落杂交法(Sambrook et al，1989)筛选文库集合物的探针。杂交在含2.5ng/ml探针的2×SSC(Sambrook et al，1989)，5XDenhardt氏溶液(Sambrook et al，1989)，1％SDS和100μg/ml变性的鲑精子DNA中于65℃进行16小时，然后在2×SSC(2×15分钟)，0.2×SSC、1％SDS(2×30分钟)，及2×SSC(2×15分钟)中进行并于-80℃放射自显影12小时。筛选集合物22中的10,000个集落得到10个推测可能的乙酰酯酶IcDNA克隆，经两次以上的杂交循环对其进行集落纯化。经用HindIII和XbaI消化质粒并用正向和反向pYES2.0多接头引物测定1.4KbcDNA插入段的末端序列鉴定出其中一个克隆(定名为pCIAE)。
PCIAE1中的1.4Kb插入段含有以核等酸位置33处的ATG密码子超始，并以TGA终止密码子终止的1019bp开放读码(OPF)(SEQ ID NO.4)。SEQ ID NO.4显示乙酰酯酶cDNA之3′末端的核苷酸序列，且SEQ ID NO.5显示推测的预期与乙酰酯酶I高度同源的棘孢曲霉之乙酰酯酶的一级结构。ORF前面是39bp5′非编码区，而后面则是132bp3′非编码区和poly(A)尾部。将推测的蛋白质序列与纯化之成熟乙酰酯酶I的NH2末端序列相比较，揭示出该cDNA编码含27残基信号肽和可能的前肽的前体蛋白质。
实施例4
为了在曲霉属中表达该酶，经用HindIII/XbaI或其他适当的限制酶消化，在凝胶上按大小分级分离并纯化而分离出各家族的一个或多个有代表性的cDNA，然后连接到pHD414上。在大肠杆菌中扩增后，按上述的一般程序将质粒转化到米曲霉或黑曲霉中。
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                  序列表(1)一般信息
(i)申请人
    (A)名称NOVO NORDISK A/S
    (B)街道Novo Alle
    (C)城市Bagsvaerd
    (E)国家DENMARK
    (F)邮编(ZIP)：DK-2880
    (G)电话+45 44448888
    (H)传真+45 4449 3256
    (I)电传37304
(ii)发明名称：有乙酰酯酶活性的酶
(iii)序列数目：5
(iv)计算机可读形式
    (A)媒介类型Floppy disk
    (B)计算机IBM PC compatible
    (C)操作系统PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件PatentIn Release#1.0，Version
           #1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：9氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)股型：单股
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假拟：无
(iii)反意义：无
(v)片段类型：内部
(vi)最初来源：
    (A)生物体Aspergillus aculeatus(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Ile Xaa Phe Gly Asp Xaa Tyr Tyr Thrl           5(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：21氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)股型：单股
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假拟：无
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
    (A)生物体：Aspergillus aculeatus
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Phe Asp Trp Asp Ser Thr Lys Tyr Leu Leu Ile Ala Phe Gly Asp Ser1               5               10                      15Tyr Tyr Thr Val Gln
        20(2)SEQ ID NO：3的特征：
(i)序列特征：
    (A)长度：17氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)股型：单股
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假拟：无
(iii)反意义：无
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
      (A)生物体：Aspergillus aculeatus
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Thr Thr Lys Tyr Val Ile Ser Phe Gly Asp Asp Tyr Tyr Thr Thr Xaa1               5                   10                  15Phe(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
       (A)长度：1315碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)股型：单股
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(iii)假拟：无
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(vi)初始来源：
      (A)生物体：Aspergillus aculeatus
(xi)序列描述SEQ ID NO：4：GAATTCCAGG GACTTCCATT CGAGCCATAG CCATGCTCGC TCTCTGGCAG TGCCTAGCCC              60TCGCGGCCAT CCCTACAGTA TCAGCATTCC CCTCCGGTTC GTCTCAGAAG GCGTTCGACT             120GGGACTCGAC GAAATACCTA ATAGCGTTCG GTGATTCCTA TACGTACGTG CAGGGCACTC             180ACGGACACCA AAACTATAGC TTCATTGGGG ATCTGCAGAA CTTCGCATAT GATGCTCAGA             240CCCTGTTAAC GGATAAGATC GTTCAGAACC AGACAGCAAC GGCAGAAGGG GGCCCCAACT             300GGGTTGAATA CCTCACCGGG TGCGGGGTAG AAGATGGAAT CATCTCACCC TTGGACTGCG             360AGAGACAACT CTGGGACTTC GCGTTCGCGG GATCTGATAT CTCCGTTGCA TACACCCCCC             420TCCACCACAA CTACACCGTC TCCCTCGTCA ACCAGGTCAN CCAATTCACG ACCTACGGGC             480AGCCGGTCCT CTCGCGGCAC ATCTCCGCGC CGCAGACCCT TGTCGCCATC TGGATCGGGA             540TCAACGACAT CGGCGACAGC GCCAAATACG CCGTCGATTT TCCGGCCTTC TACGAAACCC             600TCATCACCAC CCTCTTCGCC TCCGTCCAGG AGATCTACGC CCAGGGCTAT CGCTCCTACC             660TGTTCGTCAA CCTGCCGCCC CTCGACCGCA CCCCGGNCAA CCAGGCCCTG AGCCAGCCCT             720ACCCGAACGC CACGCAGGTC GCCTGGTACA ACGACGCGCT GGCCCGGAAC GCCGCCGCCT             780TCCACCGCAA CCACACGGAC ACGGCCGTGC ACCTGTTNGA CGCGCACCGG ACGCTCAGCG             840AGGTCATGGA CCACCCCGCG GCGTACGGCA TCGTCAACAC CACCAACTTC TGCCCCGGGT             900ACGACCAGCC CGATATCGCG TGGAACTACC GGGCGTACGG GTGTCCGACC CCGCTGGAGG             960AGTACTTCTG GTTCAACTCG GGGCATCTGA CGAGCCATGT GCATCAGATT CTTGCGGGTG            1020TGTTGGAGGG GGAGCTGAGA GAGTGGTCGA AGTGAGGGTG GTCTGTCGTT GATTGGAGGC            1080GTGGTGGGGG GAACTCATTG ATGATCCAGT GGGAATACGT CAGCTCCAAA CTATGCTTTG            1140TACGCTTCAG TTTAGACTGA CGCAGGTAAG ACTCCGTAGC ATGATTCATC ACAACAATCC            1200CGGACCTGCA TGCATTTAAG TTGGGTGTAT ACCACTGGTA TCTGCTTGTT ACTCCTCGTA            1260TATGTCAACC ATATGAGAAG TCAAATATGC CATCGCGTGA AAAAAAAAAA AAAAA                 1315(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：240氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)股型：单股
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假拟：无
(iii)反意义：无
(v)片段类型：N丰端
(vi)最初来源
(A)生物体：Aspergillus aculeatus
(xi)序列描述SEQ ID NO：5：Met Leu Ala Leu Trp Gln Cys Leu Ala Leu Ala Ala Ile Pro Thr Val1               5                   10                  15Ser Ala Phe Pro Ser Gly Ser Ser Gln Lys Ala Phe Asp Trp Asp Ser
        20                  25                  30Thr Lys Tyr Leu Ile Ala Phe Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Val Gln Gly
    35                  40                  45Thr His Gly His Gln Asn Tyr Ser Phe Ile Gly Asp Leu Gln Asn Phe
50                  55                  60Ala Tyr Asp Ala Gln Thr Leu Leu Thr Asp Lys Ile Val Gln Asn Gln65                  70                  75                  80Thr Ala Thr Ala Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Glu Tyr Leu Thr Gly
            85                  90                  95Cys Gly Val Glu Asp Gly Ile Ile Ser Pro Leu Asp Cys Glu Arg Gln
        100                 105                 110Leu Trp Asp Phe Ala Phe Ala Gly Ser Asp Ile Ser Val Ala Tyr Thr
    115                 120                 125Pro Leu His His Asn Tyr Thr Val Ser Leu Val Asn Gln Val Xaa Gln
130             135                     140Phe Thr Thr Tyr Gly Gln Pro Val Leu Ser Arg His Ile Ser Ala Pro145                 150                 155                 160Gln Thr Leu Val Ala Ile Trp Ile Gly Ile Asn Asp Ile Gly Asp Ser
            165                 170                 175Ala Lys Tyr Ala Val Asp Phe Pro Ala Phe Tyr Glu Thr Leu Ile Thr
        180                 185                 190Thr Leu Phe Ala Ser Val Gln Glu Ile Tyr Ala Gln Gly Tyr Arg Ser
    195             200                     205Tyr Leu Phe Val Asn Leu Pro Pro Leu Asp Arg Thr Pro Xaa Asn Gln
210                 215                 220Ala Leu Ser Gln Pro Tyr Pro Asn Ala Thr Gln Val Ala Trp Tyr Asn225                 230                 235                 240Asp Ala Leu Ala Arg Asn Ala Ala Ala Phe His Arg Asn His Thr Asp
            245                 250                 255Thr Ala Val His Leu Xaa Asp Ala His Arg Thr Leu Ser Glu Val Met
        260                 265                 270Asp His Pro Ala Ala Tyr Gly Ile Val Asn Thr Thr Asn Phe Cys Pro
    275                 280                 285Gly Tyr Asp Gln Pro Asp Ile Ala Trp Ash Tyr Arg Ala Tyr Gly Cys
290                 295                 300Pro Thr Pro Leu Glu Glu Tyr Phe Trp Phe Asn Ser Gly His Leu Thr305             310                     315                      320Ser His Val His Gln Ile Leu Ala Gly Val Leu Glu Gly Glu Leu Arg
            325                 330                 335Glu Trp Ser Lys
        340

Claims (20)

1.具有乙酰酯酶活性的酶，该酶包含SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列，式中X代表任何氨基酸残基。
2.具有乙酰酯酶活性的酶，该酶对乙酰化的木聚糖和乙酰化的甘露聚糖表现有活性。
3.具有乙酰酯酶活性的酶，该酶是由包含SEQ ID NO.4中所示的DNA序列的DNA构建体编码的。
4.具有乙酰酯酶活性的酶，该酶与抗衍生于棘孢曲霉CBS101，43之纯化的乙酰酯酶的抗体有免疫反应性，并且有大约44或35KDa的分子量。
5.根据权利要求1、3或4中任一项的酶，该酶包含SEQ IDNO.2中所示的N末端氨基酸序列。
6.根据权利要求5的酶，其具有大约44KDa的分子量，6.0—9.0范围内的最适pH，和/或4.4—5.1范围内的pI。
7.根据权利要求1、2或4中任一项的酶，该酶包含SEQ IDNO.3中所示的N末端氨基酸序列，式中X代表任何氨基酸残基。
8.根据权利要求7的酶，其中N末端氨基酸序列的X是T。
9.根据权利要求1—8中任一项的酶，其可从曲霉属的菌株，特别是棘孢曲霉或黑曲霉，木霉属的菌株，特别是T.harzianum，镰孢霉属的菌株，特别是尖镰孢或酵母属的菌株，特别是酿酒酵母。
10.根据权利要求9的酶，其为由分离自棘孢曲霉CBS101，43之DNA文库的DNA序列编码。
11.包含编码根据权利要求1—10中任一项之酶的DNA序列的重组表达载体。
12.包含根据权利要求11之重组表达载体的细胞。
13.根据权利要求12的细胞，其为真核细胞，特别是真菌细胞，如酵母细胞或丝状真菌细胞。
14.根据权利要求13的细胞，其中细胞属于曲霉属的菌株，特别是黑曲霉或米曲霉的菌株。
15.生产具有乙酰酯酶活性之酶的方法，该方法包括在允许产生酶的条件下培养根据权利要求12—14中任一项的细胞，并从培养物中回收酶。
16.用于处理植物细胞壁成分的酶制剂，所说的制剂富含根据权利要求1—10之任一项的有乙酰酯酶活性的酶。
17.根据权利要求16的制剂，其另外包含木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶溶解酶、半乳糖醛酸—鼠李聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、药聚糖酶、果胶甲基酯酶或这些酶的任何组合。
18.根据权利要求1—10中任一项的酶或根据权利要求17的酶制剂用于降解或修饰植物材料。
19.根据权利要求18的应用，用于降解或修饰乙酰化的木聚糖和/或乙酰化的甘露聚糖。
20.根据权利要求18或19的应用，用于制备纸和纸浆、饲料或食品。
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