CN112691606A

CN112691606A - 乙酰乳酸合酶e59作为乳化剂的应用

Info

Publication number: CN112691606A
Application number: CN202110029306.XA
Authority: CN
Inventors: 李霜; 陶惟一; 黄和
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2041-01-11
Also published as: CN112691606B

Abstract

本发明涉及乙酰乳酸合酶E59作为乳化剂的应用，所述乙酰乳酸合酶E59的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种生物乳化剂，将乙酰乳酸合酶E59与添加剂复配后作为所述生物乳化剂，与添加剂复配后获取的乳化剂乳化性能更稳定。本发明的乙酰乳酸合酶E59可作为一种高效生物乳化剂使用，可作用于宽泛的pH环境，可耐受高温，可耐受高浓度盐，对烃类和油脂均有显著的乳化效果。

Description

乙酰乳酸合酶E59作为乳化剂的应用

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及乙酰乳酸合酶E59作为生物乳化剂的应用。

背景技术

生物乳化剂是由各种各样的微生物产生的高分子量生物聚合物，可以有效地形成和稳定水包油乳液[1]。它们是由多糖、脂多糖、脂蛋白和蛋白质等组成的两亲复合物[1-3]。与表面活性剂相类似，生物乳化剂也能够提高难溶底物的生物利用度，从而促进难溶底物的生物降解[4]。它们与生物表面活性剂的区别在于生物乳化剂不会显著降低表面及界面张力[1]。因此，对于生物表面活性剂降低表面张力所带来的一些不利影响，如破坏细胞膜的通透性[5]，与酶或蛋白质的负面相互作用[6]和对细胞的一般毒性等[7]，可以通过使用生物乳化剂来避免。生物乳化剂具有毒性低、生物降解性、生物相容性高、可再生等优点，特别是在极端温度、酸碱度和盐浓度下的具有良好的稳定性[3]。这些特性使它们在石油、制药、化妆品和食品工业等领域的工业应用中极具价值[1]。目前，人们已广泛研究了生物乳化剂在石油工业中的潜在用途，如微生物强化采油技术(MEOR) [8, 9]和污染土壤或其他环境污染的生物修复[10]。尽管生物乳化剂有着潜在的优势，但产量低和纯化成本高等一些问题也阻碍了生物乳化剂的实际应用。为了解决这些问题，许多研究人员努力生产和开发更有效的生物乳化剂。

尽管生物乳化剂的组成多样且复杂，但研究表明生物乳化剂的乳化活性与其化学组成高度相关[11, 12]。最著名和研究最充分的生物乳化剂之一是由Acinetobactercalcoaceticus RAG-1菌株产生的乳化剂Emulsan，它是一种阴离子杂多糖和蛋白质的复合物[13, 14]。Emulsan中的蛋白质经过纯化被证实是一种酯酶，当其与不同多糖混合时，可以增强乳液稳定性[15-17]。此外，另一种由菌株Acinetobacter radioresistens KA53产生的生物乳化剂Alasan，是由丙氨酸、多糖和蛋白质组成。Alasan含有三种蛋白质组分，它们被认为是主要乳化功能物质，其中45-kDa蛋白质被证明具有最高的乳化活性，甚至比完整的Alasan复合物高11% [3, 18, 19]。还有两类蛋白质具有疏水表面活性，即疏水蛋白和Phasin蛋白。疏水蛋白是一组由丝状真菌产生的具有表面活性的小蛋白质。然而，疏水蛋白生产、分离和纯化的低产量仍然阻碍其作为生物乳化剂的应用[20]。Phasin蛋白位于聚羟基链烷酸酯(PHA)颗粒表面，是一种能与疏水性聚合物结合的两亲性小蛋白。Phasin蛋白PhaR显示出较高的乳化能力，但其以包涵体形式表达，为下游的分离提取带来困难[21]。综上所述，蛋白质在生物乳化剂的乳化活性中起着不可或缺的作用，而多糖在乳化系统中起稳定剂的作用。基于这一前提，可以通过蛋白质和多糖成分的适当组合来获得设计的生物乳化剂，潜在地为特定的疏水化合物提供定制的生物乳化剂。此外，由于生物乳化剂的蛋白质和多糖组分更容易在单独的工业加工中大规模生产和提取，因此可以以相对较低的成本提供这些组合的生物乳化剂。然而，很少有蛋白质具有良好的乳化活性，研究和探索具有高效乳化活性的蛋白质是解决这一问题的前提。

1.Uzoigwe C, Burgess JG, Ennis CJ, Rahman PK: Bioemulsifiers are notbiosurfactants and require different screening approaches. Front Microbiol.2015;6:245.

2.Dastgheib SMM, Amoozegar MA, Elahi E, Asad S, Banat IM:Bioemulsifier production by a halothermophilic Bacillus strain with potentialapplications in microbially enhanced oil recovery. Biotechnol Lett. 2008;30:263-270.

3.Toren A, Navonvenezia S, Ron EZ, Rosenberg E: Emulsifyingactivities of purified Alasan proteins from Acinetobacter radioresistensKA53. Appl Environ Microb. 2001;67:1102.

4.Wang Y, Wang C, Ren HJ, Jia BL, Zhang LY: Effectiveness ofrecombinant protein AlnA in enhancing the extractability of polychlorinatedbiphenyls from contaminated soils. J Hazard Mater. 2014;279:67-74.

5.Deleu M, Lorent J, Lins L, Brasseur R, Braun N, El Kirat K,Nylander T, Dufrene YF, Mingeot-Leclercq MP: Effects of surfactin on membranemodels displaying lipid phase separation. BBA-Biomembranes. 2013;1828:801-815.

6.Laha S, Luthy RG: Inhibition of phenanthrene mineralization bynonionic surfactants in soil-water systems. Environ Sci Technol. 1991;25:1920-1930.

7.Lamichhane S, Krishna KCB, Sarukkalige R: Surfactant-enhancedremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons: A review. J Environ Manage.2017;199:46-61.

8.Xia MQ, Fu DF, Chakraborty R, Singh RP, Terry N: Enhanced crude oildepletion by constructed bacterial consortium comprising bioemulsifierproducer and petroleum hydrocarbon degraders. Bioresource Technol. 2019;282:456-463.

9.Dong H, Xia WJ, Dong HH, She YH, Zhu PF, Liang K, Zhang ZZ, LiangCF, Song ZZ, Sun SS, Zhang GQ: Rhamnolipids produced by indigenousAcinetobacter junii from petroleum reservoir and its potential in enhancedoil recovery. Front Microbiol. 2016;7:1710.

10.Calvo C, Manzanera M, Silva-Castro GA, Uad I, Gonzalez-Lopez J:Application of bioemulsifiers in soil oil bioremediation processes. Futureprospects. Sci Total Environ. 2009;407:3634-3640.

11.Kaplan N, Rosenberg E: Exopolysaccharide Distribution of andBioemulsifier Production by Acinetobacter calcoaceticus BD4 and BD413. ApplEnviron Microb. 1982;44:1335-1341.

12.Kaplan N, Zosim Z, Rosenberg E: Reconstitution of emulsifyingactivity of Acinetobacter calcoaceticus BD4 emulsan by using purepolysaccharide and protein. Appl Environ Microb. 1987;53:440-446.

13.Rosenberg E, Zuckerberg A, Rubinovitz C, Gutnick DL: Emulsifier ofArthrobacter RAG-1: isolation and emulsifying properties. Appl EnvironMicrob. 1979;37:402-408.

14.Zosim Z, Fleminger G, Gutnick D, Rosenberg E, Wise G: Effect ofprotein on the emulsifying activity of emulsan. J Disper Sci Technol. 1989;10:307-317.

15.Shabtai Y, Gutnick DL: Exocellular esterase and emulsan releasefrom the cell surface of Acinetobacter calcoaceticus. J Bacteriol. 1985;161:1176-1181.

16.Bach H, Gutnick DL: A unique polypeptide from the C-terminus ofthe exocellular esterase of Acinetobacter venetianus RAG-1 modulates theemulsifying activity of the polymeric bioemulsifier apoemulsan. ApplMicrobiol Biotechnol. 2006;71:177.

17. Bach H, Gutnick DL: Novel polysaccharide-protein-basedamphipathic formulations. Appl Microbiol Biotechnol. 2006;71:34-38.

18.Toren A, Orr E, Paitan Y, Ron EZ, Rosenberg E: The activecomponent of the bioemulsifier alasan from Acinetobacter radioresistens KA53is an OmpA-like protein. J Bacteriol. 2002;184:165.

19.Toren A, Segal G, Ron EZ, Rosenberg E: Structure-function studiesof the recombinant protein bioemulsifier AlnA. Environ Microbiol. 2002;4:257-261.

20.Khalesi M, Gebruers K, Derdelinckx G: Recent Advances in FungalHydrophobin Towards Using in Industry. Protein J. 2015;34:243-255.

21.Ma HK, Liu MM, Li SY, Wu Q, Chen JC, Chen GQ: Application ofpolyhydroxyalkanoate (PHA) synthesis regulatory protein PhaR as a bio-surfactant and bactericidal agent. J Biotechnol. 2013;166:34.。

发明内容

本发明的目的在于提供乙酰乳酸合酶E59作为生物乳化剂的应用。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

乙酰乳酸合酶E59作为乳化剂的应用，所述乙酰乳酸合酶E59的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。编码所述乙酰乳酸合酶E59基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

发明人发现乙酰乳酸合酶E59具有乳化烃类物质的作用，在不同条件下，能够与多种烃类形成稳定的乳化层。

本发明所述的应用中，所述乳化底物为疏水物质。作为乳化剂，理论上只要是疏水性物质理论上都可以作为乳化底物。乙酰乳酸合酶E59对疏水物质中的烃类或油脂类均有较好的乳化效果，且具有耐受宽泛的pH环境、耐盐、耐热等优良性质。

本发明所述的应用中，乳化体系为4毫升体系，以每毫升计，油相：水相比例关系为1：1。

本发明所述的应用中，可以以含乙酰乳酸合酶E59蛋白质的载体为乳化剂，与烃类接触进行乳化反应。

对于含乙酰乳酸合酶E59蛋白质的载体为乳化剂，可以理解为，可以将上述蛋白质在重组菌中表达后分离纯化获得的纯化蛋白质；也可以将上述蛋白质表达后的重组菌细胞破碎，从而获得粗蛋白（细胞总蛋白），将粗蛋白与烃类混合进行乳化反应。

在前述应用中，还可将该乙酰乳酸合酶E59蛋白质与添加剂进行复配，可以获得工作浓度更低、乳化性能更加稳定的生物乳化剂。

其中，所述复配添加的添加剂可以选自果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶中的一种。

本发明的另一目的在于提供一种生物乳化剂，将不同添加剂与上述乙酰乳酸合酶E59进行复配，获取所述生物乳化剂；所述添加剂选自果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶中的一种。

本发明的有益效果在于，提供一种新型的高效生物乳化剂及生物乳化剂的复配方式。本发明的乳化剂对烃类有机相有较好的乳化效果，且具有耐受宽泛的pH环境、耐盐、耐热等优良性质。

附图说明

图1为乙酰乳酸合酶E59蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；Line 3: E59粗蛋白；Line 4:E59纯蛋白。

图2为乙酰乳酸合酶E59与市面上常用的不同表面活性剂对柴油的乳化指数示意图。

图3为乙酰乳酸合酶E59对不同疏水底物的乳化指数示意图。

图4为不同浓度的乙酰乳酸合酶E59对柴油的乳化指数示意图。

图5为乙酰乳酸合酶E59在不同盐度条件下对柴油乳化指数示意图。

图6为乙酰乳酸合酶E59在不同pH条件下对柴油乳化指数示意图。

图7为乙酰乳酸合酶E59在不同温度条件下对柴油乳化指数示意图。

图8为乙酰乳酸合酶E59与不同添加剂进行复配后对柴油乳化指数示意图。

具体实施方式

本发明所使用的菌种及材料来源：

野生菌Bacillus velezensis BS-37为本实验室所有，已公开于本申请发明人团队在先公开的文献中（Dayuan Zhou et.al. Genome and transcriptome analysis ofBacillus velezensis BS‐37, an efficient surfactin producer from glycerol, inresponse to D-/L-leucine. MicrobiologyOpen. 2019; 8: e79.）。本申请人在此声明，保证从本申请日起20年内免费对公众发放本菌株的生物材料。

质粒pET28购于诺维赞生物科技有限公司，E.coli DH5α购于宝日医生物技术有限公司。

下述实施例中菌株构建方法均为常规方法，可按照试剂盒和产品说明书进行；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例说明重组工程菌Escherichia coli BL21-pET-e59的构建。

利用PCR技术，从野生菌Bacillus velezensis BS-37基因组DNA中扩增出乙酰乳酸合酶E59基因e59，将e59基因连到表达载体pET28多克隆位点处，转化重组质粒pET28-e59至E.coli BL21(DE3)获得的基因工程菌Escherichia coli BL21-pET-e59。

上述构建方法，具体包括：

基因e59的克隆：

根据Genebank公布的Bacillus velezensis乙酰乳酸合酶基因AlsS (Genebank:AWG40579.1) 序列设计引物：

P1: 5’- CCATGGCCTTGGCAAAAGCAACAAATGAACTAA -3’ (Nco I);

P2: 5’- CTCGAGCTAGAGAGCTTTTGCTTTCATTTTT-3’ (Xho III)

PCR反应体系：ddH2O 20 µL，高保真酶混合物25 µL，引物P1 2 µL，引物P2 2 µL，DNA模板 1 2 µL。PCR程序：95℃预变性，5 min；进行30个循环反应：94℃变性45 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，72℃保温10 min，最后4℃保存。

重组基因工程菌Escherichia coli BL21-pET-e59的获得：

PCR产物经试剂盒纯化后，经Nco I和Xho III双酶切与pET28a载体连接，并转化至E.coli BL21(DE3)，涂布于含50 µg/mL的卡那霉素平板，挑选阳性转化子，进行菌落PCR及测序鉴定，获得的基因工程菌Escherichia coli BL21-pET-e59。

实施例2

本实施例说明乙酰乳酸合酶基因E59的获得。

乙酰乳酸合酶E59的诱导表达：

培养基：LB培养基：酵母粉 5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

培养条件：250 mL锥形瓶中装液量50mL，培养温度37℃，200rpm，培养至OD600达到0.6-0.8时，加入1 mM IPTG诱导乙酰乳酸合酶E59的表达。28℃，150 rpm培养12时后，10000×g离心10 min收集细胞。将细胞重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 7.4，经高压匀浆机进行高压破碎细胞，破碎后10000×g离心20 min，弃沉淀取上清液，即为粗酶液。

（2）蛋白量的测定：使用Brandford法测定蛋白量。

蛋白标曲的制作：

配制考马斯亮蓝溶液：100 mg 考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95% 乙醇中，再加入100 mL 85%（v/v）H₃PO₄，最后用蒸馏水稀释至1 L，滤纸过滤后可使用；配制0.1g/L BSA：称取0.01g BSA，溶于10mL蒸馏水中，使用前用生理盐水配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08mg/mL；取7个2 mL离心管，编好号（0，1，2，3，4，5，6），在1~6号离心管中分别加入上述稀释后各浓度BSA溶液0.3 mL，最后在每支离心管中加入1.2 mL 考马斯亮蓝溶液。在0号离心管中加入1.2 mL 考马斯亮蓝溶液和0.3 mL生理盐水。各管混合后，以0号管为对照测定A595，测得的标准曲线。

蛋白的检测具体步骤如下：

首先以牛血清蛋白（BSA）标样的浓度对OD595吸光值作标准曲线方程。然后适当稀释的酶液300 μL ，加入1.2 mL考马斯亮蓝工作液，混匀，室温放置15 min，与595 nm下测定吸光值。每组做两个平行样，以蒸馏水为空白。

（3）粗酶液的纯化：

缓冲液A（结合液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 7.4；

缓冲液B（洗脱液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，500 mM咪唑，pH 7.4。

采用Ni-NTA HisTrap FF柱子进行蛋白纯化：将粗酶液的上清用0.22 μm微孔膜过滤后备用；将柱子安装于蛋白纯化仪上，用10倍体积的结合液平衡镍柱，设流速为1.0 mL/min；待平衡后上样进行蛋白挂柱；用5倍体积的结合液冲洗镍柱，将未与镍柱结合的蛋白洗去；再用洗脱液进行洗脱，收集含目的蛋白的洗脱液；透析过夜出去其中的咪唑，然后用10KDa的超滤管离心进行蛋白浓缩，并用SDS-PAGE分析纯度（图1）。

实施例3

本实施例说明乳化活性测定方法。

将实施例2中纯化后的E59蛋白加入缓冲液，配制成一定浓度的乳化剂溶液，以不同烃类有机相为乳化对象，在5mL容量玻璃瓶中，取2 mL乳化剂，并与油相以1:1体积比混合，漩涡震荡2分钟，静置48h。

乳化指数 (Emulsification index，EI48) 用乳化层的高度与总高度之比，乘以100%来计算，以表示乳化剂的乳化活性。

乳化指数(EI48) =(乳化层高度 )/(总液高度 ) ×100%。

实施例4

本实施例说明本发明所述乙酰乳酸合酶E59与目前使用广泛的多种表面活性剂等组分对柴油的乳化活性比较。

选取SDS、吐温20、吐温80、洗洁精及生物乳化剂E59蛋白分别配成浓度为500 mg/L的溶液（50 mM Tris-HCl pH 7.4），取2 mL乳化剂溶液，加入 2mL柴油，漩涡震荡2分钟后，室温静置48 h，观察其EI48指数。结果如图2所示，SDS、吐温20、吐温80以及生物乳化剂E59蛋白均能很好的乳化柴油，并能在常温下长时间保持乳化活性。其中E59蛋白的乳化指数甚至略高于相同浓度的SDS，说明生物乳化剂E59蛋白与市面上广泛使用的表面活性剂相比，有着较好的乳化活性。

实施例5

本实施例说明本发明所述的乙酰乳酸合酶E59对不同疏水底物的乳化活性。

将纯化后的乙酰乳酸合酶E59配制成350 mg/L的溶液（50mM Tris-HCl pH7.8），分别与等体积的环己烷、正己烷、正辛烷、十二烷、十六烷、二甲苯、迷迭香油、大豆油、煤油、液体石蜡、柴油进行乳化反应，室温静置48h。结果如图3所示，350 mg/L 的E59蛋白对上述底物均具有较好的乳化活性，乳化指数EI₄₈分别为56.8%、64.3%、62.9%、61.9%、45.2%、62.3%、65.7%、42.9%、61.3%、34.8%、59.5%（图3）。

实施例6

本实施例说明本发明所述的乙酰乳酸合酶E59的浓度对柴油的乳化活性影响。

将纯化后的乙酰乳酸合酶E59分别配成500 mg/L、300 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L的溶液（50 mM Tris-HCl pH 7.4），比较其在不同浓度下对柴油的乳化指数EI₄₈。结果如图4所示，随着乙酰乳酸合酶E59用量的降低，乳化活性也随之下降。E59蛋白浓度为100mg/L时，乳化指数仅28.6%，当E59蛋白浓度高于350 mg/L时，乳化指数均大于50%。

实施例7

本实施例说明本发明所述的乙酰乳酸合酶E59在不同盐度条件下对柴油乳化活性影响。

将纯化后的乙酰乳酸合酶E59分别溶于30 g/L，50 g/L，100 g/L，150 g/L，200 g/L的NaCl、MgSO₄和CaCl₂溶液，乙酰乳酸合酶E59浓度均为350 mg/L（50 mM Tris-HCl pH7.4），与等体积柴油乳化，测定EI₄₈，判定乳化剂的耐盐度。结果如图5所示，NaCl、MgSO₄和CaCl₂对E59蛋白的乳化活性均没有负面影响，在30 g/L和50 g/L的浓度下，E59的乳化活性均略有增加，说明E59蛋白在高盐浓度下有良好的乳化稳定性。

实施例8

本实施例说明本发明所述的乙酰乳酸合酶E59在不同pH条件下对柴油乳化活性影响。

配制50 mmoL/L的柠檬酸盐、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH缓冲溶液，并调整pH分别为pH 3，pH 4，pH 5，pH 6，pH 7，pH 8，pH 9，pH 10，pH 11，将纯化后的乙酰乳酸合酶E59分别溶于上述缓冲液中，使乙酰乳酸合酶E59的浓度为350 mg/L。取2mL的E59溶液，与等体积柴油乳化，室温放置48 h后，测定乳化指数EI₄₈，判断乙酰乳酸合酶E59对柴油乳化作用的pH敏感性。结果如图6所示，在pH 3-10时，E59蛋白对柴油的乳化活性不受影响，当在pH11的碱性条件下，E59的乳化活性下降一半。

实施例9

本实施例说明本发明所述的乙酰乳酸合酶E59在不同温度条件下对柴油乳化活性影响。

将纯化后的乙酰乳酸合酶E59配制成350 mg/L的溶液（50 mM Tris-HCl pH 7.4），在不同温度45℃，55℃，65℃，75℃，85℃，95℃下水浴1 h，冷却至室温，与等体积柴油乳化，在室温下放置48 h后，计算其乳化指数，测定乳化剂的耐热性。结果如图7所示，随着温度升高至85℃时，E59蛋白对柴油的乳化活性几乎保持稳定，但当温度升高至95℃时，E59的乳化活性下降到15%，表明E59蛋白质作为乳化剂具有较好的耐热性，可以耐受85℃的高温，保持了良好的乳化活性及稳定性。

实施例10

本实施例说明本发明所述的乙酰乳酸合酶E59与不同添加剂进行复配后，其对柴油乳化活性影响。

将纯化后的乙酰乳酸合酶E59配制成200 mg/L的溶液（50mM Tris-HCl pH 7.4），分别加入终浓度为1 g/L的各种添加剂（果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶），取2mL乳化剂溶液与等体积柴油进行乳化反应，漩涡震荡2分钟，在室温下静置48 h后，计算其乳化指数EI₄₈。结果如图8所示，上述所有添加剂均可略微提高E59的乳化活性，其中以阿拉伯胶、琼脂糖和黄原胶对乳化促进作用最为明显。因此，本发明提供了一种增加乙酰乳酸合酶E59蛋白质乳化活性的方法，即与添加剂进行复配。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 乙酰乳酸合酶E59作为乳化剂的应用

<130> xb21011102

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 570

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Ala Lys Ala Thr Asn Glu Leu Lys Thr Ser Gly Lys Asn Arg Gly

1 5 10 15

Ala Glu Leu Val Val Asp Cys Leu Val Glu Gln Gly Val Thr His Val

20 25 30

Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile Asp Ala Val Phe Asp Ala Leu Lys

35 40 45

Asp Lys Gly Pro Glu Leu Val Leu Cys Arg His Glu Gln Asn Ala Ala

50 55 60

Phe Met Ala Ala Ala Val Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly Val Cys

65 70 75 80

Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu Leu

85 90 95

Thr Ala Asn Thr Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Ala Gly Asn Val

100 105 110

Ile Arg Ala Asp Arg Leu Lys Arg Thr His Gln Ser Leu Asp Asn Ala

115 120 125

Ala Leu Phe Gln Pro Ile Thr Lys Tyr Ser Val Glu Val Gln Glu Thr

130 135 140

Gly Asn Ile Pro Glu Ala Val Thr Asn Ala Phe Arg Ala Ala Ser Ala

145 150 155 160

Gly Gln Ala Gly Ala Ala Phe Val Ser Phe Pro Gln Asp Val Val Asn

165 170 175

Glu Ile Thr Asn Val Lys Asn Val Arg Ser Val Pro Ala Pro Lys Gln

180 185 190

Gly Pro Ala Pro Glu Glu Ala Val Ser Ala Ala Ile Ala Lys Ile Gln

195 200 205

Thr Ala Lys Leu Pro Val Leu Leu Val Gly Met Lys Gly Gly Arg Pro

210 215 220

Glu Ala Val Lys Gln Ile Arg Lys Leu Leu Ala Lys Thr Lys Leu Pro

225 230 235 240

Phe Val Glu Thr Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Leu Ser Arg Glu Leu Glu

245 250 255

Asp Gln Tyr Phe Gly Arg Ile Gly Leu Phe Arg Asn Gln Pro Gly Asp

260 265 270

Leu Leu Leu Glu Gln Ala Asp Val Val Leu Thr Ile Gly Tyr Asp Pro

275 280 285

Ile Glu Tyr Asp Pro Lys Phe Trp Asn Val Asn Gly Asp Arg Ala Ile

290 295 300

Ile His Leu Asp Glu Ile Gln Ala Asp Ile Asp His Ala Tyr Gln Pro

305 310 315 320

Glu Leu Glu Leu Leu Gly Asp Ile Ala Ala Thr Val Lys Gln Ile Glu

325 330 335

His Asp Ala Val Thr Phe Asp Met Gly Ser Arg Glu Gln Glu Val Leu

340 345 350

Ser Glu Leu Lys Gln Met Leu Thr Asp Ser Glu Lys Ala Pro Ser Asp

355 360 365

His Lys Ser Asp Arg Val His Pro Leu Gln Ile Val Gln Glu Leu Arg

370 375 380

Asn Ala Ile Asp Asp Asp Val Thr Val Thr Cys Asp Ile Gly Ser His

385 390 395 400

Ala Ile Trp Met Ser Arg Tyr Phe Arg Ala Tyr Glu Pro Leu Lys Leu

405 410 415

Leu Ile Ser Asn Gly Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala

420 425 430

Ile Ala Ala Thr Leu Val Asn Pro Gly Glu Lys Val Val Ser Val Ser

435 440 445

Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu Thr Ala Val

450 455 460

Arg Leu Lys Ala Pro Ile Val His Leu Val Trp Asn Asp Ser Thr Tyr

465 470 475 480

Asp Met Val Ala Phe Gln Gln Met Lys Lys Tyr Asn Arg Thr Ser Cys

485 490 495

Val Asp Phe Gly Asn Ile Asp Ile Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe Gly

500 505 510

Ala Thr Gly Leu Arg Val Glu Ser Pro Glu Gln Leu Ala Asp Val Leu

515 520 525

Gln Lys Gly Leu Asn Thr Glu Gly Pro Val Ile Ile Asp Ile Pro Val

530 535 540

Asp Tyr Ser Asp Asn Val His Leu Ser Ser Asp Met Leu Pro Lys Gln

545 550 555 560

Phe Lys Glu Lys Met Lys Ala Lys Ala Leu

565 570

<210> 2

<211> 1713

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttggcaaaag caacaaatga actaaaaacc tctggaaaaa atcggggggc ggagcttgtt 60

gttgattgct tagtggagca aggtgtcaca catgtttttg gcattccggg tgcaaaaatt 120

gatgcagtat ttgatgcgtt aaaagataaa ggacctgaac tggttttatg ccgtcacgaa 180

cagaacgctg catttatggc tgcggctgtc ggaagactga ctggaaaacc aggcgtttgt 240

ctcgttactt caggcccggg ggcatccaac ttggcgaccg gcttgttaac ggctaataca 300

gaaggtgatc cggtagtggc gctggcgggt aacgtaattc gcgcagaccg gttaaaacgg 360

acacaccaat cattggacaa tgcggcgcta tttcagccga ttacaaaata cagtgtagaa 420

gtacaggaaa cagggaatat accagaagcg gtaacaaacg ccttcagggc agcgtcagca 480

ggtcaggcag gcgcggcttt cgtgagcttt ccgcaggatg ttgtgaatga aatcacaaat 540

gtgaaaaacg tacgcagcgt gccggcgccg aaacaaggcc ctgcaccgga agaagcggtc 600

agcgcggcta tcgcgaaaat ccagacggcg aaacttcccg ttctgttagt cggcatgaaa 660

ggcggaagac cggaggcggt aaaacaaatc cgcaaactgc ttgccaaaac aaaactgcct 720

ttcgtagaaa cgtaccaagg ggccggcaca ttgtccagag agctggaaga ccaatatttc 780

ggccggatcg gactgttccg caaccagccg ggcgatcttc tgcttgaaca ggcggatgtc 840

gtattaacga tcggttatga tccgattgaa tacgatccga agttctggaa cgtaaacggt 900

gaccgtgcta ttatccatct tgacgaaatc caggccgata tcgatcatgc ctatcagccg 960

gaattagaat tattaggcga tatcgccgct acggttaaac aaattgaaca cgacgctgtg 1020

acatttgata tgggcagccg tgaacaagaa gtgctgagcg aattaaaaca gatgctcaca 1080

gacagcgaga aggcgccaag cgaccataaa tccgacagag tgcatcctct gcaaatcgtc 1140

caagaactgc gcaatgcaat tgatgacgac gtaaccgtca cttgcgatat cggttctcac 1200

gcgatctgga tgtcccgcta cttccgcgct tatgagccgc tgaaactgtt gatcagcaac 1260

ggcatgcaga cattgggcgt agcgcttcct tgggcgattg ctgccacatt ggtgaatccg 1320

ggtgaaaaag tcgtatccgt ttcaggagac ggaggattcc tgttctctgc aatggaattg 1380

gaaacggcag tccgcttaaa agcgccgatc gttcaccttg tatggaatga cagcacatat 1440

gatatggtcg cattccagca aatgaaaaaa tataaccgta catcatgcgt agatttcgga 1500

aacattgaca tcgtaaaata tgcagaaagc ttcggcgcca ccggcttgcg cgttgagtca 1560

ccggaacagc tggcagacgt gctgcaaaaa ggcttgaaca cagaaggtcc tgtcatcatt 1620

gacattcctg tcgattacag tgacaatgtc catttatcaa gcgacatgct tccgaagcaa 1680

ttcaaagaaa aaatgaaagc aaaagctctc tag 1713

Claims

1.乙酰乳酸合酶E59作为乳化剂的应用，所述乙酰乳酸合酶E59的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，乳化底物为疏水物质，优选烃类或油脂类。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在乳化反应体系中，反应温度不超过85℃。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在乳化反应体系中，pH范围为3~10。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以含有所述乙酰乳酸合酶E59蛋白质的载体作为乳化剂，与底物进行乳化反应。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含有乙酰乳酸合酶E59蛋白质的载体为所述乙酰乳酸合酶E59蛋白质在重组菌中表达后分离纯化获得的纯化蛋白质；或将所述蛋白质表达后的重组菌细胞破碎，从而获得粗蛋白，将粗蛋白与乳化底物混合进行乳化反应。

7.根据权利要求1~8任一项所述的应用，其特征在于，将不同添加剂与乙酰乳酸合酶E59进行复配。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述复配添加的添加剂选自果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶中的一种。

9.一种生物乳化剂，其特征在于，将不同添加剂与乙酰乳酸合酶E59进行复配，获取所述生物乳化剂，其中所述乙酰乳酸合酶E59的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

10.根据权利要求9所述的生物乳化剂，其特征在于，所述添加剂选自果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶中的一种。