CN112812868B - Sdr家族氧化还原酶e26作为乳化剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及SDR家族氧化还原酶E26作为乳化剂的应用，所述SDR家族氧化还原酶E26的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种生物乳化剂，将SDR家族氧化还原酶E26与添加剂复配后作为所述生物乳化剂，与添加剂复配后获取的乳化剂乳化性能更稳定。本发明的SDR家族氧化还原酶E26可作为一种高效生物乳化剂使用，可作用于宽泛的pH环境，可耐受高温，可耐受高浓度盐，对烃类和油脂均有显著的乳化效果。

Description

SDR家族氧化还原酶E26作为乳化剂的应用

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及SDR家族氧化还原酶E26作为生物乳化剂的应用。

背景技术

生物乳化剂是由各种各样的微生物产生的高分子量生物聚合物，可以有效地形成和稳定水包油乳液[1]。它们是由多糖、脂多糖、脂蛋白和蛋白质等组成的两亲复合物[1-3]。与表面活性剂相类似，生物乳化剂也能够提高难溶底物的生物利用度，从而促进难溶底物的生物降解[4]。它们与生物表面活性剂的区别在于生物乳化剂不会显著降低表面及界面张力[1]。因此，对于生物表面活性剂降低表面张力所带来的一些不利影响，如破坏细胞膜的通透性[5]，与酶或蛋白质的负面相互作用[6]和对细胞的一般毒性等[7]，可以通过使用生物乳化剂来避免。生物乳化剂具有毒性低、生物降解性、生物相容性高、可再生等优点，特别是在极端温度、酸碱度和盐浓度下的具有良好的稳定性[3]。这些特性使它们在石油、制药、化妆品和食品工业等领域的工业应用中极具价值[1]。目前，人们已广泛研究了生物乳化剂在石油工业中的潜在用途，如微生物强化采油技术(MEOR) [8, 9]和污染土壤或其他环境污染的生物修复[10]。尽管生物乳化剂有着潜在的优势，但产量低和纯化成本高等一些问题也阻碍了生物乳化剂的实际应用。为了解决这些问题，许多研究人员努力生产和开发更有效的生物乳化剂。

尽管生物乳化剂的组成多样且复杂，但研究表明生物乳化剂的乳化活性与其化学组成高度相关[11, 12]。最著名和研究最充分的生物乳化剂之一是由Acinetobactercalcoaceticus RAG-1菌株产生的乳化剂Emulsan，它是一种阴离子杂多糖和蛋白质的复合物[13, 14]。Emulsan中的蛋白质经过纯化被证实是一种酯酶，当其与不同多糖混合时，可以增强乳液稳定性[15-17]。此外，另一种由菌株Acinetobacter radioresistens KA53产生的生物乳化剂Alasan，是由丙氨酸、多糖和蛋白质组成。Alasan含有三种蛋白质组分，它们被认为是主要乳化功能物质，其中45-kDa蛋白质被证明具有最高的乳化活性，甚至比完整的Alasan复合物高11% [3, 18, 19]。还有两类蛋白质具有疏水表面活性，即疏水蛋白和Phasin蛋白。疏水蛋白是一组由丝状真菌产生的具有表面活性的小蛋白质。然而，疏水蛋白生产、分离和纯化的低产量仍然阻碍其作为生物乳化剂的应用[20]。Phasin蛋白位于聚羟基链烷酸酯(PHA)颗粒表面，是一种能与疏水性聚合物结合的两亲性小蛋白。Phasin蛋白PhaR显示出较高的乳化能力，但其以包涵体形式表达，为下游的分离提取带来困难[21]。综上所述，蛋白质在生物乳化剂的乳化活性中起着不可或缺的作用，而多糖在乳化系统中起稳定剂的作用。基于这一前提，可以通过蛋白质和多糖成分的适当组合来获得设计的生物乳化剂，潜在地为特定的疏水化合物提供定制的生物乳化剂。此外，由于生物乳化剂的蛋白质和多糖组分更容易在单独的工业加工中大规模生产和提取，因此可以以相对较低的成本提供这些组合的生物乳化剂。然而，很少有蛋白质具有良好的乳化活性，研究和探索具有高效乳化活性的蛋白质是解决这一问题的前提。

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19.Toren A, Segal G, Ron EZ, Rosenberg E: Structure-function studiesof the recombinant protein bioemulsifier AlnA. Environ Microbiol. 2002;4:257-261.

20.Khalesi M, Gebruers K, Derdelinckx G: Recent Advances in FungalHydrophobin Towards Using in Industry. Protein J. 2015;34:243-255.

21.Ma HK, Liu MM, Li SY, Wu Q, Chen JC, Chen GQ: Application ofpolyhydroxyalkanoate (PHA) synthesis regulatory protein PhaR as a bio-surfactant and bactericidal agent. J Biotechnol. 2013;166:34.。

发明内容

本发明的目的在于提供SDR家族氧化还原酶E26作为生物乳化剂的应用。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

SDR家族氧化还原酶E26作为乳化剂的应用，所述SDR家族氧化还原酶E26的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码所述SDR家族氧化还原酶E26基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

发明人发现SDR家族氧化还原酶E26具有乳化烃类物质的作用，在不同条件下，能够与多种烃类形成稳定的乳化层。

本发明所述的应用中，所述乳化底物为疏水物质。作为乳化剂，理论上只要是疏水性物质理论上都可以作为乳化底物。SDR家族氧化还原酶E26对疏水物质中的烃类和油脂均有较好的乳化效果，且具有耐受宽泛的pH环境、耐盐、耐热等优良性质。

本发明所述的应用中，乳化体系为4毫升体系，以每毫升计，油相：水相比例关系为1：1。

本发明所述的应用中，可以以含SDR家族氧化还原酶E26蛋白质的载体为乳化剂，与烃类接触进行乳化反应。

对于含SDR家族氧化还原酶E26蛋白质的载体为乳化剂，可以理解为，可以将上述蛋白质在重组菌中表达后分离纯化获得的纯化蛋白质；也可以将上述蛋白质表达后的重组菌细胞破碎，从而获得粗蛋白（细胞总蛋白），将粗蛋白与烃类混合进行乳化反应。

在前述应用中，还可将该SDR家族氧化还原酶E26蛋白质与添加剂进行复配，可以获得工作浓度更低、乳化性能更加稳定的生物乳化剂。

其中，所述复配添加的添加剂可以选自果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶中的一种。

本发明的另一目的在于提供一种生物乳化剂，将不同添加剂与上述SDR家族氧化还原酶E26进行复配，获取所述生物乳化剂；所述添加剂选自果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶中的一种。

本发明的有益效果在于，提供一种新型的高效生物乳化剂及生物乳化剂的复配方式。本发明的乳化剂对烃类有较好的乳化效果，且具有耐受宽泛的pH环境、耐盐、耐热等优良性质。

附图说明

图1为SDR家族氧化还原酶E26蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；M: Marker; Line 1:E26粗蛋白；Line 2: E26纯蛋白。

图2为SDR家族氧化还原酶E26与市面上常用的不同表面活性剂对柴油的乳化指数示意图。

图3为SDR家族氧化还原酶E26对各种疏水底物的乳化指数示意图。

图4为不同浓度的SDR家族氧化还原酶E26对柴油的乳化指数示意图。

图5为SDR家族氧化还原酶E26在不同盐度条件下对柴油乳化指数示意图。

图6为SDR家族氧化还原酶E26在不同pH条件下对柴油乳化指数示意图。

图7为SDR家族氧化还原酶E26在不同温度条件下对柴油乳化指数示意图。

图8为SDR家族氧化还原酶E26与不同添加剂进行复配后对柴油乳化指数示意图。

具体实施方式

本发明所使用的菌种及材料来源：

野生菌Aeribacillus pallidus SL-1为本实验室所有，已公开于本申请发明人团队在先公开的文献中（Weiyi Tao et.al. Biodegradation of aliphatic andpolycyclic aromatic hydrocarbons by the thermophilic bioemulsifier-producingAeribacillus pallidus strain SL-1. Ecotoxicology and Environmental Safety.2020; 189）。本申请人在此声明，保证从本申请日起20年内免费对公众发放本菌株的生物材料。

质粒pET28购于诺维赞生物科技有限公司，E.coli DH5α购于宝日医生物技术有限公司。

下述实施例中菌株构建方法均为常规方法，可按照试剂盒和产品说明书进行；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例说明重组工程菌Escherichia coli BL21-pET-e26的构建。

利用PCR技术，从野生菌Aeribacillus pallidus SL-1基因组DNA中扩增出SDR家族氧化还原酶E26基因e26，将e26基因连到表达载体pET28多克隆位点处，转化重组质粒pET28-e26至E.coli BL21(DE3)获得的基因工程菌Escherichia coli BL21-pET-e26。

上述构建方法，具体包括：

基因e26的克隆：

根据野生菌Aeribacillus pallidus SL-1基因组测序结果中的e26基因序列设计引物：

P1: 5’-CGGGATCCCGATGTTAACAAATCAAGTAGC-3’ (BamH I)

P2: 5’- CCAAGCTTGGTGCAATAGGATATTGTTGAA-3’ (Hind III)

PCR反应体系：ddH₂O 20 µL，高保真酶混合物25 µL，引物P1 2 µL，引物P2 2 µL，DNA模板2 µL。PCR程序：95℃预变性，5 min；进行30个循环反应：94℃变性45 s，56℃退火30s，72℃延伸60 s，72℃保温10 min，最后4℃保存。

（2）重组基因工程菌Escherichia coli BL21-pET-e26的获得：

PCR产物经试剂盒纯化后，经BamH I和Hind III双酶切与pET28a载体连接，并转化至E.coli BL21(DE3)，涂布于含50 µg/mL的卡那霉素平板，挑选阳性转化子，进行菌落PCR及测序鉴定，获得的基因工程菌Escherichia coli BL21-pET-e26。

实施例2

本实施例说明SDR家族氧化还原酶E26的获得。

（1）SDR家族氧化还原酶E26的诱导表达：

培养基：LB培养基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L。

培养条件：250 mL锥形瓶中装液量50 mL，培养温度37℃，200 rpm，培养至OD600达到0.6-0.8时，加入1 mM IPTG诱导SDR家族氧化还原酶E26的表达。28℃，200 rpm培养12时后，10000×g离心10 min收集细胞。将细胞重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 7.4，经高压匀浆机进行高压破碎细胞，破碎后10000×g离心20 min，弃沉淀取上清液，即为粗酶液。

（2）蛋白量的测定：使用Brandford法测定蛋白量。

蛋白标曲的制作：

配制考马斯亮蓝溶液：100 mg 考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95% 乙醇中，再加入100 mL 85%（v/v）H₃PO₄，最后用蒸馏水稀释至1 L，滤纸过滤后可使用；配制0.1g/L BSA：称取0.01g BSA，溶于10mL蒸馏水中，使用前用生理盐水配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08mg/mL；取7个2 mL离心管，编好号（0，1，2，3，4，5，6），在1~6号离心管中分别加入上述稀释后各浓度BSA溶液0.3 mL，最后在每支离心管中加入1.2 mL 考马斯亮蓝溶液。在0号离心管中加入1.2 mL 考马斯亮蓝溶液和0.3 mL生理盐水。各管混合后，以0号管为对照测定A595，测得的标准曲线。

蛋白的检测具体步骤如下：

首先以牛血清蛋白（BSA）标样的浓度对OD595吸光值作标准曲线方程。然后适当稀释的酶液300 μL ，加入1.2 mL考马斯亮蓝工作液，混匀，室温放置15 min，与595 nm下测定吸光值。每组做两个平行样，以蒸馏水为空白。

（3）粗酶液的纯化：

缓冲液A（结合液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 7.4；

缓冲液B（洗脱液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，500 mM咪唑，pH 7.4。

采用Ni-NTA HisTrap FF柱子进行蛋白纯化：将粗酶液的上清用0.22 μm微孔膜过滤后备用；将柱子安装于蛋白纯化仪上，用10倍体积的结合液平衡镍柱，设流速为1.0 mL/min；待平衡后上样进行蛋白挂柱；用5倍体积的结合液冲洗镍柱，将未与镍柱结合的蛋白洗去；再用洗脱液进行洗脱，收集含目的蛋白的洗脱液；透析过夜出去其中的咪唑，然后用10KDa的超滤管离心进行蛋白浓缩，并用SDS-PAGE分析纯度（图1）。

实施例3

本实施例说明乳化活性测定方法。

以不同烃类为乳化对象，在5mL容量玻璃瓶中，将实施例2中纯化后的酶液加入缓冲液（50 mM Tris-HCl pH7.8），总体积为2 mL，并与油相以1:1体积比混合，漩涡震荡2分钟，静置48h。

乳化指数 (Emulsification index，EI48) 用乳化层的高度与总高度之比，乘以100%来计算，以表示乳化剂的乳化活性。

乳化指数(EI48) =(乳化层高度 )/(总液高度 ) ×100%。

实施例4

本实施例说明本发明所述的SDR家族氧化还原酶E26与目前使用广泛的多种表面活性剂等组分对柴油的乳化活性比较。

选取SDS、吐温20、吐温80、市售洗洁精和E26蛋白分别配成浓度为500 mg/L的溶液（50 mM Tris-HCl pH 7.4），取2 mL，加入 2mL柴油，漩涡震荡2分钟后，静置48 h，观察其乳化指数EI₄₈。结果如图2所示，SDS、吐温20、吐温80以及E26蛋白均能很好的乳化柴油，并能在常温下长时间保持乳化活性。其中E26蛋白的乳化指数甚至略高于相同浓度的SDS，说明E26蛋白与市面上广泛使用的表面活性剂相比，有着较好的乳化活性。

实施例5

本实施例说明本发明所述的SDR家族氧化还原酶E26对不同疏水底物的乳化活性。

将纯化后的SDR家族氧化还原酶E26配成200 mg/L的溶液（50mM Tris-HClpH7.8），分别与等体积的环己烷、正己烷、正辛烷、十二烷、十六烷、二甲苯、迷迭香油、大豆油、煤油、液体石蜡、柴油进行乳化反应。结果表明，E26蛋白除了对液体石蜡乳化性几乎为零以外，其对以上烃类均有很好的乳化作用，乳化指数分别为47.6%、59%、41.9%、52.1%、57.6%、61.0%、14.3%、40.5%、61.0%、3.0%和54.5%，如图3所示。

实施例6

本实施例说明本发明所述的SDR家族氧化还原酶E26的浓度对柴油的乳化活性影响。

将纯化后的SDR家族氧化还原酶E26分别配成500 mg/L、300 mg/L、200 mg/L、100mg/L、50 mg/L的溶液（50 mM Tris-HCl pH 7.4），与等体积的柴油进行乳化作用，比较其对柴油的乳化指数。如图4所示，结果表明，随着E26蛋白质浓度的降低，乳化活性也随之下降。当E26蛋白浓度仅为100 mg/L时，其对柴油的乳化指数为40.5%，当其浓度高于100 mg/L时，乳化活性均大于50%。

实施例7

本实施例说明本发明所述的SDR家族氧化还原酶E26在不同盐度条件下对柴油乳化活性影响。

将纯化后的SDR家族氧化还原酶E26分别溶于30 g/L，50 g/L，100 g/L，150 g/L，200 g/L的NaCl、MgSO₄和CaCl₂溶液，其中SDR家族氧化还原酶E26浓度均为200 mg/L（50 mMTris-HCl pH 7.4），与等体积柴油乳化，室温静置48小时，测定乳化指数EI₄₈，判定乳化剂的耐盐度。结果如图5所示，随着NaCl和MgSO₄浓度的不断增加，E26蛋白的乳化活性略有下降，但当MgSO₄浓度为30 g/L和50 g/L时，E26蛋白的乳化活性略升高，随着MgSO₄浓度的进一步增加，乳化指数下降。但在3种不同盐浓度的溶液中，E26蛋白均可以保持较高的乳化活性。

实施例8

本实施例说明本发明所述的SDR家族氧化还原酶E26在不同pH条件下对柴油乳化活性影响。

配制50 mmoL/L的柠檬酸盐、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH缓冲溶液，并调整pH分别为pH 3，pH 4，pH 5，pH 6，pH 7，pH 8，pH 9，pH 10，pH 11，将纯化后的SDR家族氧化还原酶E26分别溶于上缓冲液中，使SDR家族氧化还原酶E26浓度为200 mg/L，与等体积柴油乳化，室温静置48小时后，计算 乳化指数EI₄₈，判断SDR家族氧化还原酶E26对柴油乳化作用的pH敏感性。结果如图6所示，在pH 3-11时，E26蛋白对柴油的乳化活性不受影响。

实施例9

本实施例说明本发明所述的SDR家族氧化还原酶E26在不同温度条件下对柴油乳化活性影响。

将纯化后的SDR家族氧化还原酶E26配成200 mg/L的溶液（50 mM Tris-HCl pH7.4），在不同温度45℃，55℃，65℃，75℃，85℃，95℃下水浴1小时，冷却至室温，与等体积的柴油混合乳化，在室温下静置48 小时后，计算其乳化指数，测定乳化剂的耐热性。结果如图7所示，随着温度升高至85℃时，E26蛋白对柴油的乳化活性几乎保持稳定，但当温度升高至95℃时，E26的乳化活性下降到28.6%；表明E26蛋白作为乳化剂具有较好的耐热性，可以耐受至85℃的高温，保持了良好的乳化活性及稳定性。

实施例10

本实施例说明本发明所述的SDR家族氧化还原酶E26与不同添加剂进行复配后，其对柴油乳化活性影响。

将纯化后的SDR家族氧化还原酶E26配成100 mg/L的溶液（50mM Tris-HCl pH7.4），并分别加入终浓度为1 g/L的各种添加剂（果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶），与柴油进行乳化反应，漩涡震荡2分钟，在室温下静置48 h后，计算其乳化活性。结果如图8所示，上述所有添加剂均可略微提高E26的乳化活性，其中以阿拉伯胶、琼脂糖和黄原胶提升乳化稳定性最为明显。因此，本发明提供了一种增加SDR家族氧化还原酶E26蛋白质乳化活性的方法，即与阿拉伯胶、黄原胶等乳化稳定剂进行复配。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> SDR家族氧化还原酶E26作为乳化剂的应用

<130> xb21011101

<141> 2021-01-11

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Thr Asn Gln Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile

1 5 10 15

Gly Lys Ala Val Ala Phe Gln Leu Ala Glu Gln Gly Ala Lys Leu Ala

20 25 30

Leu Ala Gly Ser Ser Glu Gly Val Tyr Glu Thr Glu Lys Glu Leu Lys

35 40 45

Glu Lys Gly Phe Ser Tyr Val Lys Ala Phe Gln Val Asp Val Ala Asn

50 55 60

Glu Gln Gln Met Gln Lys Met Val Thr Glu Val Leu Glu Glu Phe Gly

65 70 75 80

Gln Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Phe Phe Lys Glu

85 90 95

Val Glu Glu Thr Thr Val Glu Glu Trp Glu Arg Ile Phe Ala Val Asn

100 105 110

Val Gln Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Ala Val Leu Pro His Met Lys

115 120 125

Glu Arg Lys Ser Gly Thr Ile Ile Thr Ile Ser Ser Asp Val Gly Arg

130 135 140

Tyr Thr Ile Pro Asn Gly Ala Ala Tyr Thr Ala Thr Lys Tyr Ala Val

145 150 155 160

Gln Gly Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gln Glu Val Arg Lys Tyr Gly Ile

165 170 175

Arg Val Gly Thr Ile Asn Pro Gly Met Val Asp Thr Tyr Phe Ala Asn

180 185 190

Ser Ile Gln Gly Val Pro Glu Lys Arg Asp Trp Leu Lys Ala Glu Asp

195 200 205

Val Ala Lys Ala Val Val Tyr Met Ala Ser Ala Pro Lys His Met Leu

210 215 220

Ile Asp Glu Ile Ile Leu His Pro Leu Ile Gln Gln Tyr Pro Ile Ala

225 230 235 240

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttaacaa atcaagtagc gattgttaca ggggcttctc gaggaatcgg aaaagccgtt 60

gcatttcaat tagcggagca aggagcaaaa ttggcgctgg cgggaagttc tgaaggggtt 120

tatgaaacgg aaaaagagct gaaagaaaaa ggattctctt atgtgaaggc gttccaagtg 180

gacgttgcca atgaacagca gatgcaaaag atggtcacag aagtattaga agagtttgga 240

caaatcgata ttctcgtcaa caatgcagga atcggatttt ttaaagaagt ggaagagacg 300

accgtggaag aatgggagcg catctttgcc gtcaatgttc aaggtgtgtt tattggggta 360

aaagccgtgc ttccgcatat gaaagaaaga aaatcgggaa caattattac catttcttcc 420

gatgtcggcc gctacacgat tccgaacggg gcggcataca ccgcgaccaa atacgccgtt 480

caaggatttt ccggttcgct tgcgcaggaa gtaagaaagt acggcattcg cgttggcacg 540

attaacccgg gaatggttga tacgtacttt gctaattcga ttcaaggcgt tccggaaaaa 600

cgcgattggc tgaaagccga agatgtcgca aaagcggtcg tgtatatggc aagcgctcca 660

aagcatatgc ttattgatga gattattctt catccgctca ttcaacaata tcctattgca 720

Claims (5)

1.SDR家族氧化还原酶E26作为乳化剂的应用，所述SDR家族氧化还原酶E26的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；乳化底物为环己烷、正己烷、正辛烷、十二烷、十六烷、二甲苯、大豆油、煤油、柴油中的一种；乳化反应体系中，温度不超过85℃，pH范围为3~11。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以含有所述SDR家族氧化还原酶E26蛋白质的载体作为乳化剂，与乳化底物进行乳化反应。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述含有SDR家族氧化还原酶E26蛋白质的载体为重组工程菌Escherichia coli BL21-pET-e26表达后分离纯化获得的纯化蛋白质；或将所述重组工程菌Escherichia coli BL21-pET-e26表达后的细胞破碎，从而获得粗蛋白，将粗蛋白与乳化底物混合进行乳化反应。

4.根据权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，将不同添加剂与SDR家族氧化还原酶E26进行复配；所述添加剂选自果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶中的一种。

5.一种生物乳化剂，其特征在于，将不同添加剂与SDR家族氧化还原酶E26进行复配，获取所述生物乳化剂，其中所述SDR家族氧化还原酶E26的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述添加剂选自果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶中的一种。

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