CN111620942A

CN111620942A - 布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽及其应用

Info

Publication number: CN111620942A
Application number: CN202010534582.7A
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 方鸣谦; 唐小芃; 张治业
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2040-06-12
Also published as: CN111620942B

Abstract

本发明提供了布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽及其应用，属于生物医药技术领域；所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明首次发现Motistin的成熟肽能够抑制LTA4H的水解酶活性，而对其氨肽酶活性没有影响。Motistin的成熟肽能靶向LT44H，通过抑制LTA4H的水解酶活性，抑制免疫细胞的募集和炎症介质产生，还具有抑制由病毒和细菌脂多糖引起的炎症细胞因子IL6，TNFα，IL1β的产生的功能，具备成为炎症抑制的有效药物的潜力。

Description

布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽及其应用。

背景技术

LTA4H是花生四烯酸途径的最终酶和限速酶。它以其环氧水解酶功能而闻名，可以将LTA4转化为LTB4(Dennis,E.A.&Norris,P.C.Eicosanoid storm in infection andinflammation.Nat Rev Immunol15,511–523(2015))。

LTB4是一种重要的促炎脂质介体，能够启动和放大先天性和适应性免疫反应，并且对免疫细胞具有化学吸引作用并可以释放炎性介体(Peters-Golden,M.&Henderson,W.R.Leukotrienes.NEnglJMed357,1841–1854(2007)；DiGennaro,A.&Haeggstrom,J.Z.Theleukotrienes:immune-modulating lipid mediators of disease.Adv Immunol116,51-92(2012))。其受体BLT1和BLT2的参与对嗜中性粒细胞(PMN)，嗜酸性粒细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的募集和激活具有特别强的作用。在几乎所有的哺乳动物组织和器官中都可以检测到LTA4H(Haeggstrom,J.Z.LeukotrieneA4hydrolase and the committed step inleukotriene B4 biosynthesis.Clin Rev Allergy Immunol17,111–131(1999))。

此外，脂多糖(LPS)能够诱导LTA4H和LTB4的产生。另外，LTA4H的氨肽酶功能可促进三肽Pro-Gly-Pro(PGP)的降解，而PGP具有中性粒细胞的趋化活性(Byzia,A.,Haeggstrom,J.Z.,Salvesen,G.S.&Drag,M.Aremarkable activity of humanleukotriene A4 hydrolase(LTA4H)toward unnatural amino acids.Amino Acids46,1313-1320(2014))。因此，LTA4H具有促炎性(LTB4产生)和抗炎性(PGP降解)的双重功能。

目前缺少一种具有抑制LTA4H水解酶活性，而对其氨肽酶活性没有影响的抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽及其应用，本发明中Motistin的成熟肽具有抑制LTA4H水解酶活性的作用，而对其氨肽酶活性没有影响。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了一种编码上述方案所述成熟肽的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了一种包含上述方案所述基因的重组质粒，所述重组质粒的构建用骨架质粒包括Pet-32a。

本发明提供了一种包含上述方案所述重组质粒的重组菌，所述重组菌的原始菌包括大肠杆菌。

本发明提供了上述方案所述Motistin的成熟肽、所述基因、所述重组质粒或者所述重组菌在制备抑制白三烯A4水解酶活性的药物中的应用。

本发明提供了上述方案所述Motistin的成熟肽、所述基因、所述重组质粒或者所述重组菌在制备抑制白三烯B4产生和/或炎症因子产生的药物中的应用。

本发明提供了上述方案所述Motistin的成熟肽、所述基因、所述重组质粒或者所述重组菌在制备免疫抑制剂中的应用。

优选的，所述免疫抑制剂用于治疗哮喘、肿瘤、慢性肺部疾病、急性肺部疾病、心血管疾病或囊性纤维化。

本发明提供了一种治疗炎症类疾病的药物，所述药物的活性成分包括上述方案所述Motistin的成熟肽。

优选的，所述炎症类疾病包括胃炎、胰腺炎、结膜炎、结肠炎、关节炎或伤口炎症。

本发明的有益效果：本发明提供了布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明首次发现Motistin的成熟肽能够抑制LTA4H的水解酶活性，而对其氨肽酶活性没有影响。Motistin的成熟肽能靶向LT44H，通过抑制LTA4H的水解酶活性，抑制免疫细胞的募集和炎症介质产生，还具有抑制由病毒和细菌脂多糖引起的炎症细胞因子IL6，TNFα，IL1β的产生的功能，具备成为炎症抑制的有效药物的潜力。

附图说明

图1为Motistin重组蛋白表达条件探索，其中M：Protein Marker、1：15℃0.1mMIPTG诱导后、2：20℃0.1mM IPTG诱导后、3：28℃0.1mM IPTG诱导后、4：15℃0.5mM IPTG诱导后、5：20℃0.5mM IPTG诱导后、6：28℃0.5mM IPTG诱导后、7：诱导前样品；

图2为鉴定原核表达菌中Motistin重组蛋白是否为分泌型可溶性蛋白，其中M：Protein Marker、1：诱导前样品、2：诱导后样品、3：诱导超声沉淀样品、4：诱导超声上清样品；

图3为Motistin重组蛋白镍离子柱亲和层析，其中M：Protein Marker、1：破碎后沉淀、2：破碎后上清、3：过Ni柱后流出液、4：20mM咪唑洗杂、5：500mM咪唑洗脱；

图4经过高效液相色谱纯化后最终Motistin的成熟肽SDS-PAGE结果，其中M：Protein Marker、MTX：Motistin多肽；

图5表示布氏鼠耳蝠多肽Motistin的抗trypsin活性；

图6为反相高效液相色谱检测布氏鼠耳蝠多肽Motistin对LTA4H的水解酶活性作用结果；

图7为白三烯A4水解率计算结果；

图8为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对LTA4H的氨肽酶活性作用结果；

图9为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对pDC细胞抗炎症因子IL6的作用结果；

图10为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对pDC细胞抗炎症因子TNFα的作用结果；

图11为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对pDC细胞抗炎症因子IL1β的作用结果；

图12为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对小鼠血浆抗炎症因子IL6的作用结果；

图13为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对小鼠血浆抗炎症因子TNFα的作用结果；

图14为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对小鼠血浆抗炎症因子IL1β的作用结果。

具体实施方式

本发明提供了布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：VSPPAIGKAVDCSKYQGKGSRLACTREYKPVCGVDNTVYSNECMYCMKKKERGVVLRKLHDGQCVECTKFSEACTMEYMPHCGSDGVEYANKCLFCNGVAKSRGALYLANYGQCESR。

在本发明中，所述布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的分子量为14775.24道尔顿；所述布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，具体为：MKTITALAVLALVATTWAVSPPAIGKAVDCSKYQGKGSRLACTREYKPVCGVDNTVYSNECMYCMKKKERGVVLRKLHDGQCVECTKFSEACTMEYMPHCGSDGVEYANKCLFCNGVAKSRGALYLANYGQCESR，其中19～135的片段为布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽，分子量12918.94道尔顿。

本发明提供了一种编码上述方案所述成熟肽的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：GTNWSNCCNCCNGCNATHGGNAARGCNGTNGAYTGYWSNAARTAYCARGGNAARGGNWSNMGNYTNGCNTGYACNMGNGARTAYAARCCNGTNTGYGGNGTNGAYAAYACNGTNTAYWSNAAYGARTGYATGTAYTGYATGAARAARAARGARMGNGGNGTNGTNYTNMGNAARYTNCAYGAYGGNCARTGYGTNGARTGYACNAARTTYWSNGARGCNTGYACNATGGARTAYATGCCNCAYTGYGGNWSNGAYGGNGTNGARTAYGCNAAYAARTGYYTNTTYTGYAAYGGNGTNGCNAARWSNMGNGGNGCNYTNTAYYTNGCNAAYTAYGGNCARTGYGARWSNMGN；所述基因优选的由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

本发明提供了一种包含上述方案所述基因的重组质粒，所述重组质粒的构建用骨架质粒包括Pet-32a；所述基因在Pet-32a上的插入位点优选为KpnI和Hind III。

本发明提供了一种包含上述方案所述重组质粒的重组菌，所述重组菌的原始菌包括大肠杆菌；所述大肠杆菌优选的包括大肠杆菌BL21菌株。本发明具体实施过程中，所述重组菌由北京擎科新业生物技术有限公司构建得到。

本发明对所述重组菌进行原位表达和纯化方法优选的包括以下步骤：

采用IPTG诱导重组菌表达，后经镍亲和层析色谱、甲酸切割融合蛋白、凝胶过滤层析和高压液相色谱纯化，经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量及纯度；所述诱导的温度优选为28℃，IPTG浓度优选为0.5mM，诱导的时间优选为8h。

本发明提供了上述方案所述Motistin的成熟肽、所述基因、所述重组质粒或者所述重组菌在制备抑制白三烯A4水解酶活性的药物中的应用。本发明所述Motistin的成熟肽能够抑制LTA4H的水解酶活性，而对其氨肽酶活性没有影响。本发明所述Motistin的成熟肽通过抑制LTA4H的水解酶活性，进而抑制免疫细胞的募集和炎症介质产生。

本发明提供了上述方案所述Motistin的成熟肽、所述基因、所述重组质粒或者所述重组菌在制备抑制白三烯B4产生和/或炎症因子产生的药物中的应用；所述白三烯B4产生和/或炎症因子产生优选的由病毒和/或细菌脂多糖引起；所述炎症细胞因子优选的包括IL6，TNFα和IL1β。

本发明提供了上述方案所述Motistin的成熟肽、所述基因、所述重组质粒或者所述重组菌在制备免疫抑制剂中的应用；所述免疫抑制剂优选的用于治疗哮喘、肿瘤、慢性肺部疾病、急性肺部疾病、心血管疾病或囊性纤维化。

本发明的免疫抑制剂能抑制白三烯A4水解酶活性，白三烯A4水解酶活性的抑制与哮喘、肿瘤、慢性肺部疾病、急性肺部疾病、心血管疾病或囊性纤维化疾病治疗相关。

本发明提供了一种治疗炎症类疾病的药物，所述药物的活性成分包括上述方案所述Motistin的成熟肽；所述炎症类疾病优选的包括胃炎、胰腺炎、结膜炎、结肠炎、关节炎或伤口炎症。本发明中，所述药物的剂型包括注射剂或雾化剂。Motistin能够抑制白三烯A4水解酶活性，其产物LTB4的减少，有效的抑制了炎症因子IL6，IL1β，TNFα的产生，具有制备成抗炎症类疾病的潜质。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1布氏鼠耳蝠抗炎抗血栓多肽Motistin的成熟肽的原核表达及纯化

1.原核表达系统的构建

原核表达系统由北京擎科新业生物技术有限公司构建得到，基因合成Motistin的成熟肽的核苷酸序列(如SEQ ID NO：3所示)并将其连接到Pet-32a重组质粒，最后转入BL21菌株。

2.布氏鼠耳蝠抗炎抗血栓多肽Motistin的成熟肽原核表达

1)菌体收集

将得到的载体菌液划平板得到单克隆后，挑取单克隆测序，验证载体序列正确性，并将单克隆菌体在一定的甘油浓度下冻存。

首先进行小量诱导表达，在不同IPTG浓度、温度及时间条件下，摸索最合适的诱导条件，具体设置以下处理：15℃0.1mM IPTG 100rpm诱导8h、20℃0.1mM IPTG 100rpm诱导8h、28℃0.1mM IPTG 100rpm诱导8h、15℃0.5mM 100rpm IPTG诱导8h、20℃0.5mM IPTG100rpm诱导8h和28℃0.5mM IPTG 100rpm诱导8h。预实验结束后，使用最优条件进行大量诱导表达。表达结束，12000rpm离心5min，弃掉上清，收集菌体，并用binding buffer将菌体重悬。

2)重组蛋白的可溶性分析

将菌体重悬液进行超声(冰上)以破碎细胞，再次离心后分别取全细胞、上清和沉淀跑SDS-PAGE胶以验证其可溶性。

3.布氏鼠耳蝠抗炎多肽Motistin的成熟肽纯化

1)重组蛋白的亲和层析及甲酸切割

将破碎后的菌体上清用0.45μm滤膜过滤后，上样于用Binding Buffer平衡好的His Bind Resin亲和柱，并跑SDS-PAGE胶验证不同缓冲液洗脱下的样品。

甲酸切割：将洗脱下的融合蛋白加入50％(v/v)的甲酸切割以切除融合蛋白标签。切割后的样品吹干以去除甲酸，并用SDS-PAGE胶验证。

2)SephadexG-50葡聚糖凝胶纯化

将甲酸切割产物取2ml上样于PBS(0.1mol/L，pH6.0)缓冲液平衡过的Sephadex G-50(Amersham Bioscience)凝胶柱(26mm×100cm)。用同样浓度的平衡缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min，3ml/管，使用CBS-A程控全自动部分收集器收集(上海青浦沪西仪器厂)。使用ΜLtrospec2100pro分光光度计(Amersham Biosciences)测定280nm和215nm值。收集各峰组分存于-20℃备用，并用SDS-PAGE验证。

3)RP-HPLC纯化

G50葡聚糖凝胶收集到的目的峰使用反相高压色谱(Waters 1525 BinaryHPLCPump)C₄柱(Lichrospher 10×250mm)继续分离；溶剂A：0.1％TFA的超纯水溶液，溶剂B：0.1％TFA的乙腈溶液。洗脱使用线性浓度梯度：0～10min，B：0％；10～70min，B：0～60％；60～70min，B：70％～100％，流速为1.5mL/min。峰收集使用Waters 2489可见/紫外检测器检测(215nm/280nm)，每一个峰为一个收集单位。

4)MALDI-TOF质谱鉴定

将收集的高压峰进行质谱鉴定。

5)结果

参见图1，图1为Motistin重组蛋白表达条件探索，其中M：Protein Marker、1：15℃0.1mM IPTG诱导后、2：20℃0.1mM IPTG诱导后、3：28℃0.1mM IPTG诱导后、4：15℃0.5mMIPTG诱导后、5：20℃0.5mMIPTG诱导后、6：28℃0.5mM IPTG诱导后、7：诱导前样品；由图1可以看出，Motistin的成熟肽原核表达系统的最优条件为28℃，0.5mM IPTG100rpm诱导8h。

参见图2，图2为鉴定原核表达菌中Motistin重组蛋白是否为分泌型可溶性蛋白，其中M：Protein Marker、1：诱导前样品、2：诱导后样品、3：诱导超声沉淀样品、4：诱导超声上清样品；由图2可以看出Motintin在原核表达系统中为分泌型可溶性蛋白。

参见图3，图3为Motistin重组蛋白镍离子柱亲和层析，其中M：Protein Marker、1：破碎后沉淀、2：破碎后上清、3：过Ni柱后流出液、4：20mM咪唑洗杂、5：500mM咪唑洗脱；由图3可以看出通过镍离子柱初步纯化出了Motistin重组蛋白。

参见图4，图4为经过高效液相色谱纯化后为最终Motistin的成熟肽SDS-PAGE结果，其中M：Protein Marker、MTX：Motistin；由图4可以看出分离纯化得到的蛋白为单一条带，得到的蛋白较纯。

4、发色底物法检测Motistin的成熟肽对胰蛋白酶trypsin活性的影响

将trypsin与不同浓度Motistin的成熟肽在60μl的50mMTris缓冲液(pH7.4)中孵育5min，然后加入0.1mg/ml的生色底物。立即监测在405nm处的吸光度，并使用酶标仪(Epoch BioTek，USA)记录30分钟的动力学曲线。牛胰胰蛋白酶，Trypsin购自Sigma，使用的酶浓度为400nM。相应的发色底物(Sigma，美国)是Gly-Arg-p-nitroanilidedihydrochloride。用Dixon曲线来计算Motistin抑制蛋白酶的Ki，结果参见图5，图5表示布氏鼠耳蝠多肽Motistin的抗trypsin活性，由图5可以看出，Motistin的成熟肽对trypsin的抑制常数Ki值为63.18nM。

5、Motistin的成熟肽对LTA4H的水解酶活性影响

通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)和酶联免疫吸附测定(ELISA)测定LTA4H的环氧水解酶活性。

首先，通过碱性水解缓冲液将LTA4甲酯(20010-500，Cayman,USA)水解为LTA4。将不同浓度Motistin的成熟肽(0.4、2和10μM)与LTA4H(100nM，10007817，Cayman，USA)在40μlTris缓冲液(100mM，pH7.4)中，于37℃孵育5min。然后，添加上述处理过的LTA4溶液(10μl)至终浓度50μM，并将反应混合物在37℃下孵育20min。最后，通过加入1体积的甲醇终止反应。

使用C18柱(30cm×0.46cm，Hypersil BDS，USA)通过RP-HPLC分析样品。洗脱缓冲液是甲醇/水/乙酸的混合物(70/30/0.0025；v/v/v)，在270nm处监测吸光度。实验结果用峰面积积分值(1-加药处理组LTA4峰面积/对照组LTA4峰面积)计算LTB4水解率。结果如图6和图7所示，其中图6为反相高效液相色谱检测布氏鼠耳蝠多肽Motistin对LTA4H的水解酶活性作用结果；图7为LTA4水解率计算结果；由图6和图7可知，Motistin的成熟肽能抑制白三烯水解酶水解白三烯A4成LTB4，并呈剂量效应关系。

6、Motistin的成熟肽对LTA4H的氨肽酶活性的影响

用发色底物测定LTA4H的氨基肽酶活性。将LTA4H(100nM，10007817，Cayman，USA)与不同浓度Motistin的成熟肽(0.4、2和10μM)在60μlTris-HCl缓冲液(100mM，pH7.4)中孵育5min，然后加入显色底物((L-Lysinep-nitroanilide dihydrobromide,500μM，L7002-250MG，Sigma，USA)。立即在405nm处检测吸光度，并使用酶标仪器(Epoch，BioTek，USA)记录30分钟的动力学曲线。结果参见图8，图8为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对LTA4H的氨肽酶活性作用结果；图8结果显示，Motistin的成熟肽对LTA4H的氨肽酶活性没有影响。故能判断，Motistin的成熟肽具有抗炎活性，并且是通过抑制LTA4H的水解酶活性而实现的。

7、Motistin抑制炎症因子的产生

使用人外周血树突状细胞pDCs，首先使用Polymorphprep^TM(AS1114683，Axis-Shield，Norway)得到人外周血单核细胞PBMC，然后使用pDCs细胞分离试剂盒(130097412，Miltenyi，Germany)分离，以上过程按照说明书来进行。得到的pDCs细胞在含有10％FBS和1％青链霉素的RPMI1640培养基中于5％CO₂37℃培养箱培养。细胞培养24h后，更换成无血清RPMI1640培养基并细胞铺板于96孔板中，每组3个重复，饥饿处理6h后加药。先加入不同浓度Motistin的成熟肽(0.08、0.4、2μM)或LTB4受体的抗体，5min后，再加入1μg/ml LPS或0.2MOI H1N1病毒。在培养箱中培养24h后，离心，取上清检测细胞因子IL6，TNFα，IL1β。结果参见图9～图11，其中图9为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对pDC细胞抗炎症因子IL6的作用结果；图10为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对pDC细胞抗炎症因子TNFα的作用结果；图11为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对pDC细胞抗炎症因子IL1β的作用结果；图9～图11结果显示，Motistin的成熟肽能显著抑制pDC细胞由LPS和病毒引起的炎症因子，并呈剂量效应关系。

动物上，使用C57BL/6J周龄雄鼠，尾静脉注射药物，所有药物使用生理盐水溶解，分为生理盐水对照组、细菌脂多糖LPS组、LPS+LTB4受体的抗体组，LPS+2mg/kg MTX(Motistin)组、LPS+1mg/kg MTX组、0.5mg/kg MTX组、2mg/kg MTX组、1mg/kg MTX组、0.5mg/kg MTX组。每组6只小鼠，在打药2h后，取血浆，检测炎症因子IL6,TNFα，IL1β的浓度。结果参见图12～图14，其中其中图12为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对小鼠血浆抗炎症因子IL6的作用结果；图13为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对小鼠血浆抗炎症因子TNFα的作用结果；图14为布氏鼠耳蝠多肽Motistin对小鼠血浆抗炎症因子IL1β的作用结果；图12～图14结果显示，Motistin的成熟肽能显著抑制由LPS引起的炎症因子，并呈剂量效应关系。

数据处理为Graphpad Prime6，数据平均值±SD，t-test(*p<0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 135

<212> PRT

<213> 布氏鼠耳蝠(Myotis brandti)

<400> 1

Met Lys Thr Ile Thr Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Val Ala Thr Thr

1 5 10 15

Trp Ala Val Ser Pro Pro Ala Ile Gly Lys Ala Val Asp Cys Ser Lys

20 25 30

Tyr Gln Gly Lys Gly Ser Arg Leu Ala Cys Thr Arg Glu Tyr Lys Pro

35 40 45

Val Cys Gly Val Asp Asn Thr Val Tyr Ser Asn Glu Cys Met Tyr Cys

50 55 60

Met Lys Lys Lys Glu Arg Gly Val Val Leu Arg Lys Leu His Asp Gly

65 70 75 80

Gln Cys Val Glu Cys Thr Lys Phe Ser Glu Ala Cys Thr Met Glu Tyr

85 90 95

Met Pro His Cys Gly Ser Asp Gly Val Glu Tyr Ala Asn Lys Cys Leu

100 105 110

Phe Cys Asn Gly Val Ala Lys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Leu Ala Asn

115 120 125

Tyr Gly Gln Cys Glu Ser Arg

130 135

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 布氏鼠耳蝠(Myotis brandti)

<400> 2

Val Ser Pro Pro Ala Ile Gly Lys Ala Val Asp Cys Ser Lys Tyr Gln

1 5 10 15

Gly Lys Gly Ser Arg Leu Ala Cys Thr Arg Glu Tyr Lys Pro Val Cys

20 25 30

Gly Val Asp Asn Thr Val Tyr Ser Asn Glu Cys Met Tyr Cys Met Lys

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Lys Lys Glu Arg Gly Val Val Leu Arg Lys Leu His Asp Gly Gln Cys

50 55 60

Val Glu Cys Thr Lys Phe Ser Glu Ala Cys Thr Met Glu Tyr Met Pro

65 70 75 80

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Asn Gly Val Ala Lys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Leu Ala Asn Tyr Gly

100 105 110

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115

<210> 3

<211> 351

<212> PRT

<213> 布氏鼠耳蝠(Myotis brandti)

<400> 3

Gly Thr Asn Trp Ser Asn Cys Cys Asn Cys Cys Asn Gly Cys Asn Ala

1 5 10 15

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Tyr Ala Thr Gly Thr Ala Tyr Thr Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Ala Arg

130 135 140

Ala Ala Arg Ala Ala Arg Gly Ala Arg Met Gly Asn Gly Gly Asn Gly

145 150 155 160

Thr Asn Gly Thr Asn Tyr Thr Asn Met Gly Asn Ala Ala Arg Tyr Thr

165 170 175

Asn Cys Ala Tyr Gly Ala Tyr Gly Gly Asn Cys Ala Arg Thr Gly Tyr

180 185 190

Gly Thr Asn Gly Ala Arg Thr Gly Tyr Ala Cys Asn Ala Ala Arg Thr

195 200 205

Thr Tyr Trp Ser Asn Gly Ala Arg Gly Cys Asn Thr Gly Tyr Ala Cys

210 215 220

Asn Ala Thr Gly Gly Ala Arg Thr Ala Tyr Ala Thr Gly Cys Cys Asn

225 230 235 240

Cys Ala Tyr Thr Gly Tyr Gly Gly Asn Trp Ser Asn Gly Ala Tyr Gly

245 250 255

Gly Asn Gly Thr Asn Gly Ala Arg Thr Ala Tyr Gly Cys Asn Ala Ala

260 265 270

Tyr Ala Ala Arg Thr Gly Tyr Tyr Thr Asn Thr Thr Tyr Thr Gly Tyr

275 280 285

Ala Ala Tyr Gly Gly Asn Gly Thr Asn Gly Cys Asn Ala Ala Arg Trp

290 295 300

Ser Asn Met Gly Asn Gly Gly Asn Gly Cys Asn Tyr Thr Asn Thr Ala

305 310 315 320

Tyr Tyr Thr Asn Gly Cys Asn Ala Ala Tyr Thr Ala Tyr Gly Gly Asn

325 330 335

Cys Ala Arg Thr Gly Tyr Gly Ala Arg Trp Ser Asn Met Gly Asn

340 345 350

Claims

1.布氏鼠耳蝠白三烯A4水解酶抑制剂Motistin的成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种编码权利要求1所述成熟肽的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种包含权利要求2所述基因的重组质粒，所述重组质粒的构建用骨架质粒包括Pet-32a。

4.一种包含权利要求3所述重组质粒的重组菌，所述重组菌的原始菌包括大肠杆菌。

5.权利要求1所述Motistin的成熟肽、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组质粒或者权利要求4所述重组菌在制备抑制白三烯A4水解酶活性的药物中的应用。

6.权利要求1所述Motistin的成熟肽、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组质粒或者权利要求4所述重组菌在制备抑制白三烯B4产生和/或炎症因子产生的药物中的应用。

7.权利要求1所述Motistin的成熟肽、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组质粒或者权利要求4所述重组菌在制备免疫抑制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫抑制剂用于治疗哮喘、肿瘤、慢性肺部疾病、急性肺部疾病、心血管疾病或囊性纤维化。

9.一种治疗炎症类疾病的药物，所述药物的活性成分包括权利要求1所述Motistin的成熟肽。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述炎症类疾病包括胃炎、胰腺炎、结膜炎、结肠炎、关节炎或伤口炎症。