CN106422963A - 乙酰木聚糖酯酶axe作为乳化剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乙酰木聚糖酯酶AXE（Genbank:KC292495）作为乳化剂的应用。本发明还提供了将乙酰木聚糖酯酶AXE与糖类复配后作为乳化剂的应用，与糖类复配后获取的乳化剂乳化性能更稳定。本发明的乙酰木聚糖酯酶AXE可作为一种高效生物乳化剂使用，可作用于宽泛的pH环境，可耐受高温，可耐受高浓度盐，对正己烷、正辛烷、二甲苯、柴油、煤油、大豆油、橄榄油等均有显著的乳化效果。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种蛋白质乙酰木聚糖酯酶AXE作为生物乳化剂的应用及其复配工艺。
背景技术
微生物所产的表面活性物质可以分为两大类：降低空气-水界面的表面张力（生物表面活性剂），降低不混溶液体界面张力或固-液界面张力（生物乳化剂）。生物表面活性剂通常具有一定乳化能力，而生物乳化剂不一定具有降低表面张力的能力。生物乳化剂具有低毒性、生物降解性、耐高温、耐酸碱和耐盐，良好的亲水亲油性能等特点，使其在工业、农业、医疗等领域有广泛的应用。
与典型两亲性分子特征的生物表面活性剂不同，生物乳化剂多为蛋白质、脂多糖、脂蛋白及其复合物等复杂大分子组分。目前对于生物乳化剂的研究大多还处于生理生化层面，主要在于乳化剂表征及代谢产物分析，其中研究较透彻的是由不动杆菌属（Acinetobacter）细菌所产的乳化剂Emulsan和Alasan[1]，分子量大约为100万（1000 kDa）。Emulsan是由蛋白质和一个带负电荷的糖脂组成的复合物，其中多糖是它的主要成分，占复合物质量的80-90%，蛋白质仅占10-20%[2]。但是，Emulsan的乳化活性依赖于蛋白质组分，其中35 kDa的蛋白组分是关键活性组分，该蛋白为一种细胞表面酯酶。对该酯酶重组表达后，表明该酯酶蛋白自身具有良好的乳化活性，添加多糖复配后，蛋白质和多糖可以形成共价复合物或者静电复合物,进一步提升了乳化功能，乳化活性及稳定性可大幅增加[3]。此研究引起了学界关注，纷纷将目光投入到具有乳化活性酯酶的寻找，遗憾的是，Acinetobacter其他菌株中的酯酶，尽管同源性高达81%，但并不具有乳化活性[4]。
据此，我们认为，寻找具有乳化活性的新型酯酶蛋白，有助于解决目前存在的生物乳化剂产量过低、价格过高、稳定性差、生产时间周期长等问题，具有显著的应用价值。
[1] TorenA, Navon-VeneziaS, RonEE. Emulsifying activities of purifiedalasan proteins from AcinetobacterradioresistersKA53[J]. Applied &Environmental Microbiology, 2001, 67(3): 1102-6。
[2] Zosim Z, Gutnick D L, Rosenberg E. Properties of hydrocarbon-in-wateremulsionsstabilized by Acinetobacter RAG-1 emulsan[J]. BiotechnolBioeng,1982, 24: 281-292。
[3] Bach H, Gutnick D L. Novel polysaccharide-protein-basedamphipathic formulations[J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2006, 71: 34-38。
[4]Toren A, Orr E, Paitan Y, Ron EZ, Rosenberg E. The activecomponent of the bioemulsifieralasan from Acinetobacter radioresistens KA53is an ompA-Like protein[J]. Journal of Bacteriology, 2002, p:165-170。
发明内容
发明人发现，具有自主知识产权（专利申请号CN201210403666.2）的乙酰木聚糖酯酶AXE（Genbank:KC292495）具有乳化活性，基于此，提出了本发明方案。因此，发明人要求将专利申请CN201210403666.2的内容一并并入本申请，包括申请中乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列SEQ ID：2；具有活性的同源三聚体、六聚体蛋白结构；以及基因工程菌大肠杆菌（Escherichia coli）BL21-pET-Cah的构建过程，以及构建获得的菌株。
本发明的目的在于提供乙酰木聚糖酯酶AXE作为乳化剂的应用。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
乙酰木聚糖酯酶AXE作为乳化剂的应用，所述乙酰木聚糖酯酶AXE Genbank登录号为KC292495。
其中，本申请中乙酰木聚糖酯酶AXE的氨基酸序列与中国专利申请CN201210403666.2中所述的SEQ ID NO:2以及CN201510176728.4中所述的SEQ ID NO:1 代表氨基酸序列一致。发明人发现该酯酶具有乳化烃类物质的作用，在不同条件下，能够与多种烃类形成稳定的乳化层。
本发明所述的应用中，所述乳化底物包括正己烷、十六烷、正辛烷、二甲苯、煤油、柴油、大豆油、润滑油和橄榄油。该酯酶蛋白质对以上烃类均有较好的乳化效果，且具有耐受宽泛的pH环境、耐盐、耐热等优良性质。
本发明所述的应用中，乳化体系为4毫升体系，以每毫升计，油相：水相比例关系为1：1。
本发明所述的应用中，可以以含该乙酰木聚糖酯酶AXE蛋白质的载体为乳化剂，与烃类接触进行乳化反应。
对于含该酯酶蛋白质的载体为乳化剂，可以理解为，可以将上述蛋白质在重组菌中表达后分离纯化获得的纯化酯酶蛋白质；也可以将上述蛋白质表达后的重组菌细胞破碎，从而获得粗蛋白（细胞总蛋白），将粗蛋白与烃类混合进行乳化反应。
在前述应用中，还可将该乙酰木聚糖酯酶AXE与糖类进行复配，可以获得工作浓度更低、乳化性能更加稳定的生物乳化剂。
其中，所述复配添加的糖类可以选自D-果糖、蔗糖、海藻糖、琼脂糖、壳聚糖、淀粉、糊精、阿拉伯树胶、黄原胶、明胶和甲基纤维素中的一种。
本发明的有益效果在于，提供一种新型的高效生物乳化剂及一种生物乳化剂的复配方式。本发明的乳化剂对烃类有较好的乳化效果，且具有耐受宽泛的pH环境、耐盐、耐热等优良性质。
附图说明
图1为对硝基苯酚（p-NP）浓度-OD405吸光值标准曲线。
图2 为牛血清蛋白（BSA）浓度-OD595吸光值标准曲线。
图3 为AXE与市面上常用的不同表面活性剂对柴油的乳化指数示意图。
图4 为AXE对不同烃类的乳化活性乳化指数示意图。
图5为不同AXE的量对不同烃类的乳化指数示意图。
图6为AXE在不同盐度条件下对柴油乳化指数示意图。
图7为AXE在不同pH条件下对柴油乳化指数示意图。
图8为AXE在不同温度条件下对柴油乳化指数示意图。
图9为AXE与不同糖类进行复配后对柴油乳化指数示意图。
具体实施方式
下面结合附图说明和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围并非仅限于此中的细节及修改案。
本发明所使用的菌种来源：
基因工程菌（Escherichia coli）BL21-pET-Cah为本实验室所有，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO: M2012408。该菌种的构建过程以及酶的鉴定过程参见专利CN 102952787 A。重组基因工程菌（Escherichia coli）BL21-pET28a-Cah为本实验室所有，该重组菌株的构建过程以及酶的鉴定过程参见专利CN 104762334 A。
实施例1
本实施例说明本发明酯酶AXE（5升罐规模）的诱导剂表达方法。
利用重组基因工程菌诱导表达酯酶的具体方案如下：
（1）出发菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）BL21-pET28a-Cah。
（2）种子培养基为LB培养基，其成分为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；
培养条件：250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；
（3）发酵培养基组成为自诱导培养基，其成分为：酵母粉25g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钠10 g/L，甘油（v/v）0.1%，葡萄糖（w/v）0.2%，乳糖（w/v）0.2%；
培养条件：5L发酵罐，装液量为3L，接种量3.3% (v/v)，发酵温度30℃，pH7.5，搅拌转速200 r/min，通气量1.5vvm发酵16h。
（4）粗酶液的获取：
取出发酵液，8000rpm离心3min，加入1/8原发酵液体积的Tris-HCl（pH7.8），浓缩8倍；超声破碎400W、3s工作时间，7s间隙时间，超声4min（24次）；离心6500rpm、10min。上清即为粗酶液。
（5）酶活力的测定：
使用对硝基苯酚乙酸酯为底物，1个酶活单位（U）定义为：在一定反应条件下，每分钟释放1μmol p-NP所需的酶量。
标准曲线制作：
A溶液的配制：50mmol/L的磷酸缓冲（pH7.0），其中含有0.6% Triton X-100和0.1%的阿拉伯树胶；B溶液的配制：准确称取0.0139g pNP标准物质，用A溶液溶解，容量瓶定容至250mL，配成标准物质浓度为1μmol/mL的B溶液。采用A溶液对B溶液进行梯度稀释，配成不同浓度的pNP溶液。在酶标板中加入10μL缓冲液，然后依次加入不同浓度的pNP标准溶液各240μL，对照中加入A溶液。用酶标仪测定405nm波长处吸光值。以pNP的浓度作为横坐标，以吸光值作为纵坐标，作标准曲线（图1）。
测定步骤如下：
在反应体系中加入240μL 底物溶液（A溶液与B溶液按9:1混合），10μL 适当稀释的酶液，置于水浴锅中，温度为40℃，反应时间10min；使用酶标仪在405nm处测定吸光值。实验设三个平行，取平均值，并使用10μL 蒸馏水最为对照组。p-NP标准曲线及方程如图1。
（6）蛋白量的测定：使用Brandford法测定蛋白量。
蛋白标曲的制作：
配制考马斯亮蓝溶液：100mg 考马斯亮蓝G-250溶于50mL95% 乙醇中，再加入100mL85%（v/v）H3PO4，最后用蒸馏水稀释至1 l，滤纸过滤后可使用；配制0.1g/l BSA：称取0.01gBSA，溶于10mL蒸馏水中，使用前用生理盐水配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08mg/mL；取7个2mL离心管，编好号（0，1，2，3，4，5，6），在1~6号离心管中分别加入上述稀释后各浓度BSA溶液0.3mL，最后在每支离心管中加入1.2mL 考马斯亮蓝溶液。在0号离心管中1.2mL考马斯亮蓝溶液和0.3mL生理盐水。各管混合后，以0号管为对照测定A595。测得的标准曲线如图2。
蛋白的检测具体步骤如下：
首先以牛血清蛋白（BSA）标样的浓度对OD595吸光值作标准曲线方程，如图2。然后去适当稀释的酶液300μL ，加入1.2mL考马斯亮蓝工作液，混匀，室温放置15min，与595nm下测定吸光值。每组做两个平行样，以蒸馏水为空白。
（7）粗酶液的纯化：
缓冲液A （结合液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mMNaCl，10 mM咪唑，pH 7.4；
缓冲液B（洗脱液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mMNaCl，500 mM咪唑，pH 7.4。
采用Ni-NTA HisTrap FF柱子进行蛋白纯化：将粗酶液的上清用0.22μm微孔膜过滤后备用；将柱子安装于蛋白纯化仪上，用10倍体积的结合液平衡镍株，设流速为1.0 mL/min；待平衡后上样进行蛋白挂柱；用5倍体积的结合液冲洗镍柱，将未与镍柱结合的蛋白洗去；再用洗脱液进行洗脱，收集含目的蛋白的洗脱液；透析过夜出去其中的咪唑，然后用10KDa的超滤管离心进行蛋白浓缩，并用SDS-PAGE分析纯度。
结果表明，经过16小时5L罐自诱导表达，可获得酯酶活力为2.28×104U/ml，蛋白含量为19.12mg/ml，经纯化后，酯酶活力为1.38×104U/ml，蛋白含量为4.17mg/ml，其比酶活由1192.46U/mg提高到3310.26U/mg，近2.7倍。
实施例2
本实施例说明乳化活性测定方法。
以不同烃类为乳化对象，在5mL容量玻璃瓶中，将实施例1中纯化后的酶液加入缓冲液（50mM Tris-HClpH7.8），总体积为2mL，并与油相以1:1体积比混合，漩涡震荡2分钟，静置48h。
乳化指数 (Emulsification index，EI48) 用乳化层的高度与总高度之比，乘以100％来计算，以表示乳化剂的乳化活性。
实施例3
本实施例说明本发明所述的乙酰木聚糖酯酶AXE与目前使用广泛的多种表面活性剂以及蛋白质、多糖等组分对柴油的乳化活性比较。
选取SDS（1mg）、油酸钠（1mg）、吐温20（1mg）、牛血清蛋白（1mg）、AXE（1mg）、洗洁精（1mg）、黄原胶（1mg）分别溶于缓冲液（50mM Tris-HClpH7.8）至总体积为2mL，加入2mL柴油，漩涡震荡2分钟后，静置48h，观察其EI48指数。结果如图3所示，SDS、吐温20以及AXE对柴油的EI48最高，并能在常温下长时间保持乳化活性，说明AXE酯酶蛋白质与市面上广泛使用的表面活性剂相比，有着较好的乳化活性。
实施例4
本实施例说明本发明所述的乙酰木聚糖酯酶AXE对不同烃类的乳化活性。
将纯化后的AXE配成500μg/mL（50mM Tris-HCl pH7.8）的溶液，分别与正己烷、十六烷、正辛烷、二甲苯、煤油、柴油、大豆油、润滑油、橄榄油，液体石蜡进行乳化反应。结果表明，除了对液蜡乳化性几乎为零以外，AXE蛋白质对以上烃类均有很好的乳化作用，乳化指数分别为61.9%，9.5%，61.0%，66.7%，47.6%，66.7%，14.2%，19.0%，61.9%，如图4所示。
实施例5
本实施例说明本发明所述的乙酰木聚糖酯酶AXE的量对不同烃类的乳化活性影响。
将纯化后的AXE分别配成500μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL（50mM Tris-HClpH7.8）的溶液，分别与二甲苯、柴油、橄榄油进行乳化反应。如图5所示，结果表明，随着AXE蛋白质含量的降低，其对烃类的乳化活性也随之下降，其中，AXE对橄榄油的乳化活性最高，当AXE含量仅为50μg/mL时，其对二甲苯与橄榄油的乳化活性EI48分别为28.5%与42.8%，当AXE蛋白质含量在100μg/mL以上时，对二甲苯、柴油、橄榄油均有较好的乳化指数。
实施例6
本实施例说明本发明所述的乙酰木聚糖酯酶AXE在不同盐度条件下对柴油乳化活性影响。
将纯化后的AXE溶于摩尔浓度分别为10mM，50mM，100mM，300mM，500mM，1000mM的NaCl、MgSO4和CaCl2溶液，使AXE浓度均为500μg/mL（50mM Tris-HCl pH7.8），测定EI48，判定乳化剂的耐盐度。结果如图6所示，在低浓度MgSO4溶液中，AXE的乳化指数略微有所下降，但在3种不同盐浓度的溶液中，AXE均可以保持较高的乳化活性。
实施例7
本实施例说明本发明所述的乙酰木聚糖酯酶AXE在不同pH条件下对柴油乳化活性影响。
将纯化后的AXE分别溶于摩尔浓度50mmoL/L的柠檬酸盐、Tris-HCl、和甘氨酸-NaOH缓冲溶液中，使AXE浓度为500μg/mL，并调整pH分别为pH3，pH4，pH5，pH6，pH7，pH8，pH9，pH10，pH11，放置48h后，计算其乳化层的高度，测定AXE对柴油乳化作用的温度敏感性。结果如图7所示，在pH3-9时，AXE对柴油的乳化活性不受影响，当在碱性条件下时，其乳化活性降低。
实施例8
本实施例说明本发明所述的乙酰木聚糖酯酶AXE在不同温度条件下对柴油乳化活性影响。
将纯化后的AXE配成500μg/mL（50mM Tris-HCl pH7.8）的溶液，在不同温度30℃，45℃，55℃，65℃，75℃，85℃，95℃下水浴1h，冷却至室温，并在室温下放置48h 后，计算其乳化指数，测定乳化剂的温度敏感性。结果如图8所示，随着温度的升高至85℃时，AXE对柴油的乳化活性几乎保持稳定，略微有所下降，但当温度升高至95℃时，其活性下降到38%，表明其AXE作为乳化剂具有较好的温度耐受性。即使高温（>55℃处理）使得AXE的催化活性丧失，但依然保持了良好的乳化活性及稳定性。
实施例9
本实施例说明本发明所述的乙酰木聚糖酯酶AXE与不同糖类进行复配后，其对柴油乳化活性影响。
将纯化后的AXE配成150μg/mL（50mM Tris-HCl pH7.8）的溶液，并加入终浓度为1g/L的不同糖类（葡萄糖、乳糖、D-果糖、蔗糖、海藻糖、琼脂糖、壳聚糖、淀粉、糊精、阿拉伯树胶、黄原胶、明胶、甲基纤维素），与柴油进行乳化反应，漩涡震荡2分钟，在室温下静置48h后，计算其乳化活性。结果如图9所示，葡萄糖、乳糖与蔗糖可降低AXE对柴油的乳化活性，乳化层几乎为0，但D-果糖、琼脂糖、壳聚糖、淀粉、糊精、阿拉伯胶、黄原胶均可提高AXE的乳化活性，其中以阿拉伯胶与黄原胶增高最为明显，EI48分别为69%与76.1%。因此，本发明提供了一种增加AXE酯酶蛋白质乳化活性的方法，即与糖类进行复配。
Claims (10)
1.乙酰木聚糖酯酶AXE（Genbank:KC292495）作为乳化剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，乳化底物包括正己烷、正辛烷、煤油、柴油、十六烷、二甲苯、大豆油、润滑油和橄榄油。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在乳化反应体系中，以每毫升计，油相：水相比例关系为1：1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在乳化反应体系中，反应温度不超过85℃。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在乳化反应体系中，pH范围为3~9。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以含有所述乙酰木聚糖酯酶AXE蛋白质的载体作为乳化剂，与烃类接触进行乳化反应。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述含有乙酰木聚糖酯酶AXE蛋白质的载体为所述乙酰木聚糖酯酶AXE蛋白质的在重组菌中表达后分离纯化获得的纯化酯酶蛋白质；或将所述酯酶蛋白质表达后的重组菌细胞破碎，从而获得粗蛋白，将粗蛋白与烃类混合进行乳化反应。
8.根据权利要求1~7任一项所述的应用，其特征在于，将不同糖类与乙酰木聚糖酯酶AXE进行复配。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述复配添加的糖类选自D-果糖、蔗糖、海藻糖、琼脂糖、壳聚糖、淀粉、糊精、阿拉伯树胶、黄原胶、明胶和甲基纤维素中的一种。
10.一种生物乳化剂，其特征在于，将不同糖类与乙酰木聚糖酯酶AXE（Genbank:KC292495）进行复配，获取所述生物乳化剂，其中所述糖类选自D-果糖、蔗糖、海藻糖、琼脂糖、壳聚糖、淀粉、糊精、阿拉伯树胶、黄原胶、明胶和甲基纤维素中的一种。
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112691606A (zh) * | 2021-01-11 | 2021-04-23 | 南京工业大学 | 乙酰乳酸合酶e59作为乳化剂的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102906256A (zh) * | 2010-03-26 | 2013-01-30 | 纳幕尔杜邦公司 | 用于纯化蛋白质的方法 |
| CN102952787A (zh) * | 2012-10-22 | 2013-03-06 | 南京工业大学 | 一种乙酰木聚糖酯酶及其应用 |
| EP2064385B1 (en) * | 2006-09-22 | 2016-02-17 | Danisco US, Inc., Genencor Division | Enzymatic treatment of textiles using a pectate lyase from bacillus subtilis |
| CN105734069A (zh) * | 2014-12-11 | 2016-07-06 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高温α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因和一种高温乙酰木聚糖酯酶基因及其蛋白表达与应用 |
-
2016
- 2016-09-09 CN CN201610814319.7A patent/CN106422963B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2064385B1 (en) * | 2006-09-22 | 2016-02-17 | Danisco US, Inc., Genencor Division | Enzymatic treatment of textiles using a pectate lyase from bacillus subtilis |
| CN102906256A (zh) * | 2010-03-26 | 2013-01-30 | 纳幕尔杜邦公司 | 用于纯化蛋白质的方法 |
| CN102952787A (zh) * | 2012-10-22 | 2013-03-06 | 南京工业大学 | 一种乙酰木聚糖酯酶及其应用 |
| CN105734069A (zh) * | 2014-12-11 | 2016-07-06 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高温α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因和一种高温乙酰木聚糖酯酶基因及其蛋白表达与应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112691606A (zh) * | 2021-01-11 | 2021-04-23 | 南京工业大学 | 乙酰乳酸合酶e59作为乳化剂的应用 |
| CN112691606B (zh) * | 2021-01-11 | 2022-10-04 | 南京工业大学 | 乙酰乳酸合酶e59作为乳化剂的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |