CN102906256A

CN102906256A - 用于纯化蛋白质的方法

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Publication number: CN102906256A
Application number: CN2011800254430A
Authority: CN
Inventors: R.迪科西莫; A.本-巴萨; R.R.佐兰兹
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-03-23
Also published as: EP2553092A1; EP2553092B1; US8586339B2; CN102906256B; WO2011119703A1; US20110250673A1

Abstract

提供了两阶段的热处理方法，以改进包含具有过水解活性的酶的重组微生物生物质的可加工性。更具体地，提供了处理包含具有过水解活性的栖热袍菌属乙酰木聚糖酯酶的重组微生物生物质的方法，使得微量过滤可以被用于部分纯化和/或浓缩蛋白质制备物。所述乙酰木聚糖酯酶可以被用于生产适用于多种应用如清洁、杀菌、消毒、漂白、木浆处理、和纸浆处理应用中的过氧羧酸。

Description

用于纯化蛋白质的方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2010年3月26日提交的美国临时专利申请61/341,109的优先权，该专利全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及重组微生物生物质加工和酶的纯化领域。更具体地，提供了利用微量过滤改进部分地纯化和/或浓缩具有过氧水解活性的栖热袍菌属(Thermotoga sp.)乙酰木聚糖酯酶的能力的方法。

背景技术

过氧羧酸组合物可为有效的抗微生物剂。已经描述了使用过氧羧酸清洁、灭菌和/或消毒硬质表面、织物、肉制品、活植物组织和医疗器械以杀灭不良微生物生长的方法(美国专利公开6,545,047；美国专利公开6,183,807；美国专利公开6,518,307；美国专利申请公布2003-0026846；和美国专利公开5,683,724)。过氧羧酸也已被用于多种漂白应用中，包括但不限于木浆漂白/去木质化和衣物洗涤护理应用(欧洲专利1040222B1；美国专利公开5,552,018；美国专利公开3,974,082；美国专利公开5,296,161；和美国专利公开5,364,554)。在1min至5min反应时间内和中性至碱性pH下，所期望的过氧羧酸有效浓度可以根据产品的应用而变化(例如，对于中性pH下的医疗器械消毒而言大约500ppm至1000ppm，对于衣物漂白或消毒应用而言大约30ppm至80ppm)。

结构上被归类为糖酯酶家族7(CE-7)的成员的酶，已被用作过水解酶(perhydrolases)，于碱性至酸性pH范围(从大约pH 10至大约pH 5)在水中催化过氧化氢(或替代性的过氧化物试剂)与羧酸的烷基酯的反应，以产生有效浓度的过氧羧酸，所述过氧羧酸用于诸如消毒(例如医疗器械、硬质表面、纺织品)、漂白(例如木浆或纸浆加工/去木质化、纺织品漂白和衣物洗涤护理应用)、以及其他衣物洗涤护理应用如脱色、除臭、和消毒的应用(公布于DiCosimo等人的美国专利申请2008-0176783、2008-0176299、2009-0005590、和2010-0041752中)。CE-7酶类已被发现具有针对酯类尤其是醇、二醇和三醇的乙酰基酯类的过水解的高的特异性活性。DiCosimo等人的公布的美国专利申请2010-0087529描述了来源于几种栖热袍菌属的几种变体CE-7过水解酶，所述变体CE-7过水解酶当被用于从羧酸酯类制备过氧羧酸时具有较高的过水解特异性活性和/或改进的针对过水解的选择性。公布的美国专利申请2010-0087529中描述的变体中的一种，海栖热袍菌(Thermotoga maritima)C277S，表现出相对于海栖热袍菌(T.maritima)野生型酶显著改进的特异性活性。

酶的重组微生物生产经常包括用以从生物质的其他组分部分或完全地纯化和/或浓缩所述重组酶的一个或多个下游的生物质处理步骤。然而，当在微量过滤膜上过滤或浓缩蛋白质制备物时遇到了很大的困难。过滤的目的是使包含过水解酶的溶液通过膜，同时在保留物中保留大于0.2微米或0.45微米的微粒。蛋白质经常至少部分地被膜保留而不是通过膜，而膜的孔隙率是使得所述蛋白质应当自由地通过它。

可以不利地影响回收和/或浓缩所期望的酶催化剂的能力的生物质组分之一，是DNA在细胞匀浆中的存在。然而，外源的脱氧核糖核酸酶(DNAse)的添加可能不是高性价比的，尤其是对于工业规模的发酵，并且哺乳动物来源的DNAse的使用在代加工发酵中可能是不合乎期望的。

有待解决的问题是提供容易的和高性价比的方法来获得包含具有过水解活性(perhydrolytic activity)的重组酶的浓缩物，优选不包括外源的脱氧核糖核酸酶的使用的方法。

发明概述

通过提供适用于处理包含至少一种具有过水解活性的嗜热酶的微生物细胞匀浆的两阶段热处理方法，已解决了上述问题。经热处理的微生物细胞匀浆中的不溶性组分被移除，而所得到的包含过水解酶的溶液随后被浓缩，以产生包含所述过水解酶的浓缩物。

在一个实施方案中，提供了方法，所述方法包括：

a)提供包含可溶性和不溶性组分的微生物细胞匀浆，其中所述微生物细胞匀浆包含重组生产的具有过水解活性的嗜热酶；

b)使所述微生物细胞匀浆在40℃至65℃的温度范围内经受至少4小时但不超过24小时范围的第一热处理；

c)使来自步骤b)的经热处理的微生物细胞匀浆在75℃至85℃的温度范围内经受5分钟至4小时范围的第二热处理；

d)通过离心或过滤从进行步骤b)和步骤c)之后获得的微生物细胞匀浆移除不溶性组分，以获得包含重组生产的具有过水解活性的嗜热酶的溶液；以及

e)通过过滤、蒸发或蛋白质沉淀和再溶解的组合，浓缩步骤d)的包含嗜热酶的溶液，从而获得包含具有过水解活性的重组嗜热酶的浓缩物。

在另一个实施方案中，步骤a)的微生物细胞匀浆是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞匀浆。

在另一个实施方案中，外源的核酸酶不存在于步骤a)至d)中。

在另一个实施方案中，固体组分从进行步骤b)和步骤c)之后获得的微生物细胞匀浆的移除在步骤d)中使用过滤进行。

在另一个实施方案中，固体组分从进行步骤b)和步骤c)之后获得的微生物细胞匀浆的移除在步骤d)中使用具有0.45微米至0.20微米范围尺寸排阻限的膜进行。

在另一个实施方案中，步骤d)中使用的膜保留具有大于0.2微米的平均直径的不溶性微粒。

在另一个实施方案中，不溶性组分从进行步骤b)和步骤c)之后获得的微生物细胞匀浆的移除在步骤d)中使用离心进行。

在另一个实施方案中，步骤d)中产生的溶液的浓缩在步骤e)中使用过滤进行。

在另一个实施方案中，步骤d)中产生的溶液的浓缩在步骤e)中使用具有100kDa至30kDa范围的尺寸排阻限的膜进行。

在另一个实施方案中，步骤d)中产生的溶液的浓缩在步骤e)中使用蒸发进行。

在另一个实施方案中，步骤d)中产生的溶液的浓缩在步骤e)中使用蛋白质的沉淀和再溶解的组合进行。

在另一个实施方案中，所述重组生产的嗜热酶包括CE-7特征基序，所述基序包括：

对应于SEQ ID NO：8的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

对应于SEQ ID NO：8的氨基酸位置186-190的GXSQG基序；和

对应于SEQ ID NO：8的氨基酸位置303-304的HE基序。

在另一个实施方案中，所述具有过水解活性的嗜热酶是来源于栖热袍菌属的乙酰木聚糖酯酶。

在另一个实施方案中，所述嗜热酶包含选自SEQ ID NO 2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、42、43、44、45、和46的氨基酸序列。

附图概述

图1A至1D。不同处理步骤之后的细胞裂解物上层清液的层析谱：(图1A)粗制细胞裂解物，(图1B)在50℃孵育后的细胞裂解物，(图1C)在50℃孵育和在75℃热处理后的细胞裂解物，和(图1D)在75℃热处理后的细胞裂解物(没有50℃的孵育)。所有的层析谱具有相同的垂直标度，从-100至+4500mAU。

图2A至2C。不同处理步骤之后的细胞裂解物上层清液的层析谱：(图2A)均质化和在50℃孵育，(图2B)在50℃孵育和均质化，和(图2C)在50℃孵育然后均质化，随后在75℃热处理。所有的层析谱均具有相同的垂直标度，从-100至+4500mAU。

图3第1阶段温度45℃，进行8h；第2阶段处理75℃，进行2h。

图4第1阶段温度50℃，进行8h；第2阶段处理75℃，进行2h。

图5第1阶段温度55℃，进行8h；第2阶段处理75℃，进行2h。

图6没有对细胞匀浆的热处理。

图7至21。针对用于表5中所列热处理的其余条件的SEC层析谱，全部展示了在级分42-mL至46-mL的DNA的减少，和在级分82-mL至86-mL的过水解酶的保留。

图22SEC层析谱(对照)显示了单一阶段热处理(75℃)的效应。

图23SEC层析谱(对照)显示了单一阶段热处理(85℃)的效应。

生物序列简述

下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)ST.25标准(1998)以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政规程的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

表1.具有过水解活性的CE-7糖酯酶和它们相关的序列鉴定号的不完全列表。列表中的成员来源于嗜热微生物(例如栖热袍菌)。

¹＝针对在大肠杆菌中的重组表达最优化的密码子。提供了编码野生型多肽序列的多核苷酸序列。WT＝野生型CE-7糖酯酶。

SEQ ID NO：47、48、50、和51是实施例1中使用的引物核酸序列。

SEQ ID NO：49是使用PCR引物SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48制备的多核苷酸的核酸序列。

SEQ ID NO：52是使用PCR引物SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51制备的多核苷酸的核酸序列。

SEQ ID NO：53-60是用于制备海栖热袍菌变体C277V、C277A、C277S、和C277T的寡核苷酸的序列。

发明详述

包括两个热处理步骤的本发明的方法被用于帮助纯化和/或浓缩具有过水解活性的嗜热酶，使得所述酶通过膜的滤过性能够容易地或更加容易地实现。

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。除非另外特别说明，下述定义适用。

如本文所用，在本发明的元件或组分之前的词语“一个”、“一种”和“这个”旨在表明元件或组分的实例(即出现的事物)数量为非限制性的。因此，应将“一个”、“一种”和“这个”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示其为单数。

术语“包含”是指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由......组成”和“由......组成”涵盖的实施方案。类似地，术语“基本上由......组成”旨在包括由术语“由......组成”涵盖的实施方案。

如本文所用，修饰成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于相对于由特定起始混合物所得组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。

当存在时，所有范围是包括端值在内的和可以组合的。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应被视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2&4-5”、“1-3&5”等等。

如本文所用，术语“过氧羧酸”与过酸、过氧酸、过羧酸和过氧性酸同义。

如本文所用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并与过氧乙酸、乙过氧酸以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”是指包含具有过水解活性的酶(即，多肽)的催化剂。

如本文所用，将术语“过水解”或“过水解反应”被定义为所选的底物与过氧化氢的源反应形成过氧羧酸。通常，无机过氧化物与所选底物在具有过水解活性的催化剂存在下反应以产生过氧羧酸。如本文所用，术语“化学过水解”包括其中将底物(例如过氧羧酸的前体)与过氧化氢源组合的过水解反应，其中在不存在酶催化剂的情况下形成过氧羧酸。如本文所用，术语“酶促过水解”指选择底物与过氧化氢源反应以形成过氧羧酸，其中所述反应由具有过水解活性的酶催化剂催化。

如本文所用，术语“过氧化水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)蛋白、干细胞重量或固定的催化剂重量的酶催化剂活性。

如本文所用，“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”被定义为，在指定温度每分钟产生1μmol过氧羧酸产物(例如过乙酸)所需的过水解活性的量。“一个酶活性单位”在本文中也被用于指在指定温度每分钟水解1μmol过氧羧酸产物(例如过乙酸)所需的过氧羧酸水解活性的量。

如本文所用，属于“外源的核酸酶”是指催化DNA主链中磷酸二酯键的水解裂解的非内源的酶的添加和/或存在。发酵生物质的处理经常包括可商购获得的脱氧核糖核酸酶，例如来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I(DN25；Sigma Aldrich，St.Louis，MO)，向所属生物质的外源性添加，以帮助DNA的降解。然而，外源的核酸酶的添加可以增加生物质处理的成本，并且哺乳动物来源的DNAse的使用在代加工发酵中可能是不可取的。在一个实施方案中，外源性的脱氧核糖核酸酶在本发明的方法中没有被使用。

微生物细胞匀浆的制备

本发明的方法包括使微生物细胞匀浆(包含重组生产的过水解酶)经受两个不同的热处理步骤。如本文所用，术语“微生物细胞匀浆”包含在裂解宿主细胞后获得的可溶的和不溶性的组分，所述宿主细胞被用于重组生产具有过水解活性的酶。匀浆通常包含充分含水的基质，而匀浆的相对浓度可以在开始第一热处理步骤之前被调节至所期望的浓度。微生物宿主细胞可以使用任何数量的本领域已知的方法裂解，例如化学的、酶学的、机械裂解(例如，弗氏压碎器或乳品匀化器)或它们的任何组合。在第一热处理步骤之前，微生物细胞和/或微生物细胞匀浆可以被调节pH和/或可以包括缓冲液的添加。在优选的方面，所述微生物细胞匀浆的pH可以在第一热处理之前被调节至约6.5至约7.5的pH。在另一方面，可以包括磷酸盐或碳酸氢盐缓冲液。在另一个实施方案中，硫酸镁也可以存在于所述微生物细胞匀浆中，优选以0.1至10mM范围的浓度，更优选为2mM。

两阶段热处理

本发明的方法包括两个不同的热处理步骤。

如本文所用，术语“热处理”、“热处理期”、“经热处理的”、和“加热”被用于描述使微生物细胞匀浆经受指定的温度或温度范围一段指定的时间的处理步骤。本发明的方法包括第一热处理和第二热处理。

如本文所用，术语“第一热处理”、“第一热处理期”或“孵育步骤”是指包含重组生产的嗜热酶的微生物细胞匀浆在其中经受约40℃至约65℃的温度范围内一段约4小时至24小时范围的时间的处理步骤，优选采用约45℃至约55℃的温度范围进行约4小时至约16小时。尽管不受理论的约束，所述第一热处理步骤的条件是经过选择的，使得存在于匀浆中的内源的核酸酶在所述第一热处理期的至少一部分或全部是活性的。在一个实施方案中，外源的脱氧核糖核酸酶(DNAse)不存在于所述第一和/或第二热处理步骤中。

如本文所用，术语“第二热处理”或“第二热处理期”是指从所述第一热处理得到的“经热处理的”微生物细胞匀浆在其中随后经受包括约75℃至约85℃的温度范围内一段约5分钟至约24小时的时间的第二热处理的处理步骤，优选采用约75℃至约85℃的温度范围进行约30分钟至约4小时。

不溶性组分在第二热处理之后的移除

经热处理的微生物细胞匀浆中的不溶性组分可以使用离心或过滤与可溶性组分分离。所得到的溶液包含重组生产的具有过水解活性的嗜热酶。

在一个实施方案中，所述不溶性(固体)组分从所述第二热处理之后获得的微生物细胞生物质的移除，包括使用具有0.45微米至0.20微米范围的尺寸排阻限的膜过滤。在优选的方面，所述膜保留了平均直径大于0.2微米的微粒。

然后通过过滤、蒸发或蛋白质沉淀和再溶解的组合，浓缩所得到的溶液中的嗜热酶，从而获得包含具有过水解活性的重组嗜热酶的浓缩物。

在一个实施方案中，过滤被用于浓缩不溶性组分被移除之后的溶液。在另一个实施方案中，被用于浓缩所述溶液的过滤步骤使用具有100kDa至30kDa范围的尺寸排阻限的膜。

在另一个实施方案中，蒸发被用于浓缩不溶性组分在步骤(d)中被移除之后的溶液。

在另一个实施方案中，蛋白质沉淀和再溶解的组合被用于从自步骤(d)获得的溶液产生浓缩物。

在一个实施方案中，具有过水解活性的重组嗜热酶在所述浓缩物中的重量百分比(重量％)是至少2.5重量％。在一个优选的实施方案中，具有过水解活性的重组嗜热酶在所述浓缩物中的重量百分比(重量％)是至少5.0重量％。

具有过水解活性的糖酯酶(家族7)

CE-7家族的成员包括先锋霉素C脱乙酰酶(CAH，E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共享保守的特征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。如本文所用，术语“特征基序”、“CE-7特征基序”指具有过水解活性的酶家族中共享的保守结构。

如本文所用，“结构上归类为CE-7酶”、“结构上归类为糖酯酶家族7酶”、“结构上归类为CE-7碳水化合物酯酶”和“CE-7过水解酶”将用于指具有过水解活性的酶，该酶基于存在的CE-7特征基序在结构上归类为CE-7碳水化合物酯酶(Vincent等人，同上)。如本文定义，CE-7酯酶的“特征基序”包含三个保守的基序(残基位置相对于参考序列SEQ ID NO：2编号；野生型海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶)：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly186-Xaa187-Ser188-Gln189-Gly190；和

c)His303-Glu304。

在氨基酸残基位置187的Xaa通常是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、或苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的其中两个以粗体表示。在一个实施方案中，在氨基酸残基位置187的Xaa选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

对CE-7糖酯酶家族中的保守基序的进一步分析指示存在附加的保守基序(在SEQ ID NO：2的氨基酸位置272-274的LXD)，其可用于进一步确定CE-7糖酯酶家族成员。在另一个实施方案中，上文定义的特征基序包括第四保守基序，称为：

Leu272-Xaa273-Asp274.

在氨基酸残基位置273的Xaa通常是异亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸。第四基序包括属于催化三联体(Ser188-Asp274-His303)的天冬氨酸残基(粗体)。

包含CE-7特征基序和/或基本上相似结构的过水解酶适合用于本发明的方法中，只要所述酶不被本发明的方法的第二温度处理条件永久地或充分地灭活(即，失去过水解活性)。用于鉴定基本上类似生物分子的方法是本领域众所周知的(例如序列比对方案、核酸杂交、保守特征基序的存在等)。在一个方面，所述酶催化剂可以包含与本文提供的序列具有至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、甚至更优选至少70％、更加优选至少80％、更加优选至少90％同一性，并且最优选至少95％氨基酸同一性的基本上类似的酶。

如本文所用，术语“先锋霉素C脱乙酰酶”和“先锋霉素C乙酰水解酶”是指催化先锋霉素如先锋霉素C和7-氨基头孢烷酸(Mitsushima，Kenji，等人，Appl.Environ.Microbiol.(1995)61(6)：2224-2229)的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.41)。如本文所述，提供了具有明显的过水解活性的若干种先锋霉素C脱乙酰酶。

如本文所用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰化的木聚糖和其他乙酰化的糖类的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.72；AXE)。如本文所述，提供了具有显著过氧化水解酶活性的归类为乙酰木聚糖酯酶的几种酶。

包含CE-7特征基序的CE-7糖酯酶家族的成员，具有针对从羧酸酯底物和过氧化物源如过氧化氢产生过氧羧酸的优异的过水解活性(公布于DiCosimo等人的美国专利申请公布2008-0176783中)。来源于从嗜热微生物(例如栖热袍菌属的成员)获得的天然存在的乙酰木聚糖酯酶的变体酶的宿主也已被生产。表1中提供了来源于栖热袍菌属乙酰木聚糖酯酶的过水解酶的非限制性列表。

具有过水解活性的嗜热酶

如本文所用，术语“具有过水解活性的嗜热酶”或“嗜热过水解酶”将指具有过水解活性的糖酯酶家族7酶(先锋霉素脱乙酰酶和乙酰木聚糖酯酶)，其中本发明的热处理方法不会显著地影响所述酶的过水解活性。在一个实施方案中，如果使酶经受所述第二热处理步骤(即，暴露于升高的温度中一段指定的时间)没有不利地影响所述酶的过水解活性，则该酶催化剂将被认为是温度稳定的(即，“嗜热酶”)。在另一个实施方案中，如果将酶在75℃至85℃的温度范围内暴露一段5分钟至4小时的热处理期没有显著地降低所述酶的过水解活性，则该酶催化剂可以被认为是“温度稳定的”(即，嗜热的)。

在一个实施方案中，具有过水解活性的嗜热酶是来源于嗜热微生物如栖热袍菌细菌属中的物种的乙酰木聚糖酯酶。在另一个优选的实施方案中，所述嗜热酶可以是来自嗜热微生物的乙酰木聚糖酯酶的变体，只要该变体在暴露于所述第二热处理中使用的条件之后保持了过水解活性。在另一个优选的方面，具有过水解活性的嗜热酶是来自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌、莱廷格热袍菌、Thermotoga petrophila、和栖热袍菌属RQ2的乙酰木聚糖酯酶或它们的变体。酶的非限制性列表提供于表1中。

在另一个实施方案中，具有过水解活性的嗜热酶包含选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、42、43、44、45、和46的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述嗜热酶在微生物宿主细胞中被重组表达。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个优选的实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、和假单胞菌属(Pseudomonas)。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌。

羧酸酯底物

具有过水解活性的CE-7酶能够使用多种羧酸酯底物(在适当的过氧化物源的存在下)来生产一种或多种过酸，如过乙酸。羧酸酯底物的实例可包括但不限于：

一种或多种具有下列分子式的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基

R₆＝C1至C7的直链的、支链的或环状的烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R6＝C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅＝C1至C6的直链的、支链的或环状的烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m是从1至R₅中碳原子数量范围的整数；并且

其中所述酯具有在25℃至少5ppm的水中溶解度。

在另一个实施方案中，R₆为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7支链的烃基部分，任选地包含一个或多个醚键。在另一个优选的实施方案中，R₆为任选地被羟基取代的C2-C7直链的烃基部分和/或任选地包含一个或多个醚键。

如本文所用，术语“烃基”和“烃基部分”指直链、支链或环状排列的碳原子，碳原子通过碳-碳单键、双键或三键和/或醚键连接且相应地被氢原子取代。此类烃基可以是脂族的和/或芳族的。烃基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在一个实施方案中，烃基部分是直链的、支链的或环状的碳原子排列，碳原子通过碳-碳单键和/或醚键连接，并且相应地被氢原子取代。

在另一个实施方案中，适合的底物还包括符合下列分子式的一种或多种甘油酯：

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C21直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)。

在另一方面，适合的底物还可以包括符合下列分子式的一种或多种酯：

其中R₁是任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂是C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n，或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n是1至10。

适合的底物还可以包括一种或多种选自酰化的单糖、二塘、和多糖的酰化的糖类。在另一个实施方案中，酰化的糖类选自乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙酰化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半乳醛、三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖、以及乙酰化纤维素。在一个优选的实施方案中，乙酰化糖类选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半乳醛、三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖、以及乙酰化纤维素。

在另一个实施方案中，适合的底物选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯，甘油一丙酸酯，甘油二丙酸酯，甘油三丙酸酯，甘油一丁酸酯，甘油二丁酸酯，甘油三丁酸酯，葡萄糖五乙酸酯，木糖四乙酸酯，乙酰化木聚糖，乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-O-乙酰基-D-半乳醛，三-O-乙酰基-D-葡萄烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯，以及它们的混合物。

在另一个实施方案中，羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的组合。在另一个实施方案中，所述底物为包含一个或多个酯基的C1-C6多元醇。在一个优选的实施方案中，在C1-C6多元醇上的一个或多个羟基被一个或多个乙酰氧基(例如1，3-丙二醇二乙酸酯、1，4-丁二醇二乙酸酯等)取代。在另一个实施方案中，所述底物为丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二乙酸酯(EGDA)、或它们的混合物。

在另一个实施方案中，适合的底物选自：乙酸乙酯；乳酸甲酯；乳酸乙酯；乙醇酸甲酯；乙醇酸乙酯；甲氧基乙酸甲酯；甲氧基乙酸乙酯；3-羟基丁酸甲酯；3-羟基丁酸乙酯；2-乙酰柠檬酸三乙酯；葡萄糖五乙酸酯，葡糖酸内酯；甘油酯(甘油单酯、二酯、和三酯)如甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯(二丙酸甘油基酯)、甘油三丙酸酯(1，2，3-三丙酰基甘油)、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯(二丁酸甘油基酯)、甘油三丁酸酯(1，2，3-三丁酰基甘油)；乙酰化的糖类；以及它们的混合物。

在另一个实施方案中，合适的底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在又一方面，所述底物选自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在最优选的实施方案中，适合的底物包括甘油三乙酸酯。

用于测定过氧羧酸和过氧化氢浓度的方法。

本发明的方法能够使用多种分析方法分析反应物和产物，包括但不限于滴定、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、毛细管电泳(CE)、由U.Karst等人(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627(1997))描述的分析方法、和2，2′-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸(ABTS)测定法(S.Minning，等人，Analytica Chimica Acta 378：293-298(1999)和WO2004/058961A1)，如美国专利申请公布2008-0176783中所述。

过水解酶的重组表达

多种培养方法可用来生产过水解酶催化剂。从重组微生物宿主过表达的特定基因产物的大规模生产可通过分批、分批补料或连续培养的方法进行。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA (1989)和Deshpande、Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)。

在一个实施方案中，所期望的过水解酶催化剂的商业生产通过连续培养进行。连续培养是开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，并且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体支持体进行，所述固体支持体由天然材料和/或合成材料组成。

可通过本领域的技术人员已知的任何方法实现从分批或分批补料发酵或连续培养中回收所期望的过水解酶催化剂。例如，当在细胞内生产酶催化剂时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆液，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆液悬浮使其裂解或均质化，以生产出包含所期望的酶催化剂的细胞提取物。

当含量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。当本文描述数值范围时，除非另外指明，所述范围旨在包括其端点，以及所述范围内的所有整数和分数。当定义一个范围时，不旨在将范围限定于所列举的具体数值。

一般方法

提供以下实施例来说明优选实施方案。本领域的技术人员应认识到下文实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本文所公开方法的实施中功能良好的技术，因此可认为其构成实施的优选模式。然而，本领域的技术人员应依据本发明理解的是，在不背离本发明所公开方法的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多更改并仍能获得相同或相似的结果。

所有试剂和材料均得自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，TCI America(Portland，OR)，Roche DiagnosticsCorporation(Indianapolis，IN)或Sigma-Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另外指明。

本说明书中的下列缩写对应于量度、技术、特性、或化合物的单位如下：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指毫摩尔，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“ppm”指百万分之一或几，“wt”指重量，“wt％”指重量百分比，“g”指克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“g”指重力，“HPLC”指高效液相色谱法，“dd H₂O”指蒸馏和去离子水，“dcw”指干细胞重量，“ATCC”或

指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，“U”指过水解酶活性单位，“rpm”指每分钟转数，“EDTA”指乙二胺四乙酸，“slpm”指标准升每分钟，“IPTG”指异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷，“DTT”指二硫苏糖醇，“BCA”指二喹啉甲酸。

实施例1

来自海栖热袍菌的乙酰木聚糖酯酶的克隆和表达

合成(DNA 2.0，Menlo Park CA)了如

(登录号NP_227893.1)中所报道的编码来自海栖热袍菌(氨基酸序列SEQ IDNO：8)的乙酰木聚糖酯酶的基因。随后通过PCR(94℃0.5min，55℃0.5min，70℃1min，30个循环)扩增了所述基因，所述PCR使用标识为SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的引物。用限制酶PstI和XbaI切割了所得到的核酸产物(SEQ ID NO：49)并亚克隆至pUC19中的PstI和XbaI位点之间，以产生被标识为pSW207的质粒。使用针对大肠杆菌(E.coli)中的表达优化的密码子合成(DNA 2.0，Menlo Park CA)了如(登录号NP_227893.1；氨基酸序列SEQ ID NO：8)中所报道的编码来自海栖热袍菌的乙酰木聚糖酯酶的基因。随后通过PCR(94℃0.5min，55℃0.5min，70℃1min，30个循环)扩增所述基因，所述PCR使用标识为SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的引物。用限制酶EcoRI和PstI切割了所得到的核酸产物(SEQ ID NO：52)并亚克隆至pTrc99A

登录号M22744)中的EcoRI和PstI位点之间，以产生被标识为pSW228(包含密码子优化的海栖热袍菌编码序列SEQ ID NO：7)的质粒。质粒pSW207和pSW228被用于转化大肠杆菌KLP18(美国专利申请公布2008-0176299)以分别产生被标识为KLP18/pSW207和KLP18/pSW228的菌株。KLP18/pSW207和KLP18/pSW228于37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至最终浓度为1mM并继续孵育2-3h。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的20-40％。

实旋例2

构建在残基C277上的海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体

使用寡核苷酸引物对(表2)将海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶的C277(Cys277)位置各自变为Val、Ala、Ser和Thr，所述引物对基于质粒pSW228中海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：7)的经密码子最优化的序列进行设计。使用

(产品商标)按照制造商的说明书制造突变。用1U Dpnl在37℃处理扩增质粒1小时。处理后的质粒用于转化化学感受态大肠杆菌XL1-Blue(产品商标)。将转化体置于加入0.1mg氨苄青霉素/mL的LB-琼脂平板上并在37℃生长过夜。采集至多五个个体菌落并对质粒DNA测序以确认期望的突变。

表2.用于在海栖热袍菌中改变残基277的寡核苷酸

实施例3

在大肠杆菌KLP18中表达海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体

使用具有确认的乙酰木聚糖酯酶突变的质粒转化大肠杆菌KLP18(实施例1)。将转化体在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3h。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认乙酰木聚糖酯酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例4

使用1-升生物反应器在大肠杆菌KLP18中表达栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体

使用具有确认的乙酰木聚糖酯酶突变的质粒转化大肠杆菌KLP18(实施例1)。将转化体置于LB-氨苄青霉素(100μg/mL)平板上并在37℃过夜培养。从平板上收获细胞，所述平板使用2.5mL LB培养基，其中补充有20％(v/v)甘油和1.0mL冷冻在-80℃的所得细胞悬浮液的等分试样。将1mL解冻细胞悬浮液转化到具有0.7L培养基的生物反应器

Biotechnology，Foster City，CA)中，所述培养基包含KH₂PO₄(5.0g/L)，FeSO₄七水合物(0.05g/L)，MgSO₄七水合物(1.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.90g/L)，酵母提取物(Amberex 695，5.0g/L)，Biospumex 153K消泡剂(0.25mL/L，Cognis Corporation)，NaCl(1.0g/L)，CaCl₂二水合物(0.1g/L)，和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。痕量元素溶液包含一水合柠檬酸(10g/L)，MnSO₄水合物(2g/L)，NaCl(2g/L)，FeSO₄七水合物(0.5g/L)，ZnSO₄七水合物(0.2g/L)，CuSO₄五水合物(0.02g/L)和NaMoO₄二水合物(0.02g/L)。在灭菌后加入葡萄糖溶液(50％w/w，6.5g)和氨苄青霉素(25mg/mL)储备液(2.8mL)。葡萄糖溶液(50％w/w)也用于分批补料。在葡萄糖浓度降低到低于0.5g/L后40min，开始补加葡萄糖，起始进料速率为0.03g/min，随后每小时分别逐渐增加至0.04、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.12和0.14g/min；之后速率保持不变。监控培养基中的葡萄糖浓度，如果该浓度超过0.1g/L，降低给料速率或暂时中止给料。在OD₅₅₀＝50时，加入0.8mL IPTG(0.05M)开始诱导。控制溶解氧(DO)浓度为25％的空气饱和度，首先通过搅拌(400-1000rpm)、随后通过透气(0.5-2slpm)进行控制。温度被控制在37℃，并且pH被控制在6.8；NH₄OH(29％w/w)和H₂SO₄(20％w/v)被用于控制pH。在添加IPTG后20h时通过离心(5,000×g15分钟)收获细胞。

实施例5

制备包含半纯化的海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的细胞溶解产物

用与实施例4中所述相似的发酵方案以1L规模(Applikon)培育了细胞培养物。在5,000×g离心15分钟收获的细胞重悬(20％w/v)在pH7.0、补充有1.0mM DTT的50mM磷酸盐缓冲液中。使得重悬细胞两次通过弗氏压碎器以确保＞95％的细胞裂解。

实施例6

孵育包含海栖热袍菌野生型过水解酶的大肠杆菌KLP18/psW228细胞裂解物以移除DNA

通过将1828克冷冻的细胞团以250克每升的湿细胞重量载量悬浮于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，制备了包含野生型海栖热袍菌过水解酶的大肠杆菌KLP18/psW228(实施例1)细胞悬液。如表3中所示处理了上述细胞悬液的等分试样。在于50℃孵育约18小时之前，向细胞悬液的每一等分试样加入硫酸镁(2mM)。每一处理的全部处理步骤结束时，两份40-mL的样品被离心，上层清液被冷冻于-80℃。随后采用下列规程对解冻的样品进行了尺寸排阻层析：HILOAD^TM26/60柱(GE Healthcare)，SUPERDEX^TM200制备级填料(GE Healthcare)，用2.5mL/min的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)在20℃等度洗脱，在260，280和400nm监测柱洗脱液。

表3.生产用于尺寸排阻层析的样品的处理步骤。孵育进行约18小时的时间，并且热处理进行约2小时。

海栖热袍菌过水解酶具有约95分钟的保留时间，在更早的保留时间从柱上洗脱的样品的组分主要由DNA组成，其中260nm/280nm吸光度的比率为大约2，并且通过凝胶电泳分析了这些收集的级分以确认DNA的存在。

图1A至1D显示了用四种不同的处理步骤处理的细胞裂解物上层清液的层析谱：(图1A)粗制细胞裂解物(没有孵育或热处理)，(图1B)在50℃孵育后的细胞裂解物，(图1C)在50℃孵育然后在75℃热处理后的细胞裂解物，和(图1D)在75℃热处理后的细胞裂解物(没有50℃的孵育)。所有的层析谱均具有相同的垂直标度，从-100至+4500mAU。粗制细胞裂解物(图1A)中的DNA组分(具有小于75-80min的保留时间的组分)通过在50℃孵育被移除(图1B)，导致具有约130-140min的保留时间的低分子量DNA片段的增加。通过在50℃孵育然后在75℃热处理的组合(图1C)，实现了对所述细胞裂解物附加的纯化，而显著量的DNA依然存在于在75℃热处理但没有预先在50℃孵育的细胞裂解物中。

当孵育步骤在包含所述过水解酶的大肠杆菌细胞的均质化之前进行时，其对于DNA的移除不是有效的。图2A至2C显示了根据下列程序制备的样品的层析谱：(图2A)均质化然后在50℃孵育，(图2B)在50℃孵育细胞悬液然后均质化，并且(图2C)在50℃孵育然后均质化，随后在75℃热处理；均质化之前的孵育对于DNA的移除不是有效的(参见图2B和图2C)。

实施例6

孵育包含海栖热袍菌C277S过水解酶变体的大肠杆菌KLP18细胞裂解物以移除DNA

使用45℃的孵育温度和包含海栖热袍菌C277S过水解酶(参见实施例2和3；SEQ ID NO：11)的大肠杆菌KLP18细胞裂解物重复实施例5中所述的步骤。进行对(1)没有孵育、(2)在45℃孵育而不添加硫酸镁、和(3)在45℃和2mM硫酸镁的存在下孵育之后的细胞裂解物上层清液的层析分析。粗制细胞裂解物中的DNA组分(具有小于75-80min的保留时间的组分)通过在45℃孵育被移除，导致具有约130-140min的保留时间的低分子量DNA片段的增加。50min处的在400nm吸收的样品组分不是DNA组分。

实施例7

对包含海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的细胞裂解物的两阶段热处理

通过进行下文的表4中概述的两阶段热处理研究，检测了孵育时间和温度以及热处理温度对包含过水解酶的大肠杆菌细胞匀浆中DNA浓度的降低的效应。匀浆的一份50-mL等分试样被置于125-mL无菌一次性摇瓶中，并置于摇动培养箱中进行8h或16h的阶段1热处理(孵育)。在第一阶段结束时，烧瓶被转移至摇动水浴，处于升高的阶段2温度2h。在进行分析前，通过离心使所得到的包含过水解酶的混合物澄清。

表4.

由于更多的大肠杆菌蛋白质随着阶段二温度的升高而沉淀，因此最终的经热处理的上层清液的蛋白质浓度主要地是阶段二热处理温度的函数。

表5中报道了在两阶段热处理之后以pNPA单位每g(mL)澄清的上层清液计的总活性。

表5.

导致最高的比活性(U/mg蛋白质)的两阶段热处理条件并不同样产生最高的每一处理的上清液重量(体积)的总活性；在45℃或50℃进行16小时的阶段1加上在75℃进行2小时的阶段2处理产生最高的总pNPA活性，如同在45℃处理8小时然后在75℃进行2小时一样。

SEC层析谱展示了当第1阶段温度为55℃并且第2阶段处理为75℃进行2h时，与过水解酶(82-mL至86-mL级分中的峰)部分地共洗脱的洗脱液的产生。最佳的分辨率是在45℃的第1阶段温度下；在50℃仍有分辨，但所述过水解酶峰在55℃不能分辨(分别为图3、4、和5)。未处理的细胞匀浆的SEC层析谱显示于图6中以供比较，其中DNA在42-mL至46-mL级分中洗脱。

针对用于表5中所列热处理的其余条件的SEC层析谱(显示于图7至21中)，全部展示了在级分42-mL至46-mL的DNA的减少，和在级分82-mL至86-mL的过水解酶的保留。

显示在75℃或85℃进行2小时的单阶段热处理的效应的两个附加的对照实现的结果，分别提供于图22和23的SEC层析谱中。在75℃或85℃进行2hr的单阶段热处理之后，仍然存在显著量的DNA。

实施例8

包含海栖热袍菌C277S过水解酶变体的经热处理的大肠杆菌细胞匀浆的过滤

使用以12,000psig(大约82.74MPa)运行的乳品匀浆器制备了包含海栖热袍菌C277S过水解酶变体的大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S匀浆(通过BCA蛋白质测定法测定为9.9mg/mL总蛋白)，匀浆的pH被调节至pH 7.3，并添加了硫酸镁(2mM)。所得到的匀浆被分为五个等分试样(A-E；250-mL等分试样)并进行处理如下：(A)在50℃孵育16h同时缓慢混合，(B)在50℃孵育5h同时缓慢混合，(C，对照)添加DNAse至0.5mg每升并在50℃孵育5h同时缓慢混合，(C，对照)添加DNAse至0.5mg每升并在50℃孵育16h同时缓慢混合，(E，对照)没有热处理的匀浆。对于包含DNAse(DN25，Sigma/A1drich)的对照反应，DNAse溶液被制备为1mg/mL，溶于包含5mMMgSO₄的KPB缓冲液(25mM，pH 7.0)。每种匀浆的样品首先通过离心被澄清，然后使用Nanosep 0.2微米旋转过滤器(PALL)过滤2min，测定了回收的过滤液与起始匀浆相比的百分比。与没有在50℃热处理相比，在50℃孵育5h导致了匀浆的滤过性的显著改善，而当在热处理之前加入0.5mg/LDNAse时，没有实现滤过性的显著改善(表6)。

表6。

等分试样	处理	滤液(重量％)
			E	无	33
A	在50℃孵育16h	84
			B	在50℃孵育5h	77
C	在50℃与0.5mg/L DNAse孵育5h	82
			D	在50℃与0.5mg/L DNAse孵育16h	82

实施例9

使用表7中描述的温度和孵育时间，重复了实施例8中所述的流程；通过在孵育之前添加0.5mg/L DNAse至匀浆来进行对照反应。表8和9中报道了使用表7中的规程获得的过滤结果。通过首先在81℃热处理匀浆的一份等分试样1h，然后冷却至50℃并在DNAse的添加或不添加下孵育5h或21h来进行对照实验，以展示在较高的温度经受单阶段热处理的匀浆与在50℃孵育相比显著更低的滤过性(表10)。

表7：热处理规程。

等分试样	温度(℃)	DNAse	时间，hr
				A	30	-	5或21
B	30	+	5或21
				C	40	-	5或21
D	40	+	5或21
				E	50	-	5或21
F	50	+	5或21
				G	60	-	5或21
H	60	+	5或21
				I	70	-	5或21
J	70	+	5或21
				K	50	-	5或21
L	50	+	5或21

表8：在DNAse的添加和不添加下于不同温度孵育5hr之后的匀浆的过滤结果。

处理	％滤液	标准偏差
			0hr	4.9	1.36
30℃	9.1	0.51
			30℃有DNAse	68.3	1.37
40℃	44.3	6.17
			40℃有DNAse	32.9	6.76
50℃	80.6	13.66
			50℃有DNAse	89.8	0.96

60℃	18.7	0.57
			60℃有DNAse	48.4	0.96
70℃	23.1	2.59
			70℃有DNAse	61.2	17.54

表9：在DNAse的添加和不添加下于不同温度孵育21hr之后的匀浆的过滤结果。

等分试样	％滤液	标准偏差
			0hr	4.9	1.36
30℃	34.5	5.56
			30℃有DNAse	20.5	13.58
40℃	74.1	2.15
			40℃有DNAse	83.8	0.78
50℃	73.3	1.23
			50℃有DNAse	69.3	6.55
60℃	58.4	48.62
			60℃有DNAse	48.8	1.60
70℃	27.5	0.55
			70℃有DNAse	53.1	0.48

表10：在DNAse的添加和不添加下经热处理(81℃，1hr)随后在50℃ 孵育5hr或21hr的匀浆的过滤结果。

处理	％滤液	标准偏差
			0hr	1.4	1.4
50℃，5hr	13.7	13.7
			50℃，5h有DNAse	1.0	1.0
50℃，21hr	1.5	1.5
			50℃，21hr有DNAse	0.7	0.7

Claims

1.方法，其包括：

(a)提供包含可溶性和不溶性组分的微生物细胞匀浆，其中所述微生物细胞匀浆包含重组生产的具有过水解活性的嗜热酶；

(b)使所述微生物细胞匀浆在40℃至65℃的温度范围内经历至少4小时但不超过24小时范围的第一热处理期；

(c)使来自步骤(b)的经热处理的微生物细胞匀浆在75℃至85℃的温度范围内经历5分钟至4小时范围的第二热处理期；

(d)通过离心或过滤从进行步骤(b)和步骤(c)之后获得的微生物细胞匀浆移除所述不溶性组分，以获得包含重组生产的具有过水解活性的嗜热酶的溶液；以及

(e)通过过滤、蒸发或蛋白质沉淀和再溶解的组合，浓缩步骤(d)的包含嗜热酶的溶液，从而获得包含具有过水解活性的重组嗜热酶的浓缩物。

2.权利要求1的方法，其中所述重组生产的具有过水解活性的嗜热酶包含糖酯酶家族7(CE-7)特征基序，所述CE-7特征基序包括：

(a)对应于SEQ ID NO：8的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

(b)对应于SEQ ID NO：8的氨基酸位置186-190的GXSQG基序；和

(c)对应于SEQ ID NO：8的氨基酸位置303-304的HE基序。

3.权利要求2的方法，其中所述具有过水解活性的嗜热酶是来源于栖热袍菌属的乙酰木聚糖酯酶。

4.权利要求3的方法，其中所述嗜热酶包含选自SEQ ID NO 2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、42、43、44、45、和46的氨基酸序列。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤(a)的微生物细胞匀浆是大肠杆菌细胞匀浆。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤(a)至(d)中不存在外源的核酸酶。

7.权利要求1的方法，其中所述第一热处理期为4小时至不超过16小时的范围，温度范围为45℃至55℃。

8.权利要求1-4或7中任一项的方法，其中所述第二热处理期为30分钟至4小时的范围，温度范围为75℃至85℃。

9.权利要求1-4或7中任一项的方法，其中在所述微生物细胞匀浆中存在硫酸镁。

10.权利要求1-4或7中任一项的方法，其中具有过水解活性的重组嗜热酶在所述浓缩物中的重量百分比(重量％)为至少2.5重量％。

11.权利要求10的方法，其中具有过水解活性的重组嗜热酶在所述浓缩物中的重量百分比(重量％)为至少5.0重量％。

12.权利要求1-4或7中任一项的方法，其中固体组分从进行步骤(b)和步骤(c)之后获得的微生物细胞匀浆的移除在步骤(d)中使用过滤进行。

13.权利要求12的方法，其中固体组分从进行步骤(b)和步骤(c)之后获得的微生物细胞匀浆的移除在步骤(d)中使用具有0.45微米至0.20微米范围的尺寸排阻限的膜进行。

14.权利要求13的方法，其中所述膜保留平均直径大于0.2微米的微粒。

15.权利要求1-4或7中任一项的方法，其中固体组分从进行步骤(b)和步骤(c)之后获得的微生物细胞匀浆的移除在步骤(d)中使用离心进行。

16.权利要求1-4或7中任一项的方法，其中在步骤(d)中产生的溶液的浓缩在步骤(e)中使用过滤进行。

17.权利要求16的方法，其中在步骤(d)中产生的溶液的浓缩在步骤(e)中使用具有100kDa至30kDa范围的尺寸排阻限的膜进行。

18.权利要求1-4或7中任一项的方法，其中在步骤(d)中产生的溶液的浓缩在步骤(e)中使用蒸发进行。

19.权利要求1-4或7中任一项的方法，其中在步骤(d)中产生的溶液的浓缩在步骤(e)中使用蛋白质的沉淀和再溶解的组合进行。