ES2381207T3 - Nuevos genes de trichoderma - Google Patents

Abstract

Polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma; (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma; (c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma; (d) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma; (e) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma; (f) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma; y (g) una secuencia de ácidos nucleicos presentada como SEC ID No. 14, o el complemento de la misma, en el que el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con los parámetros por defecto, que incluyen una penalización por la abertura de espacio de 10, 0, una penalización por la extensión del espacio de 0, 1, y una matriz de similitud BLOSUM 30.

Description

Nuevos genes de Trichoderma

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se describen en la presente invención cuatro genes – dos genes que codifican proteínas que comprenden un dominio de unión a celulosa, una arabinofuranosidasa, y una acetilxilano esterasa. También se describen aquí las proteínas deducidas, y las composiciones que tienen las nuevas proteínas. Estas composiciones son especialmente útiles en aplicaciones textiles, detergentes, conversión de biomasa, pienso y alimentos, y las industrias de la pulpa y el papel. Los genes se aislaron a partir de un hongo filamentoso, Trichoderma reesei (también denominado indistintamente aquí Hypocrea jecorina).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La celulosa y la hemicelulosa son los materiales más abundantes de las plantas producidos por fotosíntesis. Se pueden degradar y utilizar como fuente de energía por numerosos microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de la hidrólisis de los sustratos poliméricos a azúcares monoméricos (Aro et al., J. Biol. Chem., 10.1074/ M003624200, 13 de abril de 2001). Dado que se acercan los límites de los recursos no renovables, el potencial de la celulosa para convertirse en una energía renovable principal es enorme (Krishna et al., Bioresource Tech. 77:193-196, 2001). La utilización eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos es una estrategia para superar la escasez de alimentos, pienso y combustibles (Ohmiya et al., Biotechnol. Gen. Engineer. Rev. 14:365-414, 1997).

La celulosa es un polisacárido lineal de residuos de glucosa conectados mediante uniones 1-1,4. En la naturaleza, la celulosa está normalmente asociada con lignina junto con hemicelulosas, tales como xilanos y glucomananos. El uso práctico de las celulasas está dificultado por la naturaleza de las celulasas conocidas, que a menudo son mezclas de celulasas que tienen una variedad actividades y especificidades de sustrato. Por esta razón, es deseable identificar celulasas que tienen sólo las actividades deseadas o proteínas que pueden facilitar la acción de la celulasa.

La hemicelulosa es cualquiera de los diversos heteropolímeros (polisacáridos en matriz) presentes en casi todas las paredes celulares junto con celulosa. Sus pesos moleculares son habitualmente inferiores a los de la celulosa y presentan una estructura no diferenciada débil en comparación con la celulosa cristalina. Las cadenas forman una “base” - se unen con pectina a la celulosa para formar un red de fibras reticuladas. De este modo, sería beneficioso aumentar la degradación de la hemicelulosa.

Las O-Glicosil hidrolasas (EC 3.2.1.-) con un grupo amplio de enzimas que hidrolizan el enlace glicosídico entre dos

o más carbohidratos, o entre un carbohidrato y un grupo no carbohidrato. EL sistema de clasificación para las glicosil hidrolasas, basada en la similitud de secuencias, ha conducido a la definición de hasta 60 familias diferentes [HENRISSAT, B. AND BAIROCH, A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. BIOCHEM.J. 293 781-788 (1993); HENRISSAT, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. BIOCHEM.J. 280 309-316 (1991); DAVIES, G. AND HENRISSAT, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. STRUCTURE 3 853-859 (1995); and HENRISSAT, B. AND BAIROCH, A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. BIOCHEM.J. 316 695-696 (1996)]. Las acetil xilano esterasas (EC 3.1.1.72) son un grupo de enzimas que eliminan grupos laterales acetilos a partir de xilano. El sistema de clasificación para carbohidrato esterasas, basado en la similitud de secuencias, ha conducido a la definición de 13 familias, siete de las cuales contienen acetil xilano esterasas (COUTINHO, P.M. AND HENRISSAT, B., 1999 Carbohydrate-active enzymes server at URL: <http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html>).

Con el fin de ser eficientes, la digestión de celulosa requiere de varios tipos de enzimas actuando de manera cooperativa. Son necesarias por lo menos tres categorías de enzimas para convertir la celulosa en glucosa: endo (1,4)-beta-D-glucanasas (EC 3.2.1.4) que cortan las cadenas de celulosa al azar; celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) que dividen las unidades de celobiosilo de los extremos de las cadenas de celulosa y beta-glucosidasas (EC

3.2.1.21 ) que convierten la celobiosa y las celodextrinas solubles en glucosa.

Margolles-Clark et al. (Eur. J. Biochem. 237, 553-560 (1996)) describen la clonación del gen que codifica AXE1 de

Trichoderma reesei.

Gutiérrez et al. (FEBS Letters 423 (1998) 35-38) caracterizan una acetil xilano esterasa II de Penicillin purpurogenum y la comparan con AXE1 de Trichoderma reesei.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas mejoradas que tienen una actividad degradante de celulosa o hemicelulosa y polinucleótidos que codifican las proteínas. Un objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas mejoradas que tienen actividad de unión a celulosa o hemicelulosa y polinucleótidos que codifican las proteínas. Las proteínas mejoradas pueden mejorar la degradación del material de la pared celular, por ejemplo, celulosa y/o hemicelulosa. Las proteínas también pueden mejorar la estabilidad o la actividad de otras enzimas implicadas en la degradación del material de la pared celular de la planta, por ejemplo, biomasa.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

Se describen aquí genes nuevos, denominados aquí cip1, cip2, axe2 y abf2. También se describen aquí los productos génicos codificados por los genes nuevos. Por lo menos dos genes se coexpresan con los genes en la familia de celulasa.

AXE2

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido tal como se define en las reivindicaciones. El polinucleótido puede ser ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico o un análogo no codificante de los mismos. En una realización específica, el polinucleótido comprende una secuencia sustancialmente idéntica a la SEC ID No. 14.

En un segundo aspecto, se proporcionan los polipéptidos o proteínas AXE2 tal como se definen en las reivindicaciones.

En una realización, la presente invención incluye (i) fragmentos de AXE2 de por lo menos aproximadamente 20-100 aminoácidos de longitud, más preferiblemente aproximadamente 100-200 aminoácidos de longitud, y (iii) una composición que comprende AXE2.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos, que codifica el polipéptido de la presente invención, unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la invención.

La presente invención proporciona además vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica AXE2 o un fragmento del mismo unido operativamente a elementos reguladores eficaces para la expresión de la proteína en un huésped seleccionado. En un aspecto relacionado, la presente invención incluye una célula huésped que contiene el vector.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la invención.

La presente invención también incluye un método para producir AXE2 mediante técnicas recombinantes, mediante el cultivo de células huésped recombinantes procariotas o eucariotas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica AXE2 bajo condiciones efectivas para inducir la expresión de la proteína, y la posterior recuperación de la proteína de la célula huésped o el medio de cultivo de la célula.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido de la invención, comprendiendo el método: (a) cultivar un microorganismo tal como se define en las reivindicaciones; y (b) recuperar el polipéptido.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse que, sin embargo, la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan a modo únicamente de ilustración, ya que serán evidentes para un experto en la materia a partir de esta descripción detallada varios cambios y modificaciones en el alcance y espíritu de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 es una representación en cadena sencilla de la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID NO:1), del ADNc de cip1 de T. reesei, donde la secuencia no codificante está subrayada.

La figura 2 es la secuencia codificante para cip1 de T. reesei (SEC ID No. 2), donde la secuencia señal codificada se indica con los nucleótidos en negrita.

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos prevista de CIP1 (SEC ID no. 3), la secuencia señal (SEC ID No. 4) y la secuencia de la proteína madura (SEC ID No. 5) en base a la secuencia de nucleótidos proporcionada en la figura 1.

La figura 4 es la secuencia codificante para cip2 de T. reesei (SEC ID NO:6).

La figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos prevista de CIP2 (SEC ID No. 7), la secuencia señal (SEC ID No.

8) y la secuencia de la proteína madura (SEC ID No. 9) en base a la secuencia de nucleótidos proporcionada en la figura 4.

La figura 6 es una alineación de CIP2 con R.flavefaciens cesA CAB55348. CIP2 tiene la secuencia señal N-terminal prevista de 17 aminoácidos seguido de 36 aminoácidos que comprende una molécula de unión a carbohidrato de la familia CBM1 y región de unión que acaba aproximadamente en el aminoácido 95.

La figura 7 es una representación en cadena sencilla de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID No. 10), del gen abf2 de T. reesei que codifica una arabinofuranosidasa.

La figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos prevista de ABF2 (SEC ID No. 11), la secuencia señal (SEC ID No. 12) y la secuencia de la proteína madura (SEC ID No. 13) basadas en la secuencia de nucleótidos proporcionada en la figura 7.

La figura 9 es una alineación de ABF2 con ARF1 de C. carbonum y stxIV de S. thermoviolaceus.

La figura 10 es la secuencia de ADNc para el gen axe2 (SEC ID No. 14) que codifica una acetilxilano esterasa.

La figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos prevista de AXE2 (SEC ID no. 15), la secuencia señal (SEC ID No. 16) y la secuencia de la proteína madura (SEC ID No. 17) en base a la secuencia de nucleótidos proporcionada en la figura 9.

La figura 12 es una alineación de secuencia de AXE2 con AXE1 de T. reesei.

La figura 13 muestra una transferencia Northern para dos cepas fúngicas bajo condiciones variantes. Os cultivos de QM6a y RLP-37 se desarrollaron en glucosa (carriles A), celulosa (Carriles B), glicerol (Carriles C) o glicerol complementado con soforosa (carriles D), El ARNm de cada uno de los cultivos se analizó mediante transferencia Northern. El grupo de bandas superior para cada gen se sondó con ADNcs marcados tal como se indica. El grupo de bandas inferior para cada gen se sondó con una sonda de actina para corregir las diferencias en la carga y las diferencias en los tiempos de expansión requeridos para visualizar las bandas.

La figura 15 es una representación de los resultados a partir de un análisis microarray realizado para valorar los niveles de expresión para cada uno de los genes indicados. A) Análisis de matriz de agitación de la inducción soforosa en dos cepas diferentes. El ARNm de los cultivos de QM6a y RL-P37 desarrollados en glicerol o glicerol complementado soforosa 1 mM se marcaron individualmente con los colorantes fluorescentes Cy5 y con Cy3, El ARNm marcado de los cultivos desarrollados con soforosa se combinó con ARNm marcado recíprocamente de los cultivos desarrollados con glicerol y se hibridaron a microarrays. La proporción logarítmica de las dos muestras de ARNm marcadas diferentes que se unieron a sondas para cada uno de los genes se indica según la barra de colores siguiente. L.R.: proporción logarítmica. El color refleja la magnitud de la inducción mediada con soforosa de cada uno de los genes indicados. Columna 1: inducción por soforosa en cultivos RL-P37. Columna 2: inducción por soforosa en cultivos QM6a. Columna 3: ARNm marcado fluorescentemente de cultivos RL-P37 inducidos por soforosa se cohibridizó con ARNm marcado recíprocamente de cultivos QM6a inducidos por soforosa desarrollados en condiciones similares. El color refleja la abundancia de ARNm correspondiente a cada uno de los genes en RL-P37 en relación a QM6a. B) Análisis de los niveles de expresión durante el cultivo en diferentes fuentes de carbono en fermentadores. Se desarrollaron inicialmente los micelios de RLP-37 y QM6a en medio que contiene glucosa. Una hora más tarde se haber utilizado la glucosa completamente; los cultivos fueron alimentados con lactosa a una velocidad que evitaba la acumulación en el medio. Las muestras se obtuvieron durante la alimentación de glucosa durante la privación de carbono y después de 24 y 48 horas después del comienzo de la alimentación de lactosa. Se utilizaron microarrays para determinar los niveles de expresión en cada uno de los tiempos relacionados con la expresión de la privación de carbono. Columna 4: alimentación de RL-P37 con glucosa, columna 5: alimentación de QM6a con glucosa, columna 6: alimentación de 24 horas de RL-P37 con lactosa, columna 7: alimentación de 48 horas de RL-P37 con lactosa, columna 8: alimentación de 24 horas de QM6a con lactosa, columna 9: alimentación de 48 horas de QM6a con lactosa.

La figura 15 es un mapa esquemático del vector pREP3Y.

La figura 16 es una alineación de secuencias de CIP1 con potencial hidrolasa secretada de Streptomyces coelicolor A3 (número de acceso CAA18323).

La figura 17 es un esquema del vector pTrex3g.

La figura 18 es un esquema del vector pENTR/D-TOPO (Invitrogen).

La figura 19 es un esquema de la construcción de pExpression que comprenderá un gen de interés. El gen de interés se selecciona entre cip1 o cip2 o axe2 o abf2.

La figura 20 es una fotografía de un gel de SDS-PAGE de sobrenadante en el matraz de agitación de células huésped transformadas con un vector de expresión que comprende el gen cip1. El carril 1 contiene marcadores de peso molecular, Mark12, de Invitrogen. Los carriles 2-12 el sobrenadante de cepas transformantes individuales. La flecha en la izquierda del gel designa allí donde se localizaría en el gel la proteína CIP1 si se expresara y secretara en cantidades detectables.

La figura 21 es una fotografía de un gel de SDS-PAGE de sobrenadante en el matraz de agitación de células huésped transformadas con un vector de expresión que comprende el gen cip2. El carril 1 contiene marcadores de peso molecular, Mark12, de Invitrogen. Los carriles 2-12 el sobrenadante de cepas transformantes individuales. La flecha en la izquierda del gel designa allí donde se localizaría en el gel la proteína CIP2 si se expresara y secretara en cantidades detectables.

La figura 22 es una fotografía de un gel de SDS-PAGE de sobrenadante en el matraz de agitación de células huésped transformadas con un vector de expresión que comprende el gen abf2. El carril contiene el sobrenadante de de la cepa de Trichoderma con eliminación de quad descrita aquí. El carril 2 contiene marcadores de peso molecular, Mark12, de Invitrogen. El carril 3 contiene el sobrenadante de un transformante individual de abf2. La flecha en la derecha del gen designa la banda correspondiente donde se localizaría la proteína ABF2 si se expresara.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se describirá en detalle a modo de referencia utilizando sólo las siguientes definiciones y ejemplos.

A menos que se defina aquí lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la materia al que pertenece la presente invención. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la presente invención. Aunque se pueden utilizar en la práctica o el análisis de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos aquí, se describen los métodos y materiales preferidos. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5’ a 3’; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Los profesionales deben dirigirse a Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989, y Ausubel FM et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1993, par alas definiciones y términos de la técnica. Debe entenderse que la presente invención no se limita a una metodología, protocolos y reactivos concretos descritos, ya que éstos pueden variar.

La presente invención proporciona las secuencias de nucleótidos de los genes de Trichoderma reesei implicados en la degradación de la celulosa y la biomasa. Los genes codifican proteínas con una actividad enzimática que se utiliza en la industria o es de interés para la industria. Las secuencias genómicas de la presente invención que codifican las enzimas se identifican principalmente por comparación de las secuencias de nucleótidos de ADN genómico de T. reesei y las secuencias de nucleótidos de genes de enzimas conocidas de otros microorganismos. Antes de la presente invención, no se conocían las secuencias de nucleótidos de estos genes de T. reesei, los marcos de lectura, las posiciones de exones e intrones, la estructura de las enzimas, y su utilidad potencial en diversas industrias, tales como las implicadas en la fabricación de comida y pienso, bebidas, tejidos, detergentes. Sin limitarse, los polinucleótidos de los genes de enzimas se pueden utilizar para expresar las enzimas recombinantes para la caracterización, modificaciones o usos industriales; para comparar con la secuencia de ácidos nucleicos de Trichoderma reesei para identificar genes duplicados o parálogos que tiene una actividad bioquímica y/o función igual o similar; para comparar con las secuencias de ácidos nucleicos de otros organismos fúngicos relacionados o distantes para identificar potenciales genes de enzimas ortólogas; para seleccionar y fabricar oligómeros para la unión a un conjunto de ácidos nucleicos para el examen de los patrones de expresión; y para desarrollar anticuerpos anti-proteínas utilizando técnicas de inmunización de ácidos nucleicos. La información de secuencia proporcionada aquí también puede formar la base para el diseño y el análisis de enzimas modificadas genéticamente que poseen características químicas y físicas deseables.

El término "polipéptido" tal como se utiliza aquí, se refiere a un compuesto formado de una cadena única de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. El término “proteína” tal como se utiliza aquí, se utiliza indistintamente con el término "polipéptido".

El término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ARN, ADN y ADNc. Se entenderá que, como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican una proteína determinada, tal como, por ejemplo, CIP1 (o cualquier otra proteína). La presente invención contempla cada posible variante de secuencia de nucleótidos que codifica CIP1 tal como se define en las reivindicaciones, todas ellas posibles debido a la degeneración del código genético.

Una construcción o secuencia de ácido nucleico “heteróloga” tiene una parte de la secuencia que no es nativa para la célula en la que se expresa. Heteróloga, con respecto a una secuencia de control se refiere a una secuencia de control (es decir, promotor o potenciador) que no actúa en la naturaleza para regular el mismo gen, la expresión del cual se está regulando. En general, las secuencias de ácido nucleico heterólogas no son endógenas a la célula o parte del genoma en la que están presentes, y se han añadido a la célula, mediante infección, transfección, transformación, microinyección, electroporación o similar. Una construcción de ácido nucleico “heteróloga” puede contener una combinación de la secuencia de control/secuencia codificante de ADN que es la misma que, o es diferente de una secuencia de control/secuencia codificante de ADN hallada en la célula nativa.

Tal como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñado para transferirse entre diferentes células huésped. Un “vector de expresión” se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula foránea. Existen muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas. La selección de vectores de expresión adecuados se encuentra dentro del conocimiento de los expertos en la materia.

Por consiguiente, un "cassette de expresión" o "vector de expresión" es una construcción de ácido nucleico generado de manera recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico específicos que permiten la transcripción de un ácido nucleico concreto en una célula diana. El cassette de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Habitualmente, la parte cassette de la expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico a transcribir y un promotor.

Tal como se utiliza aquí, el término “plásmido” se refiere a una construcción de ADN de doble cadena (ds) circular como vector de clonación, y que forma un elemento genético auto-replicante extracromosómico en muchas bacterias y algunas eucariotas.

Tal como se utiliza aquí, el término "secuencia de nucleótidos que codifica el marcador seleccionable” se refiere a una secuencia de nucleótidos que es capaz de expresarse en células y donde la expresión del marcador seleccionable confiere a las células que contienen el gen expresado la capacidad de crecer en presencia de un agente selectivo correspondiente, o bajo condiciones de crecimiento selectivas correspondientes.

Tal como se utiliza aquí, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de un gen en dirección 3’. El promotor será generalmente apropiado para la célula huésped en el que se expresa el gen diana. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de transcripción y la traducción (también denominadas “secuencias de control”) son necesarios para expresar un gen determinado. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción incluyen, pero sin limitación, secuencias de promotor, sitios de unión a ribosoma, secuencias de inicio y parada de la transcripción, secuencias de inicio y para de la traducción, y secuencias potenciadoras o activadoras.

"Gen quimérico" o "construcción de ácido nucleico heteróloga", tal como se define aquí se refiere a un gen no nativo (es decir, uno que se ha introducido en un huésped) que puede estar compuesto de partes de genes diferentes, incluyendo elementos reguladores. Una construcción de gen quimérico para la transformación de una célula huésped está compuesta habitualmente de una región reguladora de la transcripción (promotor) unida operativamente a una secuencia codificante de proteína heteróloga o, en un gen quimérico marcador seleccionable, a un gen marcador seleccionable que codifica una proteína que confiere resistencia a antibiótico a las células transformadas. Un gen quimérico habitual de la presente invención, para la transformación en una célula huésped, incluye una región reguladora de la transcripción que es constitutiva o inducible, una secuencia codificante de proteína y una secuencia terminadora. Una construcción gen quimérico puede incluir también una segunda secuencia de ADN que codifica un péptido señal si se desea la secreción de la proteína diana.

Un ácido nucleico está “unido operativamente” cuando se le coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN que codifica una secuencia líder secretora está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está localizado para facilitar la traducción. Por lo general, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra mediante ligación en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existieran, se utilizarían adaptadores oligonucleotídicos sintéticos, enlazadores o cebadores para PCR y se utilizarían de acuerdo con la práctica convencional.

Tal como se utiliza aquí, el término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica, que puede o no incluir regiones que preceden o siguen a la región codificante, por ejemplo, secuencias 5’ no traducidas (5’UTR) o secuencias “líder” y secuencias 3’ UTR o “trailer”, así como secuencias de intervención (intrones) entre segmentos de codificación individual (exones)

En general, las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína nueva tal como se describe aquí o un análogo u homólogo de las mimas se hibridará, bajo condiciones de moderada a alta astringencia a la secuencia de ácido nucleico correspondiente de la proteína proporcionada aquí. Sin embargo, en algunos casos, se utiliza una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína nueva que posee un uso de codón sustancialmente diferente, mientras que la proteína nueva codificada por la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína nativa. Por ejemplo, la secuencia codificante se puede modificar para facilitar una expresión más rápida de la proteína nueva en un sistema de expresión procariota

o eucariota concreto, según la frecuencia con que un codón concreto es utilizado por el huésped. Te’o, et al. FEMS Microbiology Letters 190:13-19, (2000), por ejemplo, describe la optimización de genes para la expresión en hongos filamentosos.

Una secuencia de ácido nucleico se considera que es “selectivamente hibridable” a una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias se hibridan específicamente entre sí bajo condiciones de hibridación y lavado de moderada a alta astringencia. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tf) del complejo

o sonda de unión a ácido nucleico. Por ejemplo, la “máxima astringencia” tiene lugar habitualmente a aproximadamente Tf-5°C (5° por debajo de la Tf de la sonda); "astringencia alta” a aproximadamente 5-10° por debajo de Tf; "astringencia intermedia" a aproximadamente 10-20° por debajo de la Tf de la sonda; y "baja astringencia" a aproximadamente 20-25° por debajo de la Tf. Funcionalmente, las condiciones de astringencia máxima se pueden utilizar para identificar secuencias que tiene una identidad estricta o una identidad casi estricta con la sonda de hibridación; aunque las condiciones de alta astringencia se utilizan para identificar secuencias que tienen aproximadamente un 80% o más de identidad en la secuencia con la sonda.

Las condiciones de hibridación moderadas y altas son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, et al, 1989, Capítulos 9 y 11, y en Ausubel, F.M:, et al., 1993, incorporados expresamente por eferencia aquí). Un ejemplo de condiciones de alta astringencia incluye la hibridación a aproximadamente 42°C en formamida al 50%, 5X SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 mg/ml de ADN portador desnaturalizado seguido de dos veces un en 2X SSC y SDS al 0,5% a temperatura ambiente y dos veces adicionales en 0,1 X SSC y SDS al 0,5% a 42°C.

Tal como se utiliza aquí, "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector, que se ha modificado mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga o que la célula se deriva de una célula modificada de esta manera. De este modo, por ejemplo, las células recombinantes que expresan genes que no se hallan en la forma idéntica a la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que en cambio se expresan anormalmente, subexpresan o no se expresan como resultado de intervención humana deliberada.

Tal como se utiliza aquí, los términos "transformada", "transformada de manera estable" o "transgénica" con referencia a una célula significa que la célula tiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido episomal que se mantiene a través de múltiples generaciones.

Tal como se utiliza aquí, el término "expresión" se refiere al proceso por el cual se produce un polipéptido basado en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.

El término "introducido" en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa “transfección” o “transformación” o “transducción” e incluye la referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, donde la secuencia de ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástico o ADN mitocondrial), convertirse en una replicón autónomo o se expresa manera transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).

Tal como se utiliza aquí, la frase "proteína nueva" se refiere a por lo menos uno de las cuatro proteínas nuevas descritas aquí, ABF2, AXE2, CIP1 y/o CIP2.

Se deduce que el término "expresión de proteína nueva" se refiere a la transcripción y traducción del gen que codifica la proteína nueva, los productos de la cual incluyen ARN precursor, ARNm, polipéptido, polipéptidos procesados después de traducción, y derivados de los mismos, incluyendo las correspondientes proteínas nuevas de especies relacionadas, tales como Trichoderma longibrachiatum (reesei), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Hypocrea jecorina y Hypocrea schweinitzii. A modo de ejemplo, los ensayos para la expresión de proteínas nuevas incluyen la transferencia Western para la proteína nueva, el análisis por transferencia Northern y ensayos con la reacción en cadena de la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR) para el ARNm de la proteína nueva.

El término "empalme (splicing) alternativo" se refiere al proceso por el cual se generan múltiples isoformas de polipéptidos a partir de un único gen, e implica el empalme conjunto de exones no consecutivos durante el procesado de algunos, pero no todos, los transcritos del gen. De este modo, un exón particular se puede conectar a cualquiera de varios exones alternativos para formar ARNs mensajeros. Los ARNm empalmados de forma alternativa producen polipéptidos (“variantes por empalme”) en los que algunas partes son comunes, mientras que otras partes son diferentes.

El término "secuencia señal" se refiere a una secuencia de aminoácidos en la parte N-terminal de una proteína que facilita la secreción de la forma madura de la proteína fuera de la célula. La forma madura de la proteína extracelular carece de la secuencia señal que se escinde durante el proceso de secreción.

Por el término "célula huésped" se entiende que una célula que contiene un vector y admite la replicación y/o la transcripción o la transcripción y traducción (expresión) de la construcción de expresión. Las células huésped para su uso en la presente invención pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como células de levadura, plantas, insectos, anfibios o mamíferos. En general, las células huésped son hongos filamentosos.

El término "hongo filamentoso" significa cualquier y todos los hongos filamentosos reconocidos por los expertos en la materia. Un hongo preferido se selecciona del grupo que consiste en Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Chrysosporium, Penicillium, Humicola, Neurospora, o formas sexuales alternativas de los mismos, tales como Emericella, Hypocrea.

El término "celooligosacárido" se refiere a grupos de oligosacáridos que contienen de 2 a 8 unidades de glucosa y que tienen uniones �-1,4, por ejemplo, celobiosa.

El término "celulasa" se refiere a una categoría de enzimas capaces de hidrolizar polímeros de celulosa a oligómeros de celooligosacáridos más cortos, celobiosa y/o glucosa. Se han obtenido numerosos ejemplos de celulasas, tales como exoglucanasas, exocelobiohidrolasas, endoglucanasas y glucosidasas a partir de organismos celulolíticos, particularmente incluyendo hongos, plantas y bacterias.

Los términos "dominio de unión a celulosa" o "CBD" o "módulo de unión a celulosa" o "CBM" tal como se utiliza aquí, se refieren a una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína o una región de la enzima que está implicada en la actividad de unión a celulosa de una enzima celulolítica o derivado de la misma. Un dominio es una parte estable de una proteína con diferentes dominios de proteína que llevan a cabo diferentes funciones. De este modo, un dominio central catalítico (o simplemente el núcleo) contiene el sitio activo y lleva a cabo la reacción enzimática. De manera similar, los dominios de unión a celulosa actúan generalmente mediante unión no covalente de la celulasa a la celulosa, un derivado de la celulosa u otro polisacárido equivalente del mismo. Los dominios de unión a celulosa permiten o facilitan la hidrólisis de fibras de celulosa por la región central catalítica estructuralmente distinta y habitualmente actúan de manera independiente al centro catalítico. De este modo, un dominio de unión a celulosa no poseerá la actividad hidrolítica significativa atribuible a un centro catalítico. En otras palabras, un dominio de unión a celulosa es un elemento estructural de la estructura terciaria de la proteína enzima celulolítica que es diferente del elemento estructural que posee actividad catalítica. Si una proteína posee más de un dominio, los dominios se conectan habitualmente mediante un enlazador.

Tal como se utiliza aquí, el término "disminución o eliminación de la expresión del gen que codifica una proteína nueva” significa que o el gen que codifica la proteína nueva se ha eliminado del genoma y por tanto no puede ser expresado por el microorganismo huésped recombinante; o que el gen que codifica la proteína nueva se ha modificado, de manera que el microorganismo huésped recombinante no produce una proteína nueva funcional, o el uso de ARNi para dirigir específicamente un producto nuevo del gen, dando lugar a fenotipos nulos o hipomórficos.

El término "% homología" se utiliza indistintamente aquí con el término "% identidad" y se refiere al nivel de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos entre la secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de los polipéptidos de la invención o la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención, cuando se alinean utilizando un programan de alineación de secuencias.

Por ejemplo, tal como se utiliza aquí, el 80% de homología significa lo mismo que un 80% de identidad en la secuencia determinada mediante un algoritmo definido y, por consiguiente, un homólogo de una secuencia determinada tiene más de un 80% de identidad en la secuencia sobre la longitud de la secuencia determinada. Entre los niveles de identidad en la secuencia se incluyen, pero sin limitación, un 80, 85, 90, 95, 98% o más de identidad en la secuencia con una secuencia determinada, por ejemplo, la secuencia codificante para cualquiera de los polipéptidos de la invención, tal como se describe aquí.

Entre los programas informáticos de ejemplo que se pueden utilizar para determinar la identidad entre dos secuencias se incluyen, pero sin limitación, el conjunto de programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, disponibles públicamente en Internet en www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Véase también, Altschul, et al., 1990 y Altschul, et al., 1997.

Las búsquedas de secuencias se llevan a cabo habitualmente utilizando el programa BLASTN cuando se evalúa una secuencia de ácido nucleico determinado en relación a secuencias de ácido nucleico en las secuencias de ADN del Banco de Genes y otras bases de datos públicas. Se prefiere el programa BLASTX para la búsqueda de secuencias de ácido nucleico que se han traducido en todos los marcos de lectura contra las secuencias de aminoácidos en las Secuencias de Proteínas del Banco de Genes y otras bases de datos públicas. Tanto BLASTN y BLASTX se desarrollan utilizando parámetros por defecto de una penalización por espacio abierto de 11,0 y una penalización por espacio extendido de 1,0 y utilizan la matriz BLOSUM-62 (véase por ejemplo, Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997.)

Una alineación preferida de las secuencias seleccionadas con el fin de determinar el “% de identidad” entre dos o más secuencias, se realiza utilizando, por ejemplo, el programa CLUSTAL-W en MacVector version 6.5, operado con los parámetros por defecto, incluyendo una penalización por la abertura del espacio (“open gap penalty”) de 10,0 y una penalización por la extensión del espacio (“extended gap penalti”) de 0,1, y una matriz de similitud BLOSUM 30.

El término "gen alterado" o "gen alterado que codifica la proteína nueva" significa que la secuencia de ácido nucleico del gen ha sido alterada mediante la eliminación, adición y/o manipulación de la secuencia codificante o se ha modificado la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada

Tal como se utiliza aquí, el término "purificar" se refiere en general a someter células que contienen el ácido nucleico

o proteína a purificación bioquímica y/o cromatografía en columna.

Los términos "aislado" o "purificado" tal como se utiliza aquí, se refiere a un ácido nucleico o proteína que se extrae de por lo menos un componente con el que está asociado de forma natural

En el presente contexto, el término "polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación de polipéptidos que contiene como máximo un 10% en peso de otro material polipeptídico con el que está asociado de forma nativa (se prefiere porcentajes inferiores del otro material polipeptídico, por ejemplo, como máximo un 8% en peso, como máximo un 6% en peso, como máximo un 5% en peso, como máximo un 4% en peso, como máximo un 3% en peso, como máximo un 2% en peso, como máximo un 1% en peso, y como máximo un 1/2% en peso). De este modo, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea por lo menos un 92% puro, es decir, que el polipéptido constituya por lo menos un 92% en peso del material polipeptídico total presente en la preparación, y se prefieren porcentajes superiores, tales como, por lo menos un 94% puro, por lo menos un 95% puro, por lo menos un 96% puro, por lo menos un 96% puro, por lo menos un 97% puro, por lo menos un 98% puro, por lo menos un 99% puro, y como máximo un 99,5% puro. Los polipéptidos descritos aquí están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos descritos estén en forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos descritos aquí se encuentren en “forma esencialmente pura”, es decir, que la preparación de polipéptidos esté esencialmente libre de otro material polipeptídico con el que está asociado de forma nativa. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante la preparación del polipéptido por medio de métodos recombinantes conocidos. Aquí, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada".

Tal como se utiliza aquí, los términos "activo" y "biológicamente activo" se refieren a una actividad biológica asociada con una proteína particular, tal como la actividad enzimática asociada con una proteasa. Se deduce que la actividad biológica de una proteína determinada se refiere a cualquier actividad biológica atribuida habitualmente a es proteína por los expertos en la materia.

Tal como se utiliza aquí, el término "enriquecida" significa que la proteína nueva se encuentra en una concentración que es superior en relación con la concentración de proteína nueva hallada en una composición de celulasa fúngica de tipo salvaje o natural.

Cuando se utiliza en soluciones enzimáticas, el componente proteico nuevo se añade en general en una cantidad suficiente a: para las proteínas CIP, aumentan la acción de los componentes CBH y endoglucanasa hallada en la composición de celulasa; para la arabinofuranosidasa y acetilxilanoesterasa, aumentan la acción de una xilanasa. La cantidad de componente proteico nuevo añadido depende del nivel de acción aumentada deseada proporcionada por la proteína nueva, que se puede determinar fácilmente por el técnico. Sin embargo, cuando se utiliza, el porcentaje en peso del componente proteico nuevo es preferiblemente de aproximadamente 1, preferiblemente de aproximadamente 5, preferiblemente de aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 15, o preferiblemente de aproximadamente 20 por ciento en peso a preferiblemente aproximadamente 25, preferiblemente aproximadamente 30, preferiblemente aproximadamente 35, preferiblemente aproximadamente 40, preferiblemente aproximadamente 45 ó preferiblemente aproximadamente 50 por ciento en peso. Además, los intervalos preferidos pueden ser de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 por ciento en peso, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 por ciento en peso.

Alcance de la invención

Las cepas de Trichoderma reesei utilizadas en este estudio se obtuvieron de la American Type Culture collection. Sin embargo, debe entenderse que se pueden utilizar otras fuentes microbianas para identificar los correspondientes homólogos de polipéptido. Debe indicarse que el nombre Hypocrea jecorina se puede utilizar indistintamente en la presente invención con Trichoderma reesei.

Los títulos proporcionados aquí no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invención que se pueden disponer por referencia a la memoria de manera global. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen de manera más completa por referencia a la memoria de manera global.

I. ORGANISMOS HUÉSPED

Los hongos filamentosos incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo que tiene una pared celular compuesta de quitina, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos, con crecimiento vegetativo mediante elongación hifal y catabolismo del carbono que es obligatoriamente aeróbico.

En la presente invención, la célula parental de hongo filamentoso puede ser una célula de una especie de, pero sin limitación, Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum; Penicillium sp.; Humicola sp., incluyendo Humicola insolens y Humicola grisea; Chrysosporium sp., incluyendo C. lucknowense; Gliocladium sp.; Aspergillus sp.; Fusarium sp., Neurospora sp., Hypocrea sp., y Emericella sp. Tal como se utiliza aquí, el término "Trichoderma" o "Trichoderma sp." se refiere a cualquier cepa fúngica que se ha clasificado previamente como Trichoderma o se clasifica actualmente como Trichoderma.

En una realización preferida, la célula parental de hongo filamentoso es una célula Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus foetidus, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus aculeatus, o Aspergillus nidulans.

En otra realización preferida, la célula parental de hongo filamentoso es una célula Trichoderma reesei.

II. BIOLOGÍA MOLECULAR

En una realización, la presente invención proporciona la expresión del gen CIP1 tal como se define en las reivindicaciones bajo el control de un promotor funcional en un hongo filamentoso. Por lo tanto, la presente invención se refiere a técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)).

A. Métodos de identificación de secuencias nuevas

Las técnicas que se pueden utilizar para aislar las nuevas secuencias de ADN que codifican proteínas son conocidas en la técnicas e incluyen, pero sin limitación, el cribado de bibliotecas genómicas y/o ADNc con una sonda de ADN homóloga y el cribado de la expresión con ensayos de actividad o anticuerpos contra las proteínas nuevas. Cualquiera de estos métodos se puede hallar en Sambrook, et al. o en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. Ausubel, et al., ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) ("Ausubel").

Se secuenciaron parcial o totalmente por encima de 5000 ADNc de T. reesei. Se descubrieron cuatro ADNc que codifican nuevas enzimas con supuestos papeles en la degradación de la biomasa.

Se analizan los marcos de lectura abiertos (ORFs) siguiendo la secuenciación total o parcial de los clones de las bibliotecas de ADNc derivadas de ARNm de T. reesei y se analizan posteriormente utilizando un software de análisis de secuencias y mediante la determinación de la homología a secuencias conocidas en bases de datos (públicas/privadas).

Las secuencias de nucleótidos se anotaron inicialmente mediante programas software, tales como Genescan y Glimmer M (The Institute of Genome Research, Rockville, NM), que pueden identificar posibles regiones codificantes, intrones y uniones por empalme. El tratamiento posterior automatizado y manual de las secuencias de nucleótidos se realizó para refinar y establecer una caracterización exacta de las regiones codificantes y otras características génicas.

B. Construcciones/vectores de expresión de ácidos nucleicos..

Se pueden incorporar fragmentos e polinucleótidos naturales o sintéticos que codifican una nueva proteína en construcciones o vectores de ácidos nucleicos, capaces de la introducción y la replicación en una célula de hongo filamentoso o levadura. Los vectores y métodos descritos aquí son adecuados para su uso en células huésped para la expresión de una proteína nueva. Se puede utilizar cualquier vector, siempre y cuando sea replicable y viable en las células en las que se introduce. Se conocen una gran cantidad de vectores y promotores adecuados para los expertos en la materia, y se encuentran disponibles comercialmente. Los vectores de clonación y expresión también se describen en Sambrook et al., 1989, Ausubel FM et al., 1989, y Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces 1981, cada uno se incorpora expresamente por referencia en la presente invención. Los vectores de expresión apropiados para los hongos se describen en van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) en: Bennett, J.W. y Lasure, L.L. (eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396-428. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en un plásmido o un vector (referido en general en la presente invención como “vectores”) mediante una serie de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios para endonucleasas de restricción apropiados mediante procedimientos estándar. Dichos procedimientos y procedimientos de subclonación relacionados se entiende que se encuentran en el alcance del conocimiento los expertos en la materia.

Los hongos filamentosos recombinantes que comprende la secuencia codificante para una nueva proteína se pueden producir mediante la introducción de una construcción de ácido nucleico heterólogo que comprende la proteína nueva que codifica la secuencia en las células de una cepa seleccionada de los hongos filamentosos.

Una vez se obtiene la forma deseada de una secuencia de ácido nucleico para la nueva proteína, se puede modificar de diversas maneras. Cuando la secuencia implica regiones flanqueantes no codificantes, las regiones flanqueantes se pueden someter a resección, mutagénesis, etc. De este modo, se pueden realizar transiciones, transversiones, deleciones e inserciones en la secuencia natural.

Se puede insertar una secuencia codificante de una proteína nueva seleccionada en un vector adecuado según técnicas recombinantes conocidas y se pueden utilizar para transformar hongos filamentosos capaces de la expresión heteróloga de la proteína. Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden utilizar otras secuencias de ácidos nucleicos que codifican sustancialmente la misma secuencias de aminoácidos o una funcionalmente equivalente para clonar y expresar una proteína nueva. Por lo tanto, se aprecia que dichas sustituciones en la región codificante se encuentran en las variantes de secuencias cubiertas por la presente invención, siempre que dichas variantes sean tal como se define en las reivindicaciones.

La presente invención también incluye construcciones de ácido nucleico recombinante que comprenden una o más de las secuencias de ácido nucleico que codifican AXE2 tal como se define en las reivindicaciones. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el que se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación directa o inversa.

Las construcciones de ácido nucleico heterólogas pueden incluir la secuencia codificante para una proteína nueva:

(i) aislada; (ii) en combinación con secuencias codificantes adicionales, tales como secuencias codificantes de proteínas de fusión o péptido señal, donde la secuencia codificante de la proteína nueva es la secuencia codificante dominante; (iii) en combinación con secuencias no codificantes, tales como intrones y elementos de control, tales como los elementos promotor y terminador o regiones no traducidas 5’ y/o 3’, eficaces para la expresión de la secuencia codificante en un huésped adecuado, y/o (iv) en un medio vector o huésped en el que la secuencia codificante de la proteína nueva es un gen heterólogo.

En un aspecto de la presente invención, se utiliza una construcción de ácido nucleico heterólogo para transferir una secuencia de ácido nucleico que codifica AXE2 tal como se define en las reivindicaciones en una célula in vitro, siendo preferidas las líneas fúngicas filamentosas y de levadura establecidas. Para la producción a largo plazo de una proteína nueva, se prefiere la expresión estable. Se deduce que se puede utilizar cualquier método eficaz para generar transformantes estables en la práctica de la invención.

Los vectores apropiados están equipados habitualmente con una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable, sitios de inserción y elementos de control adecuados, tales como las secuencias de promotor y terminación. El vector puede comprender secuencias reguladoras incluyendo, por ejemplo, secuencias no codificantes, tales como intrones y elementos de control, es decir, elementos promotor y terminador o regiones no traducidas 5’ y/o 3’, eficaces para la expresión de la secuencia codificante en células huésped (y/o en un medio vector o célula huésped en el que no se expresa normalmente una secuencia codificante de una proteína antígeno soluble modificada), unida operativamente a la secuencia codificante. Los expertos en la materia conocen una gran cantidad de vectores y promotores adecuados, muchos de los cuales están disponibles comercialmente y/o se describen en Sambrook, et al., (supra).

Entre los promotores de ejemplo se incluyen promotores constitutivos y promotores inducibles, ejemplos de los cuales incluyen un promotor CMV, un promotor temprano para SV40, un promotor RSV, un promotor EF-1a, un promotor que contiene un elemento de respuesta de tet (TRE) en el sistema de tet-on o tet-off descrito (ClonTech y BASF), y el promotor de beta actina y el promotor de metalotionina que pueden favorecer la expresión mediante la adición de ciertas sales metálicas. Una secuencia de promotor es una secuencia de ADN que es reconocida por el hongo filamentoso particular para fines de expresión. Está unida operativamente a la secuencia de ADN que codifica una proteína nueva. Dicha unión comprende el posicionamiento del promotor con respecto al codón de iniciación de la secuencia de ADN que codifica la proteína nueva en los vectores de expresión descritos. La secuencia de promotor contiene la secuencia de control de la transcripción y la traducción que media en la expresión de la proteína nueva. Entre los ejemplos se incluyen promotores de los genes que codifican glucoamilasa, alfa-amilasa, o alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, A awamori o A. oryzae; los genes gpdA, oliC o trpC de A. nidulans; genes cbh1 o trp1 de Neurospora crassa; los genes que codifican aspártico proteinasa de A. niger o Rhizomucor miehei; los genes cbh1, cbh2, egl1, egl2 o que codifican otra celulasa de T. reesei (Hypocrea jecorina).

La elección del marcador seleccionable correcto dependerá de la célula huésped, y los marcadores apropiados para los diferentes huéspedes son conocidos en la técnica. Los genes marcadores seleccionables habituales incluyen argB de A. nidulans o T. reesei (H. jecorina), amdS de A. nidulans, pyr4 de Neurospora crassa o H. jecorina, pyrG de Aspergillus niger o A. nidulans. Marcadores seleccionables de ejemplo adicionales incluyen, pero sin limitación, trpc, trp1, oliC31, niaD o leu2, que se incluyen en construcciones de ácidos nucleicos heterólogos utilizadas para transformar una cepa mutante, tal como trp-, pyr-, leu- y similares.

Dichos marcadores seleccionables confieren a los transformantes la capacidad de utilizar un metabolito que normalmente no es metabolizado por los hongos filamentosos. Por ejemplo, el gen amdS de H. jecorina que codifica la enzima acetamidasa que permite que las células transformantes crezcan en acetamida como una fuente de nitrógeno. El marcador seleccionable (por ejemplo, pyrG) puede restaurar la capacidad de una cepa mutante autotrófica para crecer en un medio mínimo selectivo o el marcador seleccionable (por ejemplo, olic31) puede conferir a los transformantes la capacidad de crecer en presencia de un fármaco inhibidor o antibiótico.

La secuencia codificante del marcador seleccionable se clona en cualquier plásmido adecuado utilizando los métodos utilizados generalmente en la técnica. Entre los plásmidos de ejemplo se incluyen pUC18, pBR322, pRAX y pUC100. El plásmido pRAX contiene secuencias AMA1 de A. nidulans, que posibilita la replicación en A. niger.

La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que se encuentran en el campo de la invención. Dichas técnicas se explican de manera completa en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Freshney, ANIMAL CELL CULTURE, 1987; Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New . York, N.Y., 1993; y Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1991.

C. Métodos para transformar una célula huésped

En la presente invención, la célula parental de hongo filamentoso puede ser una célula de una especie de, pero sin limitación, Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma longibrachiatum (reesei), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum; Penicillium sp.; Humicola sp., including Humicola insolens, Chrysosporium sp., incluyendo C. lucknowense; Gliocladium sp.; Aspergillus sp.; Fusarium sp., Neurospora sp., Hypocrea sp., y Emericella sp. Tal como se utiliza aquí, el término "Trichoderma" o "Trichoderma sp." Se refiere a cualquier cepa fúngica que se ha clasificado previamente como Trichoderma o se clasifica actualmente como Trichoderma.

Entre los ejemplos de líneas de células parentales que se pueden tratar y/o modificar para la expresión de proteínas nuevas se incluyen, pero sin limitación, células de hongos filamentosos. Entre los ejemplos de tipos de células primarias apropiadas para su uso en la práctica de la invención se incluyen, pero sin limitación, Aspergillus y Trichoderma.

En una realización, la célula parental de hongo filamentoso es una célula de Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus foetidus, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus aculeatus, o Aspergillus nidulans.

En una segunda realización, la célula parental de hongo filamentoso es una célula de Hypocrea jecorina. A esta célula se hizo referencia previamente como T. reesei.

Después de clonar las secuencias de ADN que codifican la proteína nueva en construcciones de ADN, se utiliza ADN para transformar microorganismos. El microorganismo a transformar para el objetivo de expresar una proteína nueva según la presente invención puede comprender de manera ventajosa una cepa derivada de Trichoderma sp. Por tanto, un modo preferido para preparar una proteína nueva según la presente invención comprende transformar una célula huésped de Trichoderma sp. con una construcción de ADN tal como se define en las reivindicaciones. La construcción de ADN se unirá generalmente funcionalmente, es decir, estará unido operativamente a un promotor. A continuación, la célula huésped transformada crece bajo condiciones para expresar la proteína nueva. Posteriormente, la proteína nueva se puede aislar. Puede ser deseable tener la proteína nueva en una forma sustancialmente pura. De forma similar, puede ser deseable tener la proteína nueva en una forma esencialmente pura.

Sin embargo, de hecho puede ser que el mejor vehículo de expresión para un ADN determinado que codifica una proteína nueva pueda diferir de H. jecorina (es decir, T. reesei). Por tanto, lo más ventajoso puede ser expresar una proteína en un huésped de transformación que porta una similitud filogenética con el organismo fuente para la proteína nueva. En una realización alternativa, se puede utilizar Aspergillus niger como vehículo de expresión. Para la descripción de las técnicas de transformación con A. niger, véase WO 98/31821.

Por consiguiente, la presente descripción del sistema de expresión de Trichoderma spp. se proporciona sólo con fines ilustrativos y como una opción para expresar la proteína nueva de la invención. Un experto en la materia, sin embargo, puede inclinarse a expresar el ADN que codifica la proteína nueva en una célula huésped diferente si es apropiada y debería entenderse que la fuente de la proteína nueva debe considerarse en la determinación del huésped de expresión óptimo. Adicionalmente, el experto en la materia será capaz de seleccionar el mejor sistema de expresión para un gen concreto mediante técnicas de rutina que utilizan herramientas disponibles en la técnica.

D. Métodos para expresar una proteína nueva

Los métodos de la presente invención se refieren al uso de células para expresar una proteína nueva sin que se requiera ningún método de expresión en concreto.

La presente invención proporciona células huésped que se han transducido, transformado o transfectado con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica AXE2 tal como se define en las reivindicaciones. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente para la célula huésped parental antes de la transducción, transformación o transfección y serán evidentes para el experto en la materia.

En una estrategia, se transfecta una célula de hongo filamentoso o célula de levadura con un vector de expresión que tenga un promotor o fragmento de promotor biológicamente activo o uno o más (por ejemplo, un conjunto) potenciadores que funcionan en la línea de célula huésped, unidos operativamente a un segmento de ADN que codifica una proteína nueva, de manera que la proteína nueva se expresa en la línea celular.

Por tanto, la presente invención proporciona hongos filamentosos que comprenden células que han sido modificadas, seleccionadas y cultivadas de una manera eficaz para dar lugar a la producción o expresión de CIP1 en relación con los correspondientes hongos parentales no transformados.

Entre los ejemplos de especies de hongos filamentosos parentales que se pueden tratar y/o modificar para la expresión de proteína nueva incluyen, pero sin limitación, Trichoderma, Penicillium sp., Humicola sp., including Humicola insolens; Aspergillus sp., incluyendo Aspergillus niger, Chrysosporium sp., Fusarium sp., Hypocrea sp., y Emericella sp.

Las células que expresan una proteína nueva se cultivan bajo condiciones utilizadas habitualmente para cultivar la línea fúngica parental. En general, las células se cultivan en un medio estándar que contiene sales fisiológicas y nutrientes, tales como se los descritos en Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 e Ilmen, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997. Las condiciones de cultivo también son estándar, por ejemplo, los cultivos se incuban a 28°C en cultivadores o fermentadores con agitación hasta conseguir los niveles deseados de la expresión de la proteína.

Las condiciones de cultivo preferidas para un hongo filamentoso determinado se puede encontrar en la literatura científica y/o a partir de una fuente de hongos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC; <www.atcc.org>). Después de establecer el crecimiento fúngico, se exponen las células a las condiciones eficaces para causar o permitir la expresión de una proteína nueva.

En los casos en los que la secuencia que codifica una proteína nueva se encuentra bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor, por ejemplo, un azúcar, sal metálica o antibióticos, se añade al medio en una concentración eficaz para inducir la expresión de la proteína nueva.

En una realización, la cepa comprende Aspergillus niger, que es una cepa útil para obtener proteína sobreexpresada. Por ejemplo, se sabe que dgr246 de A. niger var awamori secreta cantidades elevadas de celulasas secretadas (Goedegebuur et al, Curr. Genet (2002) 41: 89-98). Se conocen otras cepas de Aspergillus niger var awamori, tales como GCDAP3,GCDAP4 y GAP3-4 (Ward, M, Wilson, L.J. and Kodama, K.H., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743).

En otra realización, la cepa comprende Trichoderma reesei, que es una cepa útil para obtener proteína sobreexpresada. Por ejemplo, se sabe que RL-P37, descrita por Sheir-Neiss, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53 (1984), secreta cantidades elevadas de enzimas celulasa. Los equivalentes funcionales de RL-P37 incluyen la cepa RUT-C30 de Trichoderma reesei (ATCC No. 56765) y la cepa QM9414 (ATCC No. 26921). Se contempla que estas cepas también serían útiles en la sobreexpresión de una proteína nueva.

Cuando se desea obtener la proteína nueva deseada en ausencia de actividad celulolítica nativa potencialmente perjudicial, es útil para obtener una cepa de célula huésped a la que se han eliminado uno o más genes de celulasa antes de la introducción de una construcción de ADN o ADN plasmídico que contiene el fragmento de ADN que codifica la proteína nueva. Dichas cepas se pueden preparar mediante el método descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5,246,853 y WO 92/06209. al expresar una proteína nueva en un microorganismo huésped que carece de uno o más genes de celulasa, se simplifican los procedimientos de identificación y purificación posterior. Se puede eliminar cualquier gen de Trichoderma sp. que haya sido clonado, por ejemplo, los genes cbh1, cbh2, egl1, y egl2, así como aquellos que codifican la proteína EGV (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,475,101 y WO 94/28117, respectivamente).

La eliminación de genes se puede llevar a cabo mediante la inserción de una forma del gen deseado a eliminar o alterar en un plásmido mediante métodos conocidos en la técnica. El plásmido de deleción se corta a continuación en un sitio o sitios para enzimas de restricción adecuados, interno a la región codificante del gen deseado, y la secuencia codificante del gen o parte de la misma se sustituye por un marcador seleccionable. Las secuencias de ADN flanqueantes del locus del gen a liminar o alterar, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 a 2,0 kb, permanecen en cualquier lado del gen marcador seleccionable. Un plásmido de deleción apropiado tendrá en general sitios para enzimas de restricción únicos presentes en el mismo para permitir que el fragmento que contiene el gen eliminado, incluyendo las secuencias de ADN flanqueantes, y el gen marcador seleccionable, se eliminen como una pieza lineal única.

Debe elegirse un marcador seleccionable para permitir la detección del microorganismo transformado. Cualquier gen marcador seleccionable que se exprese en el microorganismo seleccionado será adecuado. Por ejemplo, con Aspergillus sp., el marcador seleccionable se elige de manera que la presencia del marcador seleccionable en los transformantes no afectará significativamente en las propiedades del mismo. Dicho marcador seleccionable puede ser un gen que codifica un producto analizable. Por ejemplo, se puede utilizar una copia funcional de un gen de Aspergillus sp. que si está ausente en la cepa huésped da lugar a la cepa huésped que expresa un fenotipo auxotrófico.

En una realización, una cepa derivada de pyrG de Aspergillus sp. se transforma con un gen funcional pyrG, el cual, de este modo, proporciona un marcador seleccionable para la transformación. Se puede obtener una cepa derivada de pyrG mediante la selección de cepas de Aspergillus sp. que son resistentes de ácido fluoroorótico (FOA). El gen pyrG codifica orotidin-5’-monofosfato descarboxilasa, una enzima necesaria para la biosíntesis de uridina. Las cepas con un gen pyrG intacto crecen en un medio que carece de uridina, pero son sensibles a ácido fluoroorótico. Es posible seleccionar cepas derivadas de pyrG que carecen de una enzima funcional orotidin monofosfato descarboxilasa y requieren uridina para el crecimiento mediante selección por resistencia a FOA. Utilizando la técnica de selección con FOA, también es posible obtener cepas que requieren uridina que carecen de una orotato pirofosforibosil transferasa funcional. Es posible transformar estas células con una copia funcional del gen que codifica esta enzima (Berges & Barreau, Curr. Genet. 19:359-365 (1991), y van Hartingsveldte et al., (1986) Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene. Mol. Gen. Genet. 206:71-75). La selección de cepas derivadas se realiza fácilmente utilizando la técnica de resistencia a FOA referida anteriormente, y de este modo, el gen pyrG se utiliza preferiblemente como marcador seleccionable. En otra realización, se transforma una cepa derivada de pyr4 of Trichoderma sp. con un gen funcional pyr4, el cual, de este modo, proporciona un marcador seleccionable para la transformación. A continuación se describe para el sistema de Aspergillus, se pueden utilizar procedimientos similares para Trichoderma y otros sistemas fúngicos tal como entenderá un experto en la materia.

Para transformar pyrG de Aspergillus sp. para que carezca de la capacidad de expresar uno o más genes de celulasa, a continuación se aísla un fragmento de ADN sencillo que comprende un gen de celulasa alterado o eliminado del plásmido de deleción y se utiliza para transformar un huésped pyr-Aspegillus apropiado. A continuación, se identifican los transformantes y se seleccionan en base a su capacidad de expresar el producto génico de pyrG y, de este modo, complementa la auxotrofia a uridina de la cepa huésped. A continuación, se lleva a cabo un análisis por transferencia Southern en los transformantes resultantes para identificar y confirmar una integración por doble entrecruzamiento que sustituye parte o toda la región codificante de la copia genómica del gen a eliminar por los marcadores seleccionables de pyr4.

Aunque los vectores plasmídicos específicos descritos anteriormente se relacionan con la preparación de transformantes de pyr, la presente invención no se limita a estos vectores. Se pueden eliminar y sustituir varios genes en la cepa de Aspergillus sp. utilizando las técnicas anteriores. Además, se puede utilizar cualquier marcador seleccionable adecuado, tal como se ha descrito anteriormente. De hecho, cualquier gen de Aspergillus sp. que se haya clonado y, por tanto, identificado, se puede eliminar del genoma utilizando la estrategias descrita anteriormente.

Tal como se ha afirmado anteriormente, las cepas huésped utilizadas son derivados de Aspergillus sp. que carecen

o tiene un gen no funcional o genes que corresponden con el marcador seleccionable elegido. Por ejemplo, si se elige el marcador seleccionable de pyrG, entonces se utiliza una cepa derivada de pyrG específica como receptora en el procedimiento de transformación. De manera similar, se pueden utilizar marcadores seleccionables que comprenden genes de Aspergillus sp. equivalentes a los genes de Aspergillus nidulans amdS, argB, trpC, niaD. La cepa receptora correspondiente debe ser por tanto una cepa derivada, tal como argB-, trpC-, niaD-, respectivamente.

El ADN que codifica la proteína nueva se prepara a continuación para la inserción en un microorganismo apropiado. Tal como se ha descrito aquí, el ADN que codifica una proteína nueva comprende el ADN necesario para codificar una proteína que tiene actividad funcional, por ejemplo, actividad enzimática y/o unión a sustrato. El fragmento de ADN que codifica la proteína nueva se puede unir funcionalmente a una secuencia de promotor fúngico, por ejemplo del promotor del gen glaA.

También se contempla que más de una copia de ADN que codifica una proteína se pueda combinar en la cepa para facilitar la sobreexpresión. El ADN que codifica la proteína nueva se puede preparar mediante la construcción de un vector de expresión que porta el ADN que codifica la proteína nueva. El vector de expresión que porta el fragmento de ADN insertado que codifica la proteína nueva puede ser cualquier vector que es capaz de replicarse autónomamente en un organismo huésped determinado o de integrarse en el ADN del huésped, habitualmente un plásmido. En realizaciones preferidas, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de genes. El primero contiene secuencias de ADN en las que la secuencia del promotor, la región codificante del gen y el terminador se originan todas del gen a expresar. El truncamiento de genes se puede obtener cuando se desee mediante la eliminación de secuencias de ADN no deseadas (por ejemplo, que codifican dominios no deseados) para dejar que el dominio se exprese bajo el control de sus propias secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción. Un marcador seleccionable también está contenido en el vector que permite la selección de la integración en el huésped de múltiples copias de las secuencias génicas nuevas.

El Segundo tipo de vector de expresión se preensambla y contiene secuencias necesarias para una transcripción a alto nivel y un marcador seleccionable. Se contempla que la región codificante para un gen o parte del mismo se pueda insertar en este vector de expresión de objetivo general, de manera que se encuentre bajo el control transcripcional de las secuencias de promotor y terminador de cassettes de expresión. Por ejemplo, pRAX es dicho vector de expresión de objetivo general. Los genes o partes del mismo se pueden insertar en dirección 3’ con respecto al promotor fuerte de glaA. Un ejemplo, de un vector de expresión integrador es el vector pTrex. Los genes

o partes de los mismos se pueden insertar en dirección 3’ con respecto al promotor fuerte de cbh1.

En el vector, la secuencia de ADN que codifica el polipéptido CIP 1 de la presente invención debería unirse operativamente a las secuencias transcripcionales y traduccionales, es decir, una secuencia de promotor adecuado y secuencia señal, en el marco de lectura al gen estructural. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad transcripcional en la célula huésped y puede derivar de genes que codifican proteínas homólogas

o heterólogas a la célula huésped. Un péptido señal opcional para la producción extracelular de la proteína nueva. El ADN que codifica la secuencia señal es preferiblemente aquel que está asociado de forma natural con el gen a expresar, aunque la presente invención contempla la secuencia señal de cualquier origen.

Los procedimientos utilizados para fusionar las secuencias de ADN que codifican para la proteína nueva de la presente invención con el promotor en vectores adecuados son conocidos en la técnica.

Se pueden utilizar varios métodos para liberar un vector de expresión, un vector o construcción de ADN descritos anteriormente en células in vitro. Los métodos de introducción de ácidos nucleicos en células para la expresión de secuencias heterólogas de ácidos nucleicos también son conocidos para el técnico en la materia incluyendo, pero sin limitación, eletroporación; microinyección nuclear o microinyección directa en células individuales; fusión de protoplastos bacterianos con células intactas; uso de policationes, por ejemplo, polibreno o poliormitina; fusión de membranas con liposomas, lipofectamina o transfección mediada por lipofección; bombardeo de velocidad elevada con microproyectiles recubiertos de ADN; incubación con precipitado de fosfato de calcio-ADN; transfección mediada por DEAE dextrano; infección con ácidos nucleicos virales modificados; transferencia mediada por Agrobacterium de ADN; y similares. Además, las construcciones de ácidos nucleicos heterólogas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína nueva se puede transcribir in vitro y el ARN resultante se puede introducir en la célula huésped mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante inyección.

El método preferido en la presente invención para preparar Aspergillus sp. para la transformación implica la preparación de protoplastos de micelio fúngico. Véase Campbell et al. Improved transformation efficiency of A.niger using homologous niaD gene for nitrate reductase. Curr. Genet. 16:53-56; 1989. El micelio se puede obtener a partir de esporas vegetativas germinadas. El micelio se trata con una enzima que digiere la pared celular dando lugar a protoplastos. Los protoplastos a continuación se protegen mediante la presencia de un estabilizante osmótico en el medio en suspensión. Estos estabilizantes incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio y similares. Normalmente la concentración de estos estabilizantes varía entre 0,8 M y 1,2 M. Es preferible utilizar aproximadamente una solución de sorbitol 1,2 M en el medio de suspensión.

La captación del ADN en la cepa de Aspergillus sp. huésped depende de la concentración de ion calcio. En general se utiliza ente aproximadamente 10 mM de CaCl2 y 50 mM de CaCl2 en una solución de captación. Antes de la necesidad de ion calcio en la solución de captación, otros elementos generalmente incluidos son un sistema tamponador, tal como un tampón TE (10 mM Tris, pH 7,4; EDTA 1 mM) o 10 mM de MOPS, tampón a pH 6,0 (ácido morfolinopropanosulfónico) y polietilenglicol (PEG). Se cree que el polietilenglicol actúa fusionando las membranas celulares, permitiendo así que e contenido del medio se libere en el citoplasma de la cepa de Aspergillus sp. y el ADN plasmídico se transfiere la núcleo. Esta fusión deja frecuentemente copias múltiples del ADN plasmídico integrado de forma sensible en el cromosoma huésped.

Normalmente se utiliza una suspensión que contiene los protoplastos o células de Aspergillus sp. que se han sometido a un tratamiento de permeabilidad a una densidad de 105 a 106/mL, preferiblemente 2 x 105/mL en la transformación. Se mezcla un volumen de 100 mL de estos protoplastos o células en una solución apropiada (por ejemplo, sorbitol 1,2 M; CaCl2 50 mM) con el ADN deseado. En general, se añade una concentración elevada de PEG a la solución de captación. Se pueden añadir de 0,1 a 1 volumen de PEG4000 al 25% a la suspensión de protoplastos. Sin embargo, es preferible añadir aproximadamente 0,25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. También se pueden añadir aditivos, tales como dimetil sulfóxido, heparina, espermidina, cloruro potásico y similares a la solución de captación y ayudar en la transformación. Existen procedimientos similares para otras células huésped fúngicas. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No.. 6,268,328.

En general, la mezcla se incuba a continuación a aproximadamente 0°C durante un periodo entre 10 y 30 minutos. A continuación se añade PEG adicional a la mezcla para aumentar adicionalmente la captación del gen o secuencia de ADN deseados. SE añade en general PEG 4000 al 25% en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; sin embargo, pueden ser adecuados volúmenes mayores y menores. El PEG 4000 al 25% es preferiblemente aproximadamente 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Después de añadir el PEG, la mezcla de transformación se incuba a continuación a temperatura ambiente o sobre hielo antes de la adición de una solución de sorbitol y CaCl2. La suspensión de protoplastos se añade a continuación a alícuotas fundidas de un medio de crecimiento. Este medio de crecimiento permite el crecimiento de únicamente transformantes. Se puede utilizar cualquier medio de crecimiento en la presente invención que sea adecuado para el desarrollo de los transformantes deseados. Sin embargo, si se seleccionan transformantes Pyr+ es preferible utilizar un medio de crecimiento que no contenga uridina. Las posteriores colonias se transfieren y purifican en un medio de crecimiento agotado en uridina.

En esta etapa, se pueden diferenciar transformantes estables de transformantes inestables por su velocidad de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares con un perfil más uniforme que desigual en el medio de cultivo sólido que carece de uridina. Adicionalmente, en algunos casos, se puede realizar un test adicional de estabilidad mediante el crecimiento de los transformantes en un medio sólido no selectivo (es decir, que contiene uridina), la recogida de esporas a partir de este medio de cultivo y la determinación del porcentaje de estas esporas que posteriormente germinarán y crecerán en un medio selectivo que carece de uridina. Alternativamente, se pueden utilizar otros métodos conocidos en la técnica para seleccionar transformantes.

En una realización particular del método anterior, la proteína nueva se recupera en la forma activa de la célula huésped después del crecimiento en medio líquido como resultado del procesamiento apropiado después de la traducción de la proteína nueva.

E. Métodos de análisis de las secuencias codificantes de ácidos nucleicos para la proteína nueva y/o expresión de la proteína.

Con el fin de evaluar la expresión de una proteína nueva mediante una línea celular que se ha transformado con una construcción de ácidos nucleicos que codifica una proteína nueva, se pueden llevar a cabo análisis a nivel de proteína, el nivel de ARN o mediante el uso de bioensayos funcionales particulares a la actividad y/o producción de la proteína nueva.

En una aplicación de ejemplo de las secuencias de ácido nucleico de la proteína nueva y las secuencias de proteína nueva descritas aquí, se diseña una cepa modificada genéticamente de hongos filamentosos, por ejemplo, Trichoderma reesei, para producir una mayor cantidad de proteína nueva. Dichos hongos filamentosos modificados genéticamente serían útiles para producir un producto de celulasa o hemicelulasa con una mayor capacidad celulolítica o hemocelulolítica. En una estrategia, esto se consigue mediante la introducción de la secuencia codificante para una proteína nueva en un huésped adecuado, por ejemplo, un hongo filamentoso, tal como Aspergillus niger.

Por consiguiente, la presente invención incluye métodos para expresar un polipéptido CIP1 tal como se define en las reivindicaciones en un hongo filamentoso u otro huésped adecuado mediante la introducción de un vector de expresión que contiene la secuencia de ADN que codifica una proteína nueva en células del hongo filamentoso u otro huésped adecuado.

En otro aspecto, la presente invención incluye métodos para modificar la expresión de un polipéptido CIP1 tal como se define en las reivindicaciones en un hongo filamentoso u otro huésped adecuado. Dichas modificación incluye un descenso o eliminación en la expresión del polipéptido CIP1 endógeno.

En general, los análisis utilizados para analizar la expresión de una proteína nueva incluyen, transferencia Northern, transferencia de puntos (análisis de ADN o ARN), RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada de manera apropiada (en base a la secuencia codificante de ácido nucleico) y transferencia Southern convencional y autorradiografía.

La producción y/o expresión de una proteína nueva se puede medir directamente en una muestra de lisado celular o sobrenadante de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico utilizando métodos conocidos en la técnica. Después de la separación de las proteínas en muestra mediante electroforesis y tinción con un colorante adecuado (por ejemplo azul brillante de Coomassie), se demostraría la producción de una proteína nueva mediante la aparición de una banda de proteína nueva. Además, la producción y/o expresión de una proteína nueva se pueden medir directamente en una muestra, por ejemplo, mediante ensayos para la actividad enzimática, expresión y/o producción.

Además, la expresión de proteína, se puede evaluar mediante métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células, secciones de tejido o inmunoensayo de medio de cultivo celular, por ejemplo, mediante transferencia Western o ELISA. Dichos inmunoensayos se pueden utilizar para evaluar cualitativa y cuantitativamente la expresión de una proteína nueva. Los detalles de dichos métodos son conocidos por el experto en la materia y muchos reactivos para realizar dichos métodos están disponibles comercialmente.

Se puede utilizar una forma purificada de una proteína nueva para producir anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para la proteína expresada para su uso en diversos inmunoensayos. (Véase, por ejemplo, Huet al., Mol Cell Biol. 11:5792-9, 1991). Entre los ensayos de ejemplo se incluyen ELISA, inmunoensayos competitivos, radioinmunoensayos, transferencia Western, ensayos de inmunofluorescencia indirectos, y similares.

F. Métodos para purificar una proteína nueva

En general, una proteína nueva producida en un cultivo celular se secreta en el medio, y se puede purificar o aislar, por ejemplo, mediante la eliminación de componentes no deseados del medio de cultivo celular. Sin embargo, en algunos casos, se pueden producir una proteína nueva en una forma celular que necesita la recuperación a partir de un lisado celular. En dichos casos, la proteína nueva se purifica a partir de las células en las que se produjo utilizando técnicas utilizadas habitualmente por los expertos en la materia. Entre los ejemplos se incluyen, pero sin limitación, cromatografía por afinidad (Tilbeurgh et al., FEBS Lett. 16:215, 1984), métodos cromatográficos de intercambio iónico (Goyal et al., Bioresource Technol. 36:37, 1991; Fliess et al., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314, 1983; Bhikhabhai et al., J. Appl. Biochem. 6:336, 1984; Ellouz et al., J. Chromatography 396:307, 1987), incluyendo intercambio iónico utilizando materiales con un alto poder de resolución (Medve et al., J. Chromatography A 808:153, 1998), cromatografía por interacción hidrofóbica (Tomaz and Queiroz, J. Chromatography A 865:123128, 1999), y separación de dos fases (Brumbauer, et al., Bioseparation 7:287-295, 1999).

Habitualmente, la proteína nueva se fracciona para segregar proteínas que tienen propiedades seleccionadas, tales como una afinidad de unión con agentes de unión concretos, por ejemplo, anticuerpos o receptores; o que tiene un rango de peso molecular o de puntos isoeléctricos seleccionados.

Una vez se consigue la expresión de una proteína nueva determinada, la proteína nueva producida de este modo se purifica a partir de las células o el cultivo celular. Entre los procedimientos de ejemplo adecuados para dicha purificación se incluyen los siguientes: cromatografía en columna de afinidad con anticuerpos, cromatografía de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; “chromatofocusing”; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75. Se pueden utilizar diversos métodos de purificación de proteínas y dichos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods Enzymol. 182:779-80, 1990; Scopes, Methods Enzymol. 90 Pt E:479-90, 1982. La etapa o etapas de purificación seleccionadas de penderán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y la proteína particular producida.

III. Características bioquímicas de la proteína nueva acetil xilano esterasas (axe2)

La proteína AXE2 se prevé que tenga 299 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 30 kDaltons. La proteína prevista está compuesta de 15 aminoácidos fuertemente básicos (+) (K,R), 28 aminoácidos fuertemente ácidos (-) (D, E), 91 aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, F, W, V) y 108 aminoácidos polares (N, C, Q, S, T, Y). Se prevé que AXE2 tenga un punto isoeléctrico de 4,5 y una carga de –12,9 a pH 7,9.

Axe2 es un miembro de la familia 5 de esterasas de carbohidratos (CE5). Se prevé que tenga una secuencia señal N-terminal de 21 aminoácidos. Véase la figura 11.

Presenta un posible sitio de unión de anclaje a GPI en el número de aminoácido 274, correspondiente al residuo de serina en la posición 291 en la alineación (Udenfriend, S. y Kodukula, 1995. Prediction of 0 site in nascent precursor of glycophosphatidylinositiol protein. Methods in Enzymology, 250: 57.82). Véase la figura 12. Una forma de esta proteína que se puede secretar al medio de cultivo de un organismo huésped se puede generar mediante la construcción de un vector de expresión para una versión del gen axe2 que carece del posible sitio de unión de anclaje a GPI y el dominio hidrofóbico carboxi terminal asociado.

IV. Utilidad de los genes identificados de interés

Los genes de la invención se pueden utilizar en un conjunto de aplicaciones diferentes.

Acetil xilano esterasas (AXE2)

Se anticipa que la funcionalidad de la acetil xilano esterasa codificada por la SEQ ID No: 14 (véase la figura 10) proporcionará un efecto sinérgico cuando se utiliza, en combinación con xilanasa, en aplicaciones en las que es deseable hidrolizar sustratos de base xilano en xilosa. La hidrólisis primaria de xilano se potenciaría mediante la capacidad de la acetil xilano esterasa de eliminar los grupos laterales de acetilo, haciendo así que las cadenas de xilano presentes en varios sustratos sean más accesibles a la actividad de xilanasa.

La funcionalidad anterior de la acetil xilano esterasa tendría un ventaja potencial en una serie de aplicaciones agrícolas e industriales:

-

modificación in vivo de alimentos animales que contienen xilano para mejorar la capacidad de digestión.

-

aplicaciones generales resultantes de la degradación de la biomasa en azúcares fermentables.

-

productos auxiliares de procesado en la deslignificación de pulpa y papel.

-

componente de sistemas de limpieza enzimática para tejidos.

-

aplicaciones en alimentos – especialmente panadería – en combinación con otras funcionalidades enzimáticas para mejorar las propiedades físicas de los productos horneados.

-

aplicaciones de detergentes de lavandería – eliminación de manchas de hierba – en combinación con otras funcionalidades de enzimas.

Las siguientes preparaciones y ejemplos se ofrecen para permitir a los expertos en la materia entender más claramente y realizar la presente invención. No deberían considerarse como limitantes del alcance de la invención, sino que simplemente son ilustrativos y representativos de la misma.

En el desarrollo experimental que se acompaña, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); !M (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); !mol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); !g (microgramos); L (litros); ml (mililitros); !l (microlitros); cm (centímetros); mm(milímetros); !m (micrometros); nm (nanómetros); °C. (grados centígrados); h (horas); min (minutos); s (segundos); ms (milisegundos); Ci (Curies) mCi (miliCuries); !Ci (microCuries); TLC (cromatografía en capa fina); Ts (tosilo); Bn (bencilo); Ph (fenilo); Ms (mesilo); Et (etilo), Me (metilo).

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero sin limitar, la presente invención.

Ejemplo 1

Construcción de bibliotecas de ADNc de T. Reesei

Se desarrolló T. reesei (ATCC 13631) bajo condiciones diferentes para generar micelio que expresa perfiles de ARNm específicos de las condiciones de crecimiento. A continuación, se aisló el ARN, se agrupó y se generaron bibliotecas de ADNc.

1A. Crecimiento de micelios de T. Reesei

Todos los cultivos se desarrollaron en un medio líquido de extracto de levadura/glucosa (YEG) durante la noche a 28°C. Se transfirieron a continuación en las siguientes condiciones y se cultivaron durante el tiempo indicado a 28°C, a menos que se indique lo contrario:

Experimento 1:

A. Solución de Vogel + avicel al 2%, 3 días y 6 días

B. Solución de Vogel + solkafloc al 2%, 3 días y 6 días

C. Solución de Vogel + salvado de trigo al 2%, 6 días

D. Solución de Vogel + pulpa de remolacha al 2%, 6 días

E. Cultivo en estado sólido en salvado de trigo (15 g de salvado de trigo, 1 g Proflo, 1 g solkafloc, 30 ml agua), 7 días

F. cultivo en estado sólido en pulpa de remolacha (15 g de pulpa de remolacha, 1 g Proflo, 1 g solkafloc, 30 ml agua), 9 días

Experimento 2:

A. Solución de Vogel + glucosa al 2%, 24h

B. Solución de Vogel + lactosa al 2%, 24h

C. Solución de Vogel + xilosa al 2%, 24h

D. Solución de Vogel + fructosa al 2%, 24h

E. Solución de Vogel + maltosa al 2%, 24h

F. Solución de Vogel sin ningún carbono añadido, 24h

G. Solución de Vogel sin ningún nitrógeno añadido, 24h

H. Solución de Vogel + salvado de trigo al 2%, 3 días

I. Solución de Vogel + salvado de trigo al 2%, 6 días

J. Solución de Vogel + 2% solkafloc, 3 días

K. Solución de Vogel + 2% solkafloc, 6 días

L. Solución de Vogel + 2% avicel, 3 días

M. Solución de Vogel + 2% avicel, 6 días

N. Vogels + celulosa hinchada con fosfórico al 2%, 3 días

O. Estado sólido (15 g salvado de trigo, 1 g Proflo, 1 g solkafloc, 30 mL agua), 6 días

P. YEG, 42°C durante 1,5h (choque térmico)

Q. YEG, 20 mM DTT durante 1,5h (estrés redox)

R. YEG, no agitado en recipiente cerrado durante 1,5h a temperatura ambiente (anoxia) 1B. Aislamiento de ARN

Preparación de medios

Medio extracto de levadura/glucosa 1. dH20 2. Extracto de levadura 3. Glucosa

- 1 litro 1000 ml 5 g 20 g

Solución de Vogel 1. 50X Solución madre de Vogel 2. dH2O 3. Autoclave

- 1 litro 25 ml 975 ml

50X solución madre de Vogel 1. citrato sódico 2. KH2PO4 3. NH4NO3 4. MgSO4*7H2O 5. CaCl2*2H2O 6. Solución de elementos traza

- 1 litro 150 g 250 g 100 g 10 g 5 g 5 ml

7. Solución de Biotina 8. en dH2O, se lleva a un volumen final de 1 litro

2,5 ml

Solución de elementos traza

- 1 litro

1. ácido cítrico 2. ZnSO4*7H2O 3. Fe(NH4)2SO4*6H2O 4. CuSO4*5H2O 5. MnSO4*4H2O 6. H3BO3 7. NaMoO4*2H2O 8. en dH2O, se lleva a un volumen final de 1 litro

50 g 50 g 10 g 2,5 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g

Solución de Biotina

- 1 litro

1. d-Biotina 2. en dH2O, se lleva a un volumen final de 1 litro

0,1 g

Se aisló el ARN total utilizando el Reactivo TRIZOL® de Life Technologies™ (No. Catálogo 15596-026) y una ligera modificación de su protocolo de aislamiento de ARN que se acompaña (incorporado aquí en su totalidad). A menos que se afirme lo contrario, se llevó a cabo el procedimiento entre 15 y 30°C.

Se filtró el micelio de T. reesei de los diferentes cultivos descritos en 1A para extraer el líquido en exceso y se congeló en nitrógeno líquido. El micelio congelado se molió en un mortero y una mano de mortero y se añadió a reactivo TRIZOL (aproximadamente 9 ml por 1 ml de micelio molido). A continuación, el homogenato se centrifugó a 12,000 x g durante 10 minutos entre 2 y 8°C. La solución de homogenato purificado (sobrenadante) se transfirió a un tubo nuevo.

Las muestras homogeneizadas se incubaron durante 5 minutos entre 15 y 30°C para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas. A continuación, se añadieron 0,2 mL de cloroformo por 1 mL de Reactivo TRIZOL y os tubos de muestra se taparon por seguridad. Los tubos se agitaron vigorosamente a mano durante 15 segundos, a continuación se incubaron entre 15 y 30°C durante 2 a 3 minutos. A continuación, las muestras se centrifugaron a no más de 12,000 x g durante 15 minutos entre 2 y 8°C. Después de la centrifugación, la mezcla se separa en una fase inferior roja de fenol-cloroformo, una interfase, una fase acuosa superior incolora. La fase acuosa (aproximadamente un 60% del volumen de reactivo) se transfirió a continuación a un tubo nuevo.

El ARN de la fase acuosa se precipitó mediante la adición de 0,25 mL de isopropanol seguido de 0,25 mL de una solución de precipitación elevada en sal (citrato sódico 0,8 M y NaCl 1,2 M) por 1 ml de Reactivo TRIZOL utilizado para la homogenización. La solución resultante se mezcló y las muestras se incubaron entre 15 y 30°C durante 10 minutos, a continuación se centrifugaron a no más de 12,000 x g durante 10 minutos entre 2 y 8°C.

Se extrajo el sobrenadante y se lavó el residuo de ARN de tipo gel una vez con etanol al 75% (fabricado con agua libre de ARNasa), utilizando por lo menso 1 mL de etanol al 75% por 1 mL de Reactivo TRIZOL utilizado para la homogenización inicial. La muestra se mezcló a continuación mediante centrifugación a no más de 7.500 xg durante 5 minutos entre 2 y 8°C.

El sobrenadante se extrajo de nuevo y se secó brevemente el residuo de ARN (secado al aire o al vacío durante 510 minutos). El ARN se disolvió en agua libre de ARNasa mediante el paso de la solución varias veces a través de una punta de pipeta y a continuación la incubación durante 10 minutos entre 55 y 60°C.

La pureza del ARN aislado se comprobó mediante electroforesis en gel

1C. Construcción de bibliotecas de ADNc

Se agruparon volúmenes iguales de ARN obtenido de cada una de las condiciones de crecimiento descritas para el Experimento 1 en 1A y se remitieron un total de 2 mg a Life Technologies (Rockville, MD; ahora Invitrogen) para la construcción de una biblioteca de ADNc. De forma similar, el ARN del Experimento 2 en 1A se agrupó y se remitió a Life Technologies para la construcción de ADNc. Las bibliotecas de ADNc se produjeron utilizando procedimientos estándar en la técnica. A continuación, se indica un resumen de las etapas realizadas.

Se aisló Poli-A ARN del ARN total mediante cromatografía. El ARN total se desarrolló en una columna de celulosa con oligo(dT), y posteriormente se eluyó el poli-A ARN (ARNm).

A partir del ARNm, se generaron ADNc por Life Technologies (Rockville, MD) utilizando el Sistema de Síntesis de ADNc de Life Technologies™ (el manual de instrucciones para el cual se incorpora en la presente invención en su totalidad). A continuación, se resumen los procedimientos a utilizar.

Síntesis de la primera cadena

Los componentes de reacción para la producción de una primera cadena de ADNc del ARNm de T. reesei aislado se combinan en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo. La mezcla de reacción, en un volumen de 50 !l, contiene los siguientes componentes:

-

50 mM Tris-HCl (pH 8,3)

-

75 mM KCl

-

3mM MgCl2

-

10m MDTT

-

500 !M de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP

-

50 !g/ml oligo(dT)12-18

-

100 !g/ml poli (A) ARN (de T. reesei)

-

10,000 unidades/ml de la transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina Moloney (M-MLV).

Se añade al final transcriptasa inversa, con mezclado, para iniciar la reacción. Opcionalmente, se extrae inmediatamente una alícuota de 10 !l y se transfiere a un tubo separado que contiene 1 !Ci de trazador [a-32P]dCTP. A continuación, ambos tubos se incuban a 37°C durante 1 hora. Los tubos se vuelven a colocar en hielo después de la incubación y la reacción se termina mediante la adición de 1 !l de Na2EDTA 0,25 M (pH 7,5). La mezcla de reacción de 40 !l se utiliza para la síntesis del ADNc de la segunda cadena.

Si se produce, la mezcla de trazador se diluye con 89 !l de agua y alícuotas de 5 !l por duplicado se depositan sobre filtros (por ejemplo, filtros de fibra de vidrio). El segundo filtro se lava tres veces (secuencialmente), 5 minutos cada uno, con aproximadamente 50 !l por lavado de TCA enfriado en hielo. A continuación, se lava el segundo filtro con 50 ml de etanol al 95% durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente, a continuación se seca. Los dos filtros se cuentan por centelleo estándar para determinar la cantidad de 32P en la mezcla (del primer filtro) y la cantidad de 32P incorporado en el ADNc de la primera cadena (del segundo filtro) para determinar el rendimiento de ADNc de la primera cadena.

El resto de la mezcla de trazador se extrae con fenol y se precipita con etanol. El residuo se aisla y se realiza una electroforesis en gel utilizando gel de agarosa alcalino para determinar el tamaño de productos de cadena única.

Síntesis de la segunda cadena

El ADNc de doble cadena se puede producir utilizando un procedimiento ajustado a la producción de ADNc al que se añadirán enlazadores.

En un tubo de microcentrífuga en huelo, se añaden los componentes a 40 !l del producto de reacción de la primera cadena para producir 300 ml de una mezcla de reacción de la segunda cadena. Los componentes se añaden en el siguiente orden: agua tratada con DEPC, mezcla de dNTPs, solución concentrada de tampón/sal, ADN polimerasa I de E. coli, ARNasa H de E. coli y ADN ligasa de E. coli. La mezcla de reacción final tiene la siguiente composición, además de los componentes originales en el producto de reacción de la primera cadena:

-Tris-HCl 25 mM (pH 8,3)

-

KCl 100 mM

-

(NH4)2S04 10 mM

-

MgCl2 5 mM

-

dATP, dCTP (incluyendo 10 mCi de [a32P] dCTP), dGTP, aproximadamente 250 mM

-

NAD 0,15 mM

-

DTT 5 mM

-

ADN polimerasa I 250 U/ml

-

ARNasa H 8,5 U/ml

-

ADN ligasa 30 U/ml

El tubo se centrifuga suavemente para mezclar y se incuba a 16º C durante 2 horas. A continuación, se coloca el tubo en hielo y se añaden 25 ml de Na2EDTA (pH 7,5).

Se añaden 10 ml de la mezcla a 90 ml de agua. Se dispone una alícuota de 5 ml sobre un primer filtro de fibra de vidrio y se seca. Se disponen otros 10 ml de la mezcla no diluida sobre un segundo filtro de fibra de vidrio, que se lava tres veces, 5 minutos cada vez, con 50 ml de TCA enfriado en hielo para cada lavado. A continuación, se lava el segundo filtro una vez a temperatura ambiente con etanol al 95% durante 5 minutos. Se recuentan los filtros en un centelleador estándar, el primero se utiliza para determinar la cantidad de 32P en la mezcla (actividad específica) y la segunda se utiliza para determinar la cantidad de 32P incorporado en el ADNc.

El resto de la mezcla de reacción se extrae en fenol y se precipita en etanol. El residuo se disuelve a continuación en 200 !l de tampón TE estéril (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), Na2EDTA 1 mM), al que se añaden 100 !l de acetato de amonio 7,5 M, seguido de 500 !l de etanol para la precipitación. El residuo se seca, se disuelve a continuación en 20 !l de tampón TE estéril, se extraen 2 !l y se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa alcalino. Se añaden enlazadores o adaptadores al resto para su incorporación en un vector.

Para la adición de enlazadores, el ADNc se metila primero con una metilasa especifica para el enlazador a utilizar para proteger los sitios de restricción internos. Los extremos de ADNc se reparan con ADN polimerasa de T4 y, a continuación, se añaden enlazadores mediante unión por los extremos romos. Los enlazadores deberían disponerse a una concentración elevada para una adición eficaz. El ADNc se digiere con la endonucleasa o endonucleasas de restricción seleccionadas, a continuación se purifica a partir de los productos de digestión pequeños (por ejemplo, mediante cromatografía en columna). El vector se digiere con la misma endonucleasa o endonucleasas de restricción y se combina con el ADNc que, a continuación, se une en el vector como un inserto.

Los enlazadores o adaptadores añadidos a los sitios de endonucleasa de restricción contenidos en ADNc, de manera que un sitio Sall se halla en 5’ con respecto a la secuencia de ADNc correspondiente al ARNm original y un sitio Notl 3’ con respecto a la secuencia de ADNc correspondiente al ARNm original. A continuación, se insertan los ADNc en un vector transportador (“shuttle”) pREP3Y. El vector pREP3Y es un vector pREP3X (ATTC número 87603) modificado, donde el vector se digirió con endonucleasa BamHI y se insertó un oligonucleótido sintético para añadir sitios de restricción. El vector resultante tiene los siguientes sitios de restricción en la región de polienlazadores: XhoI, Sall, XbaI, BamHI, SmaI, Notl y SmaI. El vector y el ADNc se digirieron en Sall/ NotI y el ADNc se insertó en el vector. Véase la figura 15.

Se construyeron bibliotecas de ADNc por Invitrogen Life Technologies en el vector pREP3Y. La cepa DH12S de E.coli se transformó con el vector para crear la biblioteca de ADNc. Se devolvió una biblioteca no amplificada a los inventores. A continuación, se emplacaron los clones individuales y se desarrollaron en LA más carbenicilina 50 mg/ml (bacto triptona 20 g/l; extracto de levadura de Bacto 10 g/l; NaCl 1 g/l; agar de Bacto 17,5 g/l; 1 ml/l de 50 mg/ml de carbenicilina añadida después de la esterilización en autoclave y el enfriamiento, pero antes de la solidificación).

Ejemplo 2.

Identificación de LT1-24 y el gen cip1

Se utilizó el siguiente razonamiento para encontrar el gen cip1:

1) Desarrollar las bibliotecas en membranas Hybond+ de Amersham; 2) Lisar las células y fijar el ADN de las bibliotecas en la membrana; 3) Hibridar la transferencia (“blot”) con las sondas específicas de genes; 4) Hibridar la transferencia (“blot”) una segunda vez, pero ahora con una sonda de CBM mixta; 5) Extraer el gen específico de las marcas de CBM; y Seleccionar y analizar las nuevas marcas.

Aislamiento de colonias

La biblioteca de ADNc inducida por celulosa de T. reesei se utilizó para estos experimentos de hibridación. La biblioteca de ADNc de E. coli se emplacó en placas de agar (20 x 20 cm) para obtener una cantidad suficiente de clones.

Las bibliotecas de ADNc se emplacaron en 200 ml 2xTY (bactotriptona 16 g/l, extracto de levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l) solidificado con agar al 1,5% en presencia de ampicilina (AMP) 100 !g/ml. Se puede obtener una recogida eficaz cuando se emplacan 1500 cfu en placas de agar de 20x20cm (Genetix, Q-Tray). Se emplacó 1 ml de la dilución apropiada utilizando partículas de vidrio. Las placas se dejaron crecer toda la noche a 37ºC.

Las colonias se recogieron y transfirieron a placas de microtitulación utilizando Q-Pix (Genetix Ltd.).

Esto dio lugar al crecimiento y almacenamiento de 45312 clones. Las placas de microtitulación se pueden guardar a -80C con glicerol al 10% hasta estar listas para su uso. A partir de estos clones que contienen ADN de. T. reesei, se dispusieron 34500 clones en membranas de nylon y se utilizaron para experimentos de hibridación.

Se utiliza Q-Pix (Genetix Ltd.) para pasar los clones a MTPs de 384 pocillos. Después del crecimiento, se utiliza Q-Pix para situar en rejilla las MTP de 384 pocillos en filtros de membrana. Estos filtros de membrana se utilizaron para experimentos de hibridación con sondas que contienen CBM para buscar celulasas que contienen CBM nuevos.

Preparación de sondas

Las sondas se generaron utilizando cebadores especificados en la Tabla 1. Las sondas de CBM se diseñaron utilizando secuencias conocidas de módulos de unión a carbohidratos de Trichoderma reesei. Véase, Paul Birch, Curr. Genet (1998) 33; 70-76. Brevemente, para las sondas de CBM, se mezcló ADN genómico total de QM6A de T. reesei (100 ng/50 !l) con un volumen 1 !l/50 !l 10 mM de FRG164 y un volumen 1 !l/50 !l 100 mM de FRG165, FRG166 o FRG167. FRG166 no dio lugar a la amplificación (el codón de Ser era AGY), mientras que FRG167 daba lugar a una amplificación (el codón de Ser era TCN). De este modo, se utilizó el cebador FRG167 en la amplificación. Este fragmento se mezcló con el fragmento producido con FRG165 como cebador. Los dos fragmentos separados se mezclaron y contenían una mezcla de secuencias de CBM presentes en T. reesei y se utilizaron como la sonda de CBM. En resumen: la sonda de CBM se preparó mediante la mezcla de los fragmentos obtenidos mediante PCR utilizando las combinaciones: FRG164+FRG165 y FRG164+FRG167, 2,5 unidades de platinum TAQ polimerasa, 5 !l 10x tampón TAQ, 1,5 !l MgCl2 y 1 !l de dNTPs 10mM. La PCR se realizó de la siguiente manera: 1 ciclo: 1 minuto a 98°C 10 ciclos: 1 minuto a 94°C 1,5 minutos a 65-50°C 1 minuto a 72°C 25 ciclos: 1 minuto a 94°C

1,5 minutos a 50°C 1 minuto a 72°C Parar la reacción y guardar a 15°C

5 Para sondas del núcleo catalítico (es decir, específicas de genes), se mezcló el ADN genómica total de QM6A de T. reesei (100 ng/50 !l) con 1 !l de concentración de cebador 10 mM en un volumen total de 50 !l, 2,5 unidades de Platinum Taq polimerasa, 5 !l 10 X tampón TAQ, 1,5 !l de MgCl2 y 1 !l de dNTPs 10 mM utilizando el protocolo anterior, pero en lugar de 50°C, se utilizaron 55°C.

10 Las sondas se purificaron utilizando métodos estándar. En esta serie de experimentos, las sondas se purificaron mediante purificación en gel utilizando el Kit de purificación en gel Qiagen.

Detección

15 Las muestras de colonias recogidas de las placas de microtitulación se dispusieron en filtros de membrana de nylon de 20 x 20 cm (Hybond+ (RPN.82B), Amersham) y se desarrollaron durante toda la noche a 37°C después de colocar los filtros en una agar amplio 2xTY (100 !g/ml ampicilina). Cada membrana de 20 x 20 cm contenía 4600 clones por duplicado. A continuación, las placas se procesaron mediante ECL según las instrucciones del fabricante por la presencia de cualquiera de las secuencias específicas de genes o CBM

20 Se realizó una prehibridación en tampón ECL provisto con el kit ECL Direct durante 20 minutos, durante los cuales la sonda se marcó (exactamente según el protocolo). La sonda se añade directamente a la solución de prehibridación hasta una concentración de 10 ng/ml y se hibridó durante aproximadamente 60 minutos a 42°C. A continuación, se lavaron los filtros dos veces en tampón primario (urea 6M, 0,5x SSC, SDS al 0,4%) a 42°C durante 20

25 minutos/lavado y dos veces en tampón secundario (2xSSC) a temperatura ambiente durante 5 minutos/lavado. Después de drenar el tampón de lavado en exceso, se llevó a cabo la detección mediante la adición de una mezcla de volumen igual de los reactivos de detección ECL directamente a los filtros hasta 0,125 ml/cm2. Después de un minuto, se drenó el exceso de reactivo, las membranas se envolvieron en SaranWrap™ y se expusieron a Hyperfilm™ ECL (RPN.2 103) durante menos de dos horas, habitualmente durante 10 minutos. Las colonias que

30 muestran una señal positiva se seleccionaron a continuación para un análisis posterior mediante otros métodos, tales como subclonación, secuenciación de ADN, localización por restricción y PCR.

Debido a que el sistema ECL utiliza un marcador enzimático y éste se desactiva tras la reacción quimioluminiscente, no es necesario extraer la transferencia (“blot”) de la vieja sonda antes de iniciar la segunda hibridación y 35 posteriores. La transferencia (“blot”) debe mantenerse en el reactivo de detección durante la noche antes de volver a sondar la transferencia según el protocolo descrito.

Las 9 sondas específicas de genes, es decir, sondas para módulos catalíticos, se mezclaron y utilizaron como una “megasonda”. Después de esta hibridación, se reutilizaron las mismas transferencias (“blots”) y se hibridaron con la

40 sonda de los CBM. Mediante la sustracción de los puntos de la “megasonda” de los CBM, se detectaron los desconocidos. Se cribaron un total de 34500 clones; se escogieron de forma óptima 264 clones y se sondaron con sondas catalíticas específicas; se hibridaron 20 clones con una sonda específica de gen de LT1-24. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: Cebador directo: P002248: GAC AAT CCA AAC GAC GCT; y cebador inverso: PVS173: CAA TCG AGA TGT CGT CGA AC.

45 Se identificó un clon, LT1-24, que comprende cip1, que produjo una señal cuando se sondó con un grupo mixto de sondas de CBM, pero no consiguió generar una señal cuando se sondó con las sondas agrupadas de dominios catalíticos. De este modo, la hibridación por sustracción dio lugar a la identificación de un nuevo gen de T. reesei, cip1, que contiene CBM. La secuencia completa del ADNc de este gen se determinó utilizando técnicas conocidas

50 en el sector. Tiene una señal de secreción prevista, una región “catalítica” de función desconocida, una región de enlace y un módulo de unión a celulosa C-terminal (CBM).

Tabla 1

Cebadores específicos de genes (dominio catalítico) y degenerados (CBM) de los genes conocidos que contienen CBM en T. reesei (ADN cromosómico:QM6A). N(=A o C o g o T), R (=A o G), Y (=C o T), D (G o A o T)

cebadores específicos de genes (dominio catalítico)

Gen

Orientación Cebador Secuencia

cbh1

directo FRG168 CTC CTC CAC ACC CGG TGC CG

inverso

FRG169 TGC TGC CAA TGG GTC CG

cbh2

directo FRG170 ACG TAT TCA GGC AAC CC

inverso

FRG171 GCA GTG GCC ATG GCT CC

egl1

directo FRG172 CCA GTA CAT GAA CTG GC

inverso

FRG173 AGA CCC AAT GTC TCC CC

egl2

directo FRG184 CGA ATT GTG CTC CTG GC

inverso

FRG185 GTG GTT GGA CCG GAT GG

egl4

directo FRG176 CCT ACC GTG GTA TCA GG

inverso

FRG177 TGG TTC TGC TGG TCG GG

egl5

directo FRG178 CAT TTC GAC ATC ATG GC

inverso

FRG179 CTG TCC CAC GCA GAG GC

axe1

directo FRG180 CCG GCT GGC TTC GTC TG

inverso

FRG181 TGG CCG TAA CCT TGG TG

man1

directo FRG182 CCT CTC TCA CGA CTC GC

inverso

FRG183 GTT CGA TGA GTT GTA CC

swo1

directo PVS159 CCC CCA AAC GGA ACA ACT TCC

inverso

PVS160 CTG TAT CTG TGG TTG TGT AGG

Cebadores degenerados de CBM

Caja

orientación cebador secuencia deg.

GQCGG

directa FRG164 GGNCARTGYGGN GG 64X

YSQC(L/I)

Inversa FRG165 AD RCA YTG NGA RTA 96X

YSQC(L/I)

Inversa FRG166 AD RCA YTG RCT RTA 32X

YAQC(L/I)

Inversa FRG167 AD RCA YTG NGC RTA 96X

Ejemplo 3

Identificación y análisis de secuencia de los genes de T. reesei de interés

5 La secuenciación parcial de clones de ADNc anónimos es una técnica ampliamente utilizada para la identificación de genes. Estas secuencias de ADNc parciales o marcadores de secuencia expresada (ESTs) tienen una aplicación potencial para la identificación de genes importantes implicados en la degradación de celulosa.

10 Se aisló el plásmido que contiene un inserto de ADNc de clones de las bibliotecas descritas en el ejemplo 1 y se obtuvo una secuencia 5’ de paso único del inserto de ADNc de aproximadamente 18.000 clones en la North Carolina State University (Fungal Genomics Laboratory, College of Agriculture and Life Sciences, Raleigh, NC). Las secuencias de los ADNc se obtuvieron utilizando un cebador correspondiente a la secuencia del vector adyacente al extremo 5’ del inserto de ADNc. Las secuencias de lecturas de secuencia individuales se compararon y se

15 ensamblaron segmentos solapantes para formar 2102 contigs (secuencias ensambladas) que consisten en dos o más lecturas. 3030 lecturas individuales no presentaron un solapamiento de secuencia significativo con ninguna otra lectura en el conjunto de datos. Las regiones codificantes previstas del grupo de EST se compararon mediante BLAST (Véase Altschul et al. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410) para todas las bases de datos de secuencias disponibles públicamente.

20 Los clones que contienen secuencias de ADNc similares a glicosil hidrolasas conocidas, carbohidrato esterasas o moléculas de unión a carbohidrato se identificaron para una investigación posterior utilizando el programa BLAST (BLASTX y BLASTN) utilizando los parámetros por defecto. Véase, Altschul et al., 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410. Los ADNc de longitud completa correspondientes a estos productos génicos

25 se secuenciaron en su totalidad utilizando técnicas conocidas en el sector.

Las secuencias se analizaron utilizando el paquete informático DNAstar o Vector NTI utilizando los parámetros por defecto.

30 Los genes de interés identificados mediante este método se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2. Actividades de degradación de biomasa y sus genes en Trichoderma reesei

Gen

Familiaa Funciónb Característicasc Acceso#

axe2

CE5 Acetil xilano esterasa SS, GPI AY281376

cip2

No asignado Desconocida SS,CBM AY281368

abf2

GH62 Arabinofuranosidasa SS AY281369

cip1

No asignado Desconocida SS,CBM AY281370

aFamilia de glicosil hidrolasa, GH; CE, familia de carbohidrato esterasa,bLa función de proteínas identificadas en este estudio se prevé a partir de la secuencia de aminoácidos codificada. cSS, secuencia señal N-terminal; CBM, módulo de unión a carbohidrato; GPI, ancla de glicosil fosfatidilinositol. Las características de las proteínas identificadas en este estudio se prevén a partir de la secuencia de aminoácidos codificada.

Ejemplo comparativo 4

Coregulación de los genes cip1 y cip2 con otros genes de celulasa

Se inducen endoglucansas previamente identificadas durante el crecimiento en medio que contiene celulosa, soforosa o lactosa. Para determinar si los polipéptidos recién descubiertos, CIP1 y CIP2, con potenciales papeles en la degradación de la biomasa se regulan de manera similar, se examinaron los niveles de ARNm para cada uno de los productos génicos mediante transferencia Northern. Se utilizaron dos cepas diferentes: QM6a, un aislado de tipo salvaje de T. reesei y RL-P37, una cepa que se ha seleccionado por la producción mejorada de enzimas celulolíticas. Los micelios de cada una de estas cepas se desarrollaron en matraces en medio mínimo que contenía glucosa, celulosa cristalina (avicel) o glicerol como única fuente de carbono, o glicerol complementado con soforosa 1 mM.

Se utilizaron microarrays para examinar la regulación de los genes cip1 y cip2.

Generación de ARNm

Se obtuvieron cepas de Trichoderma reesei de la American Type Culture collection.

Para el análisis de transferencia Northern, se inocularon �1X107 esporas en 50 ml de medio mínimo complementado con glucosa al 5% y se desarrollaron durante 24 horas. Se recogieron los micelios mediante centrifugación, se lavaron en medio sin carbono y se resuspendieron hasta una densidad óptica de -0,3 en 50 ml de medio mínimo complementado con glucosa al 5%, avicel al 2%, glicerol al 2% o glicerol al 2% que contiene soforosa 1 mM (Sigma). Los cultivos se desarrollaron a 30°C en matraces con aireación vigorosa durante 20 horas.

Los micelios se recogieron mediante filtración a través de miracloth y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Se preparó ARN de los micelios mediante molienda bajo nitrógeno líquido con un mortero y mano de mortero y la extracción utilizando reactivo Trizol (Invitrogen Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Se seleccionó ARN poliadenilado 2 veces utilizando Oligotex (Qiagen). La transferencia se realizó utilizando un kit NorthernMax-Gly (Ambion). Se generaron sondas marcadas con 32P utilizando un kit aDECAprime (Ambion). La hibridación se realizó utilizando el tampón de hibridación ultrasensible ULTRAhyb (Ambion).

Las endogluconasas de T. reesei conocidas son inducidas durante el crecimiento en medio que contiene celulosa, soforosa o lactosa. Para determinar si cip1 se regula de manera similar, se examinaron los niveles de ARNm para las endoglucanasas egII, egIII y cip1 mediante transferencia Northern. Se utilizaron dos cepas diferentes: QM6a, un aislado de tipo salvaje de T. reesei y RL-P37, una cepa que se ha seleccionado por la producción mejorada de enzimas celulolíticas. Los micelios de cada una de estas cepas se desarrollaron en matraces en medio mínimo que contenía glucosa, celulosa cristalina (avicel) o glicerol como única fuente de carbono, o glicerol complementado con soforosa 1 mM. Tal como se muestra en la figura 13, las endoglucanasas se regularon de forma muy similar entre sí y a cip 1. La inducción mediante soforosa dio lugar a niveles más elevados de expresión que con el crecimiento en celulosa durante el periodo de tiempo examinado. Además, la expresión de estos genes era sustancialmente superior en la cepa RL-P37 que en QM6a.

Microarrays

Para medir los niveles de expresión de cip1 y cip2 se construyeron microarrays, donde sondas de oligonucleótidos de sesenta pb que contenían secuencias únicas, de las que cada uno de los EST se diseñó para averiguar la abundancia de sus correspondientes ARNm. Se sintetizaron sondas de oligonucleótidos y se seleccionaron tal como se describe en Hughes et al. (2001) Nature Biotechnol 19:342-347 by Agilent Technologies, Palo Alto, CA. En todos los experimentos realizados, se utilizaron microarrays para determinar los niveles de expresión entre dos muestras diferentes.

Los ARNms que comprenden las muestras de interés se marcaron con los colorantes fluorescentes Cy5 y Cy3 Perkin Elmer/NEN. Se combinaron las parejas de muestras marcadas recíprocamente y se cohibridaron a los “arrays”, El logaritmo de la proporción (proporción en logaritmo) de dos especies fluorescentes unidas a cada una de las sondas refleja los niveles de expresión relativa de los genes afines en las dos muestras. Véase Hughes et al. (2001), supra, and DeRisi et al. (1996) Nat Genet 14:457-460.

Aunque las dos enzimas glicolíticas potenciales, cip1 y cip2, no se ajustan a ninguna clase actualmente definida de GHs, su regulación es análoga a GHs conocidas. La regulación de cip1 entre cepas con capacidades de producción de celulasa variables y a lo largo de una serie de condiciones es indistinguible de las endoglucanasas y particularmente la celobiohidrolasa cbh1/cel7a (Figuras 13 y 14). De manera similar, cip1 tiene un patrón de expresión en común con estos genes, particularmente en RL-P37. La corregulación de estos genes con componentes de celulasa regulados canónicamente y el hecho de que contienen diferentes módulos de unión a celulosa favorece la idea de que cip1 y cip2 codifican actividades no reconocidas previamente con potenciales papeles en la degradación de la biomasa.

Los genes que codifican la hemicelulasa axe2 y abf2 parecen estar inducidos diferencialmente por lactosa y por soforosa en QM6a o en RL-P37 o ambas. De manera más destacable, abf2 se indujo más sustancialmente en RL-P37 durante el crecimiento en lactosa que en soforosa (datos no mostrados).

Esto muestra que los genes nuevos, cip1 y cip2, se regulan de manera coordinada con otras enzimas degradantes de celulosa.

Ejemplo 5

Construcción de una cepa de Trichoderma reesei con cuatro genes de celulasa eliminados (eliminación de quad)

Este ejemplo describe la construcción de un huésped de expresión adecuado. Más específicamente, en este ejemplo se describe la construcción de un huésped de expresión de Trichoderma al que se han eliminados los principales genes de celulasa. Los métodos utilizados aquí se han descrito previamente en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5,650,322, 5,874,276 y 6,286,196.

Se construyó una cepa de T. reesei en la que los genes que codifican celobiohidrolasa I (CBHI, Cel7a), celobiohidrolasa II (CBHII, Cel6a), endoglucanasa I (EGI, Cel7b), y endoglucanasa II (EGII, Cel5a) se desactivaron por eliminación o alteración utilizando técnicas de genética molecular. Esta cepa (una cepa con quad eliminado) es útil como huésped para la sobreexpresión de genes que codifican otras proteínas secretadas por T. reesei.

La cepa huésped de T. reesei utilizada fue la cepa RL-P37 que se había utilizado previamente para producir preparaciones de celulasa comercial por Genencor International, Inc. La derivación y caracterización de esta cepa se ha publicado previamente (Sheir-Neiss, G. and Montenecourt, B.S. (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53; Patente de Estados Unidos 4,797,361). Es una cepa mutante sobreproductora de celulasa que se ha obtenido como resultado de varias etapas de mutagénesis de la cepa de tipo salvaje (QM6a).

1) Aislamiento de la cepa mutante con pyr4.

Con el fin de preparar la cepa RL-P37 para la transformación con el ADN plasmídico fue necesario aislar un derivado que tenía una mutación nula en el gen pyr4.

El gen pyr4 codifica la orotidin-5’-monofosfato descarboxilasa, una enzima necesaria para la biosíntesis de uridina. El inhibidor tóxico ácido 5-fluoroorótico (FOA) es incorporado en la uridina por las células de tipo salvaje y, de este modo, envenena las células. Sin embargo, las células defectuosas en el gen pyr4 son resistentes a este inhibidor, pero necesitan uridina para el crecimiento. Por tanto, es posible seleccionar cepas mutantes con pyr4 utilizando FOA. En la práctica, las esporas de la cepa RL-P37 de T. reesei se extendieron por la superficie de un medio solidificado que contenía 2mg/ml de uridina y 1,2 mg/ml de FOA. Aparecieron colonias espontáneas resistentes a FOA en tres o cuatro días. Posteriormente se identificaron los mutantes resistentes a FOA que requerían uridina para el crecimiento. Con el fin de identificar aquellos mutantes que presentaban específicamente un gen pyr4 defectuoso se generaron protoplastos y se transformaron con un plásmido que contenía un gen pyr 4 de tipo salvaje. (Smith, J.L., Bayliss, F.T. y Ward, M. (1991) Curr. Genet. 19:27-33). Tras la transformación, se emplacaron protoplastos en un medio que carecía de uridina. El posterior crecimiento de colonias transformadas demostró la complementación de un gen pyr4 defectuoso por el gen pyr4 que porta el plásmido. De esta manera, se identificó la cepa GC69 como un mutante en pyr4 de la cepa RL-P37

2) Construcción de un plásmido diseñado para eliminar el gen que codifica CBHI

El gen cbh1, que codifica la proteína CBHI, se clonó a partir del ADN genómico de la cepa RL-P37 mediante hibridación con una sonda de oligonucleótidos diseñada en base a la secuencia publicada para este gen (Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., Myambo, K. y Innis, M. (1983) Biotechnology 1:691-696). El gen cbh1 reside en un fragmento PstI de 6,5 kb y se insertó en el sitio PsfI de pUC4K (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA) sustituyendo el gen de resistencia a kanamicina de este vector. El plásmido resultante pUC4K::cbh1 se cortó a continuación con HindIII y se aisló el fragmento más grande y se volvió a unir para producir pUC4K::cbh1LH/H. Este procedimiento extrajo la secuencia codificante de cbh1 completa y aproximadamente 1,2 kb de las secuencia flanqueante 5’ y 1,5 kb de la secuencia flanqueante 3’. Permaneció aproximadamente 1 kb del ADN flanqueante de cualquiera de los extremos del fragmento PstI original.

El gen pyr4 de T. reesei se clonó como un fragmento Hindlll de 6,5 kb de ADN genómico en pUC18 para formar pTpyr2 (Smith, J.L., Bayliss, F.T. y Ward, M. (1991) Curr. Genet. 19:27-33). El plásmido pUC4K::cbh1LH/H se cortó con HindIII y los extremos se desfosforilaron con fosfatasa alcalina intestinal de ternera. Este ADN se unió con el fragmento Hindlll de 6,5 kb que contenía el gen pyr4 para producir pLCBHIpyr4.

La digestión de pLCBHIpyr4 con EcoRI liberó un fragmento más grande que consistía en regiones flanqueantes del locus de cbh1 en cualquier extremo con el gen pyr4 sustituyendo la secuencia codificante de cbh1 en el centro. El único ADN en este fragmento que no derivaba de T. reesei era un fragmento de 21 pb derivado del sitio de clonación múltiple de pUC4K.

3) Eliminación del gen cbh1 de T. reesei.

Los protoplastos de micelio de la cepa GC69 se transformaron con el plásmido pLCBHIpyr4 digerido con EcoRI utilizando los métodos indicados Smith et al., 1991. Se obtuvieron transformantes estables y se identificaron aquellos a los que se había eliminado el gen cbh1 tal como se describe a continuación.

El ADN total se aisló de los transformantes, se digirió con PstI, se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se transfirió a un filtro de membrana. A continuación, el filtro se hibridó con pLCBHIpyr4 marcado con 32P y se observó el patrón de hibridación mediante autorradiografía. Esta sonda se hibridó con los genes cbh1 y pyr4 nativos en una cepa no transformada. En un transformante (cepa P37PLCBHI), se observó un patrón de hibridación que se hubiera previsto si hubiera tenido lugar una integración por doble entrecruzamiento. Es decir, el gen cbh1 se había eliminado mediante la integración de una única copia del fragmento EcoRI más grande obtenido de pLCBHIpyr4 en el locus cbh1 de la cepa RL-P37.

También se realizó un análisis Southern como antes a excepción que la sonda utilizada fue pIntCBHI radiomarcada. Este plásmido consiste en un vector pUC que contiene un fragmento BglII de 2 kb del locus cbh1 en la región que se eliminó en pUC4K::cbh1LH/H. Este plásmido se hibridó al locus cbh1 de la cepa GC69, pero no se hibridó al ADN de la cepa P37PLCBHI. Esto confirma que el gen cbh1 se había eliminado y que el fragmento de ADN pUC de pLCBHIpyr4 no había sido incorporado por la cepa eliminada.

El análisis de las proteínas secretadas mediante separación en geles por enfoque isoeléctrico mostró que la proteína CBHI no era producida por la cepa P37PLCBHI.

4) Generación de un mutante nulo en pyr4 de P37PLCBHI.

Se extendieron esporas del transformante (P37PLCBHI) el cual fue eliminado para el gen cbh1 sobre un medio que contenía FOA. Posteriormente se obtuvo un derivado de este transformante deficiente en pyr4 utilizando los métodos descritos en la sección 1 anterior. La cepa deficiente en pyr4 se designó como P37PLCBHIPyr-26. El análisis southern mostró que había tenido lugar una deleción espontánea cuando se seleccionó la cepa P37PLCBHIPyr-26. Esta deleción eliminaba completamente el gen pyr4 que se había integrado en el locus cbh1 en la cepa P37PLCBHI, así como el ADN flanqueante del locus cbh1 más allá de la extensión del fragmento PstI de 6,5 kb del ADN genómico que se clonó originalmente.

5) Construcción de un vector diseñado para eliminar el gen cbh2

El gen cbh2 de T reesei, que codifica la proteína CBHII, se clonó como un fragmento EcoRI de 4,1 kb de ADN genómico (Chen et al., 1987, Biotechnology 5:274-278). Este fragmento de 4,1 kb se insertó entre los sitios EcoRI de pUC4XL. Este último plásmido es un derivado de pUC (construido por R. M. Berka, Genencor International Inc.) que contiene un sitio de clonación múltiple con un patrón simétrico de sitios para endonucleasas de restricción dispuestos en el orden que se muestra aquí. EcoRI, BamHI, SacI, SmaI, HindIII, XhoI, BglII, ClaI, Bg/II, XhoI, HindIII, SmaI, SacI, BamHI, EcoRI. Se construyó el plásmido pPLCBHII, en donde se ha eliminado una región central de 1,7 kb de este clon cbh2, entre un sitio HindIII (a 74 pb en 3’ del sitio de inició de la traducción de CBHII) y un sitio ClaI (a 265 pb en 3’ del último codón de CBHII), y se ha sustituido por un fragmento de ADN HindIII-ClaI de 1,6 kb que contiene el gen pyr4 de T. reesei obtenido de la siguiente manera. El gen pyr4 de T. reesei se escindió de pTpyr2 en un fragmento NheI-SphI de 1,6 kb y se insertó entre los sitios SphI y XbaI de pUC219 (derivado de pUC119 mediante la expansión del sitio de clonación múltiple para incluir los sitios de restricción para BglII, ClaI y XhoI; Wilson et al., 1989, Gene 77:69-78) para crear p219M (Smith et al., 1991, Curr. Genet. 19:27-33). A continuación, el gen pyr4 se pudo extraer como un fragmento HindIII-ClaI que tiene siete pb de ADN en un extremo y seis pb de ADN en el otro extremo derivado del sitio de clonación múltiple de pUC219 y se insertó en los sitios HindIII y ClaI del gen cbh2 para formar el plásmido pPLCBHII

La digestión de este plásmido con EcoRI liberó un fragmento que tenía 0,7 kb de ADN flanqueante del locus cbh2 en un extremo, 1,7 kb del ADN flanqueante del locus cbh2 en el otro extremo y el gen pyr4 de T. reesei en el centro. El único ADN en este fragmento que no derivaba de T. reesei eran los fragmentos de 6 pb y 7 pb del sitio de clonación múltiple de pUC219 en cualquiera de los extremos del gen pyr4.

6) Deleción del gen cbh2 de la cepa P37PLCBHIPyr-26.

Los protoplastos de la cepa P37PLCBHIPyr-26 se generaron y se transformaron con pPLCBHII digeridos con EcoRI según los métodos descritos en 3 anterior. Los transformantes estables se cultivaron en matraces de agitación y se examinó la proteína en los sobrenadantes de cultivo mediante enfoque isoeléctrico. Se identificó un transformante (designado como P37PLLCBH67) que no producía ninguna proteína CBHII (ni CBHI).

Se extrajo ADN de la cepa P37PLLCBH67, se digirió con EcoRI y Asp718 y se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El ADN de este gel se transfirió a un filtro de membrana y se hibridó con pPLCBHI marcado con 32P. El fragmento EcoRI de 4,1 kb que contenía el gen cbh2 de tipo salvaje se observó en el ADN de una cepa de control no transformada. En cambio, en la cepa P37PLLCBH67 se eliminó la única banda de 4,1 kb y se sustituyó por dosbandas de aproximadamente 0,9 y 3,1 kb. Éste es el patrón esperado si una copia única del fragmento EcoRI más amplio de pPLCBHI se hubiera integrado de manera precisa en el locus cbh2 y se hubiera eliminado el gen cbh2.

Las mismas muestras de ADN se digirieron también con EcoRI y se realizó un análisis Southern al igual que antes. En este ejemplo, la sonda era plntCBHII marcada con 32P. Este plásmido contiene una parte de la secuencia codificante del gen cbh2 de la que el segmento del ADN de cbh2 se había eliminado en el plásmido pPLCBHII. No se observó hibridación con el ADN de la cepa P37PACBH67 confirmando que se eliminó el gen cbh2 y que el fragmento de plásmido pUC de pPLCBHII no había sido incorporado por esta cepa

7) Selección de un mutante nulo en pyr4 de la cepa P37PLLCBH67.

Se extendieron esporas del transformante (P37PLLCBH67) al que se habían eliminado los genes cbh1 y cbh2 en un medio que contenía FOA. Posteriormente se obtuvo un derivado de este transformante deficiente en pyr4 utilizando los métodos descritos en la sección 1 anterior. Esta cepa deficiente en pyr4 se designó como P37PLLCBH67Pr-1. El análisis southern mostró que había tenido lugar una deleción espontánea cuando se seleccionó la cepa P37PLLCBH67Pr-1. Esta deleción eliminaba completamente el gen pyr4 que se había integrado en el locus cbh2 en la cepa P37PLLCBH67, así como el ADN flanqueante del locus cbh2 más allá de la extensión del fragmento EcoRI de 4,1 kb del ADN genómico que se clonó originalmente. Los fragmentos cortos (6 pb y 7 pb) de ADN derivado del sitio de clonación múltiple pUC219 que estaban presentes en cualquier extremo del gen pyr4 también se habrían eliminado del genoma mediante esta deleción.

8) Construcción de un plásmido diseñado para alterar el gen egl2.

Se clonó el gen egl2, que codificaba EGII (previamente referido como EGIII por algunos autores), a partir de T. reesei y la secuencia de ADN publicada (Saloheimo et al., 1988, Gene 63:11-21). Se obtuvo el gen de la cepa RL-P37 como un fragmento Pstl-XhoI de aproximadamente 4 kb del ADN genómico insertado entre los sitios PsfI y XhoI de pUC219. El gen pyr4 de T. reesei, presente en un fragmento SalI de 2,7 kb de ADN genómico obtenido de pTpyr2, se insertó en un sitio SalI en la secuencia codificante de EGII para crear el plásmido pEGII::P-1. Esto dio lugar a alteración de la secuencia codificante de EGII, pero sin eliminar ninguna de las secuencias. El plásmido pEGII::P-1 se puede digerir con HindIII y BamHI para producir un fragmento lineal de ADN derivado exclusivamente de T. reesei a excepción de 5 pb en un extremo y 16 pb en el otro extremo, ambos derivados del sitio de clonación múltiple de pUC219.

9) Alteración del gen egl2 de la cepa P37PLCBH67Pyr-1.

La cepa P37PLLCBH67Pyr-1 se transformó con pEGII::P-1 que se había digerido previamente con HindIII y BamHI y se seleccionaron transformantes estables. Se aisló el ADN total de los transformantes y se utilizó un análisis Southern para identificar cepas en las que se había integrado el fragmento del ADN plasmídico que contenía los genes pyr4 y egl2 en el locus egl2 y consecuentemente se había alterado la secuencia codificante de EGII. Se realizó el análisis southern utilizando como sonda un fragmento Pst1 de aproximadamente 4 kb de ADN de T. reesei que contenía el gen egl2. Cuando se digirió el ADN aislado de la cepa P37PLL67P-1 con PstI para el análisis Southern, el locus egl2 se visualizó posteriormente como una única banda de 4 kb en la autorradiografía. Sin embargo, para un transformante alterado para el gen egl2, esta banda se perdió y se sustituyó por dos nuevas bandas tal como se esperaba. Cuando se digirió el ADN con BglII o EcoRV, el tamaño de la banda correspondiente al gen egl2 aumentó en aproximadamente 2,7 kb (el tamaño del fragmento pyr4 insertado) entre la cepa P37PLL67P-1 no transformada y el transformante alterado para egl2. Éste último transformante, ahora con los genes cbh1, cbh2, y egl2 eliminados, se designó como cepa B31. Un análisis southern adicional confirmó que el fragmento de ADN pUC de pEGII::P-1 no se incorporó en esta cepa.

10) Selección de un mutante nulo en pyr4 de la cepa B31

Se extendieron esporas del transformante (B31) al que se habían eliminado los genes cbh1, cbh2 y egl2 en un medio que contenía FOA. Posteriormente se obtuvo un derivado de este transformante deficiente en pyr4 utilizando los métodos descritos en la sección 1 anterior. Esta cepa deficiente en pyr4 se designó como B31 P6. El análisis southern mostró que había tenido lugar una deleción espontánea cuando se seleccionó la cepa B31 P6. Esta deleción eliminaba la mayoría del gen pyr4 que se había integrado en el locus egl2 en la cepa B31, pero no se extendió en el ADN flanqueante del locus egl2.

11) Construcción de un plásmido diseñado para eliminar el gel eal1

El gen egl1 de T. reesei se ha clonado y la secuencia de AND del gen se ha publicado (Penttila et al., 1986, Gene 45:253-263; van Arsdell et al., 1987, Bio/technology 5:60-64). Se obtuvo este gen de la cepa RL-P37 de T. reesei como un fragmento HindIII de 4,2 kb de ADN genómico insertado en el sitio HindIII de pUC100 (un derivado de pUC18 con un oligonucleótido insertado en el sitio de clonación múltiple que añade sitios de restricción para BglII, ClaI y XhoI) para producir pUCEGI. Se extrajo un fragmento EcoRV de aproximadamente 1 kb que se extiende desde una posición próxima al dentro de la secuencia codificante de EGI hasta una posición más allá del extremo 3’ de la secuencia codificante y se sustituyó por un fragmento Scal de 3,5 kb de ADN de T. reesei que contiene el gen pyr4 obtenido de pTpyr2. El plásmido resultante se denominó pPLEGI.

El plásmido, pPLEGI, se pudo digerir con HindIII para liberar un fragmento de ADN que comprendía sólo ADN genómico de T. reesei que tenía un segmento del gen egl1 en cualquier extremo y el gen pyr4, sustituyendo parte de la secuencia codificante de EGI, en el centro.

12) Deleción del gen egl1 en la cepa B31P6

Se construyeron dos formas de pPLEG1 que diferían sólo en la orientación del gen pyr4 con respecto alas regiones flanqueantes de egl1. La cepa B31 P6 se transformó con una mezcla de ambas formas del plásmido después de haberse digerido con HindIII. Se extrajo el ADN total de los transformantes estables, se digirieron con HindIII y se sometieron a análisis Southern. La sonda utilizada fue pUCEGI radiomarcada. Se observó hibridación a un fragmento de ADN de 4,2 kb de la cepa B31 P6 que representa el gen egl1 no eliminado. Se identificó un transformante (cepa 1A52) en el que este fragmento de 4,2 kb ya no esta presente porque se había sustituido por unfragmento de aproximadamente 6,8 kb. Éste es el patrón esperado si el fragmento HindIII más grande de PPAEGI se hubiera integrado de manera precisa tal como se predijo en el locus egl1 conduciendo a la deleción de parte de la secuencia codificante de EGI y la inserción de pyr4 en esta posición. Utilizando un plásmido pUC como sonda para el análisis Southern se confirmó que el fragmento de ADN pUC de pPLEGI no se había incorporado en la cepa 1A52.

Ejemplo 6

Construcción del vector de expresión pTrex3g

Este ejemplo describe la construcción del vector básico para expresar los genes de interés.

Este vector se basa en el vector de E. coli pSL1180 (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA) que es un vector basado en el fagémido pUC118 (Brosius, J. (1989) DNA 8:759) con un sitio de clonación múltiple extendido que contiene secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de 64 hexámeros. Se diseñó como vector de destino Gateway (Hartley, J.L., Temple, G.F. y Brasch, M.A. (2000) Genome Research 10:1788-1795) para permitir la inserción utilizando tecnología Gateway (Invitrogen) de cualquier marco de lectura abierto deseado entre las regiones del promotor y el terminador del gen cbh1 T. reesei. También contiene el gen de Aspergillus nidulans amdS para su uso como marcador seleccionable en la transformación de T. reesei.

Los detalles de pTrex3g son los siguientes (véase la figura 17). El vector tiene 10,3 kb de tamaño. En la región polienlazadora de pSL1180 se encuentran insertados los siguientes fragmentos de ADN:

1.

Un segmento de ADN de 2,2 pb de la región de promotor del gen cbh1 de T. reesei.

2.

El cassette del marco de lectura A de Gateway de 1,7 kb adquirido de Invitrogen que incluye la recombinación de los sitios attR1 y attR2 en cualquier extremo que flanquea el gen de resistencia a cloramfenicol (CmR) y el gen ccdB.

3.

Un segmento de ADN de 336 pb de la región de terminador del gen cbh1 de T. reesei.

4.

Un fragmento de ADN de 2,7 kb que contiene el gen de Aspergillus nidulans amdS con sus regiones de promotor y terminador nativas.

Ejemplo comparativo 7

Inserción de la región codificante de cip1 en pTrex3g

Este ejemplo describe la construcción del vector de expresión para cip1.

El marco de lectura abierto de cip1 se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando ADN genómico purificado de la cepa QM6A de Trichoderma reesei (ATCC 13631) como molde. La máquina de PCR utilizada fue un Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research). La ADN polimerasa utilizada en la PCR fue la Herculasa (Stratagene). Los cebadores utilizados para amplificar el gen cip1 fueron el cebador 170 (directo) 5’-CACCATGGTTCGCCGGACTGCTCTG-3’, y el cebador 171 (inverso) 5’-TTATAAGCACTGGGAGTAGTATGG-3’. El cebador directo contenía cuatro nucleótidos adicionales (secuencia - CACC) en el extremo 5’ que no correspondían con el gen cip1, pero eran necesarios para la clonación en el vector pENTR/DTOPO. Las condiciones PCR para amplificar el marco de lectura abierto de cip1 fueron las siguientes: Etapa 1: 94C durante 2 min. Etapa 2: 94 C durante 30 s. Etapa 3: 58C durante 30 s. Etapa 4: 72C durante 35 s. Las etapas 2, 3 y 4 se repitieron durante 21 ciclos adicionales. Etapa 5: 72C durante 5 min.

El producto PCR se purificó utilizando un Kit de Purificación de PCR Qiaquick (Qiagen). El producto PCR purificado se clonó inicialmente en el vector pENTR/D-TOPO (Invitrogen, Fig. 18), se transformó en las células de E. coli químicamente competentes TOP10 (Invitrogen) y se emplacaron en placas LA con 50 ppm de kanamicina. El ADN plasmídico se obtuvo de los transformantes de E. coli utilizando un kit de preparación de plásmidos QlAspin (Qlagen). Se obtuvieron datos de la secuencia para el ADN insertado en el vector pENTR/D-TOPO utilizando los cebadores directo e inverso M13. Se recombinó un vector pENTR/D-TOPO con la secuencia de ADN correcta insertada con el vector pTrex3g utilizando LRclonasa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El producto de la reacción con LR clonasa se transformó posteriormente en células de E. coli químicamente competentes TOP10 que a continuación se emplacaron en LA que contenía 50 ppm de carbenicilina. La construcción pExpression resultante (Figura 19) fue pTrex3g que contenía el gen cip1 que resultaba de la recombinación entre los sitios attR1 y attR2 de pTrex3g y los sitios attL1 y attL2 de pENTR/D-TOPO. El ADN de la construcción pExpression que contenía el marco de lectura abierto de cip1 se aisló utilizando un kit de minipreparación Qiagen para la transformación biolística de esporas de Trichoderma reesei.

Ejemplo comparativo 8

Inserción de la región codificante cip2 de pTrex3g

Este ejemplo describe la construcción del vector de expresión para cip2.

El marco de lectura abierto de cip2 se amplificó mediante PCR utilizando ADN genómico purificado de la cepa QM6A de Trichoderma reesei como molde. La máquina de PCR utilizada fue un Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research). La ADN polimerasa utilizada en la PCR fue la Herculasa (Stratagene). Los cebadores utilizados para amplificar el gen cip2 fueron el cebador 230 (directo) 5’-CACCATGGCTTCCCGCTTCTTTG-3’, y el cebador 231 (inverso) 5’-TCAACTCAGCGTTGGGGTTG-3’. El cebador directo contenía cuatro nucleótidos adicionales (secuencia

-

CACC) en el extremo 5’ que no correspondían con el gen cip2, pero eran necesarios para la clonación en el vector pENTR/DTOPO. Las condiciones PCR para amplificar el marco de lectura abierto de cip2 fueron las siguientes: Etapa 1: 94C durante 2 min. Etapa 2: 94 C durante 30 s. Etapa 3: 56C durante 30 s. Etapa 4: 72C durante 1 min 15

s.

Las etapas 2, 3 y 4 se repitieron durante 21 ciclos adicionales. Etapa 5: 72C durante 5 min.

El producto PCR se purificó utilizando un Kit de Purificación de PCR Qiaquick (Qiagen). El producto PCR purificado se clonó inicialmente en el vector pENTR/D-TOPO (Invitrogen, Fig. 18), se transformó en las células de E. coli químicamente competentes TOP10 (Invitrogen) y se emplacaron en placas LA con 50 ppm de kanamicina. El ADN plasmídico se obtuvo de los transformantes de E. coli utilizando un kit de preparación de plásmidos QlAspin (Qlagen). Se obtuvieron datos de la secuencia para el ADN insertado en el vector pENTR/D-TOPO utilizando los cebadores directo e inverso M13. Se recombinó un vector pENTR/D-TOPO con la secuencia de ADN correcta insertada con el vector pTrex3g utilizando LRclonasa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El producto de la reacción con LR clonasa se transformó posteriormente en células de E. coli químicamente competentes TOP10 que a continuación se emplacaron en LA que contenía 50 ppm de carbenicilina. La construcción pExpression resultante (Figura 19) fue pTrex3g que contenía el gen cip2 que resultaba de la recombinación entre los sitios attR1 y attR2 de pTrex3g y los sitios attL1 y attL2 de pENTR/D-TOPO. El ADN de la construcción pExpression que contenía el marco de lectura abierto de cip2 se aisló utilizando un kit de minipreparación Qiagen para la transformación biolística de esporas de Trichoderma reesei.

Ejemplo Comparativo 9

Inserción de la región codificante cip2 de pTrex3g

Este ejemplo describe la construcción del vector de expresión para abf2.

El marco de lectura abierto de abf2 se amplificó mediante PCR utilizando ADN genómico purificado de la cepa QM6A de Trichoderma reesei como molde. La máquina de PCR utilizada fue un Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research). La ADN polimerasa utilizada fue Pfu Turbo cx Hotstart (Stratagene). Los cebadores utilizados para amplificar el gen abf2 fueron NSP071 (directo) 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGAGCTTAAAGCACTCAGTGCCG -3’, y NSP072 (inverso) 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTT CAGCGCTGGAGAGTTAGCAGC -3’. Los cebadores directo e inverso contenían 29 nucleótidos en el extremo 5’ que no correspondían con el gen abf2, pero representaban el sitio attB1 necesario para la clonación en el vector pDONR201 (Invitrogen). Las condiciones PCR para amplificar el marco de lectura abierto de abf2 fueron las siguientes: Etapa 1: 95C durante 2 min. Etapa 2: 95 C durante 30 s. Etapa 3: 68C durante 30 s. Etapa 4: 72C durante 3 min. Las etapas 2, 3 y 4 se repitieron durante 29 ciclos adicionales. Etapa 5: 72C durante 1 min.

El producto PCR se clonó en el vector pDONR201 a través de la reacción con BP clonasa utilizando el kit de clonación de PCR con tecnología Gateway® (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron datos de la secuencia para el ADN insertado en el vector pDONR201 utilizando los cebadores directo e inverso M13. Se recombinó un vector pDONR201 con la secuencia de ADN correcta insertada con el vector pTrex3g utilizando LRclonasa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El producto de la reacción con LR clonasa se transformó posteriormente en células de E. coli químicamente competentes TOP10 que a continuación se emplacaron en LA que contenía 50 ppm de carbenicilina. La construcción pExpression resultante (Figura 8) fue pTrex3g que contenía el gen abf2 que resultaba de la recombinación entre los sitios attR1 y attR2 de pTrex3g y los sitios attL1 y attL2 de pDONR201. El ADN de la construcción pExpression que contenía el marco de lectura abierto de abf2 se aisló utilizando un kit de minipreparación Qiagen para la transformación biolística de esporas de Trichoderma reesei.

Ejemplo 10

Inserción de la región codificante axe2 de pTrex3g

Este ejemplo describe la construcción del vector de expresión para axe2.

El marco de lectura abierto de axe2 se amplificó mediante PCR utilizando ADN genómico purificado de la cepa QM6A de Trichoderma reesei como molde. La máquina de PCR utilizada fue un Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research). La ADN polimerasa utilizada fue Pfu Turbo cx Hotstart (Stratagene). Los cebadores utilizados para

amplificar

el gen axe2 fueron NSP111 (directo) 5’-

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGCGCGCCCTCTCACT

CTCC -3’, y NSP112 (inverso) 5’-

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACAG

CATCTGAGACACCGCC -3’. Los cebadores directo e inverso contenían 29 nucleótidos en el extremo 5’ que no correspondían con el gen axe2, pero representaban el sitio attB1 necesario para la clonación en el vector pDONR201 (Invitrogen). Las condiciones PCR para amplificar el marco de lectura abierto de abf2 fueron las siguientes: Etapa 1: 95C durante 2 min. Etapa 2: 95 C durante 30 s. Etapa 3: 68C durante 30 s. Etapa 4: 72C durante 3 min. Las etapas 2, 3 y 4 se repitieron durante 29 ciclos adicionales. Etapa 5: 72C durante 1 min.

El producto PCR se clonó en el vector pDONR201 a través de la reacción con BP clonasa utilizando el kit de clonación de PCR con tecnología Gateway® (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron datos de la secuencia para el ADN insertado en el vector pDONR201 utilizando los cebadores directo e inverso M13. Se recombinó un vector pDONR201 con la secuencia de ADN correcta insertada con el vector pTrex3g utilizando LRclonasa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El producto de la reacción con LR clonasa se transformó posteriormente en células de E. coli químicamente competentes TOP10 que a continuación se emplacaron en LA que contenía 50 ppm de carbenicilina. La construcción pExpression resultante (Figura 19) fue pTrex3g que contenía el gen axe2 que resultaba de la recombinación entre los sitios attR1 y attR2 de pTrex3g y los sitios attL1 y attL2 de pDONR201.

Ejemplo 11

Transformación de una cepa de T.reesei con quad eliminado

Este ejemplo describe la transformación de una cepa de Trichoderma con una construcción de expresión. Se realizó una transformación biolística de T.reesei con los vectores de expresión pTrex3g con marcos de lectura abiertos de cip1, cip2 o abf2 (construcciones de pExpression) utilizando el protocolo resumido más adelante.

Se preparó una suspensión de esporas (aproximadamente 5x108 esporas/ml) a partir de una cepa con quad eliminado de T. reesei. Se extendieron 100 !l – 200 !l de suspensión de esporas en el centro de las placas de medio acetamida MM. El medio de acetamida MM presentaba la siguiente composición: acetamida 0,6 g/L; CsCl 1,68 g/L; glucosa 20 g/L; KH2PO4 20 g/L; CaCl2·2H2O 0,6 g/L; solución de 1000X elementos traza 1 ml/L; agar Noble 20 g/L; pH 5,5. La solución de 1000X elementos traza contenía FeSO4·7H2O 5,0 g/l, MnSO4·H2O 1,6 g/l, ZnSO4·7H2O 1,4 g/l y 1,0 g/l COCl2·6H2O. Se dejó secar la suspensión de esporas en la superficie del medio de acetamida MM.

Se realizó la transformación de T. reesei mediante biolística utilizando un Sistema de Liberación de Partículas PDS1000/He Biolistic® de Bio-Rad (Hercules, CA) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Brevemente, se colocaron 60 mg de partículas de tungsteno M10 en un tubo de microcentrífuga. Se añadió 1 mL de etanol y se dejó reposar durante 15 minutos. Se centrifugaron las partículas a 15.000 rpm durante 15 segundos. Se extrajo el etanol y se lavaron las partículas tres veces con dH2O estéril antes de añadir 1 mL de glicerol estéril al 50% (v/v). Se colocaron 25 !l de suspensión de partículas de tungsteno en un tubo de microcentrífuga. Mientras se agitaba vigorosamente de forma continua, se añadió lo siguiente; 0,5-5 !l (100-200 ng/!l) de ADN plasmídico, 25 !l de CaCl2 2,5M y 10 !l de espermidina 0.1M. Se centrifugaron las partículas durante 3 segundos. Se extrajo el sobrenadante, se lavaron las partículas con 200 !l de etanol al 70% (v/v) y se centrifugaron durante 3 segundos. Se extrajo el sobrenadante, se lavaron las partículas con 200 !l de etanol al 100% y se centrifugaron durante 3 segundos. Se extrajo el sobrenadante y se añadieron 24 !l de etanol al 100%, se mezcló mediante pipeteo, y se colocó el tubo en un baño de lavado ultrasónico durante aproximadamente 15 segundos. Mientras el tubo estaba en el baño ultrasónico, se extrajeron alícuotas de 8 !l de partículas y se colocaron en el centro del disco microportador sostenido en un desecador. Una vez se hubo secado la solución de tungsteno/ADN, se colocó el disco microportador en la cámara de bombardeo junto con la placa de acetamida MM con esporas y se realizó el proceso de bombardeo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Después del bombardeo de las esporas emplacadas con las partículas de tungsteno/ADN, las placas se colocaron y se incubaron a 28ºC. Se pasaron las colonias transformadas a placas nuevas de acetamida MM después de 4 días.

Después de 5 días de crecimiento en placas de acetamida MM se inocularon transformantes que mostraban una morfología estable en matraces de 250 ml con agitación que contenían 30 ml de medio Proflo. El medio Proflo contiene: a-lactosa 30 g/L; (NH4)2SO4 6,5 g/L; KH2PO4 2g/L; MgSO4·7H2O 0,3 g/L; CaCl2 0,2g/L; solución de sales con 1000X elementos traza 1 ml/L; Tween 80 al 10% 2 ml/L; harina de semilla de algodón Proflo 22,5g/L (Traders Protein, Memphis, TN); CaCO3 0,72g/L. Después de dos días de crecimiento a 28ºC y 140 rpm, se transfirió un 10% del cultivo Proflo a un matraz de 250 ml con agitación que contenía 30 ml de Medios Definidos de Lactosa. La composición del Medio Definido de Lactosa fue la siguiente: (NH4)2SO4 5g/L; tampón PIPPS 33g/L; casaminoácidos 9g/L; KH2PO4 4,5 g/L; MgSO4·7H2O 1g/L; antiespuma Mazu DF60-P 5 ml/L (Mazur Chemicals, Gurnee, IL); solución de 1000X elementos traza 1 ml/L; pH 5,5. Se añadió 40 ml/L de una solución de lactosa al 40% (p/v) al medio tras la esterilización. Se incubaron matraces con agitación de medio Definido de Lactosa a 28ºC, 140 rpm durante 4-5 días. Se mezclaron muestras de sobrenadante de cultivo con un volumen apropiado de 2X tampón de carga de muestra con agente reductor y se sometieron a electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico - poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando geles premoldeados según las instrucciones de los fabricantes (el Sistema de Electroforesis Bis-Tris de NuPAGE de Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA. Se utilizaron geles Bis-Tris al 10% de NuPAGE o Bis-Tris al 412% de NuPAGE con tampón MOPS. Se utilizaron tampón de muestra LDS de NuPAGE y agente reductor NuPAGE.). Se tiñeron los geles para las proteínas con colorante Azul de Coomassie Brillante.

En un análisis SDS-PAGE, una banda de proteína que no se observó en el sobrenadante de una cepa con quad eliminado, sí se observó en el sobrenadante de algunos transformantes con el vector pTrex3g que contenían el marco de lectura abierto de cip1 (Fig. 20). Esta nueva banda de proteína tenía una masa molecular aparente deaproximadamente 50 kDa. Ésta es algo más elevada que el tamaño de 33 kDa previsto a partir de la secuencia genética. La discrepancia se podía justificar por la adición después de la traducción de la glicosilación. Además, se sabe que algunas proteínas no migran según su tamaño en el SDS-PAGE (Saloheimo et al., 1997). Este resultado confirma que Cip1 es una proteína secretada.

En un análisis SDS-PAGE, una banda de proteína que no se observó en el sobrenadante de una cepa con quad eliminado, sí se observó en el sobrenadante de algunos transformantes con el vector pTrex3g que contenían el marco de lectura abierto de cip2 (Fig. 21). Esta nueva banda de proteína tenía una masa molecular aparente deaproximadamente 56 kDa. Ésta es algo más elevada que el tamaño de 48 kDa previsto a partir de la secuencia genética. La discrepancia se podía justificar por la adición después de la traducción de la glicosilación. Además, se sabe que algunas proteínas no migran según su tamaño en el SDS-PAGE (Saloheimo et al., 1997). Este resultado confirma que Cip2 es una proteína secretada.

En un análisis SDS-PAGE, una banda de proteína que no se observó en el sobrenadante de una cepa con quad eliminado, sí se observó en el sobrenadante de algunos transformantes con el vector pTrex3g que contenían el marco de lectura abierto de abf2 (Fig. 22). Esta nueva banda de proteína tenía una masa molecular aparente muy próxima a los 35 kDa previstos a partir de la secuencia genética. Este resultado confirma que Abf2 es una proteína secretada.

Ejemplo comparativo 12

Purificación de la proteína Cip1 y ensayos de actividad

Se purificó la proteína Cip1 del sobrenadante de cultivo utilizando un equipo de trabajo de cromatografía BioCAD Sprint (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA) mediante el protocolo siguiente. Se equilibró una columna Poros 20 HP2 10 que era de una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica de Perseptive Biosystems (Cambridge, MA) con 5 volúmenes de columna de (NH4)2SO4 0,5 M/NaH2PO4 0,02M, pH 6,80. Se determinó la concentración de proteína total en la muestra de sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Hercules, CA) según las instrucciones de los fabricantes y se aplicó a la columna un 20% de la capacidad de la columna (20 mg/ml). Se lavó la columna con 10 volúmenes de columna de (NH4)2SO4 0,5 M/NaH2PO4 0,02M, pH 6,80. Se eluyó la proteína Cip1 con 5 volúmenes de columna de NaH2PO4 0,02M, pH 6,80. En este punto, Cip1 era aproximadamente un 70% pura. Se concentró el eluato hasta 13 ml mediante ultrafiltración utilizando unidades de filtración centrífuga con un límite de peso molecular nominal de 5.000 (Biomax 5K; Millipore, Bedford MA). Se equilibró una columna de filtración en gel (Superdex 75, Amersham Biosciences) con dos volúmenes de columna de NaH2PO4 0,02M, pH 6,80 y se aplicó el eluato concentrado de la columna anterior. Se recogieron fracciones y se analizaron por el peso molecular de las proteínas mediante SDS-PAGE y por la actividad contra p-nitrofenil-�-D-celobiósido (p-NPC). En este punto la proteína Cip1 era pura en más de un 95% .

Para ensayos de p-NPC se mezclaron 20 !l de p-NPC (7,5 mg/ml) con 10 !l de muestra y 100 !l de acetato sódico 20 mM, pH 5,0. Después de la incubación a 50ºC durante 30 minutos se paró la reacción mediante la adición de 100 !l de glicina 100 mM, pH 10. Se midió la densidad óptica a una longitud de onda de 405 nm. Aunque no se determinó una actividad específica era obvio que Cip1 tenía actividad contra p-NPC. En un experimento, la reacción de base sin enzima añadida produjo una DO405 de 0,071, mientras que con Cip1 la DO405 fue de 0,121. Esto demuestra que la proteína Cip1 tiene cierta actividad en un sustrato utilizado habitualmente para medir la actividad de celulasas (tanto endoglucanasas como celobiohidrolasas).

Aunque se ha descrito la invención anterior con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad y comprensión, será obvio que pueden realizarse ciertos cambios y modificaciones en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> GENENCOR INTERNATIONAL, INC.

<120> Nuevos genes de Trichoderma

<130> GRF/FP6343537

<140> 04753666.9

<141> 2004-05-28

<150> US 60/475,826

<151> 2003-06-03

<150> US 60/474,411

<151> 2003-05-29

<160> 59

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 1221

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 1

gactagttca taatacagta gttgagttca tagcaacttc actctctagc tgaacaaatt 60 atctgcgcaa acatggttcg ccggactgct ctgctggccc ttggggctct ctcaacgctc 120 tctatggccc aaatctcaga cgacttcgag tcgggctggg atcagactaa atggcccatt 180 tcggcaccag actgtaacca gggcggcacc gtcagcctcg acaccacagt agcccacagc 240 ggcagcaact ccatgaaggt cgttggtggc cccaatggct actgtggaca catcttcttc 300 ggcactaccc aggtgccaac tggggatgta tatgtcagag cttggattcg gcttcagact 360 gctctcggca gcaaccacgt cacattcatc atcatgccag acaccgctca gggagggaag 420 cacctccgaa ttggtggcca aagccaagtt ctcgactaca accgcgagtc cgacgatgcc 480 actcttccgg acctgtctcc caacggcatt gcctccaccg tcactctgcc taccggcgcg 540 ttccagtgct tcgagtacca cctgggcact gacggaacca tcgagacgtg gctcaacggc 600 agcctcatcc cgggcatgac cgtgggccct ggcgtcgaca atccaaacga cgctggctgg 660 acgagggcca gctatattcc ggagatcacc ggtgtcaact ttggctggga ggcctacagc 720 ggagacgtca acaccgtctg gttcgacgac atctcgattg cgtcgacccg cgtgggatgc 780 ggccccggca gccccggcgg tcctggaagc tcgacgactg ggcgtagcag cacctcgggc 840 ccgacgagca cttcgaggcc aagcaccacc attccgccac cgacttccag gacaacgacc 900 gccacgggtc cgactcagac acactatggc cagtgcggag ggattggtta cagcgggcct 960 acggtctgcg cgagcggcac gacctgccag gtcctgaacc catactactc ccagtgctta 1020 taaggggatg agcatggagt gaagtgaagt gaagtggaga gagttgaagt ggcattgcgc 1080 tgggctgggt agataaaagt cagcagctat gaatactcta tgtgatgctc attggcgtgt 1140 acgttttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaag ggggcggccg c 1221

<210> 2

<211> 951

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 2

atggttcgcc ggactgctct gctggccctt ggggctctct caacgctctc tatggcccaa 60 atctcagacg acttcgagtc gggctgggat cagactaaat ggcccatttc ggcaccagac 120 tgtaaccagg gcggcaccgt cagcctcgac accacagtag cccacagcgg cagcaactcc 180 atgaaggtcg ttggtggccc caatggctac tgtggacaca tcttcttcgg cactacccag 240 gtgccaactg gggatgtata tgtcagagct tggattcggc ttcagactgc tctcggcagc 300 aaccacgtca cattcatcat catgccagac accgctcagg gagggaagca cctccgaatt 360 ggtggccaaa gccaagttct cgactacaac cgcgagtccg acgatgccac tcttccggac 420 ctgtctccca acggcattgc ctccaccgtc actctgccta ccggcgcgtt ccagtgcttc 480 gagtaccacc tgggcactga cggaaccatc gagacgtggc tcaacggcag cctcatcccg 540 ggcatgaccg tgggccctgg cgtcgacaat ccaaacgacg ctggctggac gagggccagc 600 tatattccgg agatcaccgg tgtcaacttt ggctgggagg cctacagcgg agacgtcaac 660 accgtctggt tcgacgacat ctcgattgcg tcgacccgcg tgggatgcgg ccccggcagc 720 cccggcggtc ctggaagctc gacgactggg cgtagcagca cctcgggccc gacgagcact 780 tcgaggccaa gcaccaccat tccgccaccg acttccagga caacgaccgc cacgggtccg 840 actcagacac actatggcca gtgcggaggg attggttaca gcgggcctac ggtctgcgcg 900 agcggcacga cctgccaggt cctgaaccca tactactccc agtgcttata a 951

<210> 3

<211> 316

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 3

Met Val Arg Arg Thr Ala Leu Leu Ala Leu Gly Ala Leu Ser Thr Leu 1 5 10 15 Ser Met Ala Gln Ile Ser Asp Asp Phe Glu Ser Gly Trp Asp Gln Thr 20 25 30 Lys Trp Pro Ile Ser Ala Pro Asp Cys Asn Gln Gly Gly Thr Val Ser 35 40 45 Leu Asp Thr Thr Val Ala His Ser Gly Ser Asn Ser Met Lys Val Val

50 55 60 Gly Gly Pro Asn Gly Tyr Cys Gly His Ile Phe Phe Gly Thr Thr Gln 65 70 75 80 Val Pro Thr Gly Asp Val Tyr Val Arg Ala Trp Ile Arg Leu Gln Thr

85 90 95 Ala Leu Gly Ser Asn His Val Thr Phe Ile Ile Met Pro Asp Thr Ala 100 105 110 Gln Gly Gly Lys His Leu Arg Ile Gly Gly Gln Ser Gln Val Leu Asp 115 120 125 Tyr Asn Arg Glu Ser Asp Asp Ala Thr Leu Pro Asp Leu Ser Pro Asn

130 135 140 Gly Ile Ala Ser Thr Val Thr Leu Pro Thr Gly Ala Phe Gln Cys Phe 145 150 155 160 Glu Tyr His Leu Gly Thr Asp Gly Thr Ile Glu Thr Trp Leu Asn Gly

165 170 175 Ser Leu Ile Pro Gly Met Thr Val Gly Pro Gly Val Asp Asn Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Gly Trp Thr Arg Ala Ser Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Gly Val 195 200 205 Asn Phe Gly Trp Glu Ala Tyr Ser Gly Asp Val Asn Thr Val Trp Phe

210 215 220 Asp Asp Ile Ser Ile Ala Ser Thr Arg Val Gly Cys Gly Pro Gly Ser 225 230 235 240 Pro Gly Gly Pro Gly Ser Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ser Thr Ser Gly

245 250 255 Pro Thr Ser Thr Ser Arg Pro Ser Thr Thr Ile Pro Pro Pro Thr Ser 260 265 270 Arg Thr Thr Thr Ala Thr Gly Pro Thr Gln Thr His Tyr Gly Gln Cys 275 280 285 Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr

290 295 300 Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 305 310 315

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 4

Met Val Arg Arg Thr Ala Leu Leu Ala Leu Gly Ala Leu Ser Thr Leu 1 5 10 15 Ser Met Ala

<210> 5

<211> 297

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei <400> 5

Gln Ile Ser Asp Asp Phe Glu Ser Gly Trp Asp Gln Thr Lys Trp Pro 1 5 10 15 Ile Ser Ala Pro Asp Cys Asn Gln Gly Gly Thr Val Ser Leu Asp Thr 20 25 30 Thr Val Ala His Ser Gly Ser Asn Ser Met Lys Val Val Gly Gly Pro 35 40 45 Asn Gly Tyr Cys Gly His Ile Phe Phe Gly Thr Thr Gln Val Pro Thr 50 55 60 Gly Asp Val Tyr Val Arg Ala Trp Ile Arg Leu Gln Thr Ala Leu Gly 65 70 75 80 Ser Asn His Val Thr Phe Ile Ile Met Pro Asp Thr Ala Gln Gly Gly 85 90 95 Lys His Leu Arg Ile Gly Gly Gln Ser Gln Val Leu Asp Tyr Asn Arg 100 105 110 Glu Ser Asp Asp Ala Thr Leu Pro Asp Leu Ser Pro Asn Gly Ile Ala 115 120 125 Ser Thr Val Thr Leu Pro Thr Gly Ala Phe Gln Cys Phe Glu Tyr His 130 135 140 Leu Gly Thr Asp Gly Thr Ile Glu Thr Trp Leu Asn Gly Ser Leu Ile 145 150 155 160 Pro Gly Met Thr Val Gly Pro Gly Val Asp Asn Pro Asn Asp Ala Gly 165 170 175 Trp Thr Arg Ala Ser Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Gly Val Asn Phe Gly 180 185 190 Trp Glu Ala Tyr Ser Gly Asp Val Asn Thr Val Trp Phe Asp Asp Ile 195 200 205 Ser Ile Ala Ser Thr Arg Val Gly Cys Gly Pro Gly Ser Pro Gly Gly 210 215 220 Pro Gly Ser Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ser Thr Ser Gly Pro Thr Ser 225 230 235 240 Thr Ser Arg Pro Ser Thr Thr Ile Pro Pro Pro Thr Ser Arg Thr Thr 245 250 255 Thr Ala Thr Gly Pro Thr Gln Thr His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile 260 265 270 Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val 275 280 285 Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 290 295

<210> 6

<211> 1383

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 6

atggcttccc gcttctttgc tcttctcctt ttagcgatcc caatccaggc ccaatctcca 60 gtctggggac aatgtggtgg aattggttgg tctggcccaa caacttgtgt tggaggtgcg 120 acttgtgtat catataaccc ttattactcg caatgtattc ccagtacaca ggcttcatcg 180 agcatagcct ctacaacgct ggtcacatca tttacgacca ccactgctac gaggacttcg 240 gcatcaacgc ctccagcgag cagtacaggt gcaggcggcg caacatgctc agcactgccg 300 ggctccatta ccctgagatc caacgcaaag ctcaacgatc tgtttacaat gttcaatgga 360 gataaggtca ccacgaaaga caaattctcg tgccgccagg cagagatgtc ggagctaata 420 caacgatatg agctcggcac cctgcccgga cgaccaagca ctctcacagc ctcattctcg 480 ggcaatacgt tgaccatcaa ttgcggagag gccggaaagt caatttcatt cacagtcacg 540 atcacttatc catcttccgg aacagcacca taccctgcga ttatcggcta tggaggcggc 600 agtcttccag ctcccgccgg ggttgccatg atcaacttta acaatgacaa catagcagcc 660 caagttaata caggcagccg cggacagggc aagttctacg atctctacgg gagctcgcac 720 tccgcgggcg ccatgaccgc atgggcctgg ggagtaagcc gagtcattga tgctcttgag 780 cttgtaccag gcgcaagaat agacaccacc aagattggcg tgacggggtg ttcacgaaat 840 ggcaaaggcg caatggtcgc aggtgctttc gagaaacgaa tcgttctgac acttccccag 900 gagtcgggcg ccggtggctc tgcgtgctgg aggatttcag actacttaaa gtcccaagga 960 gccaatatcc agaccgcgtc tgagatcatt ggcgaagacc cctggttctc gactactttc 1020 aacagctacg tcaaccaagt gccggtgttg ccgtttgacc accattcgct tgctgccttg 1080 atagccccga gaggattatt cgtcatcgac aacaatattg actggctcgg cccacaaagc 1140 tgctttggct gtatgacagc tgctcacatg gcatggcaag ctttgggtgt ctcggaccac 1200 atgggctatt cgcagattgg agctcacgca cactgcgcgt tcccatcaaa ccagcaatcg 1260 caacttactg cctttgttca gaaattcttg ctgggccagt ccacaaatac ggcgattttc 1320 caaagcgact tttcggccaa tcaaagccaa tggatcgact ggacaacccc aacgctgagt 1380 tga 1383

<210> 7

<211> 460

<212> PRT <213> Trichoderma reesei

<400> 7

Met Ala Ser Arg Phe Phe Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ile Pro Ile Gln 1 5 10 15 Ala Gln Ser Pro Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly 20 25 30 Pro Thr Thr Cys Val Gly Gly Ala Thr Cys Val Ser Tyr Asn Pro Tyr 35 40 45 Tyr Ser Gln Cys Ile Pro Ser Thr Gln Ala Ser Ser Ser Ile Ala Ser

50 55 60

Thr Thr Leu Val Thr Ser Phe Thr Thr Thr Thr Ala Thr Arg Thr Ser

65 70 75 80

Ala Ser Thr Pro Pro Ala Ser Ser Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys

85 90 95 Ser Ala Leu Pro Gly Ser Ile Thr Leu Arg Ser Asn Ala Lys Leu Asn 100 105 110 Asp Leu Phe Thr Met Phe Asn Gly Asp Lys Val Thr Thr Lys Asp Lys 115 120 125 Phe Ser Cys Arg Gln Ala Glu Met Ser Glu Leu Ile Gln Arg Tyr Glu

130 135 140

Leu Gly Thr Leu Pro Gly Arg Pro Ser Thr Leu Thr Ala Ser Phe Ser

145 150 155 160

Gly Asn Thr Leu Thr Ile Asn Cys Gly Glu Ala Gly Lys Ser Ile Ser

165 170 175 Phe Thr Val Thr Ile Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Ala Pro Tyr Pro 180 185 190 Ala Ile Ile Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Leu Pro Ala Pro Ala Gly Val 195 200 205 Ala Met Ile Asn Phe Asn Asn Asp Asn Ile Ala Ala Gln Val Asn Thr

210 215 220

Gly Ser Arg Gly Gln Gly Lys Phe Tyr Asp Leu Tyr Gly Ser Ser His

225 230 235 240

Ser Ala Gly Ala Met Thr Ala Trp Ala Trp Gly Val Ser Arg Val Ile

245 250 255 Asp Ala Leu Glu Leu Val Pro Gly Ala Arg Ile Asp Thr Thr Lys Ile 260 265 270 Gly Val Thr Gly Cys Ser Arg Asn Gly Lys Gly Ala Met Val Ala Gly 275 280 285 Ala Phe Glu Lys Arg Ile Val Leu Thr Leu Pro Gln Glu Ser Gly Ala

290 295 300

Gly Gly Ser Ala Cys Trp Arg Ile Ser Asp Tyr Leu Lys Ser Gln Gly

305 310 315 320

Ala Asn Ile Gln Thr Ala Ser Glu Ile Ile Gly Glu Asp Pro Trp Phe

325 330 335 Ser Thr Thr Phe Asn Ser Tyr Val Asn Gln Val Pro Val Leu Pro Phe 340 345 350 Asp His His Ser Leu Ala Ala Leu Ile Ala Pro Arg Gly Leu Phe Val 355 360 365 Ile Asp Asn Asn Ile Asp Trp Leu Gly Pro Gln Ser Cys Phe Gly Cys

370 375 380

Met Thr Ala Ala His Met Ala Trp Gln Ala Leu Gly Val Ser Asp His

385 390 395 400

Met Gly Tyr Ser Gln Ile Gly Ala His Ala His Cys Ala Phe Pro Ser

405 410 415 Asn Gln Gln Ser Gln Leu Thr Ala Phe Val Gln Lys Phe Leu Leu Gly 420 425 430 Gln Ser Thr Asn Thr Ala Ile Phe Gln Ser Asp Phe Ser Ala Asn Gln 435 440 445 Ser Gln Trp Ile Asp Trp Thr Thr Pro Thr Leu Ser 450 455 460

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 8 Met Ala Ser Arg Phe Phe Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ile Pro Ile Gln

1 5 10 15 Ala

<210> 9

<211> 443

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 9

Gln Ser Pro Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro 1 5 10 15 Thr Thr Cys Val Gly Gly Ala Thr Cys Val Ser Tyr Asn Pro Tyr Tyr 20 25 30 Ser Gln Cys Ile Pro Ser Thr Gln Ala Ser Ser Ser Ile Ala Ser Thr 35 40 45 Thr Leu Val Thr Ser Phe Thr Thr Thr Thr Ala Thr Arg Thr Ser Ala

50 55 60

Ser Thr Pro Pro Ala Ser Ser Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Ser

65 70 75 80

Ala Leu Pro Gly Ser Ile Thr Leu Arg Ser Asn Ala Lys Leu Asn Asp

85 90 95 Leu Phe Thr Met Phe Asn Gly Asp Lys Val Thr Thr Lys Asp Lys Phe 100 105 110 Ser Cys Arg Gln Ala Glu Met Ser Glu Leu Ile Gln Arg Tyr Glu Leu 115 120 125 Gly Thr Leu Pro Gly Arg Pro Ser Thr Leu Thr Ala Ser Phe Ser Gly

130 135 140

Asn Thr Leu Thr Ile Asn Cys Gly Glu Ala Gly Lys Ser Ile Ser Phe

145 150 155 160

Thr Val Thr Ile Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Ala Pro Tyr Pro Ala

165 170 175 Ile Ile Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Leu Pro Ala Pro Ala Gly Val Ala 180 185 190 Met Ile Asn Phe Asn Asn Asp Asn Ile Ala Ala Gln Val Asn Thr Gly 195 200 205 Ser Arg Gly Gln Gly Lys Phe Tyr Asp Leu Tyr Gly Ser Ser His Ser

210 215 220

Ala Gly Ala Met Thr Ala Trp Ala Trp Gly Val Ser Arg Val Ile Asp

225 230 235 240

Ala Leu Glu Leu Val Pro Gly Ala Arg Ile Asp Thr Thr Lys Ile Gly

245 250 255 Val Thr Gly Cys Ser Arg Asn Gly Lys Gly Ala Met Val Ala Gly Ala 260 265 270 Phe Glu Lys Arg Ile Val Leu Thr Leu Pro Gln Glu Ser Gly Ala Gly 275 280 285 Gly Ser Ala Cys Trp Arg Ile Ser Asp Tyr Leu Lys Ser Gln Gly Ala

290 295 300

Asn Ile Gln Thr Ala Ser Glu Ile Ile Gly Glu Asp Pro Trp Phe Ser

305 310 315 320

Thr Thr Phe Asn Ser Tyr Val Asn Gln Val Pro Val Leu Pro Phe Asp

325 330 335 His His Ser Leu Ala Ala Leu Ile Ala Pro Arg Gly Leu Phe Val Ile 340 345 350 Asp Asn Asn Ile Asp Trp Leu Gly Pro Gln Ser Cys Phe Gly Cys Met 355 360 365 Thr Ala Ala His Met Ala Trp Gln Ala Leu Gly Val Ser Asp His Met

370 375 380

Gly Tyr Ser Gln Ile Gly Ala His Ala His Cys Ala Phe Pro Ser Asn

385 390 395 400

Gln Gln Ser Gln Leu Thr Ala Phe Val Gln Lys Phe Leu Leu Gly Gln

405 410 415 Ser Thr Asn Thr Ala Ile Phe Gln Ser Asp Phe Ser Ala Asn Gln Ser 420 425 430 Gln Trp Ile Asp Trp Thr Thr Pro Thr Leu Ser 435 440

<210> 10

<211> 966

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 10

atggagctta aagcactcag tgccgttgtg ctgagctttg taactcttgt cgcggcagca 60 ccggcgacct gcacgcttcc gtccacatac cgctggaatt cgaccggtgc tttagccagc 120 ccgaaatcag gctgggtctc gctgaaagac ttctcccatg tcatttataa tggccagcat 180 cttgtatggg gctcgactca tgacacagga acaatctggg gttcaatgaa ctttggtctg 240 ttcagtgact ggtccaatat ggcaacggca agccagaaca aaatgactcc cggcactgtt 300 gctcctaccg tcttctactt tgccccgaag aatatttggg tactcgccta tcaatggggc 360 ccgaccacgt tttcctacct gacgtcaagc aacccctcca gcgtcaatgg atggtcgtca 420 ccacagcctc tcttctccgg cagtatctca ggctccagcc cgctggatca gacggtcatt 480 ggcgacagca cgaacatgta tctgttcttc gcgggggacg acgggaaaat ctacagggcg 540 agcatgccta tcggtaactt ccccggaagc ttcggttcga cgtcaacggt ggtcctgagc 600 gatgaaagga acaatctgtt tgaggcagtt caggtctata ccgtctcagg gcagaagcaa 660 tatctcatga ttgtcgaggc aataggcgca aatggccggt atttccggtc cttcacagcg 720 acaaacctcg gcggcacatg gactccgcaa gccaccagcg aaagtcagcc gtttgccggt 780 aaggcaaaca gtggcgctac ctggacaaac gacatcagtc atggtgatct aattcgtagc 840 aaccctgatc agacaatgac tatcgaccct tgcaatctgc agttcttgta ccaggggaga 900 gcgacaaact ctggcggcga ctacggcctc ttgccctatc gaccagggct gctaactctc 960 cagcgc 966

<210> 11

<211> 322

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 11

Met Glu Leu Lys Ala Leu Ser Ala Val Val Leu Ser Phe Val Thr Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala Pro Ala Thr Cys Thr Leu Pro Ser Thr Tyr Arg Trp 20 25 30 Asn Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Pro Lys Ser Gly Trp Val Ser Leu 35 40 45 Lys Asp Phe Ser His Val Ile Tyr Asn Gly Gln His Leu Val Trp Gly

50 55 60 Ser Thr His Asp Thr Gly Thr Ile Trp Gly Ser Met Asn Phe Gly Leu 65 70 75 80 Phe Ser Asp Trp Ser Asn Met Ala Thr Ala Ser Gln Asn Lys Met Thr

85 90 95 Pro Gly Thr Val Ala Pro Thr Val Phe Tyr Phe Ala Pro Lys Asn Ile 100 105 110 Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Pro Thr Thr Phe Ser Tyr Leu Thr 115 120 125 Ser Ser Asn Pro Ser Ser Val Asn Gly Trp Ser Ser Pro Gln Pro Leu

130 135 140 Phe Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ser Ser Pro Leu Asp Gln Thr Val Ile 145 150 155 160 Gly Asp Ser Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe Ala Gly Asp Asp Gly Lys

165 170 175 Ile Tyr Arg Ala Ser Met Pro Ile Gly Asn Phe Pro Gly Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Thr Ser Thr Val Val Leu Ser Asp Glu Arg Asn Asn Leu Phe Glu 195 200 205 Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Ser Gly Gln Lys Gln Tyr Leu Met Ile

210 215 220 Val Glu Ala Ile Gly Ala Asn Gly Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala 225 230 235 240 Thr Asn Leu Gly Gly Thr Trp Thr Pro Gln Ala Thr Ser Glu Ser Gln

245 250 255 Pro Phe Ala Gly Lys Ala Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asn Asp Ile 260 265 270 Ser His Gly Asp Leu Ile Arg Ser Asn Pro Asp Gln Thr Met Thr Ile 275 280 285 Asp Pro Cys Asn Leu Gln Phe Leu Tyr Gln Gly Arg Ala Thr Asn Ser

290 295 300 Gly Gly Asp Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Arg Pro Gly Leu Leu Thr Leu 305 310 315 320 Gln Arg

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 12

Met Glu Leu Lys Ala Leu Ser Ala Val Val Leu Ser Phe Val Thr Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala

<210> 13

<211> 303

<212> PRT <213> Trichoderma reesei

<400> 13

Ala Pro Ala Thr Cys Thr Leu Pro Ser Thr Tyr Arg Trp Asn Ser Thr 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Ser Pro Lys Ser Gly Trp Val Ser Leu Lys Asp Phe 20 25 30 Ser His Val Ile Tyr Asn Gly Gln His Leu Val Trp Gly Ser Thr His 35 40 45 Asp Thr Gly Thr Ile Trp Gly Ser Met Asn Phe Gly Leu Phe Ser Asp 50 55 60 Trp Ser Asn Met Ala Thr Ala Ser Gln Asn Lys Met Thr Pro Gly Thr 65 70 75 80 Val Ala Pro Thr Val Phe Tyr Phe Ala Pro Lys Asn Ile Trp Val Leu 85 90 95 Ala Tyr Gln Trp Gly Pro Thr Thr Phe Ser Tyr Leu Thr Ser Ser Asn 100 105 110 Pro Ser Ser Val Asn Gly Trp Ser Ser Pro Gln Pro Leu Phe Ser Gly 115 120 125 Ser Ile Ser Gly Ser Ser Pro Leu Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp Ser 130 135 140 Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe Ala Gly Asp Asp Gly Lys Ile Tyr Arg 145 150 155 160 Ala Ser Met Pro Ile Gly Asn Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Thr Ser 165 170 175 Thr Val Val Leu Ser Asp Glu Arg Asn Asn Leu Phe Glu Ala Val Gln 180 185 190 Val Tyr Thr Val Ser Gly Gln Lys Gln Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala 195 200 205 Ile Gly Ala Asn Gly Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Thr Asn Leu 210 215 220 Gly Gly Thr Trp Thr Pro Gln Ala Thr Ser Glu Ser Gln Pro Phe Ala 225 230 235 240 Gly Lys Ala Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asn Asp Ile Ser His Gly 245 250 255 Asp Leu Ile Arg Ser Asn Pro Asp Gln Thr Met Thr Ile Asp Pro Cys 260 265 270 Asn Leu Gln Phe Leu Tyr Gln Gly Arg Ala Thr Asn Ser Gly Gly Asp 275 280 285 Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Arg Pro Gly Leu Leu Thr Leu Gln Arg 290 295 300

<210> 14

<211> 900

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 14

atgcgcgccc tctcactctc cctccccctc tccctctcgc tgctcgccgc cagctcaaca 60 gcggcaacga catgcgcaaa gggcctctac atggtcgttg cccgcggcag cgaggagccc 120 gccggcacgg gcgtgacggg caacctcacg agccaaatcg ccgcaaaggt gcccggcagc 180 gaggtcgtgg cggtggacta cccggccagc tttgacgact acgaggattc cgagggcgac 240 ggcgtcaagg cgatgcggca gctgctcaac agctacgccg aggcctgtcc gggaaacaag 300 attgcggtgc tgggatactc tcagggcgcc caagtcgcaa cagacaccat ctgcggcggt 360 gccggcgatc cgtttaccag cgacaagggc atgtctgacg atgtcatgga cgacgtcgtt 420 gccgtggcca ttttcggaga cccaacccat gtcgccaaca tgacgtacga ccgaggcacc 480 agcattcaca acgggctctt caaccggagc tcgtccagca tcgaggtctg caagtcgtac 540 gccagccgca tcgtctcgta ctgcgacacg ggcgacatct actgcgacgc cggcagcaac 600 tcgaccgttc accacatgta catccagcgc tacggcgacg aaatcgtcga ctttgtcgtc 660 agccagtttg agaagagcac cagctcggga tcggggtcgg gtactaatgc caccacgacc 720 acggctccgg ctcccaccgt gtctcctacc accaccagcg gtggcaacag cacagtgcct 780 acgcgaaccg gtggcccgac gacgagttcg acgcaaggat cgggtgcgag tgctttgacg 840 agcagtttga tgctgggagg tcttttgacg gttttgacgg cggtgtctca gatgctgtga 900

<210> 15

<211> 299

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 15

Met Arg Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro Leu Ser Leu Ser Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ser Thr Ala Ala Thr Thr Cys Ala Lys Gly Leu Tyr Met Val

20 25 30 Val Ala Arg Gly Ser Glu Glu Pro Ala Gly Thr Gly Val Thr Gly Asn 35 40 45 Leu Thr Ser Gln Ile Ala Ala Lys Val Pro Gly Ser Glu Val Val Ala

50 55 60

Val Asp Tyr Pro Ala Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Asp Ser Glu Gly Asp

65 70 75 80

Gly Val Lys Ala Met Arg Gln Leu Leu Asn Ser Tyr Ala Glu Ala Cys

85 90 95 Pro Gly Asn Lys Ile Ala Val Leu Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Gln Val 100 105 110 Ala Thr Asp Thr Ile Cys Gly Gly Ala Gly Asp Pro Phe Thr Ser Asp 115 120 125 Lys Gly Met Ser Asp Asp Val Met Asp Asp Val Val Ala Val Ala Ile

130 135 140

Phe Gly Asp Pro Thr His Val Ala Asn Met Thr Tyr Asp Arg Gly Thr

145 150 155 160

Ser Ile His Asn Gly Leu Phe Asn Arg Ser Ser Ser Ser Ile Glu Val

165 170 175 Cys Lys Ser Tyr Ala Ser Arg Ile Val Ser Tyr Cys Asp Thr Gly Asp 180 185 190 Ile Tyr Cys Asp Ala Gly Ser Asn Ser Thr Val His His Met Tyr Ile 195 200 205 Gln Arg Tyr Gly Asp Glu Ile Val Asp Phe Val Val Ser Gln Phe Glu

210 215 220

Lys Ser Thr Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Ala Thr Thr Thr

225 230 235 240

Thr Ala Pro Ala Pro Thr Val Ser Pro Thr Thr Thr Ser Gly Gly Asn

245 250 255 Ser Thr Val Pro Thr Arg Thr Gly Gly Pro Thr Thr Ser Ser Thr Gln 260 265 270 Gly Ser Gly Ala Ser Ala Leu Thr Ser Ser Leu Met Leu Gly Gly Leu 275 280 285 Leu Thr Val Leu Thr Ala Val Ser Gln Met Leu 290 295

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 16

Met Arg Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro Leu Ser Leu Ser Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ser Thr Ala 20

<210> 17

<211> 278

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 17

Ala Thr Thr Cys Ala Lys Gly Leu Tyr Met Val Val Ala Arg Gly Ser 1 5 10 15 Glu Glu Pro Ala Gly Thr Gly Val Thr Gly Asn Leu Thr Ser Gln Ile 20 25 30 Ala Ala Lys Val Pro Gly Ser Glu Val Val Ala Val Asp Tyr Pro Ala 35 40 45 Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Asp Ser Glu Gly Asp Gly Val Lys Ala Met

50 55 60

Arg Gln Leu Leu Asn Ser Tyr Ala Glu Ala Cys Pro Gly Asn Lys Ile

65 70 75 80

Ala Val Leu Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Gln Val Ala Thr Asp Thr Ile

85 90 95 Cys Gly Gly Ala Gly Asp Pro Phe Thr Ser Asp Lys Gly Met Ser Asp 100 105 110 Asp Val Met Asp Asp Val Val Ala Val Ala Ile Phe Gly Asp Pro Thr 115 120 125 His Val Ala Asn Met Thr Tyr Asp Arg Gly Thr Ser Ile His Asn Gly

130 135 140

Leu Phe Asn Arg Ser Ser Ser Ser Ile Glu Val Cys Lys Ser Tyr Ala

145 150 155 160

Ser Arg Ile Val Ser Tyr Cys Asp Thr Gly Asp Ile Tyr Cys Asp Ala

165 170 175 Gly Ser Asn Ser Thr Val His His Met Tyr Ile Gln Arg Tyr Gly Asp 180 185 190 Glu Ile Val Asp Phe Val Val Ser Gln Phe Glu Lys Ser Thr Ser Ser 195 200 205 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Pro Ala Pro

210 215 220

Thr Val Ser Pro Thr Thr Thr Ser Gly Gly Asn Ser Thr Val Pro Thr

225 230 235 240

Arg Thr Gly Gly Pro Thr Thr Ser Ser Thr Gln Gly Ser Gly Ala Ser

245 250 255 Ala Leu Thr Ser Ser Leu Met Leu Gly Gly Leu Leu Thr Val Leu Thr 260 265 270 Ala Val Ser Gln Met Leu 275

<210> 18

<211> 768

<212> PRT

<213> Ruminococcus flavefaciens

<400> 18

Met Lys Lys His Phe Val Val Gly Glu Thr Ile Lys Arg Phe Leu Arg 1 5 10 15 Ile Gly Thr Ser Leu Ala Leu Ser Ile Ser Thr Leu Ser Leu Leu Pro 20 25 30 Ser Ala Pro Arg Leu Ser Ser Ala Ala Gly Thr Ile Lys Ile Met Pro 35 40 45 Leu Gly Asp Ser Ile Thr Tyr Gly Met Ala Asp Glu Gly Gly Tyr Arg

50 55 60

Lys Tyr Leu Ser Tyr Phe Leu Gln Gln Lys Gly Tyr Thr Asn Val Asp

65 70 75 80

Leu Val Gly Pro Glu Gly Lys Asp Ser Ala Ser Phe Asn Tyr Asn Gly

85 90 95 Gln Ser Val Lys Tyr Asp Asp Asn His Ala Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr 100 105 110 Ile Thr Asn Leu Pro Gly Gly Trp Phe Gly Gln Leu Asn Gly Ile Leu 115 120 125 Glu Thr Met Gln Gly Gly Asp Tyr Ile Lys Lys Tyr Ser Pro Asp Ile

130 135 140

Ile Leu Leu Gln Ile Gly Thr Asn Asp Val Ser Asn Gly His Leu Asp

145 150 155 160

Gly Ser Glu Glu Arg Leu His Lys Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Asn

165 170 175 Met Pro Ser Asn Gly Lys Val Phe Leu Thr Thr Ile Pro Asp Leu Gly 180 185 190 Asn Ser Gly Trp Gly Gly Asn Ser Asn Gly Asp Ile Ala Lys Tyr Asn 195 200 205 Glu Leu Ile Lys Lys Val Ala Asn Asp Tyr Ser Ser Lys Asn Val Ile

210 215 220

Tyr Ala Asp Ile His Ser Val Ile Asp Ala Ser Lys Asp Leu Ala Asp

225 230 235 240

Gly Val His Pro Asn Ala Gly Gly Tyr Glu Lys Met Gly Lys Tyr Trp

245 250 255 Leu Glu Gln Ile Glu Gly Tyr Leu Lys Ala Ser Asp Gly Pro Gln Gln 260 265 270 Thr Gln Pro Thr Gln Pro Ser Gln Gly Asp Ser Gly Pro Glu Leu Ile 275 280 285 Tyr Gly Asp Leu Asp Gly Asp Lys Thr Ile Thr Ser Phe Asp Ala Val

290 295 300

Ile Met Arg Lys Gly Leu Ile Asn Asp Phe Lys Asp Asn Asn Val Lys

305 310 315 320

Lys Ala Ala Asp Ile Asp Gln Asn Gly Lys Ala Glu Val Ala Asp Leu

325 330 335 Val Gln Leu Gln Ser Phe Ile Ile Gly Lys Ile Lys Glu Phe Thr Val 340 345 350 Ala Glu Lys Thr Val Thr Glu Lys Pro Val Phe Glu Lys Ser Tyr Asn 355 360 365 Phe Pro Ala Val Asn Gln Leu Lys Ser Ser Lys Asp Ile Pro Asp Pro

370 375 380

Phe Ile Phe Met Asp Gly Ser Lys Val Glu Ser Thr Asp Asp Trp Trp

385 390 395 400

Lys Arg Gln Ser Glu Ile Ser Cys Met Tyr Glu Tyr Tyr Met Tyr Gly 405 410 415

Lys Trp Ile Asp Gly Ser Asp Asp Glu Thr Thr Tyr Ser Ile Ser Gly

420 425 430 Asn Ser Met Thr Ile Asn Val Lys Arg Lys Ser Thr Gly Lys Thr Ala 435 440 445 Ser Phe Lys Ala Val Ile Asn Leu Pro Lys Asn Val Arg His Glu Gly

450 455 460

Gly Ala Pro Val Ile Leu Gly Met His Lys Gly Ile Ser Glu Ser Thr

465 470 475 480

Ala Thr Ser Asn Gly Tyr Ala Val Ile Thr Tyr Asp Ser Asp Gly Met

485 490 495 Phe Ser Ala Pro Gly Thr Ala Gln Asp Asn Asn Gln His Lys Gly Ala 500 505 510 Phe Tyr Asp Leu Tyr Pro Tyr Gly Arg Asn Trp Asp Glu Gln Thr Gly 515 520 525 Asp Leu Met Ala Trp Ser Trp Gly Ile Ser Arg Ile Leu Asp Ala Leu

530 535 540

Tyr Asn Gly Ala Ala Lys Glu Leu Asn Ile Asn Pro Asp Ser Ser Ile

545 550 555 560

Val Thr Gly Val Ser Arg Tyr Gly Lys Ala Ala Ser Val Cys Gly Ala

565 570 575 Phe Asp Thr Arg Ile Lys Met Cys Ala Pro Ser Cys Ser Gly Ala Gly 580 585 590 Gly Leu Ala Leu Tyr Arg Tyr Ser Ser Val Gly Lys Thr Tyr Asp Phe 595 600 605 Ser Ser Lys Gly Gly Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Lys Glu Asn Glu Pro

610 615 620

Leu Gly Ser Leu Gln Ala Ser Gly Glu Gln Gly Trp Phe Asn Gly Arg

625 630 635 640

Phe Met Glu Phe Arg Asn Ala Glu Gln Phe Pro Met Asp Gln His Met

645 650 655 Leu Gly Ala Leu Cys Cys Asp Pro Asp Arg Tyr Leu Phe Ile Ile Gly 660 665 670 Ser Cys Glu Ser Glu Asp Trp Val Asn Ala Pro Ser Val Trp Met Ala 675 680 685 Tyr Leu Gly Met Lys His Val Trp Asp Tyr Val Gly Ile Ser Asp His

690 695 700

Leu Ala Ile Asn Ile His Lys Ser Gly His Ala Val Ile Ala Glu Asp

705 710 715 720

Ile Glu Lys Met Val Gln Tyr Phe Asp Tyr His Val Tyr Gly Ile Gln

725 730 735 Pro Lys Met Asn Leu Glu Glu Leu Gln Thr Ser Val Phe Ala Leu Pro 740 745 750 Lys Asn Lys Asp Ser Phe Ala Asp Thr Phe Ala Ser Lys Trp Leu Tyr 755 760 765

<210> 19

<211> 511

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia consenso

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(511)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 19

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Leu Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Ala 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa

50 55 60

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Ala Xaa Ala Xaa Ile Ala Xaa

65 70 75 80

Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Ser Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser

85 90 95 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Pro Ala Xaa Xaa Xaa Leu Lys Ser Xaa Xaa Xaa Ile Xaa

115 120 125

Asp Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Lys Val Xaa Ser Xaa Asp Xaa 130 135 140

Phe Xaa Xaa Arg Gln Ala Glu Ile Ser Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa

145 150 155 160

Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Ser Xaa

165 170 175 Ser Gly Asn Ser Leu Thr Ile Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Lys 180 185 190 Ser Xaa Ser Phe Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

210 215 220

Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Met Ile Xaa Phe Xaa Xaa Asp

225 230 235 240

Xaa Ile Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Thr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

245 250 255 Gly Xaa Phe Tyr Asp Leu Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270 Xaa Gly Xaa Leu Xaa Ala Trp Ala Trp Gly Ile Ser Arg Ile Ile Asp 275 280 285 Ala Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

290 295 300

Xaa Xaa Val Thr Gly Xaa Ser Arg Xaa Gly Lys Ala Ala Xaa Val Xaa

305 310 315 320

Gly Ala Phe Asp Xaa Arg Ile Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Ser Gly

325 330 335 Ala Gly Gly Xaa Ala Xaa Trp Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Lys Ser Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Xaa Xaa Trp Phe Xaa

370 375 380

Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Phe Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Asp

385 390 395 400

Xaa His Xaa Leu Ala Ala Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Leu Xaa

405 410 415 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Trp Leu Xaa Xaa Xaa Ser Xaa 420 425 430 Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Leu Gly Ile 435 440 445 Ser Asp His Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

450 455 460

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe

465 470 475 480

Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Ser Xaa Xaa Xaa

485 490 495 Ala Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 500 505 510

<210> 20

<211> 322

<212> PRT

<213> Cochliobolus carbonum

<400> 20

Met Arg Phe Val Pro Asp Leu Ser Phe Ser Ala Ala Ala Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ser Thr Ala Ser Ala Gln Ser Cys Lys Leu Pro Thr Ser Tyr 20 25 30 Lys Trp Thr Ser Ser Gly Ala Leu Ala Gln Pro Lys Ser Gly Trp Ala 35 40 45 Asn Leu Lys Asp Phe Thr Ile Ser Ser Leu Asn Gly Lys His Ile Val

50 55 60

Tyr Ala Thr Asp His Asp Thr Gly Ser Lys Tyr Gly Ser Met Ala Phe

65 70 75 80

Ser Pro Phe Gly Ser Phe Ser Glu Met Ala Ser Ala Ser Gln Thr Ala

85 90 95 Thr Pro Phe Thr Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe Arg Phe Ala Pro Lys 100 105 110 Asn Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Pro Thr Thr Phe Ser Tyr 115 120 125 Arg Thr Ser Ser Asp Pro Thr Asn Pro Asn Ser Trp Gly Gly Val Gln 130 135 140 Thr Leu Phe Ser Gly Lys Ile Ser Gly Ser Ser Thr Gly Ala Ile Asp

145 150 155 160 Gln Thr Val Ile Gly Asp Ala Ile Asn Met Tyr Leu Phe Phe Ala Gly 165 170 175 Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ser Ser Met Pro Lys Ala Asn Phe Pro 180 185 190 Gly Ser Phe Gly Thr Ala Ser Thr Val Ile Met Ser Asp Ser Thr Asn 195 200 205 Asn Leu Phe Glu Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Lys Gly Gly Gly Tyr

210 215 220

Leu Met Ile Val Glu Ala Val Gly Ser Gly Gly Arg Tyr Phe Arg Ser

225 230 235 240

Phe Thr Ala Ser Ser Leu Ser Gly Ser Trp Thr Pro Asn Ala Ala Thr

245 250 255 Glu Ser Asn Pro Phe Ala Gly Lys Ala Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr 260 265 270 Asn Asp Ile Ser His Gly Asp Leu Val Lys Val Thr Asn Asp Glu Thr 275 280 285 Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu Gln Leu Leu Tyr Gln Gly Arg Ala

290 295 300

Pro Asn Ser Gly Gly Asp Tyr Asp Arg Leu Pro Tyr Arg Pro Gly Leu

305 310 315 320

Leu Thr

<210> 21

<211> 363

<212> PRT

<213> Streptomyces thermoviolaceus

<400> 21

Met Ser Phe His Arg Ser Leu Pro Phe Arg Pro Lys Arg Leu Phe Gly 1 5 10 15 Val Leu Ala Pro Leu Leu Leu Ala Gly Val Met Ser Thr Gln Pro Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Thr Val Val Pro Ser Asp Asp Val Gln Gly Thr Gly Arg 35 40 45 Gln Ser Gln Leu Thr Asp Gly Phe Gly Thr Arg Ala Ser Cys Glu Leu

50 55 60

Pro Ser Thr Tyr Arg Trp Thr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Gln Pro Arg

65 70 75 80

Ser Gly Trp Val Ser Leu Lys Asp Phe Thr Val Val Pro Tyr Asn Gly

85 90 95 Gln His Leu Val Tyr Ala Thr Thr His Asp Thr Gly Thr Arg Trp Gly 100 105 110 Ser Met Asn Phe Glu Pro Phe Gly Asp Trp Ser Gln Met Ala Thr Ala 115 120 125 Arg Gln Asn Ala Met Asn Ser Pro Thr Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr

130 135 140

Phe Ala Pro Lys Asp Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Gly Ser

145 150 155 160

Ala Phe Ser Tyr Arg Thr Ser His Asp Pro Thr Asp Pro Asn Gly Trp

165 170 175 Ser Ser Glu Gln Val Leu Phe Ser Gly Ser Ile Ala Asp Ser Ala Thr 180 185 190 Gly Pro Ile Asp Gln Thr Leu Ile Gly Asp Asp Thr His Met Tyr Leu 195 200 205 Phe Phe Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ala Ser Met Pro Ile

210 215 220

Gly Asp Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Thr Ala Thr Val Val Met Ser

225 230 235 240

Asp Thr Arg Asn Asn Leu Phe Glu Ala Pro Gln Val Tyr Lys Leu Gln

245 250 255 Gly Gln Asn Arg Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ala Gln Gly 260 265 270 Gln Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Thr Ser Leu Asp Gly Glu Trp 275 280 285 Thr Pro Gln Ala Thr Ser Glu Ser Asn Pro Phe Ala Gly Lys Ala Asn

290 295 300

Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asp Asp Ile Ser His Gly Glu Leu Ile Arg

305 310 315 320

Thr Thr Ala Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu Gln Leu

325 330 335 Leu Tyr Gln Gly Arg Asp Pro Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Asp Leu Leu 340 345 350 Pro Tyr Arg Pro Gly Leu Leu Thr Leu Gln Arg 355 360

<210> 22

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia consenso

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(24)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 22

Leu Xaa Phe Met Pro Xaa Lys Ala Phe Ser Ala Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Val Ala Ser Ala Gln 20

<210> 23

<211> 304

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia consenso

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(304)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 23

Ala Ser Cys Xaa Leu Pro Ser Thr Tyr Arg Trp Thr Ser Thr Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Gln Pro Lys Ser Gly Trp Val Ser Leu Lys Asp Phe Thr Ile 20 25 30 Val Xaa Tyr Asn Gly Gln His Leu Val Tyr Ala Thr Thr His Asp Thr 35 40 45 Gly Thr Lys Trp Gly Ser Met Asn Phe Xaa Pro Phe Gly Asp Trp Ser

50 55 60

Asn Met Ala Thr Ala Ser Gln Asn Ala Met Xaa Xaa Xaa Thr Val Ala

65 70 75 80

Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Ala Pro Lys Asn Ile Trp Val Leu Ala Tyr

85 90 95 Gln Trp Gly Pro Thr Thr Phe Ser Tyr Arg Thr Ser Ser Asp Pro Thr 100 105 110 Xaa Pro Asn Gly Trp Ser Ser Xaa Gln Xaa Leu Phe Ser Gly Ser Ile 115 120 125 Ser Gly Ser Ala Thr Gly Pro Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp Ala

130 135 140

Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg

145 150 155 160

Ala Ser Met Pro Ile Gly Asn Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Thr Ser

165 170 175 Thr Val Val Met Ser Asp Ser Arg Asn Asn Leu Phe Glu Ala Val Gln 180 185 190 Val Tyr Thr Val Xaa Gly Gln Xaa Xaa Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala 195 200 205 Ile Gly Ala Asn Gly Xaa Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Thr Ser

210 215 220

Leu Xaa Gly Ser Trp Thr Pro Gln Ala Thr Ser Glu Ser Asn Pro Phe

225 230 235 240

Ala Gly Lys Ala Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asn Asp Ile Ser His

245 250 255 Gly Asp Leu Ile Arg Ser Thr Xaa Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro 260 265 270 Cys Asn Leu Gln Leu Leu Tyr Gln Gly Arg Ala Pro Asn Ser Gly Gly 275 280 285 Asp Tyr Asp Leu Leu Pro Tyr Arg Pro Gly Leu Leu Thr Leu Gln Arg 290 295 300

<210> 24

<211> 302

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 24

Met Pro Ser Val Lys Glu Thr Leu Thr Leu Leu Leu Ser Gln Ala Phe 1 5 10 15 Leu Ala Thr Gly Ser Pro Val Asp Gly Glu Thr Val Val Lys Arg Gln 20 25 30 Cys Pro Ala Ile His Val Phe Gly Ala Arg Glu Thr Thr Val Ser Gln 35 40 45 Gly Tyr Gly Ser Ser Ala Thr Val Val Asn Leu Val Ile Gln Ala His

50 55 60

Pro Gly Thr Thr Ser Glu Ala Ile Val Tyr Pro Ala Cys Gly Gly Gln

65 70 75 80

Ala Ser Cys Gly Gly Ile Ser Tyr Ala Asn Ser Val Val Asn Gly Thr

85 90 95 Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ile Asn Asn Phe His Asn Ser Cys Pro Asp 100 105 110 Thr Gln Leu Val Leu Val Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Gln Ile Phe Asp 115 120 125 Asn Ala Leu Cys Gly Gly Gly Asp Pro Gly Glu Gly Ile Thr Asn Thr

130 135 140

Ala Val Pro Leu Thr Ala Gly Ala Val Ser Ala Val Lys Ala Ala Ile

145 150 155 160

Phe Met Gly Asp Pro Arg Asn Ile His Gly Leu Pro Tyr Asn Val Gly

165 170 175 Thr Cys Thr Thr Gln Gly Phe Asp Ala Arg Pro Ala Gly Phe Val Cys 180 185 190 Pro Ser Ala Ser Lys Ile Lys Ser Tyr Cys Asp Ala Ala Asp Pro Tyr 195 200 205 Cys Cys Thr Gly Asn Asp Pro Asn Val His Gln Gly Tyr Gly Gln Glu

210 215 220

Tyr Gly Gln Gln Ala Leu Ala Phe Ile Asn Ser Gln Leu Ser Ser Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gln Pro Pro Gly Gly Gly Pro Thr Ser Thr Ser Arg Pro Thr

245 250 255 Ser Thr Arg Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Thr His Trp Gly 260 265 270 Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro Thr Gln Cys Glu Ser Gly 275 280 285 Thr Thr Cys Gln Val Ile Ser Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 290 295 300

<210> 25

<211> 310

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia consenso

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(310)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 25

Ser Leu Ser Leu Xaa Leu Ser Xaa Ala Xaa Leu Ala Xaa Xaa Ser Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile His Met 20 25 30 Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Gly Xaa Ser Ala 35 40 45 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Gly Ser Xaa Xaa Xaa

50 55 60

Ala Ile Xaa Tyr Pro Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

65 70 75 80

Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa

85 90 95 Ile Asn Xaa Phe Xaa Xaa Ala Cys Pro Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Leu Leu 100 105 110

Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Gln Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Cys Gly Gly 115 120 125

Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Leu Ser Xaa 130 135 140

Xaa Xaa Met Xaa Xaa Val Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asp Pro Xaa

145 150 155 160

Xaa Ile Xaa Xaa Leu Xaa Tyr Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa Asn Gly

165 170 175 Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 180 185 190 Ser Lys Ile Xaa Ser Tyr Cys Asp Xaa Ala Asp Xaa Tyr Cys Xaa Xaa 195 200 205 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Tyr Gly Xaa

210 215 220

Xaa Xaa Leu Xaa Phe Ile Xaa Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa

225 230 235 240

Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Pro Xaa Xaa

245 250 255 Thr Xaa Xaa Pro Thr Ser Thr Xaa Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Pro Thr 260 265 270 Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Gly Xaa Ser 275 280 285 Ala Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa

290 295 300

Xaa Xaa Ser Gln Xaa Leu

305 310

<210> 26

<211> 400

<212> PRT

<213> Streptomyces coelicor

<400> 26

Met Arg Thr Arg Val Leu Arg Leu Leu Arg Arg Pro Trp Thr Ala Ala 1 5 10 15 Val Ala Ala Val Ala Leu Val Val Ser Val Leu Val Ala Met Pro Ala 20 25 30 Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Arg Val Asp Tyr Gly Val Asp Ala 35 40 45 Trp Ala Gly Gly Tyr Thr Ala Arg Val Arg Ile Thr Asn Leu Gly Pro

50 55 60

Ala Val Ser Asp Trp Arg Leu Thr Trp Thr Tyr Thr Gly Asp Gln Gln

65 70 75 80

Val Thr Ser Ala Trp Asn Ala Thr Val Thr Gln Thr Gly Ala Ser Val

85 90 95 Val Ala Val Asp Ala Gly Trp Asn Gly Ala Val Ser Thr Gly Gly Thr 100 105 110 Ala Glu Phe Gly Leu Gln Gly Thr Trp Arg Ser Ala Asp Pro Ala Pro 115 120 125 Asp Asp Phe Ala Leu Asn Gly Thr Ser Cys Gly Asp Gly Gly Thr Pro

130 135 140

Thr Ala Thr Pro Thr Thr Ser Pro Thr Ala Pro Pro Thr Thr Pro Pro

145 150 155 160

Thr Thr Pro Pro Pro Thr Thr Pro Pro Pro Ala Ala Glu Cys Gly Asp

165 170 175 Ala Val Ile Cys Ser Gly Phe Glu Asp Gln Ala Gly Pro Glu Pro Ser 180 185 190 Gly Asp Trp Arg Phe Thr Ala Pro Asp Cys Gln Gly Thr Gly Thr Ala 195 200 205 Ala Val Asp Ser Ala Val Ser His Ala Gly Gly Arg Ser Leu Arg Val

210 215 220

Asp Gly Arg Ala Gly Tyr Cys Asn His Ala Phe Val Ala His Thr Ala

225 230 235 240

Asp Leu Ser Ser Val Gly Pro Val Met Tyr Val Arg Met Trp Val Arg

245 250 255 His Thr Thr Ala Leu Pro Thr Ser His Val Thr Phe Val Ser Met Pro 260 265 270 Asp Ser Ala Gln Gly Gly Arg Ala Leu Arg Val Gly Gly Gln Asn Gly 275 280 285 Ala Leu Gln Trp Asn Arg Glu Ser Asp Asp Ala Thr Leu Pro Ala Gln

290 295 300

Ser Pro Ala Gly Val Ala Leu Ser Arg Pro Leu Pro Thr Asp Gly Trp

305 310 315 320

Gln Cys Leu Arg Phe Ala Ile Asp Thr Ser Ala Ala Gly Leu Asp Thr 325 330 335

Trp Leu Gly Asp Glu Gln Val Pro Gly Leu His Ala Asp Gly Val Pro 340 345 350 Thr Gln Asp Val Asp Gln Gln Trp Leu Thr Arg Gly Thr Ala Pro Arg 355 360 365 Pro Thr Ala Leu Arg Leu Gly Trp Glu Ser Tyr Ala Thr Gly Asp Asp

370 375 380

Thr Val Trp Phe Asp Asp Val Ala Val Gly Ser Ala Pro Ile Gly Cys

385 390 395 400

<210> 27

<211> 236

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia consenso

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(236)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 27

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Asp Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa 20 25 30 Ser Ala Pro Asp Cys Asn Xaa Xaa Gly Thr Xaa Ala Leu Asp Ser Xaa 35 40 45 Val Ala His Ala Gly Xaa Xaa Ser Leu Lys Val Xaa Gly Xaa Xaa Xaa

50 55 60

Gly Tyr Cys Xaa His Xaa Phe Xaa Ala Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Ser Xaa

65 70 75 80

Xaa Xaa Xaa Xaa Met Tyr Val Arg Xaa Trp Ile Arg Xaa Xaa Thr Ala

85 90 95 Leu Xaa Ser Xaa His Val Thr Phe Ile Xaa Met Pro Asp Ser Ala Gln 100 105 110 Gly Gly Lys Xaa Leu Arg Ile Gly Gly Gln Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Trp 115 120 125 Asn Arg Glu Ser Asp Asp Ala Thr Leu Pro Xaa Xaa Ser Pro Xaa Gly

130 135 140

Ile Ala Xaa Ser Xaa Xaa Leu Pro Thr Xaa Ala Phe Gln Cys Xaa Xaa

145 150 155 160

Phe Xaa Ile Xaa Thr Xaa Ala Xaa Xaa Ile Asp Thr Trp Leu Xaa Xaa

165 170 175 Xaa Xaa Ile Pro Gly Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa 180 185 190 Asp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Thr Ala Leu 195 200 205 Xaa Xaa Gly Trp Glu Ala Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Val Trp Phe

210 215 220

Asp Asp Ile Ala Ile Ala Ser Xaa Xaa Ile Gly Cys

225 230 235

<210> 28

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 28

gacaatccaa acgacgct 18

<210> 29

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador

<400> 29

caatcgagat gtcgtcgaac

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 30

ctcctccaca cccggtgccg

<210> 31

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 31 tgctgccaat gggtccg

<210> 32

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 32

acgtattcag gcaaccc

<210> 33

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 33

gcagtggcca tggctcc

<210> 34

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 34

ccagtacatg aactggc

<210> 35

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 35

agacccaatg tctcccc

<210> 36

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 36

cgaattgtgc tcctggc

<210> 37

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 37

gtggttggac cggatgg

<210> 38

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 38

cctaccgtgg tatcagg

<210> 39

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 39

tggttctgct ggtcggg

<210> 40

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 40

catttcgaca tcatggc

<210> 41

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 41 ctgtcccacg cagaggc

17

<210> 42 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador

<400> 42 ccggctggct tcgtctg

17

<210> 43 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador

<400> 43 tggccgtaac cttggtg

17

<210> 44 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador

<400> 44 cctctctcac gactcgc

17

<210> 45 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador

<400> 45 gttcgatgag ttgtacc

17

<210> 46 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador

<400> 46 cccccaaacg gaacaacttc c

21

<210> 47 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador

<400> 47

ctgtatctgt ggttgtgtag g

<210> 48

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(14)

<223> n = A,T,C o G

<400> 48

ggncartgyg gngg

<210> 49

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(14)

<223> n = A,T,C o G

<400> 49

adrcaytgng arta

<210> 50

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 50

adrcaytgrc trta

<210> 51

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(14)

<223> n = A,T,C o G

<400> 51

adrcaytgng crta

<210> 52

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 52

caccatggtt cgccggactg ctctg

<210> 53

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 53

ttataagcac tgggagtagt atgg

<210> 54

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 54

caccatggct tcccgcttct ttg

<210> 55

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 55

tcaactcagc gttggggttg

<210> 56

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 56

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggagcttaa agcactcagt gccg

<210> 57

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 57

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagcgctgga gagttagcag c

<210> 58

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

5 10

<400> 58 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tgcgcgccct ctcactctcc <210> 59 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> cebador 50

15

<400> 59 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cacagcatct gagacaccgc c 51

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

   (a)

   una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

   (b)

   una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

   (c)

   una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

   (d)

   una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

   (e)

   una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma;

   (f)

   una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma; y

   (g)

   una secuencia de ácidos nucleicos presentada como SEC ID No. 14, o el complemento de la misma, en el que el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con los parámetros por defecto, que incluyen una penalización por la abertura de espacio de 10,0, una penalización por la extensión del espacio de 0,1, y una matriz de similitud BLOSUM 30.

2. 2.

   Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido es una molécula de ARN.

3. 3.

   Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en el que la enzima deriva de una fuente de Trichoderma.

4. 4.

   Polinucleótido aislado según la reivindicación 3, en el que la enzima deriva de Trichoderma reesei.

5. 5.

   Construcción de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido (i) que codifica una enzima que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma; o (ii) que codifica una enzima que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma

6. 6.

   Vector que comprende la construcción de expresión de la reivindicación 5.

7. 7.

   Vector que comprende un polinucleótido aislado según la reivindicación 1, unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

8. 8.

   Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

9. 9.

   Célula huésped según la reivindicación 8, que es una célula procariota.

10. 10.

    Célula huésped según la reivindicación 8, que es una célula eucariota.

11. 11.

    Célula huésped procariota recombinante que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1.

12. 12.

    Polipéptido AXE2 sustancialmente purificado que tiene actividad acetil xilano esterasa, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

    (a)

    una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

    (b)

    una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

    (c)

    una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

    (d) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 17;

    (e)

    una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15;

    (f) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 15;

    (g)

    un fragmento biológicamente activo sustancialmente purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 17, donde el fragmento tiene actividad acetil xilano esterasa y donde el fragmento comprende por lo menos 20 aminoácidos.

13. 13. Método de producción de una enzima que tiene actividad acetil xilano esterasa, que comprende:

    (a)

    transformar de forma estable una célula huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 1;

    (b)

    cultivar dicha célula huésped transformada en condiciones adecuadas para que dicha célula huésped produzca dicha acetil xilano esterasa; y

    (b) recuperar dicha acetil xilano esterasa.

14. 14.

    Método según la reivindicación 13, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso o una célula de levadura.

15. 15.

    Método de preparación de una célula huésped recombinante, que comprende proporcionar una célula parental que tiene un gen axe2 que comprende un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 1, y realizar una deleción o inserción u otra alteración en dicho gen axe2 que desactiva el gen, para producir una célula huésped recombinante que no es capaz de producir polipéptido AXE2 tal como se define en la reivindicación 12.

16. 16.

    Oligonucleótido antisentido complementario a un ARN mensajero que codifica un polipéptido AXE2 que tiene la secuencia presentada como SEC ID No. 17, donde tras la exposición a una célula huésped productora de acetil xilano esterasa, dicho oligonucleótido disminuye o inhibe la producción de acetil xilano esterasa por dicha célula huésped.

17. 17.

    Oligonucleótido antisentido según la reivindicación 16, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso.

18. 18.

    Composición de detergente, comprendiendo dicha composición una enzima que tiene actividad acetil xilano esterasa seleccionada del grupo que consiste en:

    (a)

    una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

    (b)

    una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

    (c)

    una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

    (d) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 17;

    (e)

    una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15;

    (f) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 15;

    (g)

    un fragmento biológicamente activo sustancialmente purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 17, donde el fragmento tiene actividad acetil xilano esterasa y donde el fragmento comprende por lo menos 20 aminoácidos.

19. 19.

    Alimento animal que contiene xilano que comprende un aditivo alimentario basado en enzimas que comprende acetil xilano esterasa según la reivindicación 12.

20. 20.

    Aditivo alimentario que comprende acetil xilano esterasa según la reivindicación 12.

21. 21.

    Método de conversión de biomasa en azúcares que comprende poner en contacto dicha biomasa con una acetil xilano esterasa según la reivindicación 12.

    Figura 1: secuencia de ADNc de cip1 (SEC Id No. 1)

    Figura 2: secuencia codificante de cip1 (SEC Id No.2)

    Figura 4: secuencia de longitud completa de cip2(SEC Id No. 6)

    No. 7)

    igura 6: Alineación de Cip2 con R. Flavefaciens cesA CAB55348Cip2 tiene una secuencia señal N-terminal prevista de 17 aminoácidosseguida de 36 aminoácidos que comprenden un módulo de unión a carbohidratode la familia CBM1 y una región enlazadora que termina en aproximadamenteel aminoácido 95

    Id No. 10)

    Figura 9: alineación de la familia de GH62: aminoácidos.

    Figura 10: ADNc de axe2 (SEC Id No. 14)

    Figura 12: alineación de axe2Miembro de la familia CE5 Axe2 es un miembro de la familia 5 de carbohidrato esterasas (CE5). Seprevé que tiene una secuencia señal N-terminal de 21 aminoácidos.Presenta un potencial sitio de unión al ancla de GPI en el aminoácidonúmero 274, correspondiente al residuo de serina en la posición 291 en

    la alineación (Undenfriend, S. y K. Kodukula, 1995. Prediction of 0 site in nascent precursor of glycophosphatidylinositol proteína.Methods in Enzymology, 250: 57-82)

    FIGURA 13: transferencia Northern

    FIGURA 15

    FIGURA 17

    FIGURA 19