JP4769724B2 - 新規トリコデルマ(Trichoderma)遺伝子 - Google Patents
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Description
本出願は、2003年5月29日に提出されたU.S.仮出願 No.60/474,411、タイトル、「新規トリコデルマ遺伝子」、Foreman et al. 及び、2003年6月3日に提出されたU.S.仮出願 No.60/475,826、タイトル、「新規トリコデルマ遺伝子」、Foreman et al.に対し優先権を主張する。
この研究の一部は、米国エネルギー省との主契約番号DE-AC36-99GO10337の下、再生可能エネルギー研究所との下請け契約番号ZCO-30017-01により資金提供されたものである。従って、米国政府は本発明について一定の権利を有する。
本明細書では4の遺伝子を開示する。すなわち、セルロース結合ドメインを含むタンパク質をエンコードしている2の遺伝子、1のアラビノフラノシダーゼおよび1のアセチルキシランエステラーゼである。本明細書では、これらの遺伝子から推定されるタンパク質および新規タンパク質を含む組成物も開示する。これらの組成物は特に、布製品、洗剤、バイオマス転換、飼料および食料、並びに、パルプおよび製紙産業において有用である。この遺伝子は、糸状菌、トリコデルマレーシ(Tricodema reesei)(ハイポクレアジェコリーナ(Hypocrea jecorina)とも言う。これらの語は、本明細書では互換的に用いる。)から単離される。
本明細書で提供される新規な遺伝子を、cip1、cip2、axe2およびabf2と呼ぶ。本明細書では、新規遺伝子によりエンコードされる遺伝子産物も提供する。少なくとも2の遺伝子を、セルラーゼファミリーの遺伝子を用いて共発現させる。
本発明の第一の側面は、本発明のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関係する。
本発明の第1の側面は、本発明のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関係する。
本発明の第1の側面は、本発明のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関係する。
本発明は、以下の定義および実施例を参照することによって、詳細に説明される。本明細書で引用する、すべての配列を含んだ、特許、及び、文献は、参照により本明細書に援用する。
2つ以上の配列間の「同一性%」を決定するために選択された配列の好ましいアラインメントは例えば、MacVectorバージョン6.5のCLUSTAL-Wプログラムを用いて実行し、10.0のオープンギャップペナルティ、0.1の延長ギャップペナルティ及びBLOSUM30類似マトリックス等の初期値パラメーターを用いて操作する。
糸状菌はすべて真菌類及び卵菌類に再分類される。糸状菌は、菌糸の伸長と偏好気性である炭素代謝による栄養生長を伴う、キチン、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類から構成されている細胞壁を持っている栄養菌糸によって特徴付けられている。
1つの実施態様において、本発明は糸状菌の中で機能的するプロモータの制御下で新規遺伝子を発現することを提供する。それゆえ、本発明は、組み換え遺伝子の分野の既存技術を用いる。本発明に用いる一般的方法が開示されている基本テキストには、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989);Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 及びAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology(1994)がある。
新規タンパク質をエンコードしているDNA配列を単離するために用いる方法は、相同なDNAプローブを用いたcDNA及び/又はゲノムライブラリーのスクリーニング及び新規タンパク質に対する活性測定又は抗体を用いた発現のスクリーニングを含め、この技術分野においてよく知られているが、これらに限られない。これらの方法のいくつかは、Sambrook, et al. 又は in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. Ausubel, et al., ed. Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1987) ("Ausubel")に記載されている。
新規タンパク質をエンコードする天然のまたは合成のポリヌクレオチドフラグメントは、糸状菌又は酵母菌細胞に導入されることが可能で、複製することができる非相同核酸構築体又はベクターに組み込まれる。ここで開示しているこのベクターと方法は、新規タンパク質を発現する宿主細胞に用いることに適している。導入される細胞の中で複製され、成長できる限り、どのようなベクターでも使用される。数多くの適したベクター及びプロモーターは本技術分野において知られており、商業的に入手可能である。クローニング及び発現ベクターはSambrook et al., 1989、Ausubel FM et al., 1989、 及びStrathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1981において開示されており、それらは明示的に参照によってここに組み込まれる。細菌(糸状菌)に対する適切な発現ベクターは、van den Hondel, C. A. M. J.J.et al. (1991) In: Bennett, J. W. and Lasure, L.L.(eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp.396-428に記載されている。適切なDNAシーケンスは、さまざまな処置によって、プラスミドまたはベクター(「ベクター」としてここに集合的に参照される)に挿入される。一般的に、DNAシーケンスは標準的な操作法によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような処置と関連したサブクローニング処置は、当業者に良く知られている。
本発明では、親糸状菌種の例は、トリコデルマ属(Trichoderma)、例えば、トリコデル マレーシ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ ビリデ(Trichoderma viride)、トリコデルマ コニンギ(Trichoderma koningii);ペニシリウム属(Penicillium sp.)、フミコーラ インソレンス(Humicola insolens)を含むフミコーラ属(Humicola sp.)、アスペルギウス属(Aspergillus sp.)、クリソスポリウム属(Chrysosporium sp.)、フサリウム属( Fusarium sp. )ハイポクレア属(Hypocrea sp.)及び エメリセラ属(Emericella sp.)を含むがそれらに限られない。本明細書で用いる「トリコデルマ(Trichoderma)」又は「トリコデルマ属(Trichoderma sp.)」の語は、以前よりトリコデルマと分類されているものと、近年トリコデルマと分類されうようになった系統を含む。
必要とされる特定の発現方法を使用いずに、新規タンパク質を表現するために、本発明の方法は使用細胞に依存する。
他の実施態様においては、この系統はタンパク質の過剰発現に有用であるトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)を含む。例えば、Sheir- Neiss, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 46-53 (1984)に記載のRL-P37は多量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。RL-P37と機能的に同等な種はトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)系統RUT-C30(ATCC No.56765)及びQM9414(ATCC No.26921)を含む。これらの系統もまた、新規タンパク質を過剰発現することについて有用であるということが予測される。
新規タンパク質エンコーディング核酸構築体によって変換している細胞系による新規タンパク質の表現を評価するための検定が、タンパク質レベル、RNAレベルで、または新規タンパク質の活性、および/または生産に対する機能的な生物検定を利用することにより行うことができる。
細胞培養中に生産された新規タンパク質は培地の中に分泌され、そして、例えば細胞培地から不要な成分を取り除くことにより、精製、又は、単離される。しかし、場合によっては、分泌されずに、細胞内で形成された新規タンパク質は細胞溶解産物から回収しなければならない。かかる場合には、新規タンパク質は、当業者によって通常用いられている技術を利用して、細胞から精製される。例えば、アフィニティークロマトグラフィー (Tilbeurghetal., FEBS Lett. 16: 215,1984), 高い分解パワーを有する原料を使ったイオン交換をも含めた、イオン交換クロマトグラフ法 (Goyal et al., Bioresource Technol. 36: 37-50,1991 ; Fliess et al., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 314-318,1983 ; Bhikhabhai et al., J. Appl. Biochem. 6: 336-345,1984 ; Ellouz et al., J. Chromatography 396: 307-317,1987)、(Medve et al., J. Chromatography A 808: 153-165,1998)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(Tomaz and Queiroz, J. Chromatography A 865: 123-128,1999)、 及び二相仕切り(two-phase partitioning)(Brumbauer, et al., Bioseparation 7: 287-295,1999)などかあるが、これらに限定されるものではない。
A. アセチルキシランエステラーゼ(axe2)
AXE2タンパク質は、299アミノ酸を有し、約30キロダルトンの分子量であると推定される。この推定されるタンパク質は、15の強塩基(+)アミノ酸(K、R)、28の強酸(-)アミノ酸(D、E)、91の疎水性アミノ酸(A、I、L、W、V)及び108の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)から構成されている。AXE2は、4.5の等電点及びpH 7.0で、-12.9の電荷を有すると推定される。
ABF2タンパク質は、322アミノ酸を有し、約35キロダルトンの分子量であると推定される。この推定されるタンパク質は、17の強塩基(+)アミノ酸(K、R)、18の強酸(-)アミノ酸(D、E)、107の疎水性アミノ酸(A、I、L、W、V)及び118の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)から構成されている。ABF2は、6.4の等電点及びpH7.0で、-0.9の電荷を有すると推定される。
CIP1タンパク質は、316アミノ酸を有し、約33キロダルトンの分子量であると推定される。この推定されるタンパク質は、14の強塩基(+)アミノ酸(K、R)、23の強酸(-)アミノ酸(D,E)、86の疎水性アミノ酸(A、I、L、W、V)及び116の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)から構成されている。CIP1は、4.8の等電点及びpH7.0で、-8.3の電荷を有すると推定される。
コア;ストレプトマイセスコエリカラー(Streptmyces coelicolor)から分泌された成熟体と42%相同性を有する、
リンカー;トリコデルマレーシ(T.ressei)EG4と48%の相同性を有する、
CBD;トリコデルマレーシ(T.ressei)CBH1のCBDと100%の相同性を有する。
CIP2タンパク質は、460アミノ酸を有し、約48キロダルトンの分子量であると推定される。この推定されるタンパク質は、24の強塩基(+)アミノ酸(K、R)、24の強酸(-)アミノ酸(D、E)、160の疎水性アミノ酸(A、I、L、W、V)及び165の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)から構成されている。CIP2は、7.1の等電点及びpH7.0で、0.27の電荷を有すると推定される。
本発明の遺伝子は、各種製品に用いることができる。
配列番号14(図10参照)によりエンコードされるアセチルキシランエステラーゼは、キシラナーゼと組み合わせて使用されたときに、キシランベースの基質をキシロースに加水分解することが望ましい製品において、相乗効果を示すことが予想される。この主な、キシラン加水分解は、アセチル側基を切り離すアセチルキシランエステラーゼの能力により高められる。それゆえ、各種基質内に存在するキシラン鎖に、より高いキシラナーゼ活性を付与する。
配列番号1及び/又は2によりエンコードされるCIP1(図1及び図2参照)及び、配列番号6でエンコードされるCIP2(図4参照)を含むCBDは、バイオマス転換に用いられる、あるいは、この遺伝子を有するCBDを利用する他の製品に用いるのが適切である。従って、この遺伝子産物は、洗剤、布製品、バイオマス転換、食品及び飼料製品及びパルプ及び製紙工業等の製品中に用途が見出される。
配列番号10(図7参照)によりエンコードされるアラビノフラノシダーゼは、キシラナーゼと組み合わせて使用されたときに、キシランベースの基質をキシロースに加水分解することが望ましい製品において、相乗効果を示すことが予想される。このキシラン加水分解能は、アラビノース側基を切り離すアルファアラビノキシラーゼの能力により高められる。それゆえ、各種基質内に存在するキシラン鎖に、より高いキシラナーゼ活性を付与する。
以下の実施例は、説明するために提供し、請求項にかかる発明を限定するものではない。
トリコデルマレーシ(T.reessi)(ATCC 13631)は、成長条件特有のmRNAプロファイルを発現する菌糸体を成長させる条件下で育成した。このRANはその後、単離され、収集して、cDNAライブラリーを構築した。
すべての培養物は、酵母抽出/グルコース(YEG)液体培地を用いて28℃で一晩育成した。他の方法で示さない限り、培養物は以下で示す条件下で、所定の期間培養した:
実験1
A. Volge’s + 2%アビセル、3日間及び6日間、
B. Volge’s + 2%ソルカフルコ(solkaflco)、3日間及び6日間、
C. Volge’s + 2%小麦ブラン、6日間
D. Volge’s + 2%ビートパルプ、6日間
E. 小麦ブラン上の固体培養(15g小麦ブラン、1gプロフロ、1gソルカフルコ、30ml水)、6日間
F. ビートパルプ上の固体培養(15gビートパルプ、1gプロフロ、1gソルカフルコ、30ml水)、9日間
実験2
A. Volge’s + 2%グルコース、24時間
B. Volge’s + 2%ラクトース、24時間
C. Volge’s + 2%キシロース、24時間
D. Volge’s + 2%フルクトース、24時間
E. Volge’s + 2%マルトース、24時間
F. Volge’s w/o 任意の糖添加、24時間
G. Volge’s w/o 任意の窒素添加、24時間
H. Volge’s + 2%小麦ブラン、3日間
I. Volge’s + 2%小麦ブラン、6日間
J. Volge’s + 2%ソルカフルコ、3日間
K. Volge’s + 2%ソルカフルコ、6日間
L. Volge’s + 2%アビセル、3日間
M. Volge’s + 2%アビセル、6日間
N. Volge’s + 2%リン酸膨張セルロース、3日間
O. 固形状態(15g小麦ブラン、1gプロフロ、1gソルカフルコ、30ml水)、6日間
P. YEG、42℃で1.5時間(熱刺激)
Q. YEG、20mM DTT、1.5時間(還元ストレス)
R. YEG、室温の閉鎖コンテナで1.5時間静置(無酸素化)
培地調製物
酵母抽出/グルコース培地-1リットル
1. 脱イオン水;1000ml
2. 酵母抽出物;5g
3. グルコース;20g
Vogel’s 溶液-1リットル
1. 50xVogel’s貯蔵溶液;25ml
2. 脱イオン水;975ml
3. 高圧蒸気滅菌
50xVogel’s貯蔵溶液-1リットル
1. クエン酸ナトリウム;150g
2. KH2PO4;250g
3. NH4NO3;100g
4. MgSO4 *7H2O;10g
5. CaCl2 *2H2O;5g
6. 微量元素溶液;5ml
7. ビオチン溶液;2.5ml
8. 脱イオン水でリットルに調製
微量元素溶液 1リットル
1. クエン酸;50g
2. ZnSO4 *7H2O;50g
3. Fe(NH4)SO4 *6H2O;10g
4. CuSO4 *5H2O;2.5g
5. MnSO4 *4H2O;0.5g
6. H3BO3;0.5g
7. NaMoO4*2H2O;0.5g
8. 脱イオン水でリットルに調製
ビオチン溶液-1リットル
1. d-ビオチン;0.1g
2. 脱イオン水でリットルに調製
トータルRNAを、ライフテクノロジーズ(Life TechnologiesTM)トリゾール(TRIZOL)(登録商標)試薬(カタログNo.15596-026)用いて単離した。単離するRNAに応じて、ここに記載されている方法にわずかな変更を加えた。違った形でしめさない限り、この方法は、15℃から30℃の間の温度で行う。
1Aの実験1に記載の各成長条件で得られたRNAを、等量プールして得た、総量2mgのサンプルを、cDNAライブラリーを構築するために、ライフテクノロジーズ(Life Life Technologies)(ロックビル、ランド;現インビトロジェン)へ輸送した。同様に、1Aの実験2で述べたサンプルも同様にプールし、cDNAライブラリーを構築するために、ライフテクノロジーズ(Life Technology)(ロックビル、ランド;現インビトロジェン)へ輸送した。cDNAライブラリーは、当技術分野の通常の手段を用いて作成される。以下に用いられる工程の概要を説明する。
単離トリコデルマレーシ(T. reesei)mRNA由来のcDNAの第一鎖を生成するための反応成分を、1.5mlのミクロ遠心チューブに入れ、氷上に置く。この反応成分の混合物50μl中の成分を以下に示す:
50mM トリス-HCl(pH8.3)
75mM KCL
3mM MgCl2
10mM DTT
dATP、dCTP、dGTP及びTTPを500μMづつ
50μg/オリゴ(dT)12-18
100μg/ml ポリ(A)RNA(トリコデルマレーシ(T. reesei))
10,000単位/ml モロニーげっ歯類白血病ウイルス(M-MLV)逆転写酵素
この逆転写酵素を最後に添加し、混合し、反応を開始する。任意で、サンプルの10μlを、チューブから採取し、1μCi[α-32P]dCTPトレーサーを含むチューブに移す。ここれらのチューブは、37℃で1時間インキュベートする。このチューブをインキュベーションの後、氷上に戻し、0.25M Na2EDTA(pH7.5)を1μl添加することにより、反応を停止する。40μlの反応混合物を、cDNAの第二鎖を構築するために用いる。
二本鎖DNAは、リンカーが添加される、cDNAを生成する手順を用いて調製する。
25mM トリス-HCl(pH8.3)
100mM KCl
10mM(NH4)2SO4
5mM MgCl2
dATP、dCTP(10μCiの[α-32P]dCTP を含む)、dGTP、dTTPを250μMづつ
0.15mM NAD
5mM DTT
250U/ml DNAポリメラーゼI
8.5U/ml Rnase I
8.5U/ml Rnase H
30U/ml DNAリガーゼ
成分を混合するために、このチューブをボルテックスで激しく混合し、16℃で12時間インキュベートした。その後、このチューブを氷上に置き、25μlのNa2EDTA(pH7.5)を添加した。
以下の原理を、cip1遺伝子を検出するために用いる。1)アマシャム(Amersham)より市販されている高結合膜上でライブラリーを成長させる。2)細胞を溶解し、DNAライブラリーを膜上に固定する。3)プローブ固有の遺伝子でブロットをハイブリダイズする。4)2回ブロットをハイブリダイズさせるが、このときは、CBMプローブ混合物を使用する。5)CBMスポットから特定の遺伝子を除いて、新しいスポットの選択及び解析を行う。
トリコデルマレーシ(T. reesei)由来のcDNAライブラリーを含むセルロースをハイブリダーゼーション試験に用いる。この大腸菌cDNAライブラリーを、十分量のクローンを得るために、アガープレート(20cm×20cm)上に置く。
プローブは、表1で示すプライマーを用いて調製した。このCBMプローブは、既知のトリコデルマレーシ(T. reesei)の炭水化物結合モジュールの配列を用いるように設計されている。Paul Birch, Curr. Genet (1998) 33; 70-76参照のこと。簡単に言うと、CBMプローブを調製するために、トータルトリコデルマレーシ(T. reesei)QM6AゲノムDNA(100ng/50μl)を、10μMの1μl/50μl容量のFRG164と、100μMの1μl/50μl容量のFRG165、FRG166、あるいはFRG167と混合する。FRG166は増幅されなかた(Serコドンは、AGY)が、FRG167は増幅された(SerコドンはAGY)。従って、FRG167プライマーは増幅に用いることができる。このフラグメントは、プライマーとしてFRG165で生産されるフラグメントと混合される。この2の分離されたフラグメントは、トリコデルマレーシ(T. reesei)中に存在するCBM配列の混合物が含まれ、CBMプローブとして使用される。要約すれば、CBMプローブは、FRG164+FRG165と、FRG164+FRG167と、2.5単位の白金TAQポリメラーゼと、5μlの10xTAQ緩衝液と、1.5μlの10×TAQ緩衝液と、1.5μlのMgCl2と、及び、1μlの10mM dNTPの混合物を用いてたPCRにより得られたフラグメントの混合により調製される。このPCRは以下の手順で行われた:
1サイクル:98℃、1分
10サイクル:94℃、1分、65-50℃、1.5分、72℃で1分、
25サイクル:94℃、1分、50℃、1.5分、72℃で1分、
15℃で反応を停止させ、保存。
マイクロタイタープレートから採取されたコロニーサンプルは、20x20cmの
ナイロンメンブランフィルター(高結合+(RPN.82B)、アマシャム(Amersham))上にスポットし、2xTY(100μg/mlアンピシリン)の寒天上で、37℃で一晩平板培養を行った。2回の繰り返し実験において、20x20cmのメンブレンは、4600コロニーを含んでいた。平板培養は、その後、遺伝子特有の配列又はCBM配列のいずれかが存在するかどうかについて、製造元の取り扱い説明書に従った、ECLにより処理された。
無記名のcDNAコロニーの部分的な配列決定は、遺伝子同定のための幅広い技術である。部分的なcDNA配列又は発現された配列タグ(ESTs)は、セルロース分解能を有する重要な遺伝子の同定に対する可能性を有している。cDNAの挿入を含むプラスミドは、実施例1で説明したライブラリーのコロニーから単離され、cDNA挿入のシングルパス(single pass)5’配列は、ノースカロライナ州立大学(糸状菌ゲノム研究室(Fungal Genomics Laboratory)、 College of Agriculture and Life Sciences, ローリー(Raleigh)、ノースカロライナ(NC))で、約18,000コロニーから得られた。このcDNA配列は、cDNAを挿入する5’末端に隣接しているベクター配列に対応するプライマーを用いて得られた。個々に読まれた配列を、比較した。重複セグメントは、2以上のリード(読み)から成る2101のコンティグ配列から構成される。3010の個々の読みは、データセットの中他の読み(リード)を重複する有意配列を有していなかった。ESTセットの予測されるコード領域は、BLAST(Altschul et al. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410参照のこと。)を用いて、全ての利用可能な配列データベースと比較した。
同定されたエンドグルカナーゼは、セルロース、ソホロース、又はラクトースを含む培地上で育成する間に誘発される。バイオマス分解能力が推定される新規なポリペプチド、CIP1及びCIP2においても、同様に調節されているかどうかを調べるために、我々は、ノザンブロットによるこれらの遺伝子産物のmRNAレベルを調べた。QM6a;トリコデルマレーシ(T. reesei)の野生型単離体、及び、RL-P37;セルラーゼ分解酵素の生産を高めるように選択された系統の、異なる2系統が用いられた。これらの系統からの個々の菌糸体を、唯一の炭素源として、グルコース、結晶セルロース(アビセル)又はグリセロール、あるいは、1mMソホロースを添加したグリセロールのいずれかを有する最小培地を含むフラスコ内で育成した。
トリコデルマレーシ(T. reesei)系統は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture collection)より入手した。
cip1及びcip2の発現レベルを調べるために、マイクロアレイを用いた。それぞれのESTsの特異配列を有する60bpオリゴヌクレオチドは対応するmRNAの余剰分量を調べるために、設計されている。このヌクレオチドのプローブを、アライントテクノロジーズ(Agilent Technologies)、パロアルト、カリフォルニア)によるHughes et al. (2001) NatureBiotechnol 19: 342-347に開示されている手順を用いて配列させた。全ての実験において、実施されるマイクロアレイは、異なるサンプル間の相対的な発現レベルを検出するために用いている。
この実施例は、適切な発現宿主の構築を説明する。より具体的には、この実験の記載は、主要なセルラーゼ遺伝子を欠いたトリコデルマ発現宿主の構築に関するものである。この方法は、例えば、US Patents No. 5,650,322,5, 874,276 及び 6,286,196に明確に説明されている。
プラスミドDNAを用いた形質転換RL-P37系統を調製するために、pyr4遺伝子中にヌル突然変異を有する誘導体を単離することが必要である。
CBH1タンパク質をエンコードするcbh1遺伝子は、この遺伝子の公知の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによりRL-P37系統のゲノムDNAからクローンされた(Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., Myambo, K. and Innis, M. (1983) Biotechnology 1: 691-696)。このcbh1遺伝子は、5.6kb Pstlフラグメント上に存在しており、pUC4K(ファルマシア)のカナマイシン耐性遺伝子を置き換える、Pstl部位に挿入した。得られたプラスミドである、pUC4K::cbh1を、HindIIIで消化し、より大きなフラグメントを単離し、pUC4K::cbh1△H/HKに結合する。この手順により、cbh1コード配列全体及び5’の約1.2kb及び3’の約1.5kbのフランキング領域を排除する。約1kbのフランキングDNAが元のPstlフラグメントのいずれかの末端に残こる。
GC69細胞系統の菌糸体から単離されたプロトプラストは、Smith et al 1991に概説されている方法を用いて、EcoR1で消化されたp△CBH1pry4を用いて形質転換させた。安定な形質転換体が得られ、以下で説明するようにcbh1遺伝子が欠失しているものを同定した。
cbh1形質転換体(P37P△CBHI)の胞子をFOAを含む培地にまく。この形質転換体のpry4欠失誘導体は、上のセクション1で説明した方法を用いて得た。このpry4欠失系統を、P37P△CBH1pyr-26と称した。サザン解析の結果は、P37P△CBH1pyr-26系統に、欠失が起こっていることを示した。この欠失は、P37P△CBH1系統中にある、cbh1に取り込まれたpry4だけでなく、もともとクローンされているゲノムDNAの6.5kbのPstlフラグメントの域を超えたところに位置しているcbh1由来のフランキングDANも、完全に除去していた。
CBHIIタンパク質をエンコードしているトリコデルマレーシ(T. reesei)cbh2遺伝子は、4.1kbのゲノムDNAのEcoRIフラグメントとしてクローンされている(Chen et al., 1987, Biotechnology 5: 274-278)。この4.1kbフラグメントをpUC4XLのEcoRI部位の間に挿入した。このプラスミドは、ここで示す、EcoRl、BamHl、Sacl、Smal、 Hindlil、 Xhol、 Bglll、Clal、 Bglll、Xhol、Hindlll、Smal、Sacl、BamHl、EcoRのように配列されている制限エンドヌクレアーゼ部位の対象パターンを有するマルチクローニング部位を含む、pUCI誘導体である(ジェネンカーインターナショナルの、R.M.Berkerにより構築された)。このプラスミドpP△CBHIIを、HindIII部位(CBHIIの転写開始部位の74bp3’にある)及びClal部位(CBHIIの最終コドンの265bpの3’にある)の間にある、cbh2クローンの1.7kdの中央領域を除去し、以下の方法で得られたトリコデルマレーシ(T. reesei)pyr4遺伝子を含む、1.6kdのHindIII-ClalDNAフラグメントを置き換えることにより構築した。このトリコデルマレーシ(T. reesei)pyr4遺伝子を、1.6kbのNhel-Sphlフラグメント上のpTpyr2から取り除き、pUC219(Bglll、Clal 及びXholの制限部位を含むように伸長させた多重クローニング部位を拡張し、pUC119から誘導したもの;Wilson etal., 1989, Gene 77: 69-78)のSphl及びXbal部位の間に、p219M(Smith etal., 1991, Curr. Genet. 19: 27-33)を作るために挿入した。このpyr4遺伝子を、pUC219多重クローニング部位から誘導し、一方の端に7bpのDNAを有し、他の端に、6bpのDNAを有するHindIIIClalフラグメントとして除去し、プラスミドpP△CBHIIを形成するためにcbh2遺伝子のHindIIIとClal部位に挿入した。
上記3で概説する方法に従って、P37P△CBHpyr-26系統のプロトプラストを作成し、EcoRIで消化したpP△CBHIIを用いて形質転換した。安定な形質転換体を、振とうフラスコ内で培養し、培養物の上清中にあるタンパク質を等電点電気泳動で調べた。いかなるCBHII及びCBHIタンパク質も生成しない、1の形質転換体(P37P4△△CBH67と称す)が同定された。
cbh1とcbh2を欠失させた形質転換体(P37P△△CBH67)の胞子をFOAを含む培地にまく。この形質転換体のpry4欠失誘導体は、上のセクション1で説明した方法を用いて得た。このpry4欠失系統は、P37P△△CBH67Pyr-1と称した。サザン解析の結果は、P37P△△CBH67Pyr-1系統に、欠失が起こっていることを示した。この欠失は、P37P△△CBH67系統中にある、cbh2の遺伝子座に取り込まれたpry4だけでなく、もともとクローンされているゲノムDNAの4.1kbのEcoRIフラグメントの域を超えたところに位置しているcbh2由来のフランキングDANも、完全に除去していた。Pyr4遺伝子のいずれか一方の端にあった、pUC219多重クローニング部位由来の短い(6bp及び7bp)DNAフラグメントも、この欠失によりゲノムより除去されていた。
EGII(EGIIIと示す場合もある)をエンコードするgel2遺伝子は、トリコデルマレーシ(T. reesei)よりクローンされ、DNA配列は公知である(Saloheimo etal., 1988, Gene 63: 11- 21)。我々は、pUC219のPstl及びXhol部位の間に挿入される約4kdのPstl-XholゲノムDNAフラグメントとして、RL-P37系統から遺伝子を得た。この、pTpyr2から得られたゲノムDNAの2.7kbのSalフラグメント上にあるトリコデルマレーシ(T. reesei)pyr4遺伝子は、プラスミドpEGII::P-1を作るためにEGIIコード配列内に挿入した。このことにより、EGIIコード配列の阻害が起こるが、配列の欠失はおこらない。このプラスミドpEGII::P-1は、pUC219の多重クローニング部位由来の5pbの端部及び16pbの他方の端部を除いて、トリコデルマレーシ(T. reesei)由来の直鎖DNAフラグメントを生産するためにHidnIII及びBanHIで消化する。
P37P△△CBH67Pyr-1を、HindIII及びBanHIで消化したpEGII::P-1で形質転換し、安定な形質転換体を選択した。トータルDNAを、形質転換体から単離し、サザン解析を用いて、pyr4及びegl2遺伝子を含むプラスミドDNAがegl2の遺伝子座に取り込まれ、その結果EGIIコード配列が阻害されている系統を同定した。サザン解析では、egl2遺伝子を含むトリコデルマレーシ(T. reesei)DNAの約4kbのPst1フラグメントをプローブとして用いた。P37P△△67P-1系統から単離されたDNAが、Pst1で消化されると、サザン解析において、egl2の遺伝子座は、オートラジオグラフィーでは、単一の4kbのバンドとして確認される。しかしながら、egl2遺伝子が阻害された形質転換体では、このバンドは、消失しており、予想される2のバンドに置き換わっていた。このDNAをBglII又はEcoRVで消化すると、egl2遺伝子に対応するバンドのサイズは、形質転換されていないP37P△△67P-1系統におけるegl2阻害の形質転換体の間の、約2.7kd(挿入されたpyr4フラグメントのサイズ)まで増加した。cbh1、cbh2、及びegl2遺伝子を欠く後者の形質転換体は、B31系統とされた。さらにサザン解析で、pEGII::P-1のpUC DNAフラグメントがこの系統に取り込まれないことを確認した。
cbh1、cbh2、及びegl2遺伝子を欠いた形質転換体(B31)の胞子をFOAを含む培地にまく。この形質転換体のpry4欠失誘導体は、上のセクション1で説明した方法を用いて得た。このpry4欠失系統は、B31P6と称した。サザン解析の結果は、B31P6系統に、欠失が起こっていることを示した。この欠失は、B31系統のegl2の遺伝子座に組み込まれたpyr4遺伝子の大部分を除去するものであり、egl2遺伝子座のフランキングDNA内へ伸長するものではなかった。
egl1遺伝子はクローンされており、この遺伝子のDNA配列は公知である(Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263; van Arsdell et al., 1987, Bio/technology 5: 60-64)。我々は、トリコデルマレーシ(T. reesei)RL-P37系統由来のこの遺伝子を、pUCEGIを得るための、pUC100(BglII、Clal、及びXholのに対する制限部位を付加した多重クローニング部位へのオリゴヌクレオチド挿入によるpUC18の誘導体)のHindIII部に挿入されたゲノムDNAのHindIIIフラグメントとして入手した。EGIコード配列の中央に近い位置から、このコード配列の3’末端を越えた位置に広がっている約1kbのEcoRVフラグメントを除去し、pTPyr2から得られたpyr4遺伝子を含むトリコデルマレーシ(T. reesei)DNAの3.5kbのScalフラグメントで置き換えた。得られたプラスミドを、pP△EGIとした。
egl1フランキング領域のPyr4遺伝子の定位のみが異なる2のpP△EG1を構築した。HindIIIで消化したこの2のプラスミドを用いて、B31P6系統を形質転換した。トータルRNAを安定な形質転換体から抽出し、HindIIIで消化し、サザン解析を行った。プローブは、ラジオラベルしたpUCEGIを用いた。欠失していないegl1遺伝子を表すB31P6系統由来のDNAの4.2kbフラグメントが観察された。形質転換体(1A52系統)では、4.2kbのバンドは検出されず、約6.8kbのフラグメントに置き換わっていた。このことは、pP△EG1由来のより大きいHindIIIフラグメントが予測されたとおり、egl1の遺伝子座に取り込まれ、EG1コード配列の部分を欠失させ、この位置にPyr4が挿入されたことを示している。サザン解析のプローブとして,pUCプラスミドを用いることにより、pUC DNAフラグメントが、1A52系統に取り込まれないことを確認した。
この実験は、所望の遺伝子を発現するための基本的なベクターの構築を説明する。
1. トリコデルマレーシ(T. reesei)cbh1遺伝子のプロモーター領域由来のDNA2.2bpセグメント
2. クロラムフェニコール耐性遺伝子(CmR)及びccdB遺伝子に隣接している端部のいずれかに、attR1及びattR2組換え部位を含む、インビトロジェンより市販されている1.7kbのゲートウェイリーディングフレームAカセット
3. トリコデルマレーシ(T. reesei)cbh1遺伝子のターミネーター領域由来の36bpのDNAセグメント
4. プロモーター及びターミネーターを含むアスペルギウスニヂュランス(Aspergillus nidulans)amdS遺伝子を含む、2.7kbのDNAフラグメント。
この実施例は、cip1の発現ベクターの構築について説明する。
この実施例は、cip2の発現ベクターの構築について説明する。
この実施例は、abf2の発現ベクターの構築について説明する。
この実施例は、axe2の発現ベクターの構築について説明する。
NSP112 (後ろ方向): 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACAGCATCTGAGACACCGCC-3'.であった。前方向及び後ろ向きプライマーの両者は、5’末端にaxe2遺伝子には対応していないが、pDONR201ベクター内クローニングに必要なattB1を示す29の付加的なヌクレオチドを含んでいる。axe2のオープンリーディングフレームを増幅するPCR条件は、以下である。工程1:95℃で2分、工程2:95℃で30秒、工程3:68℃で30秒、工程4:72℃で3分。工程2,3及び4は、29回繰り返す。工程5:72℃、1分。
この実施例は、発現構築体を用いたトリコデルマレーシ(T. reesei)系統の形質転換について説明する。cip1、cip2、及びabf2オープンリディングフレームを有するpTrex3gベクターを用いたトリコデルマレーシ(T. reesei)のバイオリスティック(Biolistic)形質転換を、以下で概説する方法を用いて得た。
Cip1タンパク質を、培養物の上清から、バイオキャドスプリント(BioCAD Sprint )(プレセプティブバイオシステムズ、ケンブリッジ、マサチューセッツ(Perseptive Biosystems, Cambridge, MA)) クロマトグラフ装置を用いて、以下の手順に従い精製した。Poros 20 HP2 10カラムは、プレセプティブバイオシステムズ(Perseptive Biosystems) (ケンブリッジ、マサチューセッツ(Cambridge, MA))から入手した。この疎水相互クロマトグラフィーカラムは、5カラム容量の0.5M (NH4)2SO4/0. 02M NaH2PO4、 pH 6.80で平衡化した。上清サンプル中のタンパク質濃度は、バイオラド(Bio-Rad )タンパク質解析キットを用いて測定した。カラム容量の20%(20mg/ml)のサンプルを、カラムに付加した。このカラムを10カラム容量の0. 5M (NH4)2SO4 / 0. 02M NaH2PO4、pH 6.80で洗浄した。Cip1タンパク質は、0.02M NaH2PO4、pH 6.80を5カラム容量流したところで溶出した。このCip1タンパク質は、約70%精製されていた。この溶出物を、表記上5000の分子量のろ過限界を有する、遠心ろ過ユニット(バイオマックス(Biomax5K) ;ミリポア(Millipore))を用いた、限外ろ過方法により、13mlに濃縮した。ゲルろ過カラム(カラムは ショウデックス(Superdex 75) アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences))をカラム容量の2倍の0.02M NaH2PO4、pH 6.80で平衡化し、溶出濃縮物を付加した。分画を収集し、SDS-PAGEを用いてタンパク質の分子量を解析し、p-ニトロフェニル-p-D-デロビオシド (p-NPC)に対する活性について調べた。このときに用いたタンパク質は、95%精製されていた。
Claims (25)
- セルロース結合活性を有するタンパク質をエンコードしている単離ポリヌクレオチドであって、
(b)配列番号5で示すアミノ酸配列と、少なくとも90%の配列が同一であるCIP1ポリペプチドをエンコードしている核酸配列、
(c)配列番号5で示すアミノ酸配列と、少なくとも95%の配列が同一であるCIP1ポリペプチドをエンコードしている核酸配列、
(d)配列番号5で示すアミノ酸配列からなるCIP1ポリペプチドをエンコードしている核酸配列、
(e)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも95%の配列が同一であるCIP1ポリペプチドをエンコードしている核酸配列、
(f)配列番号3で示すアミノ酸配からなるCIP1ポリペプチドをエンコードしている核酸配列、又は、
(g)配列番号2で示す核酸配列、
から成る群より選択されることを特徴とする、単離ポリヌクレオチド。 - ポリヌクレオチドがRNA分子であることを特徴とする請求項1のポリヌクレオチド。
- 請求項1の単離ポリヌクレオチドであって、酵素がトリコデルマ源由来であることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
- 請求項3の単離ポリヌクレオチドであって、酵素がトリコデルマレーシ由来であることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
- 請求項1乃至4のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含む、発現構築体。
- 請求項5の発現構築体を含むベクター。
- 請求項1の単離ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターで形質転換させた宿主細胞が認識する制御配列に作動可能に結合することを特徴とする、単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項7のベクターで形質転換した宿主細胞。
- 請求項7のベクターで形質転換した宿主細胞。
- 請求項9の宿主細胞であって、宿主細胞が原核生物の細胞であることを特徴とする、宿主細胞。
- 請求項9の宿主細胞であって、宿主細胞が真核生物の細胞であることを特徴とする、宿主細胞。
- 請求項1のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
- 原核生物の細胞であることを特徴とする請求項12の組換え宿主細胞。
- 真核生物の細胞であることを特徴とする請求項12の組換え宿主細胞。
- セルロース結合活性を有する精製されたCIP1ポリペプチドであって、
(b) 配列番号5で示すアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列が同一であるアミノ酸配列、
(c) 配列番号5で示すアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列が同一であるアミノ酸配列、
(d)配列番号5で示すアミノ酸配列、
(e)配列番号3で示すアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列が同一であるアミノ酸配列、及び
(f) 配列番号3で示すアミノ酸配列、
から成る群より選択される配列を含むことを特徴とする、精製されたCIP1ポリペプチド。 - (a)請求項1で定義されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターで安定に形質転換させた宿主細胞を得る工程、
(b)宿主細胞がセルロース結合活性を有する酵素を生産するのに適した環境下で形質転換宿主細胞を培養する工程、及び、
(c) セルロース結合活性を有する酵素を回収する工程
を含む、セルロース結合活性を有する酵素を生産する方法。 - 請求項16の方法であって、前記宿主細胞が、糸状菌又は酵母菌の細胞であることを特徴とする方法。
- 請求項16の方法により調製されたセルロース結合活性を有する精製酵素。
- 配列番号2で定義されるcip1遺伝子の中に、cip1遺伝子を失活させ、CIP1ポリペプチド生産を阻害するための欠失、挿入、又は他の変更を有する、組換え宿主細胞。
- 配列番号5で示す配列を含むCIP1ポリペプチドをエンコードする伝達RNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
CIP1ポリペプチド生産宿主細胞において、前記オリゴヌクレオチドが、CIP1ポリペプチドの生産を減らす又は抑制することを特徴とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 請求項20のアンチセンスオリゴヌクレオチドの宿主細胞が糸状菌であることを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 請求項15のCIP1ポリペプチドを含む洗剤組成物。
- 請求項15のCIP1ポリペプチドを含む食品添加物。
- 請求項15のCIP1ポリペプチドをウッドパルプに接触させる工程を含む、ウッドパルプの処理方法。
- 請求項15のCIP1ポリペプチドをバイオマスに接触させる工程を含む、バイオマスを糖に転換させる方法。
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