WO2014142325A1 - セルラーゼ生産菌の変異株、セルラーゼの製造方法およびセロオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

セルラーゼ生産菌の変異株、セルラーゼの製造方法およびセロオリゴ糖の製造方法 Download PDF

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隆司 山口
洋介 志田
義朗 石井
樹 若山
美郎 今田
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国立大学法人長岡技術科学大学
国際石油開発帝石株式会社
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase

Definitions

  • the present invention relates to a mutant of a cellulase-producing bacterium and a method for producing the same, a method for producing a cellulase using the mutant, and a method for producing a cellooligosaccharide using the cellulase.
  • Cellooligosaccharides are oligosaccharides in which 2 to 6 molecules of glucose are polymerized, and are oligosaccharides having 2 to 6 glucopyranose units and linear ⁇ -1,4-glycosidic bonds. Cellooligosaccharide is expected as a material that can be used in the fields of functional food, energy, feed, chemical industrial products and the like.
  • Non-patent Document 1 a reaction that generates glucose from cellooligosaccharides by the action of ⁇ -glucosidase is included.
  • cellulase is composed of an endoglucanase (hereinafter also abbreviated as EG) that randomly decomposes cellulose, cellobiohydrolase (hereinafter abbreviated as CBH) that releases cellobiose from the end of the cellulose chain, and cellobiose. It is composed of three enzyme activities of ⁇ -glucosidase (hereinafter also abbreviated as BGL) which decomposes to produce two molecules of glucose.
  • EG endoglucanase
  • CBH cellobiohydrolase
  • BGL ⁇ -glucosidase
  • Patent Document 1 cellobiose is removed from cellulose using cellulase from which ⁇ -glucosidase present in cellulase is removed by adsorbing cellulase to a weakly acidic cation exchange resin equilibrated to pH 3.5 to 5.0.
  • a method of selectively generating is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses a method for producing a cellooligosaccharide in which an enzyme component other than ⁇ -glucosidase is adsorbed in advance to cellulose or a cellulose-containing substance, and then enzymatically decomposed.
  • Patent Document 3 a cellulosic raw material is charged into a tubular or column reactor, and a cellulase solution containing cellobiohydrase and containing ⁇ -glucosidase as an impurity is continuously passed from one direction,
  • a method for separating and removing ⁇ -glucosidase from cellulase is described, which comprises selectively separating and removing a fraction containing ⁇ -glucosidase.
  • Patent Document 4 discloses that ⁇ -gluconolactone or gluconic acid, which is an inhibitor of ⁇ -glucosidase, coexists in the cellulose degradation by cellulase. A method for producing cellobiose is described.
  • Patent Document 5 discloses a method in which glucose oxidase coexists in the decomposition of cellulose by cellulase to produce ⁇ -gluconolactone from the produced glucose, and as a result, attempts to suppress ⁇ -glucosidase activity. Are listed.
  • the present invention is a mutant of a cellulase-producing bacterium that produces cellulase that can preferentially produce cellooligosaccharides when cellulooligosaccharides are selectively produced by enzymatic degradation of cellulosic substances in the presence of cellulase, It is an object of the present invention to provide a method for producing the cellulase and a method for producing cellooligosaccharides using the cellulase.
  • the present inventors create a strain in which the major ⁇ -glucosidase, the major cellobiohydrolase gene and the major endoglucanase gene of cellulase-producing bacteria are genetically engineered, and use the cellulase produced by the strain.
  • the major ⁇ -glucosidase, the major cellobiohydrolase gene and the major endoglucanase gene of cellulase-producing bacteria are genetically engineered, and use the cellulase produced by the strain.
  • the present invention is as follows. 1. A mutant of a cellulase-producing bacterium in which the cellobiohydrolase gene and ⁇ -glucosidase gene are disrupted. 2. 2. The cellobiohydrolase gene is a gene belonging to a carbohydrate hydrolase family (GLY) Family 6 (GHF) and a gene belonging to GHF7, and the ⁇ -glucosidase gene is a gene belonging to GHF1 or GHF3 Mutants. 3. 3. The mutant according to item 2 above, wherein the ⁇ -glucosidase gene is a gene belonging to GHF3. 4). Further, the mutant strain according to item 1, wherein the endoglucanase gene is disrupted. 5. 5.
  • the ⁇ -glucosidase gene and the cellobiohydrolase gene have been conventionally considered to be essential for the survival of cellulase-producing bacteria, and it is difficult to obtain cellulase-producing bacteria when these genes are destroyed. It was done. In the present invention, it has been found that even if the ⁇ -glucosidase gene and the cellobiohydrolase gene are disrupted, the cellulase-producing bacterium can survive and grow. The present inventors have found that sugar can be produced efficiently and easily with high selectivity.
  • the ⁇ -glucosidase activity of the cellulase produced by the mutant is remarkably reduced due to the disruption of the main ⁇ -glucosidase gene.
  • the main cellobiohydrolase gene is disrupted in the mutant strain, it is possible to produce cellooligosaccharides of three or more sugars with high selectivity by using cellulase produced by the mutant strain.
  • the mutant strain is capable of producing more than trisaccharide cellooligosaccharides with a higher selectivity by disrupting the major endoglucanase gene. can do.
  • the mutant of the cellulase-producing bacterium of the present invention it is possible to produce cellooligosaccharides from cellulosic substances with high selectivity.
  • the cellulase produced by the mutant of the cellulase-producing bacterium of the present invention it is possible to produce cellooligosaccharides from cellulosic substances with high selectivity without requiring a complicated purification step. .
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the mechanism of cellulose degradation by cellulase.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of an enzyme fractionation method using chromatographic fractionation.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a method for producing a mutant strain that produces only endoglucanase by disrupting a gene of a cellulase-producing bacterium.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of a cellulolytic enzyme produced by Trichoderma reesei.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of a method for producing cellooligosaccharides by disrupting a gene of a cellulase-producing bacterium.
  • FIGS. 6A and 6B are schematic diagrams illustrating the selection marker pyr4. FIGS.
  • FIGS. 7A and 7B are schematic diagrams of a marker recycling method using a pyr4 disruption strain.
  • FIG. 8 shows a schematic diagram of the disruption of the egl1 gene using the pyr4 disruption strain.
  • FIGS. 9A to 9C are schematic diagrams showing a method for producing a multigene-disrupted strain using the marker recycling method.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of transformation of Trichoderma reesei.
  • FIG. 11 shows the results of SDS-PAGE for the transformants prepared in the examples.
  • FIG. 12 (a) shows the protein concentration of the culture broth of the transformant prepared in the example.
  • FIGS. 12B to 12D show the results of evaluating the activity of the enzyme obtained from the transformant prepared in the example.
  • FIG. 13 shows the results of evaluating the activity of the enzyme obtained from the transformant prepared in the example.
  • FIG. 14 shows the results of evaluating the xylanase activity of the enzyme obtained from the transformant prepared in the example.
  • FIG. 15 shows the results of evaluating the oligosaccharide production ability using an enzyme obtained from a single enzyme-disrupted strain.
  • FIG. 16 shows the results of evaluating the oligosaccharide production ability using the enzyme obtained from the enzyme gene triple disruption strain ( ⁇ C2 ⁇ C1 ⁇ B1).
  • FIG. 17 shows fractionated enzymes ( ⁇ C2-C1-B1) obtained by removing CBHI, CBHII and ⁇ -glucosidase 1 from cellulases obtained from the parent strain, and cbh1, cbh2 and bgl1 disrupted strains ( ⁇ C2 ⁇ C1 ⁇ B1, enzyme gene triple disrupted strain)
  • FIG. 18 shows the results of evaluating the oligosaccharide production ability using the enzyme obtained from the enzyme gene quadruple disruption strain ( ⁇ C2 ⁇ C1 ⁇ B1 ⁇ EG1).
  • FIG. 19 shows the results of evaluating the effects of oligosaccharide production ability and saccharification time using the enzyme obtained from the enzyme gene quadruple strain.
  • the present invention relates to a mutant of a cellulase-producing bacterium in which the cellobiohydrolase gene, ⁇ -glucosidase gene, and endoglucanase gene are disrupted.
  • cellulase-producing bacteria include, for example, the genus Tricodederma, the genus Acremonium, the Aspergillus genus, the Bacillus genus, the Pseudomonas genus, the Penicillium genus, and the Penicillium genus.
  • Trichoderma e.g., Trichoderma aggressivum, Trichoderma atroviride, Trichoderma asperellum, Trichoderma aureoviride, Trichoderma austrokoningii, Trichoderma brevicompactum, Trichoderma candidum, Trichoderma caribbaeum var. aequatorial, Trichoderma caribbaeum var.
  • Trichoderma catoptron Trichoderma cremeum, Trichoderma ceramicum, Trichoderma cerinum, Trichoderma chlorosporum, Trichoderma chromospermum, Trichoderma cinnamomeum, Trichoderma citrinoviride, Trichoderma crassum, Trichoderma cremeum, Trichoderma dingleyeae, Trichoderma dorotheae, Trichoderma effusum, Trichoderma erinaceum, Trichoderm estonicum, Trichoderma fertile, Trichoderma gelatinosus, Trichoderma ghanense, Trichoderma hamatum, Trichoderma harzianum, Trichoderma helicum, Trichoderma intricatum, Trichoderma konilangbra, Trichoderma koningii, Trichoderma koningiposis, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma longipile, Trichoderma minutisporum, Trichoderma oblongisporum, richoderma ovalisporum,
  • MA 3642 Trichoderma sp. PPRI 3559, Trichoderma spirale, Trichoderma stramineum, Trichoderma strigosum, Trichoderma stromaticum, Trichoderma surrotundum, Trichoderma taiwanense, Trichoderma thailandcum, Trichoderma thelephorucolum, Trichoderma theobromicola, Trichoderma tomentosum, Trichoderma, Trichoderma, Trichoderma, Trichoderma velutinum, Trichoderma virens, Trichoder a viride and Trichoderma Viridescens the like.
  • Trichoderma reesei Trichoderma viride, Trichoderma atrobide, or Trichoderma trocha tumra bra, from the viewpoint of cellulase secretory production ability. Trichoderma reesei is more preferred.
  • Trichoderma reesei examples include Trichoderma reesei strain QM9414 and Trichoderma reesei strain PC-3-7.
  • the cellobiohydrolase gene and the ⁇ -glucosidase gene are targeted for destruction.
  • a mutant strain that produces only endoglucanase can be obtained by disrupting the cellobiohydrase gene and ⁇ -glucosidase gene of the cellulase-producing bacterium. According to the mutant strain, complete deletion of enzyme components is possible compared to the enzyme fractionation method, and cellooligosaccharides can be produced efficiently.
  • cellooligosaccharides of three or more sugars can be produced with higher selectivity.
  • the cellobiohydrolase gene is a gene that belongs to the carbohydrate hydrolase family [Glycoside Hydrolase Family, GHF (http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html)]6 and GHF7 Is preferred.
  • the ⁇ -glucosidase gene is preferably a gene belonging to GHF1 or GHF3, more preferably a gene belonging to GHF3.
  • Fig. 4 shows cellulolytic enzymes produced by Trichoderma reesei.
  • Trichoderma reesei cellulolytic enzymes include at least 2 cellobiohydrases (CBHI, CBHII), 8 endoglucanases (EGI-EGVIII), 10 ⁇ -glucosidases (BGLI). , BGLII, Cel1b, Cel3b to Cel3h).
  • CBHI cellobiohydrases
  • EGI-EGVIII 8 endoglucanases
  • BGLI ⁇ -glucosidases
  • BGLII ⁇ -glucosidases
  • CBHI CBHII
  • CBHII Cel6a
  • EGI (Cel7b) is GHF7
  • EGII (Cel5a) is GHF5
  • EGIII (Cel12a) is GHF12
  • EGIV (Cel61a) is GHF61
  • EGV (Cel45a) is In GHF45
  • EGVI (Cel74a) belongs to GHF74
  • EGVII (Cel61b) belongs to GHF61
  • EGVIII (Cel5b) belongs to GHF5.
  • BGLI ⁇ -glucosidases
  • BGLI ⁇ -glucosidases
  • Cel1b ⁇ -glucosidases
  • Cel3b ⁇ -glucosidases
  • BGLI Cel3a
  • BGLII Cel1a
  • Cel1b belongs to GHF1
  • Cel3b to h belong to GHF3.
  • Trichoderma reesei When the microorganism belonging to the genus Trichoderma is Trichoderma reesei, it is preferable that the genes shown in Table 1 (cellobiohydrase, ⁇ -glucosidase gene) are targeted for destruction (FIG. 5). More preferably, endoglucanase is the target of destruction.
  • the names, numbers, functions, etc. of each gene in Table 1 are described based on GenBank and JGI (Trichoderma reesei) (http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html). Yes.
  • Reference 1 JP 1985149387-A / 1 Reference 2: Gene 51 (1), 43-52 (1987) Reference 3: Thesis (1993) Mikobielle Biochemie, Inst. biochem. Technol Reference 4: Nat Biotechnol. 26,553-560 (2008) Reference 5: “Homology between cellulase genes of Trichoderma reeseikoron complete nucleotide sequence of the endlucanase I gene” Pentilla, M. et al. Lehtovaara, P .; Nevalainen, H .; , Bhikhabhai, R .; and Knowles, J.A. Gene 45 (3), 253-263 (1986)
  • a cellooligosaccharide having 3 or more sugars with a high selectivity preferably 3 or more, more preferably 4 or more, still more preferably 5 or more of the above 8 genes. It is preferable to disrupt the gene. More specifically, it is preferable to destroy at least three genes, cbh1, cbh2, and bgl1. More preferably, the four genes cbh1, cbh2, bgl1 and egl1 are disrupted. Note that mutant strains in which these genes are disrupted are Mol. Gen. Genet. 241 (5-6), 523-530 (1993).
  • the gene described in Table 1 is a gene having the same function as the gene, for example, consisting of a nucleotide sequence in which one or several nucleotide sequences are deleted, substituted, or added in the nucleotide sequence of the gene. Good. Furthermore, it has the same function as the gene described in Table 1, and / or 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably in each gene and base sequence of Table 1 and Table 2. Genes having an identity of 95% or more, particularly preferably 98% or more are also considered to be genes corresponding to the genes listed in Table 1, and are included in the genes that can be destroyed in the present invention.
  • genes can be inactivated by inserting other DNA fragments inside them, or by mutating the transcription / translation initiation region of the gene, but physically deleting the target gene. Is more preferable.
  • a method by homologous recombination may be used.
  • a circular recombinant plasmid obtained by cloning a DNA fragment containing a part of the target gene into an appropriate plasmid vector is taken into the parent cell, and homologous recombination in a partial region of the target gene is performed on the parent strain genome. It is possible to disrupt and inactivate the target gene.
  • a target gene into which an inactivating mutation due to base substitution or base insertion has been introduced, or a linear DNA fragment containing an outer region of the target gene but not including the target gene is constructed by a method such as PCR.
  • the target gene on the genome is caused by two-fold homologous recombination at two sites outside the mutation site in the target gene of the parent strain genome or two regions outside the target gene. Can be replaced with a disrupted gene fragment.
  • a method for deleting or inactivating a random gene for example, a method for causing homologous recombination similar to the above method using a randomly cloned DNA fragment, The method of irradiating etc. is mentioned.
  • the Marker Recycling Law [Curr. Genet. , 48 (3), 204-211 (2005)] a method for constructing a multigene (cbh1, cbh2, bgl1) disruption strain will be described.
  • the gene disruption method in the present invention is not limited to the following.
  • pyr4 (SEQ ID NO: 8) is a selectable marker gene. As shown in FIGS. 6 (a) and (b), the pyr4 + strain can grow without adding uridine to the medium, but the pyr4 ⁇ strain (pyr4 disruption) Strain) is resistant to 5-fluoroorotic acid (5-FOA) and becomes a uridine-requiring strain.
  • 5-FOA 5-fluoroorotic acid
  • a marker recycling method using a pyr4 disruption strain will be described with reference to FIG.
  • a uridine-free medium in which a target gene is replaced with pyr4 and a recombination cassette having direct repeats is introduced into a uridine-requiring strain (pyr4 ⁇ ) obtained by gene disruption using 5-FOA resistance as an indicator.
  • the transformant that grows in the above is obtained [FIG. 7 (a)].
  • a strain in which one copy of the disruption cassette is introduced into the target position by double crossover is selected from the obtained transformants by Southern blot analysis. Thereafter, the spores of the obtained strain were applied to a medium containing 5-FOA, and pyr4 was excised by intramolecular homologous recombination.
  • sugar source used for the culture examples include various celluloses such as Avicel, filter paper powder, and biomass containing cellulose.
  • examples of the nitrogen source include polypeptone, ammonium sulfate, gravy, corn steep liquor (CSL), and soybean meal.
  • ingredients necessary for producing the target cellulase can be added to this medium.
  • xylanase can be increased by adding various xylan components to the medium.
  • various culture methods such as shaking culture, agitation culture, agitation shaking culture, stationary culture, and continuous culture can be employed, and preferably, shaking culture or agitation culture is used.
  • the culture temperature is usually 20 ° C. to 35 ° C., preferably 25 ° C. to 31 ° C.
  • the culture time is usually 4 to 10 days, preferably 4 to 9 days.
  • the cellulase produced by the mutant strain can be recovered from outside the mutant strain.
  • Cellulase can be measured by analyzing cell lysate or culture supernatant samples directly by dodecyl sodium sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting as known in the art.
  • SDS-PAGE dodecyl sodium sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
  • Cellulase produced during cell culture is secreted in the medium, and purified or separated by removing unnecessary components from the cell medium, for example.
  • Cellulase purification methods include, for example, affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, cation exchange chromatography on silica or DEAE, chromatofocusing, SDS-PAGE. And ammonium sulfate precipitation method and gel filtration method. These methods can be used alone or in combination.
  • Cellooligosaccharide production method Cellooligosaccharide production by enzymatic degradation of cellulose using cellulase may be any known method, and is not particularly limited. For example, a cellulose-based substance as a substrate in an aqueous medium may be used. A method of suspending, adding the cellulase produced by the method of the present invention, and performing saccharification reaction by heating while stirring or shaking is mentioned.
  • the suspension conditions, the stirring method, the cellulase / substrate addition method / addition order, the reaction conditions such as the concentration thereof can be appropriately adjusted so that the cellooligosaccharide can be obtained in a higher yield.
  • the pH and temperature of the reaction solution may be within the range in which the enzyme is not deactivated. Generally, when the reaction is performed at normal pressure, the temperature is 5 to 95 ° C., and the pH is 1 to 11. Range may be sufficient.
  • the cellulosic material may be water-soluble or water-insoluble, and its origin may be plant or animal. Examples of animals and plants that produce it include wood, bamboo, wheat straw, rice straw, corn cob, cotton, ramie, bagasse, kenaf, beet, squirts, and bacterial cellulose.
  • a regenerated cellulosic material obtained by regenerating natural cellulosic material once chemically or physically dissolved or swollen and a cellulosic material You may use the cellulose derivative type material which modified chemically.
  • these cellulosic materials include natural cellulosic raw materials such as pulp, cellulose powder and crystalline cellulose, regenerated cellulose such as rayon, various regenerated cellulose raw materials such as alkali cellulose and phosphoric acid swollen cellulose (PSC), Any of various cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose sodium salt (CMC) may be used.
  • cellooligosaccharides for pharmaceuticals, foods and cosmetics, it is preferable to use natural cellulosic materials. Even if one kind of cellulosic material is used as a raw material, a mixture of two or more kinds can be used.
  • Cellooligosaccharide production by enzymatic degradation of cellulose using cellulase may be performed in a batch system or a continuous system.
  • Examples of the method for maintaining the cellobiose concentration in the reaction system within a specific range include, for example, a method of extracting cellobiose generated from the reaction system by membrane filtration such as ultrafiltration or reverse osmosis filtration, and dry plant powder such as activated carbon, bamboo or wood.
  • Organic porous substrates such as silicon dioxide, inorganic porous substrates such as silicon dioxide, etc. are introduced into the reaction system, cellobiose is adsorbed to them, a cellulose substrate is immobilized on a column, etc., and a reaction solution containing cellulase is circulated. Examples thereof include a method and a method in which cellulase is immobilized on a polymer or the like and a reaction solution containing cellulose is circulated.
  • the aqueous solution mainly composed of cellooligosaccharide obtained by the enzyme decomposition reaction can be subjected to purification treatment such as decolorization, desalting or enzyme removal as necessary.
  • the purification method is not particularly limited as long as it is a known method, and examples thereof include activated carbon treatment, ion exchange resin treatment, chromatography treatment, filtration treatment such as microfiltration, ultrafiltration or reverse osmosis filtration, and crystallization treatment. It is done. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the aqueous solution mainly composed of cellooligosaccharide purified by the above method can be used as it is, but if necessary, it may be solidified by drying.
  • the drying method is not particularly limited as long as it is a known method, but for example, spray drying, freeze drying, drum drying, thin film drying, shelf drying, airflow drying, vacuum drying, etc. may be used, and these may be used alone. You may use, or may combine 2 or more types.
  • an organic solvent or the like may be used as necessary in addition to water.
  • an organic solvent used here For example, what is used in the process of manufacturing a pharmaceutical, foodstuffs, and those additives is preferable, and “pharmaceutical additive encyclopedia” (Pharmaceutical Daily Inc.) Issued), “Japanese Pharmacopoeia” and “Food Additives Official Document” (both published by Yodogawa Shoten).
  • Water and organic solvents can be used alone or in combination of two or more, and once dispersed in one medium, the medium is removed and dispersed in a different medium. Also good.
  • the form of the cellooligosaccharide that has undergone the above-mentioned process, but it can be used in the form of a solid, suspension, emulsion, syrup or solution at room temperature, for example.
  • the solid cellooligosaccharide include powder, granules, pellets, molded products, laminates, and solid dispersions.
  • cellooligosaccharide is not particularly limited, but for example, food ingredients, cosmetic ingredients, pigment ingredients, perfume ingredients, pharmaceutical medicinal ingredients, agricultural chemical ingredients, feed ingredients in the fields of food, cosmetics, pharmaceuticals or general industrial products, etc.
  • food ingredients include food ingredients, cosmetic ingredients, pigment ingredients, perfume ingredients, pharmaceutical medicinal ingredients, agricultural chemical ingredients, feed ingredients in the fields of food, cosmetics, pharmaceuticals or general industrial products, etc.
  • examples include fertilizer components, medium components, analytical reagent components, additives, intermediate raw materials, and fermentation raw materials.
  • Cellooligosaccharides produced by the method of the present invention are used in foods, for example, gels such as jelly, pudding or yogurt, mayonnaise, dressings, sauces, sauces, soups, processed vegetables, seasonings such as curry, coconut Meat sauce, retort food such as stew or soup, chilled food, hamburger, bacon, sausage, salami sausage or processed livestock products such as hams, water paste products such as salmon, chikuwa, fish ham / sausage or fried rice cake, bread, raw noodles , Dried noodles, macaroni, spaghetti, Chinese bun skin, cake mix, premix, white processed food such as dumplings and spring rolls, curry, sauce, soup, canned food such as boiled or jam, bottling , Candy, troche, tablet confectionery, chocolate, biscuits, cookies, Confectionery such as confectionery, Japanese and Western confectionery, Western confectionery, snack confectionery, sugar confectionery or pudding, fried foods, croquettes, dumplings or Chinese buns, vegetable paste, meat mince, fruit paste or seafood paste Used for
  • dairy products such as ice cream, ice milk, lacto ice, whipped cream, condensed milk, butter, yogurt, cheese or white sauce, and processed oils and fats such as margarine, fat spread or shortening.
  • carbonated drinks such as cola, carbonated drinks, alcohol drinks, fruit drinks mixed with dairy products, fruit juices, drinks containing fruit drinks or dairy drinks, coffee, milk, soy milk, cocoa milk, fruit milk or yogurt, etc.
  • tea beverages such as lactic acid / milk beverages, sencha, oolong tea, matcha tea or black tea.
  • Cellooligosaccharides produced by the method of the present invention are useful for intestinal useful bacterial flora such as activation of lactic acid bacteria, lactobacilli, etc., blood sugar concentration, blood insulin concentration reduction, blood cholesterol reduction, body fat
  • intestinal useful bacterial flora such as activation of lactic acid bacteria, lactobacilli, etc.
  • functional foods and health foods can be used in addition to the above normal food applications. It may also be used in applications such as diet foods.
  • Cellooligosaccharides are, for example, food ingredients, cosmetic ingredients, pigment ingredients, fragrance ingredients, pharmaceutical medicinal ingredients, agricultural chemical ingredients, feed ingredients, fertilizer ingredients, culture medium ingredients, analytical reagent ingredients, additives, intermediate raw materials and Used as a fermentation raw material.
  • the cellooligosaccharide produced by the method of the present invention since the cellooligosaccharide produced by the method of the present invention has high purity, it may be used as a raw material for chemical conversion into various cellooligosaccharide derivatives.
  • cbh1 and cbh2 disruption strain ( ⁇ C2 ⁇ C1), cbh1, cbh2 and bgl1 disruption strain ( ⁇ C2 ⁇ C1 ⁇ B1, enzyme gene triple disruption strain), cbh1, cbh2 and bgl1 and egl1 ( ⁇ C2 ⁇ C1 ⁇ B1 ⁇ EG1)
  • cbh1 and cbh2 disrupted strains were prepared by the marker recycling method using the cbh2 disrupted strains. Further, as shown in FIG. 9 (c) and FIG.
  • cbh1, cbh2, and bgl1 disrupted strains were prepared by the marker recycling method using the cbh1 and cbh2 disrupted strains. Furthermore, cbh1, cbh2, bgl1, and egl1 disrupted strains were prepared by the marker recycling method using the cbh1, cbh2, and bgl1 disrupted strains.
  • the composition of the trace element was as follows. 6 mg H 3 BO 3 , 26 mg (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O, 100 mg FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, 40 mg, CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 8 mg MnCl 2 ⁇ 4H 2 O, 200 mg ZnCl 2 Made up to 100 ml with distilled water.
  • FIG. 11 shows 20 ⁇ L of the obtained enzyme solution subjected to SDS-PAGE.
  • the molecular weight of the cellulase encoded by the disrupted gene is 68 kDa for CBHI, 58 kDa for CBHII, 82 kDa for BGLI, and 54 kDa for EGI.
  • SDS-PAGE deletion of the cellulase component encoded by the disrupted gene was confirmed.
  • Protein concentration was determined by measuring absorbance at 595 nm using Bio-Rad protein assay (Bio-Rad) and using bovine ⁇ globulin as a standard substance.
  • the ⁇ -glucosidase activity was measured by measuring the glucose concentration with Glucose CII Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) using cellobiose as a substrate. The amount of enzyme that decomposes 1 ⁇ mol of cellobiose per minute is 1 U. As determined.
  • Endoglucanase activity is determined using carboxymethylcellulose as a substrate, the resulting reducing sugar is measured by the Sommoji-Nelson method, and the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol of reducing sugar in terms of glucose per minute is determined as 1 U. did.
  • Cellobiohydrolase activity is an enzyme that uses crystalline cellulose as a substrate, measures the resulting reducing sugar by the Sommoji Nelson method, and releases 1 ⁇ mol of reducing sugar in terms of glucose per minute. The amount was determined as 1U.
  • Cellobiase activity was determined by measuring the glucose concentration with glucose CII test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) using cellobiose as a substrate, and determining the amount of enzyme that liberates 2 ⁇ mol of glucose per minute as 1 U.
  • Avicelase activity was determined using Avicel as a substrate, the resulting reducing sugar was measured by the Sommoji Nelson method, and the amount of enzyme that released 1 ⁇ mol of reducing sugar in terms of glucose per minute was determined as 1 U.
  • CMCase activity was determined by measuring the generated reducing sugar using carboxymethyl cellulose as a substrate by the Sommoji Nelson method, and determining the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol of reducing sugar in terms of glucose per minute as 1 U. did.
  • Xylanase activity was determined using xylan as a substrate, and the resulting xylose was measured using the DNS (Dintosalicylic acid) method, and the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol of reducing sugar per minute in terms of xylose was determined as 1 U. did.
  • oligosaccharide production ability by cellulase was evaluated by HPLC analysis using KS-802, a sugar analysis column, using phosphate-swelled cellulose as a substrate.
  • KS-802 a sugar analysis column
  • phosphate-swelled cellulose as a substrate.
  • (1) Evaluation of oligosaccharide production ability using an enzyme obtained from a single gene disruption strain Obtained from a parent strain (Trichoderma reesei PC-3-7), a bgl1 disruption strain ( ⁇ B1), and a cbh2 disruption strain ( ⁇ C2) The results of evaluating the oligosaccharide-producing ability of the cellulase are shown in Table 2 and FIG.
  • the cellulase obtained from the enzyme gene triple disruption strain exhibits oligosaccharide production ability equivalent to that of the fractionation enzyme, and also exhibits excellent productivity for the trisaccharide cellotriose. I understood.
  • the cellulase obtained from the enzyme gene quadruple disruption exhibits an oligosaccharide production ability equivalent to that of the degrading enzyme, and also exhibits an excellent productivity for the trisaccharide cellotriose. I understood. It was found that disruption of the egl1 gene has a higher effect on the production of cellooligosaccharides higher than trisaccharide.
  • Cellooligosaccharides are thought to have various physiologically active functions and are considered to be very useful as raw materials for functional foods.
  • Cellobiose which is a disaccharide, accounts for 90% or more of what is sold as cellooligosaccharide.
  • cellooligosaccharides more than pure cellotrisaccharides are difficult to obtain, and the physiological function analysis remains unresolved. Since the mutant of the cellulase-producing bacterium of the present invention can produce not only cellobiose but also more oligosaccharides than trisaccharides, it is very useful industrially and academically.

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Abstract

　セルロース系物質をセルラーゼの存在下で酵素分解してセロオリゴ糖を選択的に生成する際に、セロオリゴ糖を優先的に生産することのできるセルラーゼを生産するセルラーゼ生産菌の変異株、該セルラーゼの生産方法、該セルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法を提供することを課題とする。本発明は、セロビオハイドロラーゼおよびβ-グルコシダーゼ遺伝子が破壊されているセルラーゼ生産菌の変異株に関する。

Description

セルラーゼ生産菌の変異株、セルラーゼの製造方法およびセロオリゴ糖の製造方法
　本発明は、セルラーゼ生産菌の変異株およびその製造方法、該変異株を用いたセルラーゼの製造方法、該セルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法に関する。
　セロオリゴ糖はグルコースの２～６分子が重合したオリゴ糖であり、グルコピラノース単位が２～６個、直鎖状にβ－１，４-グリコシド結合したオリゴ糖類である。セロオリゴ糖は、機能性食品、エネルギー、飼料または化学工業製品等の分野に活用し得る素材として期待されている。
　セロオリゴ糖の生産方法としては、セルロースを原料としてセルラーゼによる分解反応を用いた方法が知られている。セルラーゼによるセルロースの分解機構は、図１に示すように、（１）セルロース分解酵素の作用でセルロースからセロビオースを含むセロオリゴ糖を生成する反応、（２）セルロースからグルコースを生成する反応、（３）β－グルコシダーゼの作用で、セロオリゴ糖からグルコースを生成する反応が含まれる（非特許文献１）。
　図１に示すように、セルラーゼはセルロースをランダムに分解するエンドグルカナーゼ（以下、ＥＧとも略記する）およびセルロース鎖の末端からセロビオースを遊離するセロビオハイドロラーゼ（以下、ＣＢＨとも略記する）、セロビオースを分解して２分子のグルコースを生産するβ-グルコシダーゼ（以下、ＢＧＬとも略記する）の３つの酵素活性から構成される。
　セロオリゴ糖の生産性を高めるためには、セルラーゼに含まれるβ-グルコシダーゼを抑制し、セロオリゴ糖からグルコースへの分解を抑制することでセロオリゴ糖の分解を抑えることが有効である。セルラーゼに含まれるβ-グルコシダーゼを抑制する方法としては、図２に示すクロマトグラフィーによる分画を用いた酵素分画法などの様々な試みがなされている。
　特許文献１には、セルラーゼをｐＨ３．５～５．０に平衡化した弱酸性陽イオン交換樹脂に吸着させることによりセルラーゼ中に存在するβ－グルコシダーゼを除去したセルラーゼを用いて、セルロースからセロビオースを選択的に生成せしめる方法が開示されている。
　特許文献２には、セルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ－グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着し、その後、酵素分解するセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。
　特許文献３には、セルロ－ス性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドラーゼを含みかつ不純物としてβ－グルコシダーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、β－グルコシダーゼを含む画分を選択的に分離除去することを特徴とするセルラーゼからのβ－グルコシダーゼの分離除去方法が記載されている。
　これら従来の方法では、セロビオース製造工程に混入するβ－グルコシダーゼを低減することが可能となり、選択的にセロビオースを得ることができる。しかしながら、これらの方法では、固形画分へのセルラーゼ吸着工程および固形画分分離工程が必要となり、プロセスが複雑になり、コストがかかるという問題があった。
　また、β－グルコシダーゼの活性を阻害する方法が開発されており、特許文献４には、セルラーゼによるセルロース分解の際に、β－グルコシダーゼの阻害剤であるδ－グルコノラクトン又はグルコン酸を共存せしめ、セロビオースを製造する方法が記載されている。
　また、特許文献５には、セルラーゼによるセルロースの分解の際に、グルコースオキシダーゼを共存させ、生成したグルコースからδ－グルコノラクトンを生成せしめ、結果的にβ－グルコシダーゼ活性を抑制しようとする方法が記載されている。
　しかし、これらの方法では、生成物であるセロビオースとδ－グルコノラクトンとの分離が煩雑であり、δ－グルコノラクトンが高価であることなどから、実用化は困難であった。
日本国特開平５－１１５２９３号公報 日本国特開２００６－２０４２９４号公報 日本国特開２００６－３４２０６号公報 日本国特開平４－７５５９４号公報 日本国特開平８－３３４９６号公報
「セルラーゼ」講談社サイエンティフィック発行、ｐ．９７－１０４、１９８７年
　本発明は、セルロース系物質をセルラーゼの存在下で酵素分解してセロオリゴ糖を選択的に生成する際に、セロオリゴ糖を優先的に生成することのできるセルラーゼを生産するセルラーゼ生産菌の変異株、該セルラーゼの生産方法、該セルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、セルラーゼ生産菌の主要なβ－グルコシダーゼ、主要なセロビオハイドロラーゼ遺伝子および主要なエンドグルカナーゼ遺伝子を遺伝子工学的にノックアウトした株を作製し、該株の生産するセルラーゼを用いることで、セルロース系物質から高い選択率でセロオリゴ糖を生産できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
１．セロビオハイドロラーゼ遺伝子およびβ-グルコシダーゼ遺伝子が破壊されているセルラーゼ生産菌の変異株。
２．前記セロビオハイドロラーゼ遺伝子が糖質加水分解酵素ファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　Ｆａｍｉｌｙ，ＧＨＦ）６に属する遺伝子およびＧＨＦ７に属する遺伝子であり、前記β－グルコシダーゼ遺伝子がＧＨＦ１またはＧＨＦ３に属する遺伝子である前項１に記載の変異株。
３．前記β－グルコシダーゼ遺伝子がＧＨＦ３に属する遺伝子である前項２に記載の変異株。
４．さらに、エンドグルカナーゼ遺伝子が破壊されている前項１記載の変異株。
５．前記エンドグルカナーゼ遺伝子がＧＨＦ７に属する遺伝子である前項４に記載の変異株。
６．前記セルラーゼ生産菌がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物である前項１～５のいずれか１項に記載の変異株。
７．前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）からなる群から選ばれる１である前項６に記載の変異株。
８．前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイである前項７に記載の変異株。
９．前記セロビオハイドロラーゼ遺伝子がｃｂｈ１遺伝子およびｃｂｈ２遺伝子であり、前記β-グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１遺伝子である前項８に記載の変異株。
１０．前記エンドグルカナーゼ遺伝子がｅｇｌ１遺伝子である前項８または９に記載の変異株。
１１．前項１～１０のいずれか１項に記載の変異株を培養することにより、セルラーゼを生産することを特徴とするセルラーゼの生産方法。
１２．前項１～１０のいずれか１項に記載の変異株が生産するセルラーゼを用いてセルロース系物質を分解する工程を含むセロオリゴ糖の製造方法。
１３．セルラーゼ生産菌の変異株の作製方法であって、セロビオハイドロラーゼ遺伝子およびβ-グルコシダーゼ遺伝子を破壊する変異株の作製方法。
　β－グルコシダーゼ遺伝子およびセロビオハイドロラーゼ遺伝子はセルラーゼ生産菌の生存に不可欠であると従来より考えられていた遺伝子であり、これら遺伝子が破壊されるとセルラーゼ生産菌を得ることは困難であると考えられていた。本発明においては、β－グルコシダーゼ遺伝子およびセロビオハイドロラーゼ遺伝子を破壊したとしてもセルラーゼ生産菌が生存増殖可能であることを見出し、さらに該セルラーゼ生産菌の生産するセルラーゼによれば三糖以上のセロオリゴ糖を高い選択率で効率的かつ簡便に生産することができることを見出したものである。
　本発明のセルラーゼ生産菌の変異株は、主要なβ－グルコシダーゼ遺伝子が破壊されていることにより、該変異株が生産するセルラーゼのβ－グルコシダーゼ活性が著しく減少している。また、該変異株は主要なセロビオハイドロラーゼ遺伝子が破壊されていることにより、該変異株が生産するセルラーゼを用いることにより三糖以上のセロオリゴ糖を高い選択率で生産することができる。
　また、該変異株は主要なβ－グルコシダーゼ遺伝子および主要なセロビオハイドロラーゼ遺伝子に加えて、主要なエンドグルカナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、三糖以上のセロオリゴ糖をさらに高い選択率で生産することができる。
　したがって、本発明のセルラーゼ生産菌の変異株が生産するセルラーゼによれば、セルロース系物質からセロオリゴ糖を高い選択率で生産することが可能である。
　また、本発明のセルラーゼ生産菌の変異株の生産するセルラーゼを用いることにより、煩雑な精製工程を必要とせずに、低コストで、セルロース系物質からセロオリゴ糖を高い選択率で生産することができる。
図１は、セルラーゼによるセルロースの分解機構の模式図を示す。 図２は、クロマトグラフィーによる分画を用いた酵素分画法の模式図を示す。 図３は、セルラーゼ生産菌の遺伝子を破壊することによる、エンドグルカナーゼのみを生産する変異株の作製方法の模式図を示す。 図４は、トリコデルマ・リーセイの生産するセルロース分解酵素の模式図を示す。 図５は、セルラーゼ生産菌の遺伝子を破壊することによる、セロオリゴ糖を生産する方法の模式図を示す。 図６（ａ）および（ｂ）は、選択マーカーｐｙｒ４を説明する模式図を示す。 図７（ａ）および（ｂ）は、ｐｙｒ４破壊株を用いたマーカーリサイクル法の模式図を示す。 図８は、ｐｙｒ４破壊株を用いたｅｇｌ１遺伝子の破壊の模式図を示す。 図９（ａ）～（ｃ）は、マーカーリサイクル法を用いた多重遺伝子破壊株の作製方法の模式図を示す。 図１０は、トリコデルマ・リーセイの形質転換の模式図を示す。 図１１は、実施例作成した形質転換体についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。 図１２（ａ）は、実施例で作製した形質転換体の培養液のタンパク質濃度を示す。図１２（ｂ）～（ｄ）は、実施例で作製した形質転換体から得られた酵素の活性を評価した結果を示す。 図１３は、実施例で作製した形質転換体から得られた酵素の活性を評価した結果を示す。 図１４は、実施例で作製した形質転換体から得られた酵素のキシラナーゼ活性を評価した結果を示す。 図１５は、単一酵素破壊株より得られた酵素を用いたオリゴ糖生産能を評価した結果を示す。 図１６は、酵素遺伝子３重破壊株（ΔＣ２ΔＣ１ΔＢ１）より得られた酵素を用いたオリゴ糖生産能を評価した結果を示す。 図１７は、親株より得られたセルラーゼからＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩおよびβ－グルコシダーゼ１を除去した分画酵素（ΔＣ２－Ｃ１－Ｂ１）、およびｃｂｈ１、ｃｂｈ２およびｂｇｌ１破壊株（ΔＣ２ΔＣ１ΔＢ１、酵素遺伝子３重破壊株）より得られたセルラーゼを用いてオリゴ糖生産能を評価した結果を示す。 図１８は、酵素遺伝子４重破壊株（ΔＣ２ΔＣ１ΔＢ１ΔＥＧ１）より得られた酵素を用いたオリゴ糖生産能を評価した結果を示す。 図１９は、酵素遺伝子４重破壊株より得られた酵素を用いたオリゴ糖生産能および糖化時間の影響を評価した結果を示す。
１．セルラーゼ生産菌の変異株
　本発明は、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β-グルコシダーゼ遺伝子およびエンドグルカナーゼ遺伝子が破壊しているセルラーゼ生産菌の変異株に関する。セルラーゼ生産菌としては、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属等の「セルラーゼ」（講談社サイエンティフィック発行（１９８７））、「セルロースの事典」（朝倉書店発行（２０００））に記載される微生物が挙げられる。これらの中でも、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物が好ましい。
　トリコデルマ属に属する微生物としては、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ　ｖａｒ．ａｅｑｕａｔｏｒｉａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ　ｖａｒ．Ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃａｔｏｐｔｒｏｎ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｅｒａｍｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｅｒｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｒａｓｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｄｏｒｏｔｈｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｅｆｆｕｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｅｒｉｎａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｆｅｒｔｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｇｈａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｍａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈｅｌｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｐｏｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｈｙｌｌｏｓｔａｈｙｄｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｏｓｓｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｉｎｕｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐ．ＭＡ　３６４２、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐ．ＰＰＲＩ　３５５９、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐｉｒａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｕｒｒｏｔｕｎｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔｈａｉｌａｎｄｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｕｃｏｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓが挙げられる。これらの中でも、セルラーゼの分泌生産能の観点から、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、またはトリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）が好ましく、トリコデルマ・リーセイがより好ましい。
　トリコデルマ・リーセイとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ株ＱＭ９４１４、トリコデルマ・リーセイ株ＰＣ－３－７が挙げられる。
　本発明において、破壊の対象となるのは、セロビオハイドロラーゼ遺伝子およびβ-グルコシダーゼ遺伝子である。図３に示すように、セルラーゼ生産菌のセロビオハイドラーゼ遺伝子およびβ－グルコシダーゼ遺伝子を破壊することにより、エンドグルカナーゼのみを生産する変異株を得ることができる。該変異株によれば、酵素分画法と比較して、酵素成分の完全な欠損が可能であり、セロオリゴ糖を効率よく生産することができる。
　また、さらに、エンドグルカナーゼ遺伝子を破壊することにより、三糖以上のセロオリゴ糖をさらに高い選択率で生産することができる。
　セロビオハイドロラーゼ遺伝子としては、糖質加水分解酵素ファミリー［Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　Ｆａｍｉｌｙ，ＧＨＦ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ－Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．ｈｔｍｌ）］６に属する遺伝子およびＧＨＦ７に属する遺伝子であることが好ましい。また、β－グルコシダーゼ遺伝子としては、ＧＨＦ１またはＧＨＦ３に属する遺伝子であることが好ましく、ＧＨＦ３に属する遺伝子であることがより好ましい。
　トリコデルマ・リーセイの生産するセルロース分解酵素を図４に示す。図４に示すように、トリコデルマ・リーセイのセルロース分解酵素には、少なくとも２種のセロビオハイドラーゼ（ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ）、８種のエンドグルカナーゼ（ＥＧＩ～ＥＧＶＩＩＩ）、１０種のβ－グルコシダーゼ（ＢＧＬＩ、ＢＧＬＩＩ、Ｃｅｌ１ｂ、Ｃｅｌ３ｂ～Ｃｅｌ３ｈ）が含まれる。このうち、５種のβ-グルコシダーゼ（ＢＧＬＩ、Ｃｅｌ３ｂ、Ｃｅｌ３ｅ、Ｃｅｌ３ｆ、Ｃｅｌ３ｇ）が菌体外に分泌生産される。
　トリコデルマ・リーセイの２種のセロビオハイドラーゼ（ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ）のうち、ＣＢＨＩ（Ｃｅｌ７ａ）はＧＨＦ７に属し、ＣＢＨＩＩ（Ｃｅｌ６ａ）はＧＨＦ６に属する。８種のエンドグルカナーゼ（ＥＧＩ～ＥＧＶＩＩ）のうち、ＥＧＩ（Ｃｅｌ７ｂ）はＧＨＦ７に、ＥＧＩＩ（Ｃｅｌ５ａ）はＧＨＦ５に、ＥＧＩＩＩ（Ｃｅｌ１２ａ）はＧＨＦ１２に、ＥＧＩＶ（Ｃｅｌ６１ａ）はＧＨＦ６１に、ＥＧＶ（Ｃｅｌ４５ａ）はＧＨＦ４５に、ＥＧＶＩ（Ｃｅｌ７４ａ）はＧＨＦ７４に、ＥＧＶＩＩ（Ｃｅｌ６１ｂ）はＧＨＦ６１に、ＥＧＶＩＩＩ（Ｃｅｌ５ｂ）はＧＨＦ５に属する。１０種のβ－グルコシダーゼ（ＢＧＬＩ、ＢＧＬＩＩ、Ｃｅｌ１ｂ、Ｃｅｌ３ｂ～Ｃｅｌ３ｈ）のうち、ＢＧＬＩ（Ｃｅｌ３ａ）はＧＨＦ３に、ＢＧＬＩＩ（Ｃｅｌ１ａ）はＧＨＦ１に、Ｃｅｌ１ｂはＧＨＦ１に、Ｃｅｌ３ｂ～ｈはＧＨＦ３に属する。
　トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイである場合、表１に示す遺伝子（セロビオハイドラーゼ、βグルコシダーゼ遺伝子）が破壊の対象となることが好ましい（図５）。さらに好ましくは、エンドグルカナーゼが破壊の対象となることが好ましい。なお、表１中の各遺伝子の名称、番号および機能等は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＪＧＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ－ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）に基づき記載されている。
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参考文献１：ＪＰ　１９８５１４９３８７－Ａ／１
参考文献２：Ｇｅｎｅ　５１（１），４３－５２（１９８７）
参考文献３：Ｔｈｅｓｉｓ（１９９３）Ｍｉｋｒｏｂｉｅｌｌｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｓｔ．ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ
参考文献４：Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，５５３－５６０（２００８）
参考文献５：「Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉｋｏｒｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ｉ　ｇｅｎｅ」Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｍ．，　Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ，Ｐ．，　Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｈ．，　Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ，Ｒ．　ａｎｄ　Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．　Ｇｅｎｅ　４５（３），２５３－２６３（１９８６）
　本発明では、三糖以上のセロオリゴ糖を高い選択率で生産することを目的として、上記の８個の遺伝子のうち、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上の遺伝子を破壊することが好ましい。より具体的には、少なくともｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｂｇｌ１の３個の遺伝子を破壊することが好ましい。さらに好ましくは、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｂｇｌ１およびｅｇｌ１の４個の遺伝子を破壊する。なお、これらの遺伝子を破壊した変異株はＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４１（５―６），５２３―５３０（１９９３）に記載の方法により作製することができる。
　表１に記載の遺伝子は、例えば、当該遺伝子の塩基配列において１若しくは数個の塩基配列が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなる、当該遺伝子と同じ機能を有する遺伝子であってもよい。更に、表１に記載の遺伝子と同じ機能を有する、及び／又は、表１及び表２の各遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する遺伝子も、表１に記載の遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において破壊しうる遺伝子に含まれる。
　これらの遺伝子は、その内部に他のＤＮＡ断片を挿入するか、または当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によっても不活性化できるが、標的遺伝子を物理的に削除することがより好ましい。
　遺伝子又は遺伝子群の破壊の手順としては、表１に示す標的遺伝子を計画的に破壊する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
　標的遺伝子を破壊するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親株細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域における相同組換えによって親株ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。
　あるいは、塩基置換や塩基挿入等による不活性化変異を導入した標的遺伝子、又は標的遺伝子の外側領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親株細胞内に取り込ませて親株ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側２ヶ所、又は標的遺伝子外側の２ヶ所の領域で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子が破壊した遺伝子断片と置換することが可能となる。
　特に、相同組換えによりセルラーゼ生産菌の標的遺伝子を破壊する方法については、既にいくつかの報告例があり（マーカーリサイクル法等）、かかる方法により、本発明のセルラーゼ生産菌の変異株を得ることができる。
　また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化を行う方法としては、例えば、ランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法、および親株にγ線等を照射する方法等が挙げられる。
　以下、より具体的な例として、マーカーリサイクル法［Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，４８（３），２０４-２１１（２００５）］による多重遺伝子（ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｂｇｌ１）破壊株の造成方法について説明するが、本発明における遺伝子破壊方法は下記に限定されるものではない。
　ｐｙｒ４（配列番号８）は選択マーカー遺伝子であり、図６（ａ）および（ｂ）に示すように、ｐｙｒ４＋株は培地にウリジンを添加しなくても生育できるが、ｐｙｒ４―株（ｐｙｒ４破壊株）は５－フルオロオロト酸（５－ＦＯＡ）に対する抵抗性を持ち、ウリジン要求性株となる。
　ｐｙｒ４破壊株を用いたマーカーリサイクル法について、図７を参照して説明する。５－ＦＯＡ耐性を指標に遺伝子ターゲッティングによる遺伝子破壊で取得したウリジン要求性株（ｐｙｒ４－）に標的遺伝子をｐｙｒ４で置換してなおかつダイレクトリピートを有する組換え用カセットを導入し、ウリジンを含まない培地で生育する形質転換体を取得する［図７（ａ）］。さらに、得られた形質転換体の中からサザンブロット解析によって、破壊カセットが二重交叉により目的の位置に１コピー導入された株を選択する。その後、得られた株の胞子を５－ＦＯＡを含む培地に塗布し、分子内相同組み換えによってｐｙｒ４が切り出された結果、再び５－ＦＯＡ耐性となり生育するコロニーを標的遺伝子破壊株とする［図７（ｂ）］。この工程を繰り返すことにより、複数の遺伝子を破壊して、本発明のセルラーゼ生産菌の変異株を得ることができる。上記標的遺伝子がｅｇｌ１遺伝子である場合について説明したものを、図８に示す。
　培養に用いる糖源としては、各種セルロース、例えば、アビセル、ろ紙粉末、セルロースを含むバイオマスが挙げられる。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、硫酸アンモニウム、肉汁、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、大豆かすが挙げられる。
　その他、この培地には目的とするセルラーゼを生産する上で必要とされる成分を添加することができる。さらに、各種キシラン成分を培地に添加することで、キシラナーゼを増産することも可能である。
　これら菌株の培養には、振とう培養、撹拌培養、撹拌振とう培養、静置培養、連続培養など、様々な培養方式を採用しうるが、好ましくは、振とう培養または撹拌培養である。培養温度は、通常、２０℃～３５℃、好ましくは２５℃～３１℃であり、培養時間は、通常、４～１０日、好ましくは４～９日である。
　こうして変異株に産生させたセルラーゼを変異株の菌体外から回収することができる。セルラーゼは、細胞溶解物又は培地の上清サンプルを直接、当該技術分野で知られているドデシルナトリウム硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロッティングで解析することにより測定できる。
　細胞培養中に生産されたセルラーゼは培地の中で分泌され、例えば、細胞培地から不要な成分を取り除くことにより精製または分離される。セルラーゼの精製方法としては、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿法およびゲルろ過法等が挙げられる。これらの方法は単独でまたは組み合わせて使用できる。
２．セロオリゴ糖の製造方法
　セルラーゼを用いたセルロースの酵素的分解によるセロオリゴ糖生産は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、例えば、基質としてセルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、本発明の方法で製造されたセルラーゼを添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。
　上記方法において、懸濁方法、攪拌方法、セルラーゼ・基質の添加方法・添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整することができる。その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は５～９５℃、ｐＨは１～１１の範囲でよい。
　セルロース系物質は、水溶性でも、水不溶性でもよく、その由来は、植物性でも動物性でもよい。それを産生する動植物としては、例えば、木材、竹、麦藁、稲藁、コーンコブ、コットン、ラミー、バガス、ケナフ、ビート、ホヤおよびバクテリアセルロースが挙げられる。
　また、前記の動植物が産生する天然セルロース系物質に加え、天然セルロース系物質を一旦、化学的・物理的に溶解、または膨潤させた後、再生して得られる再生セルロース系物質、およびセルロース系原料を化学的に修飾させたセルロース誘導体系物質を用いてもよい。これらのセルロース系物質は、工業的には、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等の天然セルロース系原料、レーヨン等の再生セルロース、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）等の各種再生セルロース系原料、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩（ＣＭＣ）等の各種セルロース誘導体のいずれでもよい。
　但し、得られるセロオリゴ糖を医薬品、食品、化粧品に用いるには、天然セルロース系原料を使用することが好ましい。原料としてこれらのうち１種のセルロース系物質を使用しても、２種以上を混合したものを使用することも可能である。
　セルラーゼを用いたセルロースの酵素的分解によるセロオリゴ糖生産は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。該酵素分解反応において、セロビオースによる生成物阻害を回避するためには、反応系内のセロビオース濃度を、セルラーゼの生成物阻害の影響が出ないように、特定範囲に保つことが、セロオリゴ糖の生産性を向上する観点から好ましい。
　反応系内のセロビオース濃度を特定範囲に保つ方法としては、例えば、限外ろ過または逆浸透ろ過等の膜ろ過により、反応系から生成したセロビオースを抜き出す方法、活性炭、竹または木材等の乾燥植物粉等の有機多孔質基材、二酸化珪素等の無機多孔質基材等を反応系に導入し、それらにセロビオースを吸着させる方法、セルロース基質をカラム等に固定化し、セルラーゼを含む反応液を流通させる方法、およびセルラーゼを高分子等に固定化し、セルロースを含む反応液を流通させる方法が挙げられる。
　前記酵素分解反応により得られたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩または酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法としては、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過または逆浸透ろ過等のろ過処理、晶析処理が挙げられる。これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
　前記方法で精製されたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
　前記の精製、乾燥処理時のセロオリゴ糖の媒体としては、水以外に、必要に応じて、有機溶剤等を使用してもよい。ここで使用される有機溶剤としては、特に制限されないが、例えば、医薬品、食品およびそれらの添加剤を製造する工程で使用されるものが好ましく、「医薬品添加物事典」（薬事日報社（株）発行）、「日本薬局方」、「食品添加物公定書」（いずれも廣川書店発行）に溶剤として分類されるものが挙げられる。水、有機溶剤は、それらを単独で使用しても、２種以上を併用することも自由であり、１種の媒体で一旦分散させた後、その媒体を除去し、異なる媒体に分散させてもよい。
　前記の工程を経たセロオリゴ糖の形態には、特に制限はないが、例えば、常温で固体、懸濁液、エマルジョン、シロップまたは溶液状で使用できる。固体状セロオリゴ糖としては、例えば、粉末、顆粒、ペレット、成形体、積層体または固体分散体等が挙げられる。
　セロオリゴ糖の用途としては、特に制限されないが、例えば、食品、化粧品、医薬品または一般工業製品等の分野における、食品成分、化粧品成分、色素成分、香料成分、医薬品薬効成分、農薬成分、飼料成分、肥料成分、培地成分、分析用試薬成分、添加剤、中間原料および発酵原料が挙げられる。
　本発明の方法で製造されるセロオリゴ糖は、食品では、例えば、ゼリー、プリンまたはヨーグルト等のゲル、マヨネーズ、ドレッシング、ソース類、たれ類、スープまたは野菜加工品等の調味料、カレー、ハヤシ、ミートソース、シチューまたはスープ等のレトルト食品、チルド食品、ハンバーグ、ベーコン、ソーセージ、サラミソーセージまたはハム類等の畜産加工品、蒲鉾、ちくわ、魚肉ハム・ソーセージまたは揚げ蒲鉾等の水練製品、パン、生麺、乾麺、マカロニ、スパゲッティ、中華饅頭の皮、ケーキミックス、プレミックス、ホワイトソースまたは餃子・春巻等の皮類などの小麦加工食品、カレー、ソース、スープ、佃煮またはジャムなどの缶詰、瓶詰類、キャンデー、トローチ、錠菓、チョコレート、ビスケット、クッキー、米菓、和洋菓子、洋生菓子、スナック菓子、砂糖菓子またはプリンなどの菓子類、フライ類、コロッケ、餃子または中華饅頭等の調理加工品、野菜ペースト、肉のミンチ、果実ペーストまたは魚介類のペースト等のペースト類などに使用される。
　また、例えば、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、ホイップクリーム、練乳、バター、ヨーグルト、チーズまたはホワイトソース等の乳製品、マーガリン、ファットスプレッドまたはショートニング等の油脂加工品等に使用される。さらに、コーラ等の炭酸飲料、炭酸入り、アルコール入り、乳製品と混合した果実飲料、果汁又は、果実入り飲料または乳性飲料等の飲料、コーヒー、牛乳、豆乳、ココア牛乳、フルーツ牛乳またはヨーグルト等の乳酸／乳性飲料等、煎茶、ウーロン茶、抹茶または紅茶等の茶飲料等に使用してもよい。
　本発明の方法で製造されるセロオリゴ糖は、乳酸菌、乳酸かん菌等の活性化等の腸内有用細菌叢賦活、血中糖濃度、血中インシュリン濃度の低減、血中コレステロールの低減、体脂肪率の低減、脂質・糖質代謝促進機能、便通・便臭改善、抗う触性等の各種生理活性が期待できるため、上記の通常食品用途に加え、生理活性物質として、機能性食品、健康食品、ダイエット食品等の用途で使用してもよい。
　セロオリゴ糖は、一般工業製品では、例えば、食品成分、化粧品成分、色素成分、香料成分、医薬品薬効成分、農薬成分、飼料成分、肥料成分、培地成分、分析用試薬成分、添加剤、中間原料および発酵原料などに使用される。
　また、本発明の方法で製造されるセロオリゴ糖は、高純度であるため、各種セロオリゴ糖誘導体への化学変換原料として使用してもよい。
　本発明を実施例などに基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例などにより何ら限定されるものではない。
［マーカーリサイクルを用いた多重遺伝子破壊株の作製］
（１）ｃｂｈ２破壊株（ΔＣ２）、ｂｇｌ１破壊株（ΔＢ１）の作製
　図９（ａ）に示すように、マーカーリサイクル法により、ｃｂｈ２破壊株を取得した。５－ＦＯＡ耐性を指標にして、遺伝子破壊法にて取得したウリジン要求性株（ｐｙｒ４―）をｃｂｈ２遺伝子破壊カセットでプロトプラスト―ＰＥＧ法により形質転換し、ウリジンを含まない培地で生育する形質転換体を取得した。さらに、得られた形質転換体の中からサザンブロット解析によって、破壊カセットが二重交叉により目的の位置に１コピー導入された株を選択した。その後、得られた株の胞子を５－ＦＯＡを含む培地に塗布し、分子内相同組換えによってｐｙｒ４が切り出された結果再び５－ＦＯＡ耐性となり生育してきたコロニーを得た。このうちの一株をｃｂｈ２破壊株（ΔＣ２）とした。同様の方法でｂｇｌ１破壊株（ΔＢ１）を作製した。
（２）ｃｂｈ１およびｃｂｈ２破壊株（ΔＣ２ΔＣ１）、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２およびｂｇｌ１破壊株（ΔＣ２ΔＣ１ΔＢ１、酵素遺伝子３重破壊株）、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２およびｂｇｌ１およびｅｇｌ１（ΔＣ２ΔＣ１ΔＢ１ΔＥＧ１、酵素遺伝子４重破壊株）の作製
　図９（ｂ）に示すように、該ｃｂｈ２破壊株を用いて、マーカーリサイクル法により、ｃｂｈ１およびｃｂｈ２破壊株を作製した。さらに、図９（ｃ）および図１０に示すように、該ｃｂｈ１およびｃｂｈ２破壊株を用いて、マーカーリサイクル法により、ｃｂｈ１およびｃｂｈ２およびｂｇｌ１破壊株を作製した。さらに、該ｃｂｈ１およびｃｂｈ２およびｂｇｌ１破壊株を用いて、マーカーリサイクル法により、ｃｂｈ１およびｃｂｈ２およびｂｇｌ１およびｅｇｌ１破壊株を作製した。
［遺伝子破壊株の評価］
　得られた遺伝子破壊株のセルラーゼの発現を確認するために、胞子１０７個を、トリコデルマ・リーセイ用液体培地５０ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに植菌した。培地の組成は次の通りとした。
１％　Ａｖｉｃｅｌ、０．１４％　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％　ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％　Ｂａｃｔｏ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、０．０５％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　８０、０．１％　Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、５０ｍＭ　酒石酸緩衝液（ｐＨ４．０）
　なお、Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔの組成は次の通りとした。
６ｍｇ　Ｈ３ＢＯ３、２６ｍｇ　（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、８ｍｇ　ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ　ＺｎＣｌ２を蒸留水で１００ｍｌにメスアップしたもの。
　２２０ｒｐｍ、２８℃で７日間培養後、培養液を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、分離した培養上清をさらに、ザルトラボ（ザルトリウス　ジャパン社）にてろ過し、得られたろ液を酵素液として使用した。得られた酵素液２０μＬをＳＤＳ-ＰＡＧＥに供したものが図１１である。
　トリコデルマ・リーセイにより分泌されたタンパク質のうち、破壊された遺伝子にコードされたセルラーゼの分子量は、ＣＢＨＩは６８ｋＤａ、ＣＢＨＩＩは５８ｋＤａ、ＢＧＬＩは８２ｋＤａおよびＥＧＩは５４ｋＤａである。ＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果、破壊された遺伝子にコードされたセルラーゼ成分の欠損が確認された。
　得られた酵素液を用いて、（１）タンパク質濃度、（２）β－グルコシダーゼ活性、（３）エンドグルカナーゼ活性、（４）セロビオハイドロラーゼ活性、（５）セロビアーゼ活性、（６）アビセラーゼ活性、（７）ＣＭＣアーゼ活性、（８）キシラナーゼ活性を以下の方法により測定した。その結果を図１２（ａ）～（ｄ）、図１３および図１４に示す。
（１）タンパク質濃度
　タンパク質濃度は、バイオ・ラッドプロテインアッセイ（バイオ・ラッド社）を用い、５９５ｎｍにおける吸光度を測定し、ウシγグロブリンを標準物質として決定した。
（２）β－グルコシダーゼ活性
　β－グルコシダーゼ活性は、セロビオースを基質として用い、グルコースＣＩＩテストワコー（和光純薬株式会社）によってグルコース濃度を測定し、１分間に１μｍｏｌのセロビオースを分解する酵素量を１Ｕとして決定した。
（３）エンドグルカナーゼ活性
　エンドグルカナーゼ活性は、カルボキシメチルセルロースを基質として用い、生じた還元糖をソモジ・ネルソン法によって測定し、１分間にグルコース換算で１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１Ｕとして決定した。
（４）セロビオハイドロラーゼ活性
　セロビオハイドロラーゼ活性は、結晶性セルロースを基質として用い、生じた還元糖をソモジ・ネルソン法によって測定し、１分間にグルコース換算で１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１Ｕとして決定した。
（５）セロビアーゼ活性
　セロビアーゼ活性は、セロビオースを基質として用い、グルコースＣＩＩテストワコー（和光純薬株式会社）によってグルコース濃度を測定し、１分間に２μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１Ｕとして決定した。
（６）アビセラーゼ活性
　アビセラーゼ活性は、Ａｖｉｃｅｌを基質として用い、生じた還元糖をソモジ・ネルソン法によって測定し、１分間にグルコース換算で１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１Ｕとして決定した。
（７）ＣＭＣアーゼ活性
　ＣＭＣアーゼ活性は、カルボキシメチルセルロースを基質として用い、生じた還元糖をソモジ・ネルソン法によって測定し、１分間にグルコース換算で１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１Ｕとして決定した。
（８）キシラナーゼ活性
　キシラナーゼ活性は、キシランを基質として用い、生じたキシロースはＤＮＳ（Ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）法を用いて測定し、１分間にキシロース換算で１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１Ｕとして決定した。
［酵素分画法による分画酵素の作製］
　陰イオン交換樹脂であるＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の条件下で吸着した画分をＮａＣｌで溶出することにより、ΔＣ２株より得られたセルラーゼからＣＢＨ１を除去した酵素標品を得た。該酵素標品を陽イオン交換樹脂であるＭｏｎｏ-Ｓに５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）の条件下で供し、吸着しなかった画分をβ－グルコシダーゼ１を除去した分画酵素（ΔＣ２－Ｃ１－Ｂ１）とした。
［オリゴ糖生産能評価］
　セルラーゼによるオリゴ糖生産能の評価は、リン酸膨潤セルロースを基質として用い、糖分析カラムであるＫＳ-８０２を用いてＨＰＬＣ分析することによって行った。
（１）単一遺伝子破壊株より得られた酵素を用いたオリゴ糖生産能の評価
　親株（トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７）、ｂｇｌ１破壊株（ΔＢ１）、ｃｂｈ２破壊株（ΔＣ２）から得られたセルラーゼのオリゴ糖生産能を評価した結果を表２および図１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２および図１５に示すように、ｂｇｌ１破壊株（ΔＢ１）より得られたセルラーゼを用いたオリゴ糖生産により、親株と比較して、２．５倍ものセロビオースが得られた。
（２）酵素遺伝子３重破壊株より得られた酵素を用いたオリゴ糖生産能の評価
　ｃｂｈ１、ｃｂｈ２およびｂｇｌ１破壊株（ΔＣ２ΔＣ１ΔＢ１、酵素遺伝子３重破壊株）から得られたセルラーゼのオリゴ糖生産能を評価した結果を表３および図１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３および図１６に示すように、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２およびｂｇｌ１破壊株から得られたセルラーゼを用いたオリゴ糖生産により、セロビオースに加えて、セロトリオースおよびセロテトラオースの生産量が増加することがわかった。
（３）酵素分画法により得られた酵素と、３重遺伝子破壊株より得られた酵素を用いたオリゴ糖生産能の評価
　親株（トリコデルマ・リーセイＰＣ３－７）より得られたセルラーゼからＣＢＨ１、ＣＢＨ２およびβ－グルコシダーゼ１を除去した分画酵素（ΔＣ２－Ｃ１－Ｂ１）、およびｃｂｈ１、ｃｂｈ２およびｂｇｌ１破壊株（ΔＣ２ΔＣ１ΔＢ１、酵素遺伝子３重破壊株）より得られたセルラーゼを用いてオリゴ糖生産能を評価した。その結果を表４および図１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４および図１７に示すように、酵素遺伝子３重破壊株より得られたセルラーゼは、分画酵素と同等のオリゴ糖生産能を示し、三糖であるセロトリオースについても優れた生産性を示すことがわかった。
（４）酵素遺伝子４重破壊株より得られた酵素を用いたオリゴ糖生産能の評価
　ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｂｇｌ１およびｅｇｌ１破壊株（ΔＣ２ΔＣ１ΔＢ１ΔＥＧ１、酵素遺伝子４重破壊株）から得られたセルラーゼのオリゴ糖生産能を評価した結果を表５および図１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 
　表５および図１８に示すように、酵素遺伝子４重破壊株より得られたセルラーゼは、分解酵素と同等のオリゴ糖生産能を示し、かつ三糖であるセロトリオースについても優れた生産性を示すことが分かった。ｅｇｌ１遺伝子の破壊は三糖以上のセロオリゴ糖生産についてより高い効果があることが分かった。
（５）酵素遺伝子４重破壊株より得られた酵素を用いたオリゴ糖生産能および糖化時間の影響
　図１９に示すように、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｂｇｌ１およびｅｇｌ１破壊株（ΔＣ２ΔＣ１ΔＢ１ΔＥＧ１、酵素遺伝子４重破壊株）から得られたセルラーゼによるセロトリオースの生産量は、糖化時間が７２時間のとき最大０．１９ｇ／ｇ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅであった。７２時間以上糖化を行ったとき、三糖の生産量はほぼ変化しなったが、二糖および単糖の生産量は増加した。このことから、酵素糖化７２時間のとき三糖の生産速度とセロトリオースの分解速度が平衡状態にあることが分かった。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１３年３月１５日付で出願された日本特許出願（特願２０１３－０５３１６６）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　セロオリゴ糖は種々の生理活性機能を有すると考えられ、機能性食品の原料として非常に有用であると考えられるが、生産法の煩雑さおよび生産コストの高さから産業化へといたっておらず、セロオリゴ糖として販売されているもののほとんどは二糖であるセロビオースが９割以上を占めている。また純粋なセロ三糖以上のセロオリゴ糖は入手困難でありその生理機能解析もままならない状況である。本発明のセルラーゼ生産菌の変異株は、セロビオースだけでなくさらなる三糖以上のオリゴ糖を生産できるため、産業上および学術上非常に有用である。

Claims (13)

  1. 　セロビオハイドロラーゼ遺伝子およびβ-グルコシダーゼ遺伝子が破壊されているセルラーゼ生産菌の変異株。
  2. 　前記セロビオハイドロラーゼ遺伝子が糖質加水分解酵素ファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　Ｆａｍｉｌｙ，ＧＨＦ）６に属する遺伝子およびＧＨＦ７に属する遺伝子であり、前記β－グルコシダーゼ遺伝子がＧＨＦ１またはＧＨＦ３に属する遺伝子である請求項１に記載の変異株。
  3. 　前記β－グルコシダーゼ遺伝子がＧＨＦ３に属する遺伝子である請求項２に記載の変異株。
  4. 　さらに、エンドグルカナーゼ遺伝子が破壊されている請求項１記載の変異株。
  5. 　前記エンドグルカナーゼ遺伝子がＧＨＦ７に属する遺伝子である請求項４に記載の変異株。
  6. 　前記セルラーゼ生産菌がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物である請求項１～５のいずれか１項に記載の変異株。
  7. 　前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）からなる群から選ばれる１である請求項６に記載の変異株。
  8. 　前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイである請求項７に記載の変異株。
  9. 　前記セロビオハイドロラーゼ遺伝子がｃｂｈ１遺伝子およびｃｂｈ２遺伝子であり、前記β-グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１遺伝子である請求項８に記載の変異株。
  10. 　前記エンドグルカナーゼ遺伝子がｅｇｌ１遺伝子である請求項８または９に記載の変異株。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の変異株を培養することにより、セルラーゼを生産することを特徴とするセルラーゼの生産方法。
  12. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の変異株が生産するセルラーゼを用いてセルロース系物質を分解する工程を含むセロオリゴ糖の製造方法。
  13. 　セルラーゼ生産菌の変異株の作製方法であって、セロビオハイドロラーゼ遺伝子およびβ-グルコシダーゼ遺伝子を破壊する変異株の作製方法。
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