KR20180026665A - 아라비노자일로-올리고당류를 포함하는 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분자당, 주사슬의 자일로오스 단위들 중 하나에 결합된 적어도 하나의 아라비노오스 단위를 포함하는 아라비노자일로-올리고당 조성물에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 아라비노오스 단위는 α-L-아라비노퓨라노실이며, 상기 조성물은 1-10의 중합도를 갖는 자일로-올리고당 주사슬을 가진다.

Description

아라비노자일로-올리고당류를 포함하는 제제
본 발명은 아라비노자일로-올리고당류(arabinoxylo-oligosaccharides)를 포함하는 제제들로서, 상세하게는 식품 또는 음료의 성분들 또는 영양 보충제들로서 유용한, 아라비노자일로-올리고당류를 포함하는 제제들 뿐만 아니라 상기 제제들을 제조하기 위한 방법들에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 또한 자일로-올리고당류(xylo-oligosaccharides) 및 아라비노자일로-올리고당류 간의 혼합물을 포함하는 기존의 프리바이오틱(prebiotic) 제형들 내에서 아라비노자일로-올리고당류의 개선된 생성에 관한 것이다.
자일란 헤미셀룰로오스류(xylan hemicelluloses)는 식물계에서 셀룰로오스(cellulose)에 이어 두 번째로 가장 풍부한 생체고분자(biopolymer)이다. 고등 식물 내 모든 자일란류(xylans)에 공통된 특징은 그들의 β-(1→4)-결합 D-자일로피라노실(xylopyranosyl, Xylp) 잔기(residue)들의 주사슬이다. 자일로오스(xylose)외에 다른 당류를 함유하는 자일란류는 헤테로자일란(heteroxylan)이라고 부르며, 쌍떡잎 식물류의 2차 세포벽에서 발견되는 글루쿠로노자일란류(glucuronoxylans, GX), 또는 곡물류의 1차 세포벽에서 발견되는 아라비노자일란(arabinoxylan, AX)으로 나뉘어질 수 있다. 곡물류에서의 아라비노자일란(AX) 함량 및 조성물은 식물학상의 출처, 품종 및 조직에 따라 다르다. 대부분의 AX는 겨의 외피 조직들(외측 및 내측 과피, 종피, 주심 표피 및 연관된 호분층)에서 발견되지만, 전분질 배유 또한 상당한 양을 함유한다. AX는 물 추출성(water-extractable, WE-AX) 또는 물 비추출성(water-unextractable, WU-AX)으로 분류될 수 있다. 물에서의 용해도는 다른 세포벽 성분들과의 공유 및/또는 비공유 결합에 의해 제한된다. AX는 쉽게 용해되는 반면, 표면에는 약하게 결합된다.
일반적으로 4개의 주요 구성 요소가 곡물 AX내에 존재한다: I) 비치환 자일로피라노실(Xylp) 단위들(uXyl); II) Xylp 단위에 결합된 α-(1→2)-결합 L-아라비노퓨라노실(arabinofuranosyl, Araf)(mXyl2); III) Xylp 단위에 결합된 α-(1→3)-결합 Araf(mXyl3); 및 IV) Xylp 단위에 결합된 이중 α-(1→2) 및 α-(1→3)-결합 Araf(dXyl). 또한, 갈락토오스(galactose) 및 글루쿠론산(glucuronic acid)들은 곡물의 외부 조직의 AX 내에 존재할 수 있다. 주로 페룰산(ferulic acid, FA)인 하이드록시신나믹산 유도체(hydroxycinnamic acid derivative)들은 물 속에서 산화적 겔화(oxidative gelation)(디하이드로페룰산(dihydrodiferulic acid)들의 교차 결합) 및 항산화제 성질을 유발하는 몇 개의 Araf 치환기들 상에 O-5를 위치시키도록 에스테르 결합될 수 있다. AX에서 아라비노오스(arabinose) 및 자일로오스(xylose)의 몰비(A/X)는 위장관(GIT) 내의 효소 가수분해, 용해도 및 발효성 성질에 관한 한 중요한 특성이다.
짧은 당 중합체인 올리고당류는 열/화학적 또는 효소적 방법들을 이용한 AX 주사슬의 부분 가수분해에 의해 유도될 수 있다. 곡물류의 AX만을 고려한다면, 올리고당류의 두 주요 군은 효소 가수분해로부터 수득될 수 있다: 자일로-올리고당류(XOS) 및 아라비노자일로-올리고당류(AXOS). XOS는 일반 분자식 C5nH8n+2 O4n+1로 β-(1→4) 결합들에 의해 결합되는 자일로오스 올리고머(oligomer)들이며, n은 자일로오스 단위들 2-10의 개수이다. 상기 XOS는 X2: 자일로비오스(xylobiose), X3: 자일로트리오스(xylotriose), X4: 자일로테트라오스(xylotetraose), X5: 자일로펜타오스(xylopentaose), X6: 자일로헥사오스(xylohexaose), X7: 자일로헵타오스(xyloheptaose), X8: 자일로옥타오스(xylooctaose), X9: 자일로에니아오스(xyloenneaose) 및 X10: 자일로데카오스(xylodecaose)이다. 한편, AXOS는 자일로오스 단위들 중 하나에 곁사슬로서 연결된 적어도 하나의 Araf 기를 포함하는 주사슬로서 XOS를 포함한다. 얼마나 많은 Araf 기가 어떤 잔기에 연결되느냐에 따라 그리고 화학 결합의 유형 (1→2) 및/또는 (1→3)에 따라, 많은 다른 AXOS 조합이 가능하다. 아라비노자일란-올리고당류(arabinoxylan-oligosaccharides, (A)XOS)는 자일로-올리고당류(XOS) 및 아라비노자일로-올리고당류(AXOS)의 혼합물을 포함하며, 시판되는 자일라나제(xylanase)들로 효소 가수분해한 후에 수득된다.
자일라나제들은, 예를 들어, 펄프 및 제지 가공, 바이오 연료 생산, 제빵 및 양조 산업들 그리고 동물 사료의 가공에 이용된다. 상기 효소들은 자일란 및 자일란 유래의 올리고당류에서 발견되는 β-(1→4)-자일로시드 결합(xylosidic linkage)들을 가수분해할 수 있다. 사용된 자일라나제에 따라서, XOS의 상이한 크기 및 AXOS 구조들이 생성될 수 있다. 10족의 자일라나제들은 작은 최종 생성물들을 생성하는 것으로 알려져 있다. 이는 AX의 주요 가수분해 생성물들로서 자일로스 및 X2의 생성과 일치한다. 10족의 자일라나제들에 의해 생성된 가장 작은 AXOS는 삼당류(A3X)이다. 11족의 자일라나제들은 10족과 동일한 촉매 기전을 갖지만, 그 활성은 일반적으로 올리고머보다는 중합체 기질들 상에서 더 높으며, 11족의 자일라나제들은 10족과 비교하여 불용성 기질들에 대하여 더 높은 활성을 갖는다. 11족 자일라나제들에 의한 주요 가수분해 생성물들은 자일로오스, X2 및 X3인 반면, 가장 작은 AXOS는 4당류(A3XX)이다.
"장내 미생물총(GI microbiota)의 조성물 및/또는 활성에 특정 변화를 유발함으로써 숙주의 건강에 이점(들)을 부여하는, 선택적으로 발효된 성분"으로 정의되는 XOS 및 AXOS에 새롭게 떠오르고 있는 프리바이오틱스(prebiotics)로서의 상업적 관심이 있다. 상기 화합물들의 프리바이오틱 성질에 대한 상당한 증거들은 프리바이오틱의 모든 기준을 충족하는 것으로 입증된 체외 및 체내 시험들을 기반으로 하여 현재 이용 가능하다. XOS 및 AXOS는 건강을 증진시키는 짧은 사슬 지방산들인 아세트산염, 젖산염, 프로피온산염 및 낙산염(butyrate)을 생성하는 대변의 미생물총에 의해 발효된다. 올리고당류의 크기에 따라, 서로 다른 대사성 산들이 생성된다. XOS 및 AXOS의 프리바이오틱 효과는 올리고당류의 크기 및 아라비노오스 치환과 밀접하게 연관되며; 탄소원으로서 활용되기 위해서 대부분의 비피더스균에 대하여 작은 크기가 요구된다. 따라서 박테리아를 활용하는 모든 XOS가 AXOS를 활용할 수는 없기 때문에, 상기 AXOS에 연결된 Araf 기(들)은 위장관(GIT) 내 발효성 성질에 있어 중요한 특징이다.
비피더스균은 면역체계 발달을 자극하고, 비타민를 생성하고, 병원균을 억제하고, 혈액 내 암모니아 및 콜레스테롤을 줄이며, 항생제 치료 후 건강한 장으로 회복시키는 능력 때문에 가장 중요한 유익균 군들 중 하나로 간주된다. 비피더스균들 간에 XOS 및/또는 AXOS를 이용하는 능력은 균주 의존적이며, 이는 균주들이 그들의 탄수화물 선호도를 기반으로 분류될 수 있음을 의미한다. 비피더스균은 아라비노오스, 자일로오스, XOS 또는 AXOS를 발효시키는 능력을 기반으로 다섯 개의 서로 다른 군(I-V)으로 분류될 수 있다. 클러스터(cluster) I에서 균주들은 XOS 또는 AXOS를 이용할 수 없다. 클러스터 II에서 균주들은 AXOS에 존재하는 아라비노오스 치환기들을 발효시킬 수 있다. 클러스터 III은 XOS 주사슬을 자일로테트라오스까지 발효시킬 수 있지만 좀 더 제한된 AXOS의 소비를 가지는 균주들을 함유한다. 클러스터 IV 및 클러스터 V에서 균주들은 XOS 및 AXOS 모두의 광범위한 분해를 포함한다.
종래 기술에서 AX로부터의 프리바이오틱스의 제조는 AX 또는 AX 함유 물질의 자일라나제 가수분해를 통해 수득된 XOS 및 AXOS 모두의 혼합물을 포함하는 (A)XOS 생성물들을 포함한다. EP 2　265　127에서, 프리바이오틱 (A)XOS 제제들은 10족 및/또는 11족 자일라나제를 이용하여 밀기울로부터 제조된다. 상기 응용은 Swennen 외(2006)에 의한 방법을 기반으로 하며, 그 최종 제제는 0.25-0.26의 낮은 A/X 비로 나타내는 상대적으로 적은 아라비노오스 함량을 포함하는 XOS 및 AXOS간의 혼합물이다(Swennen 외, 2006, 도2a). 상기 제제는 또한 자일로오스를 함유하며, 이는 프리바이오틱으로 간주되지 않으며 바람직하게는 최종 산물에서 기피하게 된다. 따라서 EP 2 265 127 및 현재까지의 과학 문헌에 기재된 AX의 모든 프리바이오틱 제제는, 잘 확립된 10족 및/또는 11족 자일라나제들에 의한 효소 가수분해가 항상 자일로오스, XOS 및 AXOS를 생성한다는 사실 때문에 자일로오스, XOS 및 AXOS의 혼합물들임이 분명하다.
따라서 현 기술의 한계는 자일로오스 및 XOS의 동반형성을 전혀 포함하지 않거나 아주 적게 포함하는 순수한 프리바이오틱 AXOS 조성물들을 생성하게 된다. 종래 기술에서도, 아라비노자일로-올리고당 제제들이 발견될 수 있지만, AXOS로부터 좀 더 순수하고 특정한 프리바이오틱스 제제가 필요하다.
본 발명은 어떻게 프리바이오틱 AXOS가, 자일로오스 및 XOS를 생성하지 않으면서 아라비노자일라나제(arabinoxylanase)를 이용하여 AX로부터 생성될 수 있는지를 기술한다. 상기 제제들은 자일로오스 및 XOS없이 올리고당류를 함유한 아라비노오스의 그들의 조성물에 있어서 특별하다. 비피더스균의 특정 균주들을 구체적으로 자극할 수 있는 능력은 상기 제제들을 더 선택적인 프리바이오틱으로서 유용하게 만든다. 일 실시예에서 본 발명은 분자당, 주사슬의 자일로오스 단위들 중 하나에 결합된 적어도 하나의 아라비노오스 단위를 포함하는 AXOS 조성물에 관한 것이며, 상기 적어도 하나의 아라비노오스 단위는 α-L-아라비노퓨라노실이며, 상기 조성물은 1-10의 중합도를 갖는 XOS 주사슬을 포함한다. 다른 실시예에서 상기 AXOS 조성물은 0.3-0.6의 평균 아라비노오스 치환도를 갖는다. 또 다른 실시예에서 상기 AXOS 조성물은 0.2-0.7의 평균 아라비노오스 치환도를 갖는다. 순수 AXOS의 응용은 특정 비피더스균 군들을 선택적으로 자극하는 것이다. 상기 제제들은 비피더스균을 추가하거나 추가하지 않고서 식품 또는 음료 성분들 내에 또는 영양 보충제들로서 이용될 수 있다. 일 실시예에서 상기 AXOS 조성물은 비피도박테리움 종(Bifidobacterium spp.)의 성장을 자극하도록 선택적으로 조정된다. 다른 실시예에서 상기 비피도박테리움 종은 올리고당류 상에서 AXOS 또는 아라비노오스 치환기들을 발효시키도록 조정된 균주들에 속한다. 또 다른 실시예에서 상기 비피도박테리움 종은 비피도박테리움 아도레스센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 갈리쿰(Bifidobacterium gallicum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 안구래텀(Bifidobacterium angulatum) 또는 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로 본 발명은 또한 XOS 및 AXOS 간의 혼합물들을 포함하는 기존의 프리바이오틱 (A)XOS 제형들에서 AXOS의 개선된 생성에 관한 것이다. 일 실시예에서 본 발명은 AXOS 조성물을 포함하고, 추가로 비피도박테리움 종을 포함하는 신바이오틱(synbiotic) 제제에 관한 것이다. 다른 실시예에서 상기 신바이오틱 제제는 위장관 문제들을 개선하는 치료를 한다. 또 다른 실시예에서 상기 신바이오틱 제제는 식품, 사료, 음료들 또는 영양 보충제들로 이루어진 군으로부터 선택된 제품 내 성분으로서 이용된다. 또 다른 실시예에서 본 발명은 위장관 문제들을 개선하는 치료에서 이용하기 위한 AXOS 조성물 또는 AXOS 조성물을 포함하는 신바이오틱 제제에 관한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 AXOS 또는 AXOS 분자(들)에 연결된 아라비노오스 치환기들을 발효시키도록 조정된 비피더스균 군에 속하는 특정 장내 세균 군들을 위한 선택적 프리바이오틱스를 포함한다. 일 실시예에서 본 발명에 따라서 수득된 AXOS는 보통 XOS를 이용할 수 있는 다른 장내 세균 군들보다 비피더스균의 성장을 선택적으로 자극하기 위해 이용될 수 있다. 다른 실시예에서 II, III IV 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 클러스터의 균주들은 AXOS만을 함유한 제제들로 인하여 선택적으로 자극된다. 다른 좀 더 구체적인 실시예에서 비피더스균의 균주들은 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 DSMZ 20219(클러스터 2), 비피도박테리움 아도레스센티스 DSMZ 20083(클러스터 3), 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 CCUG 15137(클러스터 4) 또는 비피도박테리움 카테눌라텀 DSMZ 16992(클러스터 5)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 다양한 출발점들 및 그로 인한 다양한 출발 물질이 본 발명에 따른 AXOS 조성물을 제조하기 위한 방법에서 이용될 수 있음을 암시한다. 일 실시예에서 배유 AX는 출발 물질로서 이용된다. 다른 실시예에서 겨는 출발 물질로서 이용된다. 다양한 종류의 곡물 가루 분획물들 또는 겨를 고려해 볼 만하며 본 발명은 출발 물질의 선택에 의해 제한되는 것으로 간주되지 않는다. 일 실시예에서 상기 출발 물질은 배유 AX, 겨, 겉껍질 또는 짚으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 더 구체적인 실시예에서 겨의 상기 출발 물질은 호밀, 옥수수, 기장류, 쌀, 보리, 귀리 또는 밀과 같은 곡물류의 군으로부터 선택되지만, 이에 국한되지는 않는다. 다른 가능한 출발 물질들은 퀴노아, 아마란스 또는 메밀과 같은 유사 곡물류이지만, 이에 국한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 출발 물질은 상기 식물들 중 임의의 것의 곡물 가루 또는 겨이다. 일 실시예에서 상기 출발 물질은 배유 AX를 포함하는 가루이다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 아래의 단계들을 포함하는 곡물 가루로부터 AXOS 조성물을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다:
A. 곡물 가루로부터 배유 아라비노자일란 분획물을 추출 및 분리하는 단계;
B. 단계 A에서 수득된 생성물로부터 전분 및 단백질들을 선택적으로 제거하는 단계;
C. 단계 A의 배유 아라비노자일란 또는 단계 B의 생성물을 아라비노퓨라노시다아제(arabinofuranosidase)들, 바람직하게는 이중 치환된 β-(1→4)-결합 D-자일로피라노실 단위들(dXyl)에서 α-(1→3)-결합 L-아라비노퓨라노실을 제거할 수 있는 것으로 선택적으로 처리하는 단계;
D. 단계 A, 단계 B 또는 단계 C에서 수득된 생성물에 아라비노자일라나제를 첨가하는 단계; 및
E. 단계 D에서 수득된 물질을 건조하는 단계.
일 실시예에서 단계 C는 약산의 첨가를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 출발 물질이 곡물 가루일 때, A/X 비는 0.2-0.7의 구간, 바람직하게는 0.28-0.65, 바람직하게는 0.35-0.50, 바람직하게는 0.38-0.45, 바람직하게는 0.4이다. 일 실시예에서 본 발명은 배유 AX가 아라비노퓨라노시다아제로 효소 처리되는 단계를 포함한다. 일 실시예에서 상기 아라비노퓨라노시다아제는 아라비노자일란 아라비노퓨라노하이드로라제(arabinoxylan arabinofuranohydrolase)들의 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 아라비노자일란 아라비노퓨라노하이드로라제-D3 또는 아라비노자일란 아라비노퓨라노하이드로라제-m2,3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 효소 처리의 목적은, AXOS의 수율을 개선하기 위해 Araf 기들의 분획물을 제거하는 것이다. 다른 실시예에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 겨로부터 AXOS 조성물을 제조하기 위한 방법이다:
A'. 상기 겨로부터 전분 및 단백질들을 제거하는 단계;
B'. 단계 A로부터 고체상을 회복하는 단계;
C'. 가용성 상을 제공하기 위해 상기 고체상을 알칼리 용액, 알칼리 및 과산화 용액으로 처리하거나 상기 고체상을 열로 처리하는 단계;
D'. 단계 C의 아라비노자일란을 포함하는 가용성 상을 중화시키고 아라비노자일란을 포함하는 상기 가용성 상을 회복하는 단계;
E'. 아라비노오스 대 자일로오스의 몰비를 0.2-0.7로, 바람직하게는 0.35-0.5, 바람직하게는 0.38-0.45, 바람직하게는 0.4로 수득하기 위해 아라비노퓨라노시다아제들 또는 약산성 용액을 이용하여 단계 D에서의 가용성 상을 함유한 아라비노자일란으로부터 아라비노오스를 제거하는 단계;
F'. 단계 E로부터 수득된 상기 아라비노자일란을 회복하기 위해, 바람직하게는 침전 또는 막 분리에 의해 분리하는 단계;
G'. 단계 F로부터의 상기 아라비노자일란에 아라비노자일라나제를 첨가하는 단계; 및
H'. 단계 G에서 수득된 물질을 건조하는 단계.
일 실시예에서 A/X 비는 0.2-0.7의 구간, 바람직하게는 0.28-0.65, 바람직하게는 0.35-0.5, 바람직하게는 0.38-0.45, 바람직하게는 0.4이다. 다른 실시예에서 상기 A/X 비는 0.4이다. 또 다른 실시예에서 본 발명은 AXOS 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 AXOS 조성물은 아라비노자일란에 특이적인 엔도자일라나제를 이용하여 제조된다. 다른 더 구체적인 실시예에서 본 발명은 AXOS 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 아라비노자일란에 특이적인 엔도자일라나제는 아라비노자일라나제이다.
추가로, 다른 실시예에서, 본 발명은 AXOS 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 단계 C'는 아라비노퓨라노시다아제들로의 선택적 처리를 포함하여 AXOS의 수율을 10-100%로, 더 바람직하게는 50-100%로, 더욱 더 바람직하게는 70-100%, 한층 더 바람직하게는 85-100%, 및 가장 바람직하게는 100%로 증가시킨다. 일 실시예에서 상기 증가된 수율은 95-99%이다.
겨의 AX로부터 AXOS 조성물을 제조할 때, 추가적인 단계들이 가능하다. 일 실시예에서, 본 발명은 AXOS 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 단계 A'는 전분 및 단백질들을 아밀라아제(amylase)들 및 프로테아제(protease)들로 각각 제거하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서 본 발명은 AXOS 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 단계 C'는 다른 추출 수단들을 선택적으로 이용하여 알칼리 및 과산화물로 추출하는 것을 포함한다. 다양한 열처리 수단들이 단계 C'에서 가능하다. 일 실시예에서 상기 단계 C'는 수용성 AX 함량을 높이기 위해 증기 처리하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서 상기 단계 C'는 가압 수처리하는 것을 포함한다. 또 다른 실시예에서 본 발명은 AXOS 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 단계 E는 AXOS의 수율을 높이기 위해 선택적 처리하는 것을 포함한다. 일 실시예에서 상기 단계 E는 아라비노퓨라노시다제들로 선택적 처리하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서 단계 E는 무기산류, 바람직하게는 염산, 바람직하게는 황산, 바람직하게는 인산 또는 바람직하게는 질산과 같은, 그러나 이에 국한되지는 않는, 약산성 용액으로 선택적 처리하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 XOS 및 AXOS 함유 제제들 내에서 AXOS의 생성을 개선하기 위한 아라비노자일라나제의 용도에 관한 것이다. 일 실시예에서 본 발명은 (A)XOS 내에서 AXOS의 생성을 개선하기 위한 아라비노자일라나제의 용도에 관한 것이며, 상기 XOS 및 AXOS의 제제는 10족 또는 11족 자일라나제를 이용하여 제조된다. 본 발명의 일 양태는 분자당, 주사슬의 자일로오스 단위들 중 하나에 결합된 적어도 하나의 아라비노오스 단위를 포함하는 아라비노자일로-올리고당 조성물에 관한 것이며, 상기 적어도 하나의 아라비노오스 단위는 α-L-아라비노퓨라노실이고, 상기 조성물은 1-10의 중합도를 갖는 자일로-올리고당 주사슬을 포함하며, 상기 조성물은 10% 이하의 단당류 및/또는 10% 이하의 자일로올리고당류를 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1.6% 이하, 1% 이하, 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하의 양으로 존재하는 단당류를 포함할 수 있다. 일 실시예에서 본 발명에 따른 조성물은 0.01-20%, 0.05-10%, 0.01-5%, 0.05-5%, 0.05-2%, 0.01-0.1%, 0.01-1%, 0.05-1.8% 또는 0.05-1.5%의 양으로 존재하는 단당류를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1.6% 이하, 1% 이하, 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하의 양으로 존재하는 자일로올리고당류를 포함할 수 있다. 일 실시예에서 본 발명에 따른 조성물은 0.01-20%, 0.05-10%, 0.01-5%, 0.05-5%, 0.05-2%, 0.01-0.1%, 0.01-1%, 0.05-1.8%, 또는 0.05-1.5%의 양으로 존재하는 자일로올리고당류를 포함할 수 있다. 일 실시예에서 상기 단당류는 아라비노오스를 포함할 수 있다. 일 실시예에서 상기 단당류는 자일로오스를 포함할 수 있다. 일 실시예에서 본원의 단당류 및/또는 자일로올리고당류의 양은 제제의 건조 중량(wt%)을 기준으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태는 자일로-올리고당류 및 아라비노자일로-올리고당류 함유 제제들 내에서 아라비노자일로-올리고당류의 생성을 개선하기 위한 아라비노자일라나제의 용도에 관한 것이다. 일 실시예에서 자일로-올리고당류 및 아라비노자일로-올리고당류의 제제는 11족 자일라나제를 이용하여 제조된다. 다른 실시예에서 상기 아라비노자일라나제는 글리코시드 가수분해효소(glycoside hydrolase) 5족에 속하는 자일라나제이다. 다른 실시예에서 아라비노자일로-올리고당류는 곡물 섬유질로부터 생성된다. 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 아라비노자일라나제의 용도는 다음의 단계들을 포함한다:
A'. 곡물 섬유질로부터 전분 및 선택적으로 단백질들을 제거하는 단계;
B'. 단계 A로부터 고체상을 회복하는 단계;
C'. 단계 B로부터의 상기 고체상을, 비-수용성 아라비노자일란을 가수분해할 수 있는 자일라나제로 처리하는 단계;
D'. 아라비노자일로-올리고당류의 생성을 개선하기 위해 고도로 치환된 아라비노자일란을 가수분해할 수 있는 아라비노자일라나제를 단계 C에 첨가하는 단계;
E'. 올리고당류를 포함한 단계 D로부터 상기 가용성 상을 회복하는 단계;
F'. E 단계로부터 상기 가용성 상을 선택적으로 정제하는 단계; 및
G'. 단계 F로부터 가용성 상을 농축하거나 건조하는 단계.
다른 실시예에서 상기 곡물 섬유질은 호밀, 옥수수, 기장류, 쌀, 보리, 귀리 또는 밀로부터 유래된다.
도 1. 상이한 체류 시간(retention time)에 의해(표 1) 확인되는 것처럼 수득된 상이한 생성물들이 보여주는 10족 및 11족 자일라나제들로 수득된 XOS 및 AXOS 혼합물들과는 다른, 아라비노자일라나제에 의해 생성된 AXOS.
도 2. 하부 크로마토그램: 밀 배유 AX(피크 1-13)로부터 생성된 주요 AXOS 및 상부 크로마토그램: 자일로오스 및 XOS 주사슬을 노출하기 위해 아라비노퓨라노시다제로 처리된 시료,
X: 자일로오스, X2: 자일로비오스, X3: 자일로트리오스, X4: 자일로테트라오스, X5: 자일로펜타오스, X6: 자일로헥사오스, X7: 자일로헵타오스 및 X8: 자일로옥타오스.
도 3. 하부 크로마토그램: 호밀 배유 AX(피크 1-13)로부터 생성된 주요 AXOS 및 상부 크로마토그램: 자일로오스 및 XOS 주사슬을 노출하기 위해 HCl로 처리된 시료,
X: 자일로오스, X2: 자일로비오스, X3: 자일로트리오스, X4: 자일로테트라오스, X5: 자일로펜타오스, X6: 자일로헥사오스, X7: 자일로헵타오스, X8: 자일로옥타오스, X9: 자일로에니아오스 및 X10: 자일로데카오스.
도 4. 0.43에서의 최고 수율이 나타내는 것처럼 0.35-0.61의 범위에 있는 아라비노자일라나제 AXOS의 최적의 수율.
도 5. 상부 크로마토그램: 원래 조성물(하부 크로마토그램)에서 체류시간 내에서 올리고당류가 더 짧아지고 AXOS 피크(검정색 화살표)가 소멸하는 방향으로 이동하는 것으로 나타나는 것처럼 아라비노자일라나제의 첨가에 따라 XOS 및 AXOS 함유 혼합물들 내에서 AXOS(흰색 화살표)의 개선된 생성.
도 6. 소멸해가는 피크 1-6이 나타내는 것처럼 호밀 배유 AX의 아라비노자일라나제 유래된 AXOS에 대한 비피도박테리움 아도레스센티스 ( Bifidobacterium adolescentis)의 활용.
도 7. 남아 있는 피크 1 - 6이 나타내는 것처럼 호밀 배유 AX의 아라비노자일라나제 유래된 AXOS에 대한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 비활용.
아라비노자일라나제들은 비치환된 자일란들을 공격하지 않기 때문에 AX에 대한 그들의 특이성에서 독특하다. 상기 효소들에 의해 생성된 올리고당류는 환원 말단 Xylp 단위에 결합된 적어도 하나의 (1→3) Araf 기를 함유한다. 상기 효소들의 군은 AX 또는 AX 함유 물질들로부터 프리바이오틱 AXOS를 생성함에 있어 이전에는 이용되거나 고려되지 않았다. 본 발명에 있어서 아라비노자일라나제는 AX 함유 물질들로부터 AXOS를 생성하기 위해 이용된다. 상기 아라비노자일라나제에 의해 수득된 상기 AXOS 제제들은 그들의 AXOS 조성물에서 독특한 프리바이오틱스이며 자일로스 및 XOS가 부족하다. AX로부터 프리바이오틱스를 만들기 위해 이용되는 종래 기술의 자일라나제들과 비교할 때, 본 발명의 아라비노자일라나제는 수득된 가수분해 생성물들 내에서 차이를 분명하게 보여준다(도 1 및 표 1). AXOS의 생성은 A/X 비를 0.2-0.7의 구간에서, 바람직하게는 0.28-0.65, 바람직하게는 0.35-0.5, 바람직하게는 0.38-0.45, 바람직하게는 0.4에서 선택함으로써 추가로 최적화된다. 상기 AXOS 제제들은 AXOS 또는 AXOS 분자(들)에 연결된 아라비노오스 치환기들을 발효시키도록 조정된 비피더스균 군에 속하는 특정 장내 세균 군들에 대한 선택적 프리바이오틱스로서 특히 유용하다.
표 1. 도 1의 피크 체류 시간들
Figure pct00001
참고: 자일로-올리고당 표준 체류 시간: 자일로오스: 2.667; 자일로비오스: 3.700; 자일로트리오스: 5.600; 자일로테트라오스: 7.825; 자일로펜타오스: 9.359 및 자일로헥사오스: 10.384.
제 1 실시예에서 AXOS는 밀 및 호밀의 배유(곡물 가루) AX로부터 생성되지만, 이에 국한되지는 않는다. 상기 배유 AX는 AXOS의 수율을 개선하기 위해 Araf 기들의 분획물을 제거하도록 아라비노퓨라노시다제들로 선택적으로 효소 처리된다. 배유 AX로부터 생성된 순수 AXOS는 밀에 대하여 도 2 및 호밀에 대하여 도 3에 나타낸다. 상기 데이터는 제제들 내에 형성된 자일로오스 또는 XOS가 없음을 나타낸다(건조 중량을 기준으로 0.1% 미만). 상기 수득된 AXOS에 연결된 모든 Araf 기를 아라비노퓨라노시다아제 또는 염산으로 제거한 후에만, 상기 자일로오스 및 XOS 주사슬들이 노출된다. 이는 수득된 모든 올리고당류가 자일로오스 및 XOS의 형성을 전혀 포함하지 않거나 아주 적게 포함하는 AXOS임을 확인한다. 모든 Araf 기를 제거한 후에 XOS 주사슬을 분석함으로써 상기 AXOS의 주사슬 중합도(DP)가 밀 배유 AX에 대하여 1 - 8(도 2) 및 호밀 배유 AX에 대하여 1 - 10(도 3)인 것으로 확인되었다. 밀 및 호밀 배유 AX의 AXOS 대부분은 3의 평균 주사슬을 가졌다(표 2).
표 2. 아라비노퓨라노시다아제 또는 HCl 처리한 밀 및 호밀의 AXOS 시료들 내에서의 자일로오스 및 XOS 함량(각각 몰 퍼센트 단위로 표시)
Figure pct00002
추가로 아라비노자일라나제에 의한 AXOS의 생성을 위해 AX 기질 내에서의 아라비노오스 함량의 영향을 측정하였다. AX로부터 수득되는 AXOS의 최고 수율은 0.43의 A/X를 이용하여 달성되었고(도 4), 이를 통해 AXOS의 최적의 생성은 A/X의 간격 = 0.61-0.35의 구간에서 이루어지며, 0.43일 때 최적에 가장 가까운 것을 알 수 있다. 이것의 중요성은 아라비노자일라나제 처리 이전이나 도중에 상기 AX 기질로부터 Araf 기들을 부분적으로 제거함으로써 AXOS의 생성을 최적화하는 데 있다.
상기 기술의 다른 응용은 XOS 및 AXOS를 모두 함유한 혼합물들 내에서의 AXOS의 개선된 생성으로 제시되었다. 11족 자일라나제의 (A)XOS 혼합물에 아라비노자일라나제를 첨가함으로써, 신규 AXOS는 상기 11족 자일라나제에 의해 가수분해되지 않는 폴리올리고당류 및 올리고당류를 분해함으로써 형성된다(도 5). 상기 XOS 및 AXOS 혼합물들은 종래 기술의 자일라나제 처리들을 이용하여 수득될 수 있으며, 아라비노자일라나제의 첨가는 상기 제제들 내에서 AXOS의 생성을 개선시키는 한 방법이다. XOS 및 AXOS를 함유한 상기 생성물들의 프리바이오틱 성질을 개선함에 있어 EP 2 265 127 B1에 언급된 것들과 유사한 제제들이 있다.
제 2 실시예에서 밀기울은 아라비노자일라나제에 의해 AXOS를 만들기에 적합한 AX의 상이한 분획물들을 만들기 위한 기질로서 이용된다. 상기 분획물들은 우선 전분 및 단백질들을 제거함으로써, 그 다음은 겨 물질로부터 AX 성분들을 추출함으로써, 상기 겨 물질로부터 분리한다. 그런 다음 순차적으로, 상기 AX는 아라비노퓨라노시다제로 효소 처리하거나, 또는 아라비노자일라나제를 이용하여 상이한 AXOS 조성물들을 만드는데 이용될 수 있는 상이한 A/X 비들의 분획물들을(표 3) 수득하기 위해 산 처리한다.
제 3 실시예에서 상기 수득된 AXOS는 보통 자일로오스 또는 XOS를 이용할 수 있는 다른 장내 세균 군들보다 비피더스균의 성장을 선택적으로 자극하는 데 이용될 수 있음이 제시된다(도 6 및 도 7). 그 이유는 상기 수득된 AXOS가, 보통 예를 들어 락토바실러스 브레비스에 의해 활용될 수 있는 자일로오스나 XOS를 함유하지 않기 때문이다. 또한 상이한 비피더스균 균주들 사이에 탄수화물 선호도에 대한 차이가 있으며, 이는 상기 AXOS가 비피더스균의 특정 균주들을 자극하는데 이용될 수 있음을 의미한다. 클러스터 II, III, IV 및 V 중 어느 하나의 균주들은 AXOS만을 함유한 제제들로 선택적으로 자극될 수 있다.
클러스터 II-V의 대표적인 균주들은 다음의 비피더스균 균주들이지만, 이에 국한되지 않는다:
* 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 DSMZ 20219(클러스터 2)
* 비피도박테리움 아도레스센티스 DSMZ 20083(클러스터 3)
* 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 CCUG 15137(클러스터 4)
* 비피도박테리움 카테눌라텀 DSMZ 16992(클러스터 5)
특히, 클러스터 4 및 클러스터 5에 속하는 균주들은 상기 전체 AXOS를 효율적으로 활용할 수 있으며 상기 수득된 AXOS와 결합하는데 특별한 관심이 있다. 하지만, AXOS 상에 존재하는 아라비노오스 치환기들을 쪼개거나 전체 AXOS를 활용할 수 있는 모든 비피더스균을 자극하는 것이 가능하다.
실시예들
실시예 1: 아라비노자일라나제 AXOS의 제조
재료 및 방법
클로스트리듐 써모셀룸(Clostridium thermocellum)의 아라비노자일라나제(CtXyl5A)는 Nzytech(Lisboa, Portugal)로부터 구입하였다. 로도테르뮤스 마리누 스(Rhodothermus marinus)의 10족 자일라나제(RmXyn10A)는 Falck 외(2013)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 시판되는 11족 자일라나제인 펜토판 모노(pentopan mono) bg는 Novozymes (Bagsvaerd, Denmark)로부터 수득하였다. 셀비브리오 자포니쿠스(Cellvibrio japonicus)의 고순도 재조합 α-L-아라비노퓨라노시다제(E-ABFCJ)는 Megazyme(Wicklow Ireland)으로부터 구입하였다. 밀(P-WAXYM, P-EDWAX30, P-ADWAX26, P-ADWAX22) 및 호밀(P-RAXY)로부터 알칼리로 추출된 배유 AX는 Megazyme으로부터 구입하였다. 10g/L의 AX 기질들을 제조 설명서에 따라 50mL의 MQ 물에 용해하였고, pH를 8M HCl에 의해 7로 조절하였다. 5족의 아라비노자일라나제 그리고 10족 및 11족의 자일라나제들을 질량 기준으로 1:1000의 효소 대 기질 비율로 첨가하였다. 아라비노자일라나제 반응들에서 2 mM의 CaCl2을 상기 효소를 안정화시키는 데 이용하였다. 모든 반응은 보온성 블록 또는 중탕을 이용하여 50℃에서 24시간 동안 실시하였다. 효소들은 95℃에서 30분 동안 시료를 배양함으로써 비활성화하였다.
상기 아라비노자일라나제 그리고 10족 및 11족 자일라나제들간의 비교는(도 1) 0.43의 A/X와 동일한 30%의 아라비노오스 함량을 포함하는 밀 배유 AX(P-EDWAX30)를 이용하여 실시하였다. 상기 AX는 이중 치환된 Xylp 단위들(dXyl)에서 모든 α-(1→3)-결합 Araf를 제거하기 위해 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus)의 아라비노퓨라노시다제로 처리하였다. 아라비노자일라나제 시료에서 자일로오스 및 XOS의 AXOS 주사슬들에 대한 특성(도 2)은 (1→2) 또는 (1→3) 단일 치환된 Xylp 단위들, mXyl2 및 mXyl3로부터 Araf를 각각 제거하는 아라비노퓨라노시다제(E-ABFCJ)를 이용하여 0.5 U/(mg AXOS)로 실시하였다. 상기 반응은 pH 5.8에서 20 mM의 인산 나트륨 완충액을 이용하여 50℃에서 24시간 동안 실시하였다. 상기 처리는 상기 AXOS로부터 Araf의 완전한 제거를 이끌었다(도 2). 호밀 배유 AX는 상기 아라비노자일라나제 반응을 48시간 동안 실시한 것을 제외하고는 밀과 동일한 방식으로 처리하였다. 상기 수득된 AXOS로부터 모든 단일 및 이중 치환된 Araf 기를 제거하기 위해, 약산성 처리를 이용하였다. 상기 pH는 희석된 HCI 용액으로 2.8로 설정하였고, 상기 시료(5 mL)는 90℃에서 24시간 동안 배양하여, 그 결과로 상기 AXOS로부터 모든 Araf 기가 거의 완전하게 제거되었다(도 3).
아라비노오스 함량 및 아라비노자일라나제로 생성된 AXOS의 수율과의 관계는 상이한 아라비노오스 함량을 포함한 밀 배유를 이용하여 측정하였다. P-WAXYM, P-EDWAX30, P- ADWAX26 및 P-ADWAX22는 각각 38%, 30%, 26% 및 22%의 아라비노오스 함량을 포함하거나 각각 A/X 0.61, 0.43, 0.35 및 0.28을 기반으로 한다(도 4). 상기 반응들은 2 mL의 반응 부피들 및 0.2 g/L의 기질 농도를 이용하여 유리 바이알 내에서 실시하였다. 아라비노자일라나제는, 상기 자일라나제 반응들에 대하여 이전에 기술된 바와 같은 조건들을 이용하여 XOS 및 AXOS 혼합물들 내에서(도 5) 더 많고 더 짧은 AXOS를 생성하기 위하여, 펜토판에 의해 생성된 (A)XOS를 처리하는데 이용되었다.
AXOS 및 XOS의 특성화
상기 수득된 AXOS 분획물들 및 XOS 주사슬들에 대한 분석은, 0.5 mL/분의 100 mM NaOH의 이동상 및 0-120 mM 아세트산 나트륨(Sigma)의 선형 구배(0-30분) 조건에서 동일한 재료의 CarboPac PA200 컬럼(250 mm x 3 mm, 5.5 μm) 및 가드 컬럼(50 mm x 3 mm)을 이용하여, ICS-5000을 이용한 펄스식 전기화학 검출기가 결합된 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High-Performance Anion-Exchange Chromatography Coupled with Pulsed Electrochemical Detection, HPAEC-PAD)로 실시하였다. 이용된 단당류 및 자일로올리고당 표준들은 다음과 같다: 아라비노오스 및 자일로오스(Sigma), 자일로비오스, 자일로트리오스, 자일로테트라오스, 자일로펜타오스 및 자일로헥사오스(Megazyme). 모든 시료는 분석 전에 0.22 μm 필터를 통해 여과하고 0.2 g/L의 최종 농도로 희석하였다.
실시예 2: 겨로부터 서로 다른 A/X 비를 가진 AX 기질들의 제조
재료 및 방법
시판되는 밀기울(Lantmannen Mill Malmo, Sweden)은 A/X로 정의되는 상이한 아라비노오스 함량을 포함한 AX를 제조하기 위한 출발 물질로서 이용하였다. 2.5 L의 DI 물에 250 g의 밀기울을 섞은 현탁액(1:9 w/v)은 HCl 8 M에 의해 pH 6.0으로 조절하고, 0.12 U/g의 내열성 α-아밀라아제(Thermamyl, SIGMA-ALDRICH)로 90℃에서 90분간 처리하여 전분을 가수분해하였다. 그런 다음, 깨끗한 투과액을 얻을 때까지 상기 밀기울을 뜨거운 수돗물로 헹구어 수용성 물질을 제거하였다. 물 내 새로운 현탁액(1:9 w/v)을 제조하여 프로테아제 0.035 U/g(Neutralse 0.8L, SIGMA-ALDRICH)로 50℃에서 4시간 동안 배양함으로써 단백질들을 제거하였다. 그 이후, 상기 밀기울을 뜨거운 수돗물로 헹구고 DI 물로 헹군 다음, 진공 건조시켰다. 전분과 단백질이 제거된 밀기울을 pH 11.5로 2%의 과산화수소(hydrogen peroxide)를 함유한 과산화수소의 알칼리 희석 용액(NaOH)으로 60℃에서 4시간 동안 200rpm의 속도로 교반 추출하여 수용성 AX를 수득하였다. 소포제 TRITON X-100을 거품 형성을 줄이기 위해 첨가하였다. 상기 추출 후, 고체들을 여과를 통해 제거하고 6000 g의 상기 용액을 20분간 원심 분리하였다(SIGMA). 상층액을 8 M HCl으로 중화시키고 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)를 첨가하여 남아 있는 과산화수소를 제거하였다. 6000 g의 상기 추출액을 20분간 다시 원심 분리하였다. 상기 상층액을 분리하고 50 mL를 8M HCl에 의해 pH 6으로 조절한 후, 시료를 37℃에서 24시간 동안 배양함으로써 비피도박테리움 아도레스센티스(Megazyme, E-AFAM2)의 5 U의 아라비노퓨라노시다제로 처리하였다. 상층액은 또한 자석판 교반기 상에서 200 rpm 속도로 90℃에서 pH 2.5의 약산성 HCl의 산에 의해 탈분지하였다. 시료(50 mL)들은 1M NaOH로 3.4, 5.1, 6.8, 및 8.6시간 후에 제거 및 중화시켰다. 모든 분획물은 3500 Da Mw 기준치(cut off)를 이용하여 투석 백(dialysis bag)(SpectrumLab, USA)으로 탈염하였다. 5L의 DI 물에서 투석을 2번 실시한 후 모든 시료를 냉동 건조시켰다.
분리된 제제들의 특성화
AX 분획물들의 단당류 조성물은 상기 시료들을 2M TFA로 110℃에서 60분간 가수분해한 후 HPAEC-PAD로 분석하였다. 상기 시료들에서 아라비노자일란의 총 함량은 임의의 자유 아라비노오스를 차감한 후 0.88배(% 아라비노오스 + % 자일로오스)로 계산하였다.
상기 수득된 단당류에 대한 분석은, 0.5 mL/분의 0.75 mM NaOH의 이동상 및 0.15 mL/분의 100 mM 염기의 후 칼럼 추가의 조건에서 동일한 재료의 CarboPac PA200 컬럼(250 mm x 3 mm, 5.5 μm) 및 가드 컬럼(30 mm x 3 mm)을 이용하여, HPAEC-PAD으로 실시하였다. 단당류(SIGMA)는 다음과 같았다: 아라비노오스, 갈락토오스, 글루코오스 및 자일로오스. 수득된 최종 A/X 분획물들은 표 3에 나열되었다.
표 3. 탄수화물 조성물(총 탄수화물류의 w/w) 및 밀기울로부터 수득된 AX 분획물들의 A/X
Figure pct00003
참고: Abf -아라비노퓨라노시다제 처리 시료
실시예 3: 아라비노자일라나제 AXOS 상의 장내 세균의 선택적 성장
재료 및 방법
호밀 배유 AX로부터 수득된 AXOS의 발효성을 시험하기 위해 이용된 박테리아 균주들은 비피도박테리움 아도레스센티스(B. 아도레스센티스) ATCC 15703 및 락토 바실러스 브레비스(L. 브레비스) DSMZ 1269이었다. B. 아도레스센티스, L. 브레비스는 모두 탄소원으로서 5 g/L의 글루코오스를 이용하여 두 번 사전 배양하였다. B. 아도레스센티스를 37℃에서 pH 6.8로 비피도박테리움 배지에 접종하였다. 상기 배지는 리터당 12.5 g의 카세인 펩톤(casein peptone), 트립신 다이제스트(tryptic digest), 6.25 g의 효모 추출물, 6.25 g의 육즙(meat extract), 6.25 g의 박토 소이톤(bacto soytone), 2.5 g의 K2PO4, 0.25 g의 MgSO4 ·7H2O, 0.0625 g의 MnSO4 ·H2O, 6.25 g의 NaCl 및 1.25 mL의 트윈(Tween) 80을 각각 함유하였다. 상기 용액에 리터당 0.25 g의 CaCl2 ·H2O, 0.5 g의 MgSO4 ·7 H2O, 1 g의 K2HPO4, 1 g의 KH2PO4, 10 g의 NaHCO3 및 2 g의 NaCl를 각각 함유한 50 mL의 염용액과 함께 5 mL의 레자주린(resazurin) 용액(25 mg/100 mL)을 첨가하였다. 상기 배지를 순차적으로 끓인 다음, N2 가스 하에서 냉각시켰다. 시스테인(cysteine)을 0.625 g/L의 농도로 첨가하고 NaOH를 이용하여 pH 6.8로 조절하였다. L. 브레비스를 MRS 액체 배지(broth) 내에서 pH 6.5로 37℃의 무산소 조건 하에서 무산소적으로 성장시켰다. 배양 실험용 모든 배지, 액체 배지 및 한천은 121℃에서 15분간 고압멸균처리하였다. 무산소 성장을 위해 사용된 모든 배양 배지는 무산소 관들 내의 산소를 질소 가스로 대체함으로써 기포를 제거하였다. 그런 다음, 모든 관을 금속 뚜껑으로 닫고 121℃에서 15분간 고압멸균처리하였다. 각각의 탄소원인 글루코오스 및 AXOS는 0.45 μm 필터를 통해 필터-살균시켰고 5 g/L의 최종 농도 및 5 mL의 총 부피로 배지에 첨가하였다. 2% v/v의 접종원을 이용하여 두 번째 사전 배양에서부터 발효 실험을 시작하였고, 시료들을 24시간 및 48시간 후에 빼냈다. 흡광도 및 pH를 0시간, 24시간 및 48시간 후에 측정한 반면, 올리고당류의 소비를 올리고당 분석에 대하여 기술된 바와 같은 조건으로 HPAEC-PAD를 이용하여 48시간 후에 분석하였다. B. 아도레스센티스는 호밀 배유 AX로부터 생성된 아라비노자일라나제 AXOS 상에서 성장할 수 있었던 반면, L. 브레비스는 상기 제제가 그 어떤 자일로오스 또는 XOS 분자들도 함유하지 않는다는 사실 때문에 성장할 수 없었다(도 6 및 도 7 각각).
표 4. 48시간 후의 흡광도 및 pH의 순변화
Figure pct00004
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Claims (23)

  1. 분자당, 주사슬의 자일로오스 단위들 중 하나에 결합된 적어도 하나의 아라비노오스 단위를 포함하는 아라비노자일로-올리고당 조성물에 있어서, 상기 적어도 하나의 아라비노오스 단위는 α-L-아라비노퓨라노실이고, 상기 조성물은 1-10의 중합도를 갖는 자일로-올리고당 주사슬을 가지며, 상기 조성물은 10% 이하의 단당류 및/또는 10% 이하의 자일로올리고당류를 포함하는, 아라비노자일로-올리고당 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 아라비노자일로-올리고당 조성물은 0.2-0.7, 바람직하게는 0.3-0.6, 바람직하게는 0.35-0.50, 바람직하게는 0.4의 평균 아라비노오스 치환도를 갖는, 아라비노자일로-올리고당 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 아라비노자일로-올리고당 조성물은 비피도박테리움 종( Bifidobacterium spp .)의 성장을 자극하도록 선택적으로 조정된, 아라비노자일로-올리고당 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 비피도박테리움 종( Bifidobacterium spp .)은 상기 올리고당류 상에서 아라비노자일로-올리고당류 또는 상기 아라비노오스 치환기들을 발효시키도록 조정된 균주들에 속하는, 아라비노자일로-올리고당 조성물.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 비피도박테리움 종은 비피도박테리움 아도레스센티스 (Bifidobacterium adolescentis ), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum ), 비피도박테리움 카테눌라텀 ( Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 아니말리스 ( Bifidobacterium animalis ), 비피도박테리움 슈도롱검 ( Bifidobacterium pseudolongum ), 비피도박테리움 갈리쿰 (Bifidobacterium gallicum ), 비피도박테리움 락티스 ( Bifidobacterium lactis ), 비피도박테리움 인판티스 ( Bifidobacterium infantis ), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum ), 비피도박테리움 안구래텀 ( Bifidobacterium angulatum) 또는 비피도박테리움 브레브 ( Bifidobacterium breve )로 이루어진 군으로부터 선택된, 아라비노자일로-올리고당 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따르는 아라비노자일로-올리고당 조성물을 포함하고 비피도박테리움 종( Bifidobacterium spp .)을 추가로 포함하는, 신바이오틱 제제.
  7. 제 6항에 있어서, 위장관 문제들을 개선하는 치료용, 신바이오틱 제제.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 식품, 사료, 음료 또는 영양 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 제품 내 성분으로서의 이용을 위한, 신바이오틱 제제.
  9. 위장관 문제들을 개선하는 치료용 제 1항 내지 제 5항에 따르는 아라비노자일로-올리고당 조성물 또는 제 6항 내지 제 8항에 따르는, 아라비노자일로-올리고당 조성물을 포함하는 신바이오틱 제제.
  10. 곡물 가루로부터 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    A. 곡물 가루로부터 배유 아라비노자일란 분획물을 추출 및 분리하는 단계;
    B. 상기 단계 A에서 수득된 생성물로부터 전분 및 단백질들을 선택적으로 제거하는 단계;
    C. 상기 단계 A의 배유 아라비노자일란 또는 상기 단계 B의 생성물을 아라비노퓨라노시다아제, 바람직하게는 이중 치환된 β-(1→4)-결합 D-자일로피라노실 단위들(dXyl)에서 α-(1→3)-결합 L-아라비노퓨라노실을 제거할 수 있는 것으로 선택적으로 처리하는 단계;
    D. 상기 단계 A, 상기 단계 B 또는 상기 단계 C에서 수득된 생성물에 아라비노자일라나제를 첨가하는 단계; 및
    E. 상기 단계 D에서 수득된 물질을 건조하는 단계;를 포함하는 곡물 가루로부터 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법.
  11. 겨로부터 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    A'. 상기 겨로부터 전분 및 단백질들을 제거하는 단계;
    B'. 상기 단계 A로부터 고체상을 회복하는 단계;
    C'. 가용성 상을 제공하기 위해 상기 고체상을 알칼리 용액, 알칼리 및 과산화 용액으로 처리하거나 상기 고체상을 열로 처리하는 단계;
    D'. 상기 단계 C의 아라비노자일란을 포함하는 상기 가용성 상을 중화시키고 아라비노자일란을 포함하는 상기 가용성 상을 회복하는 단계;
    E'. 아라비노오스 대 자일로오스의 몰비를 0.2-0.7로, 바람직하게는 0.35-0.5, 바람직하게는 0.38-0.45, 바람직하게는 0.4로 수득하기 위해 아라비노퓨라노시다아제 또는 약산성 용액을 이용하여 상기 단계 D에서의 가용성 상을 함유한 상기 아라비노자일란으로부터 아라비노오스를 제거하는 단계;
    F'. 상기 단계 E로부터 수득된 상기 아라비노자일란을 회복하기 위해, 바람직하게는 침전 또는 막 분리에 의해 분리하는 단계;
    G'. 상기 단계 F로부터의 상기 아라비노자일란에 아라비노자일라나제를 첨가하는 단계; 및
    H'. 상기 단계 G에서 수득된 상기 물질을 건조하는 단계;를 포함하는 겨로부터 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법.
  12. 제 10항 또는 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아라비노자일로-올리고당 조성물은 아라비노자일란에 특이적인 엔도자일라나제를 이용하여 제조되는, 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아라비노자일란에 특이적인 엔도자일라나제는 아라비노자일라나제인, 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법.
  14. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 C'는 아라비노자일로-올리고당류의 수율을 높이기 위해 아라비노퓨라노시다제로 선택적 처리하는 것을 포함하는, 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법.
  15. 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 A'는 전분 및 단백질들을 아밀라아제 및 프로테아제로 각각 제거하는 것을 포함하는, 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법.
  16. 제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 C'는 상기 수용성 아라비노자일란 함량을 높이기 위해 선택적 증기 처리하는 것과 함께 알칼리 및 과산화물로 추출하는 것을 포함하는, 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법.
  17. 제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 E'는 아라비노자일로-올리고당류의 수율을 높이기 위해 아라비노퓨라노시다아제 또는 약산으로 선택적 처리하는 것을 포함하는, 아라비노자일로-올리고당 조성물을 제조하기 위한 방법.
  18. 자일로-올리고당류 및 아라비노자일로-올리고당류 함유 제제들 내에서 아라비노자일로-올리고당류의 생성을 개선하기 위한 아라비노자일라나제의 용도.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 자일로-올리고당류 및 아라비노자일로-올리고당류의 제제는 11족 자일라나제를 이용하여 제조되는, 아라비노자일라나제의 용도.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 아라비노자일라나제는 글리코시드 가수분해효소 5족에 속하는 자일라나제인, 아라비노자일라나제의 용도.
  21. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아라비노자일로-올리고당류는 곡물 섬유질로부터 생성되는, 아라비노자일라나제의 용도.
  22. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 아라비노자일라나제의 용도로서,
    A'. 곡물 섬유질로부터 전분 및 선택적으로 단백질들을 제거하는 단계;
    B'. 상기 단계 A로부터 고체상을 회복하는 단계;
    C'. 상기 단계 B로부터의 상기 고체상을, 비-수용성 아라비노자일란을 가수분해할 수 있는 자일라나제로 처리하는 단계;
    D'. 아라비노자일로-올리고당류의 생성을 개선하기 위해 고도로 치환된 아라비노자일란을 가수분해할 수 있는 아라비노자일라나제를 상기 단계 C에 첨가하는 단계;
    E'. 상기 올리고당류를 포함한 상기 단계 D로부터 상기 가용성 상을 회복하는 단계;
    F'. 상기 E 단계로부터 상기 가용성 상을 선택적으로 정제하는 단계; 및
    G'. 상기 단계 F로부터 가용성 상을 농축하거나 건조하는 단계를 포함하는; 아라비노자일라나제의 용도.
  23. 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곡물 섬유질은 호밀, 옥수수, 기장류, 쌀, 보리, 귀리 또는 밀로부터 유래되는, 아라비노자일라나제의 용도.
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