ES2824578T3 - Preparación que comprende arabinoxilo-oligosacáridos - Google Patents

Abstract

Un proceso para producir una composición de arabinoxilo-oligosacáridos a partir de harina que comprende las etapas de: A. extraer y aislar una fracción de arabinoxilano de endospermo de la harina; B. eliminar opcionalmente el almidón y las proteínas del producto obtenido de la etapa A; C. opcionalmente tratar el arabinoxilano del endospermo de la etapa A o el producto de la etapa B con arabinofuranosidasas, preferentemente un tratamiento que sea capaz de eliminar el L-arabinofuranosilo con enlace α-(1→ 3) en unidades de D-xilopiranosilo con enlace β-(1→ 4) doblemente sustituidas (dXyl); D. agregar una arabinoxilanasa al producto obtenido de la etapa A, la etapa B o la etapa C; y E. secar el material obtenido de la etapa D.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación que comprende arabinoxilo-oligosacáridos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para producir preparaciones que comprenden arabinoxilo-oligosacáridos, que son particularmente útiles como ingredientes para alimentos o bebidas o como suplementos nutricionales. Adicionalmente, la invención se refiere además a la generación mejorada de arabinoxilo-oligosacáridos en formulaciones prebióticas establecidas que comprenden mezclas entre xilo-oligosacáridos y arabinoxilooligosacáridos.

Antecedentes técnicos

Las hemicelulosas de xilano son los segundos biopolímeros más abundantes en el reino vegetal después de la celulosa. Una característica común de todos los xilanos en plantas superiores es su estructura de residuos de D-xilopiranosilo (Xylp) con enlace p-(1^4). Los xilanos que contienen otros azúcares distintos de la xilosa se denominan heteroxilanos y se pueden dividir en glucuronoxilanos (GX), que se encuentran en las paredes celulares secundarias de las plantas dicotiledóneas, o arabinoxilanos (AX), que se encuentran en las paredes celulares primarias de los cereales. El contenido de AX y la composición en los cereales varían según la fuente botánica, el cultivar y el tejido. La mayor parte de AX se encuentra en los tejidos externos del salvado (pericarpio externo e interno, testa, epidermis nucelar y capa de aleurona asociada), aunque el endospermo amiláceo también contiene una cantidad considerable. AX pueden clasificarse como extraíbles en agua (WE-AX, arabinoxilanos extraíbles en agua) o no extraíbles en agua (WU-AX, arabinoxilanos no extraíbles en agua). La solubilidad en agua está limitada por enlaces covalentes y/o no covalentes a otros componentes de la pared celular. Aunque es fácilmente soluble, AX está débilmente unido en la superficie.

En general, cuatro elementos estructurales principales están presentes en el AX de los cereales, I) unidades Xylp no sustituidas (uXyl), II) L-arabinofuranosilo con enlace a-(1^2) (Araf) unido a una unidad Xylp (mXyl2), III) Araf con enlace a-(1^3) unido a una unidad Xylp (mXyl3) y IV) Araf con enlace doble a-(1^2) y a-(1^3) unido a una unidad Xylp (dXyl). Además, la galactosa y los ácidos glucurónicos pueden estar presentes en AX de los tejidos externos del grano. Los derivados del ácido hidroxicinámico, principalmente del ácido ferúlico (FA), pueden estar ligados al éster a la posición O-5 en unos pocos sustituyentes de Araf lo que causa la gelificación oxidativa en el agua (entrecruzamiento de ácidos dihidrodiferúlicos) y propiedades antioxidantes. La relación molar de arabinosa y xilosa (A/X) en AX es una característica importante cuando se trata de la hidrólisis enzimática, la solubilidad y las propiedades fermentativas en el tracto gastrointestinal (GIT, tracto gastrointestinal).

Los oligosacáridos, que son polímeros sacáridos cortos, se pueden derivar mediante hidrólisis parcial de la estructura de AX utilizando métodos tanto térmicos/químicos como enzimáticos. Teniendo en cuenta solo el AX de los cereales, se pueden obtener dos grupos principales de oligosacáridos a partir de la hidrólisis enzimática: xilooligosacáridos (XOS) y arabinoxilo-oligosacáridos (AXOS). XOS son oligómeros de xilosa, los cuales están ligados por enlaces p-(1^4) con la fórmula molecular general C5nH8n+2 O4n+1, donde n es el número de unidades de xilosa 2-10. Los XOS son X2: xilobiosa, X3: xilotriosa, X4: xilotetraosa, X5: xilopentaosa, X6: xilohexaosa, X7: xiloheptaosa, Xa: xilooctaosa, Xg: xiloeneaosa y X10: xilodecaosa. Por otro lado, los AXOS tienen un XOS como estructura con al menos un grupo Araf unido como una cadena lateral a una de las unidades de xilosa. Dependiendo del número de grupos Araf que estén unidos, a qué residuo, y del tipo de enlace químico (1^2) y/o (1^3), muchas combinaciones diferentes de AXOS son posibles. Los arabinoxilano-oligosacáridos (A)XOS comprenden una mezcla de xilo-oligosacáridos (XOS) y arabinoxilo-oligosacáridos (AXOS) y se obtienen después de la hidrólisis enzimática con xilanasas comerciales.

Las xilanasas se utilizan, por ejemplo, en el procesamiento de la pulpa y el papel, la producción de biocombustibles, el horneado, las industrias cerveceras y en el procesamiento de piensos. Estas enzimas son capaces de hidrolizar los enlaces p-(1^4)-xilosídicos que se encuentran en el xilano y en los oligosacáridos derivados de xilano. Dependiendo de la xilanasa utilizada, se pueden generar diferentes tamaños de XOS y estructuras de AXOS. Se sabe que las xilanasas de la familia 10 producen productos finales pequeños. Esto es consistente con la producción de xilosa y X2 como los principales productos de hidrólisis de AX. El AXOS más pequeño producido por las xilanasas de la familia 10 es un trisacárido (A3X). Las xilanasas de la familia 11 tienen el mismo mecanismo catalítico que la familia 10, pero la actividad es generalmente mayor en sustratos poliméricos que en los oligoméricos y tienen mayor actividad contra sustratos insolubles en comparación con la familia 10. Los principales productos de hidrólisis por las xilanasas de la familia 11 son xilosa, X2 y X3, mientras que el AXOS más pequeño es un tetrasacárido (A3XX).

Existe un interés comercial en XOS y AXOS como prebióticos emergentes, definidos como "un ingrediente fermentado selectivamente que produce cambios específicos en la composición y/o actividad de la microbiota gastrointestinal, otorgando así beneficios a la salud del huésped". Ahora se dispone de pruebas considerables de las propiedades prebióticas de estos compuestos, basadas en ensayos in vitro e in vivo que demostraron que cumplen todos los criterios para un prebiótico. XOS y AXOS son fermentados por la microbiota fecal lo que produce ácidos grasos de cadena corta promotores de la salud acetato, lactato, propionato y butirato. Dependiendo del tamaño de los oligosacáridos, se producen diferentes ácidos metabólicos. El efecto prebiótico de XOS y AXOS está estrechamente ligado al tamaño de los oligosacáridos y la sustitución de la arabinosa; se requiere un pequeño tamaño para la mayoría de las bifidobacterias para que puedan ser utilizadas como fuente de carbono. El o los grupos Araf unidos a los AXOS son por lo tanto una característica importante cuando se trata de las propiedades fermentativas en el tracto gastrointestinal (GIT) ya que no todas las bacterias que utilizan XOS pueden utilizar AXOS.

Las bifidobacterias se consideran uno de los grupos más importantes de bacterias beneficiosas debido a su capacidad para estimular el desarrollo del sistema inmunitario, producir vitaminas, inhibir patógenos, reducir el amoníaco y el colesterol en la sangre y ayudar a restaurar un intestino sano después del tratamiento con antibióticos. La capacidad de las bifidobacterias para usar XOS y/o AXOS depende de la cepa, lo que significa que las cepas pueden agruparse en función de su preferencia de carbohidratos. Las bifidobacterias pueden agruparse en cinco grupos diferentes (I-V) en función de su capacidad para fermentar arabinosa, xilosa, XOS o AXOS. En el grupo I, las cepas no pueden utilizar XOS ni AXOS. En el grupo II las cepas son capaces de fermentar los sustituyentes de arabinosa presentes en AXOS. El grupo III contiene cepas que son capaces de fermentar la estructura de XOS hasta xilotetraosa, pero tienen un consumo más limitado de AXO^s . En el grupo IV y V, las cepas presentan una amplia degradación tanto de XOS como de AXOS.

La preparación de prebióticos del estado de la técnica de AX incluye productos de (A)XOS que comprenden una mezcla de XOS y AXOS obtenida por hidrólisis de xilanasa de AX o de material que contiene AX. En EP 2265 127, las preparaciones de (A)XOS prebióticas se preparan a partir de salvado de trigo utilizando una xilanasa de la familia 10 y/u 11. Esta aplicación se basa en un método de Swennen y colaboradores (2006) donde la preparación final es una mezcla entre XOS y AXOS (Swennen y colaboradores, 2006, Figura 2a) con relativamente poco contenido de arabinosa indicado por una baja relación A/X 0,25-0,26. Esta preparación también contiene xilosa, que no se considera un prebiótico y se evitaría preferentemente en el producto final. Por lo tanto, está claro que todas las preparaciones prebióticas de AX descritas en EP 2 265 127 y en las publicaciones científicas hasta la fecha son mezclas de xilosa, XOS y AXOS debido al hecho de que la hidrólisis enzimática por las xilanasas de la familia 10 y/u 11 bien establecidas siempre produce xilosa, XOS y AXOS. Una limitación de la tecnología actual es, por lo tanto, producir composiciones prebióticas de AXOS puras con poca o ninguna coformación de xilosa y XOS.

La publicación "Preparation of arabinoxylobiose from rye xylan using family 10 Aspergillus aculeatus endo- 1,4-p-D-xylanase" por Rantanen et al., Carbohydrate Polymers, vol. 68, no 2, (2007), páginas 350-359, describe una preparación de los AXOS cortos más abundantes de los cereales utilizando la enzima comercial Shearzyme® que contiene xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus.

En la técnica anterior, se pueden encontrar preparaciones de arabino-xilooligosacáridos, sin embargo hay una necesidad de proporcionar una preparación más pura y específica de prebióticos de AXOS.

Sumario de la invención

La presente invención describe cómo se pueden generar AXOS prebióticos a partir de AX usando una arabinoxilanasa sin crear xilosa y XOS. Las preparaciones son especiales en su composición de oligosacáridos que contienen arabinosa sin xilosa y XOS. Su capacidad para estimular específicamente ciertas cepas de bifidobacterias las hace útiles como un prebiótico más selectivo. Se describe a modo de ejemplo solamente una composición de AXOS que comprende al menos una unidad arabinosa unida a una de las unidades de xilosa de la estructura, por molécula, donde la al menos una unidad arabinosa es un a-L-arabinofuranosilo, donde dicha composición tiene una estructura de XOS con un grado de polimerización de 1-10. Se describe a modo de ejemplo solamente, la composición de AXOS tiene un grado promedio de sustitución de arabinosa de 0,3-0,6. Se describe a modo de ejemplo solamente, la composición de AXOS tiene un grado promedio de sustitución de arabinosa de 0,2-0,7. La aplicación de AXOS puros es para estimular selectivamente ciertos grupos de bifidobacterias. Tales preparaciones pueden usarse en ingredientes de alimentos o bebidas o como suplementos nutricionales con o sin adición de bifidobacterias. Se describe a modo de ejemplo solamente, la composición de AXOS se adapta selectivamente para estimular el crecimiento de Bifidobacterium spp. En otra realización, la Bifidobacterium spp. pertenece a cepas adaptadas para fermentar AXOS o a los sustituyentes de arabinosa en los oligosacáridos. Se describe a modo de ejemplo solamente, la Bifidobacterium spp se selecciona del grupo que consiste en Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium animalis, Bifido- bacterium pseudolongum, Bifidobacterium gallicum Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium angulatum o Bifidobacterium breve. Se describe a modo de ejemplo solamente la generación mejorada de AXOS en formulaciones de (A)XOS prebióticas establecidas que comprenden mezclas entre XOS y AXOS. A modo de ejemplo solamente se describe una preparación simbiótica que comprende una composición de AXOS, además de una Bifidobacterium spp. En otra realización, la preparación simbiótica es para el tratamiento de la mejora de los problemas gastrointestinales. Solo a modo de ejemplo, la preparación simbiótica es para utilizar como un ingrediente en un producto seleccionado del grupo que consiste en alimento, pienso, bebidas o suplementos nutricionales. A modo de ejemplo solamente se describe una composición de AXOS o una preparación simbiótica que comprende una composición de AXOS, para utilizar en el tratamiento de la mejora de los problemas gastrointestinales.

A modo de ejemplo solamente se describen prebióticos selectivos para ciertos grupos de bacterias intestinales pertenecientes al grupo de bifidobacterias adaptadas para fermentar AXOS o los sustituyentes de arabinosa unidos a la o las moléculas de AXOS. Sólo a modo de ejemplo, los AXOS obtenidos pueden utilizarse para estimular selectivamente el crecimiento de bifidobacterias sobre otros grupos de bacterias intestinales que normalmente pueden utilizar XOS. Sólo a modo de ejemplo, las cepas de un grupo seleccionado del grupo que consiste en II, III, IV y V son estimuladas selectivamente con preparaciones que contienen solamente AXOS. Sólo a modo de ejemplo, las cepas de bifidobacterias se seleccionan del grupo que consiste en Bifidobacterium longum subesp. longum DSMZ 20219 (Grupo 2), Bifidobacterium adolescentis DSMZ 20083 (Grupo 3), Bifidobacterium longum subesp. longum CCUG 15137 (Grupo 4) o Bifidobacterium catenulatum DSMZ 16992 (Grupo 5).

La presente invención supone que diversos puntos de partida y por lo tanto diversos materiales de partida pueden ser utilizados en un proceso para producir una composición de AXOS de acuerdo con la presente invención. En una realización, se utiliza AX de endospermo como material de partida. En otra realización, se utiliza salvado como material de partida. Diversos tipos de fracciones de harina o salvado se pueden pensar como material de partida. En otra realización más específica, el material de partida de salvado se selecciona del grupo de cereales tales como, entre otros, centeno, maíz, mijo, arroz, cebada, avena o trigo. Otros posibles materiales de partida son los pseudocereales tales como, entre otros, quinua, amaranto o alforfón. El material de partida es la harina o el salvado de cualquiera de las plantas anteriores. En una realización, el material de partida es la harina que comprende AX de endospermo.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se relaciona con un proceso para producir una composición de AXOS a partir de harina que comprende las etapas de:

A. extraer y aislar una fracción de arabinoxilano de endospermo de la harina;

B. eliminar opcionalmente el almidón y las proteínas del producto obtenido de la etapa A;

C. opcionalmente tratar el arabinoxilano del endospermo de la etapa A o el producto de la etapa B con arabinofuranosidasas, preferentemente un tratamiento que sea capaz de eliminar el L-arabinofuranosilo con enlace a-(1^3) en unidades de D-xilopiranosilo con enlace p-(1^4) doblemente sustituidas (dXyl);

D. agregar una arabinoxilanasa al producto obtenido de la etapa A, la etapa B o la etapa C; y

E. secar el material obtenido de la etapa D.

En una realización, la etapa C comprende una adición de ácido débil. En una realización, cuando el material de partida es harina, la relación A/X está en el intervalo de 0,2-0,7 preferentemente 0,28-0,65, preferentemente 0,35­ 0,50, preferentemente 0,38-0,45 preferentemente 0,4. En una realización, la invención comprende una etapa en la cual el AX del endospermo se trata enzimáticamente con una arabinofuranosidasa. En una realización, la arabinofuranosidasa se selecciona del grupo de las arabinofuranohidrolasas de arabinoxilano, se selecciona preferentemente del grupo que consiste en arabinofuranohidrolasa de arabinoxilano-D3 o arabinofuranohidrolasa de arabinoxilano-m2,3. El objetivo del tratamiento enzimático es eliminar una fracción de los grupos Araf, con el fin de mejorar el rendimiento de AXOS. En otra realización, la presente invención es un proceso para producir una composición de AXOS a partir de salvado que comprende las etapas de:

A'. eliminación del almidón y las proteínas del salvado;

B'. recuperación de una fase sólida de A';

C'. tratamiento de la fase sólida con solución alcalina, solución alcalina y peróxido o tratamiento de la fase sólida con calor para proporcionar una fase soluble;

D'. neutralización de la fase soluble que comprende arabinoxilano de C' y recuperación de dicha fase soluble que comprende arabinoxilano;

E'. eliminación de la arabinosa de la fase soluble que contiene arabinoxilano en la etapa D' utilizando arabinofuranosidasas o una solución de ácido débil para obtener una relación molar de arabinosa a xilosa de 0,2-0,7, preferentemente 0,35-0,5, preferentemente 0,38-0,45, preferentemente 0,4;

F'. separación para recuperar el arabinoxilano obtenido de la etapa E', preferentemente por precipitación o separación de membrana;

G'. agregar una arabinoxilanasa al arabinoxilano de la etapa F'; y

H'. secar el material obtenido de la etapa G'.

En una realización, la relación A/X está en el intervalo de 0,2-0,7, preferentemente 0,28-0,65, preferentemente 0,35­ 0,5, preferentemente 0,38-0,45, preferentemente 0,4. En otra realización, la relación A/X es de 0,4. En aún otra realización, la invención es un proceso para producir una composición de AXOS, donde la composición de AXOS se produce utilizando una endoxilanasa específica de arabinoxilano. En otra realización más específica, la invención es un proceso para producir una composición de AXOS, donde la endoxilanasa específica de arabinoxilano es una arabinoxilanasa.

Adicionalmente, en otra realización, la invención es un proceso para producir una composición de AXOS donde la etapa C' incluye un tratamiento opcional con arabinofuranosidasas para aumentar el rendimiento de AXOS del 10-100%, más preferentemente del 50-100%, aún más preferentemente del 70-100%, aún más preferentemente del 85100% y con máxima preferencia del 100%. En una realización, el aumento del rendimiento es del 95-99%.

Al preparar una composición de AXOS a partir de AX de salvado son posibles etapas adicionales. En una realización, la invención se refiere a un proceso para producir una composición de AXOS, donde la etapa A' incluye la eliminación del almidón y las proteínas con amilasas y proteasas respectivamente. En otra realización, la invención se refiere a un proceso para producir una composición de AXOS, donde la etapa C' incluye extracción con una solución alcalina y peróxido, utilizando opcionalmente otros medios de extracción. En la etapa C se pueden utilizar diversos medios de tratamiento térmico. En una realización, la etapa C' incluye el tratamiento con vapor para aumentar el contenido de AX solubles en agua. En otra realización, la etapa C' incluye el tratamiento con agua presurizada. En aún otra realización, la invención se refiere a un proceso para producir una composición de AXOS, donde la etapa E' incluye un tratamiento opcional para aumentar el rendimiento de AXOS. En una realización, la etapa E' incluye un tratamiento opcional con arabinofuranosidasas. En otra realización, la etapa E' incluye un tratamiento opcional con una solución de ácido débil, tal como, entre otros, ácidos inorgánicos, preferentemente ácido clorhídrico, preferentemente ácido sulfúrico, preferentemente ácido fosfórico o preferentemente ácido nítrico. Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de una arabinoxilanasa para mejorar la generación de AXOS en XOS y preparaciones que contienen AXOS. En una realización, la invención se relaciona con el uso de una arabinoxilanasa para mejorar la generación de AXOS en (A)XOS, donde la preparación de XOS y AXOS se prepara utilizando una xilanasa de la familia 10 u 11.

Un aspecto de la presente descripción se refiere a una composición de arabinoxilo-oligosacáridos que comprende al menos una unidad arabinosa enlazada a una de las unidades de xilosa de la estructura, por molécula, donde la al menos una unidad de arabinosa es un a-L-arabinofuranosilo, donde dicha composición tiene una estructura de xilooligosacáridos con un grado de polimerización de 1-10, donde la composición comprende como máximo 10 % de monosacáridos y/o como máximo 10 % de xilooligosacáridos.

En una realización, la composición de acuerdo con la presente descripción puede comprender monosacáridos presentes en una cantidad máxima de 20%, como máximo 15%, como máximo 10%, como máximo 8%, como máximo 5%, como máximo 4%, como máximo 3%, como máximo 2%, como máximo 1,6%, como máximo 1%, como máximo 0,1% o como máximo 0,01%. En una realización, la composición de acuerdo con la presente invención puede comprender monosacáridos presentes en una cantidad de 0,01-20%, 0,05-10%, 0,01-5%, 0,05-5%, 0,05-2%, 0,01-0,1%, 0,01-1%, 0,05-1,8% o 0,05-1,5%.

En una realización, la composición de acuerdo con la presente descripción puede comprender xilooligosacáridos presentes en una cantidad máxima de 20%, como máximo 15%, como máximo 10%, como máximo 8%, como máximo 5%, como máximo 4%, como máximo 3%, como máximo 2%, como máximo 1,6%, como máximo 1%, como máximo 0,1% o como máximo 0,01%. En una realización, la composición de acuerdo con la presente invención puede comprender xilooligosacáridos presentes en una cantidad del 0,01-20%, 0,05-10%, 0,01-5%, 0,05-5%, 0,05-2%, 0,01-0,1%, 0,01-1%, 0,05-1,8%, o 0,05-1,5%. En una realización, los monosacáridos pueden comprender arabinosa. En una realización, los monosacáridos pueden comprender xilosa. En una realización, la cantidad de monosacáridos y/o xilooligosacáridos en la presente invención se basa en el % en peso seco de la preparación. Otro aspecto se relaciona con el uso de una arabinoxilanasa para mejorar la generación de arabinoxilooligosacáridos en xilooligosacáridos y preparaciones que comprenden arabinoxilo-oligosacáridos. En una realización, la preparación de xilooligosacáridos y arabinoxilo-oligosacáridos se prepara utilizando xilanasa de la familia 11. En otra realización, la arabinoxilanasa es una xilanasa perteneciente a la familia 5 de glucósido hidrolasa. En otra realización, los arabinoxilo-oligosacáridos son generados a partir de una fibra de cereal. En otra realización, el uso de una arabinoxilanasa de acuerdo con la presente invención comprende las etapas de:

A'. eliminar el almidón y, opcionalmente, las proteínas de una fibra de cereal;

B'. recuperar una fase sólida de A';

C'. tratar la fase sólida de la etapa B' con una xilanasa capaz de hidrolizar el arabinoxilano insoluble en agua;

D'. agregar una arabinoxilanasa capaz de hidrolizar el arabinoxilano altamente sustituido a la etapa C' para mejorar la generación de arabinoxilo-oligosacáridos;

E'. recuperar dicha fase soluble de la etapa D' que comprende los oligosacáridos;

F'. purificar opcionalmente dicha fase soluble de la etapa E';

G'. concentrar o secar la fase soluble de la etapa F'.

En otra realización, la fibra de cereal es derivada de centeno, maíz, mijo, arroz, cebada, avena o trigo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Los AXOS generados por una arabinoxilanasa son diferentes de las mezclas de XOS y AXOS obtenidas por las xilanasas de la familia 10 y 11 indicadas por los diferentes productos obtenidos según lo observado por los diferentes tiempos de retención (Tabla 1).

Figura 2. Cromatograma inferior: AXOS mayores generados a partir de AX del endospermo del trigo (puntos máximos 1-13) y cromatograma superior: muestra tratada con arabinofuranosidasa para exponer la estructura de xilosa y XOS. X: xilosa, X2: xilobiosa, X3: xilotriosa, X4: xilotetraosa, X5: xilopentaosa, X6: xilohexaosa, X7: xiloheptaosa y X8: xilooctaosa.

Figura 3. Cromatograma inferior: AXOS mayores generados a partir de AX del endospermo del centeno (puntos máximos 1-13) y cromatograma superior: muestra tratada con HCI para exponer la estructura de xilosa y x Os . X: xilosa, X2: xilobiosa, X3: xilotriosa, X4: xilotetraosa, X5: xilopentaosa, X6: xilohexaosa, X7: xiloheptaosa, Xa: xilooctaosa, X9: xiloeneaosa y X10: xilodecaosa.

Figura 4. Rendimiento óptimo de AXOS de arabinoxilanasa está en el intervalo de 0,35-0,61 según lo indicado por el rendimiento más alto en 0,43.

Figura 5. Cromatograma superior: Generación mejorada de AXOS (flechas blancas) en mezclas que contienen XOS y AXOS con adición de una arabinoxilanasa según lo indicado como un cambio en los tiempos de retención hacia oligosacáridos más cortos y desaparición de los puntos máximos de AXOS (flechas negras) en la composición original (cromatograma inferior).

Figura 6. Utilización de Bifidobacterium adolescentis de AXOS derivados de arabinoxilanasa de AX del endospermo del centeno según lo indicado por los puntos máximos que desaparecen 1-6.

Figura 7. Lactobacillus brevis no utiliza AXOS derivados de arabinoxilanasa del AX del endospermo del centeno según lo indicado por los puntos máximos remanentes 1- 6.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.

Las arabinoxilanasas son únicas en su especificidad para AX ya que no atacan xilanos no sustituidos. Los oligosacáridos generados por estas enzimas contienen al menos un grupo Araf (1^3) enlazado a una unidad Xylp extrema reductora. Este grupo de enzimas no se ha utilizado ni considerado previamente en la producción de AXOs prebióticos a partir de AX o de materiales que contengan AX. En la presente invención se utiliza una arabinoxilanasa para producir AXOS de materiales que contienen AX. Estas preparaciones de AXOS obtenidas mediante la arabinoxilanasa son prebióticos únicos en su composición de AXOS y falta de xilosa y XOS. La comparación con las xilanasas del estado de la técnica utilizadas para fabricar prebióticos de AX muestra claramente la diferencia en los productos de hidrólisis obtenidos (Figura 1 y Tabla 1). La producción de AXOS es adicionalmente optimizada mediante la selección de una relación A/X en el intervalo de 0,2-0,7, preferentemente 0,28-0,65, preferentemente 0,35-0,5, preferentemente 0,38-0,45, preferentemente 0,4. Las preparaciones de AXOS son especialmente útiles como prebióticos selectivos para ciertos grupos de bacterias intestinales pertenecientes al grupo de las bifidobacterias adaptadas para fermentar AXOS o los sustituyentes de arabinosa unidos a la o las moléculas de AXOS.

Tabla 1. Tiempos de retención máximos para la Figura 1

(continuación)

En el primer ejemplo, se generan AXOS a partir de AX de endospermo (harina) de, entre otros, trigo y centeno. El AX de endospermo se trata enzimáticamente, opcionalmente, con arabinofuranosidasas para eliminar una fracción de los grupos Araf con el fin de mejorar el rendimiento de AXOS. Los AXOS puros generados a partir de AX de endospermo se muestran en la figura 2 para el trigo y en la figura 3 para el centeno. Estos datos muestran que no hay xilosa ni XOS formados en las preparaciones (menos del 0,1% en base a peso seco). Solo después de eliminar todos los grupos Araf unidos a los AXOs obtenidos con una arabinofuranosidasa o ácido clorhídrico se exponen las estructuras de xilosa y XOS. Esto confirma que todos los oligosacáridos obtenidos son AXOS con poca o ninguna formación de xilosa y XOS. A partir del análisis de la estructura de XOS después de eliminar todos los grupos Araf se determina que el grado de polimerización (DP, degree of polymerisation) de la estructura del AXOS es de 1-8 para AX de endospermo de trigo (Figura 2) y de 1 - 10 para AX de endospermo de centeno (Figura 3). La mayoría de los AXOS de AX de endospermo de trigo y de centeno tenían una estructura promedio de 3 (Tabla 2).

Tabla 2. Contenido de xilosa y XOS en muestras de AXOS tratadas con arabinofuranosidasa o HCI de trigo y centeno resentado res ectivamente como orcentae molar

Además, se determinó el impacto del contenido de arabinosa en el sustrato de AX para la generación de AXOS por una arabinoxilanasa. El mayor rendimiento de AXOS obtenido de AX se logró utilizando un A/X de 0,43 (Figura 4) demostrando que la generación óptima de AXOS está en el intervalo de A/X = 0,61-0,35 con 0,43 más cercano al óptimo. La importancia de esto se encuentra en la producción optimizada de AXOS mediante la eliminación parcial de los grupos Araf del sustrato de AX antes o durante el tratamiento con arabinoxilanasa.

Otra aplicación de la tecnología se demuestra en la mejora de la generación de AXOS en mezclas que contienen tanto XOS como AXOS. Al agregar una arabinoxilanasa a una mezcla de (A)XOS de una xilanasa de la familia 11, se forman nuevos AXOS por la degradación de poli- y oligosacáridos no hidrolizados por la xilanasa de la familia 11 (Figura 5). Estas mezclas de XOS y AXOS se pueden obtener utilizando los tratamientos con xilanasas del estado de la técnica y la adición de la arabinoxilanasa es una manera de mejorar la generación de AXOS en tales preparaciones. Preparaciones similares a las mencionadas en EP 2 265 127 B1 para mejorar las propiedades prebióticas de dichos productos que contienen XOS y AXOS.

En el segundo ejemplo, se utiliza salvado de trigo como sustrato para preparar diferentes fracciones de AX adecuadas para hacer AXOS mediante una arabinoxilanasa. Las fracciones se aíslan del material de salvado eliminando primero el almidón y las proteínas, seguido por una extracción de los componentes de AX del material de salvado. El AX es posteriormente tratado enzimáticamente con una arabinofuranosidasa, o ácido tratado para obtener fracciones con diferentes relaciones A/X (Tabla 3) que podrían usarse para preparar diferentes composiciones de AXOS usando una arabinoxilanasa.

En el tercer ejemplo, se demuestra que los AXOS obtenidos pueden utilizarse para estimular selectivamente el crecimiento de bifidobacterias por sobre otros grupos de bacterias intestinales que normalmente pueden utilizar xilosa o XOS (Figuras 6 y 7). La razón es que los AXOS obtenidos no contienen ni xilosa ni XOS que normalmente podrían ser utilizados por, por ejemplo, Lactobacillus brevis. También hay una diferencia en las preferencias de carbohidratos entre las diferentes cepas de bifidobacterias, lo que significa que los AXOS pueden ser utilizados para estimular ciertas cepas de bifidobacterias. Las cepas de cualquiera de los grupos II, III, IV y V podrían ser estimuladas selectivamente con preparaciones que solo contengan AXOS.

Las cepas representativas del grupo II-V son, entre otras, las siguientes cepas de bifidobacterias:

• Bifidobacterium longum subesp. longum DSMZ 20219 (Grupo 2)

• Bifidobacterium adolescentis Ds MZ 20083 (Grupo 3)

• Bifidobacterium longum subesp. longum CCUG 15137 (Grupo 4)

• Bifidobacterium catenulatum DSMZ 16992 (Grupo 5)

Especialmente las cepas pertenecientes a los grupos 4 y 5, son capaces de utilizar eficientemente todos los AXOS y son de especial interés para combinarse con los AXOS obtenidos. Sin embargo, todas las bifidobacterias, capaces de escindir los sustituyentes de arabinosa presentes en AXOS o utilizar todos los AXOS, son posibles de estimular. EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación de AXOS de arabinoxilanasa

Materiales y métodos

Se adquirió la arabinoxilanasa de Clostridium thermocellum (CtXyl5A) de Nzytech (Lisboa, Portugal). Se preparó una xilanasa de la familia 10 de Rhodothermus marinus (RmXyn10A) como se describe en Falck y colaboradores. (2013). Se obtuvo Pentopan mono bg, una xilanasa comercial de la familia 11 de Novozymes (Bagsvaerd, Dinamarca). Se adquirió la a-L-arabinofuranosidasa recombinante de alta pureza (E-ABFCJ) de Cellvibrio japonicus en Megazyme (Wicklow Irlanda). Se adquirieron los AX de endospermo extraídos mediante álcali del trigo (P-WAXYM, P-EDWAX30, P-ADWAX26, P-ADWAX22) y centeno (P-RAXY) en Megazyme. Se disolvieron 10 g/l de sustratos de AX de acuerdo con las instrucciones del fabricante en 50 ml de agua MQ y se ajustó el pH a 7 con HCl 8M. Se añadieron arabinoxilanasa de la familia 5 y xilanasas de las familias 10 y 11 a una relación enzima-sustrato de 1:1000 en base a masa. En las reacciones de arabinoxilanasa se utilizaron 2 mm de CaCl2 para estabilizar la enzima. Todas las reacciones se realizaron a 50°C durante 24 horas utilizando un termobloque o un baño de agua. Se inactivaron las enzimas mediante incubación de la muestra a 95°C durante 30 minutos.

Se realizó la comparación entre la arabinoxilanasa y las xilanasas de las familias 10 y 11 (Figura 1) utilizando AX de endospermo de trigo (P-EDWAX30) con un contenido de arabinosa del 30% igual a una A/X de 0,43. El AX se había tratado con una arabinofuranosidasa de Bacteroides ovatus para eliminar toda la Araf con enlace a-(1^3) en unidades de Xylp sustituidas doblemente (dXyl). La caracterización de las estructuras de AXOS de xilosa y XOS en la muestra de arabinoxilanasa (Figura 2) se realizó con 0,5 U/(mg de AXOS) utilizando una arabinofuranosidasa (E-ABFCJ) eliminando Araf de las unidades de Xylp de una sola sustitución (1^2) o (1^3), mXyl2 y mXyl3 respectivamente. La reacción se llevó a cabo a pH 5,8 utilizando un amortiguador de fosfato sódico de 20 mM a 50°C durante 24 horas. El tratamiento dio como resultado una completa eliminación de Araf de los AXOS (Figura 2). Se trató el AX de endospermo de centeno del mismo modo que el del trigo con la excepción de que la reacción de arabinoxilanasa se llevó a cabo durante 48 horas. Para eliminar todos los grupos de Araf con sustitución simple y doble de los AXOS obtenidos se utilizó un tratamiento con ácido débil. El pH se estableció en 2,8 con una solución de HCI diluida y se incubó la muestra (5 ml) a 90°C durante 24 horas, lo que dio lugar a una eliminación casi completa de todos los grupos de Araf de los AXOS (Figura 3).

Se determinó la relación entre el contenido de arabinosa y el rendimiento de AXOS generados con arabinoxilanasa utilizando endospermo de trigo con diferente contenido de arabinosa. P-WAXYM, P-EDWAX30, P- ADWAX26 y P-ADWAX22 con un contenido de arabinosa del 38 %, 30%, 26% y 22% por ciento respectivamente o en función de A/X 0,61, 0,43, 0,35 y 0,28 respectivamente (Figura 4). Las reacciones se llevaron a cabo en frascos de vidrio utilizando volúmenes de reacción de 2 ml y una concentración de sustrato de 0,2 g/L. Se utilizó arabinoxilanasa para tratar (A)XOS generados con pentopan para generar más AXOS y AXOS más cortos en las mezclas de ^x O^s y AXOS (Figura 5) utilizando las mismas condiciones de reacción descritas previamente para las reacciones de xilanasas.

Caracterización de AXOS y XOS

Se llevó a cabo un análisis de las fracciones de AXOS obtenidas y de las estructuras de XOS mediante Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alto Rendimiento Acoplada con Detección Electroquímica Pulsada (HPAEC-PAD) usando (ICS-5000) usando una columna CarboPac ^pA200 (250 mm x 3 mm, 5,5 mm) y una columna de protección (50 mm x 3 mm) del mismo material y una fase móvil de NaOH 100 mM a 0,5 mL/min y un gradiente lineal (0-30 min) de 0-120 mM de acetato de sodio (Sigma). Los patrones de monosacáridos y xilooligosacáridos utilizados fueron los siguientes: arabinosa y xilosa (Sigma), xilobiosa, xilotriosa, xilotetraosa, xilopentaosa y xilohexaosa (Megazyme). Se filtraron todas las muestras a través de un filtro de 0,22 mm y se diluyeron hasta una concentración final de 0,2 g/l antes del análisis.

Ejemplo 2: Preparación de sustratos de AX con diferentes relaciones A/X de salvado

Materiales y métodos

Se utilizó salvado de trigo comercial (Lantmannen Mill Malmo, Suecia) como material de partida para la preparación de AX con diferente contenido de arabinosa definido como A/X. Una suspensión (1:9 p/v) de 25o g de salvado de trigo en 2,5 l de agua desionizada (DI) se ajustó a pH 6,0 con HCI 8 M y se trató con una a-amilasa termoestable 0,12 U/g (Thermamyl, SIGMA-ALDRlCH) durante 90 min a 90°C para hidrolizar el almidón. Luego se enjuagó el salvado con agua caliente del grifo para eliminar los solubles hasta que se obtuvo un permeado claro. Se preparó una nueva suspensión en agua (1:9 p/v) para eliminar proteínas mediante incubación con una proteasa 0,035 U/g (Neutralse 0,8L, SIGMA-ALDRICH) durante 4 horas a 50°C. Posteriormente se enjuagó el salvado con agua caliente del grifo, luego con agua desionizada y luego se secó al vacío. Se extrajo salvado de trigo desalmidonado y desproteinizado con una solución alcalina diluida (NaOH) de peróxido de hidrógeno que contenía peróxido de hidrógeno al 2% a pH 11,5 durante 4 horas a 60°C a 200 rpm de agitación para obtener AX solubles. Se agregó antiespumante TRITON X-100 para reducir la formación de espuma. Después de la extracción, se eliminaron los sólidos por filtración y se centrifugó la solución (SIGMA) 6000g durante 20 min. Se neutralizó el sobrenadante con HCI 8 M y se agregó peroxidasa de rábano picante para eliminar el peróxido de hidrógeno restante. Se centrifugó el extracto nuevamente a 6000g durante 20 minutos. Se dividió el sobrenadante y se ajustaron 50 ml a pH 6 con HCl 8M y se trató con 5 U de una arabinofuranosidasa de Bifidobacterium adolescentis (Megazyme, E-AFAM2) mediante incubación de la muestra a 37°C durante 24 horas. También se desramificó con ácido el sobrenadante con un HCl débil a pH 2,5 a 90°C en un agitador de placa magnético a 200 rpm. Se retiraron las muestras (50 ml) y se neutralizaron con NaOH 1M después de 3,4, 5,1, 6,8 y 8,6 horas. Se desalaron todas las fracciones por bolsas de diálisis (SpectrumLab, EE. UU.) usando un corte de peso molecular (Mw) de 3500 Da. Se llevó a cabo una diálisis en 5L de agua desionizada dos veces y luego se liofilizaron todas las muestras.

Caracterización de las preparaciones aisladas

Se analizó la composición de monosacáridos de las fracciones de AX mediante HPAEC-PAD tras hidrolizado de las muestras con TFA 2 M durante 60 min a 110°C. Se calculó el contenido total de arabinoxilano en las muestras como de 0,88 veces (% de arabinosa % de xilosa) después de restar cualquier arabinosa libre. El análisis de los monosacáridos obtenidos se realizó mediante HPAEC-PAD utilizando una columna CarboPac PA20 (250 mm x 3 mm, 5,5 mm) y una columna de protección (30 mm x 3 mm) del mismo material y una fase móvil de NaOH 0,75 mm a 0,5 ml/min con una adición luego de la columna de base de 100 mM a 0,15 ml/min. Los monosacáridos (SIGMA) fueron los siguientes: arabinosa, galactosa, glucosa y xilosa. Las fracciones de A/X resultantes obtenidas se enumeran en la Tabla 3.

Tabla 3. Composición de carbohidratos (p/p de carbohidratos totales) y A/X de fracciones de AX obtenidas de salvado de trigo

Ejemplo 3: Crecimiento selectivo de bacterias intestinales en AXOS de arabinoxilanasa. Materiales y métodos

Las cepas bacterianas utilizadas para probar la fermentabilidad de los AXOS obtenidos a partir de AX de endospermo de centeno fueron Bifidobacteria adolecentis (B. adolecentis) ATCC 15703 y Lactobacillus brevis (L. brevis) DSMZ 1269. B. adolecentis, L. brevis, se precultivaron todos dos veces utilizando 5 g/l de glucosa como fuente de carbono. Se inoculó B. adolescentis en medio de bifidobacterias a 37 °C y pH 6,8. El medio contenía 12,5 g de peptona de caseína, digesto tríptico, 6,25 g de extracto de levadura, 6,25 g de extracto de carne, 6,25 g de Bacto Soytone, 2,5 g de K2PO4, 0,25 g de MgSO4-7H2O, 0,0625 g de MnSO4'H2O, 6,25 g de NaCl y 1.25 ml de Tween 80 por litro, respectivamente. A esta solución se agregaron 5 ml de solución con resazurina (25 mg/100 ml) junto con 50 ml de solución salina que contenía 0,25 g de CaCh'^O, 0,5 g de MgSO4'7 H2O, 1 g de K2HPO4, 1 g de KH2PO4, 10 g de NaHCO3 y 2 g de NaCl por litro, respectivamente. Posteriormente, se hirvió el medio seguido por enfriamiento bajo gas N2. Se agregó cisteína a una concentración de 0,625 g/L y se ajustó a pH 6,8 con NaOH. Se cultivó L. brevis anaeróbicamente en caldo MRS a pH 6,5 en condición anaeróbica a 37°C. Se sometieron a autoclave todos los medios para los experimentos de cultivo, caldo y agar, a 121 °C durante 15 min. Se desairearon todos los medios de cultivo utilizados para el crecimiento anaeróbico reemplazando el oxígeno de los tubos anaeróbicos por gas nitrógeno. Luego, se cerraron todos los tubos con tapones metálicos y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 min. Se esterilizaron por medio de filtro las respectivas fuentes de carbono glucosa y AXOS a través de un filtro de 0,45 mm y se agregaron al medio a una concentración final de 5 g/l y un volumen total de 5 ml. El experimento de fermentación se inició a partir del segundo precultivo utilizando inóculo 2% vol. /vol. y las muestras se retiraron después de 24 y 48h. Se midieron la densidad óptica y el pH después de 0, 24 y 48 horas, mientras que se analizaba el consumo de oligosacáridos después de 48 horas utilizando HPAEC-PA^d con las mismas condiciones descritas para el análisis de oligosacáridos. B. adolescentis pudo crecer en los AXOS de arabinoxilanasa producidos de AX de endospermo de centeno mientras que L. brevis no pudo debido al hecho de que la preparación no contiene ninguna molécula de xilosa o XOS (Figuras 6 y 7 respectivamente).

Tabla 4. Cambio neto en densidad ó tica H des ués de 48 h

REFERENCIAS

FALCK, P., PRECHA-ATSAWANAN, S., GREY, C., IMMERZEEL, P., STÁLBRAND, H., ADLERCREUTZ, P., NORDBERG KARLSSON, E. 2013. Xylooligosaccharides from hardwood and cereal xylans produced by a thermostable xylanase as carbon sources for Lactobacillus brevis and Bifidobacterium adolescentis. Journal of Agricultural and Food Chemistry 61, 30, 7333-7340.

SWENNEN, K., COURTIN, C. M., LINDEMANS, G. C., & DELCOUR, J. A. 2006. Large scale production and characterisation of wheat bran arabinoxylooligosaccharides. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86, 1722-1731.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para producir una composición de arabinoxilo-oligosacáridos a partir de harina que comprende las etapas de:

A. extraer y aislar una fracción de arabinoxilano de endospermo de la harina;

B. eliminar opcionalmente el almidón y las proteínas del producto obtenido de la etapa A;

C. opcionalmente tratar el arabinoxilano del endospermo de la etapa A o el producto de la etapa B con arabinofuranosidasas, preferentemente un tratamiento que sea capaz de eliminar el L-arabinofuranosilo con enlace a-(1^3) en unidades de D-xilopiranosilo con enlace p-(1^4) doblemente sustituidas (dXyl);

D. agregar una arabinoxilanasa al producto obtenido de la etapa A, la etapa B o la etapa C; y

E. secar el material obtenido de la etapa D.

2. Un proceso para producir una composición de arabinoxilo-oligosacáridos a partir de salvado que comprende las etapas de:

A'. eliminación del almidón y las proteínas del salvado;

B'. recuperación de una fase sólida de A';

C'. tratamiento de la fase sólida con solución alcalina, solución alcalina y peróxido o tratamiento de la fase sólida con calor para proporcionar una fase soluble;

D'. neutralización de la fase soluble que comprende arabinoxilano de C' y recuperación de dicha fase soluble que comprende arabinoxilano;

E'. eliminación de la arabinosa de la fase soluble que contiene arabinoxilano en la etapa D' utilizando arabinofuranosidasas o una solución de ácido débil para obtener una relación molar de arabinosa a xilosa de 0,2-0,7, preferentemente 0,35-0,5, preferentemente 0,38-0,45, preferentemente 0,4;

F'. separación para recuperar el arabinoxilano obtenido de la etapa E', preferentemente por precipitación o separación de membrana;

G'. agregar una arabinoxilanasa al arabinoxilano de la etapa F'; y

H'. secar el material obtenido de la etapa G'.

3. El proceso para producir una composición de arabinoxilo-oligosacáridos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde la composición de arabinoxilo-oligosacáridos es producida utilizando una endoxilanasa específica de arabinoxilano preferentemente donde la endoxilanasa específica de arabinoxilano es una arabinoxilanasa.

4. El proceso para producir una composición de arabinoxilo-oligosacáridos de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, donde la etapa C' incluye un tratamiento opcional con arabinofuranosidasas para aumentar el rendimiento de arabinoxilo-oligosacáridos.

5. El proceso para producir una composición de arabinoxilo-oligosacáridos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde la etapa A' incluye la eliminación del almidón y de las proteínas con amilasas y proteasas respectivamente.

6. El proceso para producir una composición de arabinoxilo-oligosacáridos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde la etapa C' incluye la extracción con álcali y peróxido, con tratamiento de vapor opcional para aumentar el contenido de arabinoxilano soluble en agua.

7. El proceso para producir una composición de arabinoxilo-oligosacáridos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde la etapa E' incluye un tratamiento opcional con arabinofuranosidasas o con un ácido débil para aumentar el rendimiento de arabinoxilo-oligosacáridos.

8. El uso de una arabinoxilanasa para la generación de arabinoxilo-oligosacáridos en xilo-oligosacáridos y preparaciones que comprenden arabinoxilo-oligosacáridos, preferentemente donde la preparación de xilooligosacáridos y arabinoxilo-oligosacáridos se prepara utilizando una xilanasa de la familia 11, preferentemente donde la arabinoxilanasa es una xilanasa perteneciente a la familia 5 de glucósido hidrolasas.

9. El uso de una arabinoxilanasa de acuerdo con la reivindicación 8, donde los arabinoxilo-oligosacáridos se generan a partir de una fibra de cereal.

10. El uso de una arabinoxilanasa de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 que comprende las etapas de:

A'. eliminar el almidón y, opcionalmente, las proteínas de una fibra de cereal;

B'. recuperar una fase sólida de A';

C'. tratar la fase sólida de la etapa B' con una xilanasa capaz de hidrolizar el arabinoxilano insoluble en agua;

D'. agregar una arabinoxilanasa capaz de hidrolizar el arabinoxilano altamente sustituido a la etapa C' para la generación de arabinoxilo-oligosacáridos;

E'. recuperar dicha fase soluble de la etapa D' que comprende los oligosacáridos;

F'. purificar opcionalmente dicha fase soluble de la etapa E';

G'. concentrar o secar la fase soluble de la etapa F';

preferentemente donde la fibra de cereal es derivada de centeno, maíz, mijo, arroz, cebada, avena o trigo.