CN107849082A - 包含阿拉伯木寡糖的制品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及阿拉伯木寡糖组合物，该组合物每分子包含至少一个阿拉伯糖单元，所述阿拉伯糖单元被连接至主链的木糖单元中的一个，其中所述至少一个阿拉伯糖单元是α‑L‑阿拉伯呋喃糖基，其中所述组合物具有聚合度为1‑10的木寡糖主链。

Description

包含阿拉伯木寡糖的制品
发明领域
本发明涉及包含阿拉伯木寡糖(arabinoxylo-oligosaccharide)的制品，其作为食品成分或饮料成分或作为营养补充物是特别有用的，并且涉及用于产生此类制品的方法。另外，本发明还涉及在包含木寡糖(xylo-oligosaccharide)和阿拉伯木寡糖之间的混合物的确定的益生元(prebiotic)制剂中的阿拉伯木寡糖的改进的产生。
技术背景
木聚糖半纤维素是在纤维素之后，在植物界中第二最丰富的生物聚合物。在高等植物中的所有木聚糖的共同特征是它们的β-(1→4)-连接的D-吡喃木糖基(Xylp)残基的主链。包含不同于木糖的其它糖的木聚糖被称为杂木聚糖(heteroxylan)，并且可以分成在双子叶植物的次生细胞壁中发现的葡糖醛酸木聚糖(GX)，或在谷类的初生细胞壁中发现的阿拉伯木聚糖(AX)。在谷类中的AX含量和组成随着植物来源、品种以及组织而变化。尽管淀粉胚乳也包含相当的量，但大部分AX在外部糠组织(outer bran tissue)(外部和内部果皮、种皮、珠心表皮和相关的糊粉层)中被发现。AX可以被分类为水可提取的(WE-AX)或水不可提取的(WU-AX)。在水中的溶解性受与其它细胞壁组分的共价键和/或非共价键的限制。当容易地可溶时，AX在表面处是弱结合的。
通常，四种主要的结构元素存在于谷物AX中，I)未被取代的Xylp单元(uXyl)，II)被连接至Xylp单元的α-(1→2)-连接的L-阿拉伯呋喃糖基(Araf)(mXyl2)，III)被连接至Xylp单元的α-(1→3)-连接的Araf(mXyl3)以及IV)被连接至Xylp单元的双α-(1→2)和α-(1→3)-连接的Araf(dXyl)。此外，半乳糖和葡萄糖醛酸可在来自外部谷粒组织的AX中存在。羟基肉桂酸衍生物，主要是阿魏酸(FA)，可以被酯连接至一些Araf取代基上的O-5位，这引起在水中的氧化胶凝(二氢阿魏酸的交联)以及抗氧化性质。当提到胃肠道(GIT)中的酶促水解、溶解性和发酵性质时，AX中的阿拉伯糖和木糖的摩尔比(A/X)是重要的特征。
寡糖，其是短的糖聚合物，可以通过使用热/化学方法或酶促方法部分水解AX主链来衍生。考虑到仅来自谷类的AX，两个主要组的寡糖可以从酶促水解获得：木寡糖(XOS)和阿拉伯木寡糖(AXOS)。XOS是木糖低聚物，其通过β-(1→4)键连接，具有分子通式C5nH8n+ 2O4n+1，其中n是2-10的木糖单元的数目。XOS是X2：木二糖，X3：木三糖，X4：木四糖，X5：木五糖，X6：木六糖，X7：木七糖，X8：木八糖，X9：木九糖以及X10：木十糖。在另一方面，AXOS具有XOS作为主链，具有至少一个Araf基团作为侧链被附接至木糖单元中的一个。取决于多少个Araf基团被附接、附接至哪个残基以及化学键类型(1→2)和/或(1→3)，许多不同的AXOS的组合是可能的。阿拉伯木聚糖寡糖(arabinoxylan-oligosaccharide)(A)XOS包括木寡糖(XOS)和阿拉伯木寡糖(AXOS)两者的混合物，并且在用商业木聚糖酶酶促水解之后获得。
木聚糖酶被用于例如纸浆和纸张加工、生物燃料生产、烘焙和酿造工业以及动物饲料的加工。这些酶能够水解在木聚糖和木聚糖衍生的寡糖中发现的β-(1→4)-木糖苷键(xylosidic linkage)。取决于使用的木聚糖酶，可以产生不同的XOS的尺寸和AXOS的结构。已知家族10木聚糖酶产生小的终产物。这与从AX产生作为主要水解产物的木糖和X2一致。由家族10木聚糖酶产生的最小AXOS是三糖(A3X)。家族11木聚糖酶具有与家族10木聚糖酶相同的催化机理，但对聚合物底物的活性通常高于对低聚物底物的活性，并且与家族10木聚糖酶相比，家族11木聚糖酶具有更高的针对不溶性底物的活性。家族11木聚糖酶的主要水解产物是木糖、X2和X3，而最小的AXOS是四糖(A3XX)。
对于作为新兴的益生元的XOS和AXOS存在商业兴趣，益生元被定义为“导致GI微生物群的组成和/或活性的特异性变化、从而对宿主健康赋予益处的选择性地发酵的成分”。这些化合物的益生元性质的相当多的证据现在基于体外试验和体内试验是可获得的，体外试验和体内试验证明这些化合物满足益生元的所有标准。XOS和AXOS被产生促进健康的短链脂肪酸乙酸酯/盐、乳酸酯/盐、丙酸酯/盐和丁酸酯/盐的排泄物微生物群(faecalmicrobiota)所发酵。取决于寡糖的尺寸，产生不同的代谢酸(metabolic acid)。XOS和AXOS的益生元效果与寡糖的尺寸和阿拉伯糖取代紧密相关；对于大部分双歧杆菌，需要小的尺寸以便其被用作碳源。因此，当提到胃肠道(GIT)中的发酵性质时，被附接至AXOS的Araf基团是重要的特征，因为并不是所有利用XOS的细菌都可以利用AXOS。
双歧杆菌由于其刺激免疫系统发育、产生维生素、抑制病原体、减少血液中的氨和胆固醇以及有助于在抗生素治疗之后恢复健康消化道的能力，被认为是有益的细菌的最重要的组中的一组。在双歧杆菌中使用XOS和AXOS的能力是菌株依赖性的，这意味着菌株可以基于它们的碳水化合物偏好(carbohydrate preference)被分组。基于双歧杆菌使阿拉伯糖、木糖、XOS或AXOS发酵的能力，双歧杆菌可以被群集成五个不同的组(I-V)。在群组I中，菌株不能使用XOS或AXOS。在群组II中，菌株能够使AXOS上存在的阿拉伯糖取代基发酵。群组III包括能够使XOS主链发酵直至木四糖，但具有更有限的AXOS的消耗的菌株。在群组IV和群组V中，菌株具有XOS和AXOS两者的广泛的降解。
来自AX的益生元的现有技术制品包括(A)XOS产品，该(A)XOS产品包含通过木聚糖酶水解AX或含AX的材料获得的XOS和AXOS两者的混合物。在EP 2 265 127中，使用家族10木聚糖酶和/或家族11木聚糖酶，从小麦糠制备益生元(A)XOS制品。此申请基于Swennen等人(2006)的方法，其中最终制品是具有由低的A/X比0.25-0.26指示的相对小的阿拉伯糖含量的在XOS和AXOS之间的混合物(Swennen等人，2006，图2a)。这些制品还包含木糖，木糖不被认为是益生元并且优选地将在最终产品中被避免。因此，清楚的是，由于通过已确认的家族10木聚糖酶和/或家族11木聚糖酶的酶促水解总是产生木糖、XOS和AXOS的事实，在EP 2265 127和到目前为止的科学文献中描述的来自AX的所有益生元制品是木糖、XOS和AXOS的混合物。因此，当前技术的限制是产生纯的益生元AXOS组合物，且没有或有非常少的木糖和XOS的共形成。
在现有技术中，可以发现阿拉伯-木寡糖(arabino-xylooligosaccharide)制品，然而对于来自AXOS的益生元的更纯的、特异性制品存在需求。
发明概述
本发明描述了如何可以使用阿拉伯木聚糖酶，从AX产生益生元AXOS而不产生木糖和XOS。制品是特殊的，其组成为含阿拉伯糖的寡糖而没有木糖和XOS。它们特异性地刺激某些双歧杆菌的菌株的能力使得其用作更具选择性的益生元。在一个实施方案中，本发明涉及AXOS组合物，所述AXOS组合物每分子包含至少一个阿拉伯糖单元，所述阿拉伯糖单元被连接至主链的木糖单元中的一个，其中所述至少一个阿拉伯糖单元是α-L-阿拉伯呋喃糖基，其中所述组合物具有聚合度为1-10的XOS主链。在另一个实施方案中，AXOS组合物具有0.3-0.6的平均阿拉伯糖取代度(average degree of arabinose substitution)。在又另一个实施方案中，AXOS组合物具有0.2-0.7的平均阿拉伯糖取代度。纯的AXOS的应用是选择性地刺激某些双歧杆菌的组。在有或没有添加的双歧杆菌的情况下，此类制品可以用于食品成分或饮料成分或用作营养补充物。在一个实施方案中，AXOS组合物选择性地适于刺激双歧杆菌属(Bifidobacterium spp)的生长。在另一个实施方案中，双歧杆菌属属于适于使AXOS或在寡糖上的阿拉伯糖取代基发酵的菌株。在又另一个实施方案中，双歧杆菌属选自由以下组成的组：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、没食子双歧杆菌(Bifidobacterium gallicum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、角形双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)或短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)。另外，本发明还涉及在包含XOS和AXOS之间的混合物的确定的益生元(A)XOS制剂中的AXOS的改进的产生。在一个实施方案中，本发明是包含AXOS组合物、还包含双歧杆菌属的合生素制品。在另一个实施方案中，合生素制品用于改进胃肠问题的治疗。在又另一个实施方案中，合生素制品用于用作在选自由以下组成的组的产品中的成分：食品、饲料、饮料或营养补充物。在又另一个实施方案中，本发明是用于在改进胃肠问题的治疗中使用的AXOS组合物或包含AXOS组合物的合生素制品。
在一个实施方案中，本发明包括用于某些肠道细菌的组的选择性益生元，所述肠道细菌属于适于使AXOS或附接至AXOS分子的阿拉伯糖取代基发酵的双歧杆菌的组。在一个实施方案中，相对于通常可以使用XOS的其它的肠道细菌的组，根据本发明的所获得的AXOS可以被用于选择性地刺激双歧杆菌的生长。在另一个实施方案中，来自选自由II、III、IV和V组成的组的群组的菌株用仅包含AXOS的制品来选择性地刺激。在另一个更具体的实施方案中，双歧杆菌的菌株选自由以下组成的组：长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longumsubsp.longum)DSMZ 20219(群组2)、青春双歧杆菌DSMZ 20083(群组3)、长双歧杆菌长亚种CCUG 15137(群组4)或链状双歧杆菌DSMZ 16992(群组5)。
本发明意味着，各个起始点并因此各种起始材料可以在用于产生根据本发明的AXOS组合物的工艺中使用。在一个实施方案中，胚乳AX被用作起始材料。在另一个实施方案中，糠被用作起始材料。各种类型的谷粉(flour)级分或糠是可想到的，并且本发明不被视为受起始材料的选择所限制。在一个实施方案中，起始材料选自由以下组成的组：胚乳AX、糠、外壳(husk)或禾杆(straw)。在另一个更具体的实施方案中，糠起始材料选自谷类的组，例如黑麦、玉米、小米、稻、大麦、燕麦或小麦，但不限于这些。其它可能的起始材料是假谷类(pseudocereals)，例如但不限于藜麦(quinoa)、苋属植物(amaranth)或荞麦。优选地，起始材料是来自上文植物中的任一种的谷粉或糠。在一个实施方案中，起始材料是包含胚乳AX的谷粉。
因此，本发明的另一个方面涉及用于从谷粉产生AXOS组合物的工艺，所述工艺包括以下步骤：
A.从谷粉提取并且分离胚乳阿拉伯木聚糖级分；
B.任选地，从步骤A所获得的产物除去淀粉和蛋白质；
C.任选地，用阿拉伯呋喃糖苷酶、优选地能够除去在双取代的β-(1→4)-连接的D-吡喃木糖基单元(dXyl)处的α-(1→3)-连接的L-阿拉伯呋喃糖基的阿拉伯呋喃糖苷酶处理步骤A的胚乳阿拉伯木聚糖或步骤B的产物；
D.将阿拉伯木聚糖酶添加至步骤A、步骤B或步骤C所获得的产物；以及
E.干燥步骤D所获得的材料。
在一个实施方案中，步骤C包括添加弱酸。在一个实施方案中，当起始材料是谷粉时，A/X比在0.2-0.7、优选地0.28-0.65、优选地0.35-0.50、优选地0.38-0.45的区间内，优选地为0.4。在一个实施方案中，本发明包括其中用阿拉伯呋喃糖苷酶酶促地处理胚乳AX的步骤。在一个实施方案中，阿拉伯呋喃糖苷酶选自阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶(Arabinoxylan arabinofuranohydrolase)的组、优选地选自由阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶-D3或阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶-m2,3组成的组。酶促处理的目的是除去Araf基团的级分，以便改进AXOS的收率。在另一个实施方案中，本发明是用于从糠产生AXOS组合物的工艺，所述工艺包括以下步骤：
A’.从糠除去淀粉和蛋白质；
B’.回收来自A’的固相；
C’.用碱性溶液、碱性和过氧化物溶液处理固相，或用热处理固相，以提供可溶相；
D’.中和C’的包含阿拉伯木聚糖的可溶相，并且回收包含阿拉伯木聚糖的所述可溶相；
E’.使用阿拉伯呋喃糖苷酶或弱酸溶液，从步骤D’中的包含阿拉伯木聚糖的可溶相除去阿拉伯糖，以获得0.2-0.7、优选地0.35-0.5、优选地0.38-0.45、优选地0.4的阿拉伯糖与木糖的摩尔比；
F’.分离以回收从步骤E’获得的阿拉伯木聚糖，优选地通过沉淀或膜分离；
G’.将阿拉伯木聚糖酶添加至来自步骤F’的阿拉伯木聚糖；以及
H’.干燥步骤G’所获得的材料。
在一个实施方案中，A/X比在0.2-0.7、优选地0.28-0.65、优选地0.35-0.5、优选地0.38-0.45的区间内，优选地为0.4。在另一个实施方案中，A/X比是0.4。在又另一个实施方案中，本发明是用于产生AXOS组合物的工艺，其中使用阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶来产生AXOS组合物。在另一个更具体的实施方案中，本发明是用于产生AXOS组合物的工艺，其中阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶是阿拉伯木聚糖酶。
另外，在另一个实施方案中，本发明是用于产生AXOS组合物的工艺，其中步骤C’包括任选地，用阿拉伯呋喃糖苷酶处理，以增加10％-100％的AXOS的收率、更优选地50％-100％、甚至更优选地70％-100％、还甚至更优选地85％-100％并且最优选地100％。在一个实施方案中，增加的收率是95％-99％。
当从糠AX制备AXOS组合物时，另外的步骤是可能的。在一个实施方案中，本发明涉及用于产生AXOS组合物的工艺，其中步骤A’包括分别用淀粉酶和蛋白酶除去淀粉和蛋白质。在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生AXOS组合物的工艺，其中步骤C’包括用碱和过氧化物，以及任选地使用其它提取手段来提取。多种热处理手段在步骤C’中是可能的。在一个实施方案中，步骤C’包括蒸汽处理以增加水溶性AX含量。在另一个实施方案中，步骤C’包括加压水处理。在又另一个实施方案中，本发明涉及用于产生AXOS组合物的工艺，其中步骤E’包括任选的处理，以增加AXOS的收率。在一个实施方案中，步骤E’包括任选地，用阿拉伯呋喃糖苷酶处理。在另一个实施方案中，步骤E’包括任选地，用弱酸溶液例如但不限于无机酸、优选地盐酸、优选地硫酸、优选地磷酸或优选地硝酸处理。
本发明的另一个方面涉及使用阿拉伯木聚糖酶以改进在包含XOS和AXOS的制品中的AXOS的产生。在一个实施方案中，本发明涉及使用阿拉伯木聚糖酶以改进在(A)XOS中的AXOS的产生，其中使用家族10的木聚糖酶或家族11的木聚糖酶来制备XOS和AXOS的制品。
本发明的一个方面涉及阿拉伯木寡糖组合物，所述阿拉伯木寡糖组合物每分子包含至少一个阿拉伯糖单元，所述阿拉伯糖单元被连接至主链的木糖单元中的一个，其中所述至少一个阿拉伯糖单元是α-L-阿拉伯呋喃糖基，其中所组合物具有聚合度为1-10的木寡糖主链，其中组合物包含至多10％的单糖和/或至多10％的木寡糖。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物可以包含以至多20％、至多15％、至多10％、至多8％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1.6％、至多1％、至多0.1％或至多0.01％的量存在的单糖。在一个实施方案中，根据本发明的组合物可以包含以0.01％-20％、0.05％-10％、0.01％-5％、0.05％-5％、0.05％-2％、0.01％-0.1％、0.01％-1％、0.05％-1.8％或0.05％-1.5％的量存在的单糖。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物可以包含以至多20％、至多15％、至多10％、至多8％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1.6％、至多1％、至多0.1％或至多0.01％的量存在的木寡糖。在一个实施方案中，根据本发明的组合物可以包含以0.01％-20％、0.05％-10％、0.01％-5％、0.05％-5％、0.05％-2％、0.01％-0.1％、0.01％-1％、0.05％-1.8％或0.05％-1.5％的量存在的木寡糖。在一个实施方案中，单糖可以包括阿拉伯糖。在一个实施方案中，单糖可以包括木糖。在一个实施方案中，本文中的单糖和/或木寡糖的量是基于制品的干重％。
又另一个方面涉及使用阿拉伯木聚糖酶以改进在包含木寡糖和阿拉伯木寡糖的制品中的阿拉伯木寡糖的产生。在一个实施方案中，使用家族11木聚糖酶来制备木寡糖和阿拉伯木寡糖的制品。在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖酶是属于糖苷水解酶家族5的木聚糖酶。在另一个实施方案中，阿拉伯木寡糖由谷物纤维产生。在另一个实施方案中，根据本发明的使用阿拉伯木聚糖酶包括以下步骤：
A’.从谷物纤维除去淀粉和任选地蛋白质；
B’.回收来自A’的固相；
C’.用能够水解水不溶性阿拉伯木聚糖的木聚糖酶处理来自步骤B’的固相；
D’.将能够水解高度取代的阿拉伯木聚糖的阿拉伯木聚糖酶添加至步骤C’，以便改进阿拉伯木寡糖的产生；
E’.回收来自步骤D’的包含寡糖的所述可溶相；
F’.任选地，纯化来自步骤E’的所述可溶相；
G’.浓缩或干燥来自步骤F’的可溶相。
在另一个实施方案中，谷物纤维来源于黑麦、玉米、小米、稻、大麦、燕麦或小麦。
附图简述
图1.如通过不同的保留时间看出的、由所获得的不同产物所指示的，由阿拉伯木聚糖酶产生的AXOS不同于由家族10的木聚糖酶和家族11的木聚糖酶获得的XOS和AXOS混合物(表1)。
图2.下方色谱图：从小麦胚乳AX产生的主要AXOS(峰1-13)，以及上方色谱图：暴露木糖和XOS主链的阿拉伯呋喃糖苷酶处理的样品。X：木糖，X2：木二糖，X3：木三糖，X4：木四糖，X5：木五糖，X6：木六糖，X7：木七糖以及X8：木八糖。
图3.下方色谱图：从黑麦胚乳AX产生的主要AXOS(峰1-13)，以及上方色谱图：暴露木糖和XOS主链的HCl处理的样品。X：木糖，X2：木二糖，X3：木三糖，X4：木四糖，X5：木五糖，X6：木六糖，X7：木七糖，X8：木八糖，X9：木九糖，以及X10：木十糖。
图4.阿拉伯木聚糖酶AXOS的最佳收率在0.35-0.61的范围内，如通过在0.43处的最高收率指示的。
图5.上方色谱图：在添加阿拉伯木聚糖酶的情况下，在包含XOS和AXOS的混合物中的AXOS(白色箭头)的改进的产生，如以朝向较短的寡糖的保留时间的移动和原始组合物中的AXOS峰(黑色箭头)的消失(下方色谱图)指示的。
图6.利用来自黑麦胚乳AX的阿拉伯木聚糖酶衍生的AXOS的青春双歧杆菌，如通过消失的峰1-6指示的。
图7.短乳杆菌(Lactobacillus brevis)不利用来自黑麦胚乳AX的阿拉伯木聚糖酶衍生的AXOS，如通过保留的峰1-6指示的。
发明详述
阿拉伯木聚糖酶在它们用于AX的特异性方面是独特的，因为它们不攻击未被取代的木聚糖。由这些酶产生的寡糖包含至少一个被连接至还原端Xylp单元的(1→3)Araf基团。此组酶先前未曾在从AX或含AX的材料产生益生元AXOS中使用或考虑。在本发明中，阿拉伯木聚糖被用于从含AX的材料产生AXOS。通过阿拉伯木聚糖酶获得的这些AXOS制品在其AXOS组成以及没有木糖和XOS方面是独特的益生元。与用于从AX制备益生元的现有技术木聚糖酶的比较清楚地示出了在获得的水解产物方面的差异(图1和表1)。AXOS的产生通过选择在0.2-0.7、优选地0.28-0.65、优选地0.35-0.5、优选地0.38-0.45的区间内、优选地0.4的A/X比来进一步优化。AXOS制品特别地用作用于某些肠道细菌的组的选择性益生元，所述肠道细菌属于适于使AXOS或附接至AXOS分子的阿拉伯糖取代基发酵的双歧杆菌的组。
表1.图1的峰保留时间
注解：木寡糖标准物保留时间：木糖：2.667；木二糖：3.700；木三糖：5.600；木四糖：7.825；木五糖：9.359以及木六糖：10.384。
在第一实例中，AXOS由来自但不限于小麦和黑麦的胚乳(谷粉)AX产生。胚乳AX任选地用阿拉伯呋喃糖苷酶酶促地处理，以除去Araf基团的级分，以便改进AXOS的收率。对于小麦，从胚乳AX产生的纯的AXOS在图2中示出，而对于黑麦，从胚乳AX产生的纯的AXOS在图3中示出。此数据示出，在制品中不形成木糖或XOS(基于干重，小于0.1％)。仅在用阿拉伯呋喃糖苷酶或盐酸除去被附接至所获得的AXOS的所有Araf基团之后，暴露木糖和XOS主链。这证实，所有获得的寡糖是AXOS，而不形成或很少形成木糖和XOS。从在除去所有Araf基团之后的XOS主链的分析确定的是，对于小麦胚乳AX，AXOS的主链聚合度(DP)是1-8(图2)，并且对于黑麦胚乳AX，AXOS的主链聚合度(DP)是1-10(图3)。来自小麦胚乳AX和来自黑麦胚乳AX的大部分AXOS具有3的平均主链(表2)。
表2.以摩尔百分比表示的在分别来自小麦和黑麦的阿拉伯呋喃糖苷酶或HCl处理的AXOS样品中的木糖和XOS含量
XOS主链 小麦胚乳AX(A/X 0.43) 黑麦胚乳AX(A/X 0.64)
木糖 16％ 20％
木二糖 10％ 15％
木三糖 29％ 17％
木四糖 26％ 23％
木五糖 13％ 16％
木六糖 6％ 10％
另外的是所确定的AX底物中的阿拉伯糖含量对由阿拉伯木聚糖酶产生的AXOS的影响。使用0.43的A/X，实现从AX获得的AXOS的最高收率(图4)，这证明最优的AXOS的产生是在A/X＝0.61-0.35的区间内，其中0.43最接近最优。其意义是，通过在阿拉伯木聚糖酶处理之前或期间，从AX底物部分地除去Araf基团来优化产生AXOS。
此技术的另外的应用在包含XOS和AXOS两者的混合物中的AXOS的改进的产生中被证实。通过将阿拉伯木聚糖酶添加至来自家族11的木聚糖酶的(A)XOS混合物，新的AXOS通过降解未被家族11的木聚糖酶水解的多糖和寡糖来形成(图5)。可以使用现有技术木聚糖酶处理来获得这些XOS和AXOS混合物，并且添加阿拉伯木聚糖酶是改进在此类制品中的AXOS的产生的方式。类似于在EP 2 265 127B1中提及的制品，制品改进此类包含XOS和AXOS的产品的益生元性质。
在第二实例中，小麦糠用作底物，以制备AX的不同级分，所述AX的不同级分适合于通过阿拉伯木聚糖酶制备AXOS。通过首先除去淀粉和蛋白质、随后从糠材料提取AX组分来从糠材料分离所述级分。然后，AX随后用阿拉伯呋喃糖苷酶酶促地处理或酸处理以获得具有不同的A/X比的级分(表3)，所述级分可以用于使用阿拉伯木聚糖酶来制备不同的AXOS组合物。
在第三实例中，证明的是，相对于通常可以使用木糖或XOS的其它的肠道细菌的组，所获得的AXOS可以用于选择性地刺激双歧杆菌的生长(图6和图7)。原因是，所获得的AXOS既不包含木糖也不包含XOS，木糖和XOS通常可以被例如短乳杆菌利用。在不同的双歧杆菌菌株之间还存在碳水化合物偏好方面的差异，这意味着AXOS可以用于刺激双歧杆菌的某些菌株。来自群组II、群组III、群组IV和群组V的任一个的菌株可以用仅包含AXOS的制品选择性地刺激。
来自群组II-V的代表性菌株是但不限于以下的双歧杆菌的菌株：
●长双歧杆菌长亚种DSMZ 20219(群组2)
●青春双歧杆菌DSMZ 20083(群组3)
●长双歧杆菌长亚种CCUG 15137(群组4)
●链状双歧杆菌DSMZ 16992(群组5)
特别地，属于群组4和群组5的菌株能够有效地利用全部AXOS，并且对于与获得的AXOS组合具有特别的兴趣。然而，能够裂解在AXOS上存在的阿拉伯糖取代基或利用全部AXOS的所有双歧杆菌可能被刺激。
实施例
实施例1：阿拉伯木聚糖酶AXOS的制备
材料和方法
来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的阿拉伯木聚糖酶(CtXyl5A)购自Nzytech(里斯本，葡萄牙)。来自海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)的家族10的木聚糖酶(RmXyn10A)如在Falck等人(2013)中描述的来制备。商业的家族11的木聚糖酶Pentopan mono bg从Novozymes(Bagsvaerd，丹麦)获得。来自纤维弧菌(Cellvibriojaponicus)的高纯度重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(E-ABFCJ)购自Megazyme(威克洛，爱尔兰)。来自小麦的通过碱提取的胚乳AX(P-WAXYM、P-EDWAX30、P-ADWAX26、P-ADWAX22)和来自黑麦的通过碱提取的胚乳AX(P-RAXY)购自Megazyme。根据制造商的使用说明，将AX底物以10g/L溶解在50mL MQ水中，并且用8M HCl将pH调节至7。将来自家族5的阿拉伯木聚糖酶和来自家族10和家族11的木聚糖酶以基于质量的1:1000的酶与底物比添加。在阿拉伯木聚糖酶反应中，使用2mM CaCl2来稳定酶。使用加热块(thermoblock)或水浴，在50℃进行所有反应持续24h。通过将样品在95℃温育持续30分钟来使酶灭活。
使用具有30％阿拉伯糖含量(等同于0.43的A/X)的小麦胚乳AX(P-EDWAX30)进行在阿拉伯木聚糖酶与家族10和11的木聚糖酶之间的比较(图1)。AX已经用来自卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)的阿拉伯呋喃糖苷酶处理，以除去在双取代的Xylp单元(dXyl)处的所有α-(1→3)-连接的Araf。分别使用从(1→2)或(1→3)单取代的Xylp单元mXyl2和mXyl3除去Araf的阿拉伯呋喃糖苷酶(E-ABFCJ)，以0.5U/(mg AXOS)进行在阿拉伯木聚糖酶样品中的具有木糖和XOS的AXOS主链的表征(图2)。使用20mM磷酸钠缓冲剂在pH 5.8在50℃进行反应持续24h。处理导致从AXOS完全除去Araf(图2)。以与小麦相同的方式来处理黑麦胚乳AX，除了进行阿拉伯木聚糖酶反应持续48小时。为了从所获得的AXOS除去所有的单取代的和双取代的Araf基团，使用弱酸处理。pH用稀HCl溶液设定至2.8，并且将样品(5mL)在90℃温育持续24h，导致从AXOS几乎完全除去所有Araf基团(图3)。
使用具有不同阿拉伯糖含量的小麦胚乳来确定阿拉伯糖含量与阿拉伯木聚糖酶产生的AXOS的收率之间的关系。P-WAXYM、P-EDWAX30、P-ADWAX26和P-ADWAX22分别具有38％、30％、26％和22％的百分数的阿拉伯糖含量，或分别基于0.61、0.43、0.35和0.28的A/X(图4)。使用2mL反应体积和0.2g/L的底物浓度，在玻璃小瓶中进行反应。使用与先前关于木聚糖酶反应描述的相同的反应条件，使用阿拉伯木聚糖酶处理戊聚糖酶产生的(A)XOS以在XOS和AXOS混合物中产生更多且更短的AXOS(图5)。
AXOS和XOS的表征
所获得的AXOS级分和XOS主链的分析通过高效阴离子交换色谱法结合脉冲电化学检测(HPAEC-PAD)，使用(ICS-5000)使用CarboPac PA200柱(250mm x 3mm,5.5μm)和相同材料的保护柱(50mm x 3mm)以及以0.5mL/min的100mM NaOH的流动相和0-120mM的乙酸钠(Sigma)的线性梯度(0-30min)来进行。使用的单糖标准物和木寡糖标准物如下：阿拉伯糖和木糖(Sigma)、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖以及木六糖(Megazyme)。所有样品通过0.22μm过滤器过滤并且在分析之前稀释至0.2g/L的最终浓度。
实施例2：从糠制备具有不同A/X比的AX底物
材料和方法
使用商业小麦糠(Mill瑞典)作为用于制备具有不同的被定义为A/X的阿拉伯糖含量的AX的起始材料。将2.5L DI水中的250g小麦糠的悬浮液(1:9w/v)用HCl 8M调节至pH 6.0，并且用热稳定的α-淀粉酶0.12U/g(Thermamyl,SIGMA-ALDRICH)在90℃处理持续90min，以水解淀粉。然后，糠用热的自来水冲洗，以除去可溶物，直到获得澄清的渗透物。制备在水中的新的悬浮液(1:9w/v)，以通过用蛋白酶0.035U/g(Neutralse0.8L,SIGMA-ALDRICH)在50℃温育持续4h来除去蛋白质。其后，糠用热的自来水、然后用DI水冲洗并且然后真空干燥。脱淀粉的且脱蛋白质的小麦糠用在pH 11.5的包含2％过氧化氢的过氧化氢的稀的碱性溶液(NaOH)在60℃在200rpm搅拌下提取持续4h，以获得可溶性AX。添加防沫剂TRITON X-100以减少起泡。在提取之后，固体通过过滤除去，并且将溶液离心(SIGMA)6000g持续20min。上清液用8M HCl中和，并且添加辣根过氧化物酶以除去残留的过氧化氢。将提取物再次在6000g离心持续20分钟。将上清液分开，并且50mL用8M HCl调节至pH6并用5U的来自青春双歧杆菌(Megazyme,E-AFAM2)的阿拉伯呋喃糖苷酶通过使样品在37℃温育持续24h来处理。上清液还通过在pH 2.5的弱HCl在90℃在以200rpm的磁力板搅拌器(magnetic plate stirrer)上来酸脱支链(acid debranched)。移出样品(50mL)，并且在3.4h、5.1h、6.8h和8.6h之后，用1M NaOH中和。所有级分通过渗析袋(SpectrumLab,USA)使用3500Da Mw截留(cut off)来脱盐。渗析在5L DI水中进行两次，并且然后所有样品冷冻干燥。
分离的制品的表征
在将样品在110℃用2M TFA水解持续60min之后，AX级分的单糖组成通过HPAEC-PAD来分析。在减去任何游离的阿拉伯糖之后，在样品中的总阿拉伯木聚糖含量被计算为0.88倍(％阿拉伯糖+％木糖)。
所获得的单糖的分析通过HPAEC-PAD，使用CarboPac PA20柱(250mm x 3mm,5.5μm)和相同材料的保护柱(30mm x 3mm)以及以0.5mL/min的0.75mM NaOH的流动相，以及以0.15mL/min柱后添加(post column addition)100mM的碱来进行。单糖(SIGMA)如下：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及木糖。获得的产生的A/X级分在表3中列出。
表3.从小麦麸获得的AX级分的碳水化合物组成(总碳水化合物的w/w)和A/X
级分 阿拉伯糖 葡萄糖 木糖 A/X
上清液 0.42 0.02 0.57 0.73
Abf. 0.38 0.02 0.60 0.63
HCl 3.4h 0.37 0.02 0.61 0.60
HCl 5.1h 0.33 0.02 0.64 0.52
HCl 6.8h 0.31 0.02 0.67 0.47
HCl 8.6h 0.29 0.02 0.69 0.41
注解：Abf-阿拉伯呋喃糖苷酶处理的样品
实施例3：在阿拉伯木聚糖酶AXOS上的肠道细菌的选择性生长
材料和方法
用于测试来自黑麦胚乳AX的所获得的AXOS的可发酵性的细菌菌株是青春双歧杆菌(B.adolescentis)ATCC 15703和短乳杆菌(L.brevis)DSMZ1269。使用5g/L葡萄糖作为碳源，将青春双歧杆菌、短乳杆菌全部预培养(pre-cultivate)两次。将青春双歧杆菌接种在37℃和pH 6.8的双歧杆菌培养基中。培养基每升分别包含12.5g的酪蛋白胨、胰蛋白酶消化物、6.25g的酵母提取物、6.25g的肉膏、6.25g的蛋白大豆胨(bacto soytone)、2.5g的K2PO4、0.25g的MgSO4·7H2O、0.0625g的MnSO4·H2O、6.25g的NaCl以及1.25mL的吐温80。向此溶液添加5mL的具有刃天青的溶液(25mg/100mL)连同50mL的盐溶液，所述盐溶液每升分别包含0.25g的CaCl2·H2O、0.5g的MgSO4·7H2O、1g的K2HPO4、1g的KH2PO4、10g的NaHCO3以及2g的NaCl。将培养基随后煮沸，随后在N2气下冷却。添加半胱氨酸至0.625g/L的浓度，并且使用NaOH调节至pH 6.8。短乳杆菌在pH 6.5的MRS肉汤中在厌氧条件下在37℃厌氧地生长。将用于培养实验的所有培养基，肉汤以及琼脂在121℃高压灭菌(autoclaved)持续15min。用于厌氧生长的所有培养基通过用氮气替换厌氧管中的氧气来除去空气。然后，所有管用金属盖封闭并在121℃高压灭菌持续15min。各自的碳源葡萄糖和AXOS通过0.45μm过滤器过滤灭菌，并且以5g/L的最终浓度和5mL的总体积添加至培养基。使用2％体积/体积接种物，从第二预培养物开始发酵实验，并且在24h和48h之后，取出样品。在0h、24h和48h之后测量光密度和pH，同时使用HPAEC-PAD以与用于寡糖分析所描述的相同的条件，在48小时之后分析寡糖的消耗。青春双歧杆菌能够在从黑麦胚乳AX产生的阿拉伯木聚糖酶AXOS上生长，而由于制品不包含任何木糖分子或XOS分子，短乳杆菌不能生长(图6和图7，分别地)。
表4.在48h之后，光密度和pH的净变化
参考文献
FALCK，P.，PRECHA-ATSAWANAN，S.，GREY，C.，IMMERZEEL，P.，H.，ADLERCREUTZ，P.，NORDBERG KARLSSON，E.2013.
Xylooligosaccharides from hardwood and cerealxylans produced by athermostable xylanase as carbon sources for Lactobacillus brevis andBifidobacterium adolescentis.Journal of Agricultural and Food Chemistry 61，30，7333-7340.
SWENNEN，K.，COURTIN，C.M.，LINDEMANS，G.C.，&DELCOUR，J.A.2006.Large scaleproduction and characterisation of wheat branarabinoxylooligosaccharides.Journal of the Science of Food and Agriculture，86，1722-1731.

Claims (23)

1.一种阿拉伯木寡糖组合物，所述阿拉伯木寡糖组合物每分子包含至少一个阿拉伯糖单元，所述阿拉伯糖单元被连接至主链的木糖单元中的一个，其中所述至少一个阿拉伯糖单元是α-L-阿拉伯呋喃糖基，其中所述组合物具有聚合度为1-10的木寡糖主链，其中所述组合物包含至多10％的单糖和/或至多10％的木寡糖。
2.根据权利要求1所述的阿拉伯木寡糖组合物，其中所述阿拉伯木寡糖组合物具有0.2-0.7、优选地0.3-0.6、优选地0.35-0.50、优选地0.4的平均阿拉伯糖取代度。
3.根据权利要求1或2所述的阿拉伯木寡糖组合物，其中所述阿拉伯木寡糖组合物选择性地适于刺激双歧杆菌属的生长。
4.根据权利要求3所述的阿拉伯木寡糖组合物，其中所述双歧杆菌属属于适于使阿拉伯木寡糖或在所述寡糖上的所述阿拉伯糖取代基发酵的菌株。
5.根据权利要求3或4所述的阿拉伯木寡糖组合物，其中所述双歧杆菌属选自由以下组成的组：青春双歧杆菌、长双歧杆菌、链状双歧杆菌、动物双歧杆菌、假长双歧杆菌、没食子双歧杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、角形双歧杆菌或短双歧杆菌。
6.合生素制品，包含根据上述权利要求中任一项所述的阿拉伯木寡糖组合物，还包含双歧杆菌属。
7.根据权利要求6所述的合生素制品，用于改进胃肠问题的治疗。
8.根据权利要求6或7所述的合生素制品，用于用作在选自由以下组成的组的产品中的成分：食品、饲料、饮料或营养补充物。
9.根据权利要求1-5所述的阿拉伯木寡糖组合物或根据权利要求6-8所述的合生素制品，用于在改进胃肠问题的治疗中使用，所述合生素制品包含阿拉伯木寡糖组合物。
10.用于从谷粉产生阿拉伯木寡糖组合物的工艺，包括以下步骤：
A.从谷粉提取并且分离胚乳阿拉伯木聚糖级分；
B.任选地，从步骤A所获得的产物除去淀粉和蛋白质；
C.任选地，用阿拉伯呋喃糖苷酶、优选地能够除去在双取代的β-(1→4)-连接的D-吡喃木糖基单元(dXyl)处的α-(1→3)-连接的L-阿拉伯呋喃糖基的阿拉伯呋喃糖苷酶处理步骤A的所述胚乳阿拉伯木聚糖或步骤B的产物；
D.将阿拉伯木聚糖酶添加至步骤A、步骤B或步骤C所获得的产物；以及
E.干燥步骤D所获得的材料。
11.用于从糠产生阿拉伯木寡糖组合物的工艺，包括以下步骤：
A’.从所述糠除去淀粉和蛋白质；
B’.回收来自A’的固相；
C’.用碱性溶液、碱性和过氧化物溶液处理所述固相，或用热处理所述固相，以提供可溶相；
D’.中和C’的包含阿拉伯木聚糖的所述可溶相，并且回收包含阿拉伯木聚糖的所述可溶相；
E’.使用阿拉伯呋喃糖苷酶或弱酸溶液，从步骤D’中的包含阿拉伯木聚糖的所述可溶相除去阿拉伯糖，以获得0.2-0.7、优选地0.35-0.5、优选地0.38-0.45、优选地0.4的阿拉伯糖与木糖的摩尔比；
F’.分离以回收从步骤E’获得的阿拉伯木聚糖，优选地通过沉淀或膜分离；
G’.将阿拉伯木聚糖酶添加至来自步骤F’的阿拉伯木聚糖；以及
H’.干燥步骤G’所获得的材料。
12.根据权利要求10-11中任一项所述的用于产生阿拉伯木寡糖组合物的工艺，其中使用阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶来产生所述阿拉伯木寡糖组合物。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的用于产生阿拉伯木寡糖组合物的工艺，其中所述阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶是阿拉伯木聚糖酶。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的用于产生阿拉伯木寡糖组合物的工艺，其中所述步骤C’包括任选地，用阿拉伯呋喃糖苷酶处理以增加阿拉伯木寡糖的收率。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的用于产生阿拉伯木寡糖组合物的工艺，其中所述步骤A’包括分别用淀粉酶和蛋白酶除去淀粉和蛋白质。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的用于产生阿拉伯木寡糖组合物的工艺，其中所述步骤C’包括用碱和过氧化物、用任选的蒸汽处理来提取，以增加水溶性阿拉伯木聚糖含量。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的用于产生阿拉伯木寡糖组合物的工艺，其中所述步骤E’包括任选地，用阿拉伯呋喃糖苷酶或弱酸处理以增加阿拉伯木寡糖的收率。
18.阿拉伯木聚糖酶改进包含木寡糖和阿拉伯木寡糖的制品中的阿拉伯木寡糖的产生的用途。
19.根据权利要求18所述的阿拉伯木聚糖酶的用途，其中使用家族11的木聚糖酶来制备木寡糖和阿拉伯木寡糖的所述制品。
20.根据权利要求18所述的阿拉伯木聚糖酶的用途，其中所述阿拉伯木聚糖酶是属于糖苷水解酶家族5的木聚糖酶。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的阿拉伯木聚糖酶的用途，其中所述阿拉伯木寡糖由谷物纤维产生。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的阿拉伯木聚糖酶的用途，包括以下步骤：
A’.从谷物纤维除去淀粉和任选地蛋白质；
B’.回收来自A’的固相；
C’.用能够水解水不溶性阿拉伯木聚糖的木聚糖酶处理来自步骤B’的所述固相；
D’.将能够水解高度取代的阿拉伯木聚糖的阿拉伯木聚糖酶添加至步骤C’，以便改进阿拉伯木寡糖的产生；
E’.回收来自步骤D’的包含所述寡糖的可溶相；
F’.任选地，纯化来自步骤E’的所述可溶相；
G’.浓缩或干燥来自步骤F’的可溶相。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的阿拉伯木聚糖酶的用途，其中所述谷物纤维来源于黑麦、玉米、小米、稻、大麦、燕麦或小麦。
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