CN114981405A - 木霉属丝状菌突变株 - Google Patents
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Abstract
公开了培养液的粘度降低的木霉属丝状菌的突变株的获得和使用该木霉属丝状菌的突变株的蛋白质的制造方法。β‑葡糖苷酶和β‑木糖苷酶的活性降低了木霉属丝状菌的突变株和培养该突变株来制造蛋白质。β‑葡糖苷酶和β‑木糖苷酶的活性降低了的木霉属丝状菌突变株与具有该酶的活性的亲本株相比能够将培养液的粘度保持得较低。
Description
技术领域
本发明涉及能够将培养液的粘度保持得较低的木霉属丝状菌的突变株。
背景技术
已知木霉属丝状菌具有高的蛋白质制造能力，一直以来进行了使用木霉属丝状菌的蛋白质的制造的研究。木霉属丝状菌以纤维素、乳糖、纤维二糖等作为诱导物质，在蛋白质之中特别是制造被分类为糖化酶的纤维素酶。为了强化纤维素酶制造量，自古以来对于以控制纤维素酶制造的因子的过表达、缺损为代表的基因的改变、培养条件的最适化等进行了大量研究。
另一方面，木霉属丝状菌属于生长繁殖、蛋白质的制造需要氧的好氧性丝状菌。另外，木霉属丝状菌具有如果在液体培养基中培养，则随着增殖而培养液的粘度提高这样的特征。如果培养液的粘度提高，则氧、营养素的分布变得不均匀，因而在培养木霉属丝状菌时，需要通过增加搅拌数、增大通气量而将培养环境维持一定。如果培养槽大型化，则为了使培养环境一定需要庞大的搅拌动力，存在强的搅拌付与菌体以大的剪切损伤这样的课题。
专利文献1～6中分别公开了通过使粘性的木霉属丝状菌的Sfb3、Mpg1、Gas1、Seb1、Crz1和Tps1的蛋白质破坏或生成减少，从而与亲本株相比能够以更低的搅拌数维持培养环境。
另外，专利文献7中记载，如果破坏木霉属丝状菌的BXL1基因，则能够抑制培养液的溶解氧饱和度的降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2013-533751号公报
专利文献2:日本特表2014-513529号公报
专利文献3:日本特表2014-513530号公报
专利文献4:日本特表2014-513531号公报
专利文献5:日本特表2014-513532号公报
专利文献6:日本特表2014-513533号公报
专利文献7:国际公开第2017/170917号
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，使用木霉属丝状菌制造蛋白质时，抑制培养液中的溶解氧浓度的降低、将其保持在一定以上是非常重要的。本发明者们考虑，如果在使用木霉属丝状菌利用液体培养制造蛋白质时，能够将培养液的粘度保持得较低，则即使在将培养规模大型化的情况下，也能够降低搅拌所需的能量，并能够抑制培养液中的溶解氧饱和度的降低。本发明中，以获得培养液的粘度降低的木霉属丝状菌的突变株和提供使用该木霉属丝状菌的突变株的蛋白质的制造方法为课题。
用于解决课题的手段
本发明者对于能够将培养液的粘度保持得较低的木霉属丝状菌的筛选进行了深入研究，结果发现，β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性与突变导入前的亲本株相比降低了木霉属丝状菌的突变株，从而培养液的粘度被保持得较低，从而完成了本发明。
即，本发明以下(1)～(7)。
(1)木霉属丝状菌的突变株，其β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性与突变导入前的亲本株相比降低了。
(2)根据(1)所述的突变株，所述β-葡糖苷酶的比活性为0.02U/mg-蛋白质以下，并且所述β-木糖苷酶的比活性为0.002U/mg-蛋白质以下。
(3)根据(1)或(2)所述的突变株，所述木霉属丝状菌是里氏木霉。
(4)蛋白质的制造方法，是培养(1)～(3)的任一项所述的突变株而制造蛋白质的方法。
(5)根据(4)所述的制造方法，所述蛋白质是纤维素酶。
(6)低聚木糖的制造方法，其中，利用通过(5)所述的方法制造出的纤维素酶，水解包含木聚糖的生物质法。
(7)使木霉属丝状菌的液体培养时的培养液的粘度降低的方法，包括使木霉属丝状菌的β-葡糖苷酶活性和β-木糖苷酶活性降低。
发明的效果
根据本发明，β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性与突变导入前的亲本株相比降低了的木霉属丝状菌突变株，与具有该酶的活性的亲本株相比，能够将培养液的粘度保持得较低。
具体实施方式
本发明中的木霉属丝状菌属于木霉属(Trichoderma)，只要具有生产纤维素酶的能力就不特别限制。优选为里氏木霉(Trichoderma reesei)。另外，也可以利用来源于木霉属、用诱变剂或者紫外线照射等施加突变处理从而纤维素酶的生产性提高了突变株作为亲本株。
作为上述亲本株使用的突变株的具体例，可列举相当于里氏木霉的祖先的Trichoderma parareesei(ATCC MYA-4777)、来源于里氏木霉的公知的突变株QM6a株(NBRC31326)、QM9123株(ATCC24449)、QM9414株(NBRC31329)、PC-3-7株(ATCC66589)、QM9123株(NBRC31327)、RutC-30株(ATCC56765)、CL-847株(Enzyme.Microbiol.Technol.10,341-346(1988))、MCG77株(Biotechnol.Bioeng.Symp.8,89(1978))、MCG80株(Biotechnol.Bioeng.12,451-459(1982))和它们的衍生株等。
进而，本发明中使用的木霉属丝状菌优选被解除了碳分解代谢抑制。被解除了碳分解代谢抑制的株的纤维素酶等蛋白质的生产量提高，因此能够生产更多的蛋白质。进一步优选为被解除了经由碳分解代谢抑制物I的碳分解代谢抑制的株。例如通过在碳分解代谢抑制物I基因(cre1)中加入突变而经由碳分解代谢抑制物I的碳分解代谢抑制被解除。已知由cre1基因所编码的CRE1蛋白质通过由葡萄糖产生的分解代谢抑制，从而抑制纤维素酶基因的表达(FEBS Lett.,376,103-107,1995)。于是如果在cre1基因中加入突变则纤维素酶基因的表达抑制被解除，纤维素酶的生产量提高。因此，在cre1基因中加入了突变的株更加适合蛋白质、纤维素酶组合物的制造。作为具体的cre1基因的突变的例子，可列举在PC-3-7株(ATCC66589)的cre1基因中的第232位的A被替换成C、其结果氨基酸序列的第78位的苏氨酸被替换成脯氨酸。已知通过突变加入，从而纤维素酶的生产量提高(Biosci.Biotechnol.Biochem.,77(3),534-543,2013)。另外，已知在RutC-30株(ATCC56765)中，cre1基因被部分切断，被解除了碳分解代谢抑制(BMC Genomics.,9,327,2008)。这里所谓在cre1基因中加入了突变的株，包含通过基因诱变剂、紫外线照射等而加入了由cre1基因区域内的碱基的缺失或插入造成的移码、或由碱基的替换造成的终止密码子突变、或碱基的切断的株，进一步也包含通过重组等将cre1基因的全部或一部分除去或替换成其他基因的株。具体地，优选使用PC-3-7株(ATCC66589)、RutC-30株(ATCC56765)、以及继承了PC-3-7株(ATCC66589)、RutC-30株(ATCC56765)的特征的株，进一步优选为PC-3-7株(ATCC66589)、或继承了PC-3-7株(ATCC66589)的特征的株。其中，继承了PC-3-7(ATCC66589)、RutC-30株(ATCC56765)的特征的株也包含对继承了PC-3-7株(ATCC66589)、RutC-30株(ATCC56765)的特征的株新加入了突变的株、通过重组提高了功能的株。
此外，QM6a株、QM9414株、QM9123株可以从NBRC(NITE Biological ResourceCenter)购买，PC-3-7株、RutC-30株可以从ATCC(American Type Culture Collection)购买。
本发明中所谓“β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性与突变导入前的亲本株相比降低了木霉属丝状菌的突变株”，是指将成为上述的亲本株的木霉属丝状菌在亲本株中导入突变，从而β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性与突变导入前的亲本株相比降低了突变株，在本说明书中，有时记载为“本发明的突变株”。
本发明中所谓β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性降低，是指与被导入突变之前的亲本株相比，β-葡糖苷酶的比活性和β-木糖苷酶的比活性降低，也包含β-葡糖苷酶和/或β-木糖苷酶的功能缺损的状态。
具体地，β-葡糖苷酶比活性和β-木糖苷酶比活性优选分别与亲本株相比降低到10分之1以下，更优选为50分之1以下、更优选为100分之1以下、更优选为200分之1以下、进一步优选为500分之1以下、特别优选为800分之1以下、最优选为1000分之1以下。
作为比活性的绝对值，优选β-葡糖苷酶比活性和β-木糖苷酶比活性分别为0.02U/mg-蛋白质以下、和0.002U/mg-蛋白质以下，更优选为0.01U/mg-蛋白质以下、和0.001U/mg-蛋白质以下，更优选为0.005U/mg-蛋白质以下、和0.0005U/mg-蛋白质以下，进一步优选为0.0025U/mg-蛋白质以下、和0.00025U/mg-蛋白质以下。
对木霉属丝状菌的亲本株导入β-葡糖苷酶的比活性和β-木糖苷酶的比活性降低的突变的方法不特别限定，可列举利用基因诱变剂、紫外线照射等的基因突变处理方法，定点诱变法等。另外，可以破坏木霉属丝状菌的亲本株所具有的BGL1基因、BXL1基因。具体地，可以通过对这两基因内、或者启动子区域、或者编码基因的转录调节因子的基因导入突变、插入、缺失等突变，而使β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性降低。进而，可以通过对上述两基因导入移码突变、插入终止密码子来进行，另外，可以通过利用基因重组(与其他基因的同源重组等)将基因、或者启动子区域、或者编码基因的转录调节因子的基因的全部或一部除去或替换成其他基因，来破坏BGL1基因和/或BXL1基因。或者，可以通过将位于BGL1基因和/或BXL1基因的上游的转录调节因子的结合识别序列的全部或一部分除去或替换成其他基因，来抑制BGL1基因和/或BXL1基因的表达。因为木霉属丝状菌的BGL1基因(Gene ID:18488646)和丝状菌BXL1基因(Gene ID:18483060)是公知的，所以这些基因的破坏可以通过上述的基因突变导入处理法、定点诱变法等常规方法容易地进行。在木霉属丝状菌的BGL1基因和BGL1基因的上游1至500碱基中存在转录调节因子的结合部位。作为转录调节因子的具体例，可列举Xyr1，木霉属丝状菌中的Xyr1的推定结合识别序列在Borin,Carazzole.“Gene Co-expression Network Reveals Potential New Genes Related toSugarcane Bagasse Degradation in Trichoderma reesei RUT-30”Bioeng.Biotechnol.,2018,6,doi.org/10.3389/fbioe.2018.00151中公开。此外，在利用基因诱变剂、紫外线照射等随机的突变导入方法的情况下，可以克隆突变处理后的各菌株，通过后述的方法测定β-葡糖苷酶活性和β-木糖苷酶活性，选择这些活性与突变导入前的亲本株相比降低了菌株，从而获得β-葡糖苷酶的比活性和β-木糖苷酶的比活性与突变导入前的亲本株相比降低了菌株。
木霉属丝状菌的β-葡糖苷酶的比活性和β-木糖苷酶的比活性通过以下的方法测定。
首先，将培养木霉属丝状菌而得的培养液以20,000×g离心分离10分钟，回收上清。将所回收的上清稀释为适当的浓度，制备酶稀释液，通过以下的方法测定酶的比活性。
β-葡糖苷酶比活性通过以下的方法测定。首先，在含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应10分钟。接着加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性作为1U，计算出比活性。
β-木糖苷酶比活性通过以下的方法测定。首先，在含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃木糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应30分钟。接着，加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性作为1U，从而计算出比活性。
比活性的计算所需的蛋白质浓度如下进行测定。在Quick Start Bradford蛋白测定(Bio-Rad社制)250μL中添加酶稀释液5μL，测定室温静置15分钟后在595nm使用的吸光度。以牛血清白蛋白溶液作为标准液，基于标准曲线计算糖化酶溶液所包含的蛋白质浓度。
本发明的“β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性与突变导入前的亲本株相比降低了木霉属丝状菌的突变株”与亲本株相比，培养液的粘度降低。由此，能够降低通气搅拌所需的能量、旋转数。另外，因为能够将搅拌的旋转数设定得较低，所以也能够降低对菌丝的剪切损伤。特别是在大规模下培养时，能够实现通气所需的鼓风机、搅拌电动机的容量、搅拌能量的削减，因此更加有效。
培养方法只要是能够培养木霉属丝状菌而制造蛋白质的方法就不特别限定，可以通过使用周知的培养基的周知的方法来进行。可以通过使用例如离心沉降管、烧瓶、缸式发酵槽、罐等的液体培养来进行培养。因为里氏木霉是好氧微生物，所以在这些培养方法中特别优选缸式发酵槽，或在罐内一边进行通气、搅拌一边培养的深层培养。通气量优选为0.1vvm～2.0vvm左右，更优选为0.3vvm～1.5vvm，特别优选为0.5vvm～1.0vvm。培养温度优选为25℃～35℃左右，更优选为25℃～31℃。培养中的pH条件优选为pH3.0～7.0，更优选为pH4.0～6.0。培养时间在生产蛋白质的条件下进行到积累了能够回收的量的蛋白质。通常为24～288小时、更优选为36～240小时。
本发明中，培养液的粘度使用在以下条件下测定的值，粘度的比较将在以下条件下测定的值中的最大值彼此比较。首先，将作为评价对象的木霉属丝状菌的孢子以每1mL预培养培养基中1.0×105孢子的方式接种到预培养培养基(具体的培养基组成的一例如实施例中的表1)中，用振荡培养机在28℃、120rpm的条件下进行培养直到菌体量为11g/L左右。接下来，相对于以100g/L(w/v)添加了ArbocelI B800(商品名、纤维素纤维、レッテンマイヤー社制)、甘蔗渣粉末的表2所示的主培养培养基，以10％(v/v)接种预培养培养基，使用5L缸式发酵槽进行深层培养。培养条件是，在主培养培养基中接种预培养培养基后，以28℃、700rpm、通气量100mL/min的培养条件一边控制pH5.0一边进行深层培养。培养液的粘度的测定使用数字型旋转粘度计。数字型旋转粘度计预先进行0点校准。将从培养开始起到经过96小时为止的培养液经时地采集20ml左右。将刚刚采集之后的培养液分别加入到指定的容器中，在培养液中浸入转轴(spindle)以0.3rpm的旋转数使其旋转，在室温条件下测定作为此时的转轴工作的粘性阻抗的扭矩，从而测定培养液的粘度。粘度的单位为厘泊(cP)。1厘泊定义为当流体内对于1cm有1cm/秒的速度梯度时，在与该速度梯度的方向垂直的面上对于速度的方向1cm2产生1达因的力的大小的应力的粘度。数字型旋转粘度计使用DV2T(BROOKFIELD社)、转轴使用ULA(BROOKFIELD社)等。
本发明的“β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性与突变导入前的亲本株相比降低了突变株”与将亲本株在同样的条件下培养时相比，培养液的粘度变低，培养中的粘度的最大值优选降低为亲本株的70％以下，更优选降低为60％以下、进一步优选降低为50％以下。另外，作为绝对值，本发明的突变株的培养中的粘度的最大值与亲本株相比优选降低50cP以上、更优选降低100cP以上、更优选降低150cP以上、更优选降低200cP以上、进一步优选降低250cP以上、进一步优选降低300cP以上、进一步优选降低350cP以上、进一步优选降低400cP以上、特别优选降低500cP以上。
本发明中制造的蛋白质不特别限制，能够有效地制造被分泌到菌体外的蛋白质，其中优选为酶，更优选为纤维素酶、淀粉酶、转化酶、几丁质酶、果胶酶等糖化酶，进一步优选为纤维素酶。
本发明中制造的纤维素酶包含各种水解酶，包含具有对木聚糖、纤维素、半纤维素的分解活性的酶等。作为一般纤维素酶所包含的水解酶的具体例，可列举通过水解纤维素链来制造纤维二糖的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、从纤维素链的中央部分开始水解的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、水解纤维寡糖和纤维二糖的β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、以作用于半纤维素特别是木聚糖为特征的木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、水解低聚木糖的β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)等。纤维素酶的蛋白质浓度通过上述的方法算出即可。
培养本发明的突变株的培养方法不特别限定，可以通过使用例如离心沉降管、烧瓶、缸式发酵槽、罐等的液体培养来培养。因为里氏木霉是好氧微生物，所以在这些培养方法中特别优选缸式发酵槽，或在罐内一边进行通气、搅拌一边培养的深层培养。
培养时的培养基组成只要形成木霉属丝状菌能够制造蛋白质那样的培养基组成就不特别限制，可以采用木霉属丝状菌的周知的培养基组成。作为氮源，可使用例如，多聚胨、肉汁、玉米浸泡水(CSL)、大豆粕等。此外，该培养基中可以添加用于制造蛋白质的诱导物质。另外，作为碳源可以使用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类、含有这些糖类的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高糖量转化糖蜜、以及醋酸等有机酸、乙醇等醇类、甘油等。此外，特别是在制造纤维素酶的情况下，优选使用后述的诱导物质作为碳源。
在通过本发明制造纤维素酶的情况下，可以用在培养基中包含选自由乳糖、纤维素和木聚糖组成的组中的至少1种或2种以上的诱导物质的培养基进行培养。另外，纤维素、木聚糖可以添加包含纤维素、木聚糖的生物质作为诱导物质。作为含有纤维素、木聚糖的生物质的具体例，可以使用种子植物、蕨类植物、苔藓植物、藻类、水草等植物、以及废建材等。种子植物分类为裸子植物和被子植物，任一种都可以优选使用。被子植物进一步分类为单子叶植物和双子叶植物，作为单子叶植物的具体例，可列举甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸(玉米的茎叶)、玉米棒(玉米的芯)、稻秸、麦秸等，作为双子叶植物的具体例，优选使用甜菜浆、桉树、栎树、白桦等。
另外，包含纤维素、木聚糖的生物质可以使用进行了预处理的。预处理方法不特别限定，可以使用例如，酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等公知的方法。作为进行了这样的预处理的包含纤维素、木聚糖的生物质，可以使用包含木聚糖的浆。
另外，在不从培养本发明的突变株而得的培养液除去菌体而直接制成蛋白质的溶解液利用的情况下，优选进行处理使得本发明的突变株在培养液中不能生长。作为进行处理使得菌体不能生长的方法，可列举热处理、药剂处理、酸/碱处理、UV处理等。
在蛋白质是酶的情况下，可以将如上所述除去菌体或进行处理使得菌体不生长而得的培养液直接作为酶液利用。
本发明中制造的纤维素酶组合物的使用方法不特别限定，优选在糖的制造中使用。进一步优选在低聚木糖和/或纤维寡糖的制造中使用，进一步优选在木二糖和/或纤维二糖的制造中使用。
本发明中的低聚木糖是指至少2个以上木糖通过β-糖苷键连接而成的低聚木糖。低聚木糖的聚合度不特别限定，优选为水溶性高的2糖(木二糖)至6糖(木六糖)。最优选包含肠内细菌容易作为碳源同化的木二糖、木三糖、木四糖。
本发明中的纤维寡糖是指至少2个以上葡萄糖通过β-糖苷键连接而成的纤维寡糖。纤维寡糖的聚合度不特别限定，优选为水溶性高的2糖(纤维二糖)至6糖(纤维六糖)。最优选包含肠内细菌容易作为碳源同化的纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖。
本发明中纤维素酶组合物通过培养木霉属丝状菌而获得，在生物质的糖化反应中使用。纤维素酶组合物的制备方法不特别限定，但优选培养液所包含的木霉属丝状菌的菌体被除去、或不生长。这是为了防止纤维素酶组合物与生物质糖化反应时生成的葡萄糖、低聚木糖被菌体消耗。作为菌体的除去方法，可列举离心分离、膜分离等作为例子。作为使得菌体不生长的处理方法，可列举热处理、试剂处理、酸/碱处理、UV处理等。
使用培养木霉属丝状菌而得的纤维素酶组合物制造糖的方法不特别限定，可以用纤维素酶组合物将生物质糖化。糖化反应中使用的生物质可以利用包含纤维素和/或木聚糖的生物质。另外，糖化反应中使用的纤维素和/或生物质可以事先进行预处理。作为预处理方法，不特别限定，具体地，可以使用酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等公知的方法。另外，对于反应pH不特别限定，但pH优选为3至7左右，更优选为4至6，更优选为5左右。对于反应温度不特别限定，优选为40度至70度。
通过上述的糖化反应，可以由包含木糖的生物质获得低聚木糖、优选为木二糖，可以从包含纤维素的生物质获得纤维寡糖、优选为纤维二糖，可以从包含纤维素和木糖的生物质获得低聚木糖和纤维寡糖、优选为木二糖和纤维二糖。另外，在通过上述的糖化反应获得的糖中，除了低聚木糖、纤维寡糖以外，还可以包含通过纤维素酶组合物所包含的水解酶生成的甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖，纤维三糖、纤维四糖、甘露二糖、半乳二糖等寡糖等。
由本发明的糖化反应制造的反应后液中可以包含无机盐、氨基酸、蛋白质、木质素等作为杂质，另外为了除去这些杂质，可以进行纯化操作。作为纯化操作，可以应用离子交换、膜分离、晶析、脱盐等公知的方法。
通过本发明制造的单糖级分(葡萄糖、木糖等)与寡糖级分(低聚木糖、纤维寡糖等)优选通过后工序而分离。葡萄糖优选作为发酵原料在化学品的制造中使用，低聚木糖优选在饲料、食品、化妆品用途中使用。作为化学品的具体例，可列举乙醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、甘油等醇，醋酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸、肌苷、鸟苷等核苷、肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸、尸胺等胺化合物。另一方面，木糖能够作为发酵原料使用的微生物受限。进一步木糖如果作为饲料而给与猪等，则一半左右被作为尿排出。因此，优选将从木聚糖和低聚木糖向木糖的分解抑制在最小限，提高低聚木糖收率。
本发明中单糖级分与寡糖级分的分离方法不特别限定，可以使用公知的方法。例如，优选使用国际公开第2017/110975号所记载那样的膜分离。此时木糖的比例越少，则混入寡糖级分中的木糖的量越降低，因而在膜分离工序中有利地发挥作用。
实施例
以下列举实施例具体说明本发明。
＜参考例1＞木霉属丝状菌的培养
(预培养)
将各种里氏木霉的突变株的孢子用生理盐水稀释成1.0×107/mL，将该稀释孢子溶液2.5mL接种到装入表1所示的1L带挡板的烧瓶中的250mL的预培养培养基中，用振荡培养机在28℃、120rpm的条件下进行72小时培养。作为对照，使用里氏木霉PC-3-7株，进行同样的实验操作。
表1
＊1マンデルス包含7g/L(NH4)2SO4、10g/L KH2PO4、3g/L CaCl2、3g/L MgSO4·7H2O(以下相同)。
＊2微量元素溶液包含0.3g/L H3BO3、1.3g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O、5g/L FeCl3·6H2O、2g/L CuSO4·5H2O、0.4g/L MnCl2·4H2O、10g/L ZnCl2(以下相同)。
(主培养)
Arbocel B800(商品名、レッテンマイヤー社、粉末纤维素)添加到表2所示的主培养培养基中，使用5L缸式发酵槽(バイオット社制)进行深层培养研究。
将里氏木霉PC-3-7株和各种里氏木霉的突变株的预培养液250mL接种到添加了Arbocel B800(商品名)的主培养培养基2.5L中。
培养条件是，在主培养培养基中接种预培养培养基后，以28℃、700rpm、通气量100mL/min的培养条件一边控制pH5.0一边进行深层培养。
表2
| Arbocel B800(商品名) | 100g |
| 玉米浸泡水(CSL) | 25g |
| 5xマンデルス | 200mL |
| 硫酸铵 | 1.4g |
| 微量元素 | 1mL |
| PE-M(商品名)消泡剤 | 0.5mL |
| 总培养液量 | 1000mL |
(培养液的采集)
从培养开始到培养结束时的经过74小时后各采集培养液20mL。将采集的培养液中的16mL用于后述的粘度的测定。剩余的培养液在20,000×g、4℃的条件下进行10分钟离心分离，获得上清。将该上清用0.22μm的过滤器过滤，以其滤液作为纤维素酶溶液而在以后的糖化试验中使用。
＜参考例2＞培养液的粘度的测定
将培养开始经过0、24、48、74小时后的培养液16mL使用数字旋转粘度计DV2T和SPINDLE ULA(BROOKFIELD社制)，求出将旋转数设定为0.3rpm时的粘度(cP)。
＜参考例3＞蛋白质浓度测定条件
使用的蛋白质浓度测定试剂：Quick Start Bradford蛋白测定试剂盒(Bio-Rad制)
测定条件
测定温度：室温
蛋白质浓度测定试剂：250μL
丝状菌的培养液：5μL
反应时间：5分钟
吸光度：595nm
标准品：BSA。
＜参考例4＞纤维素酶的比活性的测定条件
(β-葡糖苷酶比活性的测定条件)
底物：对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)
反应液：含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL
酶稀释液：10μL
反应温度：30℃
反应时间：10分钟
反应终止剂：2M碳酸钠10μL
吸光度：405nm。
(β-木糖苷酶比活性的测定条件)
底物：对硝基苯基-β-吡喃木糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)
反应液：含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃木糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL
酶稀释液：10μL
反应温度：30℃
反应时间：30分钟
反应终止剂：2M碳酸钠10μL
吸光度：405nm。
＜参考例5＞糖化试验
酶液使用量：8mg/g(每1g生物质的酶使用量)
生物质：Arbocel B800(商品名、レッテンマイヤー社)、甘蔗渣粉末
生物质加入量：5％(w/v)
反应温度：50℃
反应时间：24小时
反应pH：5.0
将反应液在8,000×g的条件下进行5分钟离心分离，获得上清。将其上清用0.22μm的过滤器进行过滤，将其滤液通过参考例6所示的方法供于各种糖的分析。
＜参考例6＞糖浓度的测定
对于低聚木糖、葡萄糖、木糖，使用日立高速液相色谱LaChrom Eite(HITACHI)，通过以下的条件进行定量分析。
以通过作为低聚木糖的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、作为纤维寡糖的纤维二糖、纤维三糖、和作为单糖的葡萄糖、木糖的标准品制作的标准曲线为基础，进行定量分析。其中，本实施例中所记的低聚木糖是指2～6个木糖单元通过β-糖苷键结合而成的低聚木糖。另外，本实施例中所记的纤维寡糖是指2～6个葡萄糖单元通过β-糖苷键结合而成的纤维寡糖。
柱：KS802、KS803(Shodex)
移动相：水
检测方法：RI
流速：0.5mL/分钟
温度：75℃
＜比较例1＞以里氏木霉PC-3-7作为亲本株制作BGL活性降低了的突变株(PC-3-7-ΔBGL/BXL株)
将里氏木霉PC-3-7的孢子用生理盐水稀释成1.0×107/mL，将该稀释孢子溶液0.1mL接种到表1所示的装入到50mL带挡板的烧瓶中的10mL的预培养培养基中，利用振荡培养器在28℃、120rpm的条件下培养4小时。对培养液用NTG(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)实施90分钟突变处理。从该悬浮液通过离心分离进行集菌，将洗涤后的突变孢子接种在包含2重量％Arbocel B800(商品名、レッテンマイヤー社)的培养基中，以28℃、120小时、125rpm进行培养。关于β-葡糖苷酶活性降低了的突变株的选择，将培养液离心分离而得的上清通过参考例4所记载的方法评价β-葡糖苷酶活性。酶活性(U)作为1分钟游离出1mol的p-硝基苯酚的酶量算出。其结果获得了β-葡糖苷酶活性与作为亲本株的PC-3-7相比降低到约1/25的株。将结果示于表3。另外，分析PC-3-7-ΔBGL/BXL株的基因序列的结果表明，BGL1基因的第1226位的胸腺嘧啶(T)缺失的结果产生了移码突变。
＜比较例2＞以里氏木霉PC-3-7作为亲本株制作BXL活性降低了的突变株(PC-3-7BGL/ΔBXL株)
将里氏木霉PC-3-7的孢子用生理盐水稀释成1.0×107/mL，将该稀释孢子溶液0.1mL接种到表1所示的装入到50mL带挡板的烧瓶中的10mL的预培养培养基中，利用振荡培养器在28℃、120rpm的条件下培养4小时。对培养液用NTG(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)实施90分钟突变处理。从该悬浮液通过离心分离进行集菌，将洗涤后的突变孢子接种在包含2重量％Arbocel B800(商品名、レッテンマイヤー社)的培养基中，以28℃、120小时、125rpm进行培养。关于β-木糖苷酶活性降低了的突变株的选择，将培养液离心分离而得的上清通过参考例4所记载的方法评价β-木糖苷酶活性。酶活性(U)作为1分钟游离出1mol的p-硝基苯酚的酶量算出。其结果获得了β-木糖苷酶活性与作为亲本株的PC-3-7相比降低到约1/210的株。将结果示于表3。另外，分析PC-3-7-BGL/ΔBXL株的基因序列的结果表明，BXL基因的第1640位的鸟嘌呤(G)突变成了腺嘌呤(A)。
＜实施例1＞以PC-3-7BGL/ΔBXL作为亲本株制作BGL和BXL活性降低了的突变株(PC-3-7ΔBGL/ΔBXL)株
将PC-3-7BGL/ΔBXL株的孢子用生理盐水稀释成1.0×107/mL，将该稀释孢子溶液0.1mL接种到表1所示的装入到50mL带挡板的烧瓶中的10mL的预培养培养基中，利用振荡培养器在28℃、120rpm的条件下培养4小时。对培养液用NTG(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)实施90分钟突变处理。从该悬浮液通过离心分离进行集菌，将洗涤后的突变孢子用PDA琼脂培养基进行克隆化。将所得的突变孢子用生理盐水稀释成1.0×107/mL，在包含2重量％Arbocel B800(商品名、レッテンマイヤー社)的培养基接种1％(v/v)，以28℃、120小时、125rpm进行培养。β-葡糖苷酶活性降低了的突变株的选择，通过将培养液离心分离而得的上清用参考例4所记载的方法评价β-葡糖苷酶活性来进行。酶活性(U)作为1分钟游离出1mol的p-硝基苯酚的酶量算出。其结果获得了与作为β-葡糖苷酶活性未降低的亲本株的PC-3-7BGL/ΔBXL相比β-葡糖苷酶活性分别降低到约1/22的株。将结果示于表3。另外，分析PC-3-7-ΔBGL/ΔBXL株的基因序列的结果得知，距离BGL基因的翻译起始位点198碱基上游的推测为Xyr1结合部位的腺嘌呤(A)缺失了。
＜实施例2＞以PC-3-7ΔBGL/BXL作为亲本株制作BGL和BXL活性降低了的突变株(PC-3-7ΔBGL/ΔBXL-B)株
将PC-3-7ΔBGL/BXL株的孢子用生理盐水稀释成1.0×107/mL，将该稀释孢子溶液0.1mL接种到表1所示的装入到50mL带挡板的烧瓶中的10mL的预培养培养基中，利用振荡培养器在28℃、120rpm的条件下培养4小时。对培养液用NTG(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)实施90分钟突变处理。从该悬浮液通过离心分离进行集菌，将洗涤后的突变孢子在PDA琼脂培养基中进行克隆化。将所得的突变孢子用生理盐水稀释成1.0×107/mL，在包含2重量％Arbocel B800(商品名、レッテンマイヤー社)的培养基中接种1％(v/v)，以28℃、120小时、125rpm进行培养。β-木糖苷酶活性降低了的突变株的选择，通过将培养液离心分离而得的上清用参考例4所记载的方法评价β-木糖苷酶活性来进行。酶活性(U)作为1分钟游离出1mol的p-硝基苯酚的酶量算出。其结果获得了β-木糖苷酶活性缺失了的突变株。将结果示于表3。另外，分析PC-3-7-ΔBGL/ΔBXL-B株的基因序列的结果表明，从BXL基因的翻译起始位点起第2018位的A替换成了T，第2065位的A替换成T。
表3
| β-葡糖苷酶比活性 | β-木糖苷酶比活性 | |
| PC-3-7BGL/BXL(亲本株) | 0.406 | 0.486 |
| PC-3-7ΔBGL/BXL(比较例1) | 0.0165 | 0.397 |
| PC-3-7BGL/ΔBXL(比较例2) | 0.359 | 0.00235 |
| PC-3-7ΔBGL/ΔBXL(实施例1) | 0.0166 | 0.00154 |
| PC-3-7ΔBGL/ΔBXL-B(实施例2) | 0.0145 | 检测限以下 |
＜比较例3＞里氏木霉PC-3-7株的粘度测定
使用参考例2中记载的方法，测定里氏木霉PC-3-7的培养液中的经时粘度。其结果显示，培养中的最大粘度为226cP。将结果示于表4。以该值作为100％，与突变株的培养液的粘度进行比较。
＜比较例4＞PC-3-7ΔBGL/BXL株的粘度测定
使用参考例2中记载的方法，测定比较例1中制作的PC-3-7ΔBGL/BXL株的培养液中的经时粘度。其结果显示，培养中的最大粘度为230cP。将结果示于表4。可知与里氏木霉PC-3-7株相比无变化。
＜比较例5＞PC-3-7BGL/ΔBXL株的粘度测定
使用参考例2中记载的方法，测定比较例2中制作的PC-3-7BGL/ΔBXL株的培养液中的经时粘度。其结果显示，培养中的最大粘度为164cP。将结果示于表4。可知与里氏木霉PC-3-7株相比降低了27.4％。
＜实施例3＞PC-3-7ΔBGL/ΔBXL株的粘度测定
使用参考例2中记载的方法，测定实施例1中制作的PC-3-7ΔBGL/ΔBXL株的培养液中的经时粘度。其结果显示，培养中的最大粘度为117cP，与里氏木霉PC-3-7株相比降低了48.2％(表4)。
＜实施例4＞PC-3-7ΔBGL/ΔBXL-B株的粘度测定
使用参考例2中记载的方法，测定实施例2中制作的PC-3-7ΔBGL/ΔBXL株的培养液中的经时粘度。其结果显示，培养中的最大粘度为131cP，与里氏木霉PC-3-7株相比降低了42.0％(表4)。
表4
＜比较例6＞使用里氏木霉PC-3-7株的纤维素酶组合物的糖化试验
通过参考例5所记载的方法将二种生物质(Arbocel B800(商品名、レッテンマイヤー社)、甘蔗渣粉末以24小时、50℃供于糖化反应。将糖化反应液通过参考例6所记载的方法进行定量分析。如果着眼于木二糖的浓度，则对于PC-3-7株，在Arbocel B800(商品名)、甘蔗渣粉末的任何生物质中均未确认生成。将结果示于表5。
＜比较例7＞使用PC-3-7BGL/ΔBXL株的纤维素酶组合物的糖化试验通过参考例5所记载的方法将二种生物质(Arbocel B800(レッテンマイヤー社)、甘蔗渣粉末)以24小时、50℃供于糖化反应。将糖化反应液通过参考例6所记载的方法进行定量分析。其结果是，对于PC-3-7BGL/ΔBXL株，分别游离了3.15g/L、1.07g/L的木二糖。将结果示于表5。
＜实施例5＞使用PC-3-7ΔBGL/ΔBXL株的纤维素酶组合物的糖化试验
通过参考例5所记载的方法将二种生物质(Arbocel B800(レッテンマイヤー社)、甘蔗渣粉末)以24小时、50℃供于糖化反应。将糖化反应液通过参考例6所记载的方法进行定量分析。对于PC-3-7ΔBGL/ΔBXL株，木二糖的游离量分别显示3.45g/L、1.28g/L，意外地与PC-3-7BGL/ΔBXL株的结果相比分别增加了9.52％、19.6％。将结果示于表5。
＜实施例6＞使用PC-3-7ΔBGL/ΔBXL株的纤维素酶组合物的糖化试验
通过参考例5所记载的方法将二种生物质(Arbocel B800(レッテンマイヤー社)、甘蔗渣粉末)以24小时、50℃供于糖化反应。将糖化反应液通过参考例6所记载的方法进行定量分析。对于PC-3-7ΔBGL/ΔBXL-B株，木二糖的游离量分别显示3.45g/L、1.28g/L，意外地与PC-3-7BGL/ΔBXL株的结果相比分别增加了44.1％、61.2％。将结果示于表5。
表5
Claims (7)
1.木霉属丝状菌的突变株，其β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶的活性与突变导入前的亲本株相比降低了。
2.根据权利要求1所述的突变株，所述β-葡糖苷酶的比活性为0.02U/mg-蛋白质以下，并且所述β-木糖苷酶的比活性为0.002U/mg-蛋白质以下。
3.根据权利要求1或2所述的突变株，所述木霉属丝状菌是里氏木霉。
4.蛋白质的制造方法，是培养权利要求1～3的任一项所述的突变株而制造蛋白质的方法。
5.根据权利要求4所述的制造方法，所述蛋白质是纤维素酶。
6.低聚木糖的制造方法，其中，利用通过权利要求5所述的方法制造出的纤维素酶，水解包含木聚糖的生物质。
7.使木霉属丝状菌的液体培养时的培养液的粘度降低的方法，包括使木霉属丝状菌的β-葡糖苷酶活性和β-木糖苷酶活性降低。
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