JPH0833496A - オリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 β−グルカンを酵素加水分解し、オリゴ糖を
生成させるオリゴ糖の製造法において、反応液中にβ−
グルカン加水分解酵素の他にグルコン酸又はグルコノラ
クトンを添加することを特徴とするオリゴ糖の製造法、
及びβ−グルカンを酵素加水分解し、オリゴ糖を生成さ
せるオリゴ糖の製造法において、反応液中にβ−グルカ
ン加水分解酵素の他にグルコ−スオキシダ−ゼを添加す
ることを特徴とするオリゴ糖の製造法。 【効果】 β−グルコシダ−ゼの除去等の特別な工程を
必要とせず、市販の安価なβ−グルカン加水分解酵素を
直接製造工程に適用でき、従って製造設備の簡略化も可
能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、オリゴ糖の製造法に関
する。本発明の製造法により製造されるオリゴ糖は、砂
糖とは異なる甘味を持ち、難消化性であることから低カ
ロリ−食品素材としての用途が考えられ、また医薬分野
への利用も期待されている。

【０００２】

【従来の技術】従来、β−グルコオリゴ糖の製造法とし
ては、β−グルカンを酸加水分解、例えば塩酸や硫酸等
の存在下で加温し加水分解した後、カ−ボンカラム等に
よって分画分取する方法が知られており、セルロ−スか
らセロオリゴ糖を得る方法（Miller, G.L, Methods in
Carbohydorate Chemistry III, Cellulose, 134(196
3)）、β-1,3−グルカンからラミナリオリゴ糖を得る方
法（Whelan, M.J, Methodsin Carbohydorate Chemistry
I, 330(1962)）等が報告されている。この酸加水分解
による方法は耐酸性の設備を必要とし、操作が煩雑であ
ること、反応自体の収率がよくなく、副生物として多量
のグルコ−スを生成すること、反応後の中和反応で生成
する多量の塩の除去が必要であること、また、反応条件
が過酷なため糖が分解、異性化する等の欠点がある。

【０００３】これらの酸分解法の欠点を補うため、温和
な条件で低分子化が可能な酵素分解法も検討されてい
る。即ち、各種β−グルカンを酵素によって加水分解
し、対応するオリゴ糖を生成させる方法、例えばAcremo
nium sp.15の生産する酵素によるソホログルカンからの
ソホロ−スの製造（Agric. Biol. Chem., 51(10),2701
(1987))、Streptomyces sp.K27-4 の生産する酵素によ
るカ−ドランからのラミナリビオ−スの製造（Agric. B
iol. Chem., 48(6),1433(1984)）等も検討されている。
しかし、工業的に利用可能な酵素は数種類の酵素を含有
していることが多く、一般にβ−グルカン加水分解酵素
にはβ−グルコシダ−ゼが混入している場合が多い。こ
のβ−グルコシダ−ゼはβ−グルカン及びそのオリゴ糖
の非還元末端からグルコ−ス単位でグルコ−スを生成す
ることが知られ、この酵素が共存した場合、β−グルカ
ン加水分解酵素の作用によって生成した目的物であるオ
リゴ糖が分解を受けるためにわずかな量しかオリゴ糖が
得られなかった。特に、ビオ−スはβ−グルコシダ−ゼ
の分解を受け易く、その収率向上の大きな妨げとなって
いる。

【０００４】そこで、酵素を基質のβ−グルカンに作用
させる前にβ−グルコシダ−ゼを除去するための前処理
を行う方法が開発されており、弱酸性陽イオン交換樹脂
によってβ−グルコシダ−ゼを除去したセルラ−ゼを用
いるセロビオ−スの製造法（特開平5-115293号公報）、
セルロ−ス又はセルロ−ス誘導体にセルラ−ゼを吸着さ
せ、β−グルコシダ−ゼと分離した後、酵素反応を行う
方法（特開昭63-226294 号公報、特開平5-227957号公
報）等が知られている。しかし、これらの方法はβ−グ
ルコシダ−ゼの除去率を高めるために慎重な操作を必要
とし、また、β−グルカン加水分解酵素を１００％回収
することが難しい。更に、生産規模を大きくした場合、
より操作が複雑となり実際的・経済的とはいえない。

【０００５】また、β−グルコシダ−ゼを除去した反応
でもグルコ−スの生成は完全に抑えることができず、前
記の方法を用いても反応後の糖液はグルコ−スを含んだ
ものであり、更に高純度のオリゴ糖を製造する場合には
グルコ−スの分離操作が必要である。反応後の糖液中の
グルコ−スの分離法としては、実験室的にはカ−ボンカ
ラムを用いた方法が可能であるが、設備、工程面、規模
等の点で工業的な生産には適していない。また、生物学
的手法によってグルコ−スを除去する方法として、酵素
反応によって調製したオリゴ糖とグルコ−スの混合液
で、グルコ−スのみを選択的に資化する酵母を培養する
ことにより高純度のラミナリビオ−ス又はゲンチオビオ
−スを得る方法（特開昭59-162896 号公報、特開昭59-1
62897 号公報）や酵素反応によって調製したラミナリオ
リゴ糖とグルコ−スの混合液にグルコ−スオキシダ−ゼ
を作用させ、グルコ−スをグルコン酸に変換した後、イ
オン交換樹脂で除く方法（ソビエト国特許公開第929646
号）等が開発されている。しかし、何れの方法も二段階
反応であるために製造にかかる時間が長く、更に前者の
場合は酵母菌体の分離工程が必要なため経済的とはいえ
ない。また、β−グルカン加水分解酵素によるオリゴ糖
生成の際のグルコ−スの副生を根本的に改善するもので
はない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、酵素
反応によってオリゴ糖を生成させる際に、予めβ−グル
カン加水分解酵素中に混入しているβ−グルコシダ−ゼ
の分離操作を行う必要がなく、工業的に容易に利用され
得る酵素を用い、高収率にオリゴ糖を製造することがで
きる工業的に有利なオリゴ糖の製造法を提供することに
ある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、β−グルカンを酵
素加水分解しオリゴ糖を生成させる反応において、β−
グルコシダ−ゼの拮抗阻害物質であるグルコン酸又はグ
ルコノラクトンを反応液中に共存させることにより、β
−グルカン加水分解酵素中に混入しているβ−グルコシ
ダ−ゼの作用を抑制し、高収率でオリゴ糖が得られるこ
と、更に当該グルコン酸又はグルコノラクトンをβ−グ
ルカンの加水分解の際に副生するグルコ−スからグルコ
−スオキシダ−ゼの酸化反応によって生成させることに
よっても、β−グルカン加水分解酵素中に混入している
β−グルコシダ−ゼが阻害され、目的物であるオリゴ糖
を高濃度に蓄積すること、即ち、グルコ−スの除去を容
易にするグルコン酸又はグルコノラクトンへの変換反応
とβ−グルコシダ−ゼの阻害によるオリゴ糖の分解抑制
及び高濃度蓄積が一工程の反応で達成されることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち、本発明の第一は、β−グルカンを酵
素加水分解し、オリゴ糖を生成させるオリゴ糖の製造法
において、反応液中にβ−グルカン加水分解酵素の他に
グルコン酸又はグルコノラクトンを添加することを特徴
とするオリゴ糖の製造法であり、本発明の第二は、β−
グルカンを酵素加水分解し、オリゴ糖を生成させるオリ
ゴ糖の製造法において、反応液中にβ−グルカン加水分
解酵素の他にグルコ−スオキシダ−ゼを添加することを
特徴とするオリゴ糖の製造法である。

【０００９】グルコン酸及びグルコノラクトンは、水溶
液中では平衡混合物として存在するため、本発明の第一
の製造法においては、グルコン酸、グルコノラクトンの
いずれを添加してもよく、その結果、反応液中に存在す
るグルコン酸及び／又はグルコノラクトンがβ−グルカ
ン加水分解酵素中に混入しているβ−グルコシダ−ゼを
阻害し、オリゴ糖の分解を抑制する。

【００１０】本発明の第二の製造法においては、グルコ
−スオキシダ−ゼの作用によって生成したグルコン酸又
はグルコノラクトンがβ−グルカン加水分解酵素中に混
入しているβ−グルコシダ−ゼを阻害し、オリゴ糖の分
解を抑制する。本発明に用いるβ−グルカンとしては、
例えばセルロ−ス、パキマン、ラミナリン、カ−ドラ
ン、ソホログルカン、プスツラン、ルテオ−ス、酵母グ
ルカン等が挙げられ、その起源は農林産物、水産物、微
生物生産物のいずれでもよい。

【００１１】また、本発明に用いるβ−グルカン加水分
解酵素は、セルラ−ゼ（β−１，４−グルカナ−ゼ）、
β−１，２−グルカナ−ゼ、β−１，３−グルカナ−
ゼ、β−１，６−グルカナ−ゼ等を成分として含み、前
記β−グルカンから対応するオリゴ糖を生成する酵素を
選び使用する。β−グルカン加水分解酵素の起源、種類
は特に限定されず、トリコデルマ属、アスペルギルス
属、ペニシリウム属、リゾクトニア属、アクレモニウム
属、フミコラ属、バチルス属、セルロモナス属、クロス
トリジウム属、ルミノコッカス属、ストレプトマイセス
属等の微生物から得られるものを例示でき、その使用形
態としては、必ずしも精製して使用する必要はなく、培
養液、培養物抽出液又は精製段階の標品等のいずれを用
いてもよいし、市販の酵素製剤をそのまま使用すること
もできる。むろん可溶性や不溶性の担体に固定化して用
いることもできる。また酵素は起源の異なるものを単独
で用いても、２種以上を同時に用いてもよい。

【００１２】本発明の第二の製造法に用いるグルコ−ス
オキシダ−ゼについても、その起源、種類は特に限定さ
れず、アスペルギルス属、ペニシリウム属等の微生物か
ら得られるものを例示でき、その使用形態としては必ず
しも精製して使用する必要はなく、培養液、培養物抽出
液又は精製段階の標品等のいずれを用いてもよいし、市
販の酵素製剤を使用することもできる。

【００１３】本発明の製造法においては、基質のβ−グ
ルカンを、通常ｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ３〜８の
水性媒体に通常１〜２０重量％の範囲で懸濁し、β−グ
ルカン加水分解酵素（本発明の第二の製造法では更にグ
ルコ−スオキシダ−ゼ）を対基質で通常０．１〜３０重
量％添加し反応させる。反応は、通常１０〜９０℃、好
ましくは３０〜６０℃で、通常０．５〜１００時間、好
ましくは１〜２０時間振盪又は攪拌しながら行う。

【００１４】本発明の第一の製造法においては、グルコ
ン酸又はグルコノラクトンは、通常５μＭ〜１Ｍ、好ま
しくは５ｍＭ〜１００ｍＭ添加する。本発明の第二の製
造法においては、反応液はグルコン酸の生成に伴いその
ｐＨが低下するため、酵素が失活しない範囲でアルカリ
を添加しｐＨを調整し、また、グルコ−スの酸化を十分
に行わせるために、通気等により酸素を供給することが
好ましい。必要に応じて、グルコン酸と同時に生成する
過酸化水素を消去するためにカタラ−ゼを添加しておく
こともできる。

【００１５】本発明に用いる水性媒体としては、水、又
はNaCl、KCl 、(NH₄)₂SO₄ 、Na₂CO₃等の塩の水溶液、又
はリン酸、酢酸、クエン酸、グリシン等を含む緩衝液を
例示することができ、これらは酵素反応を阻害するもの
でなければ如何なる濃度でも使用できる。反応終了後、
不溶物を除いた後、イオン交換樹脂、電気透析等の手法
により脱塩とグルコン酸、グルコノラクトンの除去を行
うことで容易にオリゴ糖溶液が得られ、当該溶液を直接
乾燥するか濃縮析出することによりオリゴ糖粉末が容易
に高収率で得られる。

【００１６】以上のように処理することにより、基質で
あるβ−グルカンの種類、β−グルカン加水分解酵素の
種類、反応条件等に応じて、ソホロオリゴ糖、ラミナリ
オリゴ糖、セロオリゴ糖又はゲンチオオリゴ糖等の各種
β−グルコオリゴ糖、例えばソホロ−ス、ラミナリビオ
−ス、セロビオ−ス、ゲンチオビオ−スを高収率で得る
ことができる。

【００１７】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。なお、下記の実施例における生成糖の定
量は、高速液体クロマトグラフィ−を用い、ピ−ク面積
から求めた。即ち、アサヒパックGS-220（φ7.6mm ×50
cm旭化成工業株式会社製）×２本カラムを用い、水で溶
出させ、示差屈折計を用いて行った。また、グルコ−ス
についてはグルコ−ス測定用キット（商品名グルコ−ス
Ｃ−テストワコ− 和光純薬工業株式会社）による定量
を合わせて行った。

【００１８】（実施例１）市販のトリコデルマ起源のセ
ルラ−ゼ（商品名メイセラ−ゼＰ−１ 明治製菓株式会
社製）１５ｍｇ、アスペルギルス起源のグルコ−スオキ
シダ−ゼ（商品名ハイデラ−ゼ 天野製薬株式会社製）
２０ｍｇ及びセルロ−ス粉末（商品名ＫＣ−フロック
Ｗ−１００ 山陽国策パルプ株式会社製）２５０ｍｇを
Ｌ字管中の０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍｌ
に懸濁し、４０℃で１５時間振盪しながら反応させた。
反応終了後、遠心分離により残渣と上清に分け、上清を
陰イオン交換樹脂（ＯＨ^- 型）のカラムにかけグルコン
酸を除いた後、糖化液中のセロオリゴ糖及びグルコ−ス
を定量した。また別に、グルコン酸３０ｍｇを添加し、
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ５．０に調整した
後、セルラ−ゼのみで同条件にて反応させたもの、更に
対照実験として、グルコン酸及びグルコ−スオキシダ−
ゼを添加せず、セルラ−ゼのみで同条件にて反応させた
ものについてセロオリゴ糖及びグルコ−スの定量を行っ
た。その結果を表１に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】（実施例２）セルラ−ゼ（商品名メイセラ
−ゼＰ−１ 明治製菓株式会社製）と同時に作用させる
グルコ−スオキシダ−ゼとしてペニシリウム起源のグル
コ−スオキシダ−ゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）又
はペニシリウム起源のグルコ−スオキシダ−ゼ（オリエ
ンタル酵母株式会社製）を用いた他は実施例１の方法と
同様に反応させ、反応後糖含量を分析した。その結果を
表２に示す。

【００２１】

【表２】

【００２２】（実施例３）市販のリゾクトニア起源のβ
−１，３−グルカナ−ゼ（商品名キタラ−ゼ ケイ・ア
イ化成株式会社製）１０ｍｇ、アスペルギルス起源のグ
ルコ−スオキシダ−ゼ（商品名ハイデラ−ゼ 天野製薬
株式会社製）２０ｍｇ及びカ−ドラン（和光純薬工業株
式会社）５００ｍｇをＬ字管中の０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）１０ｍｌに懸濁し、以下、実施例１と同
様に操作し、生成したラミナリオリゴ糖の定量を行っ
た。その結果を表３に示す。

【００２３】

【表３】

【００２４】（実施例４）β−１，３−グルカナ−ゼ
（商品名キタラ−ゼ ケイ・アイ化成株式会社製）と同
時に作用させるグルコ−スオキシダ−ゼとしてペニシリ
ウム起源のグルコ−スオキシダ−ゼ（ナガセ生化学工業
株式会社製）又はペニシリウム起源のグルコ−スオキシ
ダ−ゼ（オリエンタル酵母株式会社製）を用いた他は実
施例３の方法と同様に反応させ、反応後糖含量を分析し
た。その結果を表４に示す。

【００２５】

【表４】

【００２６】以上のように、グルコン酸が反応液中に存
在することにより、オリゴ糖の収量が著しく増加し、ま
た、グルコ−スオキシダ−ゼの作用によって、当該グル
コン酸を副生するグルコ−スから生成させることによ
り、同時にグルコ−スの除去も可能である。 （実施例５）１Ｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
に市販のトリコデルマ起源のセルラ−ゼ（商品名メイセ
ラ−ゼＰ−１ 明治製菓株式会社製）１．５ｇ、アスペ
ルギルス起源のグルコ−スオキシダ−ゼ（商品名ハイデ
ラ−ゼ 天野製薬株式会社製）２ｇ及びセルロ−ス粉末
（商品名ＫＣ−フロック Ｗ−１００ 山陽国策パルプ
株式会社製）２５ｇを懸濁し、４０℃で１５時間攪拌し
ながら反応させた。反応は、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液でｐＨ５．０にコントロ−ルし、通気によって酸素を
供給しながら行った。反応終了後、遠心分離により残渣
と上清に分け、上清を陰イオン交換樹脂（ＯＨ^- 型）の
カラムにかけグルコン酸を除いた後、糖化液中のセロビ
オ−ス及びグルコ−スを定量した。その結果、糖液中の
セロビオ−ス、グルコ−スはそれぞれ４．３ｇ／Ｌ、
０．１２ｇ／Ｌであり、糖のうち９７％がセロビオ−ス
であった。

【００２７】（実施例６）１Ｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）にリゾクトニア起源のβ−１，３−グル
カナ−ゼ（商品名キタラ−ゼ ケイ・アイ化成株式会社
製）１ｇ、アスペルギルス起源のグルコ−スオキシダ−
ゼ（商品名ハイデラ−ゼ 天野製薬株式会社製）２ｇ及
びカ−ドラン（和光純薬工業株式会社）５０ｇを懸濁
し、以下、実施例５と同様に操作し、糖化液中のラミナ
リビオ−ス、ラミナリトリオ−ス及びグルコ−スを定量
した。その結果、糖液中のラミナリビオ−ス、ラミナリ
トリオ−ス及びグルコ−スはそれぞれ３０．３ｇ／Ｌ、
８．２ｇ／Ｌ及び１．４ｇ／Ｌであり、糖のうち９６％
がラミナリビオ−スとラミナリトリオ−スであった。

【００２８】

【発明の効果】本発明によれば、β−グルコシダ−ゼの
除去等の特別な工程を必要とせず、市販の安価なβ−グ
ルカン加水分解酵素を直接製造工程に適用でき、従って
製造設備の簡略化も可能となる。その結果として各種オ
リゴ糖を低コストで効率よく生産することができ、その
工業的意義は極めて大きい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:80）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 β−グルカンを酵素加水分解し、オリゴ
   糖を生成させるオリゴ糖の製造法において、反応液中に
   β−グルカン加水分解酵素の他にグルコン酸又はグルコ
   ノラクトンを添加することを特徴とするオリゴ糖の製造
   法。
2. 【請求項２】 オリゴ糖がソホロオリゴ糖、ラミナリオ
   リゴ糖、セロオリゴ糖又はゲンチオオリゴ糖である請求
   項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 オリゴ糖がソホロ−ス、ラミナリビオ−
   ス、セロビオ−ス又はゲンチオビオ−スである請求項１
   記載の製造法。
4. 【請求項４】 β−グルカンを酵素加水分解し、オリゴ
   糖を生成させるオリゴ糖の製造法において、反応液中に
   β−グルカン加水分解酵素の他にグルコ−スオキシダ−
   ゼを添加することを特徴とするオリゴ糖の製造法。
5. 【請求項５】 グルコ−スオキシダ−ゼの作用によって
   生成したグルコン酸又はグルコノラクトンがβ−グルカ
   ン加水分解酵素中に混入しているβ−グルコシダ−ゼを
   阻害し、オリゴ糖の分解を抑制することを特徴とする請
   求項４記載の製造法。
6. 【請求項６】 オリゴ糖がソホロオリゴ糖、ラミナリオ
   リゴ糖、セロオリゴ糖又はゲンチオオリゴ糖である請求
   項４又は５記載の製造法。
7. 【請求項７】 オリゴ糖がソホロ−ス、ラミナリビオ−
   ス、セロビオ−ス又はゲンチオビオ−スである請求項４
   又は５記載の製造法。
8. 【請求項８】 グルコ−スオキシダ−ゼがアスペルギル
   ス属又はペニシリウム属由来の酵素である請求項４〜７
   のいずれか１項に記載の製造法。