KR20180043365A - 글리코시드 하이돌라제 및 동물에서의 병원성 감염의 예방 및/또는 치료에서 이의 용도 - Google Patents

글리코시드 하이돌라제 및 동물에서의 병원성 감염의 예방 및/또는 치료에서 이의 용도 Download PDF

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샤를로테 호르스만스 풀센
스벤 하닝
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듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스
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Abstract

동물에서 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 이용하는 방법 및 조성물이 개시되며, 병원성 감염은 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하고, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

글리코시드 하이돌라제 및 동물에서의 병원성 감염의 예방 및/또는 치료에서 이의 용도
본 출원은 2015년 9월 2일에 출원된 U.S. 가출원 번호 62/213564의 이익을 청구하며, 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
분야
본 분야는 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제, 그리고 특히 동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사의 예방 및/또는 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
인간 및 동물 모두의 치료에서 항생체의 사용은 현재 주요한 세계적 건강 위협이 된 항균제 내성을 일으켰다. 따라서, 이러한 세계적 건강 우려사항을 해결하기 위해 항생제에 대한 대안 개발이 계속 추구된다.
소비자들은 동물 사료에서 항생제의 광범위한 사용을 매우 우려한다. 소매업자 및 농장주는 모두 항생제-비함유 고기에 대한 이러한 소비자 선호도 변화에 대응하여 변화할 필요가 있을 것이다.
장독소생성 에스체리키아(E.) 콜라이(Escherichia coli(ETEC))는 전형적으로 중증 물성 설사로 나타나는, 어린 동물, 예컨대 돼지 및 송아지의 가장 일반적인 유형의 대장균증이다. 이는 또한 개발도상국의 여행자("여행자 설사") 및 어린이에서 설사의 상당한 원인이다.
거의 모든 ETEC 박테리아는 단백질성 표면 부속물(가는 털 및 섬모)에 의해 또는 가는 털 단백질에 의해 소장 상피 상의 수용체에 부착하는 것으로 알려져 있다. 추가로, 이들은 소장 상피 세포의 흡수를 감소시키고 유체 및 전해질 분비를 증가시키는 단백질 독소(장독소)를 분비한다. 장독소는 장세포 상에 국소 작용한다. 동물에서 ETEC 감염 및 설사의 역학, 발병기전, 진단 및 예방의 상세내용은 문헌[Nagy and Fekete (1999) Vet Res. 30:259-84]에서 확인될 수 있다.
보다 구체적으로, ETEC 및 장독소혈증(ETEEC) 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)(F18+ E. 콜라이)는 소장에 집락하고 매우 어린 동물, 예컨대 새끼돼지 및 송아지에서 설사를 유도하고 제3 세계에서 인간 사망률의 주 원인인 F18 가는 털을 발현하는 것으로 확인되었다. 이러한 질환에 대한 보호는 동물 장 세포에 대한 이러한 병원체의 가는 털 부착을 방지함으로써 확립될 수 있다. 따라서, 병원성 감염, 예컨대 ETEC의 예방 및 치료를 위한 신규하고 대안적인 접근을 찾을 필요성이 존재한다.
하나의 양태에서, 동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법이 개시되며, 병원성 감염 및/또는 설사는 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하고, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 글리코시드 가수분해효소는 알파-L-푸코시다제이다.
또 다른 양태에서, 알파-L-푸코시다제는 단독으로 또는 (a) 혈액형 A 항원을 혈액형 H 항원으로 전환할 수 있거나 (b) 혈액형 B 항원을 혈액형 H 항원으로 전환할 수 있는 효소와 함께 글리칸-함유 구조로부터 말단 알파-1,2-결합 푸코스기를 제거할 수 있다. 보다 구체적으로, 알파-L-푸코시다제는 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95) 및 글리코시드 가수분해효소 패밀리 29(GH29)로 구성된 군으로부터 선택된다.
제3 양태에서, 병원체는 F18 가는 털을 발현하는 에스체리키아 콜라이이다.
제4 양태에서, 개시된 방법은 단독으로 또는 적어도 하나의 프로테아제와 함께 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 유효량의 알파-L-푸코시다제를 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 또한 알파-L-푸코시다제는 캡슐화된다.
제5 양태에서, 개시된 방법은 캡슐화되건 캡슐화되지 않건, 알파-L-푸코시다제, 및/또는 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 프로테아제가 동물 사료 또는 프리믹스에 투여되는 단계를 추가로 포함한다. 또한, 캡슐화되건 캡슐화되지 않건, 알파-L-푸코시다제는 동물 사료 또는 프리믹스에서의 이용을 위한 과립 형태일 수 있다.
제6 양태에서, 동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 조성물이 개시되며, 병원성 감염 및/또는 설사는 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하며, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 글리코시드 가수분해효소는 알파-L-푸코시다제이다.
이 알파-L-푸코시다제는 단독으로 또는 (a) 혈액형 A 항원을 혈액형 H 항원으로 전환할 수 있거나 (b) 혈액형 B 항원을 혈액형 H 항원으로 전환할 수 있는 효소와 함께 글리칸-함유 구조로부터 말단 알파-1,2-결합 푸코스기를 제거할 수 있다. 또한, 알파-L-푸코시다제는 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95) 및 글리코시드 가수분해효소 패밀리 29(GH29)로 구성된 군으로부터 선택된다.
제7 양태에서, 병원체는 F18 가는 털을 발현하는 에스체리키아 콜라이이다.
제8 양태에서, 개시된 조성물은 단독으로 또는 적어도 하나의 프로테아제와 함께 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물을 추가로 포함하며, 알파-L-푸코시다제는 캡슐화될 수도 캡슐화되지 않을 수도 있고, 동물 사료 또는 프리믹스에서 이용될 수 있다.
제9 양태에서, 개시된 조성물은 캡슐화되건 캡슐화되지 않건, 알파-L-푸코시다제, 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 적어도 하나의 프로테아제가 사료 또는 프리믹스로 동물에게 투여되는 단계를 포함할 수 있고, 알파-L-푸코시다제는 동물 사료 또는 프리믹스에서 이용하기 위한 과립의 형태일 수 있다.
도 1a는 p3JM의 예시적 플라스미드 맵을 도시한다.
도 1b는 p2JM의 예시적 플라스미드 맵을 도시한다.
도 2는 pGXT-GOI의 예시적 플라스미드 맵을 도시한다.
도 3은 2'-푸코실락토스의 가수분해에 의한 미정제 배양 상청액 중 알파-1,2-푸코시다제 활성의 그래프이다.
도 4는 2'푸코실락토스로의 푸코시다제 활성에 대한 pH 효과의 그래프이다.
도 5는 2'푸코실락토스로의 푸코시다제 활성에 대한 온도 효과의 그래프이다.
도 6a는 펩신의 존재 및 부재 하에 검정된 푸코시다제의 그래프이다.
도 6b는 펩신의 존재 및 부재 하에 검정된 푸코시다제의 그래프이다.
도 7은 pH 6.8 및 37℃에서 돼지 위 뮤신(II형)의 가수분해 그래프이다.
도 8은 pH 6.8 및 37℃의 H 항원 삼당류(I형)의 가수분해 그래프이다.
도 9는 A B 및 O 항원의 말단 구조를 도시한다.
도 10은 ABO 혈액형 항원의 구조적 기반을 도시한다.
도 11은 새끼돼지의 소장으로부터의 조직 샘플에서 푸코스의 푸코시다제 유도된 방출을 도시한다.
인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공보는 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시에서, 여러 용어 및 약어가 사용된다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 다음 정의가 적용된다.
요소 또는 성분 앞의 관사는 요소 또는 성분의 경우(즉, 발생)의 수에 관해 비제한적인 것이다. 따라서, 단수형("a" 또는 "an")은 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 파악되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형은 그 수가 명백히 단수임을 의미하지 않는 한 복수형도 포함한다.
용어 "포함하는"이란 청구범위에서 나타내는 언급된 특징, 정수, 단계, 또는 성분의 존재를 의미하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분 또는 이의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는"은 용어 "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"에 의해 포괄되는 구현예를 포함하려는 것이다. 유사하게, 용어 "본질적으로 구성되는"은 용어 "구성되는"에 의해 포괄되는 구현예를 포함하려는 것이다.
존재하는 경우, 모든 범위는 포괄적이며 조합 가능하다. 예를 들어, "1 내지 5"가 언급된 경우, 언급된 범위는 "1 내지 4", "1 내지 3", "1~2", "1~2 및 4~5", "1~3 및 5" 등의 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
수치 값과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, "약"이라는 용어는 이 용어가 달리 구체적으로 문맥에서 정의되어 있지 않으면, 그 수치 값의 +/- 0.5의 범위를 나타낸다. 예를 들어, 어구 "약 6의 pH값"은 pH값이 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 5.5 내지 6.5의 pH값을 나타낸다.
본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 제한은, 마치 모든 하한 수치 제한이 본원에 명백하게 적힌 것처럼, 모든 하한 수치 제한을 포함하려는 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 제한은, 마치 더 큰 모든 수치 제한이 본원에 명백하게 적힌 것처럼, 더 큰 모든 수치 제한을 포함할 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는 마치 더 좁은 모든 수치 범위 전부가 본원에 명백하게 적힌 것처럼 그러한 더 넓은 수치 범위 내에 있는 더 좁은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
용어 "글리코시드 가수분해효소"는 "글리코시다제" 및 "글리코실 가수분해효소"와 상호 교환적으로 사용된다. 글리코시드 가수분해효소는 복합당(다당류)에서 글리코시드계 결합의 가수분해를 보조한다. 글리코실트랜스퍼라제와 함께, 글리코시다제는 글리코시드계 결합의 합성 및 절단을 위한 주요 촉매 기구를 형성한다. 글리코시드 가수분해효소는 O- 또는 S-글리코시드의 가수분해를 촉매하는 효소로서 EC 3.2.1에 분류된다. 글리코시드 가수분해효소는 또한 가수분해 반응의 입체화학적 결과에 따라 분류될 수 있다: 따라서, 이들은 보전 또는 반전 효소로 분류될 수 있다. 글리코시드 가수분해효소는 또한 이들이 각각 올리고당쇄/다당쇄의 (보통 비-환원성) 말단 또는 중간에서 작용하는지에 따라, 엑소 또는 엔도 작용성으로 분류될 수 있다. 글리코시드 가수분해효소는 또한 서열 또는 구조 기반 방법에 의해 분류될 수 있다. 이들은 전형적으로 이들이 작용하는 기질에 따라 명명된다.
용어 "글리코실트랜스퍼라제"는 단당류 간 글리코시드계 결합의 형성을 촉매하는 효소를 나타낸다.
용어 "알파-L-푸코시다제", "알파-L-푸코시드 푸코가수분해효소", 및 "알파-푸코시다제"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 알파-L-푸코시드로부터 L-푸코스를 제거하는 EC 클래스 번호 3.2.1.51 내의 효소를 나타낸다. 알파-L-푸코시다제는 다양한 유기체 및 포유류에서 확인되는 엑소글리코시다제이다. 알파-L-푸코시다제는 2개의 구별되는 글리코시드 가수분해효소 패밀리로 구분되었다: 보전 기전을 이용해서 가수분해를 촉매하는 알파-L-푸코시다제는 널리 공지된 글리코시드 가수분해효소 패밀리 29(GH29)에 속한다. 반전 기전을 이용해서 가수분해를 촉매하는 알파-L-푸코시다제는 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95)에 속한다.
용어 "알파-1,2-L-푸코시다제", "아몬드 에멀신 푸코시다제 II", 알파-2-L-푸코피라노실-베타-D-갈락토시드 푸코가수분해효소" 및 "알파-(1→2)-L-푸코시다제"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 1,2-알파 결합에 의해 D-갈락토스 잔기에 결합된 비-환원성 말단 L-푸코스 잔기의 가수분해를 촉매하는 EC 클래스 번호 3.2.1.63 내의 효소를 나타낸다. 용어 "알파-1,3-L-푸코시다제", "아몬드 에멀신푸코시다제 I", 및 "알파-3-L-푸코스-N-아세틸글루코스아미닐-당단백질 푸코가수분해효소"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 알파-L-푸코스 및 N-아세틸글루코사민 잔기 간 (1→3)-결합을 가수분해하는 EC 클래스 번호 3.2.1.111 내의 효소를 나타낸다.
용어 "알파-1,6-L-푸코시다제", "알파-L-푸코시다제", 및 "1,6-L-푸코스-N-아세틸-D-글루코스아미닐글리코펩타이드 푸코가수분해효소"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되어 알파-L-푸코스 및 N-아세틸-D-글루코사민 잔기 간 (1→6)-결합을 가수분해하는 EC 클래스 번호 3.2.1.127 내의 효소를 나타낸다.
용어 "탈푸코실레이트" 및 "탈푸코실화"는 상호 교환적으로 사용되며 글리칸-함유 구조로부터 푸코실기를 제거할 수 있는 효소를 나타낸다.
용어 "글리칸" 및 "다당류"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 글리칸은 다당류 또는 올리고당류, 또는 탄수화물이 단지 올리고당류인 경우에도, 당콘주게이트의 탄수화물 섹션, 예컨대 당단백질, 당지질, 또는 프로테오글리칸을 나타낸다. 글리칸은 단당류 잔기의 동종- 또는 이종-중합체일 수 있다. 이들은 선형 또는 분기형 분자일 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착되어 확인될 수 있다. 일반적으로, 이들은 세포의 외부 표면 상에서 확인된다. O- 및 N-결합 글리칸은 진핵생물에서 매우 일반적이지만, 덜 일반적이기는 해도, 원핵생물에서도 확인될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "글리칸-함유 구조"는 글리칸이 임의의 방식으로 부착될 수 있는 임의의 구조, 예컨대 단백질, 지질 등을 나타낸다.
용어 "N-아세틸-갈락토실아민-함유 모이어티"는 N-아세틸-갈락토실아민이 부착되는 구조이다. 이러한 구조에는 비제한적으로 탄수화물 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "FUT 1"은 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 1을 나타낸다. 푸코실트랜스퍼라제는 GDP-푸코스 공여체 기질로부터 수신체 기질로 L-푸코스 당을 전달하는 효소이다. 수신체 기질은 N-결합 글리코실화의 경우에서와 같이 코어 GlcNAc 당으로, 또는 O-푸코실트랜스퍼라제에 의한 O-결합 글리코실화의 경우에서와 같이 단백질로 푸코스 전달과 같은 또 다른 당일 수 있다. 이 그룹의 일부 단백질은 적혈구 세포막의 외부 상의 표면 마커인 혈액형 항원의 분자적 기반에 관여한다.
본원에서 사용되는 용어 "동물"에는 모든 비-반추(인간 포함) 및 반추 동물이 포함된다. 특정한 구현예에서, 동물은 비-반추 동물, 예컨대 말 및 단일-위 동물이다. 단일-위 동물의 예에는 비제한적으로 돼지 및 멧돼지, 예컨대 새끼돼지, 사육 돼지, 암퇘지; 가금, 예컨대 칠면조, 오리, 닭, 구이용 닭, 산란계; 어류, 예컨대 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어; 및 갑각류, 예컨대 새우 및 대하가 포함된다. 추가 구현예에서, 동물은 비제한적으로 소, 어린 송아지, 염소, 양, 기린, 유럽들소, 무스, 엘크, 야크, 물소, 사슴, 낙타, 알파카, 라마, 영양, 가지뿔영양 및 닐가이를 포함하는 반추 동물이다.
본원에서 사용되는 용어 "병원체"는 질환의 임의의 원인 제제를 의미한다. 이러한 원인 제제에는 비제한적으로 박테리아, 바이러스, 진균 원인 제제 등이 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "병원체 결합 부위"는 효소가 스스로 화합물에 부착하고 이와 반응할 수 있는 영역 또는 부위를 의미한다. 본 개시에서, 바람직한 병원체 결합 부위는 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 것이다.
용어 "F18+ E. 콜라이"는 F18 가는 털을 발현할 수 있는 임의의 E. 콜라이를 의미한다.
본원에서 사용되는 "바실러스" 속에는 비제한적으로 B. 서브틸리스(B. subtilis), B. 리케니포르미스(B. licheniformis), B. 렌투스(B. lentus), B. 브레비스(B. brevis), B. 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus), B. 알칼로필러스(B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens), B. 클라우시이(B. clausii), B. 할로두란스(B. halodurans), B. 메가테리움(B. megaterium), B. 코아굴란스(B. coagulans), B. 써쿨란스(B. circulans), B. 깁소니이(B. gibsonii), 및 B. 투링기엔시스(B. thuringiensis)를 포함하는 당업자에게 공지된 바와 같은 "바실러스" 속 내의 모든 종이 포함된다. 바실러스 속은 계속 분류학적 재구성을 거치고 있음이 인식된다. 따라서, 이 속에는 비제한적으로 현재 "지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)"로 명명된 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 또는 현재 "패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)"인 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa)와 같은 유기체를 포함하는, 재분류된 종이 포함되는 것이다. 스트레스를 주는 환경 조건 하에 내성 내생포자의 생산은 바실러스 속을 정의하는 특징으로 간주되지만, 이 특징은 최근에 명명된 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 암피바실러스(Amphibacillus), 아뉴리니바실러스(Aneurinibacillus), 아녹시바실러스(Anoxybacillus), 브레비바실러스(Brevibacillus), 필로바실러스(Filobacillus), 그라실리바실러스(Gracilibacillus), 할로바실러스(Halobacillus), 패니바실러스(Paenibacillus), 살리바실러스(Salibacillus), 써모바실러스(Thermobacillus), 우레이바실러스(Ureibacillus), 및 비르기바실러스(Virgibacillus)에도 적용된다,
"사료" 및 "식품"은 각각 비-인간 동물 및 인간 각각에 의해 식사되고, 섭취되고, 소화되기 위한 또는 이에 적합한 임의의 적합한 천연 또는 인공 식이, 음식 등이나 이러한 음식의 성분을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "식품"은 광의의 개념으로 사용되며 - 인간을 위한 식품 및 식제품뿐만 아니라 비-인간 동물을 위한 식품(즉, 사료)을 포괄한다.
용어 "사료"는 가축의 양육에서 동물에게 섭취시키는 제품에 대해 사용된다. 용어 "사료" 및 "동물 사료"는 상호 교환적으로 사용된다. 바람직한 구현예에서, 식품 또는 사료는 비-반추동물 및 반추동물에 의한 소비를 위한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "직접 섭취시킨 미생물"("DFM")은 살아있는(생활성) 자연 발생 미생물의 원천이다. DFM의 범주에는 바실러스, 락트산 박테리아 및 효모가 포함된다. 바실러스는 포자를 형성하는 독특한, 그람-양성 막대균이다. 이들 포자는 매우 안정하며, 열, 수분 및 다양한 pH와 같은 환경 조건을 견딜 수 있다. 이들 포자는 동물에 의해 소화되면 활성 영양 세포로 발아하며, 음식 및 펠렛화된 식이에서 이용될 수 있다. 락트산 박테리아는 병원체에 길항성인 락트산을 생산하는 그람-양성 구균이다. 락트산 박테리아는 다소 열-민감성으로 나타나므로, 이들은 펠렛화된 식이에서 이용되지 않는다. 락트산 박테리아의 유형에는 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus)가 포함된다. 효모는 박테리아가 아니다. 이들 미생물은 식물 그룹 진균에 속한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로테아제"는 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 효소를 나타낸다. 용어 "프로테아제", "펩티다제" 및 "프로티나제"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 프로테아제는 동물, 식물, 박테리아, 원시세균 및 바이러스에서 확인될 수 있다. 단백분해는 현재 6개의 넓은 그룹: 아스파르트산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 및 메탈로프로테아제로 분류된 효소에 의해 달성될 수 있다.
용어 "단리된"은 자연에서 발생하지 않는 형태 또는 환경 중의 물질을 의미한다. 단리된 물질의 비제한적 예에는 (1) 임의의 비-자연 발생 물질, (2) 자연에서 연관되는 하나 이상의 또는 전체의 자연 발생 구성분으로부터 적어도 부분적으로 제거되는, 비제한적으로 임의의 숙주 세포, 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 보조인자를 포함하는 임의의 물질; (3) 자연에서 확인되는 물질에 비해 인간의 힘으로 변경된 임의의 물질; 또는 (4) 자연적으로 연관되는 다른 성분에 비해 물질의 양을 증가시킴으로써 변경된 임의의 물질이 포함된다. 용어 "단리된 핵산 분자", "단리된 폴리뉴클레오타이드", 및 "단리된 핵산 단편"은 상호 교환적으로 사용될 것이며, 선택적으로 합성, 비-천연 또는 변형된 뉴클레오타이드 염기를 함유하는, 단일쇄 또는 이중쇄인 RNA 또는 DNA의 중합체를 나타낸다. DNA의 중합체 형태인 단리된 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편으로 이루어질 수 있다.
핵산 또는 폴리펩타이드에 적용되는 용어 "정제된"은 일반적으로 당분야에 널리 공지된 분석 기법에 의해 결정된 바와 같은 다른 성분이 본질적으로 없는 핵산 또는 폴리펩타이드를 표시한다(예컨대, 정제된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 전기영동 겔, 크로마토그래픽 용출액, 및/또는 밀도 구배 원심분리를 거친 매질 중에 별도 밴드를 형성함). 예를 들어, 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성하는 핵산 또는 폴리펩타이드는 "정제된" 것이다. 정제된 핵산 또는 폴리펩타이드는 적어도 약 50% 순수하고, 보통 적어도 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8% 이상 순수하다(예컨대, 몰 농도 기준 중량 백분율). 관련된 개념에서, 조성물은 정제 또는 농축 기법의 적용 후 분자 농도의 실질적 증가가 존재하는 경우, 분자에 대해 농축된 것이다. 용어 "농축된"은 시작 조성물보다 높은 상대 또는 절대 농도로 조성물에 존재하는 화합물, 폴리펩타이드, 세포, 핵산, 아미노산, 또는 다른 명시된 물질 또는 성분을 나타낸다.
용어 "펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 중합체를 나타낸다. "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산 잔기의 중합체 서열을 포함한다. IUPAC-IUB 생화학 명명 연합 위원회(Joint Commission on Biochemical Nomenclature, JCBN)와 부합하여 정의되는 아미노산에 대한 1- 및 3-글자 코드가 본 개시를 통해 사용된다. 1글자 X는 20개 아미노산 중 임의의 하나를 나타낸다. 또한 폴리펩타이드가 유전 코드의 축퇴로 인해 하나를 초과하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코드화될 수 있는 것으로 이해된다. 돌연변이는 모체 아미노산에 대한 1글자 코드에 이어 위치 번호, 그리고 변이체 아미노산에 대한 1글자 코드에 의해 명명될 수 있다. 예를 들어, 글리신(G)의 위치 87에서의 세린(S)으로의 돌연변이화는 "G087S" 또는 "G87S"로 나타난다. 변경의 기재 시, 위치에 이어 괄호 내에 기재된 아미노산은 임의의 기재된 아미노산에 의한 대응 위치에서의 치환 목록을 나타낸다. 예를 들어, 6(L,I)는 위치 6이 류신 또는 이소류신으로 치환될 수 있음을 의미한다. 때때로, 서열에서, 슬래시(/)가 치환을 정의하기 위해 사용되어, 예컨대 F/V는 특정 위치가 그 위치에서 페닐알라닌 또는 발린을 가질 수 있음을 나타낸다.
돌연변이는 모체 아미노산에 대한 1글자 코드에 이어 위치 번호, 이어서 변이체 아미노산에 대한 1글자 코드에 의해 명명될 수 있다. 예를 들어, 글리신(G)의 위치 87에서의 세린(S)으로의 돌연변이화는 "G087S" 또는 "G87S"로 나타난다.
단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드의 용어 "성숙" 형태는 신호 펩타이드 서열 및 프로펩타이드 서열이 없는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 효소의 기능적 형태를 나타낸다.
단백질 또는 펩타이드의 용어 "전구체" 형태는 단백질의 아미노 또는 카보닐 말단에 작동 가능하게 연결된 프로서열을 갖는 단백질의 성숙 형태를 나타낸다. 전구체는 프로서열의 아미노 말단에 작동 가능하게 연결된 "신호" 서열을 또한 가질 수 있다. 전구체는 또한 번역-후 활성에 관여되는 추가적인 폴리펩타이드를 가질 수 있다(예컨대, 폴리펩타이드가 이로부터 절단되어 단백질 또는 펩타이드의 성숙 형태를 남김).
"프로서열" 또는 "프로펩타이드 서열"은 효소의 적절한 폴딩 및 분비를 위해 필요한 신호 펩타이드 서열 및 성숙 효소 서열(예컨대, 푸코시다제) 간 아미노산 서열을 나타낸다; 이들은 때때로 분자 내 샤페론으로 나타낸다. 프로서열 또는 프로펩타이드 서열의 절단은 종종 프로-효소로 발현되는 성숙 활성 효소를 생성한다.
용어 "신호 서열" 및 "신호 펩타이드"는 단백질의 성숙 또는 전구체 형태의 분비에 참여하거나 수송을 지시할 수 있는 아미노산 잔기 서열을 나타낸다. 신호 서열은 전구체 또는 성숙 단백질 서열에 대해 전형적으로 N-말단에 위치한다. 신호 서열은 내인성 또는 외인성일 수 있다. 신호 서열은 보통 성숙 단백질에 부재한다. 신호 서열은 전형적으로 단백질이 수송된 후 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다. 관심 유전자는 신호 서열을 포함하고 또는 포함하지 않고 발현될 수 있다.
아미노산 서열 또는 핵산 서열에 대한 용어 "야생형"은 아미노산 서열 또는 핵산 서열이 고유 또는 자연-발생 서열임을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "자연-발생"은 자연에서 확인되는 임의의 것(예컨대, 단백질, 아미노산, 또는 핵산 서열)을 나타낸다. 반대로, 용어 "비-자연 발생"은 자연에서 확인되지 않는 임의의 것을 나타낸다(예컨대, 실험실에서 생산된 재조합 핵산 및 단백질 서열 또는 야생형 서열의 변경).
아미노산 잔기 위치에 관해 본원에서 사용되는 "에 대응하는" 또는 "에 대응한다" 또는 "대응한다"는 단백질 또는 펩타이드 내 열거된 위치에서의 아미노산 잔기, 또는 단백질 또는 펩타이드 내 열거된 잔기와 유사하거나, 상동성이거나, 동등한 아미노산 잔기를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "대응 영역"은 일반적으로 관련된 단백질 또는 참조 단백질 내의 유사한 위치를 나타낸다.
용어 "에서 유래된" 및 "에서 수득된"은 해당 유기체 균주에 의해 생산되거나 생산 가능한 단백질뿐만 아니라 이러한 균주에서 단리된 DNA 서열에 의해 인코딩되고 이러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체에서 생산되는 단백질을 나타낸다. 추가적으로, 이 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 인코딩되며 해당 단백질을 확인시키는 특징을 갖는 단백질을 나타낸다.
용어 "아미노산"은 단백질 또는 폴리펩타이드의 기본적 화학 구조 단위를 나타낸다. 따라서, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 또 다른 소수성이 더 적은 잔기(예컨대 글리신) 또는 소수성이 더 큰 잔기(예컨대 발린, 류신, 또는 이소류신)를 인코딩하는 코돈에 의해 치환될 수 있다. 유사하게, 하나의 음으로 하전된 잔기의 또 다른 잔기(예컨대 글루탐산에 대해 아스파르트산) 또는 하나의 양으로 하전된 잔기의 또 다른 잔기(예컨대 아르기닌에 대해 라이신)의 치환을 생성하는 변화도 기능적으로 동등한 산물을 생산할 것으로 예상될 수 있다. 여러 경우에서, 단백질 분자의 N-말단 및 C-말단 부분을 변형하는 뉴클레오타이드 변화도 단백질의 활성을 변형할 것으로 예상되지 않을 것이다. 각각의 제안된 변경은 인코딩된 산물의 생물학적 활성의 보유의 결정에서와 같이, 당분야의 일상 기술수준 내에 확실히 속한다.
다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 유전자 또는 코딩 영역을 나타내는 경우와 같은 용어 "코돈 최적화된"은 DNA를 코드화하는 폴리펩타이드의 변형 없이 숙주 유기체의 전형적인 코돈 이용을 반영하기 위한 핵산 분자의 유전자 또는 코딩 영역의 코돈 변형을 나타낸다.
용어 "유전자"는 코딩 서열에 선행하는(5' 비-코딩 서열) 및 후행하는(3' 비-코딩 서열) 조절 서열을 포함하는 특정 단백질을 발현하는 핵산 분자를 나타낸다. "고유 유전자"는 자신의 조절 서열과 함께 자연에서 발견되는 유전자를 나타낸다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 확인되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는, 고유 유전자가 아닌 임의의 유전자를 나타낸다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 원천에서 유래되는 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 원천에서 유래되지만, 자연에서 확인되는 것과 상이한 방식으로 배열되는 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내 그 자연적 위치에서의 고유 유전자를 나타낸다. "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 보통 확인되지 않지만, 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입되는 유전자를 나타낸다. 외래 유전자는 비-고유 유기체 내로 삽입된 고유 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스유전자"는 형질전환 절차에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.
용어 "코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 배치되고, 결합된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 조절 서열에는 프로모터, 번역 리더 서열, RNA 가공 부위, 효과인자 결합 부위, 및 스템-루프 구조가 포함될 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 기능에 의해 영향받도록 하는 단일 핵산 분자 상 핵산 서열의 결합을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 해당 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우, 즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 제어 하에 있는 경우 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
용어 "조절 서열" 또는 "제어 서열"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 유기체 내의 특정 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열 절편을 나타낸다. 조절 서열의 예에는 비제한적으로 프로모터, 신호 서열, 오퍼레이터 등이 포함된다. 위에서 주지된 바와 같이, 조절 서열은 관심 코딩 서열/유전자에 대해 센스 또는 안티센스 배향으로 작동 가능하게 연결될 수 있다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 RNA 폴리머라제에 의한 유전자의 전사가 시작되는 곳을 정의하는 DNA 서열을 나타낸다. 프로모터 서열은 전형적으로 전사 개시 부위의 바로 상류 또는 5' 말단에 배치된다. 프로모터는 이의 전체가 고유 또는 자연 발생 서열에서 유래될 수도 있고, 또는 자연에서 확인되는 상이한 프로모터에서 유래되는 상이한 요소로 이루어질 수도 있고, 또는 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수도 있다. 당업자에게는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리적 조건에 반응하여("유도성 프로모터") 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 이해된다.
"3' 비-코딩 서열"은 코딩 서열의 하류에 배치된 DNA 서열을 나타내며, mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호, 예컨대 전사 종결을 인코딩하는 서열이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환"은 숙주 유기체 내로의 핵산 분자의 전달 또는 도입을 나타낸다. 핵산 분자는 선형 또는 원형 형태의 DNA로 도입될 수 있다. 핵산 분자는 자동 복제하는 플라스미드일 수도 있고, 또는 생산 숙주의 게놈 내로 통합될 수도 있다. 형질전환된 핵산을 함유하는 생산 숙주는 "형질전환된" 또는 "재조합" 또는 "트랜스제닉" 유기체 또는 "형질전환체"로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합"은, 예컨대 화학적 합성에 의한 또는 유전 조작 기법에 의한 핵산의 단리된 절편의 조작에 의한, 다른 경우 2개로 분리된 핵산 서열 절편의 인공 조합을 나타낸다. 예를 들어, 자연적으로 또는 실험적 조작에 의해, 상이한 분자로부터, 동일한 분자의 또 다른 부분, 또는 인공 서열로부터, 하나 이상의 절편 또는 유전자가 삽입된 DNA는 유전자에서 그리고 후속적으로 유기체에서 새로운 서열의 도입을 일으킨다. 용어 "재조합", "트랜스제닉", "형질전환된", "조작된" 또는 "외인성 유전자 발현을 위해 변경된"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "재조합 구축물", "발현 구축물", "재조합 발현 구축물" 및 "발현 카세트"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 재조합 구축물은 핵산 단편, 예컨대 자연에서 모두 함께 확인되지 않는 조절 및 코딩 서열의 인공 조합을 포함한다. 예를 들어, 구축물은 상이한 원천에서 유래되는 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 원천에서 유래되지만, 자연에서 확인되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구축물은 그대로 이용될 수도 있고, 또는 벡터와 함께 이용될 수도 있다. 벡터가 이용되는 경우, 벡터의 선택은 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 숙주 세포를 형질전환하기 위해 이용될 방법에 의존한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 이용될 수 있다. 당업자는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환하고, 선택하고, 증식시키기 위해 벡터 상에 존재해야 하는 유전 요소를 잘 인식한다. 당업자는 또한 상이한 독립적 형질전환 사건이 상이한 발현 수준 및 패턴으로 일어날 수 있고(Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78-86), 이에 따라 요망되는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 세포주를 수득하기 위해 여러 사건이 전형적으로 스크리닝됨을 또한 인식할 것이다. 이러한 스크리닝은 DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, PCR, 실시간 정량적 PCR(qPCR), 역전사 PCR(RT-PCR), 단백질 발현의 면역블로팅 분석, 효소 또는 활성 검정, 및/또는 표현형 분석을 포함하는 표준 분자 생물학, 생화학, 및 기타 검정으로 달성될 수 있다.
용어 "생산 숙주", "숙주" 및 "숙주 세포"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 인간이건 비인간이건, 재조합 구축물이 유전자를 발현하기 위해 안정적으로 또는 일시적으로 도입될 수 있는 임의의 유기체, 또는 이의 세포를 나타낸다. 이 용어는 증식 동안 일어나는 돌연변이로 인해 모체 세포와 동일하지 않은, 모체 세포의 임의의 자손을 포괄한다.
용어 "동일성 백분율"은 서열을 비교함으로써 결정되는, 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 상관관계이다. 당분야에서, "동일성"은 또한 이러한 서열 스트링 간 매칭하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수에 의해 결정되는, 가능할 수 있는 바에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 간 서열 상관성 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 비제한적으로 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) HumanaPress, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991)]에 기재된 것을 포함하는, 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 코드화되어 있다.
본원에서 사용되는 "동일성%" 또는 동일성 백분율" 또는 "PID"는 단백질 서열 동일성을 나타낸다. 동일성 백분율은 당분야에 공지된 표준 기법을 이용해서 결정될 수 있다. 유용한 알고리즘에는 BLAST 알고리즘(See, Altschul et al., J Mol Biol, 215:403-410, 1990; 및 Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993)이 포함된다. BLAST 프로그램은 몇몇 검색 파라미터를 이용하며, 그 중 대부분은 기본 값으로 설정되어 있다. NCBI BLAST 알고리즘은 생물학적 유사성의 관점에서 가장 관련된 서열을 찾지만, 20개 미만 잔기의 쿼리 서열에 대해서는 권장되지 않는다(Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402, 1997; 및 Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2994-3005, 2001). 핵산 서열 검색을 위한 예시적인 기본 BLAST 파라미터에는 다음이 포함된다: 이웃 단어 역치 = 11; E-값 컷오프 = 10; 스코어링 매트릭스 = NUC.3.1(매치 = 1, 미스매치 = 3); 갭 개방 = 5; 및 갭 연장 = 2. 아미노산 서열 검색을 위한 예시적인 기본 BLAST 파라미터에는 다음이 포함된다: 단어 크기 = 3; E-값 컷오프 = 10; 스코어링 매트릭스 = BLOSUM62; 갭 개방 = 11; 및 갭 연장 = 1. 아미노산 서열 동일성 백분율(%)값은 최적/최대 정렬을 위해 프로그램에 의해 생성된 임의의 갭을 포함하는 "참조" 서열의 총 잔기수로 나눈 매칭하는 동일한 잔기의 수에 의해 결정된다. BLAST 알고리즘은 "참조" 서열을 "쿼리" 서열로 나타낸다. 본원에서 사용되는 "상동성 단백질" 또는 "상동성 효소"는 일차, 이차, 및/또는 삼차 구조에서 구별되는 유사성을 갖는 단백질을 나타낸다. 단백질 상동성은 단백질이 정렬되는 경우 선형 아미노산 서열에서의 유사성을 나타낼 수 있다. 단백질 서열의 상동성 검색은 0.001에서의 역치(E-값 컷오프)로 NCBI BLAST로부터 BLASTP 및 PSI-BLAST를 이용하여 수행될 수 있다(Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1997 Set 1;25(17):3389-402). 이 정보를 이용하여, 단백질 서열이 그룹화될 수 있다. 아미노산 서열을 이용해서 계통학적 트리가 구축될 수 있다.
서열 정렬 및 동일성 백분율 계산은 LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc., Madison, WI)의 Megalign 프로그램, 벡터 NTI v. 7.0(Informax, Inc., Bethesda, MD)의 AlignX 프로그램, 또는 EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276-277(2000))를 이용해서 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 기본 파라미터로 Clustal 정렬 방법(예컨대 CLUSTALW; 예를 들어 version 1.83)을 이용하여 수행될 수 있다(Higgins and Sharp, CABIOS , 5:151-153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994); 및 Chenna et al., Nucleic Acids Res 31(13):3497-500 (2003)), European Bioinformatics Institute를 통해 European Molecular Biology Laboratory로부터 이용 가능함). CLUSTALW 단백질 정렬을 위해 적합한 파라미터에는 갭 존재 페널티 = 15, 갭 연장 = 0.2, 매트릭스 = Gonnet(예컨대, Gonnet250), 단백질 ENDGAP = -1, 단백질 GAPDIST = 4, 및 KTUPLE = 1이 포함된다. 하나의 구현예에서, 고속 또는 저속 정렬이 이용되며, 저속 정렬이 기본 설정이다. 대안적으로, CLUSTALW 방법(예컨대, version 1.83)을 이용하는 파라미터는 또한 KTUPLE = 1, 갭 페널티 = 10, 갭 연장 = 1, 매트릭스 = BLOSUM(예컨대, BLOSUM64), WINDOW = 5, 및 TOP DIAGONALS SAVED = 5를 이용하도록 변경될 수 있다.
다양한 폴리펩타이드 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오타이드 서열이 소정 양태의 특징으로 본원에 개시된다. 본원에 개시된 서열과 적어도 약 70~85%, 85~90%, 또는 90%~95% 동일한 이들 서열의 변이체가 소정 구현예에서 이용될 수 있다. 대안적으로, 소정 구현예에서 변이체 폴리펩타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 본원에 개시된 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다. 변이체 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 개시된 서열과 동일한 기능, 또는 개시된 서열의 기능의 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 갖는다.
폴리펩타이드에 대한 용어 "변이체"는 아미노산의 하나 이상의 자연-발생 또는 인간-제조 치환, 삽입, 또는 결실을 포함한다는 점에서 명시된 야생형, 모체, 또는 참조 폴리펩타이드와 상이한 폴리펩타이드를 나타낸다. 유사하게, 폴리뉴클레오타이드에 대한 용어 "변이체"는 명시된 야생형, 모체, 또는 참조 폴리뉴클레오타이드와 뉴클레오타이드 서열이 상이한 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 야생형, 모체, 또는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 동일성은 맥락으로부터 자명할 것이다.
용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 종종 세포의 중심 대사의 일부가 아니며, 보통 이중쇄 DNA 형태인 유전자를 수반하는 염색체외 요소를 나타낸다. 이러한 요소는 임의의 원천에서 유래되는, 단일쇄 또는 이중쇄 DNA 또는 RNA의, 선형 또는 원형 형태인 자동 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지, 또는 뉴클레오타이드 서열일 수 있고, 여러 뉴클레오타이드 서열은 세포 내로 관심 폴리뉴클레오타이드를 도입할 수 있는 고유한 구축물 내로 연결되거나 재조합되었다. "형질전환 카세트"는 유전자를 함유하며 유전자에 부가하여 특정한 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 요소를 갖는 특정 벡터를 나타낸다. 용어 "발현 카세트" 및 "발현 벡터는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 유전자를 함유하고 유전자에 부가하여 숙주에서 해당 유전자의 발현을 허용하는 요소를 가지는 특정 벡터를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 전구체 또는 성숙 형태인 기능적 최종-산물(예컨대 mRNA 또는 단백질)의 생산을 나타낸다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩타이드로의 번역을 나타낼 수 있다.
유전자의 발현에는 유전자의 전사 및 mRNA의 전구체 또는 성숙 단백질로의 번역이 관여된다. "안티센스 저해"는 표적 단백질의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 RNA 전사체의 생산을 나타낸다. "공동-억제"는 동일하거나 실질적으로 유사한 외래 또는 내인성 유전자의 발현을 억제할 수 있는 센스 RNA 전사체의 생산을 나타낸다(U.S. 특허 번호 5,231,020). "성숙" 단백질은 번역-후 가공된 폴리펩타이드; 즉 일차 번역 산물에 존재하는 임의의 프리- 또는 프로펩타이드가 제거된 것을 나타낸다. "전구체" 단백질은 mRNA의 일차 번역 산물; 즉, 프리- 및 프로펩타이드가 여전히 존재하는 것을 나타낸다. 프리- 및 프로펩타이드는 비제한적으로 세포내 편재 신호일 수 있다. "안정한 형질전환"은 유전적으로 안정한 유전을 일으키는, 핵 및 소기관 게놈을 모두 포함하는, 숙주 유기체 게놈 내로의 핵산 단편의 전달을 나타낸다. 대조적으로, "일시적 형질전환"은 통합 또는 안정한 유전 없이 유전자 발현을 일으키는 숙주 유기체의 핵, 또는 DNA-함유 소기관 내로의 핵산 단편의 전달을 나타낸다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 유기체로 나타낸다.
발현 벡터는 당분야에 공지된 적합한 생산 숙주의 형질전환에 유용한 임의의 수의 벡터 또는 카세트 중 하나일 수 있다. 전형적으로, 벡터 또는 카세트에는 관련 유전자의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선별 마커, 및 자동 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열이 포함될 것이다. 적합한 벡터에는 일반적으로 전사 개시 제어를 보유하는 유전자의 5' 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3' 영역이 포함된다. 두 제어 영역은 모두 형질전환된 생산 숙주 세포의 유전자에 대한 상동성 유전자 및/또는 생산 숙주에 고유한 유전자로부터 유래될 수 있지만, 이러한 제어 영역이 이렇게 유래되어야 하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 "상동성 단백질" 또는 "상동성 효소"는 일차, 이차, 및/또는 삼차 구조에서 구별되는 유사성을 갖는 단백질을 나타낸다. 단백질 상동성은 단백질이 정렬되는 경우, 선형 아미노산 서열에서의 유사성을 나타낼 수 있다. 단백질 서열의 상동성 검색은 0.001에서의 역치(E-값 컷오프)로 NCBI BLAST로부터 BLASTP 및 PSI-BLAST를 이용하여 수행될 수 있다(Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1997 Set 1; 25(17):3389-402). 이 정보를 이용하여, 단백질 서열이 그룹화될 수 있다. 아미노산 서열을 이용하여 계통학적 트리가 구축될 수 있다. 아미노산 서열은 프로그램, 예컨대 Vector NTI Advance suite에 입력될 수 있고 GuideTree가 이웃 연결(Neighbor Joining, NJ) 방법(Saitou and Nei, Mol Biol Evol, 4:406-425, 1987)을 이용하여 생성될 수 있다. 트리 구축은 서열 거리에 대한 Kimura 교정을 이용하고 갭을 포함하는 위치를 무시하여 계산될 수 있다. 프로그램, 예컨대 AlignX는 계통학적 트리 상에 디스플레이된 분자명 뒤 괄호에 계산된 거리값을 디스플레이할 수 있다.
분자 간 상동성의 이해는 분자의 진화 역사뿐만 아니라 이의 기능에 대한 정보를 드러낼 수 있다; 새로 시퀀싱된 서열이 이미 특성규명된 단백질과 상동성인 경우, 새로운 단백질의 생화학적 기능을 강력히 시사한다. 두 대상체 간의 가장 기본적인 상관관계는 상동성이다; 2개 분자는 이들이 공통 선조로부터 유래된 경우 상동성인 것으로 언급된다. 상동성 분자, 또는 상동체는 파라로그(paralog) 및 오르소로그(ortholog)의 2개 클래스로 구분될 수 있다. 파라로그는 하나의 종 내에 존재하는 상동체이다. 파라로그는 종종 이의 상세한 생화학적 기능이 상이하다. 오르소로그는 상이한 종 내에 존재하는 상동체이며, 매우 유사하거나 동일한 기능을 갖는다. 단백질 슈퍼패밀리는 공통 가계가 추정될 수 있는 단백질의 최대 그룹화(분기)이다. 보통 이 공통 가계는 서열 정렬 및 기계적 유사성에 기반한다. 슈퍼패밀리는 전형적으로 패밀리 내에 서열 유사성을 나타내는 몇몇 단백질 패밀리를 함유한다. 용어 "단백질 일족"은 보통 MEROPS 프로테아제 분류 시스템에 기반한 프로테아제 슈퍼패밀리에 대해 이용된다.
CLUSTAL W 알고리즘은 서열 정렬 알고리즘의 또 다른 예이다(Thompson et al., Nucleic Acids Res, 22:4673-4680, 1994 참고). CLUSTAL W 알고리즘에 대한 기본 파라미터에는 다음이 포함된다: 갭 개방 페널티 = 10.0; 갭 연장 페널티 = 0.05; 단백질 가중치 매트릭스 = BLOSUM 시리즈; DNA 가중치 매트릭스 = IUB; Delay 확산 서열% = 40; 갭 분리 거리 = 8; DNA 변화 가중치 = 0.50; 친수성 잔기 목록 = GPSNDQEKR; 음성 매트릭스 이용 = OFF; Toggle 잔기 특정 페널티 = ON; Toggle 친수성 페널티 = ON; 및 Toggle 말단 갭 분리 페널티 = OFF. CLUSTAL 알고리즘에서는, 어느 한 말단에 생기는 결실이 포함된다. 예를 들어, 500개 아미노산 폴리펩타이드의 어느 한 말단(또는 폴리펩타이드 내)에서 5개 아미노산 결실을 갖는 변이체는 "참조" 폴리펩타이드에 비해 99%(495개/500개의 동일한 잔기 × 100)의 서열 동일성 백분율을 가질 것이다. 이러한 변이체는 폴리펩타이드와 "적어도 99% 서열 동일성"을 갖는 변이체에 포괄될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "기능적 검정"은 단백질의 활성 표시를 제공하는 검정을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이 용어는 단백질이 그 일반능으로 기능하는 그 능력에 대해 분석되는 검정 시스템을 나타낸다. 예를 들어, 알파-L-푸코시다제의 경우, 기능적 검정에는 알파-L-푸코시드 기질을 가수분해하는 알파-L-푸코시다제의 효율성 결정이 관여될 수 있다.
L-푸코스-함유 당콘주게이트는 수많은 생리적 및 병리적 활성, 예컨대 염증, 박테리아 및 바이러스 감염 등을 위해 중요하다.
푸코실화 글리칸은 위장관 내에서 일반적이며 세포 표면 및 뮤신 상에서 확인된다. 뮤신은 막-결합 및 분비 형태 모두에서 확인되는 고분자량의 무거운 글리코실화 단백질이다.
F18에 대한 장 수용체의 존재 또는 부재는 유전적으로 제어된다. 부종 질환에서 F18 보유 E. 콜라이에 의한 집락에 대한 감수성은 우성 대립유전자 및 열성 대립유전자에 의한 내성에 의해 제어되는 것으로 실증되었다(Vogeli et al. (1996) Anim Genet. 27(5): 321-8).
E. 콜라이 F18 수용체의 발현을 제어하는 유전자는 알파 (1,2 L-푸코실트랜스퍼라제 1 유전자(FUT1)에 연관되는 것으로 나타났다. FUT1 유전자는 접착이 일어나는 글리칸 말단을 변경하는 갈락토시드 2-알파-L-푸코실트랜스퍼라제를 인코딩한다.
ETEC 내성 동물은 현저히 더 낮은 수준의 FUT1 효소를 나타내었다(Francis DH (2002) J Swine Health Prod. 10(4):171-5; Meijerink et al. (1997) Mammalian Genome 8:736-41). 푸코실트랜스퍼라제는 내장 상피의 푸코실화에 관여되는 것으로 나타났으며, 또한 푸코실화 수준은 동물의 발생 동안 변한다(Torres-Pinedo and Mahmood (2004) Biochem Biophys Res Commun 125:546-53; Ruggiero-Lopez et al. (1991) Biochem J 279:801-6; Biol et al. (1987) Pediatr Res 22:250-6).
혈액형 항원은 적혈구 세포막 상의 표면 마커이다. 이들은 일반적으로 적혈구 및 위장관, 비뇨기관 및 호흡기관을 둘러싼 것들을 포함하는 소정 상피 세포 상에서 검출되는 지질 및 단백질의 탄수화물 측쇄에 대한 당류의 순차적 부가에 의해 형성되는 분자로 정의된다.
특정 올리고당류 항원은 적혈구 표면 상의 단백질 및 지질에 부착한다. 부착된 가장 기본적인 올리고당류는 O 항원(또한 H 항원으로 불림)으로 불린다. 인간 혈액형은 단당류 간 글리코시드계 결합의 형성을 촉매하는 효소인 글리코실트랜스퍼라제의 기능에 의존한다. 특정 올리고당류 항원은 적혈구 표면 상의 단백질 및 지질에 부착한다.
이 O(또는 H) 항원은 모든 3가지 혈액형 AB, A, 및 B에서 확인되는 기본 올리고당류이다. O 항원은 (-지질-글루코스-갈락토스-N-아세틸글루코사민-갈락토스-푸코스) 형태를 갖는다. 혈액형 O는 적혈구에 부착된 O 항원만을 갖는다.
알파-1-2푸코실트랜스퍼라제는 혈액형 항원의 형성을 위해 필요한 것으로 확인되었다. O 또는 H-항원은 갈락토스에 대해 알파-1,2-결합된 푸코스이다. 혈액형 A-항원에서, GalNAc가 H-항원에서의 갈락토스에 부가된다. H- 및 A-항원은 인간 및 돼지에 존재한다.
혈액형 A 특이성을 결정하는 면역우성 단당류는 말단 알파-1,3-결합 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)인 반면, 혈액형 B 특이성에 대응하는 단당류는 알파-1,3-결합 갈락토스(Gal)이다. O형 세포는 이의 올리고당쇄의 말단에 이들 단당류가 모두 없으며, 대신에 알파-1,2-결합 푸코스(Fuc) 잔기로 종결되고 H 항원으로 명명된다.
도 9는 A B 및 O 항원의 말단 구조를 도시한다. 혈액 항원으로 가장 잘 알려졌으나, 이들 항원은 대부분의 신체 조직 상에서 그리고 상피 및 내피 세포 상에서 발현됨이 주지되어야 한다.
도 10은 ABO 혈액형 항원의 구조적 기반을 도시한다. A 및 B 삼당류 에피토프는 공통 H 이당류 기질 알파-1,3-N-아세틸갈락토시아미닐트랜스퍼라제(GTA) 및 알파-갈락토실트랜스퍼라제(GTB)로부터 형성된다. 반대로, 혈액형 A 및 B 항원의 H로의 효소적 전환을 위해 이용되는 전략에는 O RBC에서 확인되는 공통 H 구조를 형성하기 위해 알파-1,3-GalNAc(알파-N-아세틸갈락토시다제, A-자임 이용) 또는 알파-1,3-갈락토스(알파-갈락토시다제, B-자임 이용)를 특이적으로 가수분해하는 엑소글리코시다제가 관여된다.
아래의 실시예에서 실증되는 바와 같이, 알파-L-푸코시다제는 H1 항원 삼당류로부터 푸코스 잔기를 제거할 수 있지만 A 항원 사당류로부터 푸코스 잔기를 제거하는 데 있어 어려움을 갖는 것으로 나타나며, 이는 아마도 입체 장애에 기인할 수 있다. 그러나, 알파-L-푸코시다제가 알파-N-아세틸갈락토실아민-함유 모이어티를 제거할 수 있는 효소와 조합되는 경우, 알파-L-푸코시다제는 A 항원 글루칸-함유 구조로부터 푸코스를 제거할 수 있는 것으로 여겨진다.
또한 알파-갈락토시다제를 이용하여 혈액형 B 항원을 H 항원으로 전환할 수 있다. 글루칸-함유 구조로부터 알파-N-아세틸갈락토실아민-함유 모이어티를 제거할 수 있는 이러한 효소의 예에는 비제한적으로 New England Biolabs에서 이용 가능한 N-아세틸갈락토스아미니다제(#P0734)가 포함된다.
본 개시는 동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 관한 것이며, 병원성 감염 및/또는 설사는 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하고, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한 동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 조성물이 본 개시의 범위 내이며, 병원성 감염 및/또는 설사는 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하고, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 모든 양태(방법, 조성물 또는 이의 용도)에서, 알파-L-푸코시다제는 단독으로 또는 글리칸-함유 구조로부터 N-아세틸-갈락토실아민-함유 모이어티를 제거할 수 있는 효소와 함께 글리칸-함유 구조로부터 말단 알파-1,2-결합 푸코스기를 제거할 수 있다. 이는 아래의 실시예에서 추가 논의된다.
이론에 의해 구애받지 않고, 말단 알파 1,2 결합-푸코스의 가수분해는, 예컨대 ETEC에 의해 발현되는 F18 가는 털의 경우에서와 같이, 장 세포에 대한 부착을 예방하는 것으로 여겨진다.
푸코실 모이어티가 병원체 결합 부위로부터 제거되건 또는 푸코실 모이어티가 또한 제거되기 위해 병원체 결합 부위의 더 큰 부분이 제거되건, 적어도 하나의 푸코실 모이어티를 제거할 수 있는 임의의 효소, 예컨대 글리코시드 가수분해효소가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 알파-L-푸코시다제 폴리펩타이드가 이용될 수 있다. 본 개시의 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제 폴리펩타이드에는 단리된, 재조합, 실질적으로 순수한, 또는 비-자연 발생 폴리펩타이드가 포함된다.
바람직하게는, 알파-L-푸코시다제 폴리펩타이드는 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95) 또는 글리코시드 가수분해효소 패밀리 29(G29)에서 유래된다. 가장 바람직하게는, 이러한 알파-L-푸코시다제 폴리펩타이드는 GH95 패밀리에 속한다.
알파-L-푸코시다제가 낮은 pH에서 안정하고 또한 펩신에 대해 안정하도록 이를 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 알파-L-푸코시다제가 더 넓은 기질 특이성을 갖도록, 예컨대 기질로서 A(및 심지어 B) 혈액형 항원을 수용할 수 있도록 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 다시 말하면, 조작된 알파-L-푸코시다제가 알파-N-아세틸갈락토스아미니다제를 첨가할 필요 없이 A 사당류로부터 푸코스 잔기를 제거할 수 있도록 기질 특이성을 확장.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 병원성 감염의 예방 및/또는 치료에서 유용하며, 예방적 및/또는 치료적 조성물 내로 포함될 수 있다.
적합한 알파-L-푸코시다제는 다양한 원천에서, 예컨대 아르카노박테리움(Arcanobacterium), 바실러스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 딕티오스텔리움(Dictyostelium), 푸사리움(Fusarium), 아스페르길러스(Aspergillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 이그니스패라(Ignisphaera), 마헬라(Mahella), 셀룰로파가(Cellulophaga), 루비니스패라(Rubinisphaera), 니아스텔라(Niastella), 할리스코메노박터(Haliscomenobacter), 로도피렐룰라(Rhodopirellula), 미코박테리움(Mycobacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 플라보박테리아세애(Flavobacteriaceae), 크테도노박터(Ktedonobacter), 리스테리아(Listeria), 팔루디박터(Paludibacter), 프루누스(Prunus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 루미노코커스(Ruminococcus), 써모토가(Thermotoga), 잔토모나스(Xanthomonas), 및 락토바실러스(Lactobacillus)에서 유래될 수 있다. 알파-L-푸코시다제가 유래될 수 있는 종의 예에는 아르카노박테리움 해모라이티쿰(Arcanobacterium haemolyticum), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 종 TS-2, 바실러스 바타비엔시스(Bacillus bataviensis), 바실러스 니아시니(Bacillus niacini), 바실러스 종 J13, 바실러스 종 J37, 바실러스 레헨시스(Bacillus lehensis), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 셀룰로실라이티쿠스(Bacillus cellulosilyticus), 바실러스 헤미셀룰로실라이티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus), 바실러스 오쿠히덴시스(Bacillus okuhidensis), 바실러스 부타노리보란스(Bacillus butanolivorans), 바실러스 수드알칼리필러스(Bacillus pseudalcaliphilus), 바실러스 보고리엔시스(Bacillus bogoriensis), 바실러스 아키바이(Bacillus akibai), 바실러스 풀미난스(Bacillus fulminans), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 헬코게네스(Bacteroides helcogenes), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis) B6, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 딕티오스텔리움 디스코이듐(Dictyostelium discoideum), 플라보박테리아세애 박테리움(Flavobacteriaceae bacterium) S85, 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 이그니스페애라 아그레간스(Ignispheaera aggregans), 마헬라 오스트랄리엔시스(Mahella australiensis), 셀룰로파가 라이티카(Cellulophaga lytica), 셀룰로파가 알기콜라(Cellulophaga algicola), 루비니스패라 브라신리엔시스(Rubinisphaera brasinliensis), 니아스텔라 코레엔시스(Niastella koreensis), 할리스코메노박터 하이드로씨스(Haliscomenobacter hydrossis), 로도피렐룰라 발티카(Rhodopirellula baltica), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 크테도노박터 라세미퍼(Ktedonobacter racemifer), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 팔루디박터 프로피오니시게네스(Paludibacter propionicigenes), 프루누스 둘시스(Prunus dulcis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 루미노코쿠스 그나부스(Ruminococcus gnavus), 루미노코쿠스 토쿠에(Ruminococcus torques), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 잔토모나스 마니호티스(Xanthomonas manihotis)가 포함된다.
또 다른 구현예에서, 임의의 알파-L-푸코시다제가 본원에 개시된 방법 및 조성물을 실시하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 아르카노박테리움 해모라이티쿰(Arcanobacterium haemolyticum), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 종 TS-2, 바실러스 바타비엔시스(Bacillus bataviensis), 바실러스 니아시니(Bacillus niacini), 바실러스 종 J13, 바실러스 종 J37, 바실러스 레헨시스(Bacillus lehensis), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 셀룰로실라이티쿠스(Bacillus cellulosilyticus), 바실러스 헤미셀룰로실라이티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus), 바실러스 오쿠히덴시스(Bacillus okuhidensis), 바실러스 부타노리보란스(Bacillus butanolivorans), 바실러스 수드알칼리필러스(Bacillus pseudalcaliphilus), 바실러스 보고리엔시스(Bacillus bogoriensis), 바실러스 아키바이(Bacillus akibai), 바실러스 풀미난스(Bacillus fulminans), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 헬코게네스(Bacteroides helcogenes), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis) B6, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 딕티오스텔리움 디스코이듐(Dictyostelium discoideum), 플라보박테리아세애 박테리움(Flavobacteriaceae bacterium) S85, 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 이그니스페애라 아그레간스(Ignispheaera aggregans), 마헬라 오스트랄리엔시스(Mahella australiensis), 셀룰로파가 라이티카(Cellulophaga lytica), 셀룰로파가 알기콜라(Cellulophaga algicola), 루비니스패라 브라신리엔시스(Rubinisphaera brasinliensis), 니아스텔라 코리엔시스(Niastella koreensis), 할리스코메노박터 하이드로씨스(Haliscomenobacter hydrossis), 로도피렐룰라 발티카(Rhodopirellula baltica), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 팔루디박터 프로피오니시게네스(Paludibacter propionicigenes), 프루누스 둘시스(Prunus dulcis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 루미니코쿠스 그나부스(Ruminococcus gnavus), 루미노코쿠스 토쿠에(Ruminococcus torques), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 잔토모나스 마니호티스(Xanthomonas manihotis), 또는 아르카노박테리움 해모라이티쿰(Arcanobacterium haemolyticum), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 종 TS-2, 바실러스 바타비엔시스(Bacillus bataviensis), 바실러스 니아시니(Bacillus niacini), 바실러스 종 J13, 바실러스 종 J37, 바실러스 레헨시스(Bacillus lehensis), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 셀룰로실라이티쿠스(Bacillus cellulosilyticus), 바실러스 헤미셀룰로실라이티쿠스(Bacillus hemicellulosilyticus), 바실러스 오쿠히덴시스(Bacillus okuhidensis), 바실러스 부타노리보란스(Bacillus butanolivorans), 바실러스 수드알칼리필러스(Bacillus pseudalcaliphilus), 바실러스 보고리엔시스(Bacillus bogoriensis), 바실러스 아키바이(Bacillus akibai), 바실러스 풀미난스(Bacillus fulminans), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 헬코게네스(Bacteroides helcogenes), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis) B6, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 딕티오스텔리움 디스코이듐(Dictyostelium discoideum), 플라보박테리아세애 박테리움(Flavobacteriaceae bacterium) S85, 푸사리움 그라미네아룸(Fusariumgraminearum), 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 이그니스페애라 아그레간스(Ignispheaera aggregans), 마헬라 오스트랄리엔시스(Mahella australiensis), 셀룰로파가 라이티카(Cellulophaga lytica), 셀룰로파가 알기콜라(Cellulophaga algicola), 루비니스패라 브라신리엔시스(Rubinisphaerabrasinliensis), 니아스텔라 코리엔시스(Niastella koreensis), 할리스코메노박터 하이드로씨스(Haliscomenobacter hydrossis), 로도피렐룰라 발티카(Rhodopirellula baltica), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 팔루디박터 프로피오니시게네스(Paludibacter propionicigenes), 프루누스 둘시스(Prunus dulcis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 루미니코쿠스 그나부스(Ruminococcusgnavus), 루미노코쿠스 토쿠에(Ruminococcustorques), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 잔토모나스 마니호티스(Xanthomonas manihotis)로부터의 푸코시다제 서열과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 임의의 위에서 언급된 서열과 하나 또는 몇몇 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 상이한 폴리펩타이드; 또는 임의의 위에서의 푸코시다제 서열을 발현하는 폴리뉴클레오타이드에서 유래될 수 있다.
상동성은, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 BLAST, ALIGN, 또는 CLUSTAL과 같은 프로그램을 이용하여, 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 최소한, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 푸코실 모이어티를 제거할 수 있는 단리된, 재조합, 실질적으로 순수한, 또는 비-자연 발생 효소이다. 이 폴리펩타이드는 적어도 하나의 푸코실 모이어티가 또한 제거되는 한, 병원체 결합 부위의 더 큰 부분을 제거할 수 있다. 바람직하게는, 효소는 알파-L-푸코시다제 활성을 갖거나, 다당류, 예컨대 알파-L-푸코시드로부터 말단 알파-1,2-결합 푸코스기의 절단을 촉매한다.
당업자에게는 전장 및/또는 성숙 알파-L-푸코시다제가 임의의 당분야에 널리 공지된 기법을 이용하여 제조될 수 있음이 자명할 것이다.
또 다른 양태에서, 최소한, 병원체 결합 부위에서 적어도 하나의 푸코실 모이어티를 제거할 수 있는 임의의 폴리펩타이드(임의의 융합 단백질 등을 포함함)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 단리된, 재조합, 실질적으로 순수한, 합성적으로 유래된, 또는 비-자연 발생 핵산. 이 폴리펩타이드는 적어도 하나의 푸코실 모이어티가 또한 제거되는 한, 병원체 결합 부위의 더 큰 부분을 제거할 수 있다.
또한 알파-1,2-L-푸코시드로부터 L-푸코스 모이어티를 가수분해하는 글루코스 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 관심 대상이다.
당업자에게는 벡터가 임의의 적합한 발현 벡터일 수 있고, 벡터의 선택은 벡터가 삽입될 세포 유형에 따라 변할 수 있음이 자명할 것이다. 적합한 벡터에는 pGAPT-PG, pRAX1, pGAMD, pGPT-pyrG1, pC194, pJH101, pE194, 및 pHP13(Harwood and Cutting [eds.], Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990] 참고)이 포함된다. 또한, 문헌[Perego, Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, in Sonenshein et al., [eds.] Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C. [1993], pp. 615-624], 및 p2JM103BBI를 참고한다.
발현 벡터는 당분야에 공지된 적합한 생산 숙주의 형질전환에 유용한 임의 수의 벡터 또는 카세트 중 하나일 수 있다. 전형적으로, 벡터 또는 카세트에는 관련 유전자의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선별 마커, 및 자동 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열이 포함될 것이다. 적합한 벡터에는 일반적으로 전사 개시 제어를 보유하는 유전자의 5' 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3' 영역이 포함된다. 두 제어 영역은 모두 형질전환된 생산 숙주 세포의 유전자와 상동성 유전자 및/또는 생산 숙주에 고유한 유전자로부터 유래될 수 있지만, 이러한 제어 영역이 이렇게 유도되어야 하는 것은 아니다.
전사 종결을 제어하는 DNA 단편은 또한 바람직한 생산 숙주 세포에 고유한 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다. 소정 구현예에서, 종결 제어 영역의 포함은 선택적이다. 소정 구현예에서, 발현 벡터에는 바람직한 숙주 세포에서 유래되는 종결 제어 영역이 포함된다.
발현 벡터는 생산 숙주, 특히 미생물 생산 숙주의 세포에 포함될 수 있다. 생산 숙주 세포는 진균 또는 박테리아 패밀리 내에서 확인되고 광범위한 온도, pH값, 및 용매 관용성에 걸쳐 성장하는 미생물 숙주일 수 있다. 예를 들어, 임의의 박테리아, 조류, 및 진균, 예컨대 필라멘트성 진균 및 효모가 발현 벡터를 적합하게 보유할 수 있음이 고려된다.
생산 숙주 세포 내 발현 벡터의 포함은 이것이 세포내, 세포외, 또는 세포 내부 및 외부 모두의 조합으로 잔류할 수 있도록 하여 관심 단백질을 발현하기 위해 이용될 수 있다. 세포외 발현은 발효 산물로부터 요망되는 단백질의 회수를 세포내 발현에 의해 생산되는 단백질의 회수 방법보다 손쉽게 만든다.
재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 절차를 거칠 수 있고 뉴클레오타이드 서열의 발현을 야기하는 임의의 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 바이러스일 수 있다. 벡터 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 생산 숙주와 벡터의 상용성에 의존할 것이다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수 있다. 벡터는 자동 복제 벡터, 즉 그 복제가 염색체 복제와 독립적인 염색체외 대상체로 존재하는 벡터, 예컨대 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 보장하기 위한 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 생산 숙주 내로 도입되는 경우, 게놈 내로 통합되고 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 이러한 벡터의 일부 비-제한적 예는 문헌[Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, < www.fgsc.net≫)]에 제공되며, 적합한 발현 및/또는 통합 벡터의 추가예는 문헌[Sambrook et al., (1989) 위 문헌, Ausubel (1987) 위 문헌, van den Hondel et al. (1991) in Bennett and Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press. 396-428 및 U.S. 특허 번호 5,874,276]에 제공된다. 특히 유용한 벡터에는 pTREX, pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 및 pENTR/D가 포함된다. 박테리아 세포에서 이용하기 적합한 플라스미드에는 E. 콜라이에서의 복제를 허용하는 pBR322 및 pUC19 및 예를 들어 바실러스에서의 복제를 허용하는 pE194가 포함된다.
간략하게 생산 숙주 세포에서의 생산에 대해서는 문헌[Sambrook et al., (1989) 위 문헌, Ausubel (1987) 위 문헌, van den Hondel et al. (1991) in Bennett and Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press (1991) pp. 70-76 및 396-428; Nunberget al., (1984) Mol . Cell BioI . 4:2306-2315; Boel et al., (1984) 30 EMBO J. 3:1581-1585; Finkelstein in BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992), Chap. 6; Kinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London; Kelley et al., (1985) EMBO J. 4:475 - 479; Penttila et al., (1987) Gene 61: 155-164 및 U.S. 특허 번호 5,874,276]을 참조할 수 있다. 적합한 벡터의 목록은 문헌[Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, www at fgsc.net)]에서 확인될 수 있다. 적합한 벡터에는 예를 들어 Invitrogen Life Technologies 및 Promega에서 입수되는 것들이 포함된다. 진균 숙주 세포에서 이용하기 적합한 특정 벡터에는 pFB6, pBR322, pUC18, pUC100, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z 및 pGEM®4Z와 같은 벡터가 포함된다.
벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 함께 숙주 세포의 게놈 내로 도입될 총 DNA, 또는 트랜스포존을 함유하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드일 수 있다.
벡터는 또한 형질전환된 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 이상의 선별 마커를 함유할 수 있다. 선별 마커는 그 산물이 살생물제 또는 바이러스 내성 유전자 등을 제공하는 유전자이다. 선별 마커의 예에는 항미생물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. amdS, argB 및 pyr4와 같은 당분야에 공지된 마커를 포함하는 영양 마커도 본 발명에서 이용할 수 있다. 트리코더마(Trichoderma)의 형질전환에 유용한 마커는 당분야에 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Finkelstein, chapter 6, in Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., EDS Butterworth-Heinemann, Boston MA (1992) 및 Kinghorn et al., (1992) Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London] 참고). 일부 구현예에서, 발현 벡터에는 또한 레플리콘, 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아의 선택을 허용하는 항생제 내성을 인코딩하는 유전자, 및 이종성 서열의 삽입을 허용하는 플라스미드의 비필수 영역 내 고유한 제한 부위가 포함될 것이다. 선택된 특정한 항생제 내성 유전자가 결정적인 것은 아니다; 당분야에 공지된 임의의 여러 내성 유전자가 적합하다. 원핵생물 서열은 바람직하게는 트리코더마 리이세이(Trichoderma reesei)에서 DNA의 복제 또는 통합을 방해하지 않도록 선택된다.
벡터는 또한 생산 숙주 게놈 내로의 벡터의 안정한 통합 또는 세포 게놈과 독립적인 생산 숙주 내 벡터의 자동 복제를 허용하는 요소(들)를 함유할 수 있다. 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 위해, 벡터는 상동성 또는 비상동성 재조합에 의한 게놈 내로의 벡터의 안정한 통합을 위해 아스파르트산 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 벡터의 임의의 다른 요소에 의존할 수 있다.
자동 복제를 위해, 벡터는 벡터가 생산 숙주에서 자동 복제할 수 있도록 하는 복제 기원을 추가로 포함할 수 있다.
알파-L-푸코시다제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하나를 초과하는 카피가 알파-L-푸코시다제의 생산을 증가시키기 위해 생산 숙주 내로 삽입될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 카피수 증가는 생산 숙주의 게놈 내로 서열의 적어도 하나의 추가 카피를 통합시키거나 증폭 가능한 선별 마커 유전자를 포함시킴으로써 수득될 수 있고, 이에 의해 뉴클레오타이드 서열의 추가 카피는 적절한 선별 제제의 존재 하에 생산 숙주 세포의 배양에 의해 선택될 수 있다.
알파-L-푸코시다제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는 벡터가 염색체 통합물로 또는 자가-복제하는 염색체-외 벡터로 유지되도록 생산 숙주 내로 도입된다. 통합은 일반적으로 뉴클레오타이드 서열이 생산 숙주 내에서 더 안정적으로 유지되기 쉬우므로 장점으로 간주된다. 생산 숙주 염색체 내로의 벡터의 통합은 위에서 논의된 바와 같이 상동성 또는 비-상동성 재조합에 의해 일어날 수 있다.
예시적 벡터에는 비제한적으로 pGXT(공개된 PCT 출원 WO2015/017256에 기재된 pTTTpyr2 벡터와 동일함)가 포함된다. 또한 표준 박테리아 발현 벡터가 언급될 수 있고 박테리오파지 λ 및 M13뿐만 아니라 플라스미드, 예컨대 pBR322 기반 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 융합 발현 시스템, 예컨대 MBP, GST, 및 LacZ가 포함된다. 에피토프 태그, 예컨대, c-myc도 편리한 단리 방법을 제공하기 위해 재조합 단백질에 부가될 수 있다.
적합한 발현 및/또는 통합 벡터의 예는 문헌[Sambrook et al., (1989) 위 문헌, Bennett and Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, (1991) Academic Press pp. 70 - 76 및 pp. 396 - 428 및 여기에서 인용된 기사; USP 5,874,276 및 Fungal Genetic Stock Center Catalogue of Strains, (FGSC, www.fgsc.net.)]에 제공된다. 유용한 벡터는 Promega 및 Invitrogen에서 입수될 수 있다. 일부 특정한 유용한 벡터에는 pBR322, pUC18, pUC100, pDON™201, pENTR™, pGEN®3Z 및 pGEN®4Z가 포함된다. 그러나, 동등한 기능을 제공하고 당분야에 공지되어 있거나 공지되는 다른 형태의 발현 벡터도 이용될 수 있다. 따라서, 매우 다양한 숙주/발현 벡터 조합이 본원에 개시된 DNA 서열의 발현에서 채택될 수 있다. 유용한 발현 벡터는, 예를 들어, 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열의 절편, 예컨대 SV40의 다양한 공지된 유도체 및 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 col E1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC19 및 이의 유도체를 포함하는 E. 콜라이 유래 플라스미드, 더 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대, RP4, 파지 DNA, 예컨대 파지 람다의 여러 유도체, 예컨대, NM989, 및 다른 DNA 파지, 예컨대, M13 및 필라멘트성 단일쇄 DNA 파지, 효모 플라스미드, 예컨대 2.mu 플라스미드 또는 이의 유도체로 구성될 수 있다.
생산 숙주의 선택은 임의의 적합한 미생물, 예컨대 박테리아, 진균 및 조류일 수 있다. 전형적으로, 선택은 관심 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 인코딩하는 유전자에 의존할 것이다.
적합한 생산 숙주의 예에는 비제한적으로 박테리아, 진균, 식물 세포 등이 포함된다. 바람직하게는, 생산 숙주는 E. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 한세눌라(Hansenula), 트리코더마(Trichoderma(특히 T. 리이세이(T. reesei)), 바실러스, 락토바실러스, 아스페르길러스(Aspergillus(특히 A. 나이거(A. niger)), 식물 세포 및/또는 바실러스(Bacillus), 트리코더마(Trichoderma), 또는 아스페르길러스(Aspergillus)의 포자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 알파-L-푸코시다제 효소가 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 이용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 알파-L-푸코시다제로부터 L-푸코스를 가수분해할 수 있는 알파-L-푸코시다제 효소를 포함하는 식품 또는 사료 첨가제가 제공된다.
여러 표준 전달감염 방법이 다량의 요망되는 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 발현하는 박테리아 및 필라멘트성 진균(예컨대 아스페르길러스(Aspergillus) 또는 트리코더마(Trichoderma)) 세포주를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 트리코더마의 셀룰라제-생산 균주 내로 DNA 구축물의 도입을 위한 일부 공개된 방법에는 문헌[Lorito, Hayes, DiPietro and Harman, (1993) Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet. 17:169-174; 및 Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen and Knowles, (1987) Gene 6: 155-164, 또한 USP 6.022,725; USP 6,268,328 및 Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes" in Molecular Industrial Mycology, Eds, Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pp 129 - 148 참고]이 포함되며; 아스페르길러스(Aspergillus)에 대해서는 문헌[Yelton, Hamer and Timberlake, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474]가 포함되고, 푸사리움(Fusarium)에 대해서는 문헌[Bajar, Podila and Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212]이 포함되고, 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 대해서는 문헌[Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK 및 Fernandez-Abalos et al., Microbiol 149:1623 - 1632 (2003)]이 포함되고 바실러스에 대해서는 문헌[Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138)]이 포함된다.
그러나, 숙주 세포 내로 외래 뉴클레오타이드 서열을 도입하기 위한 임의의 널리 공지된 절차가 이용될 수 있다. 이들에는 칼슘 포스페이트 전달감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 바이오리스틱(biolistics), 리포좀, 마이크로주사, 플라즈마 벡터, 바이러스 벡터 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전 물질의 숙주 세포 내로의 도입을 위한 임의의 다른 널리 공지된 방법의 이용이 포함된다(예컨대, 문헌[Sambrook et al., 위 문헌] 참고). U.S. 특허 번호 6,255,115에 기재된 아그로박테리움-매개 전달감염 방법도 이용된다. 이용된 특정한 유전 조작 절차가 유전자를 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있기만 하면 된다.
이용된 숙주 세포에 따라 전사-후 및/또는 번역-후 변경이 수행될 수 있다. 전사-후 및/또는 번역-후 변경의 하나의 비제한적 예는 폴리펩타이드의 "클리핑" 또는 "절단"이다. 예를 들어, 이는 프로-펩타이드가 효소 활성을 갖는 성숙 펩타이드로의 추가적인 번역-후 가공을 거치는 경우에서와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 불활성 또는 실질적으로 불활성 상태에서 활성 상태로 만들 수 있다. 또 다른 경우, 이 클리핑은 본원에 기재된 바와 같은 성숙 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제 폴리펩타이드를 이용하고 N 또는 C-말단 아미노산을 추가 제거하여 효소 활성을 보전하는 알파-L-푸코시다제의 절단된 형태를 생성할 수 있다.
전사-후 또는 번역-후 변경의 다른 예에는 비제한적으로 미리스토일화, 글리코실화, 절단, 지질화 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 인산화가 포함된다. 당업자는 단백질이 거칠 수 있는 전사-후 또는 번역-후 변경의 유형이 단백질이 발현되는 숙주 유기체에 의존할 수 있음을 이해할 것이다.
아스페르길러스(Aspergillus) 및 트리코더마(Trichoderma)에 대한 형질전환 방법은, 예를 들어, 문헌[Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470 - 1474; Berka et al., (1991) in Applications of Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly and Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., (2000) Sci . 9:991 - 1001; Campbell et al., (1989) Curro Genet. 16:53-56; Pentilla et al., (1987) Gene 61:155 - 164); de Groot et al., (1998) Nat. Biotechnol . 16:839 - 842; USP 6,022,725; USP 6,268,328 및 EP 238 023]에 기재되어 있다. 트리코더마에서 이종성 단백질의 발현은 문헌[USP 6,022,725; USP 6,268,328; Harkki et ale (1991); Enzyme Microb . Technol . 13:227-233; Harkki et al., (1989) Bio Technol . 7:596-603; EP 244,234; EP 215,594; 및 Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous Heterologous Genes", in MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pp. 129 - 148)]에 기재되어 있다. 푸사리움(Fusarium) 균주의 형질전환에 대해서는 문헌[W096100787 및 Bajar et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8202 - 28212]를 참조한다.
발현 벡터가 세포 내로 도입된 후, 전달감염되거나 형질전환된 세포는 프로모터 서열의 제어 하에 유전자의 발현을 선호하는 조건 하에 배양된다. 일부 경우에서, 프로모터 서열은 cbh1 프로모터이다. 대형 배치의 형질전환된 세포는 문헌[Ilmen et al 1997 ("Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei." Appl. Envir. Microbiol. 63:1298-1306)]에 기재된 바와 같이 배양될 수 있다.
숙주 트리코더마 종 균주 내로의 DNA 흡수는 칼슘 이온 농도에 의존한다. 일반적으로, 약 10~50 mM CaCl2가 흡수 용액에서 이용된다. 추가적인 적합한 화합물에는 완충 시스템, 예컨대 TE 완충액(10 mM Tris, pH 7.4; 1 mM EDTA) 또는 10 mM MOPS, pH 6.0 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 폴리에틸렌글리콜은 세포막과 융합함으로써 배지의 내용물이 트리코더마 종 균주의 세포질 내로 전달될 수 있도록 하는 것으로 여겨진다. 이 융합은 빈번하게 숙주 염색체 내에 통합된 여러 카피의 플라스미드 DNA를 남긴다.
보통 트리코더마 종의 형질전환은 전형적으로 105 내지 107/mL, 특히 2x106/mL의 밀도로 투과도 처리를 거친 원형질체 또는 세포를 이용한다. 100 ㎕ 부피의 적절한 용액(예컨대, 1.2 M 소르비톨 및 50 mM CaCl2) 중 이러한 원형질체 또는 세포는 요망되는 DNA와 혼합될 수 있다. 일반적으로, 고농도 PEG가 흡수 용액에 첨가된다. 0.1 내지 1부피의 25% PEG 4000이 원형질체 현탁액에 첨가될 수 있다; 그러나, 약 0.25부피의 원형질체 현탁액을 첨가하는 것이 유용하다. 첨가제, 예컨대 디메틸 설폭시드, 헤파린, 스페르미딘, 칼륨 클로라이드 등이 또한 형질전환을 촉진하기 위해 흡수 용액에 첨가될 수 있다. 다른 진균 숙주 세포에 대해 유사한 절차가 이용 가능하다. 예컨대, U.S. 특허 번호 6,022,725를 참고한다.
세포를 배양하기 위해 이용되는 배지는 숙주 세포의 성장 및 알파-푸코시다제 폴리펩타이드의 발현 수득에 적합한 임의의 통상적 배지일 수 있다. 적합한 배지 및 배지 성분은 상업적 공급업체로부터 이용 가능하거나 공개된 레시피에 따라(예컨대, American Type Culture Collection의 카탈로그에 기재된 바와 같이) 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 미생물의 소모된 전체 발효 액체배지의 제조는 당분야에 공지된 임의의 배양 방법을 이용해서 달성되어 관심 효소의 발현을 일으킬 수 있다. 따라서 발효는 적합한 배지 중 그리고 효소가 발현되거나 단리될 수 있도록 하는 조건 하에 수행된 실험실 또는 산업적 발효장치에서의 진탕 플라스크 배양, 소규모 또는 대규모 발효(연속식, 회분식, 공급-회분식, 또는 고체 상태 발효 포함)를 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 용어 "소모된 전체 발효 액체배지"는 본원에서 배양 배지, 세포외 단백질(예컨대, 효소), 및 세포성 바이오매스를 포함하는 발효 물질의 분획화되지 않은 내용물로 정의된다. 용어 "소모된 전체 발효 액체배지"는 또한 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 용해되거나 투과화된 세포성 바이오매스를 포괄하는 것으로 이해된다.
숙주 세포는 알파-글루코시다제의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 효소의 발현은 이들이 연속적으로 생산되도록 구성적이거나, 발현을 개시하기 위한 자극을 필요로 하는, 유도성일 수 있다. 유도성 발현의 경우, 단백질 생산은, 예를 들어 배양 배지에 대한 유도제 물질, 예를 들어 덱사메타손 또는 IPTG 또는 소포로스의 첨가에 의해, 요구될 때 개시될 수 있다.
폴리펩타이드는 또한 시험관내 무세포 시스템, 예컨대 TNT™(Promega) 토끼 망상적혈구 시스템에서 재조합적으로 생산될 수 있다. 발현 숙주는 또한 호기성 조건 하에, 숙주에 대해 적절한 배지 중에 배양될 수 있다. 숙주의 필요 및 요망되는 알파-글루코시다제의 생산에 따라, 해당 숙주에 대해 적절한 온도, 예컨대 약 25℃ 내지 약 75℃(예컨대, 30℃ 내지 45℃)에서 생산이 일어나며, 진탕 또는 교반 및 통기의 조합이 제공될 수 있다. 배양은 약 12 내지 약 100시간 이상(및 이들 사이의 임의의 시간값, 예컨대 24 내지 72시간) 일어날 수 있다. 전형적으로, 배양 액체배지는 역시 관심 효소, 예컨대, 푸코시다제의 생산에 관해 숙주에 있어서 요구되는 배양 조건에 따라, 약 4.0 내지 약 8.0의 pH에 있다. 생산 숙주 및 형질전환된 세포는 통상적인 영양 배지 중에 배양될 수 있다. 형질전환된 숙주 세포에 대한 배양 배지는 프로모터의 활성화 및 형질전환된 세포의 선택을 위해 적절한 바에 따라 변경될 수 있다. 특정 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이용되는 것일 수 있고, 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 바람직한 배양 조건은 과학 문헌, 예컨대 문헌[Sambrook, (1982) 위 문헌; Kieser, T, MJ. Bibb, MJ. Buttner, KF Chater, and D.A. Hopwood (2000) Practical Streptomyces Genetics. John Innes Foundation, Norwich UK; Harwood, et al., (1990) Molecular Biological METHODS for Bacillus, John Wiley 및/또는 American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org)]에서 확인될 수 있다.
당분야에 널리 공지된 임의의 발효 방법이 상술된 바와 같은 형질전환된 또는 유도체 진균 균주를 발효하기 위해 적합하게 이용될 수 있다.
전통적인 회분식 발효는 폐쇄 시스템으로, 배지 조성은 발효 시작 시 설정되며, 발효 동안 조성이 변형되지 않는다. 발효 시작 시, 배지에 요망되는 유기체(들)가 접종된다. 다시 말하면, 전체 발효 공정이 발효 시스템 전체에 대한 임의의 성분 첨가 없이 일어난다.
대안적으로, 회분식 발효는 탄소원의 첨가에 대해 "회분식"으로 평가된다. 또한, 종종 발효 공정에 걸쳐 pH 및 산소 농도와 같은 요인을 제어하기 위한 시도가 수행된다. 전형적으로 회분식 시스템의 대사물질 및 바이오매스 조성은 발효가 중단되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 회분식 배양 내에서, 세포는 정적 지연상을 통과해 고성장 로그상으로, 그리고 마지막으로 성장 속도가 감소되거나 중지되는 정지상으로 진행한다. 정지상에 미처리된 채 남은 세포는 궁극적으로 사멸할 것이다. 일반적으로, 로그상의 세포가 산물의 벌크 생산에 관여된다. 표준 회분식 시스템에 대한 적합한 변이는 "공급-회분식 발효" 시스템이다. 전형적 회분식 시스템의 이러한 변이에서, 발효가 진행함에 따라 기질이 증분 첨가된다. 공급-회분식 시스템은 분해대사산물 억제가 세포의 대사를 억제할 것임이 알려진 경우, 및/또는 발효 배지 중 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 경우 유용하다. 공급-회분식 시스템에서 실제 기질 농도의 측정은 어려우며, 따라서 측정 가능한 요인, 예컨대 pH, 용해 산소 및 폐가스, 예컨대 CO2 분압의 변화에 기반하여 추산된다. 회분식 및 공급-회분식 발효는 당분야에 널리 공지되어 있다.
연속 발효는 또 다른 공지된 발효 방법이다. 이는 정의된 발효 배지가 바이오리액터에 연속적으로 첨가되고, 동량의 컨디셔닝된 배지가 가공을 위해 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속 발효는 일반적으로 배양을 일정한 밀도로 유지하며, 세포는 주로 로그상 성장으로 유지된다. 연속 발효는 세포 성장 및/또는 산물 농도에 영향을 미치는 하나 이상의 요인의 조정을 허용한다. 예를 들어, 제한 영양소, 예컨대 탄소원 또는 질소원이 고정된 비율로 유지될 수 있고, 모든 다른 파라미터가 온건하게 허용된다. 다른 시스템에서는, 성장에 영향을 미치는 여러 요인이 연속적으로 변형될 수 있는 반면, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지된다. 연속 시스템은 항정 상태 성장 조건을 유지하려고 노력한다. 따라서, 배지 인출로 인한 세포 손실은 발효 내 세포 성장 속도에 대해 균형이 맞춰져야 한다. 연속 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자의 조정 방법뿐만 아니라 산물 형성 속도의 최대화 기법은 산업 미생물학 분야에 널리 공지되어 있다.
분리 및 농축 기법은 당분야에 공지되어 있으며 통상적 방법이 본 발명의 알파-글루코시다제 폴리펩타이드를 포함하는 농축 용액 또는 액체배지를 제조하기 위해 이용될 수 있다.
발효 후, 발효 액체배지가 수득되고, 미생물 세포 및 잔여 미가공 발효 물질을 포함하는 다양한 현탁 고체는 효소-함유 용액을 수득하기 위해 통상적 분리 기법에 의해 제거된다. 여과, 원심분리, 마이크로여과, 회전 진공 드럼 여과, 초여과, 원심분리 후 초여과, 추출 또는 크로마토그래피 등이 일반적으로 이용된다.
때때로 회수를 최적화하기 위해 관심 폴리펩타이드를 포함하는 용액 또는 액체배지를 농축하는 것이 바람직할 수 있다. 농축되지 않은 용액 또는 액체배지의 이용은 전형적으로 농축되거나 정제된 효소 침전을 수집하기 위한 인큐베이션 시간을 증가시킬 것이다.
효소-함유 용액은 요망되는 효소 수준이 수득될 때까지 통상적 농축 기법을 이용해서 농축될 수 있다. 효소 함유 용액의 농축은 본원에 논의된 임의의 기법에 의해 달성될 수 있다. 농축 및 정제 방법의 예에는 비제한적으로 회전 진공 여과 및/또는 초여과가 포함된다.
본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 알파-L-푸코시다제 효소는 당분야에 공지된 다양한 평가를 이용해서 활성에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 활성은 효소를 필요에 따라 당단백질 또는 올리고당류 및 물과 조합하여 평가될 수 있다. 활성은 반응 산물의 분석에 의해 측정될 수 있고, 이는, 예를 들어, 박층 크로마토그래피 또는 분광측정에 의해 분리되고 가시화될 수 있다. 푸코스 분광측정 검정의 하나의 예는 Megazyme K-FUCOSE 키트이다(Cao et al. (2014) J Biol Chem 289(37):25624-38).
본원에 개시된 방법은 단독으로 또는 적어도 하나의 프로테아제와 함께 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 유효량의 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또한, 단독으로 및/또는 적어도 하나의 프로테아제와 함께, 단독으로 또는 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는 동물 사료 또는 프리믹스에서의 이용을 위해 캡슐화될 수 있다. 또한, 단독으로 및/또는 적어도 하나의 프로테아제와 함께, 단독으로 또는 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는, 캡슐화되건 캡슐화되지 않건, 과립의 형태일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제 효소는 하나 이상의 추가 효소와 함께 이용될 수 있는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 효소는 단백질 분해에 관여되는 것들, 예컨대 카복시펩티다제, 바람직하게는 카복시펩티다제 A, 카복시펩티다제 Y, A. 나이거 아스파르트산 프로테아제 PEPAa, PEPAb, PEPAc 및 PEPAd, 엘라스타제, 아미노 펩티다제, 펩신 또는 펩신-유사, 트립신 또는 트립신-유사 프로테아제, 산 진균 프로테아제 및 박테리아 프로테아제, 예컨대 서브틸리신 및 그 변이체, 및 전분 대사, 섬유 분해, 지질 대사에 관여되는 것들, 글리코겐 대사에 관여되는 단백질 또는 효소, 다른 오염물질을 분해하는 효소, 아세틸 에스터라제, 아밀라제, 아라비나제, 아라비노푸라노시다제, 엑소- 및 엔도-펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 키모신, 큐티나제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라제, 에스터라제, 포름아미다제, -갈락토시다제, 예를 들어 α 또는 β-갈락토시다제, 엑소-글루카나제, 글루칸 리아제, 엔도-글루카나제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, 예를 들어 α 또는 β-글루코시다제, 글루쿠로니다제, 헤미셀룰라제, 가수분해효소, 인버타제, 이소머라제, 라카제, 페놀 옥시다제, 리파제, 리아제, 만노시다제, 옥시다제, 산화환원효소, 펙티나제, 펙테이트 리아제, 펙틴 아세틸 에스터라제, 펙틴 데폴리머라제, 펩티다제, 펙틴 메틸 에스터라제, 펙틴분해 효소, 퍼옥시다제, 페놀옥시다제, 피타제, 폴리갈락투로나제, 람노-갈락투로나제, 리보뉴클레아제, 타우마틴, 트랜스퍼라제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나제, 자일라나제, 헥소스 옥시다제(D-헥소스: (3/4-산화환원효소, EC 1.1.3.5), 산 포스파타제 및/또는 기타 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들에는, 예를 들어, 조성물 또는 사료의 점도를 조정하는 효소가 포함된다.
추가로, 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는 위에서 확인되는 산 pH를 견디기 위해 캡슐화될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는, 캡슐화되건 캡슐화되지 않건, 단독으로 또는 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 이용될 수 있고, 동물 사료 또는 프리믹스에 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는, 캡슐화되건 캡슐화되지 않건, 단독으로 또는 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물 및 적어도 하나의 프로테아제와 함께 이용될 수 있고, 동물 사료 또는 프리믹스에 투여될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는, 캡슐화되건 캡슐화되지 않건, 단독으로 또는 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 이용될 수 있고, 동물 사료 또는 프리믹스에 투여될 수 있고, 알파-L-푸코시다제는 과립 또는 액체 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 과립이다.
또한 본 개시의 범위 내에는 동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 조성물이 포함되며, 병원성 감염은 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하고, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
위에서 주지된 바와 같이, 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는 단독으로 또는 글리칸-함유 구조로부터 N-아세틸-갈락토실아민-함유 모이어티를 제거할 수 있는 효소와 함께 글리칸-함유 구조로부터 말단 알파-1,2-결합 푸코스기를 제거할 수 있어야 한다. 바람직하게는, 알파-L-푸코시다제는 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95) 및 글리코시드 가수분해효소 패밀리 29(GH29)로 구성된 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는, 알파-L-푸코시다제는 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95)로 구성된 군으로부터 선택된다.
이 조성물은 위에서 논의된 바와 같이 임의의 장 병원성 감염을 예방하고/하거나 치료하기 위해 이용될 수 있다. 하나의 관심 병원체는 F18 가는 털을 발현하는 에스체리키아 콜라이이다.
위에서의 논의로부터, 조성물이 단독으로 또는 적어도 하나의 프로테아제와 함께 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물을 추가로 포함할 수 있음이 명확하다.
단독으로 및/또는 적어도 하나의 프로테아제와 함께, 단독으로 또는 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는 동물 사료 또는 프리믹스에서 이용하기 위해 캡슐화될 수 있다. 또한, 단독으로 및/또는 적어도 하나의 프로테아제와 함께, 단독으로 또는 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는, 캡슐화되건 캡슐화되지 않건, 과립 형태일 수 있다.
동물 사료에는 가금, 돼지, 반추, 수산 및 애완동물용 식물 물질, 예컨대 옥수수, 밀, 수수, 대두, 유채, 해바라기 또는 임의의 이러한 식물 물질의 혼합물 또는 식물 단백질원이 포함될 수 있다. 동물 퍼포먼스 파라미터, 예컨대 성장, 사료 섭취 및 사료 효율뿐만 아니라 개선된 균일성, 축사에서 감소된 암모니아 농도 및 결과적으로 개선된 동물 복지 및 건강 상태가 개선될 것임이 고려된다. 보다 구체적으로, 본원에서 이용되는 "동물 퍼포먼스"는 사료 효율 및/또는 동물의 체중 증가에 의해 및/또는 사료 전환 비율에 의해 및/또는 사료 중 영양소 소화력(예컨대 아미노산 소화력) 및/또는 사료 중 소화 가능한 에너지 또는 대사 가능한 에너지에 의해 및/또는 질소 보유에 의해 및/또는 동물이 괴사성 장염의 부정적 효과를 회피하는 능력에 의해 및/또는 대상체의 면역 반응에 의해 결정될 수 있다.
용어 "동물 사료", "사료", "사료물" 및 "마초"는 상호 교환적으로 사용되며, a) 곡물, 예컨대 소형 낟알(예컨대, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 이의 조합) 및/또는 대형 낟알, 예컨대 옥수수 또는 수수; b) 곡물로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐식, 가용분 함유 증류 건조 낟알(DDGS)(특히 옥수수계 가용분 함유 증류 건조 낟알(cDDGS), 밀겨, 거친 밀가루, 밀 쇼트(shorts), 쌀겨, 쌀 왕겨, 귀리 왕겨, 야자핵, 및 시트러스 펄프; c) 대두, 해바라기, 땅콩, 루핀, 완두, 누에콩, 면실, 유채, 어류 음식, 건조 혈장 단백질, 고기 및 뼈 음식, 감자 단백질, 유장, 코프라, 참깨와 같은 원천에서 수득된 단백질; d) 식물 및 동물 원천에서 수득된 오일 및 지방; 및/또는 e) 미네랄 및 비타민을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사료 물질을 포함할 수 있다.
사료, 예컨대 기능성 사료로 또는 그 제조에서 이용되는 경우, 본 발명의 효소 또는 사료 첨가제 조성물은 영양적으로 허용 가능한 담체, 영양적으로 허용 가능한 희석제, 영양적으로 허용 가능한 부형제, 영양적으로 허용 가능한 아주반트, 영양적 활성 성분 중 하나 이상과 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질, 펩타이드, 수크로스, 락토스, 소르비톨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 나트륨 클로라이드, 나트륨 설페이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포르메이트, 나트륨 소르베이트, 칼륨 클로라이드, 칼륨 설페이트, 칼륨 아세테이트, 칼륨 시트레이트, 칼륨 포르메이트, 칼륨 아세테이트, 칼륨 소르베이트, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트, 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 시트레이트, 마그네슘 포르메이트, 마그네슘 소르베이트, 나트륨 메타바이설파이트, 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분이 언급될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 효소 또는 사료 첨가제 조성물은 사료 성분과 혼합되어 사료물을 형성한다. 본원에서 사용되는 용어 "사료 성분"은 사료물의 전부 또는 일부를 의미한다. 사료물의 일부는 사료물의 하나의 구성분 또는 사료물의 하나를 초과하는, 예컨대 2 또는 3 또는 4개 이상의 구성분을 의미할 수 있다. 하나의 구현예에서, 용어 "사료 성분"은 프리믹스 또는 프리믹스 구성분을 포괄한다. 바람직하게는, 사료는 마초, 또는 이의 프리믹스, 화합물 사료, 또는 이의 프리믹스일 수 있다. 본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물은 화합물 사료, 화합물 사료 성분 또는 화합물 사료의 프리믹스 또는 마초, 마초 성분, 또는 마초의 프리믹스와 혼합될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 사료물은 a) 곡물, 예컨대 소형 낟알(예컨대, 밀, 보리, 호밀, 귀리, 라이밀 및 이의 조합) 및/또는 대형 낟알, 예컨대 옥수수 또는 수수; b) 곡물로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐식, 습식 케이크(특히 옥수수계 습식-케이크), 증류 건조 낟알(DDG)(특히 옥수수계 증류 건조 낟알(cDDG)), 가용분 함유 증류 건조 낟알(DDGS)(특히 옥수수계 가용분 함유 증류 건조 낟알(cDDGS)), 밀겨, 거친 밀가루, 밀 쇼트, 쌀겨, 쌀 왕겨, 귀리 왕겨, 야자핵, 및 시트러스 펄프; c) 대두, 해바라기, 땅콩, 루핀, 완두, 누에콩, 면실, 유채, 어류 음식, 건조 혈장 단백질, 고기 및 뼈 음식, 감자 단백질, 유장, 코프라, 참깨와 같은 원천에서 수득된 단백질; d) 식물 및 동물 원천에서 수득된 오일 및 지방; 및/또는 e) 미네랄 및 비타민을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사료 물질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "마초"는 동물(그 스스로를 위해 채집하는 동물이 아님)에 제공되는 임의의 식품을 의미한다. 마초는 절단된 식물을 포괄한다. 또한, 마초에는 저장 목초, 압축 및 펠렛화 사료, 오일 및 혼합 배급사료, 그리고 또한 싹튼 낟알 및 콩류가 포함된다.
마초는 옥수수(maize), 알팔파(Lucerne), 보리, 버어즈풋트 트레포일(birdsfoot trefoil), 브라시카스(brassicas), 차우 모엘리에(Chau moellier), 케일, 평지씨(유채), 루터베가(swede), 순무, 토끼풀, 앨사이크(alsike) 토끼풀, 붉은 토끼풀, 지하 토끼풀, 흰 토끼풀, 김의털, 참새귀리, 기장, 귀리, 수수, 대두, 나무(나무-건초용 전지 나무 새싹), 밀, 및 콩류로부터 선택되는 하나 이상의 식물로부터 수득될 수 있다.
용어 "화합물 사료"는 음식, 펠렛, 너트, 케이크 또는 크럼블 형태의 상업적 사료를 의미한다. 화합물 사료는 다양한 원료 및 첨가제로부터 배합될 수 있다. 이들 배합물은 표적 동물의 구체 요구사항에 따라 제형화된다.
화합물 사료는 모든 일일 요구 영양소를 제공하는 완전 사료, 배급사료(단백질, 에너지)의 일부를 제공하는 농축물 또는 추가 미세영양소, 예컨대 미네랄 및 비타민만을 제공하는 보충물일 수 있다.
화합물 사료에서 이용되는 주요 성분은 사료 낟알이며, 여기에는 옥수수, 밀, 유채 음식, 평지씨 음식, 루핀, 대두, 수수, 귀리, 및 보리가 포함된다.
적합하게는 본원에서 언급되는 프리믹스는 미세성분, 예컨대 비타민, 미네랄, 화학 보존제, 항생제, 발효 산물, 및 다른 필수 성분으로 이루어진 조성물일 수 있다. 프리믹스는 보통 상업적 배급사료로의 배합에 적합한 조성물이다.
하나의 구현예에서, 사료물은 옥수수, DDGS(예컨대 cDDGS), 밀, 밀겨 또는 이의 임의의 조합을 포함하거나 이로 구성된다.
하나의 구현예에서, 사료 성분은 옥수수, DDGS(예컨대 cDDGS), 밀, 밀겨 또는 이의 조합일 수 있다. 하나의 구현예에서, 사료물은 옥수수, DDGS(예컨대 cDDGS) 또는 이의 조합을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에 기재된 사료물은 적어도 30중량%, 적어도 40중량%, 적어도 50중량% 또는 적어도 60중량%의 옥수수 및 대두 음식 또는 옥수수 및 전지 대두, 또는 밀 음식 또는 해바라기 음식을 함유할 수 있다.
예를 들어, 사료물은 약 5 내지 약 40% 옥수수 DDGS를 함유할 수 있다. 가금에 있어서, 사료물은 평균 약 7 내지 15% 옥수수 DDGS를 함유할 수 있다. 멧돼지(돼지)에 있어서, 사료물은 평균 5 내지 40% 옥수수 DDGS를 함유할 수 있다. 또한 단일 낟알로 옥수수를 함유할 수 있고, 이 경우 사료물은 약 35% 내지 약 80% 옥수수를 포함할 수 있다.
혼합 낟알을 포함하는, 예컨대 옥수수 및 예를 들어 밀을 포함하는 사료물에서, 사료물은 적어도 10% 옥수수를 포함할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 사료물은 또한 고섬유질 사료물을 제공하기 위해 적어도 하나의 고섬유질 사료 물질 및/또는 적어도 하나의 고섬유질 사료 물질의 적어도 하나의 부산물을 포함할 수 있다. 고섬유질 사료 물질의 예에는 밀, 보리, 호밀, 귀리, 곡물로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐식, 옥수수 글루텐 사료, 습식-케이크, 증류 건조 낟알(DDG), 가용분 함유 증류 건조 낟알(DDGS), 밀겨, 거친 밀가루, 밀 쇼트, 쌀겨, 쌀 왕겨, 귀리 왕겨, 야자핵, 및 시트러스 펄프가 포함된다. 일부 단백질원: 해바라기, 루핀, 누에콩 및 면실과 같은 원천에서 수득된 단백질도 고섬유질로 간주될 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 사료물은, 예를 들어 가용분 함유 증류 건조 낟알(DDGS), 특히 cDDGS, 습식-케이크, 증류 건조 낟알(DDG), 특히 cDDG, 밀겨, 및 밀로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 고섬유질 물질 및/또는 적어도 하나의 고섬유질 사료 물질의 적어도 하나의 부산물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 사료물은, 예를 들어 가용분 함유 증류 건조 낟알(DDGS), 특히 cDDGS, 밀겨, 및 밀로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 고섬유질 물질 및/또는 적어도 하나의 고섬유질 사료 물질의 적어도 하나의 부산물을 포함한다.
사료는 다음: 화합물 사료 및 프리믹스, 예컨대 펠렛, 너트 또는 (소) 케이크; 농작물 또는 농작물 잔여물: 옥수수, 대두, 수수, 귀리, 보리 코프라, 짚, 여물, 사탕무 폐기물; 어류 음식; 고기 및 뼈 음식; 당밀; 오일 케이크 및 프레스 케이크; 올리고당류; 보존된 채집 식물: 저장 목초; 해초; 전체 또는 분쇄, 제분 등에 의해 제조된, 종자 및 낟알; 싹튼 낟알 및 콩류; 효모 추출물 중 하나 이상일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "사료"는 일부 구현예에서 애완동물 식품을 포괄한다. 애완동물 식품은 애완동물에 의한 소비를 위한 식물 또는 동물 물질, 예컨대 개 식품 또는 고양이 식품이다. 애완동물 식품, 예컨대 개 및 고양이 식품은 건조 형태, 예컨대 개를 위한 건조 식품, 또는 습식 캔화 형태일 수 있다. 고양이 식품은 아미노산 타우린을 함유할 수 있다.
동물 사료에는 또한 어류 식품이 포함될 수 있다. 어류 식품은 보통 포획 어류의 우수한 건강을 유지하기 위해 필요한 다량 영양소, 미량 요소 및 비타민을 함유한다. 어류 식품은 플레이크, 펠렛 또는 정제 형태일 수 있다. 그 일부가 빠르게 가라앉는, 펠렛화된 형태가 종종 대형 어류 또는 하부 섭취 종을 위해 이용된다. 일부 어류 식품은 또한 관상용 어류의 색상을 인공적으로 증강시키기 위해 첨가제, 예컨대 베타 카로틴 또는 성 호르몬을 함유한다.
또 다른 양태에서, 동물 사료는 조류 식품을 포괄한다. 조류 식품에는 조류 사육자에서 그리고 애완동물 조류에 섭취시키기 위해 모두 이용되는 식품이 포함된다. 전형적으로 조류 식품은 다양한 종자를 포함하지만, 또한 지방(소 또는 양고기 지방)을 포괄한다.
본원에서 사용되는 용어 "접촉된"은 산물(예컨대 사료)에 대한 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제(또는 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 포함하는 조성물)의 간접 또는 직접 적용을 나타낸다. 이용될 수 있는 적용 방법의 예에는, 비제한적으로 사료 첨가제 조성물을 포함하는 물질 중 제품의 처리, 사료 첨가제 조성물과 제품의 혼합에 의한 직접 적용, 제품 표면 상으로의 사료 첨가제 조성물의 스프레이 또는 사료 첨가제 조성물의 제조물 내로의 제품 침지가 포함된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 사료 첨가제 조성물은 바람직하게는 제품(예컨대 사료물)과 혼합된다. 대안적으로, 사료 첨가제 조성물에는 사료물의 에멀젼 또는 원료 성분에 포함될 수 있다. 이는 조성물이 퍼포먼스 이익을 부여할 수 있도록 한다.
용어 "열적으로 안정한"은 명시된 온도까지의 가열 전에 첨가제에 존재했던/활성이 있던 효소의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 98%가 실온까지 냉각된 후 여전히 존재함을/활성이 있음을 의미한다. 바람직하게는, 명시된 온도까지의 가열 전에 첨가제에 존재하고 활성이 있는 효소의 적어도 약 80%가 실온까지 냉각된 후 여전히 존재하며 활성이 있다.
또한 본원에 기재된 알파-L-푸코시다제(또는 알파-L-푸코시다제를 포함하는 조성물)는 균질화되어 분말을 생산할 수 있다.
대안적인 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제(또는 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 포함하는 조성물)는 본원에 참조로 포함되는 WO2007/044968(TPT 과립으로 나타냄) 또는 W01997/016076 또는 W01992/012645에 기재된 바와 같이 과립으로 제형화될 수 있다. "TPT"는 열 보호 기술(Thermo Protection Technology)을 의미한다.
또 다른 양태에서, 사료 첨가제 조성물가 과립으로 제형화되는 경우, 과립은 단백질 코어 상에 코팅된 수화된 배리어 염을 포함한다. 이러한 염 코팅의 장점은 개선된 열-관용성, 개선된 저장 안정성 및 다른 경우 효소 상에 유해 효과를 갖는 다른 사료 첨가제에 대한 보호이다. 바람직하게는, 염 코팅을 위해 이용된 염은 20℃에서 0.25 초과 수분 활성 또는 60% 초과의 일정한 습도를 갖는다. 일부 구현예에서, 염 코팅은 Na2S04를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제(또는 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 포함하는 조성물)의 제조 방법은 또한 분말을 펠렛화하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 분말은 당분야에 공지된 다른 성분과 혼합될 수 있다. 분말, 또는 분말을 포함하는 혼합물은 다이를 통해 밀려나갈 수 있고, 생성 가닥은 다양한 길이의 적합한 펠렛으로 절단된다.
선택적으로, 펠렛화 단계에는 펠렛의 형성 전에, 증기 처리, 또는 컨디셔닝 단계가 포함될 수 있다. 분말을 포함하는 혼합물은 컨디셔너, 예컨대 증기 주입을 포함하는 혼합기에 배치될 수 있다. 혼합물은 명시된 온도, 예컨대 60~100℃까지 컨디셔너에서 가열되며, 전형적 온도는 70℃, 80℃, 85℃, 90℃ 또는 95℃일 것이다. 잔류 시간은 수 초 내지 수 분, 심지어 수 시간으로 변할 수 있다. 예컨대 5초, 10초, 15초, 30초, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분 및 1시간. 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 본원에 기재된 알파-L-푸코시다제(또는 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 포함하는 조성물)가 임의의 적절한 사료 물질에 대한 첨가에 적합함이 이해될 것이다.
당업자에게는 상이한 동물이 상이한 사료물을 필요로 하며, 동물이 양육되는 목적에 따라, 심지어 동일한 동물이 상이한 사료물을 필요로 할 수 있음이 이해될 것이다.
선택적으로, 사료물은 또한 추가 미네랄, 예컨대 칼슘 및/또는 추가 비타민을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 사료물은 옥수수 대두 음식 혼합물이다.
사료물은 전형적으로 원료 물질이 먼저 적합한 입자 크기로 분쇄된 후 적절한 첨가제와 혼합되는 사료 밀로 생산된다. 이어서 사료물은 매시 또는 펠렛으로 생산될 수 있다; 후자에는 전형적으로 온도가 표적 수준까지 상승된 후 사료가 다이를 통해 통과되어 특정한 크기의 펠렛을 생산하는 방법이 관여된다. 펠렛은 냉각되도록 허용된다. 이후 액체 첨가제, 예컨대 지방 및 효소가 첨가될 수 있다. 사료물의 생산에는 또한 펠렛화 전에, 특히 적어도 증기의 이용이 포함될 수 있는 적합한 기법에 의한 압출 또는 팽창이 포함되는 추가 단계가 관여될 수 있다.
사료물은 단위 동물, 예컨대 가금(예를 들어, 구이용, 산란용, 구이용 육종용, 칠면조, 오리, 거위, 고니), 및 멧돼지(모든 연령 범주), 반추동물, 예컨대 소(예컨대 젖소 또는 황소(송아지 포함)), 말, 양, 애완동물(예를 들어 개, 고양이) 또는 어류(예를 들어 소화관 비보유 어류, 소화관 보유 어류, 담수 어류, 예컨대 연어, 대구, 송어 및 잉어, 예컨대 코이(koi) 잉어, 염수 어류, 예컨대 씨 바스(sea bass), 및 갑각류, 예컨대 새우, 홍합 및 조가비)를 위한 사료물일 수 있다. 바람직하게는 사료물은 돼지를 위한 것이다.
사료 첨가제 조성물 및/또는 이를 포함하는 사료물은 임의의 적합한 형태로 이용될 수 있다. 사료 첨가제 조성물은 고체 또는 액체 제조물 또는 이의 대안물의 형태로 이용될 수 있다. 고체 제조물의 예에는 분말, 페이스트, 볼루스, 캡슐, 펠렛, 정제, 분진, 및 수화 가능하거나, 스프레이-건조되거나, 동결-건조될 수 있는 과립이 포함된다. 액체 제조물의 예에는 비제한적으로 수성, 유기 또는 수성-유기 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다.
일부 적용에서, 사료 첨가제 조성물은 사료와 혼합되거나 음용수에 투여될 수 있다.
사료 첨가제 조성물은 본원에서 교시된 바와 같은 푸코시다제를 사료 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하는 단계, 및 (선택적으로) 패키지화하는 단계를 포함한다.
사료물 및/또는 사료 첨가제 조성물은 적어도 하나의 미네랄 및/또는 적어도 하나의 비타민과 조합될 수 있다. 이렇게 유도된 조성물은 본원에서 프리믹스로 나타낼 수 있다. 사료물은 적어도 0.0001중량%의 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 적합하게는, 사료물은 적어도 0.0005중량%; 적어도 0.0010중량%; 적어도 0.0020중량%; 적어도 0.0025중량%; 적어도 0.0050중량%; 적어도 0.0100중량%; 적어도 0.020중량%; 적어도 0.100중량% 적어도 0.200중량%; 적어도 0.250중량%; 적어도 0.500중량%의 사료 첨가제를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 식품 또는 사료 첨가제 조성물은 적어도 하나의 생리적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 생리적으로 허용 가능한 담체는 바람직하게는 말토덱스트린, 석회석(칼슘 카보네이트), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, Na[2]S0[4], 활석, PVA 및 이의 혼합물 중 적어도 하나로부터 선택된다. 추가 구현예에서, 식품 또는 사료 첨가제는 금속 이온 킬레이터를 추가로 포함할 수 있다. 금속 이온 킬레이터는 EDTA 또는 시트르산으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 식품 또는 사료 첨가제 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 적어도 0.0001 g/kg, 0.001 g/kg, 적어도 0.01 g/kg, 적어도 0.1 g/kg, 적어도 1 g/kg, 적어도 5 g/kg, 적어도 7.5 g/kg, 적어도 10.0 g/kg, 적어도 15.0 g/kg, 적어도 20.0 g/kg, 적어도 25.0 g/kg의 수준으로 포함한다. 일부 구현예에서, 식품 또는 사료 첨가제는 식품 또는 사료 물질에 첨가되는 경우, 사료 물질이 1~500 mg/kg, 1~100 mg/kg, 2~50 mg/kg 또는 2~10 mg/kg 범위의 알파-L-푸코시다제를 포함하도록 하는 수준으로 알파-L-푸코시다제를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 식품 또는 사료 물질은 사료 또는 식품 물질 1 kg 당 적어도 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000, 20000, 30000, 50000, 100000, 500000, 1000000 또는 2000000 단위의 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제를 포함한다. 일부 구현예에서, 한 단위의 α-1,2-푸코시다제 활성은 실시예 2에 기재된 검정 조건 하에 2'-푸코실락토스로부터 분 당 1 ㎛ole L-푸코스의 방출을 촉매할 수 있는 효소의 양으로 정의될 수 있다.
범위에는 비제한적으로 위에서 논의된 임의의 하한 및 상한 범위의 조합이 포함될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 임의의 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제 및 본원에 기재된 조성물을 포함하는 제형물은 제형물이 활성 효소를 포함하는 것을 보장하기 위한 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 제형물은 액체, 건조 분말 또는 과립일 수 있다. 바람직하게는, 사료 첨가제 조성물은 사료 펠렛 상으로 또는 사료 펠렛에 첨가하기 적합한 고체 형태이다.
건조 분말 또는 과립은 당업자에게 공지된 수단, 예컨대 고전단 제립, 드럼 제립, 압출, 구형화, 유동층 응집, 유동층 스프레이 건조에 의해 제조될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제 및 본원에 기재된 조성물은 코팅, 예를 들어 캡슐화될 수 있다. 하나의 구현예에서, 코팅은 열로부터 효소를 보호하며, 열보호제로 간주될 수 있다. 하나의 구현예에서, 코팅은 낮은 pH로부터 효소를 보호한다. Eudragit®은 이용될 수 있는 코팅 물질의 하나의 예이다.
본원에 기재된 사료 첨가제 조성물은 WO2007/044968(TPT 과립으로 나타냄) 또는 WO1997/016076 또는 WO1992/012645(그 각각이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 건조 분말 또는 과립으로 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 동물 사료는 코어; 활성 제제; 및 적어도 하나의 코팅을 포함하는 사료 조성물을 위한 과립으로 제형화될 수 있고, 과립의 활성 제제는 a) 사료 펠렛화 공정, b) 증기-가열 사료 전처리 공정, c) 저장, d) 펠렛화되지 않은 혼합물 중의 성분으로 저장, 및 e) 미량 미네랄, 유기산, 환원당, 비타민, 콜린 클로라이드, 및 산성 또는 염기성 사료 기재 혼합물 또는 사료 프리믹스를 생성하는 화합물로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 사료 기재 혼합물 또는 사료 프리믹스 중 성분으로 저장 중 하나 이상으로부터 선택되는 조건 후 적어도 50% 활성, 적어도 60% 활성, 적어도 70% 활성, 적어도 80% 활성을 보전한다.
과립에 대해 적어도 하나의 코팅은 과립의 적어도 55% w/w를 구성하는 수분 수화 물질을 포함할 수 있고/있거나; 적어도 하나의 코팅은 2개의 코팅을 포함할 수 있다. 2개의 코팅은 수분 수화 코팅 및 수분 배리어 코팅일 수 있다. 일부 구현예에서, 수분 수화 코팅은 과립의 25% 내지 60% w/w일 수 있고 수분 배리어 코팅은 과립의 2% 및 15% w/w일 수 있다. 수분 수화 코팅은 무기 염, 수크로스, 전분, 및 말토덱스트린으로부터 선택될 수 있고, 수분 배리어 코팅은 중합체, 고무, 유장 및 전분으로부터 선택될 수 있다.
과립은 사료 펠렛화 공정을 이용해서 생산될 수 있고 사료 전처리 공정은 최대 수 분 동안 70℃ 내지 95℃, 예컨대 85℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있다.
사료 첨가제 조성물은 코어; 활성 제제로서, 과립의 활성 제제가 저장 후 및 과립이 하나의 성분인 증기-가열 펠렛화 공정 후 적어도 80% 활성을 보전하는 활성 제제; 수분 배리어 코팅; 및 과립의 적어도 25% w/w인 수분 수화 코팅으로서, 과립이 증기-가열 펠렛화 공정 전 0.5 미만의 수분 활성을 가지는 수분 수화 코팅을 포함하는 동물 사료용 과립으로 제형화될 수 있다.
과립은 중합체 및 고무로부터 선택되는 수분 배리어 코팅을 가질 수 있고 수분 수화 물질은 무기 염일 수 있다. 수분 수화 코팅은 과립의 25% 내지 45% w/w일 수 있고 수분 배리어 코팅은 과립의 2% 내지 10% w/w일 수 있다.
과립은 최대 수 분 동안 85℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있는 증기-가열 펠렛화 공정을 이용해서 생산될 수 있다.
대안적으로, 조성물은 소비에 적합한 액체 제형물이며, 바람직하게는 이러한 소비 액체는 완충액, 염, 소르비톨 및/또는 글리세롤 중 하나 이상을 함유한다.
또한, 사료 첨가제 조성물은 적용에 의해, 예컨대 담체 기재, 예컨대 분쇄 밀 상으로 효소(들)의 스프레이에 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 사료 첨가제 조성물은 프리믹스로 제형화될 수 있다. 단지 예로서, 프리믹스는 하나 이상의 사료 성분, 예컨대 하나 이상의 미네랄 및/또는 하나 이상의 비타민을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 DFM 및/또는 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제(캡슐화되건 캡슐화되지 않건) 및/또는 적어도 하나의 프로테아제는 말토덱스트린, 석회석(칼슘 카보네이트), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, Na2SO4, 활석, PVA, 소르비톨, 벤조에이트, 소르베이트, 글리세롤, 수크로스, 프로필렌 글리콜, 1,3-프로판 디올, 글루코스, 파라벤, 나트륨 클로라이드, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 칼슘, 메타바이설파이트, 포르메이트 및 이의 혼합물 중 적어도 하나로부터 선택되는 적어도 하나의 생리적으로 허용 가능한 담체와 제형화된다.
일부 구현예에서, 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 알파-L-푸코시다제는 생리적으로 허용 가능한 담체 중에 있을 것이다. 적합한 담체는 대형의, 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어 미네랄 산 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트가 이용될 수 있다. 치료 조성물 중 약학적으로 허용 가능한 담체는 추가로 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 수화제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자에 의한 섭취를 위한 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있도록 한다. 일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에 직접 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 구현예에서, 조성물은 인간 대상체에 대한 투여를 위해 채택된다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 비제한적 예에는 다음이 포함된다:
1. 동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법으로서, 병원성 감염 및/또는 설사는 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하고, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 글리코시드 가수분해효소가 알파-L-푸코소시다제인 방법.
3. 구현예 2에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95) 및 글리코시드 가수분해효소 패밀리 29(GH29)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
4. 구현예 2에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 단독으로 또는 (a) 혈액형 A 항원을 혈액형 H 항원으로 전환시킬 수 있거나 (b) 혈액형 B 항원을 혈액형 H 항원으로 전환시킬 수 있는 효소와 함께 글리칸-함유 구조로부터 말단 알파-1,2-결합 푸코스기를 제거할 수 있는 방법.
5. 구현예 1에 있어서, 병원체가 F18 가는 털을 발현하는 에스체리키아 콜라이인 방법.
6. 구현예 1 또는 2에 있어서, 방법이 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 유효량의 글리코시드 가수분해효소 또는 알파-L-푸코시다제를 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
7. 구현예 6에 있어서, 방법이 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물 및 적어도 하나의 프로테아제와 함께 유효량의 글리코시드 가수분해효소 또는 알파-L-푸코시다제를 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
8. 구현예 1 또는 7에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 캡슐화되는 방법.
9. 구현예 6에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 캡슐화되는 방법.
10. 구현예 1 또는 7에 있어서, 알파-L-푸코시다제 및/또는 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 프로테아제가 동물 사료 또는 프리믹스에 투여되는 방법.
11. 구현예 6에 있어서, 알파-L-푸코시다제 및/또는 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 프로테아제가 동물 사료 또는 프리믹스에 투여되는 방법.
12. 구현예 1 또는 7에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 과립 형태인 방법.
11. 구현예 6에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 과립 형태인 방법.
12. 동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 조성물로서, 병원성 감염은 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하고, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 조성물.
13. 구현예 12에 있어서, 글리코시드 가수분해효소가 알파-L-푸코소시다제인 조성물.
14. 구현예 13에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95) 및 글리코시드 가수분해효소 패밀리 29(GH29)로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
15. 구현예 13에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 단독으로 또는 (a) 혈액형 A 항원을 혈액형 H 항원으로 전환시킬 수 있거나 (b) 혈액형 B 항원을 혈액형 H 항원으로 전환시킬 수 있는 효소와 함께 글리칸-함유 구조로부터 말단 알파-1,2-결합 푸코스기를 제거할 수 있는 조성물.
16. 구현예 12에 있어서, 병원체가 F18 가는 털을 발현하는 에스체리키아 콜라이인 조성물.
17. 구현예 12 또는 13에 있어서, 상기 조성물이 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물을 추가로 포함하는 조성물.
18. 구현예 17에 있어서, 상기 조성물이 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물 및 적어도 하나의 프로테아제를 추가로 포함하는 조성물.
19. 구현예 12 또는 18에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 캡슐화되는 조성물.
20. 구현예 17에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 캡슐화되는 조성물.
21. 구현예 12 또는 18에 있어서, 알파-L-푸코시다제 및/또는 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 프로테아제가 사료 또는 프리믹스로 동물에게 투여되는 조성물.
22. 구현예 17에 있어서, 알파-L-푸코시다제 및/또는 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 적어도 하나의 프로테아제가 사료 또는 프리믹스로 동물에게 투여되는 조성물.
23. 구현예 12 또는 18에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 과립 형태로 투여되는 조성물.
24. 구현예 17에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 과립 형태로 투여되는 조성물.
실시예
본원에 달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991)]는 당업자에게 본 개시에서 사용되는 여러 용어의 일반 사전을 제공한다.
본 개시는 다음 실시예에서 추가로 정의된다. 실시예는 소정 구현예를 나타내지만, 단지 예로서 주어짐이 이해되어야 한다. 위에서의 논의 및 실시예로부터, 당업자는 본 개시의 본질적 특징을 확인할 수 있고, 이의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고, 다양한 변화 및 변경을 수행하여 다양한 용도 및 조건에 적응시킬 수 있다.
일반 방법
표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법은 당분야에 널리 공지되어 있으며 문헌[Sambrook, J. and Russell, D., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); 및 Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor, NY (1984); 및 Ausubel, F. M. et. al., Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. Current Protocols and John Wiley and Sons, Inc., N.Y., 2002]에 기재되어 있다.
실시예 1
푸코시다제의 동정, 클로닝 및 발현
문헌 리뷰에 기반하여, α-1,2-L-푸코시다제를 2가지 글리코실 가수분해효소(GH) 패밀리, GH29 및 GH95(CaZy(탄수화물-활성 효소) 분류)로 그룹화한다. 이들 두 GH 패밀리에 속하는 단백질 서열을 CaZy 및 NCBI 데이터베이스로부터 풀링해내고, 소프트웨어 Mega 6을 이용하여 계통학적으로 분석하였다. 몇몇 대표적 GH95 및 GH29 푸코시다제를 발현을 위해 이의 계통학적 분포 및 생물학적 기원을 참조해서 선택하였다(프로바이오틱스 유래 푸코시다제가 선호됨). 발현된 푸코시다제 목록을 표 1에 나타낸다.
본 연구에서 발현된 푸코시다제 효소 목록
접근 번호 고유 ID 분류 유기체 패밀리
WP_008767711 CRC08377 박테리아 박테로이데스 세타이오타오마이크론(Bacteroides thetaiotaomicron) GH29
WP_039972502 CRC08378 박테리아 박테로이데스 피오게네스(Bacteroides pyogenes) GH29
WP_049703438 CRC08379 박테리아 박테로이데스 종(Bacteroides sp .) GH29
WP_044155292 CRC08380 박테리아 박테로이데스 인테스티날리스(Bacteroides intestinalis) GH29
WP_005799023 CRC08381 박테리아 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) GH29
WP_005826218 CRC08382 박테리아 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis) GH29
AIF89911 CRC08390 박테리아 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum) GH95
ACJ53393 CRC08391 박테리아 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum) GH95
AAQ72464 CRC08392 박테리아 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) GH95
ADV44858 CRC08394 박테리아 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) GH95
ALJ60603 CRC08396 박테리아 박테로이데스 헬코게네스(Bacteroides helcogenes) GH95
ACD04030 CRC08400 박테리아 악케르만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) ATCC BAA-83 GH95
AKA50945 CRC08401 박테리아 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) GH95
EFC70146 CRC08505 박테리아 프레보텔라 종(Prevotella sp .) GH95
EWY82402 CRC08370 진균 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) GH29
A. 바실러스 서브틸리스에서 박테리아 푸코시다제의 클로닝 및 발현
성숙 박테리아 푸코시다제 서열을 인코딩하는 합성 유전자를 코돈 최적화하고 GeneRay(Shanghai, China)에 의해 합성하였다. 합성된 유전자를 p2JM 및 p3JM 벡터(Vogtentanz (2007) Protein Expr. Purif., 55:40-52) 내로 삽입하였다. 두 벡터 내로 클로닝된 유전자는 aprE 프로모터의 제어 하에 있으며, p2JM 벡터가 B. 서브틸리스에서 표적 단백질 분비를 지시하기 위해 이용된 aprE 신호 서열, 및 표적 단백질의 분비를 촉진하는 펩타이드 Ala-Gly-Lys을 인코딩하는 AGK-프로AprE로 명명된 올리고뉴클레오타이드를 또한 함유한다는 차이를 갖는다. p3JM 벡터 내로 삽입된 유전자에 있어서, 시작 코돈 및 성숙 단백질을 인코딩하는 유전자 서열을 aprE 프로모터 바로 뒤에 배치하였다. 예시적 플라스미드 맵을 도 1a 및 1b에 나타낸다.
플라스미드를 Illustra TempliPhi 100 증폭 키트(GE Healthcare Life Sciences, NJ)를 이용해서 증폭하였다. 적합한 B. 서브틸리스 균주를 당분야에 공지된 방법(WO 01/14490)을 이용해서 증폭 산물로 형질전환하였다. B. 서브틸리스 형질전환체를 5 ppm 클로람페니콜이 보충된 Luria Agar 플레이트 상에서 선택하였다. 형질전환 플레이트로부터의 콜로니를 5 ml LB 배지 중에 접종하고 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플라스미드를 보유하는 B. 서브틸리스 형질전환체의 선택적 성장을 5 ppm 클로람페니콜을 함유하는 MBD 배지(MOP 완충액에 기반한 농축 반-정의된 배지로서, 주요 질소원으로 요소, 주요 탄소원으로 글루코스를 포함하며, 세포 성장을 다시 부스팅하기 위해 4% 소이톤(soytone)이 보충됨) 중 40시간 동안 37℃에서 수행하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 세포 및 상청액을 모두 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 박테리아 푸코시다제 발현을 SDS-PAGE 겔 상에서 가시적인 단백질 밴드로 확인하였다.
B. 트리코더마 리이세이에서 선택된 푸코시다제의 클로닝 및 발현
진균 푸코시다제 유전자를 예측된 단백질 서열에 기반하여 코돈 최적화하고 GeneRay(Shanghai, China)에 의해 합성하였다. 합성되고 또한 증폭된 유전자를 pGXT 벡터(공개된 PCT 출원 WO2015/017256에 기재된 pTTTpyr2 벡터와 동일함) 내로 삽입하였다. pGXT 벡터에 클로닝된 유전자는 CBH1 프로모터의 제어 하에 있으며, 고유 신호 펩타이드를 발현을 위해 이용한다. 예시적 플라스미드 맵을 도 2에 나타낸다.
적합한 트리코더마 리이세이 균주를 원형질체 형질전환(Te'o et al. (2002) J. Microbiol. Methods 51:393-99)을 이용하여 발현 플라스미드로 형질전환하였다(공개된 PCT 출원 WO 05/001036에 기재된 방법). 형질전환체를 단독 질소원으로 아세트아미드를 함유하는 배지 상에서 선택하였다. 아세트아미드 플레이트 상에서 5일 성장 후, 형질전환체를 수집하고 글루코스 및 소포로스 혼합물을 함유하는 정의된 배지 중 250 mL 진탕 플라스크 내 발효를 거쳤다. 발효 액체배지의 상청액을 여과에 의해 수집하고 발현에 대해 SDS-PAGE를 거쳤다. 진균 푸코시다제 발현은 SDS-PAGE 겔 상의 가시적 단백질 밴드로 확인하였다.
실시예 2
푸코실락토스 기질을 이용한 푸코시다제의 생화학적 특성규명
1. 미정제 배양 상청액 중 α-1,2-푸코시다제 활성에 대한 검정
활성 α-1,2-푸코시다제를 확인하기 위해, 발현된 박테리아 및 진균 푸코시다제의 미정제 배양 상청액을 10 mM 2'-푸코실락토스를 기질로 이용하여 37℃에서 검정하였다. 각각 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.0) 및 50 mM NaOH-HEPES 완충액(pH 8.2) 중 45 ㎕ 기질 용액에 5 ㎕ 미정제 샘플을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 발현된 효소를 포함하지 않는 미정제 샘플을 블랭크 대조군으로 동일한 조건 하에 검정하였다. 10분 후, 방출된 L-푸코스를 K-푸코스 키트(Megazyme, Ireland)를 이용하여 검출하였다. 340 nm에서의 흡광도로 측정되는, 관찰된 푸코시다제 활성(효소 블랭크가 감산됨)을 도 3에 보고한다.
2. α-1,2-푸코시다제 고유 활성의 측정
몇몇 발현된 푸코시다제를 추가 특성규명을 위해 정제하였다. 정제된 푸코시다제의 고유 활성을 10 mM 2'-푸코실락토스로 측정하였다. 반응 전에, 적절한 용량(예컨대 5 ppm)부터 시작해서 6회의 2배 연속 희석에 의해 효소 용액을 제조하였다. 50 mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.8) 중 45 ㎕ 기질 용액에 5 ㎕의 희석된 효소 샘플 또는 물(블랭크 대조군)을 첨가한 후 10분 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 반응을 개시하였다. 방출된 L-푸코스를 K-푸코스 키트를 이용하여 검출하였다. 흡광도 변화를 Y값으로 및 효소 용량을 X값으로 하여 용량 반응 곡선을 생성하고, 곡선의 선형 부분을 정제된 효소 샘플의 고유 활성의 계산을 위해 이용하였다. 1단위의 α-1,2-푸코시다제 활성은 기재된 검정 조건 하에 분 당 1 μ몰의 L-푸코스 방출을 촉매할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다. 모든 푸코시다제의 α-1,2-푸코시다제 고유 활성을 표 2에 제공하였다. 이러한 조건 하에, GH95 패밀리로부터의 박테리아 α-1,2-푸코시다제가 다른 효소보다 높은 고유 활성을 나타냄이 관찰되었다.
2'- 푸코실락토스를 기질로 이용하여 측정된 α-1,2- 푸코시다제의 고유 활성
고유 ID 유기체 고유 활성(U/mg)
CRC08377 박테로이데스 세타이오타오마이크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 26
CRC08378 박테로이데스 피오게네스(Bacteroides pyogenes) 22
CRC08379 박테로이데스 종(Bacteroides sp .) 27
CRC08380 박테로이데스 인테스티날리스(Bacteroides intestinalis) 39
CRC08381 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 44
CRC08382 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis) 32
CRC08390 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum) 475
CRC08391 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum) 593
CRC08392 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 421
CRC08394 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 107
CRC08396 박테로이데스 헬코게네스(Bacteroides helcogenes) 1306
CRC08400 악케르만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) ATCC BAA-835 40
CRC08401 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 670
CRC08505 프레보텔라 종(Prevotella sp .) 226
CRC08370 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 4
실시예 3
다양한 푸코시다제에 대한 pH 및 온도 프로필
푸코시다제를 검정하여 이의 pH 및 온도 프로필을 결정하였다. 최적 pH를 결정하기 위해, α-1,2-푸코시다제 후보가 37℃에서 2'-푸코실락토스를 가수분해하는 능력을 3.0 내지 10.0 범위의 pH로 50 mM 나트륨 아세테이트/HEPES/글리신 완충액 중에 측정하였다. 최적 온도를 결정하기 위해, 푸코시다제 후보가 50 mM 나트륨 포스페이트 완충액 중 2'-푸코실락토스를 가수분해하는 능력을 30℃ 내지 90℃에서 10°간격으로 측정하였다. 모든 반응은 2회씩 진행하고 10분 동안 수행하였다. 결과를 도 4, 5 및 표 3에 나타낸다.
선택 α-1,2- 푸코시다제의 pH 및 온도 범위 및 최적조건
푸코시다제 pH 범위 pH 최적조건 T 범위 T 최적조건
CRC08380 4.8~6.8 6.0 32~55 50
CRC08391 4.5~7.4 5.0 30~73 60
CRC08396 5.2~7.7 6.0~7.0 <30~58 50
실시예 4
낮은 pH 및 펩신의 존재 하에 푸코시다제의 활성 평가
α-1,2-푸코시다제 후보의 낮은 pH에서의 푸코시다제 활성 및 펩신 내성을 평가하기 위해, 효소 샘플을 각각 50 mM 글리신-HCl 완충액(pH 3.5) 및 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.0) 중 펩신(Sigma, Cat. No. P7000)과 인큐베이션하였다. 100 ppm 푸코시다제를 1:0, 1:2.5, 1:25, 및 1:250의 비율로 펩신과 혼합하고 효소 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하였다. 한편, 100 ppm 푸코시다제를 37℃ 및 4℃에서 단독으로 50 mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.8) 중에 인큐베이션하였다(대조군으로). 30분 인큐베이션 후, 효소 샘플을 적절한 용량으로 희석한 후 50 mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.8) 중 37℃에서 2'-푸코실락토스로 검정하였다. 정제수를 블랭크 대조군으로 동일한 조건 하에 검정하였다. 잔여 α-1,2-푸코시다제 활성을 100 × 전체 OD340(인큐베이션된 효소)/전체 OD340(4℃에서 저장된 효소)으로 계산하였다. 모든 반응은 2회씩 수행하였다. 도 6a 및 6b에 예시된 결과는 박테리아 α-1,2-푸코시다제가 본 검정의 산성 조건(pH 3.5) 하에 비관용적이었으나, 산성이 더 약한 조건(pH 5.0) 하에서는 안정하였음을 나타낸다.
실시예 5
다양한 천연 기질 상에서 푸코시다제 활성의 평가
α-1,2-푸코시다제 후보의 가수분해 활성을 돼지 위 뮤신(II형) 및 H 항원 삼당류(I형)에 대해 평가하였다. 40 mg/mL 돼지 위 뮤신(II형)의 가수분해는 2 및 20 ppm의 효소 샘플을 이용해서 검정한 반면 3 mM H 항원 삼당류(I형)의 가수분해는 0.25 ppm 및 1 ppm의 효소 샘플을 이용하여 검정하였다. 두 반응을 모두 실시예 4의 섹션 2에 기재된 검정 조건을 이용하여 10분 동안 수행하였다. 모든 반응을 50 mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.8) 중 37℃에서 수행하였다. 정제수를 블랭크 대조군으로 동일한 조건 하에 검정하였다. CRC08400를 제외한 GH95 패밀리로부터의 박테리아 α-1,2-푸코시다제가 뮤신 및 H 항원 삼당류(I형) 둘 다에 대해 더 높은 가수분해 활성을 나타내었음이 도 7 및 8에 예시된다. 구체적으로, CRC08392는 뮤신 분해에 대해 최고 활성을 나타낸 반면(표 4), CRC08394 및 CRC08401은 H 항원 삼당류(I형)의 가수분해에서 가장 활성이 높았다(도 8).
기질로서 돼지 위 뮤신(II형)을 이용한 α-1,2- 푸코시다제의 가수분해 고유 활성
푸코시다제 고유 활성(U/mg)
CRC08392 459
CRC08394 120
CRC08396 40
CRC08401 21
CRC08505 29
실시예 6
시험관내 장 세포 배양으로의 F18 + ETEC 균주의 부착에 대한 푸코시다제의 효과
신생 돼지 공장 유래 IPEC-1(ACC-705; DSMZ, Braunschweig, Germany) 세포를 96-웰 플레이트(NUNC)에 씨드접종하고 16시간 동안 부착하도록 둔다. 대조군 웰은 세포 없이 배양 배지만을 수용하여 대조군으로 작용한다. 푸코시다제를 완충액 1(12.5 mM HEPES, 141 mM NaCl, 0.5 mM MgCl2, 0.15 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 6) 중에 희석하고, 100 ㎕의 총 부피 중 2, 20, 또는 200 ppm의 최종 농도로 IPEC-1 세포 또는 배지만 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 플레이트를 100 ㎕의 완충액 2(12.5 mM HEPES, 141 mM NaCl, 0.5 mM MgCl2, 0.15 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)로 세척한다. IPEC-1 세포에 대한 F18 ETEC의 부착은 본 실험에서 면역글로불린과의 인큐베이션 없이 F18+ ETEC 균주를 이용하는 것을 제외하고, 본질적으로 문헌[Hedegaard CJ, Strube ML, Hansen MB, Lindved BK, Lihme A, Boye M, et al. (2016). Natural Pig Plasma Immunoglobulins Have Anti-Bacterial Effects: Potential for Use as Feed Supplement for Treatment of Intestinal Infections in Pigs. PLoS ONE 11(1): e0147373]에 기재된 바와 같이 측정한다.
실시예 7
생체내 감소된 F18 ETEC 집락회에 대한 푸코시다제의 효과
A. 제어 방출 푸코시다제 과립의 제조
제어 방출 푸코시다제 과립을 아래의 표 5의 방식을 이용하여 제조한다. 벡터 FL-1 유동층 코팅기 내로, 150 내지 355마이크론으로 체질된 670그램의 나트륨 설페이트 결정(Minera Santa Marta, Spain)을 과립 코어로 첨가한다. 코어를 입구 온도 70℃, 및 유동화 기류 50 cfm으로 유동화한다. 부분 가수분해된 폴리비닐 알코올인 Erkol 5-88(Erkol Corporation, Guardo, Spain)의 16% w/w 수용액 250그램과 함께 잘 혼합된 25% w/w 푸코시다제 효소 초여과 농축물 400그램으로 구성되는 효소 용액을 제조한다. "SP1"로 명명된 효소-PVA 용액을 70℃ 입구 온도를 유지하면서, 분무압 20 psi 및 스프레이 속도 7그램/분으로, 30분 후 분 당 12그램까지 증가시키며 유동화된 코어 상에 스프레이한다. 15% w/w PVA 용액 250그램과 30% 활석 현탁액 200그램을 조합하여 PVA/활석 용액(SP2)을 제조한다. PVA/활석 혼합물을 위에서의 입구 온도 및 분무압을 유지하면서, 10 g/분의 속도로 효소 코팅된 코어 상에 스프레이한다. 25% w/w 나트륨 설페이트 용액(SP3) 2킬로그램을 위에서의 입구 온도 및 분무압을 유지하면서, 15 g/분의 스프레이 속도로 PVA/활석-코팅 코어 상에 스프레이한다. 마지막으로, 위에서의 입구 온도 및 분무압을 유지하면서, 30% w/w Eudragit L 30 D-55 라텍스 현탁액(Evonik Corporation, Kennesaw, Georgia) 1200그램을 30% w/w 활석 현탁액 800그램과 조합하여 제어 방출 코팅(SP4)을 제조한다. Vector FL-1 코팅기로부터, 2000그램의 제어 방출 푸코시다제 과립을 수확한다.
제어 방출 푸코시다제 과립의 제조
층 성분 용액
(g) 		용액
% w/w 		고체
(g) 		과립
% w/w
코어 나트륨 설페이트 670 100% 670 33.5%
SP1 푸코시다제 400 25% 100 5.0%
SP1 PVA 250 16% 40 2.0%
SP2 PVA 200 15% 30 1.5%
SP2 활석 200 30% 60 3.0%
SP3 나트륨 설페이트 2000 25% 500 25.0%
SP4 Eudragit L 30 D-55 1200 30% 360 18.0%
SP4 활석 800 30% 240 12.0%
총 2000 100.0%
B. 감소된 F18 ETEC 집락화에 대한 푸코시다제 식이의 효과
실시예 7 섹션 A의 제어 방출 푸코시다제 과립을 1톤 당 1,000그램의 용량으로 옥수수 콩 사료와 조합한다. 과립을 야윈 새끼돼지에게 섭취시킨다.　제어 방출 코팅은 푸코시다제가 위(대략 pH 3에서)를 통한 통과 동안 방출되는 것을 방지하지만, 푸코시다제 효소를 새끼돼지의 장관 내로 방출하며, 푸코시다제는 알파 1,2 푸코스기를 글리칸으로부터 제거한다; 이에 의해, 장독성 F18 E. 콜라이에 의한 내장 집락화 및 연관된 설사에 대한 가능성을 유의미하게 감소시킨다.
실시예 8
소장(십이지장)으로부터의 조직 샘플에서 푸코스의 푸코시다제 유도된 방출의 평가
대략 1 cm2 조직 샘플을 혈액형을 알지 못하는 2마리의 상이한 24일령 새끼돼지(새끼돼지_1 및 새끼돼지_2)로부터의 십이지장에서 수득하였다. 이들 조직 샘플을 12 ml 튜브에 배치하고 100 ppm 푸코시다제 CRC08392(해당 접근 번호에 대해서는 표 1을 참고)를 포함하는 또는 포함하지 않는 3 ml의 검정 완충액(검정-완충액: 50 mM 나트륨 포스페이트 완충액 pH 6 + 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)으로 덮었다. 샘플을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 1개의 분취물을 제거한 뒤 나머지 샘플을 인큐베이터에 두었다. 샘플을 테이블 원심분리기로 회전 침강시켰다. 상청액을 원심분리 여과 장치(10 kDA 컷오프로)로 옮기고, 약 1시간 동안 원심분리하였다. 방출된 푸코스를 마이크로 플레이트 검정 절차에 대한 제조업체의 지침에 따라 Megazyme으로부터의 L-푸코스 키트를 이용하여 정량하였다.
도 11에 도시된 결과는 푸코스가 푸코시다제(접근 번호 AAQ72464를 갖는 CRC08392(표 1))를 이용하여 조직 샘플로부터 방출되었음을 나타낸다. 이러한 시험관내 결과는 이 푸코시다제가 생체내 이용된 경우 예상되는 결과와 연관될 수 있는 것으로 나타난다.

Claims (24)

  1. 동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법으로서, 병원성 감염 및/또는 설사는 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하고, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 글리코시드 가수분해효소가 알파-L-푸코소시다제인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95) 및 글리코시드 가수분해효소 패밀리 29(GH29)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 단독으로 또는 (a) 혈액형 A 항원을 혈액형 H 항원으로 전환시킬 수 있거나 (b) 혈액형 B 항원을 혈액형 H 항원으로 전환시킬 수 있는 효소와 함께 글리칸-함유 구조로부터 말단 알파-1,2-결합 푸코스기를 제거할 수 있는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 병원체가 F18 가는 털을 발현하는 에스체리키아 콜라이인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 방법이 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물과 함께 유효량의 글리코시드 가수분해효소 또는 알파-L-푸코시다제를 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 방법이 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물 및 적어도 하나의 프로테아제와 함께 유효량의 글리코시드 가수분해효소 또는 알파-L-푸코시다제를 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제1항 또는 제7항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 캡슐화되는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 캡슐화되는 방법.
  10. 제1항 또는 제7항에 있어서, 알파-L-푸코시다제 및/또는 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 프로테아제가 동물 사료 또는 프리믹스에 투여되는 방법.
  11. 제6항에 있어서, 알파-L-푸코시다제 및/또는 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 프로테아제가 동물 사료 또는 프리믹스에 투여되는 방법.
  12. 제1항 또는 제7항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 과립의 형태인 방법.
    [청구항 11]
    제6항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 과립의 형태인 방법.
    [청구항 12]
    동물에서 장 병원성 감염 및/또는 설사를 예방하고/하거나 치료하기 위한 조성물로서, 병원성 감염은 동물 장 세포에 결합할 수 있는 병원체에 의해 유도되고, 상기 병원체의 결합은 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티로 치환된 적어도 하나의 글리칸 구조를 갖는 병원체 결합 부위의 존재에 의존하고, 병원체 결합 부위로부터 적어도 하나의 알파-1,2-L-푸코스 모이어티를 제거할 수 있는 유효량의 글리코시드 가수분해효소를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 글리코시드 가수분해효소가 알파-L-푸코시다제인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 글리코시드 가수분해효소 패밀리 95(GH95) 및 글리코시드 가수분해효소 패밀리 29(GH29)로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 단독으로 또는 (a) 혈액형 A 항원을 혈액형 H 항원으로 전환시킬 수 있거나 (b) 혈액형 B 항원을 혈액형 H 항원으로 전환시킬 수 있는 효소와 함께 글리칸-함유 구조로부터 말단 알파-1,2-결합 푸코스기를 제거할 수 있는 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 병원체가 F18 가는 털을 발현하는 에스체리키아 콜라이인 조성물.
  17. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 조성물이 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물을 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 조성물이 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물 및 적어도 하나의 프로테아제를 추가로 포함하는 조성물.
  19. 제12항 또는 제18항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 캡슐화되는 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 캡슐화되는 조성물.
  21. 제12항 또는 제18항에 있어서, 알파-L-푸코시다제 및/또는 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 프로테아제가 사료 또는 프리믹스로 동물에게 투여되는 조성물.
  22. 제17항에 있어서, 알파-L-푸코시다제 및/또는 적어도 하나의 직접 섭취시킨 미생물 및/또는 적어도 하나의 프로테아제가 사료 또는 프리믹스로 동물에게 투여되는 조성물.
  23. 제12항 또는 제18항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 과립 형태로 투여되는 조성물.
  24. 제17항에 있어서, 알파-L-푸코시다제가 과립 형태로 투여되는 조성물.
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