CN102803482B - 具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体，及其用途 - Google Patents

具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体，及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纤维素酶变体。特别是本发明涉及具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体。还描述了编码纤维素酶变体的核酸，包含所述纤维素酶变体的组合物，及其使用方法。

Description

具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体，及其用途
关于在联邦赞助的研究和研发中产生的发明的权利的陈述
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年6月3日提交的美国临时申请号61/183,959的权益，其通过引用全部整合到本文中。
本发明是在政府资助下产生的，具有能源部授予的条件授予编号：DE-FC36-08GO18078。政府对本发明享有一定权利。
I.领域
本发明涉及酶，特别是纤维素酶变体。还描述了编码纤维素酶变体的核酸，包含纤维素酶变体的组合物，鉴别其它有效的纤维素酶变体的方法，以及其使用方法。
II.背景
纤维素和半纤维素是由光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可以被多种微生物(例如，细菌、酵母和真菌)降解并用作能源，所述微生物产生能够将多聚底物水解为单体糖的胞外酶(Aro等人，J Biol Chem，276：24309-24314，2001)。由于不可再生来源途径的限制，纤维素成为主要的可再生能量来源的可能性是极大的(Krishna等人，Bioresource Tech，77：193-196，2001)。通过生物学过程有效的利用纤维素是克服食物、饲料和燃料短缺的一种方法(Ohmiya等人，Biotechnol Gen Engineer Rev，14：365-414，1997)。
纤维素酶是水解纤维素(β-1，4-葡聚糖或βD-糖苷连接)，导致葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等形成的酶。纤维素酶传统上分为三大类：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶(β-D-葡糖苷葡糖水解酶，EC 3.2.1.21)(“BG”)(Knowles等人，TIBTECH 5：255-261，1987；和Schulein，Methods Enzymol，160：234-243，1988)。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素纤维的无定形部分上，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素(Nevalainen和Penttila，Mycota，303-319，1995)。因此，使结晶纤维素有效溶解需要纤维素酶系统中存在纤维二糖水解酶(Suurnakki等人，Cellulose 7：189-209，2000)。β-葡糖苷酶的作用是从纤维二糖、纤维寡糖和其他葡糖苷中释放出D-葡萄糖单元(Freer，JBiol Chem，268：9337-9342，1993)。
已知多种细菌、酵母和真菌生产纤维素酶。一些真菌生产完整的纤维素酶系统，所述系统能够降解结晶形态的纤维素，使得通过发酵可以方便的大量生产纤维素酶。由于许多酵母，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)缺少水解纤维素的能力，因此丝状真菌扮演了特殊的角色(参见例如，Wood等人，Methods in Enzymology，160：87-116，1988)。
CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类可以进一步扩展至在每个分类中包括多个组分。例如，已经从多种真菌来源中分离出多个CBH、EG和BG，包括里氏木霉(Trichoderma reesei)(也称为红褐肉座菌(Hypocreajecorina))，其含有以下已知基因：两种CBH，即CBHI(“CBH1”)和CBHII(“CBH2”)；至少8种EG，即EGI、EGII、EGIII、EGIV、EGV、EGVI、EGVII和EGVIII；以及至少5种BG，即BG1、BG2、BG3、BG4和BG5。EGIV、EGVI和EGVIII也具有木葡聚糖酶的活性。
为了将结晶纤维素有效转化为葡萄糖，需要完整的纤维素酶系统，其包括来自CBH、EG和BG分类中的每种的组分，以及水解结晶纤维素时较不有效的分离组分(Filho等人，Can J Microbiol，42：1-5，1996)。在来自不同分类的纤维素酶组分之间已观察到协同关系。特别是EG类纤维素酶和CBH类纤维素酶协同的相互作用，更有效的降解纤维素。
本领域已知出于增强去垢剂组合物的清洁能力、用作软化剂、用于改善棉织物的触感和外观等目的，纤维素酶在处理纺织品时是有效的(Kumar等人，Textile Chemist and Colorist，29：37-42，1997)。已经描述了具有改善的清洁性能(美国专利号4,435,307；和英国申请号2,095,275和2,094,826)的，和用于处理织物来改善纺织品的触感和外观(美国专利号5,648,263、5,691,178和5,776,757；英国申请号1,358,599)的含纤维素酶的去垢剂组合物。因此，在真菌和细菌中生产的纤维素酶已受到了极大关注。特别是，木霉属物种(Trichoderma spp)(例如长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)或里氏木霉)的发酵已表现出产生能够降解结晶形态的纤维素的完整纤维素酶系统。
虽然之前已描述过纤维素酶组合物，仍然需要新的和改良的纤维素酶组合物。改良的纤维素组合物可用于家用去垢剂、纺织品处理、生物质转化和造纸。表现出改善的表达、活性和稳定性的纤维素酶是特别令人感兴趣的。
III.概述
本发明涉及酶，特别是纤维素酶变体。还描述了编码纤维素酶变体的核酸、包含纤维素酶变体的组合物、鉴别其它有效的纤维素酶变体的方法，以及其使用方法。
本发明提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式，并在选自5，18，19，28，30，32，35，38，79，80，89，100，102，103，104，105，111，117，119，121，125，126，133，137，138，139，140，141，143，150，158，162，177，180，181，182，185，186，188，190，191，192，193，196，201，207，225，226，228，229，230，233，234，236，240，243，245，251，252，258，267，268，274，292，293，303，304，306，307，313，319，322，328，331，338，340，346，361，362，363，364，365，371，384，394，396，400，406，407，414，417，422，427，431，433，436，440，441，443，444，445和447的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代导致与参考CBH2相比具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体。在一些实施方案中，所述变体在选自(i)由63，77，129，146，147，151，153，157，161，189，194，197，203，204，208，211，237，239，244，247，254，277，281，285，288，289，294，327，339，344，356，378，382和405组成的第一组；或(ii)由94，98，107，120，134，144，147，154，178，179，206，210，214，231，232，266，272，275，316，323，343，360，380，381，386，399，410，413，416，426和429组成的第二组的一个或多个另外的位置上包含另外的取代，其中另外的位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代选自1，2，3，4，5，6，7，8，9和10个位置。
在另一个方面，本发明提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自63，77，129，146，147，151，153，157，161，189，194，197，203，204，208，211，237，239，244，247，254，277，281，285，288，289，294，327，339，344，356，378，382和405的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是K/E，R/Q，N/D，Q/E，D/N或E/Q取代。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代导致与参考CBH2相比具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体。分离的纤维素酶变体在选自(i)由5，18，19，28，30，32，35，38，79，80，89，100，102，103，104，105，111，117，119，121，125，126，133，137，138，139，140，141，143，150，158，162，177，180，181，182，185，186，188，190，191，192，193，196，201，207，225，226，228，229，230，233，234，236，240，243，245，251，252，258，267，268，274，292，293，303，304，306，307，313，319，322，328，331，338，340，346，361，362，363，364，365，371，384，394，396，400，406，407，414，417，422，427，431，433，436，440，441，443，444，445和447组成的第一组；或(ii)由94，98，107，120，134，144，147，154，178，179，206，210，214，231，232，266，272，275，316，323，343，360，380，381，386，399，410，413，416，426，和429组成的第二组的一个或多个另外的位置上包含另外的取代，其中另外的位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代选自1，2，3，4，5，6，7，8，9和10个位置。
在另一个方面，本发明提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自94，98，107，120，134，144，147，154，178，179，206，210，214，231，232，266，272，275，316，323，343，360，380，381，386，399，410，413，416，426，和429的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是V94E，P98L，E107Q，M120L，M134G，M134L，M134V，L144G，L144R，L144S，T154A，A178V，L179C，V206L，S210L，S210R，T214M，T214Y，G231P，G231I，G231A，G231N，G231S，G231T，T232V，H266S，H266A，W272A，W272D，W272Y，N275L，S316P，V323L，V323N，V323Y，G360R，S380T，A381T，E399N，E399D，R413Y，R413P，和A416G之一。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代导致与参考CBH2相比具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体。在一些实施方案中，所述变体在选自(i)由5，18，19，28，30，32，35，38，79，80，89，100，102，103，104，105，111，117，119，121，125，126，133，137，138，139，140，141，143，150，158，162，177，180，181，182，185，186，188，190，191，192，193，196，201，207，225，226，228，229，230，233，234，236，240，243，245，251，252，258，267，268，274，292，293，303，304，306，307，313，319，322，328，331，338，340，346，361，362，363，364，365，371，384，394，396，400，406，407，414，417，422，427，431，433，436，440，441，443，444，445和447组成的第一组，或(ii)由63，77，129，146，147，151，153，157，161，189，194，197，203，204，208，211，237，239，244，247，254，277，281，285，288，289，294，327，339，344，356，378，382和405组成的第二组的一个或多个另外的位置上包含另外的取代，其中另外的位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代选自1，2，3，4，5，6，7，8，9和10个位置。
本发明还提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自111，144，154，162，410和413的1至6个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含：第111位的亮氨酸或丝氨酸；第144位的亮氨酸、谷氨酰胺或色氨酸；第154位的苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；第162位的酪氨酸或天冬酰胺；第410位的精氨酸或丝氨酸；和第413位的丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是S413Y取代。
本发明还提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自98，194，313，316，384和443的1至6个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含：第98位的脯氨酸或亮氨酸；第194位的赖氨酸、半胱氨酸或谷氨酸；第313位的丝氨酸或苏氨酸；第316位的丝氨酸或脯氨酸；第384位的甘氨酸、半胱氨酸或谷氨酰胺；和第443位的天冬酰胺或异亮氨酸；其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是P98L取代、K194E取代和S316P取代之一。
另外，本发明提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自153，161，203，233，422和444的1至6个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含：第153位的精氨酸或谷氨酰胺；第161位的天冬酰胺、丙氨酸或色氨酸；第203位的精氨酸或组氨酸；第233位的脯氨酸或天冬氨酸；第422位的谷氨酰胺或缬氨酸；和第443位的脯氨酸或谷氨酰胺；其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是R153Q取代。
另外，本发明提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自98，111，144，313，316，413和422的1至7个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含：第98位的脯氨酸或亮氨酸；第111位的亮氨酸或丝氨酸；第144位的亮氨酸或色氨酸；第313位的丝氨酸或苏氨酸；第316位的丝氨酸或脯氨酸；第413位的丝氨酸或色氨酸；和第422位的谷氨酰胺或缬氨酸；其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是P98L取代和S316P取代之一。
在本发明的另一个方面提供了纤维素酶变体，其中所述变体包含第98位的谷氨酰胺，和选自T138C、S316P、S343Q、Q362I、S386C、C400S和S406P的取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。
另外，提供了纤维素酶变体，其包含第138位的半胱氨酸，和选自S316P、S343Q、Q362I、S386C、C400S和S406P的取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。
在另一个方面提供了纤维素酶变体，其包含第316位的脯氨酸，和选自S343Q、Q362I、S386C、C400S和S406P的取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。
另外，本发明提供了纤维素酶变体，其包含第343位的谷氨酰胺，和选自Q362I、S386C、C400S和S406P的取代，其中所述位置通过对应如SEQID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。
本发明还提供了纤维素酶变体，其包含第362位的异亮氨酸，和选自S386C、C400S和S406P的取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。
在一个方面，提供了纤维素酶变体，其包含第386位的半胱氨酸，和选自C400S和S406P的取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，所述变体包含第400位的丝氨酸和第406位的脯氨酸。
另外，本发明提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自98，111，182，291，316，362和400的1至7个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含：第98位的脯氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺；第111位的亮氨酸或丝氨酸；第182位的天冬酰胺或色氨酸；第291位的丝氨酸或谷氨酸；第316位的丝氨酸或脯氨酸；第362位的谷氨酰胺、异亮氨酸或亮氨酸；和第400位的半胱氨酸或丝氨酸；其中所述位置通过对应如SEQ ID NO：3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是P98L取代或S316P取代。在一些实施方案中，所述变体还包含L439P取代或T74S取代。
在本发明的一些优选的实施方案中，概述的任意前述段落中的纤维素酶变体来源于选自红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)CBH2、康宁肉座菌(Hypocrea koningii)CBH2、特异腐质霉(Humicola insolens)CBH2、解纤维素醋弧菌(Acremonium cellulolyticus)CBH2、二孢蘑菇(Agaricusbisporus)CBH2、尖镰孢(Fusarium osysporum)EG、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)CBH2、埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)CBH2、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida.fusca)6B/E3CBH2、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)6A/E2EG和粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)CenA EG的亲本纤维素酶。在一些实施方案中，纤维素酶变体源自这样的亲本纤维素酶，所述亲本纤维素酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的成员至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，所述变体是分离的。也提供了包含纤维素酶变体的组合物。在一些优选的实施方案中，组合物富含纤维素酶变体。
在另外的方面，本发明提供了编码概述的任意前述段落中的纤维素酶变体的分离的核酸。也提供了包含与调控序列有效连接的分离的核酸的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了产生纤维素酶变体的方法，其包括在合适的条件下在培养基中培养所述宿主细胞以产生所述纤维素酶变体。
还提供了包含概述的任意前述段落中的纤维素酶变体的组合物。在一些优选的实施方案中，组合物还包括至少一种其它的酶，所述酶选自枯草杆菌蛋白酶、中性金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶和过氧化物酶。本发明还提供了清洁或织物护理的方法，其包括将包含织物的表面或物品与组合物接触。另外，还提供了去球(depilling)和表面光洁处理(surfacefinish)的方法，其包括将包含织物的表面或物品与组合物接触。
在一些优选的实施方案中，提供了将生物质转化为糖的方法，其包括将所述生物质与概述的任意前述段落中的纤维素酶变体接触。在一些优选的实施方案中，提供了生产燃料的方法：将生物质组合物与包含概述的任意前述段落中的纤维素酶变体的酶促组合物接触来生产糖溶液；和在足以生产燃料的条件下培养含发酵微生物的糖溶液。
本发明的其它目标、特征和优点根据下文详述的说明可以是显而易见的。然而应该理解，当表示本发明的优选的实施方案时，仅通过示例的方式给出详细的说明和特定的实施例，因为根据本详细的说明书，在本发明的范围和精神下，各种改变和修饰对本领域技术人员是显而易见的。
VI.附图简介
图1提供了成熟形态的各种纤维素酶的氨基酸序列的比对：红褐肉座菌(也称为里氏木霉)CBH2(SEQ ID NO：3)、康宁肉座菌CBH2(SEQ IDNO：4)、特异腐质霉CBH2(SEQ ID NO：5)、解纤维素醋弧菌CBH2(SEQ IDNO：6)、二孢蘑菇CBH2(SEQ ID NO：7)、尖镰孢EG(SEQ ID NO：8)、黄孢原毛平革菌CBH2(SEQ ID NO：9)、埃默森篮状菌CBH2(SEQ ID NO：10)、褐色嗜热裂孢菌6B/E3CBH2(SEQ ID NO：11)、褐色嗜热裂孢菌6A/E2EG(SEQ ID NO：12)和粪肥纤维单胞菌CenA EG(SEQ ID NO：13)。
图2A提供了作为CBH2SEL的电荷改变产物，预处理玉米秸秆(cornstover)(PCS)测定中观察到的获胜者对预期的获胜者的相对频率的图。减少的CBH2电荷导致显著更高的PCS测定的获胜者频率。图2B提供了作为CBH2SEL的电荷改变产物，观察到的磷酸膨胀纤维素(PASC)测定的获胜者对预期的获胜者的相对频率的图。在没有电荷改变的变体中观察到显著更高的PASC获胜者频率。
图3提供了pTTTpyrG-cbh2的质粒图。
图4提供了里氏木霉ku80缺失盒的示意图。
图5说明了天然ku80基因的失活，原因是将其替换为als选择标记物。
图6提供了里氏木霉pyr2缺失盒的示意图，其中天然pyr2基因失活，原因是将其替换为hygR选择标记物和amdS片段。
图7提供了里氏木霉hygR缺失盒的示意图，其中异源hygR基因失活，原因是将其替换为pyr2选择标记物。
图8提供了里氏木霉bgl1缺失盒的示意图。
图9提供了里氏木霉egl3缺失盒的示意图。
图10提供了用于表达cre重组酶的里氏木霉端粒质粒载体的示意图。
图11说明了pyr2选择标记物的失活和amdS选择标记物的活化，原因是引入了目的基因(GOI)的多核苷酸。在示范的实施方案中，GOI编码CBH2变体。
V.各实施方案的详述
本发明涉及酶，特别是纤维素酶变体。也描述了编码纤维素酶变体的核酸，包含纤维素酶变体的组合物，鉴定另外的有用的纤维素酶变体的方法和使用所述组合物的方法。
可以理解，前面的一般性描述和下文的详细描述都只是示例性的和解释性的，并不限制本文描述的组合物和方法。除非在本文中另外定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的一个普通技术人员通常理解的相同含义。在本申请中，单数的使用包括了复数，除非另外特别陈述。除非另外陈述，“或”的使用意味着“和/或”。同样地，术语包含或包括都并非意在限制。本文提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有氨基酸和核苷酸序列都通过引用明确的整合到本文中。本文提供的标题不是对发明所公开的各方面或实施方案的限制，其具体公开可以通过整体参考说明书产生。因此，通过整体参考说明书更全面的定义了本文中的术语。
除非本文中另外定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的一个普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton，等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wiley和Sons，New York(1994)；和Hale & Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本发明使用的许多术语的常规词典。虽然在实践或测试本发明时可以使用与本文描述的相似或等价的任何方法和材料，但是，仍描述了优选方法和材料。数值范围包括了定义范围的数。除非另外指出，分别地，核酸按从左至右为5’至3’的方向书写；氨基酸按从左至右为氨基至羧基的方向书写。关于本领域的定义和术语，实施者可以特别参考Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(第2版)，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.，1989；和Ausubel FM等人，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1993。可以理解，本发明不限于所述的特定方法、规程和试剂，因为这些是可以改变的。
I.定义
通过整体参考说明书可以更全面的定义下列术语。
如本文中使用的，术语“多肽”指由通过肽键连接的氨基酸残基的单链组成的化合物。如本文中使用的，术语“蛋白质”可以与术语“多肽”是同义的。
“变体”意指源自前体蛋白质(例如，天然蛋白质)的蛋白质，这是通过在C-和/或N-末端添加一个或多个氨基酸，取代氨基酸序列的一个或多个不同位点上的一个或多个氨基酸，或者在蛋白质的一个或两个末端或氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸。可以通过本领域已知的任何方法来实施纤维素酶变体的制备。在优选的实施方案中，通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列，将修饰的DNA序列转化到合适的宿主中，并表达修饰的DNA序列形成变体酶制备纤维素酶变体。本发明的变体纤维素酶包括这样的肽，所述肽包含与前体酶的氨基酸序列相比改变的氨基酸序列，其中变体纤维素酶保留了前体酶的特征性纤维素分解性质，但可以具有在一些特定的方面改变的性质。例如，变体纤维素酶可以具有增加的pH优化，或增加的温度或氧化稳定性，或与非纤维素物质降低的亲和力或结合，但可以保留它的特征性纤维素分解活性。认为根据本发明的变体可源自编码纤维素酶变体的DNA片段，其中保留了所表达的纤维素酶变体的功能活性。例如，编码纤维素酶的DNA片段可以进一步包括这样的DNA序列或其部分，所述DNA序列或其部分编码在5’或3’端与纤维素酶DNA序列连接的铰链或接头，其中保留了编码的纤维素酶结构域的功能活性。在本文中，术语变体和衍生物可以互换的使用。
还可以通过在三级结构水平确定与前体纤维素酶的同源性来定义“等价残基”，所述前体纤维素酶的三级结构已通过X-射线晶体学被确定。等价残基定义为在比对后，纤维素酶和红褐肉座菌CBH2的特定氨基酸残基的两个或多个主链原子(N对N，CA对CA，C对C以及O对O)的原子坐标在0.13nm以内，优选的在0.1nm内。在关于红褐肉座菌CBH2定向并定位最佳模型，以产生纤维素酶的非氢蛋白质原子的原子坐标的最大重叠后实现比对。最佳模型是使在最高分辨率的实验衍射数据时可获得最低R因子的晶体学模型，可见于例如US 2006/0205042。
与红褐肉座菌CBH2的特定残基功能类似的等价残基定义为纤维素酶的这样的氨基酸，所述氨基酸可以采用这样的构象，使得它们以定义的并归因于红褐肉座菌CBH2的特定残基的方式改变、修饰或促进蛋白质结构、底物结合或催化作用。此外，它们是纤维素酶的这样的残基(已通过x-射线晶体学获得了所述纤维素酶的三级结构)，所述残基以下述程度占据了类似位置，即尽管给定残基的主链原子可以没有满足基于占据同源位置的等价规则，但是残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于红褐肉座菌CBH2的对应侧链原子的0.13nm以内。Zou等人(1999)(参考文献5，见上文)显示了红褐肉座菌CBH2的晶体结构。
术语“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子。可以理解，由于遗传密码简并性的结果，可以产生编码给定蛋白质的多个核苷酸序列，例如CBH2和/或其变体。本发明考虑了编码变体纤维素酶(例如CBH2)的每种可能的变体核苷酸序列，考虑遗传密码的简并性所有这些都是可能的。
“异源”核酸构建体或序列具有部分序列，所述部分对于表达它的细胞而言是非天然的。在控制序列方面，异源指控制序列(即，启动子或增强子)目前调控的基因表达实质上没有作用于调控相同的基因。通常，异源核酸序列对于其存在的细胞或部分基因组不是内源的，已被通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等添加到细胞中。“异源的”核酸构建体可以含有控制序列/DNA编码序列的组合，与天然细胞中发现的控制序列/DNA编码序列的组合相同或不同。
如本文中使用的，术语“载体”指设计用于在不同的宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”指具有在外来细胞中掺入和表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
因此，“表达盒”或“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，具有一系列特殊化的核酸元件，所述元件允许特定核酸在靶细胞中的转录。重组表达盒可以被掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列外，表达载体的重组表达盒部分还包括待转录的核酸序列和启动子。
如本文中使用的，术语“质粒”指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，其在许多细菌和一些真核生物中形成染色体外自我复制的遗传元件。
如本文中使用的，术语“编码可选择的标志物的核苷酸序列”指这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够在细胞中表达，并且可选择的标志物的表达赋予含有表达基因的细胞在存在对应的选择剂或对应的选择性生长条件下生长的能力。
如本文中使用的，术语“启动子”指发挥指导下游基因转录的功能的核酸序列。启动子通常对表达靶基因的宿主细胞是合适的。启动子和其它转录和翻译调控核酸序列一起(也称为“控制序列”)，对表达给定基因是必需的。通常，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，以及增强子或激活子序列。
如本文中定义的，“嵌合基因”或“异源核酸构建体”指由不同基因的部分组成的非天然基因(即，已经导入宿主中的基因)，所述部分包括调控元件。用于宿主细胞转化的嵌合基因构建体通常包括转录调控区(启动子)，其与异源蛋白质编码序列有效连接，或者在可选择的标志物嵌合基因中，与可选择的标志物基因有效连接，所述标志物基因编码赋予转化细胞例如抗生素抗性的蛋白质。本发明的用于转化宿主细胞的典型的嵌合基因包括转录调控区(组成型的或可诱导的)，蛋白质编码序列和终止子序列。如果需要分泌靶蛋白，则嵌合基因构建体还可以包括编码信号肽的第二DNA序列。
当核酸被放置于与另一种核酸序列功能性的关系中时，核酸是有效连接的。例如，如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则编码分泌前导子的DNA与多肽的DNA是有效连接的；如果影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列是有效连接的；或者如果其位置有利于翻译，则核糖体结合位点与编码序列是有效连接的。通常，“有效连接”意指DNA序列的连接是连续的，并且在分泌前导子的情况下，是连续的且符合读框的。然而，增强子不必是连续的。通过在常规的限制性位点连接来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头(adaptor)、接头或用于PCR的引物。
如本文中使用的，术语“基因”意指在生产多肽链中涉及的DNA片段，可以或可以不包括在编码区前后的区域，例如5’非翻译(5’UTR)或“前导”序列，和3’UTR或“非转录尾区”序列，以及在单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
通常，在中等至高严谨条件下，编码变体纤维素酶(例如CBH2)的核酸分子可以与如本文中提供的野生型序列杂交，如SEQ ID NO：1。然而，在一些情况下，使用具有基本不同的密码子选择的CBH2-编码核苷酸序列，而由CBH2-编码核苷酸序列编码的蛋白质则与天然蛋白质具有相同或基本相同的氨基酸序列。例如，根据宿主使用的特定密码子的频率，可以修饰编码序列有利于CBH2在特定的原核或真核表达系统中更快的表达(Te′o等人，FEMS Microbiology Letters，190：13-19，2000；例如，描述了用于在丝状真菌中表达的基因优化)。
如果在中等至高严谨的杂交和洗涤条件下，两条序列特异性的彼此杂交，则认为核酸序列与参照核酸序列是“可选择性杂交的”。杂交条件基于核酸结合复合体或探针的解链温度(Tm)。例如，“最高严谨度”通常发生在约Tm-5℃(低于探针的Tm 5℃)；“高严谨度”发生在低于Tm约5-10℃；“中等”或“中间严谨度”发生在低于探针的Tm约10-20℃；而“低严谨度”发生在低于Tm约20-25℃。功能上，最高严谨度条件可用于鉴别与杂交探针具有严格同一性或近似严格同一性的序列，而高严谨度条件可用于鉴别与探针具有约80％或更高序列同一性的序列。
中等或高严谨度杂交条件是本领域普遍已知的(参见例如，Sambrook等人，1989，第9和11章；以及Ausubel，F.M.等人，1993；通过引用明确的整合到本文中)。高严谨度条件的实例包括在约42℃下，在50％甲酰胺、5xSSC、5倍Denhardt′s液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，然后在室温下，在2倍SSC和0.5％SDS中洗涤2次，和在42℃下，在0.1x SSC和0.5％SDS中再洗涤2次。
当对于例如细胞或核酸、蛋白质或者载体使用时，术语“重组”表示通过导入异源的核酸或蛋白质，或者改变天然的核酸或蛋白质，来修饰细胞、核酸、蛋白质或载体，或者所述细胞是源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不可见的基因，或者表达另外异常表达的、低表达的或完全不表达的天然基因。
如本文中使用的，涉及细胞的术语“转化的”、“稳定转化的”或“转基因的”意指细胞具有整合到其基因组或作为在多个世代中维持的附加型质粒的非天然(异源的)核酸序列。
如本文中使用的，术语“表达”指基于基因的核酸序列生产多肽的过程。过程包括转录和翻译。
在涉及向细胞中插入核酸序列时，术语“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指代核酸序列掺入到真核或原核细胞中，其中核酸序列可以被掺入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化为自主复制子或被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
因而术语“CBH2表达”指cbh2基因或其变体的转录和翻译，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽及其衍生物，包括来自相关物种的CBH2，所述物种例如康宁木霉(Trichoderma koningii)、红褐肉座菌(也称为长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride))和Hypocrea schweinitzii。通过示例，CBH2表达的测定包括用于CBH2蛋白的Western印迹、用于cbh2mRNA的Northern印迹分析和反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)测定，以及磷酸膨胀纤维素(Phosphoric AcidSwollen Cellulose，PASC)和对-羟基苯甲酰肼(PAHBAH)测定，如下列中所述：(a)PASC：(Karlsson，J.等人，(2001)，Eur.J.Biochem，268，6498-6507；Wood，T.(1988)在Methods in Enzymology，第160卷，Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose(Wood，W.& Kellog，S.编著)中，第19-25页，Academic Press，San Diego，Calif.，USA)和(b)PAHBAH：(Lever，M.(1972)Analytical Biochemistry，47，273；Blakeney，A.B.& Mutton，L.L.(1980)Journal of Science of Foodand Agriculture，31，889；Henry，R.J.(1984)Journal of theInstitute of Brewing，90，37)。
术语“可变剪接”指从单个基因产生多个多肽同种型的过程，涉及在一部分而并非全部基因转录物的加工过程中，将不连续的外显子剪接到一起。因此，特定的外显子可以与一些选择性外显子的任一个连接，形成信使RNA。可变剪接的mRNA产生多肽(“剪接变体”)，其中一些部分是相同的，而其它部分是不同的。
术语“信号序列”指在蛋白质N末端部分的氨基酸序列，其有利于成熟形态的蛋白质分泌到细胞外。成熟形态的胞外蛋白质缺少在分泌过程中切割掉的信号序列。
术语“宿主细胞”意指含有载体，并支持表达构建体的复制和/或转录或转录和翻译(表达)的细胞。用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，或真核细胞，例如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。通常，宿主细胞是丝状真菌。
术语“丝状真菌”意指本领域技术人员认识的任何和所有的丝状真菌。优选的真菌选自曲霉属(Aspergillus)、木霉属、镰孢属(Fusarium)、金小孢子属(Chrysosporium)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)、或其可选的有性型如裸孢壳属(Emericella)、肉座菌属(Hypocrea)。已证明无性的工业真菌里氏木霉是子囊菌纲(ascomycete)红褐肉座菌的克隆衍生物(参见，Kuhl s等人，PNAS，93：7755-7760，1996)。
术语“纤维寡糖”指含有2-8个葡萄糖单元并具有β-1，4连接的寡糖基，例如纤维二糖。
术语“纤维素酶”、“纤维素分解酶”或“纤维素酶”指能够水解纤维素多聚物为较短的纤维寡糖寡聚物、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。已从纤维分解生物中，特别包括真菌、植物和细菌中，获得了纤维素酶的多个实例，例如外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和葡糖苷酶。这类微生物制造的酶是这样的蛋白质的混合物，所述蛋白质具有在将纤维素转化为葡萄糖中有效的三类作用：内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶。这三类不同的纤维素酶协同作用，将纤维素及其衍生物转化为葡萄糖。
许多微生物制造水解纤维素的酶，包括木腐真菌木霉属、堆肥细菌高温单孢菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌属(Bacillus)和纤维单胞菌属(Cellulomonas)；链霉菌属(Streptomyces)；以及真菌腐质霉属、曲霉属和镰孢属。
来自红褐肉座菌的CBH2是糖基水解酶家族6(因而，Cel6)的成员，特别的是在红褐肉座菌中鉴别的该家族的第一个成员(因而，Cel6)。糖基水解酶家族6既含有内切葡聚糖酶，也含有纤维二糖水解酶/外切葡聚糖酶，CBH2是后者。因此，词组CBH2、CBH2型蛋白和Cel6纤维二糖水解酶在本文中可互换的使用。
如本文中使用的，术语“纤维素结合结构域”指在纤维素酶或其衍生物的纤维素结合活性中涉及的纤维素酶的部分氨基酸序列或酶的区域。纤维素结合结构域通常通过将纤维素酶与纤维素、纤维素衍生物或其其它的多糖等价物非共价结合来发挥作用。纤维素结合结构域通过结构迥异的催化核心区允许或有利于纤维素纤维的水解，而且通常独立于催化核心发挥作用。因此，纤维素结合结构域可以不具有归因于催化核心的显著的水解活性。换言之，纤维素结合结构域是纤维素酶蛋白质三级结构的结构元件，其不同于具有催化活性的结构元件。纤维素结合结构域和纤维素结合组件在本文中可互换的使用。
如本文中使用的，术语“表面活性剂”指本领域常规已知的具有表面活性性质的任何化合物。因此例如，表面活性剂包括阴离子、阳离子和非离子型表面活性剂，例如常见于去垢剂中的那些。阴离子表面活性剂包括线性的或分支的烷基苯磺酸盐；具有线性的或分支的烷基或烯基的烷基醚硫酸盐或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯属磺酸酯；和烷基磺酸盐。两性表面活性剂包括季铵盐磺酸盐和甜菜碱型两性表面活性剂。此类两性表面活性剂在同一个分子中同时具有正和负电荷基团。非离子表面活性剂可以包括聚氧化烯醚以及较高脂肪酸的链烷醇酰胺或其烯化氧的加合物、脂肪酸甘油单酯等。
如本文中使用的，术语“含纤维素的织物”指由含棉或非棉的纤维素或含棉或非棉的纤维素混合物制成的任何缝制的或非缝制合的织物、纱或纤维，包括天然纤维素制品和人造纤维素制品(例如黄麻、亚麻、苎麻、人造丝和lyocell)。
如本文中使用的，术语“含棉的织物”指由纯棉或棉混合物制成的缝制的或非缝制的植物、纱或纤维，包括棉机织织物、棉编织物、棉劳动布、棉纱、原棉等。
如本文中使用的，术语“石洗(stonewashing)组合物”指用于含石洗纤维素的织物的制剂。石洗组合物用于在销售前修饰含纤维素的织物，例如在生产过程中。相反，去垢剂组合物意在用于清洁污损的衣物，不在生产过程中使用。
如本文中使用的，术语“去垢剂组合物”指意图在用于清洗污损的含纤维素织物的洗涤基质中使用的混合物。在本发明的上下文中，此类组合物除纤维素酶和表面活性剂以外，可以包括其它的水解酶、增效剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、纤维素酶激活剂、抗氧化剂和加溶剂。
如本文中使用的，术语“降低或消除cbh2基因的表达”意指已从基因组中缺失了cbh2基因从而重组宿主微生物不能表达cbh2基因；或者cbh2基因或转录物已经被修饰使宿主微生物不生产功能性CBH2酶或以显著低于未修饰的cbh2基因或转录物的水平生产。
术语“变体cbh2基因”意指通过去除、添加和/或操纵编码序列，改变了来自红褐肉座菌的cbh2基因的核酸序列。
如本文中使用的，术语“纯化”通常指将含转基因核酸或蛋白质的细胞进行生物化学纯化和/或柱层析。
如本文中使用的，术语“活性”和“生物学活性”指与特定蛋白质相关的生物学活性，在本文中可互换的使用。例如，与蛋白酶相关的酶活性是蛋白酶解，因而有活性的蛋白酶具有蛋白水解活性。因而，给定蛋白质的生物学活性指本领域技术人员通常归因于蛋白质的任何生物学活性。
如本文中使用的，术语“富集的”意指相对于在野生型或天然存在的真菌纤维素酶组合物中发现的CBH2浓度，发现纤维素酶(例如CBH2)的浓度更大。术语富集的、升高的和增强的在本文中可互换的使用。
野生型真菌纤维素酶组合物是由天然存在的真菌来源生产的组合物，包括一种或多种BGL、CBH和EG组分，其中发现每种组分都是真菌来源生产的比例。因此，富集的CBH组合物可以具有改变比例的CBH，其中CBH与其它纤维素酶组分(例如，EG、β-葡糖苷酶和其它内切葡聚糖酶)的比例是升高的。可以通过本领域已知的任何方法增加CBH或降低(或消除)至少一种其它组分，来增加该比例。
如本文中使用的，术语“分离的”或“纯化的”指核酸或氨基酸是从其天然相关的至少一种组分中移出的。
因此，作为示例，通过文献中已充分公开的已知分离技术，可以将天然存在的纤维素酶系统纯化为基本纯的组分，所述技术包括在合适pH下的离子交换层析、亲和层析、大小排阻等。例如，在离子交换层析(通常是阴离子交换层析)中，能够通过用pH梯度或盐梯度或pH与盐梯度洗脱，分离纤维素酶组分。然后，可以将纯化的CBH添加到酶溶液中，获得富集的CBH溶液。还可以使用分子遗传学方法过表达编码CBH的基因(可能组合缺失一个或多个编码其它纤维素酶的基因)，来提高微生物生产的CBH的量。
真菌纤维素酶可以含有一种以上的CBH组分。不同的组分通常具有不同的等电点，使得可以通过离子交换层析等将它们分离。在酶溶液中可以使用单个CBH组分，或CBH组分的组合。
当在酶溶液中使用时，同源物或变体CBH2组分添加的量通常足以允许从生物质最高速率的释放可溶性糖。添加的同源物或变体CBH2组分的量依赖于待糖化的生物质的类型，使用时所述量可以由本领域技术人员方便的确定，纤维素酶组合物中存在的同源物或变体CBH2组分的重量百分比优选的在1和100之间，示例性实例是约1，优选的约5，优选的约10，优选的约15，或优选的约20重量百分比至优选的约25，优选的约30，优选的约35，优选的约40，优选的约45，或优选的约50重量百分比。此外，优选的范围可以是约0.5至约15重量百分比，约0.5至约20重量百分比，约1至约10重量百分比，约1至约15重量百分比，约1至约20重量百分比，约1至约25重量百分比，约5至约20重量百分比，约5至约25重量百分比，约5至约30重量百分比，约5至约35重量百分比，约5至约40重量百分比，约5至约45重量百分比，约5至约50重量百分比，约10至约20重量百分比，约10至约25重量百分比，约10至约30重量百分比，约10至约35重量百分比，约10至约40重量百分比，约10至约45重量百分比，约10至约50重量百分比，约15至约60重量百分比，约15至约65重量百分比，约15至约70重量百分比，约15至约75重量百分比，约15至约80重量百分比，约15至约85重量百分比，约15至约95重量百分比。然而，当使用时，相对于纤维素酶组合物中存在的任何EG型组分，同源物或变体CBH2组分的重量百分比优选的是从约1，优选的约5，优选的约10，优选的约15，或优选的约20重量百分比至优选的约25，优选的约30，优选的约35，优选的约40，优选的约45，或优选的约50重量百分比。此外，优选的范围可以是约0.5至约15重量百分比，约0.5至约20重量百分比，约1至约10重量百分比，约1至约15重量百分比，约1至约20重量百分比，约1至约25重量百分比，约5至约20重量百分比，约5至约25重量百分比，约5至约30重量百分比，约5至约35重量百分比，约5至约40重量百分比，约5至约45重量百分比，约5至约50重量百分比，约10至约20重量百分比，约10至约25重量百分比，约10至约30重量百分比，约10至约35重量百分比，约10至约40重量百分比，约10至约45重量百分比，约10至约50重量百分比，约15至约20重量百分比，约15至约25重量百分比，约15至约30重量百分比，约15至约35重量百分比，约15至约30重量百分比，约15至约45重量百分比，约15至约50重量百分比。
II.纤维素酶
纤维素酶是本领域已知的水解纤维素(β-1，4-葡聚糖或β-D-糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。如上文所述，纤维素酶传统上分为三大类：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)(“BG”)。
一些真菌产生完整的纤维素酶系统，包括外切纤维二糖水解酶或CBH型纤维素酶、内切葡聚糖酶或EG型纤维素酶，以及β-葡糖苷酶或BG-型纤维素酶。然而，有时这些系统缺少CBH型纤维素酶和细菌纤维素酶，还通常包括极少或不含CBH型纤维素酶。此外，已显示EG组分和CBH组分协同的相互作用，更有效的降解纤维素。在多组分或完整的纤维素酶系统中的不同组分，即各种内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶，通常具有不同的性质，例如等电点、分子量、糖基化程度、底物特异性和酶作用模式。
认为内切葡聚糖酶类型的纤维素酶水解纤维素的低结晶度(crystallinity)区域内部的β-1，4-糖苷键，而外切纤维二糖水解酶型纤维素酶从纤维素的还原端或非还原端水解纤维二糖。因而，通过创造外切纤维二糖水解酶组分识别的新的链末端，内切葡聚糖酶组分的作用可以极大的有利于外切纤维二糖水解酶的作用。此外，β-葡糖苷酶类型的纤维素酶已显示催化烷基和/或芳香基β-D-葡糖苷的水解，例如甲基β-D-葡糖苷和p-硝基苯葡糖苷，以及仅含碳水化合物残基的糖苷，例如纤维二糖。这产生葡萄糖作为微生物的单一产物，并降低或消除抑制纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的纤维二糖。
纤维素酶还在去垢剂组合物中有多种应用，包括增强清洁能力、作为软化剂和改善棉织物的触感(Hemmpel，ITB Dyeing/Printing/Finishing3：5-14，1991；Tyndall，Textile Chemist and Colorist 24：23-26，1992；和Kumar等人，Textile Chemist and Colorist，29：37-42，1997)。虽然机制不是本发明的一部分，但纤维素酶的软化和色彩修复性质已归因于纤维素酶组合物中的碱性内切葡聚糖酶组分，如美国专利号5,648,263、5,691,178和5,776,757中示例的，其中公开了含富集了特定碱性内切葡聚糖酶组分的纤维素酶组合物的去垢剂组合物赋予所处理的衣物色彩修复和改善的软化，这是与未富集此类组分的纤维素酶组合物相比。此外，去垢剂组合物中的此类碱性内切葡聚糖酶组分的应用已显示补偿了去垢剂组合物的pH要求(例如，通过在7.5-10的碱性pH下表现出最大活性，如美国专利号5,648,263、5,691,178和5,776,757中所述)。
纤维素酶组合物也显示出降解含棉织物、导致织物降低的力量损失(strength loss)(美国专利号4,822,516)，引起在商业去垢剂应用中使用纤维素酶组合物的阻碍。已提示，与包含完整纤维素酶系统的组合物相比，包含内切葡聚糖酶组分的纤维素酶组合物表现出含棉织物降低的力量损失。
纤维素酶还表现出可用于降解纤维素酶生物质为乙醇(其中，纤维素酶降解纤维素为葡萄糖，而酵母或其他微生物进一步发酵葡萄糖为乙醇)，这是在机械纸浆处理(Pere等人，In Proc.Tappi Pulping Conf.，Nashville，Tenn.，27-31，第693-696页，1996)中，用作饲料添加物(WO91/04673)以及在谷粒湿磨中。
大部分CBH和EG具有多结构域的结构，包括通过接头肽与纤维素结合结构域(CBD)分隔的核心结构域(Suurnakki等人，2000)。核心结构域含有活性位点，而CBD通过将酶与纤维素结合而与纤维素相互作用(vanTilbeurgh等人，FEBS Lett.204：223-227，1986；Tomme等人，Eur.J.Biochem.170：575-581，1988)。在结晶纤维素的水解中，CBD是特别重要的。已显示，当缺失CBD时，纤维二糖水解酶降解结晶纤维素的能力明显降低(Linder和Teeri，J.Biotechnol.57：15-28，1997)。然而，CBD的精确作用和作用机制仍然是思考的话题。已提示CBD仅通过增加纤维素表面的有效酶浓度(Stahlberg等人，Bio/Technol.9：286-290，1991)，和/或通过从纤维素表面松弛单条纤维素链(Tormo等人，EMBO J.，第15卷，第21期，第5739-5751页，1996)来增加酶活性。已经用纤维二糖水解酶的核心蛋白进行了大部分关注纤维素酶结构域对不同底物的影响的研究，因为所述酶的核心蛋白可以方便的通过木瓜蛋白酶限制性蛋白酶解来生产(Tomme等人，1988)。科学文献中已经描述了多种纤维素酶，其实例包括：来自里氏木霉的：Shoemaker，S.等人，Bio/Technology，1：691-696，1983，其公开了CBH1；Teeri，T.等人，Gene，51：43-52，1987，其公开了CBH2。还描述了来自木霉属以外的物种的纤维素酶，例如Ooi等人，Nucleie Acids Research，第18卷，第19期，1990，其公开了编码由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)生产的内切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T等人，Gene 173(2)：287-8，1996，其公开了编码来自棘孢曲霉的β-葡糖苷酶1的cDNA的克隆和测序；Sakamoto等人，Curr.Genet.27：435-439，1995，其公开了编码来自白曲霉(Aspergilluskawachii)IFO 4308的内切葡聚糖酶CMC酶-1的cDNA序列；Saarilahti等人，Gene 90：9-14，1990，其公开了来自胡萝卜欧文氏菌(Erwiniacarotovara)的内切葡聚糖酶；Spilliaert R等人，Eur J Biochem.224(3)：923-30，1994，其公开了编码来自Rhodothermus marinus的热稳定β-葡聚糖酶的bglA的克隆和测序；以及Halldorsdottir S等人，ApplMicrobiol Biotechnol.49(3)：277-84，1998，其公开了编码糖基水解酶家族12的热稳定的纤维素酶的Rhodothermus marinus基因的克隆、测序和过表达。然而，仍然需要鉴别和表征具有改良性质的新的纤维素酶，例如在热胁迫的条件下或者在存在表面活性剂的条件下改良的性能、增加的比活、改变的底物切割模式，和/或高水平的体外表达。
包含改变量的CBH型、EG型和BG型纤维素酶的、新的和改良的纤维素酶组合物的开发旨在用于：例如(1)表现出增强的清洁能力，作为柔软剂发挥作用和/或改善棉织物的触感(例如，“石洗(stone washing)”或“生物抛光(biopolishing)”)的去垢剂组合物；(2)将木浆或其他生物质降解为糖的组合物(例如，用于生物燃料生产)；和/或(3)饲料组合物。
本文还提供了包含纤维素酶变体的全纤维素酶制品。如此处所用的短语“全纤维素酶制品”是指天然存在和非天然存在的含有纤维素酶的组合物。“天然存在”的组合物是通过天然存在的来源生产的组合物，该组合物含有一种或多种纤维二糖水解酶类型、一种或多种内切葡聚糖酶类型和一种或多种β-葡糖苷酶组分，其中这些组分的每一种都以来源生产的比例得到。天然存在的组合物是这样一种组合物，其产生于纤维素分解酶方面未经修饰的生物，从而组分酶的比例并未从天然生物产生的比例发生改变。“非天然存在”的组合物包含那些组合物，其产生是通过(1)以天然存在的比例或非天然存在(也就是改变了的)比例来组合组分纤维素分解酶，或(2)修饰生物以过量表达或不足表达一种或多种纤维素分解酶，或(3)修饰生物以致至少一种纤维素分解酶被缺失。相应地，在一些实施方案中，全纤维素酶制品可缺失多种EG和/或CBH中的一种或多种、和/或β-葡糖苷酶。例如，EG1可单独缺失或与其他EG和/或CBH组合被缺失。
一般来说，全纤维素酶制品包括酶，该酶包括并不限于(i)内切葡聚糖酶(EG)或l，4-β-d-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，其包括1，4-β-d-葡聚糖葡聚糖水解酶(又已知为纤维糊精酶(cellodextrinases))(EC 3.2.1.74)和1，4-β-d-葡聚糖纤维二糖水解酶(外切纤维二糖水解酶，CBH)(EC 3.2.1.91)和(iii)β-葡糖苷酶(BG)或β-葡萄糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)。
在本公开内容中，全纤维素酶制品可来自任何可用于纤维素物质水解的微生物。在一些实施方案中，全纤维素酶制品是丝状真菌全纤维素酶。“丝状真菌”包括亚门真菌(Eumycota)和藻属(Oomycota)的所有丝状形式。在一些实施方案中，全纤维素酶制品是支顶孢属(Acremonium)、曲霉属、裸孢壳属(Emericella)、镰孢属、腐质霉属(Humicola)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、柱霉属(Scytalidium)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属物种的全纤维素酶。在一些实施方案中，全纤维素酶制品是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉或米曲霉的全纤维素酶。在另一方面，全纤维素酶制品是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、Fusarium negundi、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum的全纤维素酶。在另一方面，全纤维素酶制品是特异腐质酶(Humicola insolens)、Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthorathermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、Scytalidiumthermophilum或太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)的全纤维素酶。在另一方面，全纤维素酶制品是Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)，如RL-P37(Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnology，20(1984)第46-53页；Montenecourt B.S.，Can.，1-20，1987)、QM9414(ATCC No.26921)、NRRL 15709、ATCC 13631、56764、56466、56767或绿色木霉(Trichoderma viride)如ATCC 32098和32086的全纤维素酶。在一些实施方案中，全纤维素酶制品是里氏木霉RutC30的全纤维素酶，其可从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)如里氏木霉ATCC 56765中得到。
适合用于本发明的可商购的纤维素酶制品的实例包括例如CELLUCLASTTM(可从Novozymes A/S获得)和LAMINEXTM、IndiAgeTM和PrimafastTM LAMINEX BG酶(可从Genencor Division，Danisco US.Inc.获得)。
在本公开内容中，全纤维素酶制品可来自本领域已知的任意微生物培养方法，导致能够水解纤维素物质的酶的表达。发酵可包括在实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养、小或大规模发酵，如连续、分批、补料分批或固态发酵，其在允许纤维素酶表达或分离的条件下、于合适的培养基中进行。
通常，微生物在细胞培养基中培养，该培养基适合用于产生能够水解纤维素物质的酶。培养运用本领域已知方法，在含有碳源、氮源和无机盐的合适的营养培养基中发生。本领域已知适合生长和纤维素酶生产的合适的培养基、温度范围和其他条件。作为非限制性的例子，通过里氏木霉生产纤维素酶的正常温度范围是24℃到28℃。
通常，全纤维素酶制品以发酵生产的样子使用，不进行或极少进行回收和/或纯化。例如，一旦纤维素酶由细胞分泌到细胞培养基中，就可以使用含有纤维素酶的细胞培养基。在一些实施方案中，全纤维素酶制品含有发酵物质的未分级分离的成分，包括细胞培养基、细胞外酶和细胞。可选地，全纤维素酶制品可用任何方便的方法加工，如，通过沉淀、离心、亲和、过滤或本领域已知的任何其他方法。在一些实施方案中，全纤维素酶制品例如可以被浓缩，然后不经进一步纯化而被使用。在一些实施方案中，全纤维素酶制品含有降低细胞活力或杀死细胞的化学剂。在一些实施方案中，使用本领域已知方法裂解或透化处理细胞。
III.分子生物学
在一个实施方案中，本发明提供了变体cbh2基因在丝状真菌中功能性的启动子的控制下表达。因此，本发明依赖于重组遗传性领域中的常规技术(参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，1989；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A LaboratoryManual，1990；和Ausubel等人编著，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1994)。
突变cbh2核酸序列的方法
本发明考虑了任何本领域已知可导入突变的方法。
本发明涉及变体CBH2的表达、纯化和/或分离，以及用途。这些酶优选的通过重组方法制备，使用来自红褐肉座菌的cbh2基因。可以使用进行或不进行纯化的发酵培养基。
在从红褐肉座菌中分离和克隆cbh2基因后，使用本领域已知的其它方法，例如定点诱变，产生与表达的CBH2变体中取代氨基酸对应的取代、添加或缺失。同样，定点诱变和在DNA水平向表达蛋白质中掺入氨基酸改变的其它方法是本领域已知的(Sambrook等人，见上文；和Ausubel等人，见上文)。
通过多种本领域已知的方法制备编码红褐肉座菌CBH2的氨基酸序列变体的DNA。这类方法包括但不限于通过对较早制备的编码红褐肉座菌CBH2的DNA进行定点(或寡核苷酸-介导的)诱变、PCR诱变和盒诱变来制备。
定点诱变是制备取代变体的优选方法。该技术是本领域普遍已知的(参见例如，Carter等人，Nucleic Acids Res.13：4431-4443(1985)和Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1987))。简而言之，在进行DNA的定点诱变中，通过首先将编码目的突变的寡核苷酸与此类起始DNA的单链杂交，来改变起始DNA。在杂交后，使用DNA聚合酶合成完整的第二链，使用杂交的寡核苷酸作为引物，并使用起始DNA的单链作为模板。因此，将编码目的突变的寡核苷酸掺入到所获得的双链DNA中。
PCR诱变也适合制造起始多肽(即，红褐肉座菌CBH2)的氨基酸序列变体。参见Higuchi，在PCR Protocols，第177-183页(Academic Press，1990)；和Vallette等人，Nuc.Acids Res.17：723-733(1989)。还参见例如Cadwell等人，PCR Methods and Applications，第2卷，28-33(1992)。简而言之，当使用少量模板DNA作为PCR的起始材料时，可以使用与模板DNA的对应区域的序列轻微差异的引物来产生相对大量的特定DNA片段，所述片段仅在引物不同于模板的位置与模板序列不同。
制备变体的另一种方法，盒诱变，是基于Wells等人，Gene 34：315-323(1985)描述的技术。起始材料是包含待突变的起始多肽DNA的质粒(或其它载体)。鉴别了起始DNA中待突变的密码子。在鉴别的突变位点的每一侧必须有独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在此类限制性位点，可以使用上述寡核苷酸-介导的诱变方法，在起始多肽DNA的合适位置导入它们来产生它们。在这些位点切割质粒DNA来将其线性化。使用标准程序合成双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸编码在限制性位点之间含有目的突变的DNA序列，其中两条寡核苷酸链是分别合成的，然后使用标准技术将所述链杂交在一起。该双链寡核苷酸被称为盒。该盒被设计为具有与线性化质粒的末端相容的5’和3’末端，使其可以直接连接到质粒中。现在，所述质粒含有突变DNA序列。
可选的或另外的，可以确定编码变体CBH2的目的氨基酸序列，并可以合成产生编码此类氨基酸序列变体的核酸序列。
如此制备的变体CBH2可以进行进一步修饰，通常依赖于纤维素酶的预期用途。此类修饰可以涉及氨基酸序列的进一步改变，与异源多肽融合和/或共价修饰。
IV.cbh2核酸和CBH2多肽
A.变体cbh2-型核酸
SEQ ID NO：1显示了野生型cbh2的核酸序列。本发明涵盖了编码本文所述的变体纤维素酶的核酸分子。核酸可以是DNA分子。
在将编码CBH2变体的DNA序列克隆到DNA构建体中后，使用DNA转化微生物。用于表达根据本发明的变体CBH2目的的待转化微生物可以有利的包括源自木霉属物种的菌株。因此，用于制备根据本发明的变体CBH2纤维素酶的优选模式包括用DNA构建体转化木霉属物种宿主细胞，所述构建体至少包含编码一部分或全部变体CBH2的DNA片段。DNA构建体通常可以与启动子功能性连接。然后，转化的宿主细胞生长在表达目的蛋白质的条件下。然后，可以将目的的蛋白质产物纯化至基本同质。
然而，实际上，编码变体CBH2的给定DNA的最佳表达载体可以不同于红褐肉座菌。因此，在与变体CBH2的来源生物具有系统发生相似性的转化宿主中表达蛋白质可以是最有利的。在可选的实施方案中，可以使用黑曲霉(Aspergillus niger)作为表达载体。关于使用黑曲霉的转化技术的描述，参见WO 98/31821，其公开文本通过引用全文整合到本文中。
因此，仅出于示例的目的提供曲霉属物种表达系统的本说明，它们作为表达本发明的变体CBH2的一个选择。然而，本领域技术人员可以倾向于根据需要在不同宿主细胞中表达编码变体CBH2的DNA，应该理解，在确定最佳表达宿主时应该考虑变体CBH2的来源。此外，本领域技术人员能够利用本领域可获得的工具，通过常规技术选择特定基因的最佳表达系统。
B.变体CBH2多肽
本发明的变体CBH2具有源自前体CBH2的氨基酸序列的氨基酸序列。通过取代、缺失或插入前体氨基酸序列一个或多个氨基酸，CBH2变体的氨基酸序列不同于前体CBH2氨基酸序列。在优选的实施方案中，前体CBH2是红褐肉座菌CBH2。在实施例2(SEQ ID NO：3)中显示了红褐肉座菌CBH2的成熟氨基酸序列。因此，本发明涉及这样的CBH2变体，所述变体含有等价于红褐肉座菌CBH2的特定鉴别残基的位置上的氨基酸残基。如果与红褐肉座菌CBH2中的该残基的特定残基或部分同源(即，在初级或三级结构中位置对应)或功能类似，则CBH2同源物的残基(氨基酸)与红褐肉座菌CBH2的残基是等价的(即，具有相同或相似的功能性能力而化学的或结构性的结合、反应或相互作用)。如本文中使用的，编号意在与成熟CBH2氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的编号的相对应。
比对氨基酸序列来确定同源性优选的使用“序列比较算法”来确定。可以通过例如Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法；Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法；Pearson  &Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化运用(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package中，GeneticsComputer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)或者通过视觉观察(visual inspection)，来执行用于比较的优化的序列比对，视觉观察可以使用绘图包，例如Chemical Computing Group，Montreal Canada的MOE。
适合确定序列相似性的算法的实例是BLAST算法，描述在Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。用于实施BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。该算法涉及首先鉴别高分序列对(HSP)，这是通过在查询序列中鉴别短的字节长度W，当所述字节与数据库序列中相同长度的字节比对时，匹配或者满足一定的正阈值分数T。这些初始的相邻字节命中作为寻找含有它们的较长HSP的起始点发挥作用。沿着比较的两条序列中任一向两个方向扩展字节命中，只要可以增加累积比对分数。当：累积比对分数从达到的最大值下降量X；累积分数达到0或更低；或者达到任一条序列的末端时，停止字节命中的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的缺省值为：字节长度(W)为11，BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对(B)为50，期望值(E)为10，M’5，N’4，以及比较两条链。
然后，BLAST算法实施两条序列之间的相似性统计学分析(参见例如，Karlin & Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总概率(P(N))，其提供了在两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配可以偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试氨基酸序列与蛋白酶氨基酸序列的比较中，最小总概率低于约0.1，更优选的低于约0.01，最优选的低于约0.001，则认为氨基酸序列与蛋白酶是相似的。
出于本发明的目的，可以通过本领域已知的计算机程序适当的确定同一性的程度，例如在GCG程序包(Program Manual for the WisconsinPackage，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575ScienceDrive，Madison，Wis.，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)中提供的GAP，使用具有下列设定的GAP用于多核苷酸序列比较：GAP生成罚分为5.0，GAP延伸罚分为0.3。
可以使用里氏木霉CBH2和其他纤维素酶之间的结构比对来鉴别在具有中等至高度同源性的其他纤维素酶中的等价/对应位置，所述同源性例如与里氏木霉CBH2(SEQ ID NO：3)约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者甚至99％的同源性。获得结构比对的一种方法是使用来自GCG包的Pile Up程序，使用空位罚分的缺省值，即空位生成罚分为3.0，空位延伸罚分为0.1。其他结构比对方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等人，FEBS Letters，224：149-155，1987)和反向联系(feverse threading)(Huber和Torda，Protein Sc ience，7：142-149，1998)。
如图1提供了成熟形态的各种参照纤维素酶的示例性比对。参照纤维素酶包括：红褐肉座菌(也称为里氏木霉)CBH2(SEQ ID NO：3)、康宁肉座菌CBH2(SEQ ID NO：4)、特异腐质霉CBH2(SEQ ID NO：5)、解纤维素醋弧菌CBH2(SEQ ID NO：6)、二孢蘑菇CBH2(SEQ ID NO：7)、尖镰孢EG(SEQ ID NO：8)、黄孢原毛平革菌CBH2(SEQ ID NO：9)、埃默森篮状菌CBH2(SEQ ID NO：10)、褐色嗜热裂孢菌6B/E 3CBH2(SEQ ID NO：11)、褐色嗜热裂孢菌6A/E2EG(SEQ ID NO：12)和粪肥纤维单胞菌CenA EG(SEQID NO：13)。使用ClustalW和MUSCLE多序列比对算法比对序列。表1提供了矩阵，其显示图1的序列比对的纤维素酶百分比同一性。
表1.纤维素酶百分比同一性矩阵
*
  百分比ID   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13
  3   100   95.5   62.3   64.7   59.6   63.1   55.4   63.4   31.9   13.5   27
  4   95.5   100   61.6   64   59.1   63.6   54.7   63   32.9   13.5   26.8
  5   62.3   61.6   100   59.1   57.6   61.3   54   58.8   31.9   15.9   26.6
  6   64.7   64   59.1   100   58.6   564   54   72.6   32.8   13.5   29.2
  7   59.6   59.1   57.6   58.6   100   55.8   69.1   58.1   34.9   17.5   27.6
  8   63.1   63.6   61.3   56.4   55.8   100   48.7   54.8   31.1   13.9   25.2
  9   55.4   54.7   54   54   69.1   48.7   100   52.6   32.4   15.4   25.6
  10   63.4   63   58.8   72.6   58.1   54.8   52.6   100   33.9   13.2   27.3
  11   31.9   32.9   31.9   32.8   34.9   31.1   32.4   33.9   100   15.9   36.3
  12   13.5   13.5   15.9   13.5   17.5   13.9   15.4   13.2   15.9   100   12.8
  13   27   26.8   26.6   29.2   27.6   25.2   25.6   27.3   36.3   12.8   100
*最顶排和左栏的数字对应图1的比对序列的SEQ ID NO。
当相对于GenBank DNA Sequence和其它公开数据库评估给定核酸序列时，通常使用BLASTN程序进行序列检索。对于针对在GenBank ProteinSequence和其它公开数据库中的氨基酸序列检索已经以所有可读框被翻译的核酸序列而言，BLASTX程序是优选的。BLASTN和BLASTX都使用缺省参数运行：开放空位罚分为11.0，延伸空位罚分为1.0，使用BLOSUM-62矩阵(参见例如，Altschul等人，1997)。
V.重组CBH2变体的表达
本发明的方法依赖于使用细胞表达变体CBH2，不需要特定的CBH2表达方法。优选的从细胞中分泌变体CBH2。本发明提供了用包含变体CBH2-编码核酸序列的表达载体转导、转化或转染的宿主细胞。培养条件例如温度、pH等是在转导、转化或转染前预先用于亲本宿主细胞的那些条件，对本领域技术人员是显而易见的。
在一种方法中，用表达载体转染丝状真菌细胞或酵母细胞，所述表达载体具有与编码变体CBH2的DNA片段有效连接的、在宿主细胞系中发挥作用的启动子或生物性活性的启动子片段或一种或多种(例如，一系列)增强子，使变体CBH2在细胞系中表达。
A.核酸构建体/表达载体
编码变体CBH2(“CBH2-编码核酸序列”)的天然或合成的多核苷酸片段可以掺入到异源核酸构建体或载体中，所述构建体或载体能够导入到并在丝状真菌或酵母细胞中复制。本文公开的载体和方法适合在用于表达变体CBH2的宿主细胞中使用。可以使用任何载体只要它在导入的细胞中是可复制的和有活力的。大量的合适载体和启动子是本领域技术人员已知的，并可商购获得。克隆和表达载体也描述在Sambrook等人，1989；Ausubel FM等人，1989和Strathern等人，The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces，1981中，它们都通过引用明确的整合到本文中。用于真菌的适当的表达载体描述在van den Hondel，C.A.M.J.J.等人，(1991)In：Bennett，J.W.和Lasure，L.L.(编著)More Gene Manipulationsin Fungi.Academic Press，第396-428页中。可以通过多种方法将适当的DNA序列插入到质粒或载体中(在本文中统称为“载体”)。一般而言，通过标准方法将DNA序列插入到适当的限制性内切酶位点中。认为此类方法和相关的亚克隆方法应该落入本领域技术人员的知识范围内。
可以通过将包含变体CBH2编码序列的异源核酸构建体导入选定的丝状真菌菌株的细胞中，来生产包含变体CBH2编码序列的重组丝状真菌。
一旦获得了目的形态的变体cbh2核酸序列，则可以以各种方式修饰。序列涉及非编码侧翼区时，可对侧翼区进行切除、诱变等。因而，可以在天然存在的序列上实施转换、颠换、缺失和插入。
根据普遍已知的重组技术，可以将选定的变体cbh2编码序列插入到合适的载体中，并将其用于转化能够表达CBH2的丝状真菌。由于遗传密码内在的简并性，可以使用编码实质上相同或功能等价的氨基酸序列的其它核酸序列来克隆和表达变体CBH2。因此，可以理解，在编码区的此类取代落入本发明涵盖的序列变体的范围内。可以以与本文所述对亲本CBH2-编码核酸序列相同的方式，使用任何和所有的这类序列变体。
本发明还包括重组核酸构建体，所述构建体包含一个或多个如上所述的变体CBH2-编码核酸序列。构建体包含载体，例如质粒或病毒载体，其中正向或反向的插入了本发明的序列。
异源核酸构建体可以包括变体cbh2的编码序列，所述编码序列是(i)分离的；(ii)与其它编码序列组合的；例如作为融合蛋白或信号肽编码序列，其中cbh2编码序列是主导的编码序列；(iii)与非编码序列组合的，所述非编码序列例如内含子和控制元件，如启动子和终止子元件或5’和/或3’非翻译区，它们对编码序列在合适宿主中的表达是有效的；和/或(iv)在载体或宿主环境中的，其中cbh2编码序列是异源基因。
在本发明的一个方面，使用异源核酸构建体在体外将变体CBH2-编码核酸序列转移到细胞中，其中已确立的丝状真菌和酵母系是优选的。对于长期生产变体CBH2，稳定的表达是优选的。因而，在实践本发明中可以使用有效产生稳定转化体的任何方法。
适当的载体通常装配有可选择的标志物编码核酸序列、插入位点和合适的控制元件，例如启动子和终止子序列。载体可以包含使编码序列在宿主细胞中(和/或在载体或宿主细胞环境中，其中正常的不表达修饰的可溶性蛋白质抗原编码序列)有效表达的调控序列，包括例如非编码序列，如内含子和控制元件，即启动子和终止子元件或5’和/或3’非翻译区，它们与编码序列有效的连接。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，其中许多是可商购的和/或描述在Sambrook等人，(见上文)中。
示例性的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子，其实例包括CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、含有如描述的tet-on或tet-off系统中的tet应答元件(TRE)的启动子(ClonTech和BASF)、β肌动蛋白启动子和可以通过添加一些金属盐而上调的金属硫蛋白启动子。启动子序列是被用于表达目的的特定丝状真菌识别的DNA序列。它与编码变体CBH2多肽的DNA序列有效连接。此类连接包括在公开的表达载体中，将启动子针对编码变体CBH2多肽的DNA序列的起始密码子放置。启动子序列含有转录和翻译控制序列，其介导变体CBH2多肽的表达。实例包括来自以下基因的启动子：黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或α-葡糖苷酶编码基因；构巢曲霉gpdA或trpC基因；粗糙脉孢菌cbh1或trp1基因；黑曲霉或米黑毛霉的天冬氨酸蛋白酶编码基因；红褐肉座菌(里氏木霉)cbh1、cbh2、egl1、egl2或其他的纤维素酶编码基因。
适当的可选择标志物的选择取决于宿主细胞，用于不同宿主的适当标志物是本领域普遍已知的。典型的可选择标志物基因包括来自构巢曲霉或里氏木霉的argB，来自构巢曲霉的amdS，来自粗糙脉孢菌或里氏木霉的pyr4，来自黑曲霉或构巢曲霉的pyrG。其他示例性可选择标志物包括但不限于trpc、trp1、oliC31、niaD或leu2，它们包含在用于转化突变菌株(例如，trp-、pyr-、leu--等)的异源核酸构建体中。
此类可选择标志物赋予转化体利用丝状真菌通常不代谢的代谢物的能力。例如，来自红褐肉座菌的amdS基因，编码乙酰胺酶，允许转化体细胞以乙酰胺作为氮源生长。可选择标志物(例如，pyrG)可以恢复营养缺陷型突变菌株在选择性基本培养基上生长的能力，或者可选择标志物(例如，olic31)可以赋予转化体在存在抑制性药物或抗生素的条件下生长的能力。
利用本领域常规使用的方法，将可选择标志物编码序列克隆到任何合适的质粒中。示例性质粒包括pUC18、pBR322、pRAX和pUC100。pRAX质粒含有来自构巢曲霉的AMAL序列，其使质粒能够在黑曲霉中复制。
除非另外指出，本发明的实践可以使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，落入本领域技术人员的范围内。文献中全面的解释了此类技术。参见例如，Sambrook等人，1989；Freshney，Animal CellCulture，1987；Ausubel等人，1993；和Coligan等人，Current Protocolsin Immunology，1991。
B.用于CBH2生产的宿主细胞和培养条件
(i)丝状真菌
因此，本发明提供了包含这样的细胞的丝状真菌，所述细胞已被修饰、选择，并以相对于对应的未转化的亲本真菌，有效导致变体CBH2生产或表达的方式培养。
可以经处理和/或修饰用于变体CBH2表达的亲本丝状真菌物种的实例包括但不限于木霉属，例如里氏木霉、长枝木霉、绿色木霉、康宁木霉；青霉属物种(Penicillium sp.)；腐质霉属物种(Humicola sp.)，包括特异腐质霉；曲霉属物种(Aspergillus sp.)；金小孢子属物种(Chrysosporium sp.)；镰孢属物种；肉座菌属物种和裸孢壳属物种。
在通常用于培养亲本真菌系的条件下培养CBH2表达细胞。一般而言，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞，例如Pourquie，J.等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradat ion编著，Aubert，J.P.等人，Academic Press，第71-86页，1988和I lmen，M.等人，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997中描述的。培养条件也是标准的，例如，在28℃在摇瓶培养或发酵罐中孵育培养物直到获得想要的CBH2表达水平。
用于给定丝状真菌的优选培养条件可见于科学文献和/或来自真菌来源，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC；www.atcc.org/)。在已建立真菌生长以后，将细胞暴露在有效导致或允许变体CBH2表达的条件下。
在CBH2编码序列处于诱导型启动子控制的情况下，向培养基中添加有效诱导CBH2表达的浓度的诱导剂，例如糖、金属盐或抗生素。
在一个实施方案中，菌株包括黑曲霉，这是用于获得过表达蛋白质的有效菌株。例如，已知黑曲霉泡盛变种(A.niger var awamori)dgr246分泌增量的分泌性纤维素酶(Goedegebuur等人，Curr.Genet(2002)41：89-98)。黑曲霉泡盛变种的其它菌株例如GCDAP3、GCDAP4和GAP3-4是已知的，Ward等人(Ward，M，Wilson，L.J.和Kodama，K.H.，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743)。
在另一个实施方案中，菌株包括里氏木霉，这是用于获得过表达蛋白质的有效菌株。例如，已知Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53(1984)描述的RL-P37分泌增量的纤维素酶。RL-P37的功能等价物包括里氏木霉菌株RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)。认为这些菌株对过表达变体CBH2也是有效的。
当需要获得缺少潜在有害的天然纤维素分解活性的变体CBH2时，在导入含有编码变体CBH2的DNA片段的DNA构建体或质粒之前，获得已缺失一个或多个纤维素酶基因的木霉属宿主细胞株是有益的。可通过美国专利号5,246,853和WO 92/06209中公开的方法制备此类菌株，所述公开文本通过引用整合到本文中。通过在缺失一个或多个纤维素酶基因的宿主微生物中表达变体CBH2纤维素酶，简化了鉴别和后续的纯化步骤。可以缺失已被克隆的来自木霉属物种的任何基因，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因以及编码EG III和/或EGV蛋白质的基因(分别参见例如，美国专利号5,475,101和WO 94/28117)。
可以通过本领域已知的方法，将待缺失或破坏的目的基因形态插入到质粒中来实现基因缺失。然后，在适当的限制性酶切位点切割缺失质粒，所述位点在目的基因编码区的内部，并用可选择标志物替换基因编码序列或其部分。来自待缺失或破坏基因的基因座侧翼的DNA序列，优选的在约0.5-2.0kb之间，仍保留在可选择标志物基因的任一侧。适当的缺失质粒通常可以具有其中存在的独特的限制性酶位点，使含有缺失基因(包括侧翼DNA序列)，和可选择标志物基因的片段作为单线性片段被移除。
可选择的标志物的选择必须使得能够检测转化的微生物。在选定微生物中表达的任何可选择标志物基因都可以是适合的。例如，对于曲霉属物种，选择可选择标志物使得可选择标志物在转化体中的存在不显著影响它的性质。此类可选择标志物可以是编码可测定产物的基因。例如，可以使用曲霉属物种基因的功能性拷贝，如果宿主菌株缺少所述基因，则导致宿主菌株表现出营养缺陷型的表型。相似的，存在用于木霉属物种的可选择标志物。
在一个实施方案中，用功能性pyrG基因转化曲霉属物种的pyrG-衍生菌株，从而为转化提供可选择的标志物。可以通过选择抗氟乳清酸(FOA)的曲霉属物种菌株来获得pyrG-衍生菌株。pyrG基因编码乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶，它是尿苷的生物合成需要的酶。具有完整pyrG基因的菌株生长在缺少尿苷的培养基中，但对氟乳清酸是敏感的。通过选择FOA抗性，能够选择缺少功能性乳清酸核苷单磷酸脱羧酶并需要尿苷进行生长的pyrG-衍生菌株。使用FOA选择技术，还能够获得缺少功能性乳清酸磷酸核糖基转移酶的、需要尿苷的菌株。能够用编码上述酶的基因的功能性拷贝转化上述细胞(Berges & Barreau，Curr.Genet.19：359-365(1991)；和van Hartingsveldt等人，(1986)Development of a homologoustransformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene.Mol.Gen.Genet.206：71-75)。使用上述FOA抗性技术方便的实施衍生菌株的选择，因而优选的使用pyrG基因作为可选择标志物。
在第二个实施方案中，用功能性pyr4基因转化肉座菌属物种的pyr4-衍生菌株(肉座菌属物种(木霉属物种))，从而为转化提供了可选择标志物。可以通过选择抗氟乳清酸(FOA)的肉座菌属物种(木霉属物种)菌株，获得pyr4.sup.-衍生菌株。pyr4基因编码乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶，是尿苷的生物合成需要的酶。具有完整pyr4基因的菌株生长在缺少尿苷的培养基中，但对氟乳清酸是敏感的。通过选择FOA抗性，能够选择缺少功能性乳清酸核苷单磷酸脱羧酶并需要尿苷进行生长的pyr4.sup.-衍生菌株。使用FOA选择技术，还能够获得缺少功能性乳清酸磷酸核糖基转移酶的、需要尿苷的菌株。能够用编码上述酶的基因的功能性拷贝转化上述细胞(Berges & Barreau，1991)。使用上述FOA抗性技术方便的实施衍生菌株的选择，因而优选的使用pyr4基因作为可选择标志物。
为了转化pyrG-曲霉属物种或pyr4-肉座菌属物种(木霉属物种)使得缺少表达一种或多种纤维素酶基因的能力，从缺失质粒中分离出包含破坏的或缺失的纤维素酶基因的单个DNA片段，并用于转化合适的pyr-曲霉属或pyr-木霉属宿主。然后，分别基于它们表达pyrG或pyr4的能力、基因产物和因而对宿主菌株的尿苷营养缺陷型的补偿，鉴别并选择转化体。然后，对获得的转化体进行Southern印迹分析，鉴别并验证了替换基因的基因组拷贝的部分或全部编码区的双交换整合事件，所述基因是要用合适的pyr可选择标志物缺失的基因。
虽然上述特定的质粒载体涉及pyr-转化体的制备，但是本发明不限于这类载体。利用上述技术可以在曲霉属物种或肉座菌属物种(木霉属物种)中缺失和替换各种基因。此外，可以使用任何可获得的可选择标志物，如上述。实际上，利用上述策略，可以从基因组中缺失任何宿主，例如曲霉属物种或肉座菌属物种的已克隆并鉴别的基因。
如上述，使用的宿主菌株可以是肉座菌属物种(木霉属物种)的衍生物，它们缺失或具有非功能性基因或对应于选定的可选择标志物的基因。例如，如果选择可选择标志物pyrG用于曲霉属物种，则使用特定的pyrG-衍生菌株作为转化步骤的受体。此外，例如，如果选择可选择标志物pyr4用于肉座菌属物种，则使用特定的pyr4-衍生菌株作为转化步骤的受体。相似的，可以使用的可选择标志物包括与构巢曲霉基因amdS、argB、trpC、ni aD等价的肉座菌属物种(木霉属物种)基因。因此，对应的受体菌株必须是衍生菌株，例如分别是argB-、trpC-、niaD-。
然后，制备编码CBH2变体的DNA用于插入到合适的微生物中。根据本发明，编码CBH2变体的DNA包含编码具有功能性纤维素分解活性的蛋白质所必需的DNA。编码CBH2变体的DNA片段可以功能性连接到真菌启动子序列上，例如，曲霉属中的glaA基因的启动子或木霉属中的cbh1或egl1基因的启动子。
还考虑可以将一份以上拷贝的编码CBH2变体的DNA重组到菌株中，以利于过表达。可以通过构建携带编码变体的DNA的表达载体来制备编码CBH2变体的DNA。携带插入的编码CBH2变体的DNA片段的表达载体可以是任何载体，所述载体能够在给定宿主生物中自主复制，或整合到宿主的DNA中，典型的是质粒。在优选的实施方案中，考虑两种类型的表达载体用于获得基因的表达。第一种含有这样的DNA序列，所述序列中的启动子、基因编码区和终止子序列都源自待表达的基因。需要时，可以通过缺失不需要的DNA序列(例如，编码不需要的结构域的)获得基因截短，以将待表达的结构域保留在它自身的转录和翻译调控序列的控制下。载体上还可以含有可选择标志物，允许针对新基因序列的多个拷贝到宿主中的整合来进行选择。
第二种类型的表达载体是预装配的，含有高水平转录所需的序列和可选择标志物。考虑到基因的编码区或其部分可以插入到该通用表达载体中，使其处于表达盒的启动子和终止子序列的转录控制下。
例如，在曲霉属中，pRAX是此类通用表达载体。基因或其部分可以被插入到glaa强启动子的下游。
例如，在肉座菌属中，pTEX是此类通用表达载体。基因或其部分可以插入到cbh1强启动子的下游。
在载体中，编码本发明的CBH2变体的DNA序列应该与转录和翻译序列有效的连接，即，合适的启动子序列和与结构基因符合读框的信号序列。启动子可以是任何在宿主细胞中表现出转录活性的DNA序列，并可以源自编码蛋白质的基因，所述蛋白质与宿主细胞同源或异源的。为CBH2变体的胞外生产提供任选的信号肽。编码信号序列的DNA优选的是与待表达的基因天然相关的，然而，本发明考虑来自任何合适来源的信号序列，例如来自木霉属的外切纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶。
用于连接编码本发明的变体CBH2的DNA序列与启动子的方法，以及插入到合适载体中的方法是本领域普遍已知的。
可以根据已知的技术将上述DNA载体或构建体导入到宿主细胞中，例如转化、转染、显微注射、微穿孔(microporation)、生物射弹轰击等。
在优选的转化技术中，必须考虑在肉座菌属物种(木霉属物种)中，细胞壁对DNA的通透性是非常低的。因此，目的DNA序列、基因或基因片段的摄入最多是极微量的。有多种在转化步骤前增加衍生菌株(即，缺少与使用的可选择标志物对应的功能基因)中的肉座菌属物种(木霉属物种)细胞壁通透性的方法。
本发明中制备用于转化的曲霉属物种或肉座菌属物种(木霉属物种)的优选方法涉及从真菌菌丝体制备原生质体。参见Campbell等人。黑曲霉改良的转化效率使用硝酸还原酶的同源niaD基因，Curr.Genet.16：53-56；1989。可以从发芽的营养孢子获得菌丝体。用消化细胞壁的酶处理菌丝体，获得原生质体。然后，通过悬浮培养基中存在的渗透压稳定剂保护原生质体。这些稳定剂包括山梨糖醇、甘露糖醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变动。优选的在悬浮培养基中使用约1.2M的山梨糖醇溶液。
宿主菌株(曲霉属物种或肉座菌属物种(木霉属物种))摄入DNA依赖于钙离子浓度。通常在摄入溶液中使用约10mM CaCl2至50mM CaCl2。摄入溶液除了需要钙离子外，通常包括的其它物质是缓冲体系，例如TE缓冲液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。认为聚乙二醇通过融合细胞膜从而允许培养基内容物递送到宿主细胞的细胞质内来发挥作用，以曲霉属物种或肉座菌属物种菌株为例，质粒DNA被转移到细胞核中。所述融合经常导致多拷贝的质粒DNA整合到宿主染色体中。
通常，在转化中使用密度为10-5至10-6/mL，优选的2x10-5/mL的、含有曲霉属物种原生质体或已进行通透性处理的细胞的悬浮液。相似的，在转化中使用密度为10-8至10-9/mL，优选的2x10-8/mL的、含有肉座菌属物种(木霉属物种)原生质体或已进行通透性处理的细胞的悬浮液。将体积为100μL的适当溶液(例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)中的上述原生质体或细胞，与目的DNA混合。通常，向摄入溶液中添加高浓度的PEG。可以向原生质体悬浮液中添加0.1-1体积的25％PEG4000。然而，优选的向原生质体悬浮液中添加约0.25体积。还可以像摄入溶液中添加添加剂，例如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等，帮助转化。
通常，然后将混合物孵育在约0℃下10至30分钟。然后向混合物中添加额外的PEG，进一步增加目的基因或DNA序列的摄入。通常添加的25％PEG4000体积是5-15倍体积的转化混合物；然而，更多或更少体积可以是合适的。25％PEG4000体积优选的是约10倍体积的转化混合物。在添加PEG后，在添加山梨糖醇和CaCl2溶液之前，然后在室温或冰上孵育转化混合物。然后将原生质体悬浮液再进一步添加到融化的生长培养基的等分试样中。该生长培养基只允许转化体的生长。本发明中可以使用任何适合目的转化体生长的生长培养基。然而，如果选择Pyr+转化体，优选的使用不含尿苷的生长培养基。后续菌落被转移到缺少尿苷的生长培养基上，并进行纯化。
在此阶段，可以通过较快的生长速率以及例如木霉属中在缺少尿苷的固体培养基上形成具有光滑而非粗糙轮廓的圆形菌落，将稳定的转化体与不稳定的转化体区别开。此外，在一些情况下，可以通过在固体非选择性培养基(即，含尿苷的)上生长转化体，从该培养基中收获孢子，并确定这些孢子中随后可以在缺少尿苷的选择性培养基上发芽和生长的百分比，来进一步进行稳定性的测试。
在上述方法的特定实施方案中，在液体培养基中生长后，从宿主细胞中回收活性形态的CBH2变体，所述变体是CBH2变体的正确的翻译后加工的结果。
(ii)酵母
本发明还考虑了使用酵母作为宿主细胞用于CBH2生产。酿酒酵母的不同菌株中已表达了其它一些编码水解酶的基因。所述基因包括编码以下酶的序列：两种内切葡聚糖酶(Penttila等人，Yeast，第3卷，第175-185页，1987)、两种纤维二糖水解酶(Penttila等人，Gene，63：103-112，1988)和一种来自里氏木霉的β-葡糖苷酶(Cummings和Fowler，Curr.Genet.29：227-233，1996)、来自出芽短梗酶(Aureobasidliumpullulans)的木聚糖酶(Li和Ljungdahl，Appl.Environ.Microbiol.62，第1期，第209-213页，1996)、来自小麦的α-淀粉酶(Rothstein等人，Gene 55：353-356，1987)等。此外，在酿酒酵母的实验室菌株中，已经成功的表达了编码溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)内切-[β]-1，4-葡聚糖酶(END1)、黄孢原毛平革菌纤维二糖水解酶(CBH1)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)纤维糊精酶(CEL1)和Endomyces fibril izer纤维二糖酶(Bgl1)的纤维素酶基因盒(VanRensburg等人，Yeast，14卷，第67-76页，1998)。
C.将CBH2-编码核酸序列导入宿主细胞
本发明还提供了经遗传修饰包含外源提供的变体CBH2-编码核酸序列的细胞和细胞组合物。可以用克隆载体或表达载体遗传修饰(即，转导、转化或转染)亲本细胞或细胞系。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式，如上所述。
本发明的转化方法可以导致所有或部分的转化载体在丝状真菌基因组中的稳定整合。然而，还考虑导致维持自我复制的染色体外转化载体的转化。
可以使用多种标准的转染方法来生产表达大量异源蛋白质的里氏木霉细胞系。用于将DAN构建体导入到木霉属的纤维素酶-生产菌株的一些公开方法包括：Lorito，Hayes，DiPietro和Harman，1993，Curr.Genet.24：349-356；Goldman，VanMontagu和Herrera-Estrella，1990，Curr.Genet.17：169-174；Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen和Knowles，1987，Gene 6：155-164；对于曲霉属而言：Yelton，Hamer和Timberlake，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474；对于镰孢属而言：Bajar，Podila和Kolattukudy，1991，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 88：8202-8212；对于链霉菌属而言：Hopwood等人，1985，The John InnesFoundation，Norwich，UK；和对于芽孢杆菌属而言：Brigidi，DeRossi，Bertarini，Riccardi和Matteuzzi，1990，FEMS Microbiol.Lett.55：135-138。
用于将异源核酸构建体(表达载体)导入到丝状真菌(例如，红褐肉座菌)中的其它方法包括但不限于使用基因枪颗粒，在转化步骤前透化丝状真菌细胞壁(例如，通过使用高浓度的碱，如0.05M-0.4M CaCl2或醋酸锂)，原生质体融合或农杆菌介导的转化。通过用聚乙二醇和CaCl2处理原生质体或原生质球而转化丝状真菌的示例性方法描述在Campbell，E.I.等人，Curr.Genet.16：53-56，1989和Pentt ila，M.等人，Gene，63：11-22，1988中。
可以使用任何用于将外来核苷酸序列导入到宿主细胞中的普遍已知的方法。包括使用磷酸钙转染、polybrene，原生质体融合、电穿孔、生物射弹、脂质体、显微注射、细胞质载体(plasma vector)、病毒载体和任何其它普遍已知的方法，将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传材料导入到宿主细胞中(例如参见，Sambrook等人，见上文)。还可以使用在美国专利号6,255,115中描述的农杆菌介导的转化方法。使用的特定遗传工程方法只必须能够成功的导入至少一个基因到能够表达异源基因的宿主细胞中。
此外，可以在体外转录包含变体CBH2编码核酸序列的异源核酸构建体，并将获得的RNA通过普遍已知的方法导入到宿主细胞中，例如通过注射。
本发明还包括新的和有益的丝状真菌转化体，例如红褐肉座菌和黑曲霉，用于生产真菌纤维素酶组合物。本发明包括丝状真菌的转化体，特别是包含变体CBH2编码序列的真菌，或缺失了内源cbh编码序列的真菌。
在导入包含变体cbh2编码序列的异源核酸构建体后，可以根据需要在针对激活启动子、选择转化体或扩大变体CBH2-编码核酸序列的表达而修饰的常规营养培养基中培养遗传修饰的细胞。培养条件例如温度、pH等，是之前选定用于表达的宿主细胞所使用的，并对本领域技术人员是显而易见的。
通常认为已导入此类异源核酸构建体的细胞的后代包含在异源核酸构建体中可见的变体CBH2-编码核酸序列。
本发明还包括新的和有益的丝状真菌转化体，例如红褐肉座菌，用于生产真菌纤维素酶组合物。黑曲霉也可以用于生产变体CBH2。本发明包括丝状真菌的转化体，特别是包含变体cbh2编码序列的真菌，或缺失了内源cbh2编码序列的真菌。
通常可以通过较快的生长速率以及例如在木霉属中在固体培养基上形成具有光滑而非粗糙轮廓的圆形菌落，将稳定的丝状真菌转化体与不稳定的转化体区别开。此外，在一些情况下，可以通过在固体非选择性培养基上生长转化体，从该培养基中收获孢子，并确定这些孢子中随后可以在选择性培养基上发芽和生长的百分比，来进一步进行稳定性的测试。
VI.分离和纯化重组的CBH2蛋白质
一般而言，在细胞培养中生产的变体CBH2蛋白质被分泌到培养基中，并可以纯化或分离，例如，通过从细胞培养基中移出不需要的组分。然而，在一些情况下，变体CBH2蛋白质可能以细胞形态生产，必须从细胞裂解物中回收。在此情况下，使用本领域技术人员常规使用的技术从生产细胞中纯化变体CBH2蛋白质。实例包括但不限于亲和层析(Tilbeurgh等人，FEBSLett.16：215，1984)、离子交换层析法(Goyal等人，Bioresource Technol.36：37-50，1991；Fliess等人，Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314-318，1983；Bhikhabhai等人，J.Appl.Biochem.6：336-345，1984；Ellouz等人，J.Chromatography 396：307-317，1987)，包括使用具有高解析力(resolution power)的材料进行离子交换(Medve等人，J.Chromatography A 808：153-165，1998)、疏水相互作用层析(Tomaz和Queiroz，J.Chromatography A 865：123-128，1999)和两相分配(Brumbauer等人，Bioseparation 7：287-295，1999)。
通常，分级分离变体CBH2蛋白，以分离具有选择性质的蛋白质(所述性质例如与特定结合剂的结合亲和力，所述结合剂如抗体或受体)；或者具有选定的分子量范围，或等电点范围的蛋白质。
一旦实现给定变体CBH2蛋白质的表达，则从细胞或细胞培养物中纯化因而生产的CBH2蛋白质。适合此类纯化的示例性方法包括下列：抗体-亲和柱层析、离子交换层析；乙醇沉淀；逆向HPLC；在硅胶或在阳离子-交换树脂(例如DEAE)上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和凝胶过滤，其使用如Sephadex G-75。可以使用各种蛋白质纯化方法，且此类方法是本领域已知的，描述在例如Deutscher，Methods in Enzymology，第182卷，第57期，第779页，1990；Scopes，Methods Enzymol.90：479-91，1982中。选定的纯化步骤依赖于例如，使用的生产方法和生成的特定蛋白质的性质。
VII.Cbh2和CBH2的利用
可以理解变体cbh核酸、变体CBH2蛋白质和包含变体CBH2蛋白质活性的组合物可用于广泛的用途，其中一些如下述。
包含改变量的BG型、EG型和变体CBH型纤维素酶的、新的和改良的纤维素酶组合物可用于表现出增强的清洁能力的去垢剂组合物，作为软化剂发挥作用和/或改善棉织物的触感(例如，“石洗”或“生物抛光”)，用在将木浆降解为糖的组合物中(例如，用于生物乙醇生产)，和/或用于饲料组合物中。各类型纤维素酶的分离和表征提供了控制此类组合物各个方面的能力。
在一种方法中，本发明的纤维素酶可用于去垢剂组合物，或用于处理织物以改善触感和外观。
由于通过使用基因组中插入了至少一种其它拷贝的cbh基因的转化体可以增加纤维素产品的水解速率，因而可以以更快的速率和更大的程度降解含有纤维素或异多糖的产物。可以在垃圾填埋中更有效地降解由纤维素制成的产物，例如纸、棉花、纤维素棉织物等。因此，组合物中可以使用可自转化体获得的发酵产物或转化体本身，来帮助通过液化降解加入到过度拥挤的垃圾填埋场中的多种纤维素产物。
分步糖化和发酵是这样的过程，其中生物质(例如，玉米秸秆)中存在的纤维素转化为葡萄糖，然后酵母菌株将葡萄糖转化为乙醇。同时糖化发酵是这样的过程，其中生物质(例如，玉米秸秆)中存在的纤维素转化为葡萄糖，同时并在同一反应器中，酵母菌株将葡萄糖转化为乙醇。因此，在另一种方法中，本发明的变体CBH型纤维素酶可用于将生物质降解为乙醇。从可方便获得的纤维素来源生产乙醇提供了一种稳定的、可再生的燃料来源。
基于纤维素的原料包含农业废物、草和木头，以及其他低价值的生物质，例如城市废物(例如，再循环纸、庭院剪下物等)。可以从任何上述纤维素原料的发酵生产乙醇。然而，在可以转化为乙醇之前，纤维素必须首先转化为糖。
本发明的变体CBH可以与多种原料一起使用，其选择使用依赖于进行转化的地区。例如，在美国中西部，以农业废物例如小麦秸秆、玉米秸秆和蔗渣为主，而在加州则以稻秸秆为主。然而，应该理解，在任何地区都可以使用任何可获得的纤维素生物质。
本发明的方法可用于作为微生物的化学或发酵原料生产单糖、二糖和多糖，所述微生物用于生产有机产物、化学品和燃料、塑料和其它产物或中间产物。特别的是，通过纤维素或半纤维素的部分或完全溶解可以增加加工剩余物(干酒糟(dried distiller grain)、spent grains frombrewing、甘蔗渣，等)的价值。除乙醇外，从纤维素和半纤维素可以生产的一些化学品包括丙酮、醋酸盐、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如，乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醛、聚羟链烷酸酯、顺式，顺式-粘康酸、动物饲料和木糖。
含有增量的纤维二糖水解酶的纤维素酶组合物可用于乙醇生产。来自该工艺的乙醇可以进一步用作辛烷增值剂或直接作为汽油替代燃料(fuelin lieu of gasoline)，后者是有利的，因为乙醇作为燃料来源比石油衍生产物对环境更好。已知乙醇的使用可以改善空气质量，并可能降低局部的臭氧水平和烟雾。此外，乙醇在汽油替代中的应用对缓冲不可再生能源和石油化工供应的突然转移的影响是战略上重要的。
可以通过纤维素生物质(例如，木本、草本植物、城市固体废物以及农业和林业剩余物)的糖化和发酵过程来生产乙醇。然而，在微生物生产的天然存在的纤维素酶混合物中的各个纤维素酶的比例，对于生物质中的纤维素快速转化为葡萄糖可能不是最有效的。已知内切葡聚糖酶作用产生新的纤维素链末端，所述末端自身是纤维二糖水解酶作用的底物，从而改善了整个纤维素酶系统的水解效率。因此，使用增加的或优化的纤维二糖水解酶活性可以极大的增强乙醇的生产。
因此，本发明的纤维二糖水解酶可用于水解纤维素为其糖组分。在一个实施方案中，在添加发酵生物前，将变体纤维二糖水解酶添加到生物质中。在第二个实施方案中，将变体纤维二糖水解酶与发酵生物同时添加到生物质中。任选的，在任一种实施方案中都可以存在其他纤维素酶组分。
在另一个实施方案中，可以预处理纤维素的原料。预处理可以是通过升高温度，添加稀释的酸、浓缩的酸或稀释的碱溶液。预处理溶液被以足以至少部分的水解半纤维素组分的时间被添加，且然后被中和。
CBH2作用于纤维素的主要产物是纤维二糖，纤维二糖可以通过BG活性被转化为葡萄糖(例如，在真菌的纤维素酶产物中)。通过预处理纤维素的生物质，或者通过对生物质的酶促作用，可以从生物质中获得除葡萄糖和纤维二糖以外的其它糖。生物质的半纤维素内容物可以转化为(通过半纤维素酶)糖，例如木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。因此，在生物质转化过程中，酶促的糖化作用可以生产可用于生物或化学转化为其它中间产物或终产物的糖。因此，从生物质生成的糖可用于除乙醇生产以外的多种工艺中。此类转化的实例是葡萄糖发酵为乙醇(如M.E.Himmel等人，第2-45页，“Fuels and Chemicals from Biomass”，ACS Symposium Series666，编著B.C.Saha和J.Woodward，1997中综述的)和葡萄糖的其它生物转化，转化为2，5-二酮-D-葡糖酸(美国专利号6,599,722)、乳酸(R.Datta和S-P.Tsai，第224-236页，如上)、琥珀酸(R.R.Gokarn，M.A.Eiteman和J.Sridhar，第237-263页，同上)、1，3-丙二醇(A-P.Zheng，H.Biebl和W-D.Deckwer，第264-279页，同上)、2，3-丁二醇(C.S.Gong，N.Cao和G.T.Tsao，第280-293页，同上)，以及木糖向木糖醇的化学和生物转化(B.C.Saha和R.J.Bothast，第307-319页，同上)。还参见例如WO 98/21339。
除纤维素酶组合物以外(与纤维二糖水解酶的含量无关，即，不含纤维二糖水解酶、基本不含纤维二糖水解酶或增强的纤维二糖水解酶)，本发明的去垢剂组合物可以使用表面活性剂(包括阴离子、非离子和两性表面活性剂)、水解酶、增效剂、漂白剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、加溶剂、阳离子表面活性剂等。所有这类组分都是去垢剂领域已知的。上述纤维素酶组合物可以被添加到液体稀释剂、颗粒、乳液、凝胶、糊剂(paste)等形式的去垢剂组合物中。这些形式是本领域的技术人员已知的。当使用固体去垢剂组合物时，纤维素酶组合物优选的配制成颗粒。优选的，可以配制颗粒使其含有纤维素酶保护剂。关于更深入的讨论，参见名为“Detergent compositions containing cellulase compositionsdeficient in CBH2type components”的美国专利号6,162,782，其通过引用整合到本文中。
优选的，相对于总去垢剂组合物，使用的纤维素酶组合物为约0.00005重量百分比至约5重量百分比。更优选的，相对于总去垢剂组合物，使用的纤维素酶组合物为约0.0002重量百分比至约2重量百分比。
此外，变体CBH2核酸序列可用于鉴别和表征相关的核酸序列。可用于确定(预测或验证)相关基因或基因产物的功能的多种技术包括但不限于：(A)DNA/RNA分析，例如(1)过表达、异位表达和在其它物种中表达；(2)基因敲除(反向遗传学、靶向敲除、病毒诱导的基因沉默(VIGS，参见Baulcombe，100Years of Virology，Calisher和Horzinek编著，Springer-Verlag，New York，N.Y.15：189-201，1999))；(3)基因的甲基化状态分析，特别是侧翼调控序列；和(4)原位杂交；(B)基因产物分析，例如(1)重组蛋白表达；(2)抗血清生产；(3)免疫定位；(4)生物化学测定催化或其它活性；(5)磷酸化状态；和(6)通过酵母双杂分析与其它蛋白质的相互作用；(C)通路分析，例如基于过表达的表型或通过与相关基因的序列同源性，将基因或基因产物置于特定的生物化学或信号通路中；和(D)还可以实施的其它分析，来确定或验证分离的基因或其产物在特定代谢或信号传导通路中的参与，并帮助确定基因功能。
实验
下列实施例中更详细的描述了本发明，所述实施例并非以任何方式限制本发明要求保护的范围。附图意在认为是本发明的说明书和描述的整体的部分。提供下列实施例进行示例，而并非限制要求保护的发明。
在下列实验公开文本中，使用下列缩写：M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；nM(纳摩尔)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；℃(摄氏度)；Qs(适量)；ND(未进行)；NA(不适用)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(拷贝或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷酸三磷酸)；RNA(核糖核酸)；MgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量/体积)；v/v(体积/体积)；g(重力)；OD(光密度)；CNPG(氯代-硝基-苯基-β-D-葡糖苷)；CNP(2-氯代-4-硝基苯)；APB(酸预处理的蔗渣)；PASC(磷酸膨胀纤维素)；PCS(酸预处理的玉米秸秆)；Pi或PI(性能指数)；HPLC(高压液相色谱)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PCR(聚合酶链式反应)；RT-PCR(逆转录PCR)和SEL(位点评估文库)。
实施例1
测定
在下述实施例中使用下列测定。实施例中提示了关于下文提供的规程的任何偏离。在这些实验中，使用分光光度计测量反应完成后形成的产物的吸光度。
A.用于测量剩余葡萄糖的已糖激酶测定
使用己糖激酶测定测量表达CBH2变体的红褐肉座菌培养物上清液中的剩余葡萄糖。在96孔微滴定板(Costar Flat Bottom PS)中，将体积为5μl的上清液添加到195μl葡萄糖己糖激酶测定(InstrumentationLaboratory，Breda，Netherlands)中。在室温下孵育平板15分钟。孵育后，在340nm OD测量吸光度。表现出剩余葡萄糖的培养物上清液从混合中排除用于进一步研究。
B.用于确定蛋白质含量的HPLC测定
使用配置了Proswift RP 2H柱(Dionex)的Agilent 1100(HewletPackard)HPLC，来确定来自混合的培养物上清液的CBH2变体蛋白质的浓度。在用含0.01％三氟乙酸的10％乙腈平衡HPLC柱后，将10微升与50μl过滤的去矿物质水中的10％乙腈混合的样品注射。化合物的洗脱使用10％至30％乙腈梯度0.3-1分钟，然后用30％至65％的梯度1-4分钟。根据使用纯化的野生型CBH2(6.25、12.5、25、50μg/ml)生成的校准曲线确定CBH2变体的蛋白质浓度。为了计算性能指数(Pi或PI)，平均由变体生产的(平均)总蛋白与由相同剂量的野生型生产的(平均)总蛋白质的比例。
C.由磷酸膨胀纤维素(PASC)水解测定确定比活
纤维素水解：根据已公开的方法(Walseth，Tappi 35：228，1971；和Wood，Biochem J，121：353-362，1971)从Avicel制备磷酸膨胀纤维素(PASC)。用缓冲液和水稀释上述材料，获得1％w/v混合物，使醋酸钠的终浓度为50mM，pH 5.0。将100微升在50mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)中的1％PASC悬浮液分散在96孔微滴定板(Costar Flat Bottom PS)中。将10微升来自CBH2缺失菌株的5mg/ml培养物上清液添加到PASC中，并向其添加5、10、15或20μl的混合培养物上清液，所述混合的培养物上清液来自表达野生型CBH2或CBH2变体的红褐肉座菌细胞。从红褐肉座菌(也称为里氏木霉)中缺失CBH2基因描述在美国专利号5,861,271和5,650,322中。添加补偿体积的醋酸盐缓冲液，补足总体积的差异。密封微滴定板，在恒温孵育箱中50℃孵育，并以900rpm持续振荡。2小时后，通过向每个孔添加100μl甘氨酸缓冲液，pH 10终止水解反应。为了计算性能指数(Pi或PI)，平均由变体生产的(平均)总糖与由相同剂量的野生型生产的(平均)总糖的比例。用PAHBAH测定分析水解反应产物。
PAHBAH测定：将等分的150μl PAHBAH还原糖试剂(5％w/v对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH，Sigma#H9882，溶于0.5N HCl)(Lever，AnalBiochem，47：273-279，1972))添加到空微滴定板的所有孔中。将10微升的水解反应上清液添加到PABAH反应平板中。密封所有平板，在69℃孵育，并以900rpm持续振荡。1小时后，将平板置于冰上5分钟，720x g室温离心5分钟。将80μl显色的PAHBAH反应混合物样品转移到新鲜的(读数)平板，在分光光度计中测量410nm的吸光度。包括纤维二糖标准作为对照。生成野生型CBH2蛋白的剂量响应曲线。
D.通过稀释的酸预处理的玉米秸秆(PCS)的水解确定比活
预处理的玉米秸秆(PCS)：如描述的(Schell等人，J Appl BiochemBiotechnol，105：69-86[2003])用2％w/w H2SO4预处理玉米秸秆，然后用去离子水多次洗涤，获得具有pH 4.5的糊状物。然后，添加醋酸钠缓冲液(pH 5.0)至醋酸钠终浓度为50mM，如果需要，然后用1N NaOH滴定该混合物至pH 5.0。反应混合物中的纤维素浓度是约7％。向96孔微滴定板(Nunc Flat Bottom PS)的每个孔添加65微升的该纤维素悬浮液。将10微升5mg/ml的来自CBH2缺失菌株的培养物上清液添加到PCS中，并向其添加5、10、15或20μl来自表达野生型CBH2或CBH2变体的红褐肉座菌细胞的混合培养物上清液。添加补偿体积的醋酸缓冲液，补足总体积的差异。密封微滴定板后，将平板置于恒温孵育箱中50℃，并以1300rpm持续振荡5分钟。然后在50℃孵育平板，同时在80％湿度中220rpm振荡，防止干燥。7天后，将平板置于冰上5分钟，通过向每个孔添加100μl甘氨酸缓冲液，pH 10终止水解反应。用PAHBAH测定分析水解反应产物。为了计算性能指数(Pi或PI)，平均由变体生产的(平均)总糖与由相同剂量的野生型生产的(平均)总糖的比例。PAHBAH测定：将等分的150μl PAHBAH还原糖试剂(5％w/v对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH，Sigma#H9882，溶于0.5N HCl)(Lever，Anal Biochem，47：273-279，1972))添加到空微滴定板的所有孔中。将10微升的水解反应上清液添加到PABAH反应平板中。密封所有平板，在69℃孵育，并以900rpm持续振荡。1小时后，将平板置于冰上5分钟，720x g室温离心5分钟。将80μl显色的PAHBAH反应混合物样品转移到新鲜的(读数)平板，在分光光度计中测量410nm的吸光度。包括纤维二糖标准作为对照。生成野生型CBH2蛋白的剂量响应曲线。
E.通过氨预处理的玉米芯(CC)的水解确定比活
研磨玉米芯以通过0.9mm的筛，然后如在专利申请WO2006110901的实施例4(在此引入作为此方法的参考)中所描述的预处理。以在50mM醋酸钠(pH5.0)中的7％纤维素悬浮液使用预处理的玉米芯。将65微升的悬浮液加入96孔微滴定板(Nunc Flat Bottom PS)的每个孔中。对每个孔加入20μl 3.4mg/ml的补充0.23mg/ml纯化的里氏木霉β-葡萄糖苷酶I(Cel 3A)的菌株(Δegl1，Δegl2，Δcbh1，Δcbh2)上清。加入20或40微升表达野生型CBH2或CBH2变体的红褐肉座菌细胞的混合的培养上清。添加补偿体积的醋酸缓冲液，补足总体积的差异。在50℃孵育平板，同时在80％湿度中220rpm振荡，防止干燥。3天后，将平板置于冰上5分钟，添加100μl的100mM pH 10的甘氨酸。混合后，在3000rpm离心板5分钟。在190μl水中稀释10μl体积的上清。将20μl稀释的溶液转移至新的包含100μl ABTS葡萄糖测定混合物(2.74mg/ml 2，2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)，0.333U/ml VI型辣根过氧化物酶，1U/ml葡萄糖氧化酶)的96孔微滴定板(Costar Flat Bottom PS)，并在微滴定板分光光度计(Spectramax Plus 384，Molecular Devices)中记录到A420的增加。在每块板上包括一系列葡萄糖浓度作为标准物(6.25，12.5，25，50，100，200，400mM)。一式两份进行测定。通过用Langmuir方程(y＝(x*a)/(x+b))拟合数据生成野生型CBH2的剂量应答曲线，并用CBH2变体的活性除以相同板上的野生型CBH2的计算活性得到性能指数。
F.在存在乙醇的条件下CBH2变体的稳定性
在49℃下存在4.5％乙醇(EtOH)的条件下，测试野生型CBH2和CBH2变体的稳定性。将表达CBH2变体的红褐肉座菌细胞的混合培养物上清液(80μL)添加到含有10μl的40.5％EtOH/孔的96孔板(GreinerV-bottom PS)中。密封平板，在恒温孵育箱中49℃孵育16小时，并在900rpm振荡。孵育后，将平板置于冰上5分钟。如上述，使用磷酸膨胀纤维素(PASC)水解测定来确定剩余的CBH2活性。
为了计算剩余的活性，将向剩余活性PASC测定中添加5、10、15和20μl EtOH孵育的CBH2所形成的产物的值，除以向PASC测定中添加5、10、15和20μl不含EtOH的CBH2所形成的产物的值。然后，平均上述四种比例的单个值，产生平均剩余活性。为了确定变体的PI值，将变体的平均剩余活性的值，除以野生型CBH2对照的剩余活性值的平均值。
G.CBH2变体的热稳定性
在53℃测试野生型CBH2和CBH2变体的热稳定性。向96孔板(GreinerV-bottom PS)中添加表达CBH2变体的红褐肉座菌细胞的混合培养物上清液(80μL)。密封平板，在恒温孵育箱中53℃孵育16小时，并在900rpm振荡。孵育后，将平板置于冰上5分钟。如上述，使用磷酸膨胀纤维素(PASC)水解测定来确定剩余的CBH2活性。
为了计算剩余的活性，将向剩余活性PASC测定中添加5、10、15和20μl热处理CBH2所形成的产物的值，除以向PASC测定中添加5、10、15和20μl未热处理的CBH2所形成的产物的值。然后，平均上述四种比例的单个值，产生平均剩余活性。为了确定变体的PI值，将变体的平均剩余活性的值，除以野生型CBH2对照的剩余活性值的平均值。
实施例2
红褐肉座菌CBH2位点评估和组合文库的生成
将包含红褐肉座菌CBH2蛋白编码序列(SEQ ID NO：1)的pTTTpyr-cbh2质粒寄送至BASEClear(Leiden，The Netherlands)，GeneArt AG(Regensburg，Germany)，和Sloning BioTechnology GmbH公司(Puchheim，Germany)以生成位点评估文库(SEL)。图3中提供了pTTTpyr-cbh2的图谱。要求供应商在如表2-1显示的红褐肉座菌CBH2成熟蛋白(SEQ ID NO：3)的每个位点上生成位置文库。SEQ ID NO：2显示了CBH2全长蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1陈列了参考红褐肉座菌CBH2编码DNA序列：atgattgtcggcattctcaccacgctggctacgctggccacactcgcagctagtgtgcctctagaggagcggcaagcttgctcaagcgtctggggccaatgtggtggccagaattggtcgggtccgacttgctgtgcttccggaagcacatgcgtctactccaacgactattactcccagtgtcttcccggcgctgcaagctcaagctcgtccacgcgcgccgcgtcgacgacttctcgagtatcccccacaacatcccggtcgagctccgcgacgcctccacctggttctactactaccagagtacctccagtcggatcgggaaccgctacgtattcaggcaacccttttgttggggtcactccttgggccaatgcatattacgcctctgaagttagcagcctcgctattcctagcttgactggagccatggccactgctgcagcagctgtcgcaaaggttccctcttttatgtggctagatactcttgacaagacccctctcatggagcaaaccttggccgacatccgcaccgccaacaagaatggcggtaactatgccggacagtttgtggtgtatgacttgccggatcgcgattgcgctgcccttgcctcgaatggcgaatactctattgccgatggtggcgtcgccaaatataagaactatatcgacaccattcgtcaaattgtcgtggaatattccgatatccggaccctcctggttattgagcctgactctcttgccaacctggtgaccaacctcggtactccaaagtgtgccaatgctcagtcagcctaccttgagtgcatcaactacgccgtcacacagctgaaccttccaaatgttgcgatgtatttggacgctggccatgcaggatggcttggctggccggcaaaccaagacccggccgctcagetatttgcaaatgtttacaagaatgcatcgtctccgagagctcttcgcggattggcaaccaatgtcgccaactacaacgggtggaacattaccagccccccatcgtacacgcaaggcaacgctgtctacaacgagaagctgtacatccacgctattggacctcttcttgccaatcacggctggtccaacgccttcttcatcactgatcaaggtcgatcgggaaagcagcctaccggacagcaacagtggggagactggtgcaatgtgatcggcaccggatttggtattcgcccatccgcaaacactggggactcgttgctggattcgtttgtctgggtcaagccaggcggcgagtgtgacggcaccagcgacagcagtgcgccacgatttgactcccactgtgcgctcccagatgccttgcaaccggcgcctcaagctggtgcttggttccaagcctactttgtgcagcttctcacaaacgcaaacccatcgttcctgtaa。
SEQ ID NO：2陈列了红褐肉座菌CBH2全长蛋白序列：MIVGILTTLATLATLAASVPLEERQACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL。
SEQ ID NO：3陈列了红褐肉座菌CBH2成熟蛋白序列：QACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL。
对表2-1中列出的162个位点中的每一个位点，平均生成了18个取代变体。以编码CBH2变体蛋白的纯化质粒的形式接收文库。
表2-1：成熟的CBH2蛋白的选定位置
也由Sloning Biotechnology GmbH(Puchheim，Germany)和BaseClear公司(Leiden，The Netherlands)产生4个合成的CBH2组合文库。表2-2至2-5列出了在合成的CBH2组合文库中可存在的取代(根据CBH2成熟氨基酸序列编号)。
CBH2变体蛋白的产生
从上述服务商获得含有编码CBH2变体序列的可读框的、纯化的pTTTpyr-cbh2质粒(pcbh1，AmpR，AcetamideR)。如描述的(WO 2009/048488)，用pTTTpyr构建体转化四重缺失的红褐肉座菌菌株(Δeg1、Δeg2、Δcbh1、Δcbh2)的原生质体，并在含有乙酰胺的选择性琼脂上28℃生长7天。编码纤维二糖水解酶I(CBH I，Cel7a)、纤维二糖水解酶II(CBHII，Cel6a)、内切葡聚糖酶I(EG I，Cel7b)和内切葡聚糖酶II(EGII，Cel5a)的基因已经在四基因缺失菌株中失活。收获孢子，重新种植在乙酰胺琼脂上，并在28℃孵育7天。另外，将孢子收获在15％甘油中，并储存在-20℃下供进一步使用。关于CBH2变体蛋白质生产，在PVDF过滤平板中，将体积为10μl的孢子悬浮液添加到200ul补充了2％葡萄糖/槐糖(sophorose)混合物的甘氨酸基本培养基中：6.0g/L甘氨酸；4.7g/L(NH4)2SO4；5.0g/LKH2PO4；1.0g/L MgSO4·7H2O；33.0g/L PIPPS；pH 5.5；灭菌后添加～2％葡萄糖/槐糖混合物作为碳源，10ml/L的100g/L的CaCl2，2.5ml/L里氏木霉痕量元素(400X)：175g/L无水柠檬酸；200g/L FeSO4·7H2O；16g/LZnSO4·7H2O；3.2g/L CuSO4·5H2O；1.4g/L MnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3。各CBH2变体都一式四份的生长。在用透氧膜密封平板后，在28℃孵育平板6天，同时以220rpm振荡。在低压下，通过将培养基转移到微滴定板中收获上清液，如实施例1所述，利用己糖激酶测定测试剩余的葡萄糖。
实施例3
CBH2变体的表达、活性和稳定性
测试红褐肉座菌CBH2SEL和组合变体蛋白的多种目标性质。特别的是，如实施例1所述，利用HPLC测定(HPLC)测试纤维素酶变体的蛋白质表达，利用PASC水解测定(Act.PASC)和PCS水解测定(Act.PCS)测试比活，测试在存在乙醇(EtOH比例)条件下的稳定性和热稳定性(热比例)。如实施例1所述，利用氨预处理的玉米芯的水解(Sp.Act.CC)也测试了组合变体的比活。表3-1中显示了CBH2SEL变体的性能数据，表3-2中显示了CBH2组合变体的性能数据。缺乏性能数据的表3-2的行对应在初始测试中未表达的CBH2组合变体。
性能指数(PI)是变体纤维素酶与亲本或参照纤维素酶的性能比例。下列所述各种术语用于描述突变：上升突变具有PI＞1；中性突变具有PI＞0.5；非有害突变具有PI＞0.05；有害突变具有PI＝0.05；可组合突变是变体在至少一种性质上具有＝0.5，和在所有性质上＞0.05的性能指数值的突变。可组合突变是可以组合使蛋白质对一种或多种目标性质具有适当的性能指数的突变。突变发生的位置分类如下：非限制性位置对于至少一种性质具有≥20％的中性突变；限制性位置对活性和稳定性具有＜20％的中性突变。
这些数据可用于改造任何CBH。即使待改造的CBH2在特定位置具有不同于红褐肉座菌CBH2的氨基酸，通过鉴别最佳取代选项，这些数据可用于发现可以改变目标性质的取代，包括取代红褐肉座菌CBH2野生型氨基酸。
表3-1显示了红褐肉座菌CBH2在162个位置上的2，828个变体的性能指数值(Pi或PI)。将低于或等于0.05的性能指数固定为0.05，并在表格中以粗斜体表示。
不可组合的变体是所有Pi值≤0.05的变体。在红褐肉座菌CBH2的2，828个变体中，有6个是不可组合的。它们是A121Q，L243H，A322Q，L328C，L328Y，V436Y。相对红褐肉座菌CBH2具有上述取代之一的任意CBH2可通过将该氨基酸突变为在该位置上的可组合的取代之一，或突变为在红褐肉座菌CBH2的第121，243，322，328，或463位存在的氨基酸而得到改进。
实施例4
CBH2位置的分类
如一直描述地，以性能指数(PI)定量纤维素酶变体的功能性，其是变体纤维素酶与亲本或参照纤维素酶的性能比例。下列所述各种术语用于描述突变：上升突变具有PI≥1；中性突变具有PI＞0.5；非有害突变具有PI＞0.05；有害突变具有PI＝0.05；可组合突变是变体在至少一种性质上具有＝0.5，和在所有性质上＞0.05的性能指数值的突变。可组合突变是可以组合使蛋白质对一种或多种目标性质具有适当的性能指数的突变。突变发生的位置分类如下：非限制性位置对于至少一种性质具有≥20％的中性突变；限制性位置对活性和稳定性具有＜20％的中性突变。
如表4-1所示，在CBH2中测试的162位置上，所有162个都是非限制性的。非限制性位置是最适于在构建组合文库中使用的位置，因为其具有大量可组合的突变。
实施例5
电荷改变对CBH2变体活性的影响
在此实施例中，评估了电荷改变对PCS和PASC测定中的CBH2活性的影响。简而言之，确定在CBH2SEL中的PCS和PASC胜者数为净电荷改变的性质。在表5-1和5-2中，在PCS和PASC测定中确定观察到的胜者与预期胜者(o/e)的比例。粗斜体的值是与10个随机分布的均值加减各栏所列的标准偏差的数(sd)显著不同的。
如表5-1和图2A所示，减少的电荷(例如，-1、-2)导致PCS测定中显著较高的CBH2胜者频率，而增加的电荷(例如，+1)导致PCS测定中显著较低的CBH2胜者频率。相反地，如表5-2和图2B所示，在没有电荷改变(例如，0)的变体中观察到显著较高的CBH2胜者频率，而在电荷改变中(例如，-2、-1、+2)观察到显著较低的CBH2胜者频率。
总而言之，CBH2对PCS的活性与电荷减少相关。然而，CBH2对PASC的活性显示，此趋势不与纤维素酶水解活性相关，而是特异性针对PCS材料的。
实施例6
制备里氏木霉筛选菌株
制备了改进的筛选菌株，以提高在与酶变体的氨基酸序列无关的因素的存在下，CBH2变体表达的一致性。特别地，在与靶向载体的组合下开发了里氏木霉筛选菌株以强制cbh2变体基因的整合(例如，编码区与调控序列有效组合)。在本发明的开发中制备的新菌株组合了若干有利于筛选变体文库的突变。图4中显示了基因工程步骤的示意图。
从里氏木霉四基因缺失衍生菌株中缺失ku80。通过在红褐肉座菌QM6a(里氏木霉)的基因组序列中的TBLASTN搜索鉴定出人KU80的粗糙脉孢菌直向同系物，MUS52的单个直向同系物，并之后命名为里氏木霉ku80，蛋白质ID58213；http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html。里氏木霉ku80基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：23提供：ATGGCGGACAAGGAAGCAACCGTCTTCATCATCGACCTCGGCGCGTCCATGGCAGCTGTCAATGGGGGTCGAGAAGAATCCGACCTTGATTGGAGCATGAGCTACGTCTGGGACAAGATCAGCAACGTCGTGGCCTCGAATCGCAAGACGCTGTGCGTTGGCGTCGTGGGGTTCAGAACCGACGAGACAAACCACACGCTGAGCGAGGATGGGTACGAGAACATCTCCATATTGCAGCCCCTGGGGCCGATGAGCATGTCCAGCCTCAAGGCTCTTCAGCCCAAGGTGAAGCCGAGCAGGACGGTGGAAGGCGATGCCATCTCGGCGATTGTCATTGCCGTCGACATGATTGACAAGTACACGAAGAAGAACAAATGGAAGCGGCAGATTGTTCTCATTACCGACGGCCAAGGCGAGATTGATCCAGATGATATTGGCGACATTGCTAGAAAGATGCGCGACTCGAATATTGAATTGACAGTCTTGTGAGTTGGCGAGACCGTTTGGCGGACGGTAATGGTGCTGACGGTGATGCAAGGGGCGTCGACTTTGATGCTCCCGATTACGGCTTCAAAGAGGAGGACAAACCTTCAGTCAAGGTACTCCATATGTTCACTTCTTTTCTTTTTCTTCTTTATTTTCTTTTCTTTTGAAGCTTTCATTAACCTCTTCGTTAGAAGCAAAACGAAGAGACCCTAAAAAAGCTCGTGGATGGCTGTGGCGACGACTCAAGGTTCGCCTCCATGGTCGAGGCCATTGACGACTTGAATGAGCCACGAGCAAAGTCGGTCAAGCCTTACAAAACGTACGAAGGTCTCTTGACCTTGGGAGATCCGAAAAACGCTCCCGCAGTGGTGGAAATCCGCGTCGAGAGATACTTCAAGACCCATCTAGCCAGGCCACCTGCCGCCAGCACCGTGGTGGTCAAGGAGGAGCAAGCTGGGCCGTCTCAGGCAGACGAGGACGAACAGATGGACGGAGCGGAACTTACAGCTGTGAGGCAGGCCAGGACATACAAGGTCAATGATCCAGATGCCCCTGGCGGTAAGCGTGACGTTGAGTTTGAGTCTCTGGCCAAAGGGTACGAGTACGGCAGGACGGCAGTCCACATCAGCGAGTCTGATCAAAACGTCACCAAGCTCGCGACAGAAAAGAGCTTCAAGATCATCGGCTTCGTCCAGAAAGAAAAGGTATTGGCTTGGCTCTCAGCATTTGACCCGTTGCTCTTGGCTAACCCTTGTTTAGTATGAAATGCTCCTTAATCTTGGCGAAACCTGCGTTACCGTTGCATCCAAGTACGATGAAAAGTCTGAGCTGGCTTTTAGCTCTCTGGTGTGGGCGCTCTCGGAGCTCGACGCCTACGCCGTGGCCCGCCTAGTAACTAAGGACCAAAAGGACCCCATGCTGGTGTTACTGATGCCGTATATGGAGCCTGATTATGTTTGTCTCTATGATGTGCCTCTGCCTTTCGCAGAGGACATCAGGACGTACCAGTTTCCTCCCTTGGACAGAGTCGTTACCGTCAGTGGCCAAACGCTCACCAACCATCGCCTATTGCCATCCGACGAGCTCAACCAAGCGATGAGCGACTACGTAGATGCCATGGACATTTCAAGTTATGGTATCGATGAAGATGGGTGAGTATAGAAGATGATTGTTCAAATCTTTCACTTCTAAGCATTGCTTCTGATCTAGGCAACCGGCTGAATATGCCACCATCGATGAGTTATACAACCCTGCGATACATCGCATAGGCCATGCGATCAAACAACGAGCGATCCACCCAGAGAAACCCGTGCCCGAGATCCCCCCAGTCTTGCTTAGATTCGCAGCACCCCCGACAGAACTCGTCGAGACTGTGCAGCCTCATATCGATGCACTGATTCACGCTGCAGACGTGAAGAAAGGTACTGATTCCATTACATATGCTTCTCTGCACACTGATGTTTGATTTGTGCTAACGCCCCCCTTAGTGCCGCCCAAGGCCAAGGGCAAGCGCCAAAGAGAAACAGTTAAACCCATCTCGGGACTGGATGTGGATGCCCTTCTGGGAGAAGAGCAGAAAGGTTCCATTAGTCCGGAGAATGCCATTCCGGACTTCAAACGAGCCCTCAACTCGTCCGAAGAAGTCGAGCAGATTGCCGACGCCACAAAACAAATGGGGGCCATTGTGCGGTCTCTCATTACGGACAGCTTCGGGGATAGCAAATATGCCCAGGCAATGGAAGGCATTGGTGCGATGCGTGAGGAGCTGATCAACCTGGAAGAGCCTGGCCTGTACAACGACTTTGTGCGCGACTTGAAGAAAAGTTTGCTATCTGGAGCCTTGGGTGGTGACAGGCGAGATTTCTGGTTCAAGATGAGGTGGGCGAAGCTGGGCCTGATTGACAAGAAACAGTCGGAGGTGTCTTCGGTCACTCTTGAGGAGGCGGACGAGGTGAGTGGTGCAGCATGCTGTCGGATTATACGGACGTTGTTTGCTAACTTGTGGGATAGTTTTACAAGTCGAGGTGAGGTATCTACGTTGACCAAGAATGGGACCATGTATATGAGCGGTGTAACAACAGAATCCTGTGCTTTGAGCATTGTATGA
使用本领域标准方法(WO 2005/001036)从四基因缺失衍生菌株中缺失里氏木霉ku80基因。简单地说，利用如图5中图示的ku80缺失盒，其中使用两侧为5’ku80的1.3kb序列和3’ku80的2.3kb序列的可选择标记物。赋予对除草剂氯嘧磺隆抗性的变体里氏木霉als被用作如WO2008/039370中所述的可选择标记物。ku80敲除盒的核苷酸序列为7685bp的长度：碱基1-1271对应5’ku80同源区；碱基1280-7685对应als-氯嘧磺隆抗性变体(A190D)；和碱基5381-7685对应3’ku80同源区。ku80敲除盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：14提供：ggccgcctcaacacccacactcgaggcacacgagttcatcggcggcttcccccacaagctctcggccaacctgctaccggctctctcgcgagacttcccaaagcctacaaacgaggtcgacgtcaaggaggccctcgagcgccagcccggcagatggagcctccagggccagatcaaggccaacaacatgagagcccagagcgccgcactccggctcgacgacaaggagggcaaggcgagagcctttgaggaggccaagcgcgagctactggcgtatcaccacagcgccctgcggaagccttccggcgcaagataatgagcttgatcgcaatgacgagttcacgtacgctttgccatattgttgttgctttttgtttggtcctacatgtacggcgcattggttgggaggatatacccacggagagtgtccgagtggcttctgggatttagagcgtcattagcaggatagagatggttggccaggggaatggaattgacttttcactacaaggaacttgttcactctggtgttgattcccattgcgtgactggtagtagggaggaatgcttttactttgtgccactagaccgcagagaagggttggttgcaagcggggtccgtgtataccgaccaagagtgatgggcatacagcaacgtttctgaacgacttcattttgtccgagtctactggatgcgagatgccagcgtgaagccgtacgccaccagggcgacgaactcgacaaggttgacgagggaggagatgccgtgcagcatgccaaacttcttgttgagggcacgcatctcatccgactgtgcatccttgtcataccactcctttccgtctcgcttggctggtgggagggttcaacaaatccatcgtcagccatccggggtctcaaatcaatggcgtgcatgcggagtcgggcttgaggctaaccttgtccatggcggtccttcatggtcttgacagtggcgggaagcagcacggcgaggttgacgaggccgctgacgaacatggttgcgatgggcaccaaggagctccacttgttgggagcgtcgacgaggccgccgatgccgcccttgatgcccaagagggcgtttccggggaacgtgagggcgagcagcgcggggatggccgtctgcatgccaaagtagatggggaacagcttgctctggatggcggagaaggagggccggctgacggtgcggaacatgacgatgccgttgacgaaggactgcagtagcgtagtgtgatggtaagcagctggccggcgcgcctgagacaatggccggcaatggtaaaaaggaccaagatgtactaggtagttgcaatgtggcttattacctacctactacctggtaggcacctactaggtacttgggtagacggacaatgaaatttgaagtcggggttgcaggaaagcagggcgctggacacattgtgcttcaggcggtacccgtcgtcatcgtcagccaatgtcgaggcccggcagcccgaggagcgagacaaccttggccggaggagcccgcaggtacctgccaaagcgcggctggtacctctcaaccctctcaggcctgttggatgccctatgacatgccctgggggatgcagctgttgccccggccccgcactttcgggtgaccgcgaggctgctgattggctggttgccacgggctgggcggtccctgaagttgttgccatctgaactctgtcggcgctggcgtcggctgcgcccaatgggaggcgagacaactcagggtactagaatcactgacagaagaagagaatcgaaagtaggtagacagccaattcgttgcatggcaggcaaccgcacaggagaaaaattgactaccccacaatcaggcacagtaagtagggcacagtacgtatgtacagacaaggcgcaagcgatactgcgcgacccggtacctcgccggcttgacacgtgcgacaggctactttactagtattcgcagcggcgggtcgcgcattattacatgtactgtgccgccatttgatgactgggctgctgcagtattagtagatctgcccggcatcgcccttccatgggcgcgacccgggactggaccctctgactctacctacatgtacctaggccgggccgggcttggtgacttttgtccgatcaggtcgttcgcctggctacctattatttctctttcttcttctccatcctgcttctggccttgcaattcttcttcgccactcctccctcttccccccgcgatacccttgaattcgtcagagaggaaaagacgagaaaaaaaagggcagcagagacgtcggtctggctcacgtgctgcatctctgcgcactctcattttttttattgtccgacccctccctcaaccttctccttcgttgacaggctaagccttgcttcgacgctctctctttgaatttttctacttctaccttcttttcttgcgtgttacccaccatagctcgattcacgatgctccgaagtcgccaagtcacagccagggccgtccgggctctgggccaggcgcgcgcctttacctcgacgaccaagcctgtcatgatccagagcagccagaggaaacaggccaacgccagcgctgctccgtaagtcgcccattgccattgcatcttctgtttgatatatacttcctgctgcttgcgtggcgtcgtctctcggttatgcgtgtcaaggaccaggtgtgttcgcatcgtggttttccagcgccgattaccgggggacgaatttttggctgctcaactcgcgcgcgcgcattctgattcttcgttttcaatcttgagcgacaactggctaacataatggccattggcaattgcttcacacagacaagtccgccctgtaccgagccctgctttcaacgctgaagacaaagaccgcagccatgtgcagcctctggtcaacccgtcgaagcccgacatggatgaatcgtatgtccacgtcccctcgtcccgccctacaaaatgaacacgattacaccagaatttttgcaacaatcgacacttctataacagaccaattgagctttgttctgaccaatcatgttgctctagattcattggcaaaaccggaggcgaaatcttccacgagatgatgctgcgacagggtgtcaagcacatttgtaggttccgatgccggccgcccacacgggctccatccttgctccatctctccagctaggcaaatctcgctaaccttgagtcaccatccagtcggataccctggcggcgctatcctgcccgtcttcgacgccatctacaactcaaaacacttcgacttcatcctgccccgtcatgagcagggagctggccatatggccgagggctatgcccgtgcctcgggcaaacccggtgtcgtcctggtgacttccggccccggtgctaccaatgtcatcacgcccatgcaggatgccctgtcggacggaacgcccttggtcgtcttctgcggccaggtccccaccacggccatcggcagcgatgacttccaagaggccgacgtcgtgggcatctcgcgggcctgcaccaagtggaacgtcatggtcaagagcgttgctgagctgccgcggagaatcaacgaggcctttgagattgccaccagcggccgccctggccccgtcctcgtcgacctgcccaaggatgtcacggctggtatcctgaggagagccatccctacggagactgctctgccgtctctgcccagtgccgcctcccgcgccgccatggagctgagctccaagcagctcaacgcctccatcaagcgtgccgccgacctcatcaacatcgccaagaagcccgtcatctacgccggtcagggtgtcatccagtccgagggcggcgttgagctcctgaagcagctggcggacaaggcctccatccccgtcaccaccaccctccatggcctgggtgcctttgatgagctggacgagaagtcgctgcacatgctgggcatgcacggctcggcgtatgccaacatggccatgcagcaggccgacctcatcatcgccctcggcagccgattcgacgaccgtgttactctgaatgtctccaaatttgcgcctgcagccaggcaagctgctgccgagggccgcggcggcatcattcactttgagatcatgcccaagaacatcaacaaggtcatccaggcgaccgaggccgtcgagggcgacgtcgccaccaacctgaagcacctcattccccagattgccgaaaagtccatggcggaccgaggagagtggttcggcctcatcaatgagtggaagaagaagtggcccctgtcaaactaccagcgcgcggagcgggctggcctcatcaagccgcagacggtcatggaggagattagcaacctgacggccaaccgaaaggacaagacgtacattgccacgggtgtcggccagcaccagatgtgggttgcccagcacttccgctggaggcaccctcgatccatgattacctctggtggtctgggcaccatgggctacggtctccccgcggccattggcgccaaggtggcccagcccgacgctctcgtaattgacgttgatggcgatgcctcgtttaacatgacgctgacggagctgtcgactgctgcacagttcaacattggcgtcaaggtggttgtgctcaacaacgaggagcagggcatggtgacgcagtggcagaacctcttttacgaggaccgatatgcc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从里氏木霉Δku80四基因缺失衍生菌株制备Archy2菌株。从ku80敲除菌株中缺失pyr2基因。pyr2缺失盒包含里氏木霉chb1启动子、潮霉素抗性基因和两侧为5’和3’pyr2序列的部分amdS可选择标记物，如图6中图示。使用此载体允许筛选pyr2敲除转化体对潮霉素和氟乳清酸的抗性。部分amdS基因包含该基因的3’部分，但缺乏启动子和编码区的氨基端部分，因此是无功能的。pyr2敲除盒的核苷酸序列为9259bp的长度：碱基1-1994对应pyr23’同源区；碱基2002-3497对应里氏木霉cbh1启动子；碱基3563-5449对应潮霉素抗性可选择标记物；碱基5450-7440对应构巢曲霉amdS3’部分标记物；和碱基7441-9259对应pyr25’同源区。pyr2敲除盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：15提供：atcacgccctcgcataaaagaccctcaagagtccatgtgccctatctgcctgatcttcctaacccttatttaacattggccctatcacaacctagttcttcttcagcctgctttgtcaacacttgtcacggttcaactcaacgtaatcagcaggtagcaggacgaggatagggagagaaacgaagagaagaagaggagagaggaagaaaaaaaaaagaaaagaaagaaaaagggaaaaggaaagaaggaggaaaagagaagaaagtcagatgaagaagcaagaagacgccatggtagccaccgcttgtcagggctccttagcaacgaacaactctagcttggggacttgtcgatgtgtcgtttccttcctacccatcagcaccaacgatgagttcgatatagacgaggacctcatggaagtagagaccattgggttcgacaggatctctcagtttcact tctatgaggtctgtcgctcggatgactttttgaggagcttccccttctgcttcaaccccaaactctctttcctgaaaccgcagcacgttggcacggccgtgttgctggagcagtttgctttcgagcactctcagcgtggtttcagcagcccactggtgagtggcctcctttgacgtccacaccttgctcctgtcgcatgcgtatctggtgggaacgactgctccaaggaggattgctaacgaggttgtaggccgaatatcgcatcagattctccggtaaccttagctacggcctcttcaacatctgtgacatgacggagcgcaagtactggtggttggcgaccaagatgcgcggctggaacatcgacggctgccccgaagacgtcaggagactcatgtttgttcacatcatcgccaccctgggatgcagccccgtcgtgacggatgaagacatggactaccccaagaactgggcggcaattctccacggtagagacagatatccgagtgaacctgtgggccaccggcctcatgggcgcaccatctgcctccactcggtggccgtctgccctcgtctccagggcttgggtctcggtactgcgactctgaagtcgtatgtgcagcgcatgaacagcctcggcgccgcggaccgtgttgctctcgtttgccgcaagcccgagacgagattttttgaaagatgcggcttcaggaacagcggccggagtagtatcaagactctggtcggcgaatactacaacatggtgtgtgcttccacatcgacttggccagactctatacgattttcaaacctcgctatacgtcatattgacttgtttctttaggtcttcgatttgcccgggcccaaagactttatcgactggaatagcattgccgacgctgccaagaagatgtgaaccatttgactgatacgatgtgtgctacgcatgtcgaccttctttgtttgtttctttggcggctctttgtataccttgggacacggcagacgcatgtctatgtgaagaaaacgttcacggcgctgtttgcatcaggaatatgatcattaaacatggagcgtaatggtattaatgatcaactagaaaaatggtatggaagggcgagagggcgatcaacaaagcagcccggggcatagtctggaagcagcaggaattggaagggaaaaggaagctgcacaatgaagggatatcgtgagcggagtggctcacgagagtatcaacagactggcgaaagcaagcaattgccaacgccggctattaggccataagatggcctgttgtgagtcccagttgcacgtatccccatatgactgctctgtcgctgacttgaaaaaaaatagggaggataaaggagaaagaaagtgagacaacccgtgagggacttggggtagtaggagaacacatgggcaaccgggcaatacacgcgatgtgagacgagttcaacggcgaatggaaaatcttgaaaaacaaaataaaataactgccctccatacgggtatcaaattcaagcagttgtacggaggctagctagagttgtgaagtcggtaatcccgctgtatagtaatacgagtcgcatctaaatactccgaagctgctgcgaacccggagaatcgagatgtgctggaaagcttctagcgagcggctaaattagcatgaaaggctatgagaaattctggagacggcttgttgaatcatggcgttccattcttcgacaagcaaagcgttccgtcgcagtagcaggcactcattcccgaaaaaactcggagattcctaagtagcgatggaaccggaataatataataggcaatacattgagttgcctcgacggttgcaatgcaggggtactgagcttggacataactgttccgtaccccacctcttctcaacctttggcgtttccctgattcagcgtacccgtacaagtcgtaatcactattaacccagactgaccggacgtgttttgcccttcatttggagaaataatgtcattgcgatgtgtaatttgcctgcttgaccgactggggctgttcgaagcccgaatgtaggattgttatccgaactctgctcgtagaggcatgttgtgaatctgtgtcgggcaggacacgcctcgaaggttcacggcaagggaaaccaccgatagcagtgtctagtagcaacctgtaaagccgcaatgcagcatcactggaaaatacaaaccaatggctaaaagtacataagttaatgcctaaagaagtcatataccagcggctaataattgtacaatcaagtggctaaacgtaccgtaatttgccaacggcttgtggggttgcagaagcaacggcaaagccccacttccccacgtttgtttcttcactcagtccaatctcagctggtgatcccccaattgggtcgcttgtttgttccggtgaagtgaaagaagacagaggtaagaatgtctgactcggagcgttttgcatacaaccaagggcagtgatggaagacagtgaaatgttgacattcaaggagtatttagccagggatgcttgagtgtatcgtgtaaggaggtttgtctgccgatacgacgaatactgtatagtcacttctgatgaagtggtccatattgaaatgtaaagtcggcactgaacaggcaaaagattgagttgaaactgcctaagatctcgggccctcgggccttcggcctttgggtgtacatgtttgtgctccgggcaaatgcaaagtgtggtaggatcgaacacactgctgcctttaccaagcagctgagggtatgtgataggcaaatgttcaggggccactgcatggtttcgaatagaaagagaagcttagccaagaacaatagccgataaagatagcctcattaaacggaatgagctagtaggcaaagtcagcgaatgtgtatatataaaggttcgaggtccgtgcctccctcatgctctccccatctactcatcaactcagatcctccaggagacttgtacaccatcttttgaggcacagaaacccaatagtcaaccgcggactgcgcatcatgtatcggaagttggccgtcatctcggccttcttggccacacctcgtgctagactaggcgcgccaggaagcccggaaggtaagtggattcttcgccgtggctggagcaaccggtggattccagcgtctccgacttggactgagcaattcagcgtcacggattcacgatagacagctcagaccgctccacggctggcggcattattggttaacccggaaactcagtctccttggccccgtcccgaagggacccgacttaccaggctgggaaagccagggatagaatacactgtacgggcttcgtacgggaggttcggcgtagggttgttcccaagttttacacaccccccaagacagctagcgcacgaaagacgcggagggtttggtgaaaaaagggcgaaaattaagcgggagacgtatttaggtgctagggccggtttcctccccatttttcttcggttccctttctctcctggaagactttctctctctctcttcttctcttcttccatcctcagtccatcttcctttcccatcatccatctcctcacctccatctcaactccatcacatcacaatcgatatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggcc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从Archy2里氏木霉菌株制备Archy3菌株。用载体转化Archy菌株，以在相同的pyr2基因座整合并用pyr2基因的编码区替换潮霉素抗性基因。潮霉素缺失盒在图7中显示。将pyr2基因重新引回pyr2基因组使其置于里氏木霉chb1启动子和部分amdS可选择标记物之间。此菌株可用于选择尿苷原养型和对潮霉素的敏感性。hygR敲除盒的核苷酸序列为9088bp的长度：碱基1-1994对应pyr23’同源区；碱基1995-3497对应里氏木霉cbh1启动子；碱基3564-5137对应pyr2可选择标记物；碱基5280-7270对应构巢曲霉amdS 3’部分标记物；和碱基7271-9088对应pyr25’同源区。hygR敲除盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：16提供：atcacgccctcgcataaaagaccctcaagagtccatgtgccctatctgcctgatcttcctaacccttatttaacattggccctatcacaacctagttcttcttcagcctgctttgtcaacacttgtcacggttcaactcaacgtaatcagcaggtagcaggacgaggatagggagagaaacgaagagaagaagaggagagaggaagaaaaaaaaaagaaaagaaagaaaaagggaaaaggaaagaaggaggaaaagagaagaaagtcagatgaagaagcaagaagacgccatggtagccaccgcttgtcagggctccttagcaacgaacaactctagcttggggacttgtcgatgtgtcgtttccttcctacccatcagcaccaacgatgagttcgatatagacgaggacctcatggaagtagagaccattgggttcgacaggatctctcagtttcacttctatgaggtctgtcgctcggatgactttttgaggagcttccccttctgcttcaaccccaaactctctttcctgaaaccgcagcacgttggcacggccgtgttgctggagcagtttgctttcgagcactctcagcgtggtttcagcagcccactggtgagtggcctcctttgacgtccacaccttgctcctgtcgcatgcgtatctggtgggaacgactgctccaaggaggattgctaacgaggttgtaggccgaatatcgcatcagattctccggtaaccttagctacggcctcttcaacatctgtgacatgacggagcgcaagtactggtggttggcgaccaagatgcgcggctggaacatcgacggctgccccgaagacgtcaggagactcatgtttgttcacatcatcgccaccctgggatgcagccccgtcgtgacggatgaagacatggactaccccaagaactgggcggcaattctccacggtagagacagatatccgagtgaacctgtgggccaccggcctcatgggcgcaccatctgcctccactcggtggccgtctgccctcgtctccagggcttgggtctcggtactgcgactctgaagtcgtatgtgcagcgcatgaacagcctcggcgccgcggaccgtgttgctctcgtttgccgcaagcccgagacgagattttttgaaagatgcggcttcaggaacagcggccggagtagtatcaagactctggtcggcgaatactacaacatggtgtgtgcttccacatcgacttggccagactctatacgattttcaaacctcgctatacgtcatattgacttgtttctttaggtcttcgatttgcccgggcccaaagactttatcgactggaatagcattgccgacgctgccaagaagatgtgaaccatttgactgatacgatgtgtgctacgcatgtcgaccttctttgtttgtttctttggcggctctttgtataccttgggacacggcagacgcatgtctatgtgaagaaaacgttcacggcgctgtttgcatcaggaatatgatcattaaacatggagcgtaatggtattaatgatcaactagaaaaatggtatggaagggcgagagggcgatcaacaaagcagcccggggcatagtctggaagcagcaggaattggaagggaaaaggaagctgcacaatgaagggatatcgtgagcggagtggctcacgagagtatcaacagactggcgaaagcaagcaattgccaacgccggctattaggccataagatggcctgttgtgagtcccagttgcacgtatccccatatgactgctctgtcgctgacttgaaaaaaaatagggaggataaaggagaaagaaagtgagacaacccgtgagggacttggggtagtaggagaacacatgggcaaccgggcaatacacgcgatgtgagacgagttcaacggcgaatggaaaatcttgaaaaacaaaataaaataactgccctccatacgggtatcaaattcaagcagttgtacggaggctagatagagttgtgaagtcggtaatcccgctgtatagtaatacgagtcgcatctaaatactccgaagctgctgcgaacccggagaatcgagatgtgctggaaagcttctagcgagcggctaaattagcatgaaaggctatgagaaattctggagacggcttgttgaatcatggcgttccattcttcgacaagcaaagcgttccgtcgcagtagcaggcactcattcccgaaaaaactcggagattcctaagtagcgatggaaccggaataatataataggcaatacattgagttgcctcgacggttgcaatgcaggggtactgagcttggacataactgttccgtaccccacctcttctcaacctttggcgtttccctgattcagcgtacccgtacaagtcgtaatcactattaacccagactgaccggacgtgttttgcccttcatttggagaaataatgtcattgcgatgtgtaatttgcctgcttgaccgactggggctgttcgaagcccgaatgtaggattgttatccgaactctgctcgtagaggcatgttgtgaatctgtgtcgggcaggacacgcctcgaaggttcacggcaagggaaaccaccgatagcagtgtctagtagcaacctgtaaagccgcaatgcagcatcactggaaaatacaaaccaatggctaaaagtacataagttaatgcctaaagaagtcatataccagcggctaataattgtacaatcaagtggctaaacgtaccgtaatttgccaacggcttgtggggttgcagaagcaacggcaaagccccacttccccacgtttgtttcttcactcagtccaatctcagctggtgatcccccaattgggtcgcttgtttgttccggtgaagtgaaagaagacagaggtaagaatgtctgactcggagcgttttgcatacaaccaagggcagtgatggaagacagtgaaatgttgacattcaaggagtatttagccagggatgcttgagtgtatcgtgtaaggaggtttgtctgccgatacgacgaatactgtatagtcacttctgatgaagtggtccatattgaaatgtaaagtcggcactgaacaggcaaaagattgagttgaaactgcctaagatctcgggccctcgggccttcggcctttgggtgtacatgtttgtgctccgggcaaatgcaaagtgtggtaggatcgaacacactgctgcctttaccaagcagctgagggtatgtgataggcaaatgttcaggggccactgcatggtttcgaatagaaagagaagcttagccaagaacaatagccgataaagatagcctcattaaacggaatgagctagtaggcaaagtcagcgaatgtgtatatataaaggttcgaggtccgtgcctccctcatgctctccccatctactcatcaactcagatcctccaggagacttgtacaccatcttttgaggcacagaaacccaatagtcaaccgcggactgcgcatcatgtatcggaagttggccgtcatctcggccttcttggccacacctcgtgctagactaggcgcgtcaatatgtggccgttactcgagtttataagtgacaacatgctctcaaagcgctcatggctggcacaagcctggaaagaaccaacacaaagcatactgcagcaaatcagctgaattcgtcaccaattaagtgaacatcaacctgaaggcagagtatgaggccagaagcacatctggatcgcagatcatggattgcccctcttgttgaagatgagaatctagaaagatggcggggtatgagataagagcgatgggggggcacatcatcttccaagacaaacaacctttgcagagtcaggcaatttttcgtataagagcaggaggagggagtccagtcatttcatcagcggtaaaatcactctagacaatcttcaagatgagttctgccttgggtgacttatagccatcatcatacctagacagaagcttgtgggatactaagaccaacgtacaagctcgcactgtacgctttgacttccatgtgaaaactcgatacggcgcgcctctaaattttatagctcaaccactccaatccaacctctgcatccctctcactcgtcctgatctactgttcaaatcagagaataaggacactatccaaatccaacagaatggctaccacctcccagctgcctgcctacaagcaggacttcctcaaatccgccatcgacggcggcgtcctcaagtttggcagcttcgagctcaagtccaagcggatatccccctacttcttcaacgcgggcgaattccacacggcgcgcctcgccggcgccatcgcctccgcctttgcaaagaccatcatcgaggcccaggagaaggccggcctagagttcgacatcgtcttcggcccggcctacaagggcatcccgctgtgctccgccatcaccatcaagctcggcgagctggcgccccagaacctggaccgcgtctcctactcgtttgaccgcaaggaggccaaggaccacggcgagggcggcaacatcgtcggcgcttcgctcaagggcaagagggtcctgattgtcgacgacgtcatcaccgccggcaccgccaagagggacgccattgagaagatcaccaaggagggcggcatcgtcgccggcatcgtcg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从Archy3里氏木霉菌株制备A5D菌株。使用本领域已知的双重组载体从Archy3菌株中缺失天然的里氏木霉bgl1。使用潮霉素抗性作为bgl1缺失的可选择标记物。另外，潮霉素抗性标记物的两侧具有loxP位点。缺失盒在图8中显示。分析得到的潮霉素抗性转化体的bgl1缺失。随后用编码cre重组酶和用于选择转化体的有功能的amdS的端粒载体转化已确认缺失了bgl1的菌株，以通过cre重组酶的表达和从loxP位点成环脱离促进潮霉素的去除。编码cre重组酶的端粒载体在图10中图示。最初在乙酰胺培养基上得到转化体，然后转移至马铃薯葡萄糖琼脂并复制涂板在潮霉素培养基上以筛选潮霉素敏感性。将对潮霉素敏感的菌株再次转移至马铃薯葡萄糖培养基并复制涂板至乙酰胺培养基。选择失去在乙酰胺上生长的能力的菌株，这指示端粒载体的丢失。bgl1敲除盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：17提供：aatggtaggaatgctgggatataggctctgtgctggcaagttgatggatcctcgaatgaggccgccctgcaaggggaacatcagagatctaccattgcctccttggcccaatccactatcatacctacctcatgatcattcctgcgaaggtctaccagtaaatatttcctcgtcccgtgtttcatcatgtccagaacctcatctcgccaaattgactttgccacagtgtctggagctgggtaagcagcgtgccaaggaattgttgtcgagtctgtgccaggcattgtgcccgacattgtgaacttcagccaggagaacttttcgatcgcacctatgctgagcaccgtgggcatgcgatggcttcaataatgcagttcgagagggagtgtgtcatgccctaaagctcattggccacctccacaggctagctctacctgcatctgtagatggactttccttgtcctcctccttcagaaaacctcttggtcgctcgcaggtaactgttgttgccgtcattgtttgacagtggatagccaaggcaaaaccgtctgctttcaacggaagcattcggcggttgtttgtcatcgtgttatcgatcgaccaggagaacccagacgagtgttgttcgagagaatcatcgacgatgtgaagaggcgacgactagtatctagaagattataatcgaacaaatcagcgtttgtctgtcgggcgtttgagggcgcagttgcccgccaaagcagcgtcgcaatatataggcagcgagagactgtcaacagccagccgccatgtgatcgatcgtagccgtcttcccgatcttccctaaacccctttctttggggggcgggggcagcggcgttctaatatttgctggctgtctggataacgtgaatggtagacatggtaatgttcggtctgcgaaacatttgtacaattggagtttacgatcgagatggaaggaaacgctccacaaactcggtgactgggttgccatcaggtgctcagggcatagcgttctctgcaaatagaggaaagagaatagcactagtgaaagtgtgaatcacaatgaagaggaggttgttgccggaatgctttgagcagcgtcaaagttgaacttgaagctatcacaaattgcagggtaaagtacatgttggtgccagtttgacagcacagtgcgcggagcggaggatgtcgcggaagaggcgcgacgctaacccgggccttcttctcagtgagcagaactcctgctgcaagagttccttctctctgcgagatgacgtgaggcccaatttgcagcttccctcgaacaaggtgattgaacatctctcttccctcacatttcatcatcactacctcctcaattcacttctgcttcggccgtcttcatcattcatgttactgctctgatgcctatcctgaagattgtattcctgcagtattcacgccatcccaccttcggtcctcactcacagtcacaggtcaaccgccttcaccctcctcgcgatgatgtcggcaatctggtggatcaatgtgcggttgagggccgccgtagtgaggatgggcatggggaacgaggtcgcccattcgcccacagataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcctgggcttgtgactggtcgcgagctgccactaagtggggcagtaccattttatcggacccatccagctatgggacccactcgcaaatttttacatcattttctttttgctcagtaacggccaccttttgtaaagcgtaaccagcaaacaaattgcaattggcccgtagcaaggtagtcagggcttatcgtgatggaggagaaggctatatcagcctcaaaaatatgttgccagctggcggaagcccggaaggtaagtggattcttcgccgtggctggagcaaccggtggattccagcgtctccgacttggactgagcaattcagcgtcacggattcacgatagacagctcagaccgctccacggctggcggcattattggttaacccggaaactcagtctccttggccccgtcccgaagggacccgacttaccaggctgggaaagccagggatagaatacactgtacgggcttcgtacgggaggttcggcgtagggttgttcccaagttttacacaccccccaagacagctagcgcacgaaagacgcggagggtttggtgaaaaaagggcgaaaattaagcgggagacgtatttaggtgctagggccggtttcctccccatttttcttcggttccctttctctcctggaagactttctctctctctcttcttctcttcttccatcctcagtccatcttcctttcccatcatccatctcctcacctccatctcaactccatcacatcacaatcgatatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagagtagatgccgaccgggatccacttaacgttactgaaatcatcaaacagcttgacgaatctggatataagatcgttggtgtcgatgtcagctccggagttgagacaaatggtgttcaggatctcgataagatacgttcatttgtccaagcagcaaagagtgccttctagtgatttaatagctccatgtcaacaagaataaaacgcgtttcgggtttacctcttccagatacagctcatctgcaatgcattaatgcattggacctcgcaaccctagtacgcccttcaggctccggcgaagcagaagaatagcttagcagagtctattttcattttcgggagacgagatcaagcagatcaacggtcgtcaagagacctacgagactgaggaatccgctcttggctccacgcgactatatatttgtctctaattgtactttgacatgctcctcttctttactctgatagcttgactatgaaaattccgtcaccagcccctgggttcgcaaagataattgcactgtttcttccttgaactctcaagcctacaggacacacattcatcgtaggtataaacctcgaaaatcattcctactaagatgggtatacaatagtaaccatggttgcctagtgaatgctccgtaacacccaatacgccggccgataacttcgtatagcatacattatacgaagttatacttggcgcgcctagtggaacacgagcacataagcttttacctatggttatcgcttgcatctacgcgccgttgatggtggaggatggtggacgttcccgagacccctacgagctgtggcatcgtcaaactgtgcccacagacctttgtcttgctttcataacctcgaggagtgtttccagactcatcatccatacacaagcagtattaatcaaagaaactcggtcgcaatggcaaaaatggtttgcaaacagaaaactatggcctcttcctattccatcattaactactctacccgtttgtcataacaacatcattaaaacccttatgcgtcaggtgtagcatccttgatctgttgctcctccaacggccagttctcaatcgttacctcttctcccaccaactcaaactcaagcttcacagactcgtcggtgttcaaggctagctcatacttgccggggtatacaatccggtttccgtgagaatcaacacgggcgagagcactgacagggatg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端粒载体pTTT-cre的核苷酸序列如SEQ ID NO：18提供：ttgtacaaagtggtgatcgcgccgcgcgccagctccgtgcgaaagcctgacgcaccggtagattcttggtgagcccgtatcatgacggcggcgggagctacatggccccgggtgatttattttttttgtatctacttctgacccttttcaaatatacggtcaactcatctttcactggagatgcggcctgcttggtattgcgatgttgtcagcttggcaaattgtggctttcgaaaacacaaaacgattccttagtagccatgcattttaagataacggaatagaagaaagaggaaattaaaaaaaaaaaaaaaacaaacatcccgttcataacccgtagaatcgccgctcttcgtgtatcccagtaccagtttattttgaatagctcgcccgctggagagcatcctgaatgcaagtaacaaccgtagaggctgacacggcaggtgttgctagggagcgtcgtgttctacaaggccagacgtcttcgcggttgatatatatgtatgtttgactgcaggctgctcagcgacgacagtcaagttcgccctcgctgcttgtgcaataatcgcagtggggaagccacaccgtgactcccatctttcagtaaagctctgttggtgtttatcagcaatacacgtaatttaaactcgttagcatggggctgatagcttaattaccgtttaccagtgccatggttctgcagctttccttggcccgtaaaattcggcgaagccagccaatcaccagctaggcaccagctaaaccctataattagtctcttatcaacaccatccgctcccccgggatcaatgaggagaatgagggggatgcggggctaaagaagcctacataaccctcatgccaactcccagtttacactcgtcgagccaacatcctgactataagctaacacagaatgcctcaatcctgggaagaactggccgctgataagcgcgcccgcctcgcaaaaaccatccctgatgaatggaaagtccagacgctgcctgcggaagacagcgttattgatttcccaaagaaatcggggatcctttcagaggccgaactgaagatcacagaggcctccgctgcagatcttgtgtccaagctggcggccggagagttgacctcggtggaagttacgctagcattctgtaaacgggcagcaatcgcccagcagttagtagggtcccctctacctctcagggagatgtaacaacgccaccttatgggactatcaagctgacgctggcttctgtgcagacaaactgcgcccacgagttcttccctgacgccgctctcgcgcaggcaagggaactcgatgaatactacgcaaagcacaagagacccgttggtccactccatggcctccccatctctctcaaagaccagcttcgagtcaaggtacaccgttgcccctaagtcgttagatgtccctttttgtcagctaacatatgccaccagggctacgaaacatcaatgggctacatctcatggctaaacaagtacgacgaaggggactcggttctgacaaccatgctccgcaaagccggtgccgtcttctacgtcaagacctctgtcccgcagaccctgatggtctgcgagacagtcaacaacatcatcgggcgcaccgtcaacccacgcaacaagaactggtcgtgcggcggcagttctggtggtgagggtgcgatcgttgggattcgtggtggcgtcatcggtgtaggaacggatatcggtggctcgattcgagtgccggccgcgttcaacttcctgtacggtctaaggccgagtcatgggcggctgccgtatgcaaagatggcgaacagcatggagggtcaggagacggtgcacagcgttgtcgggccgattacgcactctgttgagggtgagtccttcgcctcttccttcttttcctgctctataccaggcctccactgtcctcctttcttgctttttatactatatacgagaccggcagtcactgatgaagtatgttagacctccgcctcttcaccaaatccgtcctcggtcaggagccatggaaatacgactccaaggtcatccccatgccctggcgccagtccgagtcggacattattgcctccaagatcaagaacggcgggctcaatatcggctactacaacttcgacggcaatgtccttccacaccctcctatcctgcgcggcgtggaaaccaccgtcgccgcactcgccaaagccggtcacaccgtgaccccgtggacgccatacaagcacgatttcggccacgatctcatctcccatatctacgcggctgacggcagcgccgacgtaatgcgcgatatcagtgcatccggcgagccggcgattccaaatatcaaagacctactgaacccgaacatcaaagctgttaacatgaacgagctctgggacacgcatctccagaagtggaattaccagatggagtaccttgagaaatggcgggaggctgaagaaaaggccgggaaggaactggacgccatcatcgcgccgattacgcctaccgctgcggtacggcatgaccagttccggtactatgggtatgcctctgtgatcaacctgctggatttcacgagcgtggttgttccggttacctttgcggataagaacatcgataagaagaatgagagtttcaaggcggttagtgagcttgatgccctcgtgcaggaagagtatgatccggaggcgtaccatggggcaccggttgcagtgcaggttatcggacggagactcagtgaagagaggacgttggcgattgcagaggaagtggggaagttgctgggaaatgtggtgactccatagctaataagtgtcagatagcaatttgcacaagaaatcaataccagcaactgtaaataagcgctgaagtgaccatgccatgctacgaaagagcagaaaaaaacctgccgtagaaccgaagagatatgacacgcttccatctctcaaaggaagaatcccttcagggttgcgtttccagtctagacacgtataacggcacaagtgtctctcaccaaatgggttatatctcaaatgtgatctaaggatggaaagcccagaatatcgatcgcgcgcagatccatatatagggcccgggttataattacctcaggaaatagctttaagtagcttattaagtattaaaattatatatatttttaatataactatatttctttaataaataggtattttaagctttatatataaatataataataaaataatatattatatagctttttattaataaataaaatagctaaaaatataaaaaaaatagctttaaaatacttatttttaattagaattttatatatttttaatatataagatcttttacttttttataagcttcctaccttaaattaaatttttacttttttttactattttactatatcttaaataaaggctttaaaaatataaaaaaaatcttcttatatattataagctataaggattatatatatatttttttttaatttttaaagtaagtattaaagctagaattaaagttttaattttttaaggctttatttaaaaaaaggcagtaatagcttataaaagaaatttctttttcttttatactaaaagtactttttttttaataaggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggtaagggtttaaacaaagccacgttgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcagcggtttaaacctaaccctaaccctaa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从A5D里氏木霉菌株制备MAD6菌株。使用前面描述的用于bgl1缺失的方法从A5D菌株中缺失天然的egl3。图9中显示了缺失盒的图示。使用潮霉素抗性作为egl3缺失的可选择标记物。潮霉素抗性标记物的两侧具有loxP位点。确认了具有egl3缺失的转化体。如在A5D菌株的制备中描述的，从此菌株中去除了潮霉素标记物。Egl3缺失盒的核苷酸序列如SEQ IDNO：19提供：gggaggtaggcgcagatacggtgcatgggacccgaacccgtaaccggaacacgaccttatcagccctccaactcacaccctctcgcctatcactatcctagatagttcatcggccaactcatgtaacctagctacctacctacctggtaagaatgcgggctatcatgtctcacggcgcggtacatgtcggtatctcgctgcttccccgcaggttgacgtcggaatccatgcaagtactccctgaaatcgagacgacagagagaacaaccaacgcgcttaaacgcttcatgttcatctaagaggcacattcgaagaactagcttaacacactagacctggcttttcgaccccctccgcagaaagccgttttctcctcaatcctcccgggcttggcttttgtcagtccgtacttgctgcgctaacagagtcttggacgcagcgtttgcgcatcagtcttgcaggcggttcacgggactaggacaacaggggatgtgacaggccggatagtaattatgggttatccggggtaagcagggaatttacgaggccgctttacgtgggggaacagccacttgcggggggaagaggagtagtaggcgactcggtcgatgagctcgaggtgtctggttgacttggactgcagagcgtaggtaattgagatcgggcaacattatcggtgttcggctcggtatggccgagttgcgactgcttggtcattcggcgaagctgatgtcgtggtatcctgaagcatcgatatcggaaaccatgatggtcagtctatctgacgtgtgcggtgacaagcgagtccggattttgtgacatgacgttcaacttcagtcaatgccttagggctcgataagattaagattgggttctggcagcggtctagaacaccgccacaaattctgtccattgaggagcgtgatgtctaggcgcatcactaacacggagctgtatgaccggcagctcaacggacttctcttcgttcaacggcagtctatttgcggtacacgaatggatctttcttcctggtcttgaagtgccgcagtggcgtgcgaatgtatagatgtctcgctacctagaaaagctggcttttctgacagggtcccttccacctctcctaccaacgacaaactgaacaagtatctggcggtttcccaacgccgaataggccagtcgccaatactccctccagccctgattgggcccctcgaagtatcgccatgtctgtgtgttgagattattcgatggacgtcactcccccaacctacaggaagagcaaaatgggagcagtgttctgcaatgagctatataatagatcgctcgatctcatacaaattgtatgctcagtcaatacaacgagcggttccaagatcccttctccaacgaccctcgaaacattgcaacccggtgcagcctgaacttgttcgtatagcctagaaagcgacgccatcttcatcttttacgcgattagcctcatggctatttgtgccgaagtgggagttgtatggtagcagtgaggagattgtggctacgacacaggcgggttctcttgagcggcttacatctccgcattaggcctgcgtacgatccagatcatgggaaactttacaatggcttactcgttttatctcaacactgagcttccaattcactctatgcattgattaacacgtttggtcatgtggttcttcagctgtaaatcttcagcttcccaagaattgcaacctcgctgattgctaatagtgttgcatgcgttgcatcctggtgcggcagtgcaaaggagagtcaaagtagccggcagattaatttaagcttatatcactcaggggtaaacagccgtaaaggaccttttgatctaacatgccgatgtgtatgtagatcacgcaatgcccaccatatcttggcagtcagatttgtccgtggcgcgccaagtataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatcggccggcgtattgggtgttacggagcattcactaggcaaccatggttactattgtatacccatcttagtaggaatgattttcgaggtttatacctacgatgaatgtgtgtcctgtaggcttgagagttcaaggaagaaacagtgcaattatctttgcgaacccaggggctggtgacggaattttcatagtcaagctatcagagtaaagaagaggagcatgtcaaagtacaattagagacaaatatatagtcgcgtggagccaagagcggattcctcagtctcgtaggtctcttgacgaccgttgatctgcttgatctcgtctcccgaaaatgaaaatagactctgctaagctattcttctgcttcgccggagcctgaagggcgtactagggttgcgaggtccaatgcattaatgcattgcagatgagctgtatctggaagaggtaaacccgaaacgcgttttattcttgttgacatggagctattaaatcactagaaggcactctttgctgcttggacaaatgaacgtatcttatcgagatcctgaacaccatttgtctcaactccggagctgacatcgacaccaacgatcttatatccagattcgtcaagctgtttgatgatttcagtaacgttaagtggatcccggtcggcatctactctattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttctgcgggcgatttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggtcaagaccaatgcggagcatatacgcccggagccgcggcgatcctgcaagctccggatgcctccgctcgaagtagcgcgtctgctgctccatacaagccaaccacggcctccagaagaagatgttggcgacctcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcggggcagtcctcggcccaaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatgtagtgtattgaccgattccttgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctggctaagatcggccgcagcgatcgcatccatggcctccgcgaccggctgcagaacagcgggcagttcggtttcaggcaggtcttgcaacgtgacaccctgtgcacggcgggagatgcaataggtcaggctctcgctgaattccccaatgtcaagcacttccggaatcgggagcgcggccgatgcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaaccatcggcgcagctatttacccgcaggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagattcttcgccctccgagagctgcatcaggtcggagacgctgtcgaacttttcgatcagaaacttctcgacagacgtcgcggtgagttcaggctttttcatatcgattgtgatgtgatggagttgagatggaggtgaggagatggatgatgggaaaggaagatggactgaggatggaagaagagaagaagagagagagagaaagtcttccaggagagaaagggaaccgaagaaaaatggggaggaaaccggccctagcacctaaatacgtctcccgcttaattttcgcccttttttcaccaaaccctccgcgtctttcgtgcgctagctgtcttggggggtgtgtaaaacttgggaacaaccctacgccgaacctcccgtacgaagcccgtacagtgtattctatccctggctttcccagcctggtaagtcgggtcccttcgggacggggccaaggagactgagtttccgggttaaccaataatgccgccagccgtggagcggtctgagctgtctatcgtgaatccgtgacgctgaattgctcagtccaagtcggagacgctggaatccaccggttgctccagccacggcgaagaatccacttaccttccgggcttccgccagctggcaacatatttttgaggctgatatagccttctcctccatcacgataagccctgactaccttgctacgggccaattgcaatttgtttgctggttacgctttacaaaaggtggccgttactgagcaaaaagaaaatgatgtaaaaatttgcgagtgggtcccatagctggatgggtccgataaaatggtactgccccacttagtggcagctcgcgaccagtcacaagcccaggataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatctgtgggcgttatgaataatagactggaaccgggccctttgattgacgactccatattttgtagatgtagcaactcggcaagagcattatgtgcaatacatttgttaccatacaaaggcagctgccagacgacttgtattgcgtacaattctcacggcaagctttccaggtgttatgcattatgcgcaaatgcttgatgcttaccgcaggattaatctcggaagaagcgctgcaagctatatgggtgtagtagatatgtagatgtaccaaccaatgaagaacatttatggtctagaacgtagtgatgaaggttttgagtaatttgtatcaagtaagacgatattattgatataataccaagcatatatt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实施例7
在活性和热稳定性测定中选择单取代的CBH2变体的分析
如描述的(WO 2009/048488)，用在pTTTpyrG载体上编码的选定的CBH2SEL变体转化6基因缺失的里氏木霉菌株(Δegl1，Δegl2，Δegl3，Δcbh1，Δcbh2，Δbgl1)的原生质体。收获孢子，在乙酰胺琼脂上重新涂板，并在28℃培养7天。下一步，通过用在琼脂上形成孢子的木霉菌株接种25ml的YEG培养基(5g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖)，接着在28℃，200rpm下培养2天的时间制备CBH2变体。使用5ml YEG培养物接种45ml含有2％葡萄糖槐糖混合物的甘氨酸培养基。将培养物分液在6孔微滴定板中并在富含氧气的空气中在28℃静置培养5天。通过0.2μm滤器的过滤去除细胞。然后使用具有10kD截止分子量的Vivaspin旋转小室(spincell)浓缩上清。检测了变体在50℃水解磷酸膨胀纤维素(PASC)、在50℃水解稀释的酸预处理的玉米秸秆(PCS)、在50℃和57℃水解稀释的氨预处理的玉米芯(CC)的能力。另外，检测了变体的热稳定性。
PASC 50℃。基本上如在实施例1，章节C中描述的检查了对磷酸膨胀纤维素的酶活性，具有以下改动。对每个孔加入10μl包含4.9μg来自CBH2缺失菌株(Δegl1，Δegl2，Δcbh1，Δcbh2)蛋白质的上清。在50℃孵育板，同时以200rpm摇晃。2小时后将板置于冰上5分钟并加入100μl的100mM甘氨酸pH10.0。混合后，以3000rpm离心板5分钟。在160μl水中稀释40μl体积的上清。将10μl稀释的溶液转移至新的包含100μl ABTS葡萄糖测定混合物(2.74mg/ml 2，2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)，1U/ml VI型辣根过氧化物酶，1U/ml葡萄糖氧化酶)的96孔微滴定板(Costar Flat Bottom PS)，并在微滴定板分光光度计(Spectramax Plus 384，Molecular Devices)中记录A420的增加。在每块板上包括一系列葡萄糖浓度作为标准物(0；0.008；0.016；0.031；0.063；0.125；0.25；0.5；1mg/ml)。一式两份进行测定。通过用Temkin等温线方程(y＝a+b(ln(1+c*x)))拟合数据生成野生型CBH2的剂量应答曲线，并用CBH2变体的活性除以相同板上的野生型CBH2的计算活性得到性能指数。
PCS 50℃。基本上如在实施例1，章节D中描述的检查了对洗过的稀释的酸预处理的玉米秸秆的酶活性，具有以下改动。对每个孔加入10μl包含4.9μg来自BH2缺失菌株(Δegl1，Δegl2，Δcbh1，Δcbh2)的蛋白质上清。在50℃孵育板，同时以200rpm摇晃。2天后将板置于冰上5分钟并加入100μl的100mM甘氨酸pH 10.0。混合后，以3000rpm离心板5分钟。在190μl水中稀释10μl体积的上清。将10μl稀释的溶液转移至新的包含100μl ABTS葡萄糖测定混合物的96孔微滴定板(Costar Flat Bottom PS)，并如上面对PASC测定所描述的测定和分析。
玉米芯50℃。基本上如在实施例1，章节E中描述的进行对玉米芯在50℃的酶活性检验，具有以下改动。对每个孔加入10μl包含46.55μg来自CBH2缺失菌株(Δegl1，Δegl2，Δcbh1，Δcbh2)的蛋白质的上清，补充4.90μg里氏木霉CBH1，6.84μg里氏木霉Xyn2Y5(Xiong等人，Extremophiles 8：393-400，2004)，2.28μg轮状镰刀霉(Fusariumverticillioides)(Fv)51A，5.32μg Fv3A，0.76μg Fv43D，和2.45μg里氏木霉BGL1。在US 61/245269(在此处引入作为教授此方法的参考)中描述了轮状镰刀霉的酶。如实施例1中描述的加入不同体积的表达CBH2变体的转化的里氏木霉菌株的上清。在50℃培养板2天，同时以200rpm摇晃。
玉米芯57℃。研磨玉米芯以通过0.9mm的筛，然后如WO 2006/110901(在此处引入作为传授此方法的参考)的实施例4中所描述的预处理。预处理的玉米芯作为在50mM醋酸钠pH5.0中的7％纤维素悬浮液使用。对96孔微滴定板(Nunc Flat Bottom PS)的每个孔加入70微升悬浮液。对每个孔加入10μl包含来自CBH2缺失菌株(Δegl1，Δegl2，Δcbh1，Δcbh2)的46.55μg蛋白质的上清，4.90μgCBH1变体S8P/T41I/N89D/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/E295K/T296P/T332Y/V403D/S411F/T462I)，6.84μg里氏木霉Xyn2Y5(Xiong等人，Extremophiles 8：393-400，2004)，2.28μg Fv51A，5.32μg Fv3A，0.76μg Fv43D，和2.45μg埃默森篮状菌β-葡糖苷酶的溶液。加入最多20微升表达野生型CBH2或CBH2变体的红褐肉座菌细胞上清。加入补偿体积的醋酸缓冲液以补足总体积的差异。在57℃孵育板，同时以200rpm摇晃。2天后将板置于冰上5分钟并加入100μl的100mM甘氨酸pH 10.0。混合后，以3000rpm离心板5分钟。在190μl水中稀释10μl体积的上清。将10μl稀释的溶液转移至新的包含100μl ABTS葡萄糖测定混合物的96孔微滴定板(Costar Flat Bottom PS)，并如上所述测定和分析。
CBH2热稳定性测定2。为了测定CBH2变体的热稳定性，在50-70℃温度范围的PCR仪器中孵育50μl上清。通过将20μl上清与80μl 0.625mg/ml纤维三糖在50mM含0.0025％Tween80的醋酸钠缓冲液pH5.0中孵育，测定剩余活性。1小时后，加入40μl的100mM甘氨酸pH10。将20μl加至80μl ABTS试剂(见上文)并在OD420处记录显色5分钟。通过用以下公式在每个温度上拟合剩余活性，计算假熔解温度(Tm)：
y＝1/(1+exp(-(a*(1-b/c-ln(c/b))+d*((1/c)-(1/b)))/e))
其中，a是热容量(kcal*mol-1*K-1)，b是熔解温度(K)，c是测定温度(K)，d是焓变(kcal*mol-1*K-1)，和e是气体常数(kcal*mol-1*K-1)。
1通过热稳定性测定2测定的。在检测条件下，SEQ ID NO：3的参考CBH2的Tm是57.5℃。
设计了一系列突变，其为具有高度可组合性的突变，以包含具有在至少一个性质上＞0.75和在所有性质上＞0.05的PI的突变。如在随后的实施例中说明的，一些具有2个可高度组合的突变的变体具有高于参考CBH2酶的活性和/或稳定性。可高度组合的突变的积累可用于产生有利的变体，其中每个单独的突变不足以赋予变体酶高活性、热稳定性和/或表达水平。
实施例8
CBH2组合文库变体及其活性
由GeneOracle(Mountain View，CA)制备合成的CBH2组合文库。表8-1列出了CBH2组合文库成员的可能的取代(根据CBH2成熟氨基酸序列编号)。通过组合基于如表7-1中所列的其Tm和性能被归类为上升突变和/或可高度组合的突变的取代，产生此文库。
从上述供应商处以纯化的PCR产物的形式接收文库，其中使用引物GACCGGACGTGTTTTGCCCTTCAT(SEQ ID NO：20)和GTGTGACCGGCTTTGGCGAGTG(SEQ ID NO：21)扩增cbh2基因，其上游侧翼为约1.1kb的cbh1启动子和下游为约1.85kb的amdS标记物，用于强制整合进红褐肉座菌宿主菌株中的pyr2基因座。在图11中显示了表达盒同源重组进筛选菌株的图示。使用引物SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21从pTTTpyrG-CBH2上扩增的PCR片段(部分cbh1启动子，cbh2基因，和部分amdS)的核苷酸序列如下SEQ IDNO：22提供：gaccggacgtgttttgcccttcatttggagaaataatgtcattgcgatgtgtaatttgcctgcttgaccgactggggctgttcgaagcccgaatgtaggattgttatccgaactctgctcgtagaggcatgttgtgaatctgtgtcgggcaggacacgcctcgaaggttcacggcaagggaaaccaccgatagcagtgtctagtagcaacctgtaaagccgcaatgcagcatcactggaaaatacaaaccaatggctaaaagtacataagttaatgcctaaagaagtcatataccagcggctaataattgtacaatcaagtggctaaacgtaccgtaatttgccaacggcttgtggggttgcagaagcaacggcaaagccccacttccccacgtttgtttcttcactcagtccaatctcagctggtgatcccccaattgggtcgcttgtttgttccggtgaagtgaaagaagacagaggtaagaatgtctgactcggagcgttttgcatacaaccaagggcagtgatggaagacagtgaaatgttgacattcaaggagtatttagccagggatgcttgagtgtatcgtgtaaggaggtttgtctgccgatacgacgaatactgtatagtcacttctgatgaagtggtccatattgaaatgtaaagtcggcactgaacaggcaaaagattgagttgaaactgcctaagatctcgggccctcgggccttcggcctttgggtgtacatgtttgtgctccgggcaaatgcaaagtgtggtaggatcgaacacactgctgcctttaccaagcagctgagggtatgtgataggcaaatgttcaggggccactgcatggtttcgaatagaaagagaagcttagccaagaacaatagccgataaagatagcctcattaaacggaatgagctagtaggcaaagtcagcgaatgtgtatatataaaggttcgaggtccgtgcctccctcatgctctccccatctactcatcaactcagatcctccaggagacttgtacaccatcttttgaggcacagaaacccaatagtcaaccatcacaagtttgtacaaaaaagcaggctccgcggccgcccccttcacccaccatgattgtcggcattctcaccacgctggctacgctggccacactcgcagctagtgtgcctctagaggagcggcaagcttgctcaagcgtctggtaattatgtgaaccctctcaagagacccaaatactgagatatgtcaaggggccaatgtggtggccagaattggtcgggtccgacttgctgtgcttccggaagcacatgcgtctactccaacgactattactcccagtgtcttcccggcgctgcaagctcaagctcgtccacgcgcgccgcgtcgacgacttctcgagtatcccccacaacatcccggtcgagctccgcgacgcctccacctggttctactactaccagagtacctccagtcggatcgggaaccgctacgtattcaggcaacccttttgttggggtcactccttgggccaatgcatattacgcctctgaagttagcagcctcgctattcctagcttgactggagccatggccactgctgcagcagctgtcgcaaaggttccctcttttatgtggctgtaggtcctcccggaaccaaggcaatctgttactgaaggctcatcattcactgcagagatactcttgacaagacccctctcatggagcaaaccttggccgacatccgcaccgccaacaagaatggcggtaactatgccggacagtttgtggtgtatgacttgccggatcgcgattgcgctgcccttgcctcgaatggcgaatactctattgccgatggtggcgtcgccaaatataagaactatatcgacaccattcgtcaaattgtcgtggaatattccgatatccggaccctcctggttattggTAtgagtttaaacacctgcctccccccccccttcccttcctttcccgccggcatcttgtcgttgtgctaactattgttccctcttccagagcctgactctcttgccaacctggtgaccaacctcggtactccaaagtgtgccaatgctcagtcagcctaccttgagtgcatcaactacgccgtcacacagctgaaccttccaaatgttgcgatgtatttggacgctggccatgcaggatggcttggctggccggcaaaccaagacccggccgctcagctatttgcaaatgtttacaagaatgcatcgtctccgagagctcttcgcggattggcaaccaatgtcgccaactacaacgggtggaacattaccagccccccatcgtacacgcaaggcaacgctgtctacaacgagaagctgtacatccacgctattggacctcttcttgccaatcacggctggtccaacgccttcttcatcactgatcaaggtcgatcgggaaagcagcctaccggacagcaacagtggggagactggtgcaatgtgatcggcaccggatttggtattcgcccatccgcaaacactggggactcgttgctggattcgtttgtctgggtcaagccaggcggcgagtgtgacggcaccagcgacagcagtgcgccacgatttgactcccactgtgcgctcccagatgccttgcaaccggcgcctcaagctggtgcttggttccaagcctactttgtgcagcttctcacaaacgcaaacccatcgttcctgtaaAagggtgggcgcgccgacccagctttcttgtacaaagtggtgatcgcgccgcgcgccagctccgtgcgaaagcctgacgcaccggtagattcttggtgagcccgtatcatgacggcggcgggagctacatggccccgggtgatttattttttttgtatctacttctgacccttttcaaatatacggtcaactcatctttcactggagatgcggcctgcttggtattgcgatgttgtcagcttggcaaattgtggctttcgaaaacacaaaacgattccttagtagccatgcattttaagataacggaatagaagaaagaggaaattaaaaaaaaaaaaaaaacaaacatcccgttcataacccgtagaatcgccgctcttcgtgtatcccagtaccagtttattttgaatagctcgcccgctggagagcatcctgaatgcaagtaacaaccgtagaggctgacacggcaggtgttgctagggagcgtcgtgttctacaaggccagacgtcttcgcggttgatatatatgtatgtttgactgcaggctgctcagcgacgacagtcaagttcgccctcgctgcttgtgcaataatcgcagtggggaagccacaccgtgactcccatctttcagtaaagctctgttggtgtttatcagcaatacacgtaatttaaactcgttagcatggggctgatagcttaattaccgtttaccagtgccatggttctgcagctttccttggcccgtaaaattcggcgaagccagccaatcaccagctaggcaccagctaaaccctataattagtctcttatcaacaccatccgctcccccgggatcaatgaggagaatgagggggatgcggggctaaagaagcctacataaccctcatgccaactcccagtttacactcgtcgagccaacatcctgactataagctaacacagaatgcctcaatcctgggaagaactggccgctgataagcgcgcccgcctcgcaaaaaccatccctgatgaatggaaagtccagacgctgcctgcggaagacagcgttattgatttcccaaagaaatcggggatcctttcagaggccgaactgaagatcacagaggcctccgctgcagatcttgtgtccaagctggcggccggagagttgacctcggtggaagttacgctagcattctgtaaacgggcagcaatcgcccagcagttagtagggtcccctctacctctcagggagatgtaacaacgccaccttatgggactatcaagctgacgctggcttctgtgcagacaaactgcgcccacgagttcttccctgacgccgctctcgcgcaggcaagggaactcgatgaatactacgcaaagcacaagagacccgttggtccactccatggcctccccatctctctcaaagaccagcttcgagtcaaggtacaccgttgcccctaagtcgttagatgtccctttttgtcagctaacatatgccaccagggctacgaaacatcaatgggctacatctcatggctaaacaagtacgacgaaggggactcggttctgacaaccatgctccgcaaagccggtgccgtcttctacgtcaagacctctgtcccgcagaccctgatggtctgcgagacagtcaacaacatcatcgggcgcaccgtcaacccacgcaacaagaactggtcgtgcggcggcagttctggtggtgagggtgcgatcgttgggattcgtggtggcgtcatcggtgtaggaacggatatcggtggctcgattcgagtgccggccgcgttcaacttcctgtacggtctaaggccgagtcatgggcggctgccgtatgcaaagatggcgaacagcatggagggtcaggagacggtgcacagcgttgtcgggccgattacgcactctgttgagggtgagtccttcgcctcttccttcttttcctgctctataccaggcctccactgtcctcctttcttgctttttatactatatacgagaccggcagtcactgatgaagtatgttagacctccgcctcttcaccaaatccgtcctcggtcaggagccatggaaatacgactccaaggtcatccccatgccctggcgccagtccgagtcggacattattgcctccaagatcaagaacggcgggctcaatatcggctactacaacttcgacggcaatgtccttccacaccctcctatcctgcgcggcgtggaaaccaccgtcgccgcactcgccaaagccggtcacacc
用如描述(US 2006/0094080)的线性DNA文库转化实施例6中描述的AD5红褐肉座菌菌株(Δegl1，Δegl2，Δcbh1，Δcbh2，Δbgl1)的原生质体，并在包含乙酰胺的选择性琼脂上于28℃培养7天(0.6g/L乙酰胺，1.68g/L CsCl，20g/L葡萄糖，6g/L KH2PO4，0.6g/L MgSO4.7H20，0.6g/L CaCl2.2H20，0.5g/L尿苷，微量元素盐，10g/L低熔点琼脂糖)。24小时后，用补充1.2g/L氟乳清酸(FOA)的选择性琼脂覆盖琼脂。将总共380个菌落转移至含有1.2g/L FOA的马铃薯葡萄糖琼脂板上，并在28℃培养4-5天。将孢子转移至新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂板，并在28℃培养3天。可选地，可使用实施例6中描述的MAD5菌株的原生质体代替AD5用于表达变体文库成员。类似地，为了此目的可使用失活了另外的纤维素酶的MAD6菌株的衍生物的原生质体。这样的衍生物将展示更低的背景纤维素酶活性。
用于CBH2变体蛋白的产生，使用96-针复制器将孢子转移至PVDF滤板中的200μl补充2％葡萄糖/槐糖混合物的甘氨酸基础培养基中：6.0g/L甘氨酸，4.7g/L(NH4)2SO4；5.0g/L KH2PO4；1.0g/L MgSO4·7H2O；33.0g/L PIPPS；pH 5.5；无菌加入2％葡萄糖/槐糖混合物作为碳源，10ml/L100g/L CaCl2，2.5ml/L里氏木霉微量元素(400X)：175g/L无水柠檬酸；200g/L FeSO4·7H2O；16g/L ZnSO4·7H2O；3.2g/L CuSO4·5H2O；1.4g/LMnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3。一式四份培养每种CBH2变体。在用可渗透氧气的膜密封板后，将板在28℃培养6天，同时以200rpm摇晃。通过在低压下将培养基转移至微滴定板收获上清。
分离了在57℃下显示对玉米芯的改善的活性的共10个变体。分离了这些菌株的基因组DNA并测定了其cbh2基因的序列。检测了CBH2变体的目的性质。表8-2中显示了组合文库成员的取代和对玉米芯和玉米秸秆的活性。如实施例7中描述的测定了对洗过的稀释的酸预处理的玉米秸秆(PCS 50℃)、在50℃下对玉米芯(CC 50℃)和在57℃下对玉米芯(CC 57℃)的比活。
实施例9
CBH2单取代和双取代变体及其活性
由GeneOracle(Mountain View，CA)在pTTTpyrG中构建了编码CBH2变体的合成基因。表9-1列出了构建的单和双变体(根据CBH2成熟氨基酸序列编号)。
从上述供应商处以纯化的PCR产物的形式接收cbh2变体基因，其中使用引物GACCGGACGTGTTTTGCCCTTCAT(SEQ ID NO：20)和GTGTGACCGGCTTTGGCGAGTG(SEQ ID NO：21)扩增cbh2基因，其上游为约1000bp的cbh1启动子和下游为约1000bp的amdS标记物，用于强制整合进红褐肉座菌宿主菌株中的pyr2基因座。使用引物SEQ ID NO：20和SEQ IDNO：21从pTTTpyrG-CBH2上扩增的PCR片段(部分cbh1启动子，cbh2基因和部分amdS基因)的核苷酸序列如上实施例8中以SEQ ID NO：22提供。
用如描述(US 2006/0094080)的线性DNA片段转化实施例6中描述的MAD6红褐肉座菌菌株(Δegl1，Δegl2，Δegl3，Δcbh1，Δcbh2，Δbgl1)的原生质体，并在包含乙酰胺的选择性琼脂上于28℃培养7天。24小时后，用补充1.2g/L氟乳清酸(FOA)的选择性琼脂覆盖琼脂。将菌落转移至含有1.2g/L FOA的马铃薯葡萄糖琼脂板上，并在28℃培养4-5天。将孢子转移至马铃薯葡萄糖琼脂板，并在28℃培养3天。
如实施例8中描述的，在微滴定板中培养变体。用于在摇瓶中培养，用在琼脂上形成孢子的木霉菌株接种25ml的YEG培养基(5g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖)，并在28℃以200rpm培养2天。下一步，使用5mlYEG培养物在摇瓶中接种45ml含有2％葡萄糖槐糖混合物的甘氨酸培养基。接种后，在共振声(resonant acoustic)培养箱中在28℃孵育培养物3天。通过0.2μm滤器的过滤去除细胞。然后使用具有10kD截止分子量的Vivaspin旋转小室(spin cell)浓缩上清。
如实施例1中描述的，通过HPLC分析在微滴定板中培养的样品的CBH2产生水平。检测了微滴定板和摇瓶培养二者的样品的目的性质。表9-2列出了CBH2变体在多个目的性质上的性能。
1Tm＝假熔点温度(℃)，通过热稳定性测定2测定。
2IR＝稳定性的性能指数，通过热稳定性测定3测定。
CBH2热稳定性测定3。为了分析CBH2变体的热稳定性，在PCR仪器中于58℃一式三份孵育40μl上清，并在孵育后30、60和120分钟后移取样品。通过将10μl上清与50μl 1mg/ml纤维三糖在50mM含0.0025％Tween20的醋酸钠缓冲液pH5.0中孵育，测定剩余活性。1小时后，加入40μl的100mM甘氨酸pH10。加入50μl 3X浓缩的ABTS试剂(见上文)并在OD420处记录显色3分钟。使用指数衰减公式拟合实时的剩余活性：y＝A0*exp(-k*t)，其中A0是在t＝0时的活性，t是时间，k是衰减常数。通过以下公式计算性能指数(PI)：PI＝-log(k变体)/-log(kwt)。

Claims (15)

1.纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并来源于其氨基酸序列与SEQ ID NO:3至少85％同一的亲本纤维素酶，其中所述变体为选自以下的多取代变体：P98Q/S316P变体,P98Q/S343Q变体,P98Q/Q362I变体,P98Q/S386C变体,P98Q/C400S变体,P98Q/S406P变体,P98Q/S316P/Q362L/L439P变体,P98Q/N182W/S291E/S316P/C400S变体,P98L/N182W/S291E/Q362I/C400S变体,P98L/N182W/S291E/S316P/Q362I变体,其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:3所列的参考纤维二糖水解酶II，即CBH2的氨基酸序列编号。
2.权利要求1的纤维素酶变体，其中所述变体是分离的。
3.包含权利要求1或2的纤维素酶变体的组合物。
4.权利要求3的组合物，其中所述组合物富含纤维素酶变体。
5.编码权利要求1的纤维素酶变体的分离的核酸。
6.表达载体，其包含与调控序列有效连接的权利要求5的分离的核酸。
7.包含权利要求6的表达载体的宿主细胞。
8.产生纤维素酶变体的方法，其包括在合适的条件下在培养基中培养权利要求7的宿主细胞以产生所述纤维素酶变体。
9.包含权利要求8的宿主细胞和培养基的组合物。
10.包含权利要求8的培养基上清中的纤维素酶变体的组合物。
11.权利要求3的组合物，还包含至少一种其它的酶，所述酶选自枯草杆菌蛋白酶、中性金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶和过氧化物酶。
12.清洁或织物护理的方法，其包括将包含织物的表面或物品与权利要求1的纤维素酶变体接触。
13.织物去球和表面光洁处理的方法，其包括将包含织物的表面或物品与权利要求1的纤维素酶变体接触。
14.将生物质转化为糖的方法，其包括将所述生物质与权利要求1的纤维素酶变体接触。
15.生产燃料的方法，其包含：将生物质组合物与包含权利要求1的纤维素酶变体的酶促组合物接触来生产糖溶液；和在足以生产燃料的条件下培养含发酵微生物的糖溶液。
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