CN1834237A

CN1834237A - β－甘露聚糖酶及其表达方法与专用工程菌

Info

Publication number: CN1834237A
Application number: CNA2006100731604A
Authority: CN
Inventors: 李德发; 陈小玲; 曹云鹤; 陆文清; 赖长华; 朴香淑; 贺平丽; 乔家运
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Beijing Yang long view Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2006-04-10
Filing date: 2006-04-10
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2026-04-10
Also published as: CN100420744C

Abstract

本发明公开了一种β－甘露聚糖酶及其表达方法与专用工程菌。该酶是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID№：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对甘露聚糖具有降解作用的蛋白质。专用工程菌是将含有该β－甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中得到的。该工程菌实现了β－甘露聚糖酶的高效表达，且发酵工艺简单，提取成本低廉，适于大规模工业化生产。本发明的β－甘露聚糖酶及其工程菌将在β－甘露聚糖酶的工业化生产及动物饲料添加剂的制备中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

β-甘露聚糖酶及其表达方法与专用工程菌

技术领域

本发明涉及酶及其表达方法及其专用工程菌，特别是涉及一种β-甘露聚糖酶及其表达方法与专用工程菌。

背景技术

植物细胞壁主要由半纤维素、纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有乙酰基和半乳糖基等取代基团。甘露聚糖具有高度的亲水性，因而在单胃动物的消化道内大量吸水，使消化道内容物的粘度增加，从而对胃肠的蠕动产生抵抗作用，直接影响了动物对营养物质的消化和吸收。近年来，随着豆类产品(豆粕等)在饲粮中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养问题也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)和脱乙酰酶(EC3.1.1.6)的协同作用，其中β-甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。

β-甘露聚糖酶在自然界中广泛存在，在低等动物、高等植物发芽的种子，以及细菌及真菌中等都有发现。微生物来源的β-甘露聚糖酶由于活性高，提取、纯化方便，发挥酶效的温度和pH范围广等优点，备受研究人员的重视。特别是对芽孢杆菌、曲霉和木霉等产的β-甘露聚糖酶研究较多，部分微生物产的β-甘露聚糖酶及其特性如表1所示。不同微生物所产的β-甘露聚糖酶在分子量、最适催化温度、最适pH值、底物特异性等方面都存在很大差异。真菌产β-甘露聚糖酶作用偏酸性，而细菌和放线菌产β-甘露聚糖酶作用的pH近中性或偏碱性，但稳定性较好。

表1部分微生物产生的β-甘露聚糖酶及其性质

菌株	分子量	最适温度	最适pH	参考文献
菌株	分子量	最适温度	最适pH	参考文献	Bacillus licheniformis	-	50	6.0	(Zhang J，He Z and Hu K，2000，Purification andcharacterization ofβ-mannanase from Bacilluslicheniformis for industrial use，Biotechnologyletters，22：1375-1378.)

Trichoderma harzianumBacillus subtilisBacillusstearothermophilusAspergillus fumigatusAspergillus nigerSclerotium rolfsiiTrichoderma reesei

32.53973604061.246

5550-557060-7075

3.07.05.5-7.54.53.52.95.0

(Zakaria MM，Yamamoto S and Yagi T，1998，Purificationand characterization of an endo-β-mannanase fromBacillus subtilis KU-1，FEMS Microbiology Letters，158：25-31.)(Ferreira HM and Filho EXF，2004，Purification andcharacterization of aβ-mannanase from Trichodermaharzianum strain T4，Carbohydrate Polymers，57：23-29.)(Talbot G and Sygusch J，1990，Purification andcharacterization of thermostableβ-mannanase andα-galactosidase from Bacillus stearothermophilus，Applied and Environmental Microbiology，56：3505-3510.)(Puchat V，Vrsanska M，Svoboda P et al，2004，Purification and characterization of two forms ofendo-h-1，4-mannanase from a thermotolerant fungus，Aspergillus fumigatus IMI 385708(formerly Thermomyceslanuginosus IMI 58749)，Biochimica et Biophysica Acta，1674：239-250.)(Ademark P，Varga A，Medve J et al，1998，Softwoodhemicellulose-degrading enzymes from Aspergillusniger：Purification and properties of a β-mannanase，Journal of Biotechnology，63：199-210.)(Gubiz GM，Hayn M，Urbanz G et al，1996，Purificationand properties of an acidic β-mannanase fromSclerotium rolfsii.Journal of Biotechnology，45：165-172.)(Arisan-Atac I，Hodits R，Kristufek D et al，1993，Purification，and characterization of aβ-mannanase of Trichoderma reesei C-30，Applied Microbiololgy and Biotechnology，39：58-62.)

近年来，随着对自然界半纤维素资源的开发和对饲料中甘露聚糖抗营养因子研究的深入，研究人员也逐渐展开了对甘露聚糖酶的分子生物学研究。但目前的研究还主要集中于酶蛋白的分离纯化、酶学性质分析以及编码基因的克隆和表达上，关于酶催化的分子机制和酶学特性改造方面的研究报道还很少。吴襟等(吴襟，何秉旺，2000，诺卡氏菌型放线菌β-甘露聚糖酶的化学修饰及活性中心的研究，中国生物化学与分子生物学报，16(2)：227-230.)利用化学修饰的方法对诺卡氏菌形放线菌产的甘露糖酶的结构与功能进行了初步研究，证明了酶蛋白的巯基、酪氨酸残基及色氨酸残基是维持酶活性必需的基团，进一步研究证实蛋白内部的二硫键是影响该酶热稳定性的重要因素。Cann等(Cann IKO，Kocherginskaya S，King MR et al，1999，Molecularcloning，sequencing，and expression of a novel multidomain mannanase gene fromThermoanaerobacterium polysaccharolyticum，Journal of Bacteriology，181(5)：1643-1651.)从Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum中克隆到一种高分子量(119.6kDa)甘露聚糖酶，缺失突变证明该酶含有两个纤维素结合区和一个催化功能区。

目前，β-甘露聚糖酶的生产主要采用细菌或芽孢杆菌的液体发酵法，主要缺点是需要底物诱导，且发酵工艺复杂，成本高，产率低，酶活性低等。

发明内容

本发明的目的是提供一种活性较高的β-甘露聚糖酶。

本发明所提供的β-甘露聚糖酶，来源于硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus，保藏号：CGMCC No.0608)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对甘露聚糖具有降解作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由383个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第1-21位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第22-383位氨基酸残基为成熟蛋白，自氨基端第205-207位氨基酸残基为典型的甘露聚糖酶保守序列。

编码上述β-甘露聚糖酶的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

3)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在6×SSC或(6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液中，65℃条件下杂交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2和SEQ ID №：3均由1327个碱基组成，编码序列均为自5’端第25-1176位碱基，均编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-24位碱基为5’端非翻译区，自5’端第25-87位碱基为信号肽编码序列，自5’端第88-1176位碱基为成熟蛋白编码序列，自5’端第613-621位碱基编码典型的甘露聚糖酶保守序列，自5’端第1177-1327位碱基为3’端非翻译区。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增β-甘露聚糖酶基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的第三个目的是提供一种表达β-甘露聚糖酶的专用工程菌。

本发明所提供的表达β-甘露聚糖酶的工程菌，是将含有上述β-甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中得到的；所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列在毕赤酵母表达载体中位于α因子序列的下游；所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列为序列表中的SEQ ID №：4或SEQ ID №：5，优选为SEQ ID №：5。

序列表中的SEQ ID №：4和SEQ ID №：5均由1089个碱基组成，编码上述β-甘露聚糖酶的成熟蛋白。

用于构建含有β-甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列的毕赤酵母表达载体的出发载体可为任意一种适于外源基因表达的毕赤酵母表达载体，如pPICzαA、pPICZA或pPIC9K等。

以pPICzαA为出发载体，构建的含有上述β-甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列的毕赤酵母表达载体为pPIC-Mann。

所述毕赤酵母可为任意适于蛋白表达的毕赤酵母菌株，如毕赤酵母X-33或GS115菌株等。

以毕赤酵母X-33为出发菌株，构建的转化有pPIC-Mann的重组毕赤酵母菌株为X-33/pPIC-Mann。

上述重组毕赤酵母表达载体可按照生物工程领域中的常规方法构建。

将重组毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母的方法优选为电击转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如，氯化锂转化法、原生质体转化法等。

本发明的另一个目的是提供一种β-甘露聚糖酶的表达方法。

本发明所提供的β-甘露聚糖酶的表达方法，是发酵上述β-甘露聚糖酶的专用表达工程菌，得到β-甘露聚糖酶。

发酵上述重组毕赤酵母时需加入甲醇诱导剂，所加入甲醇的浓度为0.8-1.2％，优选为1％。

为补偿甲醇的挥发损失，每24小时还要补加甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.8-1.2％，诱导温度为28-30℃。

上述百分浓度均为体积百分浓度。

本发明提供了一种来源于硫色曲霉的β-甘露聚糖酶及其编码基因，并且根据毕赤酵母的密码子偏好性，合成了经密码子优化的该酶成熟蛋白的编码序列，进而构建出硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株。将该菌株在10L发酵罐中发酵后，发酵液的酶活力可达1100IU/mL以上，实现了β-甘露聚糖酶的高效表达，且发酵工艺简单，提取成本低廉，适于大规模工业化生产。此外，该酶具有酸稳定性高，催化pH范围广，比活性高，对金属离子耐受性好的特点。本发明的β-甘露聚糖酶及其工程菌将在β-甘露聚糖酶的工业化生产及动物饲料添加剂的制备中发挥重要作用，应用前景广阔。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为毕赤酵母重组子的PCR鉴定结果

图2为重组毕赤酵母X-33/pPIC-Mann中β-甘露聚糖酶基因遗传稳定性的PCR鉴定结果

图3为重组菌株X-33/pPIC-Mann表达产物的SDS-PAGE检测结果

图4为表达的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的最适pH值和pH稳定性检测结果

图5为表达的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的最适温度和温度稳定性检测结果

图6为表达的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的的动力学参数

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述培养基中的溶剂均为水，所述引物、序列合成及测序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。

实施例1、本发明来自硫色曲霉的β-甘露聚糖酶基因的克隆

来自硫色曲霉的β-甘露聚糖酶基因的全长cDNA序列的获得包括以下步骤：

1、硫色曲霉的药配及其总RNA的提取

将硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus，保藏号：CGMCC No.0608)接种到其生长培养基(用400mL自来水溶解85g麦麸、10g豆饼粉、0.2g KH₂PO₄、0.3g NaCl和10g蔗糖，121℃蒸煮30min，过滤取上清，分装后再高压灭菌)中，30℃摇床培养48h。培养结束后，5000r/min离心1min收集菌体，置于液N₂中研磨。取100mg研磨后的菌体，置于1.5mL离心管中，加入500μL RNA抽提缓冲液(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，1％SDS，200mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA)，再加入500μL酚/仿(1∶1)，4℃、12000r/min离心5min，上清加入等体积4mol/L LiCl，4℃沉淀4h，然后12000r/min离心15min，弃上清，将沉淀用70％的乙醇洗两次，真空抽干，溶于20μl DEPC处理的ddH₂O中，得到目的菌株的总RNA。

2、β-甘露聚糖酶基因cDNA片段的克隆

对GenBank中公布的刺孢曲霉(GenBank登录号：L35487)和瑞氏木霉(GenBank登录号：L25310)β-甘露聚糖酶基因的mRNA序列进行分析，分析结果表明在中间段有一段高度同源的核苷酸序列，根据这一高度保守的核苷酸序列设计一对简并引物，引物序列如下：

P1(上游引物)：5’-TTCAACGACGTCAACAC-3’；

P2(下游引物)：5’-A(T/C)CCAGCC(G/A)TTGCCCCA-3’

以步骤1提取的硫色曲霉总RNA为模板，用M-MLV反转录酶(Promega)合成其第一链cDNA。再以反转录合成的第一链cDNA为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR扩增，50μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL、引物P1和P2各1μL(20μM)、Taq酶1μL(5μ/μL)、dNTPs 1μL(2.5mM)、模板cDNA 1μL、H₂O 40μL；PCR反应条件为：首先94℃预变性3min；然后94℃预变性45s，49℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收长度约600bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段克隆到载体pUCm-T(上海生工生物工程有限公司)中，得到含有回收片段的重组质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增片段含有上述高度保守的核苷酸序列，长度为608bp。

3、β-甘露聚糖酶基因cDNA的3’UTR(非翻译区)的克隆

根据步骤2获得的β-甘露聚糖酶基因的部分cDNA序列，设计出3’-RACE扩增特引物MAN-3-2：5’-TACCCGTACCAATTCGC-3’。然后以总RNA为模板，用3’-Full RACE试剂盒(TaKaRa公司)扩增β-甘露聚糖酶基因cDNA的3’末端片段，反应体系及反应条件参照试剂盒说明书。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化长度约600bp的扩增片段，将其克隆到载体pUCm-T，得到含有回收片段的重组质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增的β-甘露聚糖酶基因cDNA的3’UTR片段长度为151bp。

4、β-甘露聚糖酶基因cDNA的5’UTR的克隆

根据步骤2获得的β-甘露聚糖酶基因的部分cDNA序列，设计出5’-RACE扩增特引物Race-1、Race-2、Race-3、Race-4和RT-P，引物序列如下：

Race-1：5’-GTATTTGCGTGGGAGTTGGC-3’；

Race-2：5’-TACCCGTACCAATTCGCCGA-3’：

Race-3：5’-TGCAATCTGCGTATCAGACG-3’；

Race-4：5’-ACGAGACGGATTTCTATACC-3’；

RT-P：5’-CCAACTCCCACGCAA-3’。

然后以硫色曲霉总RNA为模板，用5’-Full RACE试剂盒(TaKaRa公司)扩增β-甘露聚糖酶基因cDNA的5’末端片段，反应体系及反应条件参照试剂盒说明书。应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化长度约500bp的扩增片段，将其克隆到载体pUCm-T上，得到含有回收片段的重组质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增的β-甘露聚糖酶基因cDNA的5’UTR片段长度为24bp。

5、β-甘露聚糖酶基因全长cDNA序列的获得

根据步骤3和4获得的β-甘露聚糖酶基因的5’和3’末端序列设计一对引物，引物序列如下：

F1(上游引物)：5-cggaattcatgaagctctccagctc-3；

F2(下游引物)：5-cccaagcttttaggcgctatcaatagc-3

以硫色曲霉总RNA为模板，在引物F1和F2的引导下，PCR扩增β-甘露聚糖酶基因的全长cDNA，10×PCR buffer 5μL、引物(F1/F2)各1μL(20μM)、Taq酶1μL(5μ/μL)、dNTPs 1μL(2.5mM)、模板cDNA 1μL、H₂O 40μL，总反应体系50μL，反应程序为94℃预变性3min，然后按以下循环参数进行扩增反应：94℃预变性45s，49℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化长度约1152bp的扩增片段，将其克隆到载体pUCm-T上，得到含有回收片段的重组质粒，用M13+/-引物对其进行测序，测序结果表明硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因全长cDNA具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：2由1327个碱基组成，编码序列为自5’端第25-1176位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-24位碱基为5’端非翻译区，自5’端第25-87位碱基为信号肽编码序列，自5’端第88-1176位碱基为成熟蛋白编码序列，自5’端第613-621位碱基编码典型的甘露聚糖酶保守序列，自5’端第1177-1327位碱基为3’端非翻译区。序列表中的SEQ ID №：1由383个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第1-21位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第22-383位氨基酸残基为成熟蛋白，自氨基端第205-207位氨基酸残基为典型的甘露聚糖酶保守序列。硫色曲霉β-甘露聚糖酶成熟蛋白的分子量为41kDa。将克隆的硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中的序列进行同源性比对，比对结果表明该酶与刺孢曲霉β-甘露聚糖酶的亲缘关系最近，核苷酸序列相似性达71％，氨基酸序列相似性达72％。

实施例2、硫色曲霉β-甘露聚糖酶的表达工程菌的构建

一、硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因毕赤酵母表达载体的构建

1、硫色曲霉β-甘露聚糖酶成熟蛋白基因的合成

在不改变氨基酸序列的前提下，仅将实施例1克隆的硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因中编码成熟蛋白的密码子替换为毕赤酵母的偏爱密码子，从而得到另外一条硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID №：3，序列表中的SEQ ID№：3由1327个碱基组成，编码序列为自5’端第25-1176位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-24位碱基为5’端非翻译区，自5’端第25-87位碱基为信号肽编码序列，自5’端第88-1176位碱基为成熟蛋白编码序列，自5’端第613-621位碱基编码典型的甘露聚糖酶保守序列，自5’端第1177-1327位碱基为3’端非翻译区。然后人工合成SEQ ID №：3中编码硫色曲霉β-甘露聚糖酶成熟蛋白的基因片段(SEQ ID №：3中自5’端第88-1176位碱基)，并在5’和3’末端分别添加限制性内切EcoR I和Xba I酶切位点。

2、硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因毕赤酵母表达载体的获得

用限制性内切EcoR I和Xba I对步骤1合成的基因进行双酶切后，将其连入经相同酶双酶切的载体pPICzαA(Invitrogen)中α因子序列的下游，得到硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的毕赤酵母表达载体，命名为pPIC-Mann，然后将连接产物转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞，用含有100μg/mL抗生素Zeocin的LB抗性平板筛选出阳性克隆，提质粒。

二、硫色曲霉β-甘露聚糖酶的表达工程菌的获得

1、线性化硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的毕赤酵母表达质粒的获得

取10μg步骤一获得的硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的毕赤酵母表达质粒pPIC-Mann，将其用限制性内切酶BspHI在37℃下酶切12-24小时，然后将酶切产物用无水乙醇沉淀，溶于10μL灭菌水中。

2、毕赤酵母X-33感受态细胞的制备

将毕赤酵母X-33接种于YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，其余为水)中，在28℃下摇瓶培养至OD₆₀₀为1.3-1.5后，5000rpm离心5min收集菌体细胞，用灭菌水洗涤2次，将菌体悬浮于0.5mL 1mol/L的山黎醇溶液中。

3、转化

取80μL步骤2制备的毕赤酵母X-33感受态细胞，加入10μg步骤1获得的线性化的质粒pPIC-Mann，混匀，置于0.2cm电击杯中，冰浴5min，在2000伏电压(25μF)条件下电击，迅速加入1mL 1mol/L山黎醇，置于28℃静止培养2h。然后将培养物涂布于含抗生素Zeocin(100μg/mL)的YPDS(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂，其余为水)平板上，在28℃下培养3-4天，直至长出清晰的菌落。

4、重组菌的鉴定、筛选

挑取长出的单菌落，将其接种于YPD液体培养基中，在28℃下摇瓶培养2-3天，提取重组酵母菌的总DNA并以此为模板，在引物QJ-F-1(5-ccggaattcttgccaaaggctttc-3)和QJ-R-1(5-gctctagattaagcagaatcaatagcag-3)的引导下，，PCR鉴定阳性重组子，鉴定结果如图1所示(泳道1：转化pPICzαA空载体的毕赤酵母X-33(对照)；泳道2：DNA Marker：λDNA/EcoRI+HindIII双酶切；泳道3和泳道4：重组酵母)，扩增出约1000bp DNA片段的为阳性重组子。挑取阳性重组子，将其接种于含30mL BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％biotin，1％甘油，100mM pH6.0磷酸盐缓冲液，其余为水)培养基的250mL摇瓶中，于28℃、250-300rpm培养至OD₆₀₀为2-6，然后室温下离心收集菌体，用BMMY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素)重悬菌体，使OD₆₀₀为1.0，再用终浓度为0.5％(V/V)的甲醇为唯一碳源进行诱导培养，通过SDS-PAGE及活性测定筛选高效表达重组菌株，结果筛到1株酶活较高的重组菌，命名为X-33/pPIC-Mann。对该株菌进行传代培养，共传20代，分别于传至第1、5、10、15、20代采集样品，提取总DNA，在引物QJ-F-1(5-ccggaattcttgccaaaggctttc-3)和QJ-R-1(5-gctctagattaagcagaatcaatagcag-3)的引导下，PCR鉴定硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的稳定性，结果如图2所示(泳道1：转化pPICzαA空载体的毕赤酵母X-33(对照)；泳道2-6：传至第1、5、10、15、20代的X-33/pPIC-Mann；泳道7：DNAMarker：λDNA/EcoRI+HindIII双酶切)，表明没有发生外源基因丢失现象，该菌株具有较高的遗传稳定性。

实施例3、硫色曲霉β-甘露聚糖酶的诱导表达

挑取实施例2获得的重组毕赤酵母酵母菌株X-33/pPIC-Mann，将其接种于装有200mL BMGY培养基的3L摇瓶中，在28-30℃、280rpm下振摇24小时以上，得到OD₆₀₀约为3.0的种子液。然后配制4L BMGY培养基，装入10L自动控制发酵罐中，在121℃下灭菌后，冷却至28.5℃，加入上述种子液，用氨水和磷酸调节pH至5.5，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30％。经测定，接入种子液23h后，甘油消耗完全(溶氧标记为100％)，进入流加50％(W/V)甘油阶段，流速为60mL/h。流加4h后，甘油消耗完全(溶氧标记为100％)，进入甲醇流加阶段，流速为12mL/h，同时控制溶氧为20％以上(如不能使溶氧保持在20％以上，停止添加甲醇，直至溶氧回升)。3h后，将甲醇流速调到24mL/h，再过2h，将流速调到30mL/h，并保持到最后，同时，分别于诱导表达1、2、3、4天后采集发酵液，留待检测。培养结束后，通过SDS-PAGE检测发酵液中表达的蛋白含量，检测结果如图3所示(泳道1：Marker；泳道2：转化pPICzαA空载体的毕赤酵母X-33(对照)；泳道3：诱导4天后采集的样品；泳道4：诱导3天后采集的样品；泳道5：诱导2天后采集的样品；泳道6：诱导1天后采集的样品)，结果经诱导表达获得了约45KD的重组蛋白，与预期结果相符，且诱导表达4天后的蛋白表达量最高。

实施例4、硫色曲霉β-甘露聚糖酶的酶学性质分析

现对实施例3表达的硫色曲霉β-甘露聚糖酶进行以下酶学性质分析：

1、最适pH值和pH稳定性分析

最适pH值的测定：分别用pH值为2.4、3.0、4.0、5.0、6.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制甘露聚糖底物，浓度为0.8g/mL，于40℃下测定相对酶活力，以最高酶活力为100％，确定该酶的最适pH值。检测结果如图4所示，经测定，本发明硫色曲霉β-甘露聚糖酶的最适pH值为2.4。

pH值稳定性的检测：将表达的β-甘露聚糖酶分别用pH值为2.4、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液处理30min后，于40℃反应温度下测定残留的相对酶活力，以最高酶活力为100％，检测结果如图4所示，经测定，本发明的硫色曲霉β-甘露聚糖酶具有较高的pH值稳定性。

2、最适温度和温度稳定性分析

最适温度的测定：用100mM醋酸钠缓冲液配制甘露聚糖底物，浓度为0.8g/mL，分别在30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃、90℃下测定相对酶活力，以最高酶活力为100％，确定该酶的最适反应温度。检测结果如图5所示，经测定，本发明硫色曲霉β-甘露聚糖酶的最适反应温度为50℃。

温度稳定性的检测：将表达的β-甘露聚糖酶在不同温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，90℃)下保温30min，然后放入冰水中冷却，于最适温度(50℃)和最适pH值(2.4)条件下测定相对酶活力，以最高酶活力为100％，检测结果如图5所示，经测定，本发明的硫色曲霉β-甘露聚糖酶具有较高的温度稳定性。

3、酶动力学参数的测定

动力学参数(K_m：米氏常数、V_max：最大反应速率)的测定：用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(最适pH值2.4)配制成不同浓度(1-20mg/mL)的甘露聚糖溶液并以此为底物，在最适温度(50℃)下反应10min测定表达的β-甘露聚糖酶的酶活力，利用米氏方程双倒数作图法确定K_m、V_max值。根据米氏方程：V＝-K_mxV/[S]+V_max绘制的直线图如图6所示，由图可知K_m值为0.91mg/mL、V_max值为909.09U/mg，表明本发明的硫色曲霉β-甘露聚糖酶具有较高的酶活力。

4、金属离子和螯合剂(EDTA)对酶活力的影响

在磷酸氢二钠-柠檬酸盐缓冲液(最适pH值2.4)中加入1mM的不同化合物(MgCl₂、FeCl₂、MnSO₄、CuSO₄、ZnCl₂、CaCl₂、NaCl、EDTA)，将表达的甘露聚糖酶在上述溶液中处理30min后，在最适温度下测定表达的β-甘露聚糖酶的相对酶活力，以不添加金属离子和螯合剂等为空白对照(100％)，结果如表2所示，表明金属离子和螯合剂(EDTA)对本发明的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的酶活影响不大，该酶具有较高的金属离子稳定性。

表2表达的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的金属离子稳定性检测结果

金属离子	相对酶活(％)
金属离子	相对酶活(％)	Cu²⁺	106.60
Fe²⁺	109.34	Cu²⁺	106.60
Fe²⁺	109.34	Mn²⁺	96.01
Zn²⁺	96.81	Mn²⁺	96.01
Zn²⁺	96.81	EDTA	88.16
Na⁺	112.75	EDTA	88.16
Na⁺	112.75	Ca²⁺	96.92
Mg²⁺	102.84	Ca²⁺	96.92
Mg²⁺	102.84	对照	100.00

序列表

<160>5

<210>1

<211>383

<212>PRT

<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)

<400>1

Met Lys Leu Ser Ser Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Asn Leu Ser Thr Ala Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Ser Ser Ala Ser Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe

35 40 45

Thr Ile Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp

50 55 60

Ile Gly Phe Leu Thr Asp Asp Ser Asp Val Asp Leu Val Met Ser His

65 70 75 80

Leu Lys Ser Ser Gly Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp

85 90 95

Val Thr Thr Gln Pro Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln

100 105 110

Asp Gly Lys Ser Thr Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu

115 120 125

Asp Tyr Val Val Ser Ser Ala Glu Gln His Gly Ile Lys Leu Ile Ile

130 135 140

Asn Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val

145 150 155 160

Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Asp Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr

165 170 75

Met Gln Ser Ala Tyr Gln Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr

180 185 90

Ser Asn Ser Ser Ala Val Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg

195 200 205

Cys Pro Ser Cys Asp Thr Thr Val Leu Tyr Asp Trp Ile Glu Lys Thr

210 215 220

Ser Lys Phe Ile Lys Gly Leu Asp Ala Asp His Met Val Cys Ile Gly

225 230 235 240

Asp Glu Gly Phe Gly Leu Asn Thr Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr

245 250 255

Gln Phe Ala Glu Gly Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr

260 265 270

Ile Asp Phe Ala Thr Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser

275 280 285

Asp Asp Trp Gly Asn Gly Trp Ile Ser Ala His Gly Ala Ala Cys Lys

290 295 300

Ala Ala Gly Lys Pro Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn

305 310 315 320

His Cys Ser Val Glu Ser Pro Trp Gln Gln Thr Ala Leu Asn Thr Thr

325 330 335

Gly Val Ser Ala Asp Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr

340 345 350

Gly Glu Ser Pro Asp Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp

355 360 365

Tyr Glu Cys Leu Val Thr Asp His Val Ala Ala Ile Asp Ser Ala

370 375 380

<210>2

<211>1327

<212>DNA

<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)

<400>2

aatacagcca agcaaaccac cacaatgaag ctctccagct ccctcctcac cctggccagc 60

ctggcgctgg ccaacctctc cacggccctg cccaaagcct ctcctgcacc aagcaccagc 120

agcagcagcg cctccacctc cttcgccagc acctcgggcc tccaattcac catcgacggc 180

gaaaccggct acttcgccgg aacgaacagt tactggatcg gtttcctgac cgacgactcc 240

gatgtcgacc tggtgatgag ccacctgaag tcatccggcc tcaaaatcct ccgcgtatgg 300

ggcttcaacg acgtcaccac gcagccctct tccggcacag tctggtacca actgcaccag 360

gacggcaaat caaccatcaa cactggcgcc gacggtctcc agcgcctcga ctacgtcgtc 420

tcctccgccg aacagcacgg catcaaactc atcatcaact tcgtcaacta ctggaccgac 480

tacggcggta tgtccgcgta cgtgagcgca tatggcggat ccgacgagac ggatttctat 540

accagtgata cgatgcaatc tgcgtatcag acgtatatta agacggtcgt ggagcggtat 600

agtaactcct ctgcggtatt tgcgtgggag ttggcgaatg agccgagatg tcctagttgt 660

gatactaccg tgttgtatga ttggattgag aagacgagta aatttattaa ggggttggat 720

gccgatcata tggtttgtat tggtgatgag ggcttcggcc tcaacaccga ctcggacggc 780

agctacccgt accaattcgc cgagggtctc aacttcacca tgaacctcgg tatcgatact 840

attgactttg ctaccctcca cttgtatcct gatagctggg gcacctccga cgactggggc 900

aacggatgga tcagcgcaca cggcgcggca tgcaaagcgg ccggcaagcc ctgtctactg 960

gaggaatacg gagtcacctc gaaccactgt agtgtggaga gcccgtggca gcagacggcc 1020

ctcaacacga ctggcgtcag cgcagatctc ttctggcagt atggtgatga tttgagcacg 1080

ggcgagtcgc cggatgatgg aaataccatt tactacggga cgagcgatta tgagtgtttg 1140

gtcacggatc atgtggctgc tattgatagc gcctaaggga tagggagatg tggatatatc 1200

tagttgatac attatgaggg gtgctgtaca taagaatgcg ccggagggag ggtgtgaagg 1260

atgataactg atctttgagt ttggatagga tacaattcga gaggcaaatc atcccttcga 1320

ttaccat 1327

<210>3

<211>1327

<212>DNA

<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)

<400>3

aatacagcca agcaaaccac cacaatgaag ctctccagct ccctcctcac cctggccagc 60

ctggcgctgg ccaacctctc cacggccttg ccaaaggctt ctccagctcc atctacttct 120

tcttcttctg cttctacttc ttttgcttct acttctggtt tgcaatttac tattgatggt 180

gaaactggtt actttgctgg tactaactct tactggattg gttttttgac tgatgattct 240

gatgttgatt tggttatgtc tcatttgaag tcttctggtt tgaagatttt gagagtttgg 300

ggttttaacg atgttactac tcaaccatct tctggtactg tttggtacca attgcatcaa 360

gatggtaagt ctactattaa cactggtgct gatggtttgc aaagattgga ttacgttgtt 420

tcttctgctg aacaacatgg tattaagttg attattaact ttgttaacta ctggactgat 480

tacggtggta tgtctgctta cgtttctgct tacggtggtt ctgatgaaac tgatttttac 540

acttctgata ctatgcaatc tgcttaccaa acttacatta agactgttgt tgaaagatac 600

tctaactctt ctgctgtttt tgcttgggaa ttggctaacg aaccaagatg tccatcttgt 660

gatactactg ttttgtacga ttggattgaa aagacttcta agtttattaa gggtttggat 720

gctgatcata tggtttgtat tggtgatgaa ggttttggtt tgaacactga ttctgatggt 780

tcttacccat accaatttgc tgaaggtttg aactttacta tgaacttggg tattgatact 840

attgattttg ctactttgca tttgtaccca gattcttggg gtacttctga tgattggggt 900

aacggttgga tttctgctca tggtgctgct tgtaaggctg ctggtaagcc atgtttgttg 960

gaagaatacg gtgttacttc taaccattgt tctgttgaat ctccatggca acaaactgct 1020

ttgaacacta ctggtgtttc tgctgatttg ttttggcaat acggtgatga tttgtctact 1080

ggtgaatctc cagatgatgg taacactatt tactacggta cttctgatta cgaatgtttg 1140

gttactgatc atgttgctgc tattgattct gcttaaggga tagggagatg tggatatatc 1200

tagttgatac attatgaggg gtgctgtaca taagaatgcg ccggagggag ggtgtgaagg 1260

atgataactg atctttgagt ttggatagga tacaattcga gaggcaaatc atcccttcga 1320

ttaccat 1327

<210>4

<211>1089

<212>DNA

<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)

<400>4

ctgcccaaag cctctcctgc accaagcacc agcagcagca gcgcctccac ctccttcgcc 60

agcacctcgg gcctccaatt caccatcgac ggcgaaaccg gctacttcgc cggaacgaac 120

agttactgga tcggtttcct gaccgacgac tccgatgtcg acctggtgat gagccacctg 180

aagtcatccg gcctcaaaat cctccgcgta tggggcttca acgacgtcac cacgcagccc 240

tcttccggca cagtctggta ccaactgcac caggacggca aatcaaccat caacactggc 300

gccgacggtc tccagcgcct cgactacgtc gtctcctccg ccgaacagca cggcatcaaa 360

ctcatcatca acttcgtcaa ctactggacc gactacggcg gtatgtccgc gtacgtgagc 420

gcatatggcg gatccgacga gacggatttc tataccagtg atacgatgca atctgcgtat 480

cagacgtata ttaagacggt cgtggagcgg tatagtaact cctctgcggt atttgcgtgg 540

gagttggcga atgagccgag atgtcctagt tgtgatacta ccgtgttgta tgattggatt 600

gagaagacga gtaaatttat taaggggttg gatgccgatc atatggtttg tattggtgat 660

gagggcttcg gcctcaacac cgactcggac ggcagctacc cgtaccaatt cgccgagggt 720

ctcaacttca ccatgaacct cggtatcgat actattgact ttgctaccct ccacttgtat 780

cctgatagct ggggcacctc cgacgactgg ggcaacggat ggatcagcgc acacggcgcg 840

gcatgcaaag cggccggcaa gccctgtcta ctggaggaat acggagtcac ctcgaaccac 900

tgtagtgtgg agagcccgtg gcagcagacg gccctcaaca cgactggcgt cagcgcagat 960

ctcttctggc agtatggtga tgatttgagc acgggcgagt cgccggatga tggaaatacc 1020

atttactacg ggacgagcga ttatgagtgt ttggtcacgg atcatgtggc tgctattgat 1080

agcgcctaa 1089

<210>5

<211>1089

<212>DNA

<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)

<400>5

ttgccaaagg cttctccagc tccatctact tcttcttctt ctgcttctac ttcttttgct 60

tctacttctg gtttgcaatt tactattgat ggtgaaactg gttactttgc tggtactaac 120

tcttactgga ttggtttttt gactgatgat tctgatgttg atttggttat gtctcatttg 180

aagtcttctg gtttgaagat tttgagagtt tggggtttta acgatgttac tactcaacca 240

tcttctggta ctgtttggta ccaattgcat caagatggta agtctactat taacactggt 300

gctgatggtt tgcaaagatt ggattacgtt gtttcttctg ctgaacaaca tggtattaag 360

ttgattatta actttgttaa ctactggact gattacggtg gtatgtctgc ttacgtttct 420

gcttacggtg gttctgatga aactgatttt tacacttctg atactatgca atctgcttac 480

caaacttaca ttaagactgt tgttgaaaga tactctaact cttctgctgt ttttgcttgg 540

gaattggcta acgaaccaag atgtccatct tgtgatacta ctgttttgta cgattggatt 600

gaaaagactt ctaagtttat taagggtttg gatgctgatc atatggtttg tattggtgat 660

gaaggttttg gtttgaacac tgattctgat ggttcttacc cataccaatt tgctgaaggt 720

ttgaacttta ctatgaactt gggtattgat actattgatt ttgctacttt gcatttgtac 780

ccagattctt ggggtacttc tgatgattgg ggtaacggtt ggatttctgc tcatggtgct 840

gcttgtaagg ctgctggtaa gccatgtttg ttggaagaat acggtgttac ttctaaccat 900

tgttctgttg aatctccatg gcaacaaact gctttgaaca ctactggtgt ttctgctgat 960

ttgttttggc aatacggtga tgatttgtct actggtgaat ctccagatga tggtaacact 1020

atttactacg gtacttctga ttacgaatgt ttggttactg atcatgttgc tgctattgat 1080

tctgcttaa 1089

Claims

1、β-甘露聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2、根据权利要求1所述的β-甘露聚糖酶，其特征在于：所述蛋白具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列。

3、编码权利要求1所述β-甘露聚糖酶的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

3)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因具有序列表中SEQ ID №：2或SEQ ID №：3的DNA序列。

5、含有权利要求3所述基因的表达载体、转基因细胞系和工程菌。

6、表达权利要求1所述β-甘露聚糖酶的工程菌，是将含有所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中得到的；所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列在毕赤酵母表达载体中位于α因子序列的下游；所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列为序列表中的SEQ ID №：4或SEQ ID №：5。

7、根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：用于构建所述含有β-甘露聚糖酶成熟蛋白编码序列的毕赤酵母表达载体的出发载体为pPICzαA、pPICZA或pPIC9K；以pPICzαA为出发载体构建的毕赤酵母表达载体为pPIC-Mann。

8、根据权利要求6或7所述的工程菌，其特征在于：用于构建表达所述β-甘露聚糖酶的工程菌的出发菌株为毕赤酵母X-33或GS115；以毕赤酵母X-33为出发菌株构建的工程菌为X-33/pPIC-Mann。

9、一种表达权利要求1所述β-甘露聚糖酶的方法，是发酵权利要求6所述的表达β-甘露聚糖酶的工程菌，得到β-甘露聚糖酶。

10、权利要求1所述的β-甘露聚糖酶在制备动物饲料添加剂中的应用。